HK1169171B - 用於测定神经毒素多肽的量及其催化活性和蛋白酶解活性的手段和方法 - Google Patents

Description

用于测定神经毒素多肽的量及其催化活性和蛋白酶解活性的手段和方法

技术领域

本发明属于用于确保多肽生产和质量控制的工具领域。具体来说，本发明涉及在含有已加工好的神经毒素多肽和部分加工的或未加工的神经毒素多肽的溶液中确定加工好的(活性)神经毒素多肽的量的方法。本发明还涉及用于测定所述量的装置以及适用于实施本发明方法的试剂盒。

背景技术

肉毒梭菌(Clostridium botulinum)和破伤风梭菌(Clostridium tetani)产生强效的神经毒素，即分别为肉毒杆菌毒素(BoNTs)和破伤风毒素(TeNT)。这些梭菌神经毒素(CNTs)特异地和神经元细胞结合并破坏神经递质的释放。每种毒素合成为无活性的、未加工的约150kDa的单链蛋白质。翻译后的加工包括二硫键的形成、以及由细菌蛋白酶进行的有限的蛋白酶解(切割)。活性神经毒素由通过二硫键相连的两条链组成，一条约50kDa的N-端轻链和一条约100kDa的重链。CNTs在结构上和功能上由3个结构域组成，即具有催化功能的轻链、包含移位结构域(translocation)(N-端的半部分)和受体结合结构域(C-端的半部分)的重链，见Krieglstein1990，Eur J Biochem 188，39；Krieglstein 1991，Eur J Biochem 202，41；Krieglstein 1994，J Protein Chem 13，49。肉毒杆菌毒素被合成为包含150kDa神经毒素蛋白和相关非毒性蛋白的分子复合物。复合物的大小根据梭菌的菌株和独特的神经毒素血清型而不同，在300kDa、大于500kDa和900kDa之间变化。这些复合物中的非毒性蛋白具有稳定神经毒素、保护其不被降解的作用，见Silberstein 2004，Pain Practice 4，S19-S26。

肉毒梭菌分泌7种抗原性上独特的肉毒杆菌毒素(BoNT)血清型，称为血清型A至G。所有这些血清型与破伤风梭菌分泌的相关破伤风神经毒素(TeNT)一起是Zn2+内切蛋白酶，它们通过切割SNARE蛋白来阻断突触的胞吐，见Couesnon，2006，Microbiology，152，759。CNTs导致见于肉毒中毒和破伤风的弛缓性肌肉瘫痪，见Fischer 2007，PNAS 104，10447。

尽管具有毒性效应，肉毒杆菌毒素复合物已被用作许多疾病的治疗剂。肉毒杆菌毒素血清型A于1989年在美国被批准人用以治疗斜视、睑痉挛以及其它疾病。它在商业上以肉毒杆菌毒素A蛋白制剂获取，例如，在商业名BOTOX(Allergan公司)或商业名DYSPORT(Ipsen公司)下。一种改进的、无复合的肉毒杆菌毒素A制剂可以以商业名XEOMIN(MerzPharmaceuticals GmbH)商业获得。作为治疗用途，该制剂被直接注射到需要治疗的肌肉中。在生理pH值时，该毒素从蛋白质复合物中被释放出来并产生期望的药理学效应。肉毒杆菌毒素的效应只是短暂的，这正是为什么可能需要反复施用肉毒杆菌毒素以维持治疗效果的原因。

梭菌神经毒素减弱随意肌的强度，是对斜视、局灶性肌张力障碍，包括颈部张力障碍、和良性特发性睑痉挛有效的疗法。它们还已经被证实可以缓解半面痉挛和局灶性强直，此外，在例如胃肠道病症、多汗症以及美容抗皱修复等其它广泛的适应症中有效，见Jost 2007，Drugs 67，669。

