HK1171765A - 双特异性抗-egfr/抗-igf-1r抗体 - Google Patents

Description

双特异性抗-EGFR/抗-IGF-1R抗体

本申请是国际申请号PCT/EP2009/006782，国际申请日为2009年9月21日，进入中国国家日期是2011年3月24日，中国国家申请号是200980137723.3，发明名称为“双特异性抗-EGFR/抗-IGF-1R抗体”的分案申请。

本发明涉及针对EGFR和针对IGF-1R的双特异性抗体，制备它们的方法，包含所述抗体的药物组合物，及其应用。

发明背景

EGFR和抗-EGFR抗体

人表皮生长因子受体(也已知为HER-1或Erb-B1，并且在本文中称作″EGFR″)是170kDa的跨膜受体，其由c-erbB原癌基因编码，并且显示固有的酪氨酸激酶活性(Modjtahedi，H.，等，英国癌症杂志(Br.J.Cancer)73(1996)：228-235；Herbst，R.S.和Shin，D.M.，癌症(Cancer)94(2002)：1593-1611)。SwissProt数据库登录号P00533提供了EGFR的序列。还存在EGFR的同种型和变体(例如，可变RNA转录物，截短形式，多态性等)，包括但不限于Swissprot数据库登录号P00533-1，P00533-2，P00533-3，和P00533-4确定的那些。已知EGFR结合包括以下各项的配体：表皮生长因子(EGF)，转化生长因子-α(TGf-α)，双调蛋白，肝素结合EGF(hb-EGF)，β动物纤维素，和epiregulin(Herbst，R.S.和Shin，D.M.，癌症(Cancer)94(2002)1593-1611；Mendelsohn，J.，和Baselga，J.，  原癌基因(Oncogene)19(2000)6550-6565)。EGFR经由酪氨酸激酶介导的信号转导途径调节许多细胞过程，包括但不限于激活控制细胞增殖、分化、细胞存活、程序性细胞死亡、血管发生、有丝分裂发生和转移的信号转导途径(Atalay等，Ann.Oncology 14(2003)1346-1363；Tsao，A.S.和Herbst，R.S.信号(Signal)4(2003)4-9；Herbst，R.S.，和Shin，D.M.，癌症(Cancer)94(2002)1593-1611；Modjtahedi，H.，等，英国癌症杂志(Br.J.Cancer)73(1996)228-235)。

EGFR的过量表达已经在许多人类恶性病症中报道，包括膀胱癌、脑癌、头和颈癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、前列腺癌和肾癌。(Atalay，G.，等，Ann.Oncology 14(2003)1346-1363；Herbst，R.S.，和Shin，D.M.，癌症(Cancer)94(2002)1593-1611；Modjtahedi，H.，等，英国癌症杂志(Br.J.Cancer)73(1996)228-235)。在这些病症的许多中，EGFR的过量表达与患者的差的预后相关或关联。(Herbst，R.S.，和Shin，D.M.，癌症(Cancer)94(2002)1593-1611；Modjtahedi，H.，等，英国癌症杂志(Br.J.Cancer)73(1996)228-235)。EGFR也在正常组织的细胞中表达，特别是皮肤、肝脏和胃肠道的上皮组织，尽管通常水平比在恶性细胞中低(Herbst，R.S.，和Shin，D.M.，癌症(Cancer)94(2002)1593-1611)。

未缀合的单克隆抗体(mAbs)可以是用于治疗癌症的有用的药，如由美国食品和药物管理局(U.S.Food and Drug Administration)所批准的下列药物所证明：用于治疗晚期乳腺癌的曲妥珠单抗(Herceptin^TM；Genentech Inc，)(Grillo-Lopez，A.-J.，等，Semin.Oncol.26(1999)66-73；Goldenberg，M.M.，临床治疗(Clin.Ther.)21(1999)：309-18)，用于治疗CD20阳性B细胞，低级或滤泡性非霍奇金氏淋巴瘤的利妥昔单抗(Rituxan^TM；IDECPharmaceuticals，San Diego，CA，和Genentech Inc.，San Francisco，CA)，用于治疗复发性急性骨髓白血病的吉妥珠单抗(Mylotarg^TM，Celltech/Wyeth-Ayerst)，和用于治疗B细胞慢性淋巴细胞白血病的阿仑珠单抗(CAMPATH^TM，Millenium Pharmaceuticals/Schering AG)。这些产品的成功不仅依赖于它们的功效，还依赖于它们突出的安全模式(Grillo-Lopez，A.-J.，等.，Semin.Oncol.26(1999)：66-73；Goldenberg，M.M.，临床治疗(Clin.Ther).21(1999)309-18)。尽管在这些药物上所取得的成就，目前在获得更高特异性抗体活性方面存在巨大的兴趣，所述特异性活性比典型地由未缀合的mAb疗法所提供的要高。

许多研究的结果显示Fc-受体依赖性机制相当大地有利于对针对肿瘤的细胞毒性抗体的作用，并且指示针对肿瘤的最佳抗体将优先结合以激活Fc受体，并且与抑制性配偶体FcγRIIB结合程度最小。(Clynes，R.A.，等，自然药物(Nature Medicine)6(4)：443-446(2000)；Kalergis，A.M.，和Ravetch，J.V.，J.Exp.Med.195(12)(2002)1653-1659。例如，至少一项研究的结果显示FcγRIIIa受体中的多态性特别地与抗体疗法的功效紧密相关(Cartron，G.，等，血液(Blood)99(3)(2002)754-757。该研究显示对于FcγRIIIa是纯合的患者，与对于FcγRIIIa是杂合的患者相比，具有更好的针对利妥昔单抗的应答。作者得出结论为更优的应答是由于抗体与FcγRIIIa的更好的体内结合，其导致了针对淋巴瘤细胞的更好的ADCC活性(Cartron，G.，等，血液(Blood)99(3)(2002)754-758)。

已经报道了靶向EGFR和阻断EGFR信号传导途径的各种策略。小分子酪氨酸激酶抑制剂如吉非替尼，厄洛替尼和CI-1033在胞内酪氨酸激酶区域内阻断EGFR的自磷酸化，由此抑制下游信号传导事件(Tsao，A.S.，和Herbst，R.S.，信号(Signal)4(2003)4-9)。另一方面，单克隆抗体，靶向EGFR的胞外部分，导致阻断配体结合并由此抑制下游事件如细胞增殖(Tsao，A.S.，和Herbst，R.S.，信号(Signal)4(2003)4-9)。

已经产生了几种鼠单克隆抗体，其获得这种体外阻断并且已经在小鼠异种移植模型中评估它们影响肿瘤生长的能力(Masui，等，癌症研究(Cancer Res.)46(1986)5592-5598；Masui，H.，等，癌症研究(Cancer Res).44(1984)1002-1007；Goldstein，等，临床癌症研究(Clin.Cancer Res.)(1995)11311-1318)。例如，EMD 55900(EMD Pharnaceuticals)是针对人表皮样癌细胞系A431产生的鼠抗-EGFR单克隆抗体，并且在喉或下咽部晚期鳞状细胞癌患者的临床研究中检验(Bier，H.，等，Eur.Arch.Otohinolaryngol.252(1995)433-9)。另外，结合EGFR胞外结构域的大鼠单克隆抗体ICR16，ICR62，和ICR80已经显示有效抑制EGF和TGF-α受体的结合(Modjtahedi，H.，等，Int.J.Cancer 75(1998)310-316)。鼠单克隆抗体425是另一种针对人A431癌细胞系产生的Mab并且发现在人表皮生长因子受体的外部结构域上与多肽表位结合。(Murthy，U.，等，生物化学生物物理进展(Arch.Biochem.Biophys).252(2)(1987)549-560。在治疗性治疗中使用鼠抗体的潜在问题是非人单克隆抗体可以被人宿主识别为外源蛋白；因此，重复注射这些外源抗体可导致诱导免疫反应，导致有害的超敏反应。对于基于鼠的单克隆抗体，这经常被称为人抗小鼠抗体应答，或″HAMA″应答，或人抗大鼠抗体，或″HARA″应答。此外，这些“异源”抗体可以被宿主的免疫系统所攻击从而使它们，在达到它们的靶位点前被有效地中和。另外，非人单克隆抗体(例如，鼠单克隆抗体)典型地缺乏人效应子功能性，即它们不能，特别是通过抗体依赖性细胞毒性或Fc-受体介导的吞噬作用来介导补体依赖性的裂解或溶解人靶细胞。

已经开发了嵌合抗体作为“缀合”抗体的置换物，所述嵌合抗体包含来自两种或多种不同物种(例如，小鼠和人类)的抗体的部分。例如US5,891,996(Mateo de Acosta del Rio，C.M.，等)讨论了小鼠/人嵌合抗体，R3，针对EGFR，并且US 5,558,864讨论了产生嵌合和人源化形式的鼠抗-EGFR MAb 425。此外，IMC-C225ImClone)是嵌合小鼠/人抗-EGFR单克隆抗体(基于小鼠M225单克隆抗体，其在人临床试验中导致HAMA应答)，其已经报道在各种人异种移植模型中显示抗肿瘤功效。(Herbst，R.S.，和Shin，D.M.，癌症(Cancer)94(2002)1593-1611)。IMC-C225的功效已经归因于几个机制，包括抑制通过EGFR信号传导途径，和可能通过增加的抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)活性调节的细胞事件(Herbst，R.S.，和Shin，D.M.，癌症(Cancer)94(2002)1593-1611)。IMC-C225也用于临床试验中，包括与放射疗法和化学疗法联合(Herbst，R.S.，和Shin，D.M.，癌症(Cancer)94(2002)1593-1611)。最近，Abgenix，Inc.(Fremont，CA)开发了用于癌症治疗的ABX-EGF。ABX-EGF是一种完全人的抗-EGFR单克隆抗体。(Yang，X.D.，等，Crit.Rev.Oncol./Hematol.38(2001)17-23)。

WO 2006/082515涉及源自大鼠单克隆抗体ICR62的人源化的抗-EGFR单克隆抗体并且涉及它们用于癌症治疗的糖改造形式。

IGF-1R和抗-IGF-1R抗体

胰岛素样生长因子I受体(IGF-1R，IGF-IR，CD 221抗原)属于跨膜蛋白酪氨酸激酶家族)(LeRoith，D.，等，内分泌学综述(Endocrin.Rev.)16(1995)143-163；和Adams，T.E.，等，细胞分子生命科学(Cell.Mol.LifeSci.)57(2000)1050-1093)。IGF-IR以高亲和性结合IGF-I并在体内起始针对这种配体的生理反应。IGF-IR还与IGF-II结合，但是以稍微更低的亲和性结合。IGF-IR的过量表达促进细胞的致瘤性转化，并且存在这样的证据，即IGF-IR涉及细胞的恶性转化并且因此成为有用的靶标用于开发治疗癌症的治疗剂(Adams，T.E.，等，细胞分子生命科学(Cell.Mol.LifeSci.)57(2000)1050-1093)。

针对IGF-IR的抗体是现有技术中公知的并且关于它们在体外和体内的抗肿瘤功效进行了研究(Benini，S.，等，临床癌症研究(Clin.CancerRes.)7(2001)1790-1797；Scotlandi，K.，等，癌症基因治疗(Cancer GeneTher.)9(2002)296-307；Scotlandi，K.，等，国际癌症杂志(Int.J.Cancer)101(2002)11-16；Brunetti，A.，等，生物化学生物物理研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.)165(1989)212-218；Prigent，S.A.，等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)265(1990)9970-9977；Li，S.L.，等，癌症免疫学免疫治疗(Cancer Immunol.Immunother.)49(2000)243-252；Pessino，A.，等，生物化学生物物理研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.)162(1989)1236-1243；Surinya，K.H.，等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)277(2002)16718-16725；Soos，M.A.，等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)267(1992)12955-12963；Soos，M.A.，等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86(1989)5217-5221；O′Brien，R.，M.，等，EMBO J.6(1987)4003-4010；Taylor，R.，等，生物化学杂志(Biochem.J.)242(1987)123-129；Soos，M.A.，等，生物化学杂志(Biochem.J.)235(1986)199-208；Li，S.L.，等，生物化学生物物理通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.)196(1993)92-98；Delafontaine，P.，等，J.Mol.Cell.Cardiol.26(1994)1659-1673；Kull，F.C.，Jr，等生物化学杂志(J.Biol.Chem.)258(1983)6561-6566；Morgan，D.O.，和Roth，R.A.，生物化学(Biochemistry)25(1986)1364-1371；Forsayeth，J.R.，等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)84(1987)3448-3451；Schaefer，E.M.，等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)265(1990)13248-13253；Gustafson，T.A.，和Rutter，W.J.，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)265(1990)18663-18667；Hoyne，P.A.，等，FEBS通信(FEBS Lett.)469(2000)57-60；Tulloch，P.A.，等，结构生物学杂志(J.Struct.Biol.)125(1999)11-18；Rohlik，Q.T.，等，生物化学生物物理研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Comm.)149(1987)276-281；和Kalebic，T.，等，癌症研究(Cancer Res.)54(1994)5531-5534；Adams，T.E.，等，细胞分子生命科学(Cell.Mol.Life Sci.)57(2000)1050-1093；Dricu，A.，等，糖生物学(Glycobiology)9(1999)571-579；Kanter-Lewensohn，L.，等，黑素瘤研究(Melanoma Res.)8(1998)389-397；Li，S.L.，等，癌症免疫学免疫治疗(Cancer Immunol.Immunother.)49(2000)243-252)。针对IGF-IR的抗体在许多其他的文献中进行了描述，例如Arteaga，C.L.，等，乳腺癌研究治疗(Breast Cancer Res.Treatment)22(1992)101-106；和Hailey，J.，等，分子癌症治疗(Mol.Cancer Ther.)1(2002)1349-1353。

具体地，针对IGF-IR被称为αIR3的单克隆抗体广泛用于研究IGF-IR介导的过程和IGF-I介导的疾病如癌症的研究中。α-IR-3由Kull，F.C.，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)258(1983)6561-6566描述。同时，约有百篇已经出版的出版物涉及αIR3抗肿瘤效果的研究和治疗应用，其中αIR3单独地和与细胞生长抑制剂如多柔比星(doxorubicin)和长春新碱(vincristine)一起进行治疗。αIR3是一种已知抑制IGF-I与IGF受体的结合，但是不抑制IGF-II与IGF-IR结合的鼠单克隆抗体。αIR3以高浓度刺激肿瘤细胞增殖和IGF-IR磷酸化作用(Bergmann，U.，等，癌症研究(Cancer Res.)55(1995)2007-2011；Kato，H.，等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)268(1993)2655-2661)。存在其他的抗体(例如，1H7，Li，S.，L.，等，癌症免疫学免疫疗法(Cancer Immunol.Immunother.)49(2000)243-252)，所述抗体抑制IGF-II与IGF-IR的结合比抑制IGF-I结合更有效。抗体和它们的性质和特征的现有技术的简述由Adams，T.E.，等，细胞分子生命科学(Cell.Mol.Life Sci.)57(2000)1050-1093描述。

在现有技术中描述的大多数抗体是小鼠起源的。所述抗体，如在现有技术中所公知的，如果不经过进一步改变如嵌合或人源化对于人患者的治疗是无效的。基于这些缺陷，明显地优选人抗体作为治疗剂用于治疗人患者。人抗体在现有技术中是公知的(van Dijk，M.A.，和van de Winkel，J.G.，Curr.Opin.Pharmacol.5(2001)368-374)。基于这些技术，可以产生针对多种靶标的人抗体。将针对IGF-IR的人抗体的实例描述在WO 02/053596中。

WO 2005/005635涉及人抗-IGF-1R抗体<IGF-1R>HUMAB克隆18(DSM ACC 2587)或<IGF-1R>HUMAB克隆22(DSM ACC 2594)以及它们在癌症治疗中的应用。

双特异性抗体

最近已经开发了广泛多样的重组抗体形式，例如通过融合例如IgG抗体形式和单链结构域的四价双特异性抗体(参见例如Coloma，M.J.，等，自然生物技术(Nature Biotech.)15(1997)159-163；WO 2001/077342和Morrison，S.L.等，自然生物技术(Nature Biotech.)25(2007)1233-1234)。

此外，开发了能够结合两种以上抗原的若干其他新型形式，其中抗体核心结构(IgA，IgD，IgE，IgG或IgM)不再保持诸如双抗体(diabodies)、三链抗体或四链抗体(tetrabodies)，微型抗体(minibodies)，若干单链形式(scFv，双-scFv)(Holliger P，等，Nature Biotech(自然生物技术)23(2005)1126-11362005；FischerN.，和Léger，O.，病理学(Pathobiology)74(2007)3-14；Shen J，等，免疫学方法杂志(Journal of Immunological Methods)318(2007)65-74；Wu，C.等，自然生物技术(Nature Biotech)25(2007)1290-1297)。

所有这样的形式使用接头将抗体核心(IgA，IgD，IgE，IgG或IgM)与其他结合蛋白(例如scFv)融合或融合例如两个Fab片段或scFv(Fischer N.，Léger O.，病理学(Pathobiology)74(2007)3-14)。人们可能一直希望保持效应子功能，诸如例如补体依赖性细胞毒性(CDC)或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，它们通过保持与天然存在的抗体的高度相似性而通过Fc受体结合来介导。

在WO 2007/024715中，报道了双重可变的结构域免疫球蛋白作为改造的多价和多特异性结合蛋白。在US 6,897,044中报道了具有生物活性的抗体二聚体的制备方法。在US 7,129,330中报道了具有至少四个彼此通过肽接头连接的可变结构域的多价F_V抗体构建体。在US 2005/0079170中报道了二聚体和多聚体抗原结合结构。在US 6,511,663中报道了三价或四价单特异性抗原结合蛋白，其包含通过连接结构彼此共价结合的三个或四个Fab片段，所述蛋白不是天然免疫球蛋白。在WO 2006/020258中报道了这样的四价双特异性抗体，其可以在原核细胞和真核细胞中有效表达，并且用于治疗和诊断方法中。在US 2005/0163782中报道了在包含两种类型的多肽二聚体的混合物中将通过至少一个链间二硫键连接的二聚体与不通过至少一个链间二硫键连接的二聚体分离或优先合成通过至少一个链间二硫键连接的二聚体的方法。在US 5,959,083中报道了双特异性四价受体。在WO 2001/077342中报道了具有三个或多个功能性抗原结合位点的改造的抗体。

在WO 1997/001580中报道了多特异性和多价抗原结合多肽。WO 1992/004053报道了共轭对配合物(homoconjugate)，其典型地由结合相同抗原决定簇的IgG类的单克隆抗体制备，通过合成交联共价连接。在WO 1991/06305中报道了对于抗原具有高亲和力的低聚单克隆抗体，其中分泌典型地是IgG类的低聚物，其具有两种以上的免疫球蛋白单体，所述免疫球蛋白单体缔合在一起形成四价或六价IgG分子。在US 6,350,860中报道了绵羊来源的抗体和改造的抗体构建体，其可以用于治疗其中干扰素γ活性是致病性的疾病。在US 2005/0100543中，报道了可靶向的构建体，所述构建体是双特异性抗体的多价载体，即可靶向的构建体的每个分子可以作为两种以上双特异性抗体的载体。在WO 1995/009917中报道遗传改造的双特异性四价抗体。在WO 2007/109254中，报道了由稳定的scFv组成或包含稳定的scFv的稳定的结合分子。

自Lu，D.，等，生物化学和生物物理研究通讯(Biochemical andBiophysical Research Communications)318(2004)507-513；生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，279(2004)2856-2865；和生物化学杂志(J.Biol Chem.)280(2005)19665-72已知针对EGFR和IGF-1R的双特异性抗体。然而，当与母体单特异性抗体的组合比较，这些双特异性抗-EGFR/抗-IGF-1R抗体清楚地显示减少的肿瘤生长抑制(尤其在这两者，即EGFR和IGF-1R具有相等(高)表达水平的肿瘤细胞中)。

发明简述

我们目前令人惊奇地发现新的双特异性抗-EGFR/抗-IGF-1R抗体，与母体单特异性抗体的组合比较，其显示至少类似的肿瘤生长抑制(仅使用减少量的双特异性抗体)(尤其在这两者，即EGFR和IGF-1R具有相等(高)表达水平的肿瘤细胞中)。

本发明的第一方面是结合EGFR和IGF-1R的双特异性抗体，其包含结合EGFR的第一抗原结合位点和结合IGF-1R的第二抗原结合位点，所述双特异性抗体特征在于

i)所述抗原结合位点每个是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域；

ii)所述第一抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：1的CDR3区域，SEQ ID NO：2的CDR2区域，和SEQ ID NO：3的CDR1区域，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：4的CDR3区域，SEQ ID NO：5的CDR2区域，和SEQ ID NO：6的CDR1区域；和

iii)所述第二抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：11的CDR3区域，SEQ ID NO：12的CDR2区域，和SEQ ID NO：13的CDR1区域，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：14的CDR3区域，SEQ ID NO：15的CDR2区域，和SEQ ID NO：16的CDR1区域；

或所述第二抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：17的CDR3区域，SEQ ID NO：18的CDR2区域，和SEQ ID NO：19的CDR1区域，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：20的CDR3区域，SEQ ID NO：21的CDR2区域，和SEQ ID NO：22的CDR1区域。

在本发明的一个实施方案中，所述双特异性抗体特征在于：

i)所述第一抗原结合位点包含SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8作为重链可变结构域，和包含SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10作为轻链可变结构域，

ii)所述第二抗原结合位点包含SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：24作为重链可变结构域，和包含SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26作为轻链可变结构域。

在本发明的一个实施方案中，所述双特异性抗体特征在于：

i)所述第一抗原结合位点包含SEQ ID NO：8作为重链可变结构域，和包含SEQ ID NO：10作为轻链可变结构域，

ii)所述第二抗原结合位点包含SEQ ID NO：23作为重链可变结构域，和包含SEQ ID NO：25作为轻链可变结构域。

所述双特异性抗体至少是二价的，并且可以是三价、四价或多价的。优选地，根据本发明的双特异性抗体是二价、三价或四价的。

本发明的另一方面是编码所述双特异性抗体的链的核酸分子。

本发明的另一方面是包含所述双特异性抗体的药物组合物，所述组合物用于治疗癌症，所述双特异性抗体用于制备治疗癌症的药物的应用，通过向需要所述治疗的患者施用所述双特异性抗体来治疗患有癌症的患者的方法。

根据本发明所述的双特异性抗体对于需要EGFR和IGF-1R靶向疗法的患者显示益处。根据本发明所述的抗体具有新的和有创造性的性质，从而导致对于患有所述疾病的患者，尤其是患有癌症的患者的益处。

发明详述

本发明的一个实施方案是结合EGFR和IGF-1R的双特异性抗体，其包含结合EGFR的第一抗原结合位点和结合IGF-1R的第二抗原结合位点，所述双特异性抗体特征在于：

i)所述抗原结合位点每个是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域；

ii)所述第一抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：1的CDR3区域，SEQ ID NO：2的CDR2区域，和SEQ ID NO：3的CDR1区域，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：4的CDR3区域，SEQ ID NO：5的CDR2区域，和SEQ ID NO：6的CDR1区域；和

iii)所述第二抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：11的CDR3区域，SEQ ID NO：12的CDR2区域，和SEQ ID NO：13的CDR1区域，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：14的CDR3区域，SEQ ID NO：15的CDR2区域，和SEQ ID NO：16的CDR1区域。

本发明的另一个实施方案是结合EGFR和IGF-1R的双特异性抗体，其包含结合EGFR的第一抗原结合位点和结合IGF-1R的第二抗原结合位点，所述双特异性抗体特征在于：

i)所述抗原结合位点每个是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域；

ii)所述第一抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：1的CDR3区域，SEQ ID NO：2的CDR2区域，和SEQ ID NO：3的CDR1区域，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：4的CDR3区域，SEQ ID NO：5的CDR2区域，和SEQ ID NO：6的CDR1区域；和

iii)所述第二抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：17的CDR3区域，SEQ ID NO：18的CDR2区域，和SEQ ID NO：19的CDR1区域，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：20的CDR3区域，SEQ ID NO：21的CDR2区域，和SEQ ID NO：22的CDR1区域。

本发明的另一个实施方案是结合EGFR和IGF-1R的双特异性抗体，其包含结合EGFR的第一抗原结合位点和结合IGF-1R的第二抗原结合位点，所述双特异性抗体特征在于：

i)所述抗原结合位点每个是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域；

ii)所述第一抗原结合位点包含SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8作为重链可变结构域，和包含SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10作为轻链可变结构域

iii)所述第二抗原结合位点包含SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：24作为重链可变结构域，和包含SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26作为轻链可变结构域。

本发明的另一个实施方案是结合EGFR和IGF-1R的双特异性抗体，其包含结合EGFR的第一抗原结合位点和结合IGF-1R的第二抗原结合位点，所述双特异性抗体特征在于：

i)所述抗原结合位点每个是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域；

ii)所述第一抗原结合位点包含SEQ ID NO：7作为重链可变结构域，和包含SEQ ID NO：10作为轻链可变结构域

iii)所述第二抗原结合位点包含SEQ ID NO：23作为重链可变结构域，和包含SEQ ID NO：25作为轻链可变结构域。

本发明的另一个实施方案是结合EGFR和IGF-1R的双特异性抗体，其包含结合EGFR的第一抗原结合位点和结合IGF-1R的第二抗原结合位点，所述双特异性抗体特征在于：

i)所述抗原结合位点每个是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域；

ii)所述第一抗原结合位点包含SEQ ID NO：8作为重链可变结构域，和包含SEQ ID NO：10作为轻链可变结构域

iii)所述第二抗原结合位点包含SEQ ID NO：23作为重链可变结构域，和包含SEQ ID NO：25作为轻链可变结构域。

本发明的另一个实施方案是结合EGFR和IGF-1R的双特异性抗体，其包含结合EGFR的第一抗原结合位点和结合IGF-1R的第二抗原结合位点，所述双特异性抗体特征在于：

i)所述抗原结合位点每个是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域；

ii)所述第一抗原结合位点包含SEQ ID NO：7作为重链可变结构域，和包含SEQ ID NO：10作为轻链可变结构域

iii)所述第二抗原结合位点包含SEQ ID NO：24作为重链可变结构域，和包含SEQ ID NO：26作为轻链可变结构域。

本发明的另一个实施方案是结合EGFR和IGF-1R的双特异性抗体，其包含结合EGFR的第一抗原结合位点和结合IGF-1R的第二抗原结合位点，所述双特异性抗体特征在于：

i)所述抗原结合位点每个是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域；

ii)所述第一抗原结合位点包含SEQ ID NO：8作为重链可变结构域，和包含SEQ ID NO：10作为轻链可变结构域

iii)所述第二抗原结合位点包含SEQ ID NO：24作为重链可变结构域，和包含SEQ ID NO：26作为轻链可变结构域。

用于本文时，″抗体″指包含抗原结合位点的结合蛋白。术语“结合位点”或“抗原结合位点”用于本文时，指配体实际上结合的抗体分子的区域。在根据本发明所述的抗体中的结合位点每个可以由两个可变结构域的对形成，即一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的一对形成。在抗体中的最小结合位点决定簇是重链CDR3区域。在本发明的一个实施方案中，每个结合位点包含抗体重链可变结构域(VH)和/或抗体轻链可变结构域(VL)，和优选地由抗体轻链可变结构域(VL)和抗体重链可变结构域(VH)组成的对形成。

抗体特异性指抗体对于抗原的特定表位的选择性识别。天然抗体，例如是单特异性的。根据本发明所述的“双特异性抗体”是具有两种不同的抗原结合特异性的抗体。如果抗体具有超过一种特异性，识别的表位可以与单抗原或一种以上的抗原相关。本发明的抗体特异于两种不同的抗原，即作为第一抗原的EGFR和作为第二抗原的IGF-1R。

术语“单特异性”抗体，用于本文时指具有一个或多个分别结合于相同抗原的相同表位的结合位点的抗体。

术语“价”在本申请中使用时指结合位点在抗体分子上存在的具体数量。象这样，术语“二价”，“四价”，和“六价”指在抗体分子上分别存在两个结合位点，四个结合位点，和六个结合位点。根据本发明的双特异性抗体是至少“二价的”，并且可以是“三价”或“多价”的(例如(“四价”或六价)的)。优选地，根据本发明的双特异性抗体是二价，三价或四价的。在一个实施方案中，所述双特异性抗体是二价的。在一个实施方案中，所述双特异性抗体是三价的。在一个实施方案中，所述双特异性抗体是四价的。

本发明的抗体具有两个以上的结合位点，并且是双特异性的。即，即使是在存在两个以上结合位点(即，抗体是三价或多价的)的情形中，所述抗体可以是双特异性的。本发明的双特异性抗体包括，例如多价单链抗体、双抗体和三链抗体，以及具有全长抗体的恒定结构域结构的抗体，另外的抗原结合位点(例如单链Fv、VH结构域和/或VL结构域，Fab，或(Fab)2))通过一个或多个肽接头连接所述全长抗体的恒定结构域结构。所述抗体可以是来自单一物种的全长抗体，或可以是嵌合化或人源化的。对于具有超过两个抗原结合位点的抗体，一些结合位点可以是相同的，只要所述蛋白具有对于两个不同抗原的结合位点。即，当第一结合位点特异于EGFR时，第二结合位点特异于IGF-1R。

象天然抗体一样，本发明的抗体的抗原结合位点典型地包含六个互补性决定区(CDRs)，其在不同程度上有助于结合位点对于抗原的亲和性。存在三个重链可变结构域CDRs(CDRH1，CDRH2和CDRH3)和三个轻链可变结构域CDRs(CDRL1，CDRL2和CDRL3)。CDR和构架区(FRs)的程度通过与氨基酸序列的汇编数据库进行比较来确定，所述氨基酸序列中那些区域根据序列之间的可变性来确定。此外，还包括在本发明范围内的是包含更少CDRs的功能性抗原结合位点(即，在结合特异性由三个、四个或五个CDRs决定的情形中)。例如，少于6个CDRs的完整组对于结合可能是足够的。在一些情形中，VH或VL结构域是足够的。

在某些实施方案中，本发明的抗体还包含一个或多个免疫球蛋白种类的免疫球蛋白恒定区。免疫球蛋白种类包括IgG，IgM，IgA，IgD，和IgE同种型，并且在IgG和IgA的情形中，包括它们的亚型。在优选的实施方案中，本发明的抗体具有IgG型抗体的恒定结构域结构，但是具有四个抗原结合位点。这是通过将两个特异性结合EGFR的完整抗原结合位点(例如，单链Fv)与特异性结合IGF-1R的完整抗体的N端或C端重链或轻链进行连接来实现。这四个抗原结合位点优选地对于两种不同结合特异性的每种包含两个结合位点。

术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”用于本文中时，指单一氨基酸组成的抗体分子制剂。

术语“嵌合抗体”指一种抗体，其包括来自一种来源或物种的可变区，即结合区，以及源自不同来源或物种的恒定区的至少一部分，其通常通过重组DNA技术进行制备。优选包括鼠可变区和人恒定区的嵌合抗体。本发明涵盖的“嵌合抗体”的其它优选形式是这样的那些，其中恒定区已经被从初始抗体的恒定区开始进行修饰或改变以产生按照本发明的特性，特别是关于C1q结合和/或Fc受体(FcR)结合。也将这种“嵌合”抗体称作“类别转换抗体”。嵌合抗体是被表达的免疫球蛋白基因的产物，该基因包括编码免疫球蛋白可变区的DNA区段和编码免疫球蛋白恒定区的DNA区段。制备嵌合抗体的方法包括目前在本领域众所周知的常规重组DNA和基因转染技术。见，例如，Morrison，S.L.，等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad Sci.USA)81(1984)6851-6855；US 5,202,238和5,204,244。

术语“人源化抗体”指这样的抗体，其中的构架或“互补性决定区”(CDR)已经被修饰为包括与母体免疫球蛋白相比特异性不同的免疫球蛋白的CDR。在一个优选实施方案中，将鼠CDR移植到人抗体的构架区以制备“人源化抗体”。见，例如，Riechmann，L.，等，自然(Nature)332(1988)323-327；和Neuberger，M.S.，等，自然(Nature)314(1985)268-270。特别优选的CDRs对应于识别以上指出的关于嵌合抗体的抗原的那些代表性序列。本发明涵盖的“人源化抗体”的其它形式是这样的那些，其中恒定区已经另外被从初始抗体的恒定区开始进行修饰或改变以产生按照本发明的特性，特别是关于C1q结合和/或Fc受体(FcR)结合。

用于本文时，术语“人抗体”意欲包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。人抗体是现有技术中公知的(van Dijk，M.A.，和van de Winkel，J.G.，当前化学生物学观点(Curr.Opin.Chem.Biol).5(2001)368-374)。人抗体还可以在转基因动物(例如小鼠)中产生，所述转基因动物在免疫时能够在缺乏内源免疫球蛋白生成的条件下产生人抗体的全部所有组成成分或选择部分(selection)。在所述种系突变小鼠中转移人种系免疫球蛋白基因阵列将导致在抗原攻击时产生人抗体(见，例如Jakobovits，A.，等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)90(1993)2551-2555；Jakobovits，A.，等.，Nature(自然)362(1993)255-258；Bruggemann，M.，等.，Year Immunol.(免疫学年度)7(1993)33-40)。人抗体还可以在噬菌体展示文库中产生(Hoogenboom，H.R.，和Winter，G.，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)227(1992)381-388；Marks，J.D.，等.，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)222(1991)581-597)。Cole，等和Boerner等的技术也可以用于制备人单克隆抗体(Cole，S.P.C.，等.，Monoclonal antibodiesand Cancer Therapy(单克隆抗体和癌症治疗)，Alan R.Liss，(1985)77-96；和Boerner，P.，等.，J.Immunol.(免疫学杂志)147(1991)86-95)。如已经对按照本发明的嵌合和人源化抗体所提及地，术语“人抗体”用于本文中时还包括这样的抗体，其在恒定区内进行修饰以产生按照本发明的特性，特别是关于C1q结合和/或FcR结合，例如通过“类别转换”即改变或突变Fc部分(例如由IgG1到IgG4和/或IgG1/IgG4突变。)

用于本文时，术语“重组人抗体”意欲包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的所有人抗体，诸如分离自宿主细胞，诸如NS0或CHO细胞的抗体或分离自人免疫球蛋白基因的转基因动物(例如小鼠)的抗体，或利用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体。这种重组人抗体具有处于重排形式的可变区和恒定区。按照本发明的重组人抗体已经经历了体内体细胞高变。因此，重组抗体的VH和VL区域的氨基酸序列是尽管源自并涉及人种系VH和VL序列，但在体内可能不天然存在于人抗体种系所有组成成分中的序列。“可变结构域”(轻链(VL)的可变结构域，重链(VH)的可变区)用于本文中时，表示直接参与抗体与抗原结合的每对轻链和重链对。可变人轻链和重链的结构域具有相同的一般结构且每个结构域包括4个构架(FR)区，所述构架区的序列普遍保守，其通过3个“高变区”(或互补性决定区，CDRs)相连接。构架区采用β-折叠构象且CDR可以形成连接β-折叠结构的环。每条链中的CDR通过构架区以其三维结构保持并与来自另一条链的CDR一起形成抗原结合位点。抗体重链和轻链CDR3区在按照本发明的抗体的结合特异性/亲和性方面发挥特别重要的作用并因此提供本发明的另一个目的。

用于本文时，术语“高变区”或“抗体的抗原结合部分”指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区包括来自“互补性决定区”或“CDRs”的氨基酸残基。“构架”或“FR”区是除本文中定义的高变区残基之外的那些可变结构域区域。因此，抗体的轻链和重链从N端到C端包括结构域FR1，CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。各条链上的CDR通过所述构架氨基酸分开。特别地，重链的CDR3是最有助于抗原结合的区域。按照Kabat等，免疫目的的蛋白质序列(Sequences of Proteins ofImmunological Interest)，第5版，公众健康服务，国家健康研究所(PublicHealth Service，National Institutes of Health)，Bethesda，MD.(1991))的标准定义确定CDR和FR区域。

根据本发明所述的双特异性抗体还包括具有“保守序列修饰”的这些抗体(这是指双特异性抗体的“变体”)。这意味着不影响或改变根据本发明所述的抗体的上述特征的核苷酸和氨基酸序列修饰。可以通过本领域已知的标准技术引入修饰，如位点定向诱变和PCR介导的诱变。保守氨基酸置换包括其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基取代的置换。具有类似侧链的氨基酸残基家族已经在本领域中定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)，具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，具有β支链侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，在双特异性<EGFR-IGF1R>抗体中的预测的非必需氨基酸残基可以优选地被来自相同侧链家族的另一种氨基酸残基置换。因此，“变体”双特异性<EGFR-IGF1R>抗体在本文是指这样的分子，其氨基酸序列与“母体”双特异性<EGFR-IGF1R>抗体氨基酸序列的不同之处在于在母体抗体的一个或多个可变区或恒定区中至多10个，优选约2个到约5个添加、缺失和/或置换。氨基酸置换可以通过基于分子建模的诱变进行，如在Riechmann，L.，等，自然(Nature)332(1988)323-327和Queen，C.，等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86(1989)10029-10033中所述。

在本文将关于所述序列的同一性或同源性定义为在比对序列和引入间隙(如果需要)以获得最大的百分比序列同一性后，在候选序列中与母体序列相同的氨基酸残基的百分比。N端、C端或内部延伸、缺失或插入抗体序列都不应该被认为影响序列同一性或同源性。变体保留结合人EGFR和人IGF-1R的能力。

用于本文时，术语“结合”或“特异性结合”指在体外测定法中，优选地在用表达野生型抗原的CHO细胞进行的基于细胞的ELISA中，抗体与抗原的表位的结合。结合意为10^-8M以下，优选地10^-13M到10^-9M的结合亲和性(K_D)。抗体与抗原或FcγRIII的结合可以通过BIAcore测定法(Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，Sweden)进行研究。结合的亲和性由术语ka(来自抗体/抗原复合物的抗体的缔合的速率常数)，k_D(解离常数)和K_D(k_D/ka)定义。

术语“表位”包括能够特异性结合抗体的任何多肽决定簇。在某些实施方案中，表位决定簇包括分子的化学活性表面分组(groupings)，诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，在某些实施方案中，可以具有特定的三维结构特征，和或特定的带电特性。表位是被抗体结合的抗原区域。在某些实施方案中，当抗体在蛋白和/或大分子的复杂混合物中优选识别其靶抗原时，将该抗体称为与抗原特异性结合。

人表皮生长因子受体(也已知为HER-1或Erb-B1，并且在本文中称作″EGFR″)是170kDa的跨膜受体，其由c-erbB原癌基因编码，并且显示固有的酪氨酸激酶活性(Modjtahedi，H.，等，英国癌症杂志(Br.J.Cancer)73(1996)：228-235；Herbst，R.S.和Shin，D.M.，癌症(Cancer)94(2002)：1593-1611)。SwissProt数据库登录号P00533提供了EGFR的序列。还存在EGFR的同种型和变体(例如，可变RNA转录物，截短形式，多态性等)，包括但不限于Swissprot数据库登录号P00533-1，P00533-2，P00533-3，和P00533-4确定的那些。已知EGFR结合包括以下各项的配体：α)，表皮生长因子(EGF)，转化生长因子-α(TGf-α)，双调蛋白，肝素结合EGF(hb-EGF)，β动物纤维素，和epiregulin(Herbst，R.S.和Shin，D.M.，癌症(Cancer)94(2002)1593-1611；Mendelsohn，J.，和Baselga，J.，原癌基因(Oncogene)19(2000)6550-6565)。EGFR经由酪氨酸激酶介导的信号转导途径调节许多细胞过程，包括但不限于激活控制细胞增殖、分化、细胞存活、程序性细胞死亡、血管发生、有丝分裂发生和转移的信号转导途径(Atalay，G.，等，Ann.Oncology 14(2003)1346-1363；Tsao，A.S.和Herbst，R.S.信号(Signal)4(2003)4-9；Herbst，R.S.，和Shin，D.M.，癌症(Cancer)94(2002)1593-1611；Modjtahedi，H.，等，英国癌症杂志(Br.J.Cancer)73(1996)228-235)。

胰岛素样生长因子I受体(IGF-IR，CD 221抗原)属于跨膜蛋白酪氨酸激酶家族)(LeRoith，D.，等，内分泌学综述(Endocrin.Rev.)16(1995)143-163；和Adams，T.E.，等，细胞分子生命科学(Cell.Mol.Life Sci.)57(2000)1050-1093)。SwissProt数据库登录号P08069提供IGF-IR的序列。IGF-IR以高亲和性结合IGF-I并在体内起始针对这种配体的生理反应。IGF-IR还与IGF-II结合，但是以稍微更低的亲和性结合。IGF-IR的过量表达促进细胞的致瘤性转化，并且存在这样的证据，即IGF-IR涉及细胞的恶性转化并且因此成为有用的靶标用于开发治疗癌症的治疗剂(Adams，T.E.，等，细胞分子生命科学(Cell.Mol.Life Sci.)57(2000)1050-1093)。

在本发明的一个实施方案中，所述双特异性抗体包含全长母体抗体作为支架。

术语“全长抗体”指由两条“全长抗体重链”和两条“全长抗体轻链”组成的抗体(见图10，不具有CH4结构域的“全长抗体”的示意性结构。还见图1和12中，具有单链Fv连接物(XGFR)和具有单链Fab连接物(scFab-XGFR)的四价双特异性形式的全长部分)。“全长抗体重链”是这样的多肽，其在N端到C端方向由抗体重链可变结构域(VH)、抗体恒定重链结构域1(CH1)，抗体铰链区(HR)，抗体重链恒定结构域2(CH2)，和抗体重链恒定结构域3(CH3)组成，缩写为VH-CH1-HR-CH2-CH3；并且在IgE亚类的抗体的情形中，任选地还包括抗体重链恒定结构域4(CH4)。优选地，“全长抗体重链”是在N端到C端方向由VH，CH1，HR，CH2和CH3组成的多肽。“全长抗体轻链”是在N端到C端方向由抗体轻链可变结构域(VL)，和抗体轻链恒定结构域(CL)组成的多肽，缩写为VL-CL。所述抗体轻链恒定结构域(CL)可以是κ(kappa)或λ(lambda)。两条全长抗体链通过在CL结构域和CH1结构域之间的多肽间二硫键和全长抗体重链的铰链区之间的多肽间二硫键连接在一起。典型的全长抗体的实例是天然抗体如IgG(例如，IgG 1和IgG2)，IgM，IgA，IgD，和IgE。根据本发明所述的全长抗体可以来自单一物种，例如人，或它们可以是嵌合的或人源化的抗体。根据本发明所述的全长抗体包含分别由VH和VL对形成的两个抗原结合位点，这两个抗原结合位点都特异性结合于相同的抗原。因此，包含第一抗原结合位点并且由两条抗体轻链和两条抗体重链组成的单特异性二价(＝全长)抗体是全长抗体。所述全长抗体的重链或轻链的C端指在所述重链或轻链的C端的最后的氨基酸。所述全长抗体的重链或轻链的N端指在所述重链或轻链的N端的最后的氨基酸。

在一个实施方案中，所述双特异性抗体是二价的-使用如例如a)在WO 2009/080251，WO 2009/080252或WO 2009/080253(结构域交换的抗体-见实施例14)中所述的形式或基于scFab-Fc融合抗体的形式，其中一个单链Fab片段特异于EGFR，而另一个单链Fab片段特异于IGF-1R(见实施例17)或c)在EP申请号07024867.9(WO 2009/080251)，Ridgway，J.B.，Protein Eng.9(1996)617-621；WO 96/027011；Merchant A.M，等，自然生物技术(Nature Biotech)16(1998)677-681；Atwell，S.，等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)270(1997)26-35和EP 1870459A1中所述的形式。在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体特征在于包含SEQ ID NO：30，SEQID NO：31，SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33的氨基酸序列或其变体。在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体特征在于包含SEQ ID NO：34，SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：37的氨基酸序列或其变体。在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体特征在于包含SEQID NO：38，和SEQ ID NO：39的氨基酸序列或其变体。在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体特征在于包含SEQ ID NO：38，和SEQ IDNO：39的氨基酸序列或其变体。在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体特征在于包含SEQ ID NO：40，和SEQ ID NO：41的氨基酸序列或其变体。在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体特征在于包含SEQ ID NO：42，和SEQ ID NO：43的氨基酸序列或其变体。这些氨基酸序列基于作为结合EGFR的第一抗原结合位点的SEQ ID NO：8的重链可变结构域，和SEQ ID NO：10的轻链可变结构域(来自人源化的<EGFR>ICR62)，并且基于作为结合IGF-1R的第二抗原结合位点的SEQID NO：23的重链可变结构域，和SEQ ID NO：25的轻链可变结构域(来自人抗-IGF-1R抗体<IGF-1R>HUMAB克隆18(DSMACC 2587))。

在一个实施方案中，所述双特异性抗体是三价的，使用例如基于特异性结合两种受体EGFR或IGF-1R之一的全长抗体的形式，仅在一条重链的一个C端scFab片段融合在所述全长抗体上，所述scFab片段特异性结合于两种受体EGFR或IGF-1R的另一种上，包括凸起-进入-孔洞技术(knobs-into holes technology)，如在EP申请号09004909.9中所述，或例如基于特异性结合两种受体EGFR或IGF-1R之一的全长抗体的形式，在一条重链的一个C端，所述全长抗体融合VH或VH-CH1片段，并且在第二重链的另一个C端融合VL或VL-CL片段，所述VL或VL-CL片段特异性结合两种受体EGFR或IGF-1R的另一种，包括凸起-进入-孔洞技术，如在EP申请号09005108.7中所述。对于凸起-进入-孔洞技术及其变化还见Ridgway，J.B.，Protein Eng.9(1996)617-621；WO 96/027011，MerchantA.M.等，自然生物技术(Nature Biotech)16(1998)677-681；Atwell，S.，等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)270(1997)26-35；和EP1870459A1。在一个实施方案中，根据本发明的双特异性三价抗体特征在于包含SEQ ID NO：44，SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：46的氨基酸序列或其变体。在一个实施方案中，根据本发明的双特异性三价抗体特征在于包含SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：48，和SEQ ID NO：49的氨基酸序列或其变体。这些氨基酸序列基于作为结合EGFR的第一抗原结合位点的SEQ IDNO：8的重链可变结构域，和SEQ ID NO：10的轻链可变结构域(来自人源化的<EGFR>ICR62)，并且基于作为结合IGF-1R的第二抗原结合位点的SEQ ID NO：23的重链可变结构域，和SEQ ID NO：25的轻链可变结构域(来自人抗-IGF-1R抗体<IGF-1R>HUMAB克隆18(DSM ACC2587))。

在一个实施方案中，所述双特异性抗体是四价的，使用如例如在WO 2007/024715，或WO 2007/109254或EP申请号09004909.9中所述的形式(结合第一抗原的全长抗体，结合其它抗原的两种scFab片段融合在所述全长抗体上)(见，例如实施例1或9)

在一个实施方案中，所述双特异性抗体是四价的，并且由下列各项组成：

a)单特异性二价抗体，其包含所述第一抗原结合位点并且由每条链仅包含一个可变结构域的两条抗体轻链和两条抗体重链组成，

b)两个肽接头，和

c)包含所述第二抗原结合位点的两种单价单特异性单链抗体(单特异性单价单链Fv)，其分别由轻链可变结构域，重链可变结构域和在所述轻链可变结构域和所述重链可变结构域之间的单链接头组成；