在梭菌神经毒素的生产过程中，活性神经毒素多肽的定性和定量确定及其质量控制非常重要。目前可获得的神经毒素制剂除了包含所需要的活性(已加工好的或成熟的)神经毒素之外，还包含未经蛋白酶解加工的前体和/或部分加工的神经毒素多肽。未经蛋白酶解加工的前体或部分加工的神经毒素多肽和成熟的(活性的、已加工好的)神经毒素多肽在序列上只有少数几个氨基酸的差异。因此，很难根据它们的化学和物理特性将其定量地区分开来。另一方面，在这类制剂中，未经蛋白酶解加工的前体和/或部分加工的神经毒素多肽在总蛋白中所占的部分可能仍然显著。该部分取决于用于生产的生物系统，并是发酵过程中的生物合成和反应条件的结果。因此，在神经毒素制剂中所需要的成熟、具有生物活性的神经毒素多肽的含量是预先规定的，并且目前非常难以确定。

迫切需要用于成熟(活性)神经毒素多肽的可靠定性和定量检测系统的工具和方法，这些工具和方法目前还不可获得。

因此，本发明的技术问题可以看做提供满足上述需要的工具和方法。该技术问题通过在权利要求和下文中描述的实施方案得到了解决。

发明内容

本发明涉及一种在含有已加工好的神经毒素多肽和部分加工的和/或未加工的神经毒素多肽的溶液中确定已加工好的(活性)神经毒素多肽的量的方法，包括以下步骤：

a)使上述溶液的第一部分与特异性结合成熟神经毒素多肽、部分加工和未加工神经毒素多肽的轻链的第一捕获抗体，在允许所述抗体结合到所述成熟神经毒素、部分加工的和未加工的神经毒素多肽的条件下接触，从而形成第一抗体复合物，

b)使第一抗体复合物与检测抗体接触，从而形成第一检测复合物，其中所述检测抗体特异性结合步骤a)中形成的抗体复合物中的所述成熟神经毒素、部分加工和未加工神经毒素多肽的重链，

c)使上述溶液的第二部分与特异性结合所述部分加工和未加工神经毒素多肽的接头的第二捕获抗体，在允许所述抗体结合到所述部分加工和未加工神经毒素多肽的条件下接触，从而形成第二抗体复合物，

d)使第二抗体复合物与检测抗体接触，从而形成第二检测复合物，

e)测定步骤b)和d)中形成的第一和第二检测复合物的量。

f)根据步骤e)中确定的第一和第二检测复合物的量，计算成熟神经毒素多肽的量。

上述方法通常可以包含另外的步骤，包括溶液的配制步骤或关于进一步评价步骤f)中所获得的结果的步骤。此外，步骤a)和b)以及步骤c)和d)可以同时或相继地进行。在后一种情况下，步骤a)和b)可以在步骤c)和d)之前或之后进行。另外，在步骤e)中提及的测定在所述情况下可以在两个步骤系列均已经完成之后进行，或者步骤e)中的测定就第一检测复合物而言在步骤a)和b)之后进行，而关于第二检测复合物的测定在步骤c)和d)之后进行。该方法可以部分或完全地借助自动化技术完成。孵育和测量步骤可以由例如机器人来执行。数据分析和解释可以通过计算机执行的算法来进行。

本发明中所使用的术语“神经毒素多肽”指肉毒杆菌神经毒素的7个不同的血清型(即BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G)、和破伤风神经毒素(TeNT)(见表1)、以及它们的变体。