其中所述单链抗体(所述单链Fv)连接于单特异性二价抗体轻链或抗体重链的相同末端。

在另一个实施方案中，所述双特异性抗体是四价的，并且由下列各项组成：

a)单特异性二价抗体，其包含所述第二抗原结合位点并且由每条链仅包含一个可变结构域的两条抗体轻链和两条抗体重链组成，

b)两个肽接头，和

c)包含所述第一抗原结合位点的两种单价单特异性单链抗体(单特异性单价单链Fv)，其分别由轻链可变结构域，重链可变结构域和在所述轻链可变结构域和所述重链可变结构域之间的单链接头组成；

其中所述单链抗体(所述单链Fv)连接于单特异性二价抗体轻链或抗体重链的相同末端。

在另一个实施方案中，所述双特异性抗体是四价的，并且由下列各项组成：

a)全长抗体，其包含所述抗原结合位点并且由两条抗体重链和两条抗体轻链组成；和

b)包含所述第二抗原结合位点的两个相同的单链Fab片段，

其中在b)下的所述单链Fab片段通过在所述全长抗体的重链或轻链的C端或N端的肽连接体融合于在a)下的所述全长抗体。

在另一个实施方案中，所述双特异性抗体是四价的，并且由下列各项组成：

a)全长抗体，其包含所述第二抗原结合位点并且由两条抗体重链和两条抗体轻链组成；和

b)包含所述第一抗原结合位点的两个相同的单链Fab片段，

其中在b)下的所述单链Fab片段通过在所述全长抗体的重链或轻链的C端或N端的肽连接体融合于在a)下的所述全长抗体。

优选地，在b)下的所述单链Fab片段通过在所述全长抗体的重链或轻链的C端的肽连接体融合于所述全长抗体。

在一个实施方案中，结合第二抗原的两个相同的单链Fab片段通过在所述全长抗体的每个重链或轻链的C端的肽连接体融合于所述全长抗体。

在一个实施方案中，结合第二抗原的两个相同的单链Fab片段通过在所述全长抗体的每个重链的C端的肽连接体融合于所述全长抗体。

在一个实施方案中，结合第二抗原的两个相同的单链Fab片段通过在所述全长抗体的每个轻链的C端的肽连接体融合于所述全长抗体。

在另一个实施方案中，所述四价双特异性抗体具有下列特征：-其由下列各项组成：

a)由两条全长抗体重链和两条全长抗体轻链组成的单特异性二价母体(全长)抗体，其中每条链仅包含一个可变结构域，

b)两个肽接头，

c)两种单特异性单价单链抗体(单特异性单价单链Fv)，每种由抗体重链可变结构域，抗体轻链可变结构域和在所述抗体重链可变结构域和所述抗体轻链可变结构域之间的单链接头组成；

和优选地，所述单链抗体(所述单链Fv)连接于单特异性二价抗体重链的相同末端(C端和N端)，或备选地连接于单特异性二价抗体轻链的相同末端(优选地C端)，和更优选地连接于单特异性二价抗体重链的相同末端(C端和N端)。

术语“肽接头”用于本发明时指具有氨基酸序列的肽，其优选地是合成来源的。这些根据本发明所述的肽接头用于连接不同的抗原结合位点和/或最终包含不同的抗原结合位点的抗体片段(例如单链Fv，全长抗体，VH结构域和/或VL结构域，Fab，(Fab)2，Fc部分)从而在一起形成根据本发明所述的双特异性抗体。所述肽接头可以包含下列在表1中列出的氨基酸序列中的一个或多个以及另外任意选择的氨基酸。所述肽接头是具有至少5个氨基酸长度，优选地至少10个氨基酸长度，更优选地10-50个氨基酸长度的氨基酸序列的肽。优选地，在b)下的所述肽接头是具有至少10个氨基酸长度的氨基酸序列的肽。在一个实施方案中，所述肽接头是(GxS)n，其中G＝甘氨酸，S＝丝氨酸，(x＝3和n＝3，4，5或6)或(x＝4和n＝2，3，4或5)，优选地x＝4和n＝2或3，更优选地x＝4，n＝2((G₄S)₂)。还可以将另外的G＝甘氨酸，例如GG，或GGG加入所述(GxS)n肽接头。

术语“单链接头”用于本发明时指具有氨基酸序列的肽，其优选地是合成起源的。这些根据本发明所述的单链接头用于连接VH和VL结构域从而形成单链Fv。优选地，在c)下的所述单链接头是具有至少15个氨基酸长度，更优选地具有至少20个氨基酸长度的氨基酸序列的肽。在一个实施方案中，所述单链接头是(GxS)n，其中G＝甘氨酸，S＝丝氨酸，(x＝3和n＝4，5或6)或(x＝4和n＝3，4或5)，优选地x＝4，n＝4或5，更优选地x＝4，n＝4。

此外，所述单链(单链Fv)抗体优选地是二硫化物稳定的。这样的单链抗体的进一步的二硫化物稳定通过在单链抗体的可变结构域之间引入二硫键实现，并且例如在WO 94/029350，Rajagopal，V.，等，Prot.Engin.10(12)(1997)1453-59；Kobayashi，H.，等，核酸药物和生物学(Nuclear Medicine &Biology)25(1998)387-393；或Schmidt，M.，等，原癌基因(Oncogene)18(1999)1711-1721中进行描述。

在二硫化物稳定的单链(单链Fv)抗体的一个实施方案中，包含在根据本发明所述的抗体中的单链抗体的可变结构域之间的二硫键独立于每种单链抗体选自：

i)重链可变结构域位置44到轻链可变结构域位置100，

ii)重链可变结构域位置105到轻链可变结构域位置43，或

iii)重链可变结构域位置101到轻链可变结构域位置100。

在一个实施方案中，包含在根据本发明所述的抗体中的单链抗体的可变结构域之间的二硫键在重链可变结构域位置44到轻链可变结构域位置100之间。在一个实施方案中，包含在根据本发明所述的抗体中的单链抗体的可变结构域之间的二硫键在重链可变结构域位置105到轻链可变结构域位置43之间。

在一个实施方案中，优选在单链抗体(单链Fv)的可变结构域VH和VL之间不存在所述任选的二硫化物稳定的所述单链(单链Fv)抗体。

在另一个实施方案中，所述双特异性抗体特征在于：

-两个抗原结合位点分别由单特异性二价母体抗体的两对重链和轻链可变结构域形成，并且都结合于相同的表位，

-另外的两个抗原结合位点分别由一个单链抗体的重链和轻链可变结构域形成，

-所述单链抗体分别通过肽接头连接于一条重链或一条轻链，其中每个抗体链末端仅连接于单链抗体。

在另一个实施方案中，所述四价双特异性抗体特征在于：在a)下的所述单特异性二价(全长)抗体部分结合EGFR并且在c)下的所述两种单价单特异性单链抗体结合IGF-1R。

在另一个实施方案中，所述四价双特异性抗体特征在于：在a)下的所述单特异性二价(全长)抗体部分结合IGF-1R并且在c)下的所述两种单价单特异性单链抗体结合EGFR。

结合EGFR和IGF-1R的根据本发明所述的双特异性抗体的该第一四价实施方案的结构，其中抗原A或B之一是EGFR，而另一个是IGF-1R。所述结构基于结合抗原A的全长抗体，结合抗原B的两条(任选地二硫化物稳定的)单链Fv’s通过肽接头连接于所述全长抗体，所述结构在图1和图2的示意图中例示。

在第二个四价实施方案中，所述四价、双特异性抗体包含

a)特异性结合于所述第一抗原(两种抗原EGFR或IGF-1R之一)并且由两条抗体重链和两条抗体轻链组成的全长抗体；和

b)特异性结合于所述第二抗原(两种抗原EGFR或IGF-1R的另一种)的两个相同的单链Fab片段，

其中在b)下的所述单链Fab片段通过在所述全长抗体的重链或轻链的C端或N端的肽连接体融合于在a)下的所述全长抗体。

在一个实施方案中，结合第二抗原的两个相同的单链Fab片段通过在所述全长抗体的每条重链或轻链的C端的肽连接体融合于所述全长抗体。

在一个实施方案中，结合第二抗原的两个相同的单链Fab片段通过在所述全长抗体的每条重链的C端的肽连接体融合于所述全长抗体。

在一个实施方案中，结合第二抗原的两个相同的单链Fab片段通过在所述全长抗体的每条轻链的C端的肽连接体融合于所述全长抗体。

“单链Fab片段”(见图11)是由抗体重链可变结构域(VH)，抗体恒定结构域1(CH1)，抗体轻链可变结构域(VL)，抗体轻链恒定结构域(CL)和接头组成的多肽，其中所述抗体结构域和所述接头从N端到C端方向具有下列顺序之一：a)VH-CH1-接头-VL-CL，b)VL-CL-接头-VH-CH1，c)VH-CL-接头-VL-CH1或d)VL-CH1-接头-VH-CL；和其中所述接头是至少30个氨基酸的多肽，优选地32-50个氨基酸的多肽。所述单链Fab片段a)VH-CH1-接头-VL-CL，b)VL-CL-接头-VH-CH1，c)VH-CL-接头-VL-CH1和d)VL-CH1-接头-VH-CL，通过在CL结构域和CH1结构域之间的天然二硫键稳定。术语“N-端”指N端的最后氨基酸。术语“C-端”指C端的最后的氨基酸。

在优选的实施方案中，在所述单链Fab片段中的所述抗体结构域和所述接头具有从N端到C端方向的下列顺序之一：

a)VH-CH1-接头-VL-CL，或b)VL-CL-接头-VH-CH1，更优选地VL-CL-接头-VH-CH1。

在另一个优选的实施方案中，在所述单链Fab片段中的所述抗体结构域和所述接头具有从N端到C端方向的下列顺序之一：

a)VH-CL-接头-VL-CH1或b)VL-CH1-接头-VH-CL。

术语“肽连接体”用于本发明时指具有氨基酸序列的肽，所述肽优选地是合成来源的。将根据本发明所述的这些肽连接体用于将单链Fab片段与全长抗体的C端或N端融合从而形成根据本发明所述的多特异性抗体。

优选地，在b)下的所述肽连接体是具有至少5个氨基酸长度的氨基酸序列的肽，优选地具有5-100个氨基酸长度的氨基酸序列的肽，更优选地具有10-50个氨基酸长度的氨基酸序列的肽。在一个实施方案中，所述肽连接体是(GxS)n或(GxS)nGm，其中G＝甘氨酸，S＝丝氨酸，和(x＝3，n＝3，4，5或6，和m＝0，1，2或3)或(x＝4，n＝2，3，4或5和m＝0，1，2或3)，优选地x＝4和n＝2或3，更优选地x＝4，n＝2。在一个实施方案中，所述肽连接体是(G₄S)₂。

术语“接头”用于本发明时指具有氨基酸序列的肽，其优选地是合成来源的。将根据本发明所述的这些肽用于连接a)VH-CH1与VL-CL，b)VL-CL与VH-CH1，c)VH-CL与VL-CH1或d)VL-CH1与VH-CL从而形成下列根据本发明所述的单链Fab片段a)VH-CH1-接头-VL-CL，b)VL-CL-接头-VH-CH1，c)VH-CL-接头-VL-CH1或d)VL-CH1-接头-VH-CL。在所述单链Fab片段中的所述接头是具有至少30个氨基酸长度的氨基酸序列，优选地具有32-50个氨基酸长度的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述接头是(GxS)n，其中G＝甘氨酸，S＝丝氨酸，(x＝3，n＝8，9或10和m＝0，1，2或3)或(x＝4和n＝6，7或8和m＝0，1，2或3)，优选地其中x＝4，n＝6或7和m＝0，1，2或3，更优选地x＝4，n＝7和m＝2。在一个实施方案中，所述接头是(G₄S)₆G₂。

任选地在所述单链Fab片段中，除了在CL-结构域和CH1结构域之间的天然二硫键之外，还通过在下列位置之间引入二硫键来对抗体重链可变结构域(VH)和抗体轻链可变结构域(VL)进行二硫化物稳定：

i)重链可变结构域位置44到轻链可变结构域位置100，

ii)重链可变结构域位置105到轻链可变结构域位置43，或

iii)重链可变结构域位置101到轻链可变结构域位置100(总是根据Kabat的EU索引进行编号)。

单链Fab片段的这些另外的二硫化物稳定通过在单链Fab片段的可变结构域VH和VL之间引入二硫键来实现。引入非天然的二硫化物桥来稳定单链Fv的技术例如描述在WO 94/029350，Rajagopal，V.，等，Prot.Engin.(1997)1453-59；Kobayashi，H.，等；核药物和生物学(NuclearMedicine & Biology)，卷25，(1998)387-393；或Schmidt，M.，等，原癌基因(Oncogene)(1999)18，1711-1721中。在一个实施方案中，包含在根据本发明所述的抗体中的单链Fab片段的可变结构域之间的任选的二硫键在重链可变结构域位置44和轻链可变结构域位置100之间。在一个实施方案中，包含在根据本发明所述的抗体中的单链Fab片段的可变结构域之间的任选的二硫键在重链可变结构域位置105和轻链可变结构域位置43之间(总是根据Kabat的EU索引编号)。

在一个实施方案中，优选在单链Fab片段的可变结构域VH和VL之间不具有所述任选的二硫化物稳定的单链Fab片段。

优选地，根据本发明所述的四价双特异性抗体的所述第二实施方案包含两个相同的单链Fab片段(优选地VL-CL-接头-VH-CH1)，所述单链Fab片段都融合于在a)下的所述全长抗体的两条重链的两个C端或融合于在a)下的所述全长抗体的两条轻链的两个C端。这样的融合导致形成两个相同的融合肽((i)重链和单链Fab片段或ii)轻链和单链Fab片段))，所述融合肽与i)全长抗体的轻链或重链共同表达从而提供根据本发明的双特异性抗体(见图12，13和14)。

在另一个实施方案中，所述四价双特异性抗体特征在于在a)下的所述全长抗体部分结合于EGFR并且在b)下的所述两个单链Fab片段结合于IGF-1R。

在另一个实施方案中，所述四价双特异性抗体特征在于在a)下的所述全长抗体部分结合于IGF-1R并且在b)下的所述两个单链Fab片段结合于EGFR。

在另一个实施方案中，所述双特异性抗体特征在于所述恒定区是人来源的。

在另一个实施方案中，所述双特异性抗体特征在于根据本发明所述的双特异性抗体的恒定区是人IgG1亚类的，或是具有突变L234A和L235A的人IgG1亚类的。

在另一个实施方案中，所述双特异性抗体特征在于根据本发明所述的双特异性抗体的恒定区是人IgG2亚类的。

在另一个实施方案中，所述双特异性抗体特征在于根据本发明所述的双特异性抗体的恒定区是人IgG3亚类的。

在另一个实施方案中，所述双特异性抗体特征在于根据本发明所述的双特异性抗体的恒定区是人IgG4亚类的，或具有另外的突变S228P的IgG4亚类的。

目前已经发现根据本发明所述的双特异性抗体具有改善的特征。与仅应用一个个体抗体或两个个体抗体的组合比较，或与Lu，D.，等，生物化学和生物物理研究通讯(Biochemical and Biophysical ResearchCommunications)318(2004)507-513；生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，279(2004)2856-2865；和生物化学杂志(J.Biol Chem.)280(2005)19665-72的双特异性抗体比较，它们显示至少相同或增加的体外和体内抗肿瘤活性/功效。与Lu，D.，等，生物化学和生物物理研究通讯(Biochemical andBiophysical Research Communications)318(2004)507-513；生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，279(2004)2856-2865；和生物化学杂志(J.Biol.Chem.)280(2005)19665-72的双特异性抗体比较，它们显示提高的体内药物代谢动力学稳定性。另外，与仅应用一种个体抗体或两种个体抗体的组合比较，根据本发明所述的双特异性抗体显示调节的受体下调/内在化。此外，根据本发明所述的双特异性抗体可以提供益处如减少的剂量和/或施用频率和伴随的费用节省。

术语“恒定区”用于本申请时指除了可变区之外的抗体的结构域的总合。恒定区不直接涉及抗原的结合，但是显示不同的效应子功能。取决于它们重链的恒定区的氨基酸序列，抗体被分为下述类别：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，并且这些中的一些可以被进一步分为类别如IgG1，IgG2，IgG3，和IgG4，IgA1和IgA2。对应于不同种类的抗体的重链恒定区分别被称为α、δ、ε、γ和μ。可以在所有5种抗体种类中发现的轻链恒定区被称为κ(kappa)和λ(lambda)。

术语“来自人来源的恒定区”在本申请中使用时，指亚类IgG1，IgG2，IgG3，或IgG4的人抗体的恒定重链区和/或恒定轻链κ或λ区域。这样的恒定区是现有技术中公知的并且例如由Kabat，E.A.，描述(见，例如Johnson，G.和Wu，T.T.，核酸研究(Nucleic Acids Res.)28(2000)214-218；Kabat，E.A.，等.，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)72(1975)2785-2788)。当IgG4亚类的抗体显示减少的Fc受体(FcγRIIIa)结合时，其它IgG亚类的抗体显示强烈的结合。然而，Pro238，Asp265，Asp270，Asn297(失去Fc糖)，Pro329，Leu234，Leu235，Gly236，Gly237，Ile253，Ser254，Lys288，Thr307，Gln311，Asn434，和His435是这样的残基，其如果改变的话，还提供减少的Fc受体结合(Shields，R.，L.，等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)276(2001)6591-6604；Lund，J.，等，FASEB J.9(1995)115-119；Morgan，A.，等，免疫学(Immunology)86(1995)319-324；EP 0307434)。在一个实施方案中，根据本发明所述的抗体与IgG1抗体比较具有减少的FcR结合，并且所述单特异性二价(全长)母体抗体涉及IgG4亚类的FcR结合或具有突变S228，L234，L235和/或D265的IgG1或IgG2亚类的FcR结合，和/或包含PVA236突变。在一个实施方案中，在单特异性二价(全长)母体抗体中的突变是S228P，L234A，L235A，L235E和/或PVA236。在另一个实施方案中，在单特异性二价(全长)母体抗体中的突变在IgG4中是S228P，在IgG1中是L234A和L235A。恒定重链区在SEQ ID NO：27和28中显示。在一个实施方案中，单特异性二价(全长)母体抗体的恒定重链区是具有突变L234A和L235A的SEQ ID NO：27的恒定重链区。在另一个实施方案中，单特异性二价(全长)母体抗体的恒定重链区是具有突变S228P的SEQ ID NO：28的恒定重链区。在另一个实施方案中，单特异性二价(全长)母体抗体的恒定轻链区是SEQ ID NO：29的恒定轻链区。

抗体的恒定区直接涉及ADCC(抗体依赖性细胞毒作用)和CDC(补体依赖的细胞毒性)。补体激活(CDC)由补体因子C1q与大多数IgG抗体亚类的恒定区结合而起始。C1q与抗体的结合由在所谓的结合位点的定义的蛋白-蛋白相互作用所导致。这样的恒定区结合位点在现有技术中是已知的，并且例如由Lukas，T.J.，等，免疫学杂志(J.Immunol.)127(1981)2555-2560；Brunhouse，R.，和Cebra，J.J.，分子免疫学(Mol.Immunol.)16(1979)907-917；Burton，D.R.，等，自然(Nature)288(1980)338-344；Thommesen，J.E.，等，分子免疫学(Mol.Immunol.)37(2000)995-1004；Idusogie，E.E.，等，免疫学杂志(J.Immunol.)164(2000)4178-4184；Hezareh，M.，等，病毒学杂志(J.Virol.)75(2001)12161-12168；Morgan，A.，等，免疫学(Immunology)86(1995)319-324；和EP 0307434所描述。所述恒定区结合位点例如特征在于氨基酸L234，L235，D270，N297，E318，K320，K322，P331，和P329(根据Kabat的EU索引编号)。

术语“抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)”指在存在效应细胞时，由根据本发明的抗体裂解人靶细胞。ADCC优选地通过用根据本发明的抗体在存在效应细胞时处理表达IGF-1R和EGFR的细胞的制备物进行测量，所述效应细胞如新鲜分离的PBMC或来自暗黄覆盖层的纯化的效应细胞，如单核细胞或天然杀伤(NK)细胞或永久生长的NK细胞系。

术语“补体依赖的细胞毒性(CDC)”指由补体因子C1q与大多数IgG抗体亚类的Fc部分结合而起始的过程。C1q与抗体的结合由在所述结合位点的限定的蛋白-蛋白相互作用所导致。这些Fc部分结合位点是现有技术已知的(见上)。这些Fc部分结合位点例如特征在于氨基酸L234，L235，D270，N297，E318，K320，K322，P331，和P329(根据Kabat的EU索引编号)。亚类IgG1，IgG2，和IgG3的抗体通常显示包括C1q和C3结合的补体激活，而IgG4不激活补体系统并且不结合C1q和/或C3。

单克隆抗体的细胞介导的效应子功能可以通过改造它们的寡糖成分而得以增强，如在Umana，P.，等，自然生物技术(Nature Biotechnol.)17(1999)176-180，和US 6,602,684中所述。IgG1型抗体是最常用的治疗性抗体，其是在每个CH2结构域的Asn297具有保守的N-连接的糖基化位点的糖蛋白。与Asn297附着的两个复合双触角寡糖隐藏在CH2结构域之间，形成了与多肽主链的广泛接触，并且它们的存在对于抗体介导效应子功能诸如抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)是必要的(Lifely，M.R.，等，糖生物学(Glycobiology)5(1995)：813-822；Jefferis，R.，等，免疫学综述(ImmunolRev).163(1998)：59-76；Wright，A.和Morrison，S.L.，生物技术趋势(TrendsBiotechnol.)15(1997)：26-32)。Umana，P.，等自然生物技术(NatureBiotechnol.)17(1999)176-180和WO 99/54342显示，β(1，4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III(“GnTIII”)，一种催化分叉(bisected)寡糖形成的糖基转移酶，在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的过量表达，显著增加了抗体的体外ADCC活性。在Asn297糖的组成上的改变或其消除也影响FcγR和C1q的结合(Umana，P.，等，自然生物技术(Nature Biotechnol.)17(1999)176-180；Davies，J.，等，生物技术生物工程(Biotechnol.Bioeng.)74(2001)288-294；Mimura，Y.，等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)276(2001)45539-45547；Radaev，S.，等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)276(2001)16478-16483；Shields，R.L.，等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)276(2001)6591-6604；Shields，R.L.，等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)277(2002)26733-26740；Simmons，L.C.，等，免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)263(2002)133-147)。

增强单克隆抗体的细胞介导的效应子功能的方法例如在WO 2005/044859，WO 2004/065540，WO2007/031875，Umana，P.，等，自然生物技术(Nature Biotechnol.)17：176-180(1999)，WO 99/154342，WO 2005/018572，WO 2006/116260，WO 2006/114700，WO 2004/065540，WO 2005/011735，WO 2005/027966，WO 1997/028267，US 2006/0134709，US 2005/0054048，US 2005/0152894，WO 2003/035835和WO 2000/061739中进行报道，或例如在Niwa，R.，等，免疫方法杂志(J.Immunol.Methods)306(2005)151-160；Shinkawa，T.，等，生物化学杂志(J Biol Chem)，278(2003)3466-3473；WO 03/055993和US2005/0249722中进行报道。

因此，在本发明的一个实施方案中，双特异性抗体是糖基化的(如果其包含IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚类的Fc部分，优选地IgG1或IgG3亚类的Fc部分)，在Asn297具有糖链，其中在所述糖链中的岩藻糖的量是65％以下(根据Kabat的编号)。在另一个实施方案中，岩藻糖在所述糖链中的量在5％-65％，优选地20％-40％。根据本发明所述的“Asn297”意为在Fc区域的约位置297定位的氨基酸天冬酰胺。基于抗体的微小序列变化，Asn297也可以在定位在位置297上游或下游的一些氨基酸上(通常不超过±3个氨基酸)，即在位置294-300之间。在一个实施方案中，根据本发明所述的糖基化的抗体IgG亚类是人IgG1亚类的，具有突变L234A和L235A的人IgG1亚类，或IgG3亚类的。在另一个实施方案中，在所述糖链中N-羟乙酰神经氨酸(NGNA)的量是1％以下和/或N端α-1，3-半乳糖的量是1％以下。糖链优选地显示与在CHO细胞中重组表达的抗体的Asn297连接的N-连接的聚糖的特征。

术语“糖链显示与在CHO细胞中重组表达的抗体的Asn297附着的N-连接的聚糖的特征”指在根据本发明所述的双特异性抗体的恒定区的Asn297的糖链具有与在未修饰的CHO细胞中表达的相同抗体，例如如在WO 2006/103100中报道的那些抗体相同的结构和糖残基序列，除了岩藻糖残基之外。

术语“NGNA”用于本申请时指糖残基N-羟乙酰神经氨酸。

人IgG1或IgG3在Asn297发生糖基化，如核心岩藻糖基化的双触角复合寡糖糖基化，末端为多至两个Gal残基。IgG1或IgG3亚类的人恒定重链区由Kabat，E.A.，等，免疫目的蛋白序列(Sequences of Proteins ofImmunological Interest)，第5版.公众健康服务(Public Health Service)，国家健康研究所(National Institutes of Health)，Bethesda，MD.(1991)，和由Brüggemann，M.，等，J.Exp.Med.166(1987)1351-1361；Love，T.W.，等，酶学方法(Methods Enzymol.)178(1989)515-527中详细报道。根据末端Gal残基的量，将这些结构称为G0，G1(α-1，6-或α-1，3-)，或G2聚糖残基(Raju，T.S.，Bioprocess Int.1(2003)44-53)。抗体Fc部分的CHO型糖基化例如由Routier，F.H.，糖缀合物杂志(Glycoconjugate J).14(1997)201-207描述。在未进行糖修饰的CHO宿主细胞中重组表达的抗体通常在Asn297进行岩藻糖基化，量为至少85％。根据本发明所述的双特异性抗体的恒定区的修饰的寡糖可以是杂合的或复合的。优选地，所述分叉，还原/未岩藻糖基化的寡糖是杂合的。在另一个实施方案中，所述分叉、还原/未岩藻糖基化的寡糖是复合的。

根据本发明，“岩藻糖的量”意为与在Asn297附着的所有糖结构的总和(例如，复合、杂合和高甘露糖结构)相比的在Asn297的糖链中所述糖的量，所述糖的量通过MALDI-TOF质谱测量并且计算为平均值。岩藻糖的相对量是包含岩藻糖的结构相对于在N-糖苷酶F处理的样品中由MALDI-TOF鉴定的所有糖结构(例如，复合、杂合和低聚和高甘露糖结构，分别的)的百分比。

对于所有的根据本发明所述的双特异性抗体，“GE”意为糖改造的。

在本发明的一个其它方面中，根据本发明的双特异性抗体是具有ADCC和/或CDC的抗体，并具有来自人来源的IgG1或IgG3(优选地IgG1)亚类的恒定区，其结合Fcγ受体和/或补体因子C1q。结合Fc受体和/或补体因子C1q的这样的抗体确实激发抗体依赖性的细胞毒作用(ADCC)和/或补体依赖的细胞毒性(CDC)。

根据本发明所述的抗体由重组方式产生。因此，本发明的一个方面是编码根据本发明所述的抗体的核酸，并且另一个方面是包含编码根据本发明所述的抗体的核酸的细胞。用于重组生产的方法是现有技术中广泛已知的并且包含在原核细胞和真核细胞中的蛋白表达，以及随后的抗体分离和通常纯化为药用纯度。对于将前述抗体在宿主细胞中的表达，将编码各个修饰的轻链和重链的核酸通过标准方法插入表达载体中。在适合的原核或真核宿主细胞如CHO细胞，NS0细胞，SP2/0细胞，HEK293细胞，COS细胞，PER.C6细胞，酵母，或大肠杆菌细胞中进行表达，并且将所述抗体从细胞(裂解后的上清液或细胞)中回收。用于重组生产抗体的一般方法是现有技术中公知的，并且例如在Makrides，S.C.，Protein Expr.Purif.17(1999)183-202；Geisse，S.，等，Protein Expr.Purif 8(1996)271-282；Kaufman，R.J.，分子生物技术(Mol.Biotechnol.)16(2000)151-160；Werner，R.G.，Drug Res.48(1998)870-880的综述文章中描述。

双特异性抗体适当地从培养基中通过常规免疫球蛋白纯化方法分离，所述纯化方法如，例如蛋白A-琼脂糖，羟基磷灰石层析法，凝胶电泳，透析或亲和层析法。编码所述单克隆抗体的DNA和RNA容易地使用常规方法进行分离和测序。杂交瘤细胞可以充当所述DNA和RNA的来源。一旦被分离，可以将DNA插入表达载体中，所述表达载体接着被转染到不另外产生免疫球蛋白的宿主细胞如HEK 293细胞，CHO细胞，或骨髓瘤细胞中，从而在宿主细胞中获得重组单克隆抗体的合成。

双特异性抗体的氨基酸序列变体(或突变体)通过将适合的核苷酸变化引入抗体DNA中，或通过核苷酸合成进行制备。然而，这样的修饰可以仅在例如如上述的非常有限的范围内进行。例如，修饰不改变上述提及的抗体特征如IgG同种型和抗原结合，但是可以提高重组生产的产率、蛋白稳定性或有利于纯化。

根据本发明所述的结合EGFR和IGF-1R的双特异性抗体下调EGFR。在A549细胞中，在一个实施方案中，EGFR的下调是至少约30％，在另一个实施方案中，下调是至少约35％，和在另一个实施方案中，下调是至少约40％。

根据本发明所述的结合EGFR和IGF-1R的双特异性抗体下调IGF-1R。在H322M细胞中，在一个实施方案中，双特异性Cross-Mab(VH/VL)或Cross-Mab(CH/CL)下调IGF-1R至多约15％，在另一个实施方案中，下调至多约20％，和在另一个实施方案中，下调至多40％(75μg蛋白/mL)。

术语“宿主细胞”用于本申请时是指可以被改造从而产生根据本发明所述的抗体的细胞系统的任何种类。在一个实施方案中，将HEK293细胞和CHO细胞用作宿主细胞。用于本文时，表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可交替使用，且全部这些名称都包括后代。因此，词语“转化体”和“转化的细胞”包括原代受试者细胞和由其来源的培养物，而不考虑转移数。还理解所有的后代的DNA含量可能不精确一致，这归因于有意或无意的突变。包括在最初转化的细胞中筛选的具有相同功能或生物学活性的变异后代。

在NS0细胞中的表达记述在，例如，Barnes，L.M.，等.，细胞技术学(Cytotechnology)32(2000)109-123；Barnes，L.M.，等.，生物技术和生物工程(Biotech.Bioeng.)73(2001)261-270中。瞬时表达记述在，例如，Durocher，Y.，等.，核酸研究(Nucl.Acids.Res.)30E9(2002)中。可变结构域的克隆记述在Orlandi，R.，等.，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86(1989)3833-3837；Carter，P.，等.，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89(1992)4285-4289；和Norderhaug，L.，等.，免疫学方法杂志(J.Immunol.Method)204(1997)77-87中。优选的瞬时表达系统(HEK 293)记述在Schlaeger，E.-J.，和Christensen，K.，在细胞技术学(Cytotechnology)30(1999)71-83中和Schlaeger，E.-J.，在免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)194(1996)191-199中。

适合用于原核生物的控制序列，例如包括启动子，任选地操纵子序列，和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、增强子和多腺苷酸化信号。

当核酸在被置于与另一个核酸序列的功能关系中，是“可操作地连接的”。例如，前序列或分泌前导序列的DNA与多肽的DNA可操作地连接，条件是其表达为参与多肽分泌的前蛋白；启动子或增强子与编码序列可操作地连接，条件是其影响序列的转录；或核糖体结合位点与编码序列可操作地连接，条件是其被定位为促进翻译。一般地，“可操作地连接的”意指被连接的DNA序列是连续的，且在分泌前导序列的情形中，是连续的且在可读框中。然而，增强子不必须是连续的。连接通过在方便的限制性位点处的连接来实现。如果所述位点不存在，则合成的寡核苷酸适体或接头根据常规实践使用。

具有减少量的岩藻糖的根据本发明所述的抗体可以在被改造以表达编码具有GnTIII活性的多肽和具有ManII活性的多肽的至少一种核酸的糖修饰的宿主细胞中表达，所述表达以根据本发明使Fc区域中的寡糖岩藻糖基化的量进行。在一个实施方案中，具有GnTIII活性的多肽是融合多肽。备选地，宿主细胞的α1，6-岩藻糖基转移酶活性可以根据US 6,946,292减少或消除从而产生糖修饰的宿主细胞。抗体岩藻糖基化的量可以例如通过发酵条件或通过至少两种抗体与不同岩糖基化的量组合来进行预先确定。

具有减少量的岩藻糖的根据本发明所述的抗体可以在宿主细胞中，通过包括下列步骤的方法产生：(a)在容许所述抗体产生，并容许以根据本发明的量对存在于所述抗体的Fc区域上的寡糖进行岩藻糖基化的条件下，培养宿主细胞，所述宿主细胞被改造从而表达编码具有GnTIII活性和/或ManII活性的融合多肽的至少一种多核苷酸；和(b)分离所述抗体。在一个实施方案中，具有GnTIII活性的多肽是融合多肽，优选含有GnTIII的催化结构域和异源高尔基体定居(resident)多肽的高尔基体定位结构域，所述定位结构域选自由下列组成的组：甘露糖苷酶II的定位结构域，β(1，2)-N-乙酰葡糖胺转移酶I(“GnTI”)的定位结构域，甘露糖苷酶I的定位结构域，β(1，2)-N-乙酰葡糖胺转移酶II(“GnTII”)的定位结构域，和α1-6核心岩藻糖基转移酶的定位结构域。优选地，该高尔基体定位结构域来自甘露糖苷酶II或GnTI。

用于本文时，“具有GnTIII活性的多肽”指这样的多肽，所述多肽能够催化以β-1-4连接将N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)残基添加到N-联寡糖中的三甘露糖基核心的β连接的甘露糖苷上。这包括融合多肽，所述多肽显示类似于但不必须相同于β(1，4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III的活性的酶活性，如在具体的生物测定中所测量的，具有或不具有剂量依赖性，按照国际生化和分子生物学命名委员会(NC-IUBMB)，其也被称为β-1，4-甘露糖基-糖蛋白4-β-N-乙酰基葡糖胺基-转移酶(EC 2.4.1.144)。在其中确实存在剂量依赖性的情形中，其不需要与GnTIII的剂量依赖性相同，但是与GnTIII活性相比，基本类似于在给定活性中的剂量依赖(即，相对于GnTIII，候选多肽将显示更大的活性或不超过约25倍更少，并且优选地，不超过约10倍更少的活性，并且最优选地，不超过约三倍更少的活性)。用于本文时，术语“高尔基体定位结构域”指负责将多肽锚定在高尔基复合体的位置中的高尔基体定居多肽的氨基酸序列。通常，定位结构域包括酶的氨基末端“尾”。

对于生产具有减少量的岩藻糖的根据本发明所述的抗体，同样地也可以使用能够并被改造以容许产生具有修饰的糖形的抗体的宿主细胞。可以进一步操作所述宿主细胞从而表达增加水平的具有GnTIII活性的一种或多种多肽。优选将CHO细胞作为这样的宿主细胞。同样地，产生具有增加的ADCC的抗体组合物的细胞在US 6,946,292中报道。

通过标准技术，包括碱/SDS处理，CsCl分级(CsCl banding)，柱层析法，琼脂糖凝胶电泳，和其它本领域公知的技术，进行抗体的纯化从而消除细胞成分或其它污染物，例如其它细胞核酸或蛋白。见Ausubel，F.，等，编辑，现代分子生物学中的方法(Current Protocols in Molecular Biology)，Greene Publishing和Wiley Interscience，New York(1987)。不同的方法是充分建立的并且广泛用于蛋白纯化，如用微生物蛋白进行的亲和层析法(例如，蛋白A或蛋白G亲和层析法)，离子交换层析法(例如阳离子交换(羧甲基树脂)，阴离子交换(氨基乙基树脂)和混合模式的交换)，亲硫吸附(例如，用β-巯基乙醇和其它SH配体)，疏水相互作用或芳香吸附层析法(例如用苯基-琼脂糖、氮杂-arenophilic树脂，或间氨基苯基硼酸)，金属螯合亲和层析法(例如用Ni(II)-和Cu(II)-亲和性材料)，大小排阻层析和电泳方法(如凝胶电泳，毛细管电泳)(Vijayalakshmi，M.，A.，应用生物化学生物技术(Appl.Biochem.Biotech).75(1998)93-102)。

本发明的一个方面是包含根据本发明所述的抗体的药物组合物。本发明的另一个方面是将根据本发明所述的抗体用于制备药物组合物的应用。本发明的另一个方面是用于制备包含根据本发明所述的抗体的药物组合物的方法。在另一个方面中，本发明提供包含与药用载体一起配制的根据本发明所述的抗体的组合物，例如药物组合物。

令人惊奇地发现当与单特异性母体抗-EGFR抗体和抗-IGF-1R抗体比较，或与自Lu，D.，等，生物化学和生物物理研究通讯(Biochemical andBiophysical Research Communications)318(2004)507-513；生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，279(2004)2856-2865；和生物化学杂志(J.Biol.Chem.)280(2005)19665-72已知的针对EGFR和针对IGF-1R的双特异性抗体比较(如这些双特异性抗体与各个母体抗体的组合比较仅显示在表达EGFR/IGF-1R的肿瘤细胞中的减少的功效)，根据本发明的针对EGFR和针对IGF-1R的双特异性抗体具有针对癌细胞的提高的抗增殖性质。

本发明的另一个方面是用于治疗癌症的所述药物组合物。

本发明的另一个方面是根据本发明所述的抗体用于制备治疗癌症的药物的应用。

本发明的另一个方面是通过向需要所述治疗的患者施用根据本发明所述的抗体治疗遭受癌症的患者的方法。

用于本文时，“药物载体”包括生理相容的任何和所有的溶剂、分散介质、涂层、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗试剂和吸附延缓试剂等。优选地，所述载体适合用于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊或表皮施用(例如通过注射或输注)。

本发明的组合物可以通过多种本领域已知的方法施用。如技术人员清楚地，施用的路径和/或方式将根据需要的结果变化。为了通过某些施用路径施用本发明的化合物，可能需要用防止其失活的材料包被所述化合物，或使所述化合物与防止其失活的材料共同施用。例如，所述化合物可以在适合的载体中施用于受试者，所述载体例如是脂质体或稀释剂。药用稀释剂包括盐水和水性缓冲溶液。药物载体包括无菌水溶液或分散体和用于即时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。这些介质和药剂用于药物活性物质是本领域已知的。

术语“肠胃外施用”和“肠胃外地施用”用于本文时意为除了肠和局部施用之外的施用方式，通常通过注射施用，并且包括，但不限于，静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眼内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、角质下(subcuticular)、关节内、囊下、蛛网膜下、脊内、硬膜外和胸骨内注射和输注。

术语癌症用于本文时指增生性疾病，如淋巴瘤(lymphomas)，淋巴细胞性白血病(lymphocytic leukemias)，肺癌(lung cancer)，非小细胞肺(NSCL)癌(non small cell lung(NSCL)cancer)，支气管肺泡细胞肺癌(bronchioloalviolar cell lung cancer)，骨癌(bone cancer)，胰腺癌(pancreaticcancer)，皮肤癌(skin cancer)，头或颈癌(cancer of the head or neck)，皮肤或眼内黑素瘤(cutaneous or intraocular melanoma)，子宫癌(uterine cancer)，卵巢癌(ovarian cancer)，直肠癌(rectal cancer)，肛区癌(cancer of the analregion)，胃癌(stomach cancer)，胃癌(gastric cancer)，结肠癌(colon cancer)，乳腺癌(breast cancer)，子宫癌(uterine cancer)，输卵管癌(carcinoma of thefallopian tubes)，子宫内膜癌(carcinoma of the endometrium)，子宫颈癌(carcinoma of the cervix)，阴道癌(carcinoma of the vagina)，外阴癌(carcinoma ofthe vulva)，霍奇金病(Hodgkin′s Disease)，食管癌(cancer of theesophagus)，小肠癌(cancer of the small intestine)，内分泌系统癌(cancer ofthe endocrine system)，甲状腺癌(cancer of the thyroid gland)，甲状旁腺癌(cancer of the parathyroid gland)，肾上腺癌(cancer of the adrenal gland)，软组织肉瘤(sarcoma of soft tissue)，尿道癌(cancer of the urethra)，阴茎癌(cancer of the penis)，前列腺癌(prostate cancer)，膀胱癌(cancer of thebladder)，肾癌或输尿管癌(cancer of the kidney or ureter)，肾细胞癌(renalcell carcinoma)，肾盂癌(carcinoma of the renal pelvis)，间皮瘤(mesothelioma)，肝细胞癌(hepatocellular cancer)，胆管癌(biliary cancer)，中枢神经系统(CNS)肿瘤(neoplasms of the central nervous system(CNS))，脊椎轴肿瘤(spinal axis tumors)，脑干胶质瘤(brain stem glioma)，多形性成胶质细胞瘤(glioblastoma multiforme)，星形细胞瘤(astrocytomas)，神经鞘瘤(schwanomas)，室管膜瘤(ependymonas)，成髓细胞瘤(medulloblastomas)，脑膜瘤(meningiomas)，鳞状细胞癌(squamous cell carcinomas)，垂体腺瘤(pituitary adenoma)，和埃文斯肉瘤(Ewing’s sarcoma)，包括上述癌症任一的难治性形式，或一种或多种上述癌症的组合。

这些组合物还可以包含佐剂如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。防止微生物的存在可以通过灭菌方法，见上文和通过包含各种抗细菌和抗真菌药剂，例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸等来确保。可能需要在组合物中包含等渗剂，如糖、氯化钠等。此外，可以通过包含延缓吸附的试剂如单硬脂酸铝和明胶来导致可注射药物形式的延长的吸附。

不管所选择的施用路径为何，可以以适合的水合形式使用的本发明的化合物，和/或本发明的药物组合物通过本领域技术人员已知的常规方式配制到药用剂型中。

在本发明的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平可以变化从而获得这样的活性成分的量，其对于特定的患者、组合物和施用方式有效获得需要的治疗反应，而不会对于患者具有毒性。选定的剂量水平将取决于多种药物代谢动力学因素包括所用的本发明的特定组合物的活性、施用路径、施用时间、使用的特定化合物的排泄速率、治疗的延续时间、与所用的特定组合物组合使用的其它药物、化合物和/或材料、待治疗的患者的年龄、性别、体重、病症、一般健康和以前的医疗病史，以及医疗领域已知的类似因素。

所述组合物必需是无菌和可流动的，到所述组合物可通过注射器递送的程度。除了水之外，所述载体优选地是等渗缓冲的盐水溶液。

适当的流动性可以例如通过使用涂层如磷脂酰胆碱，在分散体的情形中通过维持需要的颗粒大小和通过使用表面活性剂来维持。在许多情形中，优选在所述组合物中包括等渗剂，例如，糖、多元醇如甘露醇或山梨醇，和氯化钠。

用于本文中时，表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可交替使用，且全部这些名称都包括子代。因此，词语“转化体”和“转化的细胞”包括原代受试细胞和由其来源的培养物，而不考虑转移的次数。还理解所有的子代的DNA含量可能不精确一致，这归因于有意或无意的突变。包括在最初转化的细胞中筛选的具有相同功能或生物学活性的变异子代。在意指不同名称时，通过上下文其将是清楚的。

术语“转化”用于本文中时，指将载体/核酸转移到宿主细胞中的过程。如果将无难以克服的细胞壁屏障的细胞用作宿主细胞，则转染例如通过如Graham，F.L.和van der Eb.A.J.，Virology(病毒学)52(1973)456-467所述的磷酸钙沉淀法来进行。然而，还可以使用其他将DNA引入细胞的方法，诸如通过核注射或通过原生质体融合。如果使用原核细胞或包含实质细胞壁结构的细胞，例如一种转染方法是利用氯化钙的钙处理，如Cohen，S.N，等，PNAS(美国科学院院报).69(1972)2110-2114所述。

用于本文中时，“表达”指将核酸转录为mRNA的过程和/或将转录的mRNA(也称为转录物)随后翻译为肽、多肽或蛋白质的过程。转录物和被编码的多肽共同称为基因产物。如果多核苷酸源自基因组DNA，则在真核细胞中的表达可以包括mRNA的剪接。

“载体”是核酸分子，特别是自体复制的，其将插入的核酸分子转移到宿主细胞之中和/或之间。该术语包括主要功能为将DNA或RNA插入细胞(例如，染色体整合)的载体，主要功能是复制DNA或RNA的复制载体，和功能是转录和/或翻译DNA或RNA的表达载体。还包括提供多于一种上述功能的载体。

“表达载体”是多核苷酸，其在引入到合适的宿主细胞中时能够被转录和翻译为多肽。“表达系统”通常指包括表达载体的适当宿主细胞，所述表达载体可以起作用产生所需的表达产物。

氨基酸序列描述

SEQ ID NO：1重链CDR3，人源化的<EGFR>ICR62

SEQIDNO：2重链CDR2，人源化的<EGFR>ICR62

SEQIDNO：3重链CDR1，人源化的<EGFR>ICR62

SEQIDNO：4轻链CDR3，人源化的<EGFR>ICR62

SEQ ID NO：5轻链CDR2，人源化的<EGFR>ICR62

SEQ ID NO：6轻链CDR1，人源化的<EGFR>ICR62

SEQ ID NO：7重链可变结构域，人源化的<EGFR>ICR62-I-HHB

SEQ ID NO：8重链可变结构域，人源化的<EGFR>ICR62-I-HHD

SEQ ID NO：9轻链可变结构域，人源化的<EGFR>ICR62-I-KA

SEQ ID NO：10轻链可变结构域，人源化的<EGFR>ICR62-I-KC

SEQ ID NO：11重链CDR3，<IGF-1R>HUMAB-克隆18

SEQ ID NO：12重链CDR2，<IGF-1R>HUMAB-克隆18

SEQ ID NO：13重链CDR1，<IGF-1R>HUMAB-克隆18

SEQ ID NO：14轻链CDR3，<IGF-1R>HUMAB-克隆18

SEQ ID NO：15轻链CDR2，<IGF-1R>HUMAB-克隆18

SEQ ID NO：16轻链CDR1，<IGF-1R>HUMAB-克隆18

SEQ ID NO：17重链CDR3，<IGF-1R>HUMAB-克隆22

SEQ ID NO：18重链CDR2，<IGF-1R>HUMAB-克隆22

SEQ ID NO：19重链CDR1，<IGF-1R>HUMAB-克隆22

SEQ ID NO：20轻链CDR3，<IGF-1R>HUMAB-克隆22

SEQ ID NO：21轻链CDR2，<IGF-1R>HUMAB-克隆22

SEQ ID NO：22轻链CDR1，<IGF-1R>HUMAB-克隆22

SEQ ID NO：23重链可变结构域，<IGF-1R>HUMAB-克隆18

SEQ ID NO：24重链可变结构域，<IGF-1R>HUMAB-克隆22

SEQ ID NO：25轻链可变结构域，<IGF-1R>HUMAB-克隆18

SEQ ID NO：26轻链可变结构域，<IGF-1R>HUMAB-克隆22

SEQ ID NO：27来自IgG1的人重链恒定区

SEQ ID NO：28来自IgG4的人重链恒定区

SEQ ID NO：29kappa轻链恒定区

SEQ ID NO：30双特异性、二价结构域交换的<EGFR-IGF1R>抗体分子：Cross-Mab(VH/VL)的重链1

SEQ ID NO：31双特异性、二价结构域交换的<EGFR-IGF1R>抗体分子：Cross-Mab(VH/VL)的重链2

SEQ ID NO：32双特异性、二价结构域交换的<EGFR-IGF1R>抗体分子：Cross-Mab(VH/VL)的轻链1

SEQ ID NO：33双特异性、二价结构域交换的<EGFR-IGF1R>抗体分子：Cross-Mab(VH/VL)的轻链2

SEQ ID NO：34双特异性、二价结构域交换的<EGFR-IGF1R>抗体分子：Cross-Mab(CH/CL)的重链1

SEQ ID NO：35双特异性、二价结构域交换的<EGFR-IGF1R>抗体分子：Cross-Mab(CH/CL)的重链2

SEQ ID NO：36双特异性、二价结构域交换的<EGFR-IGF1R>抗体分子：Cross-Mab(CH/CL)的轻链1

SEQ ID NO：37双特异性、二价结构域交换的<EGFR-IGF1R>抗体分子：Cross-Mab(CH/CL)的轻链2

SEQ ID NO：38双特异性、二价scFab-Fc融合<EGFR-IGF1R>抗体分子：scFab-Fc的重链1

SEQ ID NO：39双特异性、二价scFab-Fc融合<EGFR-IGF1R>抗体分子：scFab-Fc的重链2

SEQ ID NO：40双特异性、二价scFab-Fc融合<EGFR-IGF1R>抗体分子：N-scFabSS-盐桥-s3的重链1

SEQ ID NO：41双特异性、二价scFab-Fc融合<EGFR-IGF1R>抗体分子：N-scFabSS-盐桥-s3的重链2

SEQ ID NO：42双特异性、二价scFab-Fc融合<EGFR-IGF1R>抗体分子：N-scFabSS-盐桥-w3C的重链1

SEQ ID NO：43双特异性、二价scFab-Fc融合<EGFR-IGF1R>抗体分子：N-scFabSS-盐桥-w3C的重链2

SEQ ID NO：44双特异性、三价scFab-IgG融合<EGFR-IGF1R>抗体分子：KiH-C-scFab-1的重链1

SEQ ID NO：45双特异性、三价scFab-IgG融合<EGFR-IGF1R>抗体分子：KiH-C-scFab-1的重链2

SEQ ID NO：46双特异性、三价scFab-IgG融合<EGFR-IGF1R>抗体分子：KiH-C-scFab-1的轻链

SEQ ID NO：47双特异性、三价scFab-IgG融合<EGFR-IGF1R>抗体分子：KiH-C-scFab-2的重链1

SEQ ID NO：48双特异性、三价scFab-IgG融合<EGFR-IGF1R>抗体分子：KiH-C-scFab-2的重链2

SEQ ID NO：49双特异性、三价scFab-IgG融合<EGFR-IGF1R>抗体分子：KiH-C-scFab-2的轻链

提供以下实施例、序列表和附图来帮助理解本发明，本发明的真正范围在所附权利要求中给出。要理解在不偏离本发明精神的条件下可以对所述程序作出改动。

附图简述

图1.结合EGFR和IGF-1R的根据本发明所述的双特异性抗体的一个四价实施方案的示意性结构，其中抗原A或B之一是EGFR，而另一个是IGF-1R。所述结构基于结合抗原A的全长抗体，结合抗原B的两个(任选地二硫化物稳定的)单链Fv’s通过肽-接头连接于所述全长抗体。

图2.结合EGFR和IGF-1R的根据本发明所述的双特异性抗体的四个可能的四价实施方案A-D的示意性结构，其中抗原A或B之一是EGFR，而另一个是IGF-1R。所述结构基于结合抗原A的全长抗体，结合抗原B的两个(任选地二硫化物稳定的)单链Fv’s通过位于下列位置的肽-接头连接于所述全长抗体：

A：全长抗体重链的C端

B：全长抗体重链的N端

C：全长抗体轻链的C端

D：全长抗体轻链的C端

图3.3a：纯化的双特异性抗体XGFR1-2421的SDS-PAGE

3b：纯化的双特异性抗体XGFR1-2421(3mg，/ml)的HP-大小排阻层析法(SEC)分析

3c：纯化的双特异性抗体XGFR1-2421(1mg，/ml)的HP-大小排阻层析(SEC)分析

图4.4a：双特异性抗体XGFR1-2320(无二硫化物稳定)的HP-大小排阻层析(SEC)纯化(8.7％团聚体)

4b：双特异性抗体XGFR1-2321(二硫化物稳定的)的HP-大小排阻层析(SEC)纯化(0％团聚体)

图5.在用固定的XGFR1-2320进行的Biacore测定法中双特异性抗-EGFR/抗-IGF-1R抗体(XGFR1-2320)与EGFR和IGF1R的同时结合

图6.由双特异性抗体下调在A549NSCLC肿瘤细胞系中的IGFR(6a)和EGFR(6b)

图7.双特异性抗-EGFR/抗-IGF-1R抗体分子(XGFR)在H322M NSCLC肿瘤细胞系中抑制IGF-1R磷酸化(7a)和EGFR磷酸化(7b)

7a：在用各种双特异性抗体XGFR分子和它们的母体抗体在H322MNSCLC肿瘤细胞中抑制后的Phospho-EGF-R-ELISA，抗体浓度与温育有关，在用IGF1/EGF抗体刺激的情形中，浓度被稀释到起始浓度的一半

7b：在用各种双特异性抗体XGFR分子和它们的母体抗体在H322MNSCLC肿瘤细胞中抑制后的Phospho-EGF-R-ELISA，抗体浓度与温育有关，在用IGF1/EGF抗体刺激的情形中，抗体浓度被稀释到起始浓度的一半

图8.双特异性抗-EGFR/抗-IGF-1R抗体分子(XGFR)和它们的母体抗体对表达EGFR-和IGF-1R的H322M NSCLC肿瘤细胞的抗肿瘤生长抑制

图9.双特异性抗-EGFR/抗-IGF-1R抗体分子(XGFR)的体外ADCC活性

图10.特异性结合EGFR或IGF1-R的无CH4结构域的全长抗体的示意性结构，其具有两对重链和轻链，以典型的顺序包含可变结构域和恒定结构域。

图11.特异性结合例如EGFR或IGF1-R的四个可能的单链Fab片段的示意性结构

图12.根据本发明所述的四价、双特异性抗体的示意性结构，其包含特异性结合两种抗原EGFR或IGF1-R之一的全长抗体和特异性结合两种抗原EGFR或IGF1-R的另一个的两个单链Fabs(scFab-XGFR分子)

图13.包含特异性结合IGF-1R的全长抗体和特异性结合EGFR的两个相同的单链Fabs的根据本发明所述的双特异性抗体-ScFab-XGFR1分子A，B，C，和D以及在纯化后的表达水平

A：与重链的C端融合的scFab(VH-CH1-接头-VL-CL)

B：与重链的C端融合的scFab (VH-CH1-接头-VL-CL，融合另外的VH44-VL100二硫化物桥)

C：与轻链的C端融合的scFab (VH-CH1-接头-VL-CL)

D：与轻链的C端融合的scFab(VH-CH1-接头-VL-CL，融合另外的VH44-VL100二硫化物桥)

图14.包含特异性结合EGFR的全长抗体和特异性结合IGF-1R的两个相同的单链Fabs的根据本发明所述的双特异性抗体-ScFab-XGFR2分子A，B，C，和D

A：与重链的C端融合的scFab(VH-CH1-接头-VL-CL)

B：与重链的C端融合的scFab(VH-CH1-接头-VL-CL，融合另外的VH44-VL100二硫化物桥)

C：与轻链的C端融合的scFab(VH-CH1-接头-VL-CL)

D：与轻链的C端融合的scFab(VH-CH1-接头-VL-CL，融合另外的VH44-VL100二硫化物桥)

图15.包含单链Fab的双特异性抗体衍生物scFab-XGFR1的SDS-PAGE分析

1：scFab-XGFR1_4720(未还原)

2：scFab-XGFR1_4721(未还原)

3：scFab-XGFR1_4720(还原)

4：scFab-XGFR1_4721(还原)

图16.包含scFab的双特异性抗体衍生物scFab-XGFR1的HP-SEC分析

图16a：scFab-XGFR1-4720；7.7％，团聚体(用盒标记)

图16b：scFab-XGFR1-4721；3.5％，团聚体(用盒标记)

图17.scFab-XGFR1和scFab-XGFR2与EGFR和IGF 1R的结合

图17a：Biacore图-scFab-XGFR1_2720与EGFR的结合，KD＝2nM

图17b：Biacore图-scFab-XGFR1_2720与IGF-1R的结合，KD＝2nM

图17c：Biacore图-scFab-XGFR2_2720与EGFR的结合，KD＝0.5nM

图17d：Biacore图-scFab-XGFR2_2720与IGF-1R的结合，KD＝11nM

图18.示意图-用FACS竞争测定法分析的scFab-XGFR与细胞的结合，使用下列一般方法：

-平行加入用Alexa647(1μg/mL)标记的<IGF1R>Mab+未标记的scFab-XGFR(100μg/mL-0,001μg/mL)

-在冰上温育45分钟，洗涤并去除未结合的抗体

-用1％HCHO固定，接着进行FACS

图19.通过FACS竞争测定法分析的scFab-XGFR_2721和母体<IGF1R>克隆18与细胞的结合

图19a：比较<IGF-1R>克隆18(0，18μg/ml)和scFab-XGFR_2721(0，15μg/ml)的IC50值

图19b：<IGF-1R>克隆18的结合曲线(转折点0，11μg/ml)-y-轴＝RLU；x-轴抗体浓度μg/ml)

图19c：scFab-XGFR_2721的结合曲线(转折点0，10μg/ml)-y-轴＝RLU；x-轴抗体浓度(μg/ml)

图20.用不同的双特异性抗-EGFR/抗-IGF-1R抗体分子(scFab-XGFR；100nM)温育24小时后在H322M细胞上下调IGF1-R

图21.用不同的双特异性抗-EGFR/抗-IGF-1R抗体分子(scFab-XGFR；100nM)温育24小时后在H322M细胞上下调EGFR

图22.用不同的双特异性抗-EGFR/抗-IGF-1R抗体分子(scFab-XGFR；100nM)抑制H322M-细胞的增殖

实验程序

实施例

设计双特异性<EGFR-IGF-1R>抗体

根据本发明所述的结合EGFR和IGF-1R的双特异性抗体包含结合于EGFR的第一抗原结合位点和结合于IGF-1R的第二抗原结合位点。可以使用SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的重链可变结构域，和SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10的轻链可变结构域作为结合EGFR的第一抗原结合位点，所述重链可变结构域和轻链可变结构域都来自人源化的大鼠抗-EGFR抗体ICR62，其在WO 2006/082515中详细描述。

可以使用SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：24的重链可变结构域，和SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26的轻链可变结构域作为结合IGF-1R的第二抗原结合位点，所述重链可变结构域和轻链可变结构域都来自人抗-IGF-1R抗体<IGF-1R>HUMAB克隆18(DSM ACC 2587)或<IGF-1R>HUMAB克隆22(DSM ACC 2594)，其详细描述在WO 2005/005635中。

在下面所有的实施例1-20中，双特异性<EGFR-IGF-1R>抗体基于作为结合EGFR的第一抗原结合位点的SEQ ID NO：8的重链可变结构域，和SEQ ID NO：10的轻链可变结构域(来自人源化的<EGFR>ICR62)，并且基于作为结合IGF-1R的第二抗原结合位点的SEQ ID NO：23的重链可变结构域，和SEQ ID NO：25的轻链可变结构域(来自人抗-IGF-1R抗体<IGF-1R>HUMAB克隆18(DSM ACC 2587))。

A)设计具有scFv连接物(attachment)的双特异性<EGFR-IGF-1R>抗体(XGFR1和XGFR2命名法，指scFv-XGFR分子)

为了产生组合两种抗体特征的试剂，构建各种新的四价双特异性抗体来源的蛋白实体。在这些分子中，一种抗体的重组单链结合分子通过重组蛋白融合技术连接于另一种抗体，其保留全长IgG1的形式。该第二抗体具有需要的第二结合特异性。

基于人抗-IGF-1R抗体<IGF-1R>HUMAB克隆18(DSM ACC 2587)和衍生自SEQ ID NO：8的重链可变结构域(VH)和SEQ ID NO：10的轻链可变结构域(VL)的结合EGFR的单链Fv(scFv)的设计的形式的总结显示在图1中，并且在表1和2中列举。

通过基因合成和重组分子生物学技术，将SEQ ID NO：8的重链可变结构域(VH)和SEQ ID NO：10的轻链可变结构域(VL)通过甘氨酸丝氨酸(G4S)n单链接头连接从而提供结合EGFR的单链Fv(scFv)，其连接于抗-IGF-1R抗体<IGF-1R>HUMAB克隆18(DSM ACC 2587)轻链或重链的N端或C端的可变位置。此外，将半胱氨酸残基引入结合EGFR的scFv的VH结构域(包括Kabat位置44)和VL结构域(包括Kabat位置100)的不同位置，如前所述(例如，WO 94/029350；Reiter，Y.，等，自然生物技术(Nature biotechnology)14(1996)1239-1245；Young，N.，M.，等，FEBSLetters卷377(1995)135-139；或Rajagopal，V.，等，蛋白工程(ProteinEngineering)卷101453-59(1997)。随后，评估蛋白表达，稳定性和生物学活性。此外，在<IGF1R>抗体的重链或轻链的C端和结合EGFR的scFv之间的包含(甘氨酸4-丝氨酸)n的肽接头长度是变化的。此外，作为结合EGFR的单链Fv组件的完整部分的甘氨酸4-丝氨酸(G₄S)单链接头的长度是变化的。所有这些分子重组产生，纯化并表征。在表1和2中提供了用于产生四价双特异性<EGFR-IGF1R>抗体的所有双特异性抗体设计的总结。对于该研究，我们使用术语‘XGFR’来描述同时识别EGFR以及IGF1R并包含特异性结合EGFR或IGF1R之一的全长抗体以及特异性结合EGFR或IGF1R的另一个的两个scFv片段的各种蛋白实体。

表1-具有N端和C端scFv连接物的不同双特异性<EGFR-IGF1R>抗体形式，和相应的XGFR1-命名法和XGFR2-命名法。

XGFR1形式基于a)人抗-IGF-1R抗体<IGF-1R>HUMAB克隆18(DSM ACC 2587)和b)来自SEQ ID NO：8的重链可变结构域(VH)和SEQID NO：10的轻链可变结构域(VL)的两条结合EGFR的单链Fv(scFv)，其连接于抗-IGF-1R抗体<IGF-1R>HUMAB克隆18的重链(HC)或轻链(LC)的相同端(C端或N端)。

XGFR2形式基于a)人源化的大鼠抗-EGFR抗体ICR62的可变区VH(SEQ ID NO：8)和VL(SEQ ID NO：10)和b)结合抗-IGF-1R抗体<IGF-1R>HUMAB克隆18的人抗-IGF-1R抗体<IGF-1R>HUMAB克隆18(DSM ACC 2587)VH(SEQ ID NO：23)和VL(SEQ ID NO：25)的两条单链Fv(scFv)。

表中的“-“表示“不存在”

表2-具有可变的单链接头和肽接头长度的XGFR1双特异性抗体。表中的“-“表示“不存在”.

实施例1-8涉及具有scFv连接物的四价XGFR1和XGFR2分子B)设计具有单链Fab(scFab)连接物的四价、双特异性<EGFR-IGF-1R>抗体(scFab-XGFR1和scFab-XGFR2命名法)

术语scFab-XGFR用于描述同时识别EGFR以及IGF1R并包含特异性结合EGFR或IGF1R之一的全长抗体；和特异性结合EGFR或IGF1R的另一个的两个scFab片段的各种蛋白实体。

在下面本发明的一个实施方案中，列举了这样的四价双特异性抗体，其包含结合于第一抗原(IGF-1R或EGFR)的全长抗体，具有结合第二不同抗原(IGF-1R或EGFR的另一个)的两个单链Fab片段，所述单链Fab片段通过肽连接体连接于全长抗体(在重链的两个C端的两个单链Fab片段或在轻链的两个C端的两个单链Fab片段)。在所述单链Fab片段中的抗体结构域和接头具有从N端到C端方向的下列顺序：VL-CL-接头-VH-CH1。

使用SEQ ID NO：23作为<IGF-1R>抗原结合位点的重链可变结构域VH。使用SEQ ID NO：25作为<IGF-1R>抗原结合位点的轻链可变结构域VL。

使用SEQ ID NO：8作为<EGFR>抗原结合位点的重链可变结构域VH。使用SEQ ID NO：10作为<EGFR>抗原结合位点的轻链可变结构域VL。

通过基因合成和重组分子生物学技术，将包含各个抗原结合位点的VH和VL的VL-CL和VH-CH1通过甘氨酸丝氨酸(G4S)nGm接头连接从而提供单链Fab片段VL-CL-接头-VH-CH1，所述Fab片段使用(G4S)n肽连接体连接于抗体重链或轻链的C端。

任选地，根据前述技术(例如WO 94/029350；Reiter，Y.，等，自然生物技术(Nature biotechnology)(1996)1239-1245；Young，N.M.，等，FEBSLetters(1995)135-139；或Rajagopal，V.，et al，蛋白工程(ProteinEngineering)(1997)1453-59)将半胱氨酸残基引入单链Fab片段的VH(包括Kabat位置44)和VL(包括Kabat位置100)结构域。

将所有这些分子进行重组产生、纯化和表征并评估蛋白表达、稳定性和生物学活性。

在表3中提供用于产生四价、双特异性scFab<EGFR-IGF-1R>，<IGF-1R-EGFR>抗体的抗体设计的总结。对于该研究，我们使用术语‘scFab-Ab’来描述各种四价蛋白实体。将设计的形式的表示显示在图13和14中并在表3中列举。

表3-具有C端单链Fab片段连接物的不同的双特异性抗-IGF1R和抗-EGFR scFab-四价抗体形式和相应的scFab-Ab-命名法

实施例9-13涉及具有单链Fab连接物的四价scFab-XGFR1和scFab-XGFR2分子

材料和一般方法

在Kabat，E.A.，等，免疫目的的蛋白序列(Sequences of Proteins ofImmunological Interest)，第5版，公众健康服务(Public Health Service)，国家健康研究所(National Institutes of Health)，Bethesda，MD(1991)中提供关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息。根据EU编号(Edelman，G.M.，等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)63(1969)78-85；Kabat，E.A.，等，免疫目的的蛋白序列(Sequences of Proteinsof Immunological Interest)，第5版，公众健康服务(Public Health Service)，国家健康研究所(National Institutes of Health)，Bethesda，MD(1991)对抗体链的氨基酸进行编号和参考。

重组DNA技术

将标准方法用于操作DNA，如在Sambrook，J.，等，分子克隆：实验室手册(Molecular cloning：A laboratory manual)；冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，冷泉港，纽约，1989中所述。根据生产商的说明书使用分子生物学试剂。

基因合成

需要的基因片段制备自通过化学合成制备的寡核苷酸。侧邻单限制性内切酶切割位点的600-1800bp长基因片段通过退火和包括PCR扩增的寡核苷酸连接进行组装，并且将其随后通过指定的限制性酶切位点，例如BamHI/BstEII，BamHI/BsiWI，BstEII/NotI或BsiWI/NotI克隆到基于pUC克隆载体的pcDNA 3.1/Zeo(+)(Invitrogen)中。通过DNA测序证实亚克隆的基因片段的DNA序列。根据在Geneart(Regensburg，Germany)的指定说明对基因合成片段进行排序。

DNA序列确定

DNA序列通过在Sequiserve GmbH(Vaterstetten，Germany)进行的双链测序来确定DNA序列。

DNA和蛋白序列分析和序列数据处理

使用GCG′s(Genetics Computer Group，Madison，Wisconsin)软件包10.2版本和Invitrogens VectorNTl Advance suite版本9.1来用于序列产生、作图、分析、注释和举例说明。

细胞培养技术

如在细胞生物学中的当前方法(Current Protocols in Cell Biology)(2000)，Bonifacino，J.，S.，Dasso，M.，Harford，J.，B.，Lippincott-Schwartz，J.，和Yamada，K.，M.(编辑)，John Wiley & Sons，Inc中所述使用标准细胞培养技术。

在HEK293F细胞中的免疫球蛋白变体的瞬时表达

根据生产商的说明书，使用FreeStyle^TM 293表达系统(Invitrogen，USA)通过人胚肾293-F细胞的瞬时转染来表达双特异性抗体。简言之，将混悬液FreeStyle^TM 293-F细胞在FreeStyle^TM 293表达培养基中，在37℃/8％CO₂进行培养，并在转染当天将细胞以1-2x10⁶活细胞/ml的密度接种在新鲜的培养基中。使用333μl的293fectin^TM(Invitrogen，Germany)和250μg1∶1摩尔比率的重链和轻链质粒DNA在I培养基(Invitrogen，USA)中制备DNA-293fectin^TM复合物，最终转染体积为250ml。在转染后7天，通过在14000g离心30分钟并通过无菌滤器(0.22μm)过滤使包含双特异性抗体的细胞培养物上清液澄清。将上清液贮存在-20℃直到纯化。

蛋白确定

使用基于根据Pace，C.N.，等，蛋白科学(Protein Science)，4(1995)2411-1423的氨基酸序列计算的摩尔消光系数通过确定280nm的光密度(OD)(用在320nm的OD作为背景校正)，来确定纯化的抗体和衍生物的蛋白浓度。

在上清液中的抗体浓度确定

通过亲和HPLC层析法测量细胞培养物上清液中的抗体和衍生物的浓度。简言之，将包含结合蛋白A的抗体和衍生物的细胞培养物上清液施加到应用生物系统(Applied Biosystems)Poros A/20柱上，所述柱在200mM KH2PO4，100mM柠檬酸钠，pH7.4中，并在UltiMate 3000HPLC系统(Dionex)上，用200mM NaCl，100mM柠檬酸，pH2,5从基质中洗脱。通过UV吸光度并整合峰面积来量化洗脱的蛋白。将纯化的标准IgG1抗体用作标准。

蛋白纯化

通过使用蛋白A-琼脂糖^TM(Protein A-Sepharose^TM)(GE保健(GEHealthcare)，Sweden)的亲和层析法和Superdex200大小排阻层析法，以两个步骤，将分泌的抗体从上清液中纯化出来。简言之，将包含双特异性和三特异性抗体的澄清的培养物上清液施加到HiTrap ProteinA HP(5ml)柱上，所述柱用PBS缓冲液(10mM Na₂HPO₄，1mM KH₂PO₄，137mM NaCl和2.7mM KCl，pH 7.4)平衡。将未结合的蛋白用平衡缓冲液洗出。将双特异性抗体用0.1M柠檬酸盐缓冲液，pH 2.8洗脱，并将包含蛋白的级分用0.1ml 1M Tris，pH8.5中和。接着，合并洗脱的蛋白级分，用Amicon超离心滤器装置(MWCO：30K，Millipore)将其浓缩到3ml的体积，并负载到用20mM组氨酸，140mM NaCl，pH 6.0平衡的Superdex200HiLoad 120ml16/60凝胶过滤柱(GE保健(GE Healthcare)，Sweden)上。将单体抗体级分合并、快速冷冻并在-80℃贮存。提供样品的部分用于随后的蛋白分析和表征。

纯化的蛋白的分析

使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，通过测量280nm的光密度(OD)确定纯化的蛋白样品的蛋白浓度。通过在存在和不存在还原剂(5mM 1，4-二硫苏糖醇)进行SDS-PAGE，并用考马斯亮蓝进行染色来分析双特异性抗体的纯度。根据生产商的说明书使用Pre-Cast凝胶系统(Invitrogen，USA)(4-20％Tris-甘氨酸凝胶)。在25℃，使用在200mMKH₂PO₄，250mM KCl，pH7.0运行缓冲液中的Superdex 200分析大小排阻柱(GE保健(GE Healthcare)，Sweden)，通过在UltiMate 3000HPLC系统(Dionex)上的高效SEC分析双特异性抗体样品的团聚体含量。将25μg蛋白以0.5ml/min的流速注射到柱上，并在50分钟内等度洗脱。对于稳定性分析，制备0.1mg/ml，1mg/ml和3mg/ml浓度的纯化蛋白，并将其在4℃，37℃温育7天，接着通过高效SEC评估。在通过用肽-N-糖苷酶F(罗氏分子生物化学(Roche Molecular Biochemicals))酶促处理去除N-聚糖之后，通过NanoElectrospray Q-TOF质谱来证实还原的双特异性抗体轻链和重链的氨基酸主链的完整性。

实施例1

双特异性<EGFR-IGF1R>抗体XGFR1分子的表达和纯化

将相应的双特异性抗体的轻链和重链构建在携带原核和真核生物选择标记的表达载体中。将这些质粒在大肠杆菌中扩增，纯化，并随后转染从而在HEK293F细胞(使用Invitrogen’s自由系统(Invitrogen’s freesylesystem))中进行重组蛋白的瞬时表达。7天后，收获HEK 293细胞上清液，并将其通过蛋白A和大小排阻层析法纯化。通过在非还原和还原条件下的SDS-PAGE证实所有的双特异性抗体构建体的均一性。在还原条件下(图2a)，携带C端和N端scFv融合物的多肽链在SDS-PAGE上显示类似于计算的分子量的表观分子大小。通过蛋白AHPLC分析所有的构建体的表达水平，其类似于‘标准’IgGs的表达产率，或在一些情形中稍微更低。在这样的非最优化瞬时表达实验中(图3)，平均蛋白产率是每升细胞培养物上清液1-36mg的纯化蛋白。与N端附着的scFvs(XGFR1-3320和XGFR1-5320)相比，在轻链(XGFR-4320)或重链(XGFR-2320)具有C端融合的scFvs的非二硫化物稳定的构建体在蛋白A纯化后显示更高量的需要大小的回收蛋白。

纯化的蛋白的HP-大小排阻层析分析显示(与‘正常’IgGs比较)聚集包含未由VH和VL之间的链间二硫化物稳定的scFvs的分子的一些倾向。为了解决这些双特异性抗体聚集的问题，使用所述scFv结构部分的二硫化物稳定。对此，我们在指定位置(位置VH44/VL100，根据Kabat编号方案)引入scFv的VH和VL内的单半胱氨酸置换。这些突变能够形成VH和VL之间稳定的链间二硫化物，这又稳定得到的二硫化物稳定的scFv组件。将VH44/VL100二硫化物在Fv的N端和C端引入scFvs导致所有构建体的蛋白表达水平的提高(见图4)。

根据生产商的说明书，使用FreeStyle^TM 293表达系统(Invitrogen，USA)通过人胚肾293-F细胞的瞬时转染来表达双特异性抗体。简言之，将混悬液FreeStyle^TM 293-F细胞在FreeStyle^TM 293表达培养基中，在37℃/8％CO₂进行培养，并在转染当天将细胞以1-2x10⁶活细胞/ml的密度接种在新鲜的培养基中。使用333μl的293fectin^TM(Invitrogen，Germany)和250μg1∶1摩尔比率的重链和轻链质粒DNA在I培养基(Invitrogen，USA)中制备DNA-293fectin^TM复合物，最终转染体积为250ml。在转染后7天，通过在14000g离心30分钟并通过无菌滤器(0.22μm)过滤使包含双特异性抗体的细胞培养物上清液澄清。将上清液贮存在-20℃直到纯化。

通过使用蛋白A-琼脂糖^TM(Protein A-Sepharose^TM)(GE保健(GEHealthcare)，Sweden)的亲和层析法和Superdex200大小排阻层析法，以两个步骤，将分泌的抗体从上清液中纯化出来。简言之，将包含双特异性和三特异性抗体的澄清的培养物上清液施加到HiTrap ProteinA HP(5ml)柱上，所述柱用PBS缓冲液(10mM Na₂HPO₄，1mM KH₂PO₄，137mM NaCl和2.7mM KCl，pH7.4)平衡。将未结合的蛋白用平衡缓冲液洗出。将双特异性抗体用0.1M柠檬酸盐缓冲液，pH2.8洗脱，并将包含蛋白的级分用0.1ml 1M Tris，pH 8.5中和。接着，合并洗脱的蛋白级分，用Amicon超离心滤器装置(MWCO：30K，Millipore)将其浓缩到3ml的体积，并负载到用20mM组氨酸，140mM NaCl，pH 6.0平衡的Superdex200HiLoad 120ml 16/60凝胶过滤柱(GE保健(GE Healthcare)，Sweden)上。将单体抗体级分合并、快速冷冻并在-80℃贮存。提供样品的部分用于随后的蛋白分析和表征。

纯化后，XGFR1-2320具有0.27mg的最终产率，而XGFR1-2321具有13.8mg的最终产率。

双特异性抗体的示例性的SDS-PAGE和HP-大小排阻层析(SEC)纯化和分析显示在图3和图4中。

实施例2

双特异性<EGFR IGF 1R>抗体XGFR1分子的体外稳定性进行HP-大小排阻层析分析

在25℃，使用在200mM KH₂PO₄，250mM KCl，pH 7.0运行缓冲液中的Superdex 200分析大小排阻柱(GE保健(GE Healthcare)，Sweden)，通过在UltiMate 3000HPLC系统(Dionex)上的高效SEC分析双特异性抗体样品的团聚体含量。将25μg蛋白以0.5ml/min的流速注射到柱上，并在50分钟内等度洗脱。对于稳定性分析，制备0.1mg/ml，1mg/ml和5mg/ml浓度的纯化蛋白，并将其在4℃，37℃和40℃温育7天或28天，接着通过高效SEC评估。在通过用肽-N-糖苷酶F(罗氏分子生物化学(RocheMolecular Biochemicals))酶促处理去除N-聚糖之后，通过NanoElectrosprayQ-TOF质谱来证实还原的双特异性抗体轻链和重链的氨基酸主链的完整性。

在不同条件(不同的浓度和时间)下纯化的蛋白的HP-大小排阻层析分析显示-与正常IgGs-0比较，包含scFvs的分子聚集倾向大大增加。

对于该项工作，我们限定需要的“单体分子”由重链和轻链的2个杂二聚体组成，其中scFvs连接于重链或轻链。

与包含未修饰的scFvs的实体的强烈聚集倾向相比，VH44/VL100二硫化物稳定的构建体的HP大小排阻分析显示聚集的倾向小得多。

双特异性抗体的示例性HP-大小排阻层析(SEC)纯化和分析显示在图4中。

实施例3

双特异性<EGFR-IGF1R>抗体XGFR1分析与RTKs EGFR和IGF1R的同时结合

将scFv组件的结合和保留在不同的双特异性抗体形式的IgG-组件中的Fvs的结合与结合组件和双特异性抗体来自其中的‘野生型’IgGs的结合进行比较。通过应用表面等离振子共振(Surface Plasmon Resonance)(Biacore)，以及细胞-ELISA进行这些分析。

使用Biacore T100仪器(Biacore AB，Uppsla)，通过表面等离振子共振(SPR)技术来分析双特异性抗-IGF-1R/抗-EGFR抗体的结合性质。充分建立该系统用于研究分子相互作用。这允许在各种测定法设置中持续实时监测配体/分析物结合并因此确定缔合速率常数(ka)，解离速率常数(kd)，和平衡常数(KD)。SPR-技术基于对接近金包被的生物传感器芯片表面的折射率的测量。折射率的改变指示由固定的配体和溶液中注射的分析物的相互作用导致的表面上的质量改变。如果分子结合于在表面上的固定的配体，质量增加，如果解离，则质量减少。

使用胺-偶联的化学原理，将捕获抗-人IgG抗体固定在CM5生物传感器芯片的表面上。用0.1M N-羟基琥珀酰亚胺和0.1M 3-(N，N-二甲基氨基)丙基-N-乙基碳二亚胺的1∶1混合物以5μl/min的流速激活流动细胞。将抗-人IgG抗体以10μg/ml注射到乙酸钠，pH 5.0中，这导致约12000RU的表面密度。将参照对照流动细胞以相同的方式处理，但是仅以赋形剂缓冲液取代捕获抗体。将表面用1M乙醇胺/HCl pH 8.5的注射剂进行封闭。将双特异性抗体在HBS-P中稀释，并以5μl/min的流速注射。关于EGFR-ECD结合，对于1-5nM浓度的抗体，接触时间(缔合阶段)是1分钟，而关于

关于IGF-1R相互作用，对于20nM浓度的抗体，接触时间(缔合阶段)是1分钟。以3.125，6.25，12.5，25，50和100nM的增加浓度注射EGFR-ECD，以0.21，0.62，1.85，5.6，16.7和50nM的浓度注射IGF-1R。对于流速为30μl/min的两种分子，接触时间(缔合阶段)是3分钟，解离时间(用运行缓冲液洗涤)是5分钟。在25℃(标准温度)进行所有的相互作用。在每个结合周期后，以5μl/min的流速注射3M氯化镁的再生溶液达60秒从而去除任何未共价结合的蛋白。以每秒1个信号的速率检测信号。以增加的浓度注射样品。

将双特异性抗体与EGFR和IGF1R的示例性同时结合显示在图5中。

表4-双特异性抗体(XGFR-命名法)与EGFR和IGF-1R的亲和性(KD)

实施例4

双特异性<EGFR-IGF 1R>抗体XGFR1分子对EGFR-以及IGF1R的下调

人抗-IGF-1R抗体<IGF-1R>HUMAB克隆18(DSM ACC 2587)抑制IGFR1-信号传导和人源化的大鼠抗-EGFR抗体<EGFR>ICR62抑制EGFR的信号传导。为了评估不同的XGFR1变体的潜在抑制活性，分析这两者下调受体的程度。

为了检测本发明的抗体对肿瘤细胞中的IGF-I受体(IGF-IR)的量的效果，用IGF-IR和EGFR特异性抗体进行时程实验和随后的ELISA分析。

将人肿瘤细胞(A549，2x 10⁵细胞/ml)培养在补充了1％PenStrep的RPMI-VM培养基(PAA，批号E15-039)(在一个6孔板中)中，并关于每个实验用4ml细胞接种在各个培养基中，在37℃和5％CO₂培养24小时。

将培养基小心去除，并用稀释在RPMI-VM培养基中的2ml 0.01mg/ml XGFR抗体取代。在3个对照孔中，用无抗体的培养基、具有对照抗体的培养基(<IGF-1R>HUMAB克隆18和<EGFR>ICR62，终浓度0.01mg/ml)取代培养基，并且一个孔仅包含缓冲液。将细胞在37℃和5％CO₂培育，并且在24小时后取出每个板进行进一步处理。

将培养基通过抽吸小心去除，并将细胞用1ml PBS洗涤。加入300μl/孔的冷MES-裂解缓冲液(MES，10mM Na₃VO₄，和蛋白酶抑制剂)。使用细胞刮器(Corning，Cat.No.3010)使细胞脱离，并将孔的内容物转移到Eppendorf反应管中。通过在13000rpm和4℃离心10分钟来去除细胞碎片。

对于EGFR检测

根据方案(对于人EGFR的DuoSet ELISA，RnD系统批号DY231)制备96孔链霉抗生物素蛋白微量滴定板(MTP)。将在PBS中的人EGFR山羊抗体144μg/ml以1∶180稀释在PBS中，并以100μl/孔加入MTP中。将MTP在4℃温育过夜，伴随搅动。将所述板用补充了0.1％20的PBS洗涤3次，并用300μl/孔的具有3％BSA和0.1％20溶液的PBS在室温(RT)封闭1小时，伴随搅动。将所述板用补充了0.1％20的PBS洗涤3次。

使用BCA蛋白测定试剂盒(皮尔斯(Pierce))确定细胞裂解物中蛋白的量，接着将细胞裂解物用补充了100mMNa₃VO₄1∶100和蛋白酶抑制剂1∶20的MES-裂解缓冲液调节到0.1mg/ml的蛋白浓度，并将100μl/孔的裂解物加入预先制备的MTP中。

所用的第二细胞裂解物浓度是0.05mg/ml，并且裂解物被稀释1∶2，以100μl/孔加入预先制备的MTP中。将MTP在室温再温育2小时，伴随搅动，接着用具有0.1％20溶液的PBS将其洗涤3次。

用于EGFR的检测抗体是浓度为36μg/ml的人EGFR山羊生物素化的抗体，其以1∶180稀释在具有3％BSA和0.2％20的PBS中。加入100μl/孔，并在室温温育2小时，伴随搅动。接着将MTP用200μl/孔的具有0.1％20溶液的PBS洗涤3次。接着加入次级抗体，在具有3％BSA和0.2％20的PBS中的1∶200链霉抗生物素蛋白-HRP，加入100μl/孔并在室温温育20分钟，伴随搅动。接着，将所述板用具有0.1％20溶液的PBS洗涤6次。加入100μl/孔的3，3’-5，5’-四甲基联苯胺(Roche，BM-Blue ID-No.：11484581)并将其在室温温育20分钟，伴随搅动。通过加入25μl/孔的1M H₂SO₄终止颜色反应，并在室温再温育5分钟。在450nm测量吸光度。

对于IGF-1R检测

通过加入100μl/孔的AK1a-生物素化的抗体(Genmab，Denmark)制备链霉抗生物素蛋白-MTP(Roche ID.No.：11965891001)，将所述抗体在具有3％BSA和0.2％20的PBS中以1∶200稀释。将链霉抗生物素蛋白-MTP在室温温育1小时，伴随搅动，接着用200μl/孔的具有0.1％20溶液的PBS洗涤3次。

使用BCA蛋白测定试剂盒(皮尔斯(Pierce))确定细胞裂解物中蛋白的量，接着将细胞裂解物用50mM Tris pH7.4，100mM Na₃VO₄1∶100和蛋白酶抑制剂1∶20调节到0.04mg/ml的蛋白浓度，并将100μl/孔的裂解物加入预先制备的链霉抗生物素蛋白-MTP中。

所用的第二细胞裂解物浓度为0.02mg/ml，稀释裂解物，并以100μl/孔加入预先制备的链霉抗生物素蛋白-MTP中。将包含未刺激细胞的阳性对照在补充了50mM Tris pH7.4，100mM Na₃VO₄1∶100和蛋白酶抑制剂1∶20的裂解缓冲液中稀释到1∶4000并将100μl/孔的裂解物加入预先制备的链霉抗生物素蛋白-MTP中。对于阴性对照，将100μl裂解缓冲液加入在链霉抗生物素蛋白-MTP的孔中。

将MTP在室温再温育1小时，伴随搅动，接着用具有0.1％20溶液的PBS洗涤3次。

关于IGF-1R的检测抗体是人IGF-1Rβ兔抗体(圣克鲁斯生物技术(Santa Cruz Biotechnology)，批号sc-713)，其在具有3％BSA和0.2％20的PBS中以1∶750稀释。以100μl/孔加入，并将其在室温温育1小时，伴随搅动。接着，将MTP用200μl/孔的具有0.1％20溶液的PBS洗涤3次。接着，加入次级抗体，在具有3％BSA和0.2％20的PBS中的1∶4000的兔IgG-POD(细胞信号传导(Cell signaling)批号7074)，以100μl/孔加入，并将其在室温温育1小时，伴随搅动。接着，将所述板用具有0.1％20溶液的PBS洗涤6次。加入100μl/孔的3，3’-5，5’-四甲基联苯胺(Roche，BM-Blue ID-No.：11484581)并将其在室温温育20分钟，伴随搅动。通过加入25μl/孔的1M H₂SO₄终止颜色反应，并在室温再温育5分钟。在450nm测量吸光度。

图12显示了在A549细胞中，双特异性抗体XGFR与母体单特异性抗体<EGFR>ICR62和<IGF-1R>HUMAB-克隆18比较的受体下调检测的结果。双特异性抗体XGFR下调EGFR以及IGF1R。令人惊奇的是，双特异性抗体XGFR与母体<EGFR>ICR62抗体比较显示了提高的下调EGFR。

实施例5

双特异性<EGFR IGF1R>抗体XGFR1分子抑制EGFR以及IGF1R信号传导途径

人抗-IGF-1R抗体<IGF-1R>HUMAB克隆18(DSMACC 2587)抑制IGFR1-信号传导并且人源化的大鼠抗-EGFR抗体ICR62抑制EGFR的信号传导。为了评估不同的XGFR1变体的潜在抑制活性，分析针对两种途径的信号传导的抑制程度。

将人肿瘤细胞(H322M，2x 10⁵细胞/ml)培养在补充了1％PenStrep的RPMI培养基(PAA，批号E15-039)(在一个6孔板中)中，并关于每个实验用4ml细胞接种在各个培养基中，在37℃和5％CO₂培养24小时。

将培养基小心去除，并用稀释在RPMI-VM培养基中的2ml 0.01mg/ml XGFR抗体取代。在3个对照孔中，用无抗体的培养基、具有对照抗体(<IGF-1R>HUMAB克隆18和<EGFR>ICR62，终浓度0.01mg/ml)的培养基取代培养基，并且一个孔仅包含缓冲液。将细胞在37℃和5％CO₂培育，并且在24小时后取出每个板进行进一步处理。

关于EGFR磷酸化检测

使用IC人Phospho-EGF R，RnD系统批号DYC1095-5。所述板通过将Phospho EGF R捕获抗体(批号841402)稀释到0.8μg/ml的浓度进行制备。加入100μl/孔的MTP，密封板，并将其在室温温育过夜。

接着，将捕获抗体吸出，将每个孔用400μl洗涤缓冲液(0.05％在PBS中的20，pH 7.2-7.4批号WA126)洗涤5次，在最后一次洗涤后，在干净的纸巾上将所述板吸干。

将所述板通过加入300μl的封闭缓冲液(1％BSA，在PBS中的0.05％NaN₃pH 7.2-7.4)封闭，并在室温温育2小时。接着，吸出溶液，并将每个孔用400μl洗涤缓冲液(0.05％在PBS中的20pH 7.2-7.4批号WA126)洗涤5次，在最后一次洗涤后，在干净的纸巾上将所述板吸干。

将细胞用PBS漂洗，并用裂解缓冲液9(1％NP-40，20mM Tris pH8.0，137mM NaCl，10％甘油，2mM EDTA，1mM活化的原钒酸钠，10μg/ml牛胰蛋白酶抑制剂和10μg/ml抑酶醛肽)，以1x 10⁷细胞/ml的细胞密度裂解细胞，并将细胞在4℃温育30分钟，伴随轻微搅动。接着将所述样品在14,000g离心5分钟。接着，将样品转移到清洁的测试管中。

使用BCA蛋白测定试剂盒(皮尔斯(Pierce))确定细胞裂解物中蛋白的量，接着用IC稀释剂12(1％NP-40，20mM Tris pH8.0，137mM NaCl，10％甘油，2mM EDTA，1mM活化的原钒酸钠)将细胞裂解物调节到0.1mg/ml和0.05mg/ml的蛋白浓度。将100μl/孔的裂解物加入预先制备的MTP中，并将所述板密封，并在室温温育2小时。

在使用之前，立即将检测抗体在IC稀释剂14(20mM Tris，137mMNaCl，0.05％20，0.1％BSA，pH 7.2-7.4)中稀释到瓶上制定的工作浓度。将100μl的检测抗体加入每孔中，将所述板密封，并在室温在暗处温育2小时。接着，吸出检测抗体，并将每个孔用400μ1洗涤缓冲液(在PBS中的0.05％20pH 7.2-7.4批号WA126)洗涤5次，在最后一次洗涤后，在干净的纸巾上将所述板吸干。

将100μl的底物溶液(批号DY999)加入每孔中，并将所述板在暗处再温育20分钟。通过加入50μl终止溶液2N H₂SO₄(批号DY994)并彻底混合来终止反应。

测量在450nm的吸光度。

关于IGF-1R磷酸化检测

通过加入100μl/孔的AK1a-生物素化的抗体(Genmab，Denmark)制备链霉抗生物素蛋白-MTP(Roche ID.No.：11965891001)，将所述抗体在具有3％BSA和0.2％20的PBS中以1∶200稀释。将链霉抗生物素蛋白-MTP在室温温育1小时，伴随搅动，接着用200μl/孔的具有0.1％20溶液的PBS洗涤3次。

使用BCA蛋白测定试剂盒(皮尔斯(Pierce))确定细胞裂解物中蛋白的量，接着将细胞裂解物用50mM Tris pH7.4，100mM Na₃VO₄1∶100和蛋白酶抑制剂1∶20调节到1μM的蛋白浓度，并将100μl/孔的裂解物加入预先制备的链霉抗生物素蛋白-MTP中。

将包含未刺激细胞的阳性对照在补充了50mM Tris pH7.4，100mMNa₃VO₄1∶100和蛋白酶抑制剂1∶20的裂解缓冲液中稀释到1∶4000并将100μl/孔的裂解物加入预先制备的链霉抗生物素蛋白-MTP中。对于阴性对照，将100μl裂解缓冲液加入在链霉抗生物素蛋白-MTP的孔中。

将MTP在室温再温育1小时，伴随搅动，接着用具有0.1％20溶液的PBS洗涤3次。

关于IGF-1R的检测抗体是人IGF-1R(Tyr1135/1136)/胰岛素受体β(Tyr1150/1151)(19H7)抗体(细胞信号传导(Cell signalling)，批号3024L)，其在具有3％BSA和0.2％20的PBS中以1∶500稀释。以100μl/孔加入，并将其在室温温育1小时，伴随搅动。接着，将MTP用200μl/孔的具有0.1％20溶液的PBS洗涤3次。接着，加入次级抗体，在具有3％BSA和0.2％20的PBS中的1∶4000的兔IgG-POD(细胞信号传导(Cell signaling)批号7074)，以100μl/孔加入，并将其在室温温育1小时，伴随搅动。接着，将所述板用具有0.1％20溶液的PBS洗涤6次。加入100μl/孔的3，3’-5，5’-四甲基联苯胺(Roche，BM-BlueID-No.：11484581)并将其在室温温育20分钟，伴随搅动。通过加入25μl/孔的1M H₂SO₄终止颜色反应，并在室温再温育5分钟。在450nm测量吸光度。

图7a和7b显示施用<IGF-1R>HUMAB-克隆18在IGFR1-信号传导测定中强烈减少特异性磷酸化信号，但是在测量EGFR-信号传导的相应测定中没有效果。反之亦然，施用<EGFR>ICR62在EGFR-信号传导测定中减少了特异性磷酸化信号，但是在测量IGF1R-信号传导的相应测定中则没有显示效果。当以相同的摩尔浓度施用到相同的测定法中时，XGFR1变体#2421，3421，和4421在两种测定法中显示与野生型抗体相同或更好的活性。因此，XGFR1分子能够干扰两种信号传导途径。

实施例6

XGFR1介导的对肿瘤细胞系的体外生长抑制

人抗-IGF-1R抗体<IGF-1R>HUMAB克隆18(DSMACC 2587)抑制表达IGF1R的肿瘤细胞系的生长(WO 2005/005635)。以类似的方式，人源化的大鼠抗-EGFR抗体<EGFR>ICR62显示抑制表达EGFR的肿瘤细胞系的生长(WO2006/082515)。为了评估不同的XGFR1变体在肿瘤细胞系的生长测定中的潜在抑制活性，分析了在表达EGFR以及IGF1R的H322M细胞中的抑制程度。

将H322M细胞在聚-HEMA(聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯))包被的培养皿上，在补充了0.5％FCS的RPMI 1640培养基中培养从而防止粘附于塑料表面。在这些条件下，H322M细胞形成致密的球体，其以三维生长(被称为贴壁不依赖性的性质)。这些球体非常类似于原位实体瘤的三维组织结构和组织。在存在自50或100nM增加量的抗体时，将球体培养物温育5天。将WST转化测定法用于测量生长抑制。当将H322M球体培养物用<IGF-1R>HUMAB-克隆18处理时，观察到生长抑制。

图8显示施用50nM<IGF-1R>HUMAB-克隆18减少细胞生长达53％，而在相同测定中，施加50nM<EGFR>ICR62减少了细胞生长达53％。

同时施用两种抗体(以相同的浓度)导致细胞存活力进一步减少到26％(74％抑制)。这说明与仅干扰一种途径相比，同时干扰两种RTK途径对于肿瘤细胞系具有更明显的影响。

以50nM的摩尔浓度施用各种XGFR1-变体导致更高的生长抑制，其比用50nM浓度的单一分子观察到的抑制更加明显。

事实上，在50nM的抗体浓度，与在100nM的双倍抗体浓度的原始<EGFR>和<IGF1R>抗体的组合(50nM<IGF-1R>HUMAB-克隆18和50nM<EGFR>ICR62)比较，各种XGFR1-变体显示提高的抗增殖活性。

我们得出结论，即与干扰EGFR信号传导或IGF1R信号传导的IgGs比较，XGFR1分子具有明显增加的生长抑制活性。而且，如果比较XGFR1分子的活性与<IGF-1R>HUMAB-克隆18和<EGFR>ICR62抗体的混合物的活性，可以在明显比所述混合物更低的浓度(摩尔和质量)获得相同或更好的活性。

表5-双特异性抗体(XGFR-命名法)针对H322M肿瘤细胞的抗增殖活性(存活和抑制)

实施例7

制备糖改造XGFR1-2421，XGFR1-3421，XGFR1-4421和XGFR1-5421的衍生物(XGFR1-2421-GE，XGFR1-3421-GE，XGFR1-4421-GE和XGFR1-5421-GE)

将得到的完整抗体重链和轻链DNA序列亚克隆到哺乳动物表达载体(一种对于轻链的，一种对于重链的)在MPSV启动子控制之下和合成的聚腺苷酸位点上游，每个载体携带EBV OriP序列。

通过将HEK293-EBNA细胞用哺乳动物抗体重链和轻链表达载体使用磷酸钙-转染方法共转染，生产抗体。指数生长的HEK293-EBNA细胞通过磷酸钙方法转染。为了生产未修饰的抗体，仅用比率为1∶1的抗体重链和轻链表达载体转染细胞。为了生产糖改造的抗体，将细胞用四个质粒共转染，两个用于抗体表达，一个用于融合GnTIII多肽表达，和一个用于甘露糖苷酶II表达，各自比率为4∶4∶1∶1。将细胞在T摇瓶中作为贴壁单层培养物培养，使用补充有10％FCS的DMEM培养基，并且当它们在50％和80％汇合之间时转染。对于T75烧瓶的转染，在转染前24小时将8百万个细胞接种于添加了FCS(于10％V/V终浓度)，250μg/ml新霉素的14ml DMEM培养基中，并将细胞于37℃置于具有5％CO₂气氛的培养箱中过夜。对于每个待转染的T75烧瓶，通过将在轻链和重链表达载体之间平分的47μg总质粒载体DNA，235μl的1M CaCl₂溶液混合，并加水至终体积469μl而制备DNA、CaCl₂和水的溶液。向此溶液中加入469μl的50mM HEPES，280mM NaCl，1.5mM Na₂HPO₄溶液pH 7.05，立即混合10秒并留置于室温20秒。用添加了2％FCS的12ml DMEM稀释混悬液，并加入到T75中代替现有的培养基。将细胞于37℃，5％CO₂温育约17到20小时，随后以12ml DMEM，10％FCS置换培养基。在转染后5-7天收获条件培养基，在1200rpm离心5分钟，接着在4000rpm第二次离心10分钟，并保持在4℃。

通过蛋白质A亲和层析，接着阳离子交换层析和最后大小排阻层析步骤在Superdex 200柱(Amersham Pharmacia)上交换缓冲液至磷酸盐缓冲溶液和收集纯单体IgG1抗体来纯化分泌的抗体。利用分光光度计由280nm上的吸光度来估计抗体浓度。在pH 6.7的25mM磷酸钾，125mM氯化钠，100mM甘氨酸溶液中配制抗体。

通过共转染以下各项来生产人源化抗体的糖改造的变体：抗体表达质粒以及GnT-III糖基转移酶表达载体，或以及GnT-III表达载体加上高尔基甘露糖苷酶II表达载体。糖改造的抗体的纯化和配制如上关于非糖改造的抗体所述。与抗体Fc区域连接的寡糖通过下述MALDI/TOF-MS分析。

通过PNGaseF消化从抗体中酶促释放出寡糖，其中抗体固定于PVDF膜上或在溶液中。

对得到的含有释放的寡糖的消化溶液直接进行制备用于MALDI/TOF-MS分析或在样品制备之前用EndoH糖苷酶进一步消化以进行MALDI/TOF-MS分析。

对于所有的根据本发明所述的双特异性抗体，GE意为糖改造。

实施例8

XGFR1分子与FcgRIIIa的结合和ADCC能力

未糖基化修饰的人源化的大鼠抗-EGFR抗体ICR62(来自WO 2006/082515)不仅通过干扰RTK介导的生长刺激信号，而且还在显著程度上通过诱导肿瘤细胞上的ADCC来介导其抗肿瘤活性。以类似的方式，其它的抗体，如抗-IGF-1R抗体<IGF-1R>HUMAB克隆18也能够诱导ADCC。由给定抗体介导的ADCC的程度不仅依赖于结合的抗原，还依赖于恒定区与FcgRIIIa的亲和性，所述FcgRIIIa已知是引发ADCC反应的Fc受体。

因为ADCC是XGFR1分子需要的机制，重要的是这些分子可以以与‘正常’抗体相同的方式结合FcgRIIIa，并且这些分子具有良好的ADCC能力。为了分析各种XGFR1分子与bFcgRIIIa的结合，我们应用了以前建立的Biacore技术(参考)。通过这种技术，评估了XGFR1-分子与重组产生的FcgRIIIa结构域的结合。

在25℃，在BIAcore 3000仪器(GE保健生物科学AB(GE HealthcareBiosciences AB)，Sweden)上进行了所有的表面等离振子共振测量。运行和稀释缓冲液是PBS(1mM KH₂PO₄，10mM Na₂HPO₄，137mM NaCl，2.7mM KCl)，pH6.0，0.005％(v/v)Tween20。将可溶的人FcgRIIIa在10mM柠檬酸钠，pH 5.0中稀释，并使用标准的胺偶联试剂盒(GE保健生物科学AB(GE Healthcare Biosciences AB)，Sweden)固定在CM5生物传感器芯片上从而获得约1000RU的FcgRIIIa表面密度。在固定过程中，将HBS-P(10mM HEPES，pH 7.4，150mM NaCl，0.005％表面活性剂P20；GE保健生物科学AB(GE Healthcare Biosciences AB)，Sweden)用作运行缓冲液。将XGFR双特异性抗体用PBS，0.005％(v/v)Tween20，pH6.0稀释到450nM的浓度，并以30μl/分钟的流速在3分钟内注射。接着，将传感器芯片用PBS，pH8.0，0.005％(v/v)Tween20再生1分钟。用BIA评估软件(BIAcore，Sweden)进行数据分析。

将这些实验的结果总结在表7中。

表6-双特异性抗体(XGFR-命名法)与FcγRIIIa和FcRn的结合亲和性

这些分析揭示针对无抗原结合的XGFR1分子与FcgRIIIa的结合与野生型IgG1分子的结合不可区分。因此，这些生化测定法表示无抗原结合的XGFR1-2421，和XGFR1-4421结合ADCC-介导的受体FcgRIIIa的完全的能力。

在存在抗原时使用XGFR1分子进行这些实验的重复性揭示对于可溶性FcgRIII结合的能力没有影响。

用通过前述技术(Umana，P.，等自然生物技术(Nature Biotechnol).17(1999)176-180和WO 99/54342)已经进行糖修饰的XGFR1-分子(见实施例7)进行另一组这样的Biacore实验。这种糖修饰增加了Fc-区域与FcgRIIIa的亲和性，并由此增加了靶细胞上的ADCC。比较无抗原结合的糖修饰的XGFR1-分子的FcgRIIIa-结合能力与无抗原结合的糖修饰的野生型IgG的FcgRIIIa-结合能力显示无抗原结合的糖修饰的XGFR1分子与野生型抗体相比具有增加的结合亲和性。

表7-双特异性抗体(XGFR-命名法)与FcγRIIIa和FcRn的结合亲和性

分子	与FcγRIIIa的亲和性	与FcRn的结合亲和性
			XGFR1-2421-GE	是	是
XGFR1-3421-GE	是	是
			XGFR1-4421-GE	是	是
XGFR1-5421-GE	是	是

为了分析XGFR1-分子与FcgRIIIa的结合能力也转化为针对肿瘤细胞的体外ADCC活性的程度，我们在细胞测定法中确定ADCC能力。对于这些测定法，制备XGFR1-2421，XGFR1-3421，XGFR1-4421和XGFR1-5421的糖修饰的衍生物(XGFR1-2421-GE，XGFR1-3421-GE，XGFR1-4421-GE和XGFR1-5421-GE)(见实施例6)，并将其在前述BIAcore ADCC-能力测定形式以及下述的体外ADCC测定法中进行测试。

将人外周血单核细胞(PBMC)用作效应细胞并利用Histopaque-1077(Sigma Diagnostics Inc.，St.Louis，MO63178USA)以及基本上按照生产商的说明书进行制备。简言之，以肝素化的注射器从健康志愿者体内取静脉血。用PBS(不含Ca⁺⁺或Mg⁺⁺)将血液稀释1∶0.75-1.3并铺于Histopaque-1077上。将梯度于室温(RT)以400x g不间断离心30分钟。收集含有PBMC的中间相并用PBS进行洗涤(来自两种梯度的每一种的细胞50ml)并通过于RT以300x g离心10分钟进行收集。在用PBS重悬沉淀物后，对PBMC计数并通过于RT以200x g离心10分钟进行第二次洗涤。随后将细胞重悬于适当的培养基中以便进行接下来的操作。

对于PBMC而言，用于ADCC测定的效应细胞与靶标的比率是25∶1。于适当的浓度在AIM-V培养基中制备效应细胞以便加入50微升/圆底96孔板的孔。靶细胞是生长于含有10％FCS的DMEM中的人EGFR/IGFR表达细胞(例如，H322M，A549，或MCF-7)。在PBS中洗涤靶细胞，计数并以0.3百万/ml重悬于AIM-V中以便以100μl/微孔加入30,000细胞。将抗体稀释在AIM-V中，加入50μl到预铺板的靶细胞中并让其于RT结合靶标10分钟。随后加入效应细胞并于37℃在含有5％CO₂的加湿气氛中将板温育4小时。通过使用细胞毒性检测试剂盒(罗氏诊断(RocheDiagnostics)，Rotkreuz，Switzerland)测量由受损细胞释放的乳酸脱氢酶(LDH)来评估靶细胞的杀伤。在4小时的温育后将板于800x g进行离心。将来自每孔中的100μl上清液转移到新的透明平底96孔板中。每孔加入100μl来自试剂盒的颜色底物缓冲液。使用SOFTmax PRO软件(分子装置(Molecular Devices)，Sunnyvale，CA94089，USA)，在ELISA读数器中于490nm测定颜色反应的Vmax值至少10min。由只包含靶和效应细胞但不包含抗体的孔测定自发的LDH释放。由只包含靶细胞和1％Triton X-100的孔测定最大释放。将特异性抗体介导的杀伤百分比计算如下：((x-SR)/(MR-SR)*100，其中x是在特定抗体浓度上Vmax的平均值，SR是自发释放的Vmax的平均值，而MR是最大释放的Vmax的平均值。

在这些测定中，还将ADCC能力与糖修饰的野生型抗体的ADCC能力比较。这些测定的结果显示关于糖修饰的XGFR1-3421-GE/XGFR1-4421-GE/XGFR1-5421-GE的优良的ADCC能力(见图9)。

实施例9

双特异性<EGFR-IGF1R>抗体scFab-XGFR1分子的表达与纯化

将相应的双特异性抗体的轻链和重链构建在携带原核和真核生物选择标记的表达载体中。将这些质粒在大肠杆菌中扩增，纯化，并随后转染从而在HEK293F细胞(使用Invitrogen’s自由系统(Invitrogen’s freesylesystem))中进行重组蛋白的瞬时表达。7天后，收获HEK 293细胞上清液，并将其通过蛋白A和大小排阻层析法纯化。通过在非还原和还原条件下的SDS-PAGE证实所有的双特异性抗体构建体的均一性。在还原条件下(图15)，携带C端和N端scFab融合物的多肽链在SDS-PAGE上显示类似于计算的分子量的表观分子大小。通过蛋白AHPLC分析所有的构建体的表达水平，其类似于‘标准’IgGs的表达产率，或在一些情形中稍微更低。在这样的非最优化瞬时表达实验中，平均蛋白产率是每升细胞培养物上清液1.5-10mg的蛋白(图13和14)。

纯化的蛋白的HP-大小排阻层析分析显示重组分子聚集的某些倾向。为了解决这些双特异性抗体聚集的问题，使用另外的结合结构部分的VH和VL之间的二硫化物稳定。对此，我们在指定位置(位置VH44/VL100，根据Kabat编号方案)引入scFab的VH和VL内的单半胱氨酸置换。这些突变能够形成VH和VL之间稳定的链间二硫化物，这又稳定得到的二硫化物稳定的scFab组件。将VH44/VL100二硫化物引入scFabs并没有显著干扰蛋白表达水平，并且在一些情形中，甚至提高表达产率(见图13和14)。

根据生产商的说明书，使用FreeStyle^TM 293表达系统(Invitrogen，USA)通过人胚肾293-F细胞的瞬时转染来表达双特异性抗体。简言之，将混悬液FreeStyle^TM 293-F细胞在FreeStyle^TM 293表达培养基中，在37℃/8％CO₂进行培养，并在转染当天将细胞以1-2x10⁶活细胞/ml的密度接种在新鲜的培养基中。使用333μl的293fectin^TM(Invitrogen，Germany)和250μg1∶1摩尔比率的重链和轻链质粒DNA在I培养基(Invitrogen，USA)中制备DNA-293fectin^TM复合物，最终转染体积为250ml。在转染后7天，通过在14000g离心30分钟并通过无菌滤器(0.22μm)过滤使包含重组抗体衍生物的细胞培养物上清液澄清。将上清液贮存在-20℃直到纯化。

通过使用蛋白A-琼脂糖^TM(Protein A-Sepharose^TM)(GE保健(GEHealthcare)，Sweden)的亲和层析法和Superdex200大小排阻层析法，以两个步骤，将分泌的抗体衍生物从上清液中纯化出来。简言之，将包含双特异性和三特异性抗体的澄清的培养物上清液施加到HiTrap ProteinA HP(5ml)柱上，所述柱用PBS缓冲液(10mM Na₂HPO₄，1mM KH₂PO₄，137mMNaCl和2.7mM KCl，pH 7.4)平衡。将未结合的蛋白用平衡缓冲液洗出。将抗体衍生物用0.1M柠檬酸盐缓冲液，pH 2.8洗脱，并将包含蛋白的级分用0.1ml 1M Tris，pH 8.5中和。接着，合并洗脱的蛋白级分，用Amicon超离心滤器装置(MWCO：30K，Millipore)将其浓缩到3ml的体积，并负载到用20mM组氨酸，140mM NaCl，pH 6.0平衡的Superdex200HiLoad 120ml 16/60凝胶过滤柱(GE保健(GE Healthcare)，Sweden)上。将单体抗体级分合并、快速冷冻并在-80℃贮存。提供样品的部分用于随后的蛋白分析和表征。纯化蛋白的示例性的SDS-PAGE分析和双特异性抗体衍生物的HP-大小排阻层析(SEC)图谱显示在图15和图16中。

图13和14列出了在瞬时表达系统中观察到的表达产率：所有指定的抗体衍生物可以以充足的量进行表达和纯化以进行进一步的分析。每升上清液的表达产率范围在少于1mg到＞30mg。例如，scFab-XGFR1-2720在纯化后具有少于1mg的最终产率，而scFab-XGFR1-2721具有13.8mg的最终产率。这种差异还显示VH44-VL100二硫化物稳定对我们对于某些蛋白观察到的表达产率的正向影响。

实施例10

双特异性<EGFR IGF 1R>抗体scFab XGFR1分子的体外稳定性

双特异性<EGFR-IGF 1R>抗体scFab分子的稳定性和聚集倾向

进行HP大小排阻层析法分析来确定在制备重组抗体衍生物中存在的团聚体的量。为此，使用Superdex 200分析大小排阻柱(GE保健(GEHealthcare)，Sweden)，通过在UltiMate 3000HPLC系统(Dionex)上的高效SEC分析双特异性抗体样品。图16显示这些分析的实例。团聚体作为在包含单体抗体衍生物的级分之前的单独的峰或肩峰出现。对于该项工作，我们限定需要的“单体分子”由重链和轻链的2个杂二聚体组成，其中scFabs连接于重链或轻链。在通过用肽N-糖苷酶F (罗氏分子生物化学(Roche Molecular Biochemicals))酶促处理去除N-聚糖之后，通过NanoElectrospray Q-TOF质谱来证实还原的双特异性抗体轻链和重链和融合蛋白的氨基酸主链的完整性。在不同条件(不同的浓度和时间)下纯化的蛋白的HP-大小排阻层析分析显示-与正常IgGs-比较，包含scFabs的分子聚集倾向稍稍增加。我们观察到对于某些分子这种聚集倾向可以通过在scFab组件中引入VH44/VL100链间二硫键得到改善。

实施例11

双特异性<EGFR-IGF1R>抗体scFab-分子与RTKs EGFR和IGF1R的结合

将scFab组件的结合和保留在不同的双特异性抗体形式scFab-XGFR的全长IgG-组件中抗原结合位点的结合与结合组件和双特异性抗体来自其中的‘野生型’IgGs的结合进行比较。通过应用表面等离振子共振(Surface Plasmon Resonance)(Biacore)，以及细胞-ELISA进行这些分析。

使用Biacore T100仪器(GE保健生物科学AB(GE HealthcareBio-Sciences AB)，Uppsala)，通过表面等离振子共振(SPR)技术来分析双特异性<IGF-1R-EGFR>抗体的结合性质。充分建立该系统用于研究分子相互作用。这允许在各种测定法设置中持续实时监测配体/分析物结合并因此确定缔合速率常数(ka)，解离速率常数(kd)，和平衡常数(KD)。SPR-技术基于对接近金包被的生物传感器芯片表面的折射率的测量。折射率的改变指示由固定的配体和溶液中注射的分析物的相互作用导致的表面上的质量改变。如果分子结合于在表面上的固定的配体，质量增加，如果解离，则质量减少。

使用胺-偶联的化学原理，将捕获抗-人IgG抗体固定在C1生物传感器芯片的表面上。用0.1M N-羟基琥珀酰亚胺和0.1M 3-(N，N-二甲基氨基)丙基-N-乙基碳二亚胺的1∶1混合物以5μl/min的流速激活流动细胞。将抗-人IgG抗体以5μg/ml注射到乙酸钠，pH 5.0中，这导致约200RU的表面密度。将参照对照流动细胞以相同的方式处理，但是仅以赋形剂缓冲液取代捕获抗体。将表面用1M乙醇胺/HCl pH 8.5的注射剂进行封闭。将双特异性抗体在HBS-P中稀释，并以5μl/min的流速注射。关于1-5nM浓度的抗体，接触时间(缔合阶段)是1分钟。以1.2，3.7，11.1，33.3，100和300nM增加浓度注射EGFR-ECD，以0.37，1.11，3.33，10，30和90nM的浓度注射IGF-1R。对于流速为30μl/min的两种分子，接触时间(缔合阶段)是3分钟，解离时间(用运行缓冲液洗涤)是5分钟。在25℃(标准温度)进行所有的相互作用。在每个结合周期后，以5μl/分钟的流速分别注射0.85％磷酸和5mM氢氧化钠的再生溶液，达60秒从而去除任何未共价结合的蛋白。以每秒1个信号的速率检测信号。以增加的浓度注射样品。

将双特异性抗体<IGF-1R-EGFR>抗体与EGFR和IGF1R的示例性同时结合显示在17a-d中。

表8：双特异性抗体(scFab-XGFR1_2720和scFab-XGFR2_2720)与EGFR和IGF-1R的亲和性(KD)

还可以将关于培养的细胞的基于FACS的结合和竞争分析应用于评估双特异性抗体衍生物与暴露在细胞表面上的RTKs的结合能力。图18显示我们用于测试包含scFab的双特异性XGFR衍生物对A549癌细胞的结合能力的实验设置。对于这些细胞竞争测定法，使表达抗原EGFR以及IGF1R的A549细胞脱离并计数。将1.5x10⁵细胞接种到锥形96-孔板的每孔中。离心细胞(1500rpm，4℃，5min)并将其在冰上，在50μL的在各种双特异性抗体在PBS中的稀释系列物中温育45分钟，所述PBS具有2％FCS(胎牛血清)，包含1μg/mL的Alexa647-标记的IGFIR-特异性抗体。再次将细胞离心，并用包含2％FCS的200μL PBS洗涤两次。最终，将细胞重悬在BD CellFix溶液(BD生物科学(BD Biosciences))中，并在冰上温育至少10分钟。通过流式细胞术(FACS Canto)确定细胞的平均荧光强度(mfi)。至少进行重复的两次独立染色来确定Mfi。使用FlowJo软件(TreeStar)进一步处理流式细胞术光谱。使用XLFit 4.0(IDBS)和剂量反应单位点模型(one site model)205确定半最大结合。

显示在图19a-c中的这些测定法的结果显示包含双特异性scFab的抗体衍生物在肿瘤细胞的表面上的结合功能性。例如在双特异性抗体衍生物scFab-XGFR1_2721的竞争实验中的IC50是0.11μg/ml，而单特异性抗体的IC50是＞50％更高(0.18μg/ml)。与母体抗体比较的双特异性scFab-XGFR_2721衍生物在竞争测定法中这种增加的活性提示双特异性分子与单特异性抗体比较更好地与细胞表面结合。

实施例12

双特异性<EGFR-IGF-1R>抗体scFab-XGFR分子下调EGFR-以及IGF-1R-人抗-IGF-1R抗体<IGF-1R>HUMAB克隆18(DSM ACC 2587)抑制IGFR1-信号传导而人源化的大鼠抗-EGFR抗体<EGFR>ICR62抑制EGFR的信号传导。为了评估不同的scFab-XGFR1变体的潜在抑制活性，分析这两者下调受体的程度。

为了检测本发明的抗体对肿瘤细胞中的IGF-I受体(IGF-IR)的量的效果，用IGF-IR和EGFR特异性抗体进行时程实验和随后的ELISA分析。

用在补充了10％FCS(PAA，批号E15-039)和1％PenStrep的RPMI1640中的人肿瘤细胞(H322M，5x 10⁵细胞/ml)以1ml/孔接种6孔板。将3ml培养基加入每个孔中，并且将所述细胞在37℃和5％CO₂培养24小时。

将培养基小心去除，并用稀释在RPMI-VM培养基中的2ml 100nMXGFR抗体置换。在对照孔中，用无抗体的培养基和缓冲液和具有对照抗体(<IGF-1R>HUMAB克隆18和<EGFR>ICR62，终浓度100nM)的培养基置换培养基。将细胞在37℃和5％CO₂培育，并且在24小时后取出每个板进行进一步处理。

将培养基通过抽吸小心去除，并将细胞用1ml PBS洗涤。加入300μl/孔的冷MES-裂解缓冲液(MES，10mM Na₃VO₄，和蛋白酶抑制剂)。1小时后，在冰上使用细胞刮器(Corning，批号3010)使细胞脱离，并将孔的内容物转移到Eppendorf反应管中。通过在13000rpm和4℃离心10分钟来去除细胞碎片。

对于EGFR检测

根据方案(对于人EGFR的DuoSet ELISA，RnD系统批号DY231)制备96孔微量滴定板(MTP)。将在PBS中的人EGFR山羊抗体144μg/ml以1∶180稀释在PBS中，并将100μl/孔加入MTP中。将MTP在室温温育过夜，伴随搅动。将所述板用补充了0.1％20的PBS洗涤3次，并用300μl/孔的具有3％BSA和0.1％20溶液的PBS在室温(RT)封闭1小时，伴随搅动。将所述板用补充了0.1％20的PBS洗涤3次。

使用BCA蛋白测定试剂盒(皮尔斯(Pierce))确定细胞裂解物中蛋白的量，接着将细胞裂解物用补充了100mMNa₃VO₄1∶100和蛋白酶抑制剂1∶20的MES-裂解缓冲液调节到0.04mg/ml的蛋白浓度，并将100μl/孔的裂解物加入预先制备的MTP中。关于背景测量，将100μl的裂解缓冲液加入MTP的孔中。

所用的第二细胞裂解物浓度是0.025mg/ml，并且裂解物被稀释1∶2，并以100μl/孔加入预先制备的MTP中。将MTP在室温再温育2小时，伴随搅动，接着用具有0.1％20溶液的PBS将其洗涤3次。

用于EGFR的检测抗体是浓度为36μg/ml的人EGFR山羊生物素化的抗体，其以1∶180稀释在具有3％BSA和0.2％20的PBS中。以100μl/孔加入，并在室温温育2小时，伴随搅动。接着将MTP用200μl/孔的具有0.1％20溶液的PBS洗涤3次。接着加入在具有3％BSA和0.2％20的PBS中的链霉抗生物素蛋白-HRP 1∶200，以100μl/孔加入并在室温温育20分钟，伴随搅动。接着，将所述板用具有0.1％20溶液的PBS洗涤6次。加入100μl/孔的3，3’-5，5’-四甲基联苯胺(罗氏(Roche)，BM-Blue ID-No.：11484581)并将其在室温温育20分钟，伴随搅动。通过加入25μl/孔的1M H₂SO₄终止颜色反应，并在室温再温育5分钟。在450nm测量吸光度。

对于IGF-1R检测

通过加入100μl/孔的AK1a-生物素化的抗体(Genmab，Denmark)制备链霉抗生物素蛋白-MTP(Roche ID.No.：11965891001)，将所述抗体在具有3％BSA和0.2％20的PBS中以1∶200稀释。将链霉抗生物素蛋白-MTP在室温温育1小时，伴随搅动，接着用200μl/孔的具有0.1％20溶液的PBS洗涤3次。

使用BCA蛋白测定试剂盒(皮尔斯(Pierce))确定细胞裂解物中蛋白的量，接着将细胞裂解物用50mM Tris pH7.4，100mM Na₃VO₄1∶100和蛋白酶抑制剂1∶20调节到0.3mg/ml的蛋白浓度，并将100μl/孔的裂解物加入预先制备的链霉抗生物素蛋白-MTP中。

所用的第二细胞裂解物浓度为0.15mg/ml，稀释裂解物，并以100μl/孔加入预先制备的链霉抗生物素蛋白-MTP中。将100μl的裂解缓冲液加入链霉抗生物素蛋白-MTP的孔中进行背景测量。

将MTP在室温再温育1小时，伴随搅动，接着用具有0.1％20溶液的PBS洗涤3次。

关于IGF-1R的检测抗体是人IGF-1Rβ兔抗体(圣克鲁斯生物技术(Santa Cruz Biotechnology)，批号sc-713)，其在具有3％BSA和0.2％20的PBS中以1∶750稀释。以100μl/孔加入，并将其在室温温育1小时，伴随搅动。接着，将MTP用200μl/孔的具有0.1％20溶液的PBS洗涤3次。接着，加入次级抗体，在具有3％BSA和0.2％20的PBS中的1∶4000的兔IgG-POD(细胞信号传导(Cell signaling)批号7074)，以100μl/孔加入，并将其在室温温育1小时，伴随搅动。接着，将所述板用具有0.1％20溶液的PBS洗涤6次。加入100μl/孔的3，3’-5，5’-四甲基联苯胺(罗氏(Roche)，BM-Blue ID-No.：11484581)并将其在室温温育20分钟，伴随搅动。通过加入25μl/孔的1M H₂SO₄终止颜色反应，并在室温再温育5分钟。在450nm测量吸光度。

在图20和21中显示了在H322M细胞中，包含双特异性scFab的XGFR分子与母体单特异性抗体<EGFR>ICR62和<IGF-1R>HUMAB-克隆18比较对受体下调检测的结果。双特异性抗体scFab-XGFR下调EGFR-以及IGF1R两者。这显示保留了结合组件的完全的功能性(生物功能性)和表型调节。图21还显示令人惊奇地，双特异性抗体scFab-XGFR_2720与单独的母体<EGFR>ICR62抗体比较显示提高的对EGFR的下调。

当以相同摩尔浓度应用于相同测定法中时，包含scFab的XGFR1变体与野生型抗体相比显示相同或更好活性的事实说明scFab-XGFR1分子能够干扰两种信号传导途径。

实施例13

scFab-XGFR1和scFab-XGFR2-介导的对肿瘤细胞系的体外生长抑制

人抗-IGF-1R抗体<IGF-1R>HUMAB克隆18(DSMACC 2587)抑制表达IGF1R的肿瘤细胞系的生长(WO 2005/005635)。以类似方式，人源化的大鼠抗-EGFR抗体<EGFR>ICR62显示抑制表达EGFR的肿瘤细胞系的生长(WO 2006/082515)。为了评估不同的scFab-XGFR1变体在肿瘤细胞系的生长测定中的潜在抑制活性，分析在表达EGFR和IGF1R的H322M细胞中的抑制程度。

将H322M细胞(5000细胞/孔)在聚-HEMA(聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯))包被的培养皿上，在补充了10％FCS的RPMI 1640培养基中培养从而防止粘附于塑料表面。在这些条件下，H322M细胞形成致密的球体，其以三维生长(被称为贴壁不依赖性的性质)。这些球体非常类似于原位实体瘤的三维组织结构和组织。在存在100nM抗体时，将球体培养物温育7天。将Celltiter Glow发光测定法用于测量生长抑制。当将H322M球体培养物用<IGF-1R>HUMAB-克隆18处理时，观察到生长抑制。

图22显示施用100nM<IGF-1R>HUMAB-克隆18减少细胞生长达72％，并且在相同的测定法中施用100nM<EGFR>ICR62减少细胞生长达77％。同时施用两种抗体(两者的浓度相同，为100nM)导致细胞存活力的完全减少(100％抑制)。这显示同时干扰两种RTK途径与仅干扰一种途径相比，对于肿瘤细胞系具有更明显的影响。以100nM的摩尔浓度施用不同的scFab-XGFR1-变体导致更高的生长抑制，其比单独用单分子观察到的抑制更明显。事实上，在100nM的抗体浓度，各种scFab-XGFR1-变体显示对细胞生长的完全(100％)抑制，而施用单组件则导致部分抑制。

我们得出结论，即scFab-XGFR1分子与仅干扰EGFR信号传导或IGF1R信号传导的IgGs比较，具有明显增加的生长抑制活性。

实施例14

双特异性、二价结构域交换的<EGFR-IGF1R>抗体分子Cross-Mab (VH/VL)(VH/VL结构域交换)或Cross-Mab(CH/CL)(CH/CL结构域交换)的表达与纯化

与实施例1和9中所述的方法类似，对双特异性、二价结构域交换的<EGFR-IGF1R>抗体分子Cross-Mab(VH/VL)(VH/VL交换，如在WO 2009/080252中所述)和Cross-Mab(CH/CL)(CH/CL交换，如在WO 2009/080253中所述)进行表达和纯化。两种双特异性<EGFR-IGF-1R>抗体基于作为结合EGFR的第一抗原结合位点的SEQ ID NO：8的重链可变结构域，和SEQ ID NO：10的轻链可变结构域(来自人源化的<EGFR>ICR62)，并基于作为结合IGF-1R的第二抗原结合位点的SEQ IDNO：23的重链可变结构域和SEQ ID NO：25的轻链可变结构域(来自人抗-IGF-1R抗体<IGF-1R>HUMAB克隆18(DSM ACC 2587))。

在通过使用蛋白A-琼脂糖^TM(Protein A-Sepharose^TM)(GE保健(GEHealthcare)，Sweden)的亲和层析法和Superdex200大小排阻层析法后的表达产率是关于Cross-Mab(VH/VL)的29.6mg/L和关于Cross-Mab(CH/CL)的28.2mg/L。

关于Cross-Mab(VH/VL)在SEQ ID NO：30-33中提供相应的双特异性抗体的相关完全(部分修饰)的轻链和重链氨基酸序列，并且关于Cross-Mab(CH/CL)在SEQ ID NO：34-37中提供相应的双特异性抗体的相关完全(部分修饰)的轻链和重链氨基酸序列。

实施例15

由双特异性、二价结构域交换的<EGFR-IGF1R>抗体分子Cross-Mab(VH/VL)或Cross-Mab(CH/CL)下调EGFR-以及IGF-1R-

与实施例12类似，确定实施例14的双特异性、二价结构域交换的<EGFR-IGF1R>抗体分子Cross-Mab(VH/VL)(VH/VL交换)和Cross-Mab(CH/CL)(CH/CL交换)对H322M肿瘤细胞上的EGFR-以及IGF-1R的下调。

双特异性、二价结构域交换的<EGFR-IGF1R>抗体Cross-Mab(VH/VL)和Cross-Mab(CH/CL)对EGFR的下调与单特异性<EGFR>ICR62的下调(约41％；在9,38μg蛋白/ml)比较，类似(Cross-Mab(VH/VL)约41％)或稍微更高(Cross-Mab(VH/VL)约49％)。

双特异性、二价结构域交换的<EGFR-IGF1R>抗体Cross-Mab(VH/VL)和Cross-Mab(CH/CL)对IGF-1R的下调与单特异性<IGF-1R>HUMAB-克隆18的下调((约85％；在75μg蛋白/ml))比较，令人惊奇地明显更低(Cross-Mab(VH/VL)约17％)(Cross-Mab(VH/VL)约20％)。

实施例16

双特异性、二价结构域交换的<EGFR-IGF1R>抗体分子Cross-Mab(VH/VL)或Cross-Mab(CH/CL)对H322M肿瘤细胞系的体外肿瘤生长抑制

类似于实施例13，确定实施例14的双特异性、二价结构域交换的<EGFR-IGF1R>抗体分子Cross-Mab(VH/VL)(VH/VL交换)和Cross-Mab(CH/CL)(CH/CL交换)对H322M肿瘤细胞的肿瘤生长抑制。

在100nM，单特异性抗体<IGF-1R>HUMAB-克隆18减少细胞生长达75％，而施用100nM<EGFR>ICR62减少细胞生长达89％。

同时施用两种抗体(两种抗体都在100nM的相同浓度，导致共200nM抗体浓度)导致细胞存活力的完全减少(≥100％抑制)。

双特异性、二价结构域交换的<EGFR-IGF1R>抗体分子Cross-Mab(VH/VL)和Cross-Mab(CH/CL)(仅在100nM的浓度)也分别单独显示对细胞生长的完全(≥100％)抑制。

这说明根据本发明所述的双特异性抗体可以以比相应的单特异性母体抗体的组合更低的抗体浓度完全抑制肿瘤细胞生长，而单独的单特异性母体抗体仅导致部分抑制。

实施例17

双特异性、二价ScFab-Fc融合<EGFR-IGF1R>抗体分子scFab-Fc的表达和纯化

与实施例1和9中所述的方法类似，对双特异性、二价ScFab-Fc融合<EGFR-IGF1R>抗体scFab-Fc进行表达和纯化。这种双特异性<EGFR-IGF-1R>抗体也基于作为结合EGFR的第一抗原结合位点的SEQ ID NO：8的重链可变结构域，和SEQ ID NO：10的轻链可变结构域(来自人源化的<EGFR>ICR62)，并基于作为结合IGF-1R的第二抗原结合位点的SEQID NO：23的重链可变结构域和SEQ ID NO：25的轻链可变结构域(来自人抗-IGF-1R抗体<IGF-1R>HUMAB克隆18(DSM ACC 2587))。

在通过使用蛋白A-琼脂糖^TM(Protein A-Sepharose^TM)(GE保健(GEHealthcare)，Sweden)的亲和层析法和Superdex200大小排阻层析法后的表达产率是关于scFab-Fc的29.7mg/L。

表10：双特异性、二价ScFab-Fc融合的<EGFR-IGF1R>抗体分子scFab-Fc在表达和纯化后的产率

在SEQ ID NO：38-39中提供双特异性抗体scFab-Fc的相关完全(修饰的)重链氨基酸序列。

实施例18

双特异性、二价ScFab-Fc融合<EGFR-IGF1R>抗体分子对EGFR-以及IGF-1R的下调

与实施例12类似，确定实施例17的双特异性、二价ScFab-Fc融合<EGFR-IGF1R>抗体导致的对H322M肿瘤细胞上的EGFR-以及IGF-1R的下调。

实施例19

双特异性、二价ScFab-Fc融合<EGFR-IGF1R>抗体分子对肿瘤细胞系的体外肿瘤生长抑制

与实施例13类似，确定实施例17的双特异性、二价ScFab-Fc融合<EGFR-IGF1R>抗体对H322M肿瘤细胞的肿瘤生长抑制。

实施例20

在同位A549异种移植模型中的存活分析

细胞培养物

A549腺癌细胞(NSCLC)开始获自ATCC，并且在扩增后保藏在内部细胞库。将肿瘤细胞系在37℃，在水饱和的气氛中，在5％CO2下，常规培养在补充了10％胎牛血清(Invitrogen，Switzerland)和2mM L-谷氨酰胺(GIBCO，Switzerland)的DMEM培养基(GIBCO，Switzerland)中。每三天用胰蛋白酶/EDTA 1x(GIBCO，Switzerland)分裂进行培养物传代。将第10代用于注射。

动物

根据指定的指南(committed guideline)(GV-Solas；Felasa；TierschG)，将在实验开始时8-9周龄的SCID米色雌性小鼠(购自查理斯河(Charles River)，Sulzfeld，Germany)在无特定的病原体的条件下维持，伴随每天12小时光照/12小时黑暗的周期。实验研究方案由当地政府进行评述和批准(P2005086)。在动物到达后，将其维持1周以适应新环境并便于观察。常规进行持续的健康监测。

肿瘤细胞注射

在注射当天，使用胰蛋白酶-EDTA(Gibco，Switzerland)，从培养瓶(Greiner Bio-One)中收获A549肿瘤细胞，并将其转移到50ml培养基中，将其洗涤1次，并重悬在AIMV(Gibco，Switzerland)中。在用AIM V再次洗涤后，使用细胞计数器确定细胞浓度。对于A549细胞的注射，将最终的滴度调节到5.0x 10⁶细胞/ml。随后，使用1.0ml结合菌素注射器(BD生物科学(BD Biosciences)，Germany))将200μl的这种混合物注射到小鼠的侧尾静脉中。

处理

在对每组10只动物进行肿瘤细胞接种后两周开始动物处理。在指定的剂量，每周一次静脉内施用双特异性抗-EGFR/抗-IGF1R抗体XGFR1-4421GE，XGFR1-2421GE，XGFR1-3421GE，<EGFR>ICR62GE，<IGF-1R>HUMAB-克隆18和相应的赋形剂。施用每月的剂量直到实验终止。在使用之前，将抗体稀释物从贮液中新鲜制备。

表11：在同位A549异种移植模型中的存活分析的研究设计

GE＝糖改造

监测

每天控制动物的临床症状，并检测不利的效果，即呼吸困难、受损的运动性和肮脏的皮毛。在相应的项目许可中描述和批准关于动物的研究排除标准。

鉴定/分级(staging)

将小鼠在分级时随机分布。将动物置于M3大小的笼中。

尸体解剖

根据终末标准(肮脏的皮毛、弓背、受损的运动)处死小鼠。从所有的动物中收集肺肿瘤进行随后的组织病理学分析(PFA，冷冻)。

存活分析

存活数据包含持续到具体事件发生的时间，并且有时称为时间-事件数据(time-to-event data)。所述事件可以例如是患者的死亡。如果对于一次观察，在研究结束前事件没有发生或当事件发生前研究客体离开研究时，认为观察是经检查的(censored)。那么精确的存活时间是未知的，但是已知其大于具体的值。

存活数据需要用专门的方法进行分析，但是它们具有专业的非正常分布，如指数分布或威布尔(Weibull)分布。此外，在没有偏离分析的情况下不能忽视经检查的观察。

Kaplan-Meier曲线提供关于一组或多组正确检查数据的存活函数的估计。

表12：分位数(quantiles)-中位值存活的总结

GE＝糖改造

分位数表显示中位值存活时间。从表Y中可见，当与用单特异性<EGFR>ICR62GE的处理比较时，用双特异性<EGFR-IGF1R>抗体XGFR1-4421GE，XGFR1-2421GE，XGFR1-3421GE处理的天数的中位值存活时间更高，并且当与用<EGFR>ICR62GE和<IGF-1R>HUMAB-克隆18的组合处理比较时，所述中位值存活时间更高或至少相同。

实施例21

双特异性、二价ScFab-Fc融合<EGFR-IGF-1R>抗体分子N-scFabSS-盐桥-s3和N-scFabSS-盐桥-w3C的表达和纯化，体外和体内性质

与实施例17、1和9中所述的方法类似，对双特异性、二价ScFab-Fc融合<EGFR-IGF1R>抗体分子N-scFabSS-盐桥-s3和N-scFabSS-盐桥-w3C进行表达和纯化。这些双特异性<EGFR-IGF-1R>抗体也基于作为结合EGFR的第一抗原结合位点的SEQ ID NO：8的重链可变结构域，和SEQID NO：10的轻链可变结构域(来自人源化的<EGFR>ICR62)，并基于作为结合IGF-1R的第二抗原结合位点的SEQ ID NO：23的重链可变结构域和SEQ ID NO：25的轻链可变结构域(来自人抗-IGF-1R抗体<IGF-1R>HUMAB克隆18(DSMACC 2587))。

关于N-scFabSS-盐桥-s3的双特异性抗体分子的相关完全(修饰)的重链氨基酸序列是SEQ ID NO：40-41，而关于N-scFabSS-盐桥-w3C的双特异性抗体分子的相关完全(修饰)的重链氨基酸序列是SEQ ID NO：42-43。

根据上述实施例确定双特异性、二价ScFab-Fc融合<EGFR-IGF1R>抗体分子N-scFabSS-盐桥-s3和N-scFabSS-盐桥-w3C的表达产率、纯度、体外和体内性质。

实施例22

双特异性、三价ScFab-IgG融合<EGFR-IGF1R>抗体分子KiH-C-scFab-1和KiH-C-scFab-2的表达和纯化，体外和体内性质

与实施例1和9、17中所述的方法类似，对双特异性、三价ScFab-IgG融合<EGFR-IGF1R>抗体分子KiH-C-scFab-1和KiH-C-scFab-2(使用凸起-进入-孔洞技术，将特异于IGF1R的scFab与全长EGFR特异性抗体的仅一条重链的C端融合(或反之亦然))进行表达和纯化。这些双特异性<EGFR-IGF-1R>抗体也基于作为结合EGFR的第一抗原结合位点的SEQID NO：8的重链可变结构域，和SEQ ID NO：10的轻链可变结构域(来自人源化的<EGFR>ICR62)，并基于作为结合IGF-1R的第二抗原结合位点的SEQ ID NO：23的重链可变结构域和SEQ ID NO：25的轻链可变结构域(来自人抗-IGF-1R抗体<IGF-1R>HUMAB克隆18(DSMACC 2587))。

关于双特异性抗体分子N-scFabSS的相关完全(修饰)的重链和轻链氨基酸序列是SEQ ID NO：44-46，而关于N-scFabSS-盐桥-s3c的相关完全(修饰)的重链和轻链氨基酸序列是SEQ ID NO：47-49。

根据上述实施例确定双特异性、二价ScFab-Fc融合<EGFR-IGF1R>抗体分子N-scFabSS，N-scFabSS-盐桥-s3和N-scFabSS-盐桥-w3C的表达产率、纯度、体外和体内性质。

Claims (12)

1.结合EGFR和IGF-1R的双特异性抗体，其包含结合EGFR的第一抗原结合位点和结合IGF-1R的第二抗原结合位点，所述双特异性抗体特征在于

i)所述抗原结合位点每个是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域；

ii)所述第一抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：1的CDR3区域，SEQ ID NO：2的CDR2区域，和SEQ ID NO：3的CDR1区域，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：4的CDR3区域，SEQ ID NO：5的CDR2区域，和SEQ ID NO：6的CDR1区域；和

iii)所述第二抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：11的CDR3区域，SEQ ID NO：12的CDR2区域，和SEQ ID NO：13的CDR1区域，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：14的CDR3区域，SEQ ID NO：15的CDR2区域，和SEQ ID NO：16的CDR1区域；

或所述第二抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：17的CDR3区域，SEQ ID NO：18的CDR2区域，和SEQ IDNO：19的CDR1区域，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：20的CDR3区域，SEQ ID NO：21的CDR2区域，和SEQ ID NO：22的CDR1区域。

2.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于：

i)所述第一抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：1的CDR3区域，SEQ ID NO：2的CDR2区域，和SEQ ID NO：3的CDR1区域，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：4的CDR3区域，SEQ ID NO：5的CDR2区域，和SEQ ID NO：6的CDR1区域；和

ii)所述第二抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：11的CDR3区域，SEQ ID NO：12的CDR2区域，和SEQ ID NO：13的CDR1区域，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：14的CDR3区域，SEQ ID NO：15的CDR2区域，和SEQ ID NO：16的CDR1区域。

3.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于：

i)所述第一抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：1的CDR3区域，SEQ ID NO：2的CDR2区域，和SEQ ID NO：3的CDR1区域，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：4的CDR3区域，SEQ ID NO：5的CDR2区域，和SEQ ID NO：6的CDR1区域；和

ii)所述第二抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：17的CDR3区域，SEQ ID NO：18的CDR2区域，和SEQ ID NO：19的CDR1区域，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：20的CDR3区域，SEQ ID NO：21的CDR2区域，和SEQ ID NO：22的CDR1区域。

4.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于：

i)所述第一抗原结合位点包含SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8作为重链可变结构域，和包含SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10作为轻链可变结构域，

ii)所述第二抗原结合位点包含SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：24作为重链可变结构域，和包含SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26作为轻链可变结构域。

5.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于：

i)所述第一抗原结合位点包含SEQ ID NO：8作为重链可变结构域，和包含SEQ ID NO：10作为轻链可变结构域，

ii)所述第二抗原结合位点包含SEQ ID NO：23作为重链可变结构域，和包含SEQ ID NO：25作为轻链可变结构域。

6.根据权利要求1-5中任一项的双特异性抗体，其特征在于所述抗体是二价的、三价的或四价的。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的双特异性抗体，其特征在于所述抗体是通过在Asn297具有糖链而被糖基化的，其中在所述糖链中的岩藻糖的量是65％以下。

8.药物组合物，其包含根据权利要求1-7所述的双特异性抗体。

9.根据权利要求8所述的药物组合物，用于治疗癌症。

10.根据权利要求1-7中任一项所述的双特异性抗体，其用于治疗癌症。

11.根据权利要求1-7所述的双特异性抗体用于制备治疗癌症的药物的应用。

12.治疗患有癌症的患者的方法，所述方法通过向需要所述治疗的患者施用根据权利要求1-7的双特异性抗体进行。