表1、肉毒杆菌神经毒素和破伤风神经毒素

本文述及的神经毒素原则上包含N-端轻链和C-端重链。神经毒素作为单链前体分子产生，在此被称为“未加工的神经毒素多肽”。在未加工的神经毒素中，N-端轻链和C-端重链序列之间间隔至少一个蛋白酶解切割位点。这些神经毒素可以包含位于轻链和重链序列之间的接头序列，其中轻链位于自第一切割位点起的N-端，而重链位于自第二切割位点起的C-端。在本发明的一方面，所述的接头具有SEQ ID NOs：1至16中任何一个所示的氨基酸序列。在神经毒素的加工过程中，接头序列将被切除。这些神经毒素包含两个蛋白酶解切割位点，其中一个位于接头序列的N-末端，另一个位于接头序列的C-末端。在这类神经毒素的加工过程中，可能产生只在其中一个切割位点切割的中间产物，即接头序列不被切除而是保留在N-端轻链或C-端重链上。该中间产物在本说明书中被称为“部分加工的神经毒素多肽”。其它的神经毒素可以仅包含一个切割位点。对这些神经毒素而言，可以理解，接头序列不能被切除。然而，未加工的神经毒素能够通过完整的蛋白酶解切割位点及侧翼序列被免疫识别。这些侧翼序列和切割位点在本发明中也被认为是一种接头。因此，在此所使用的和上述的术语“接头”，对于具有两个切割位点的神经毒素多肽，是指轻链和重链序列之间的序列，或者对于仅具有一个切割位点的神经毒素多肽，是指切割位点及侧翼序列。加工的结果是得到“已加工好的神经毒素多肽”。所述的加工好的神经毒素多肽表现出神经毒素特有的生物学特性，即(a)受体结合，(b)内化，(c)跨内体膜移位到细胞溶胶中，和/或(d)内切蛋白酶解切割参与突触小泡膜融合的蛋白质。因此，已加工好的神经毒素多肽在本文中有时候称作活性或成熟神经毒素多肽。神经毒素多肽的生物学活性，在一方面，源于所有上述生物学特性。评价生物学活性的体内试验包括小鼠LD50分析以及离体小鼠半膈分析，如Pearce et aL.和Dressier etal.(Pearce 1994，Toxicol Appl Pharmacol 128：69-77和Dressier 2005，Mov Disord 20：1617-1619)所描述的。生物学活性通常表示为小鼠单位(Mouse Units，MU)。如在此所使用，1MU是腹膜内注射后将杀死规定的一个小鼠群体中的50％小鼠的神经毒性成分的量，即小鼠i.p.LD50。

在本发明方法的一方面，所述的神经毒素多肽选自：a)具有SEQ IDNOs：17至24任何之一所示氨基酸序列的神经毒素多肽，以及b)具有与SEQ ID NOs：17至24的任何之一所示的神经毒素多肽的氨基酸序列至少40％相同的氨基酸序列的神经毒素多肽。上述氨基酸序列显示未加工的神经毒素多肽。相应的部分加工的或已加工好的神经毒素多肽的序列可以通过下面表3中提供的切割位点的信息，从上述序列推导出来。在本发明的另一方面，神经毒素多肽具有与SEQ ID NOs：17至24所示氨基酸序列至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列相同的氨基酸序列。本发明中所使用的“相同”/“同一”是指氨基酸序列的序列一致性，其中序列被比对以得到最高级别的匹配。这可以通过利用编写在例如BLASTP，BLASTN，FASTA(Altschul 1990，J Mol Biol 215，403)等计算机程序中的公开技术或方法来实现。在一方面，同一性百分比数值在整个氨基酸序列上计算。技术人员可以获得基于各种算法的一系列程序来比对不同序列。在本文中，Needleman和Wunsch或Smith和Waterman的算法给出特别可靠的结果。可以使用PileUp程序(1987，J Mol Evolution 25，351；Higgins 1989 CABIOS 5，151)或GCG软件包(Genetics ComputerGroup 1991，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711)中的组件Gap和BestFit程序(Needleman and Wunsch 1970，J Mol Biol 48；443；Smith and Waterman 1981，Adv Appl Math 2，482)进行序列比对。在本发明的一方面，使用GAP程序在整个序列区域上确定上述以百分数(％)表示的序列同一性值，其中采用下述设置：空位权重(Gap Weight)：50、长度权重(Length Weight)：3，平均匹配(Average Match)：10.000、平均错配(Average Mismatch)：0.000，除非另有说明，这些参数应总是用作序列比对的标准设置。可以理解的是，在本发明的一方面，上述变体应该保留神经毒素的至少一种生物学特性，以及在一个方面，本文所描述的神经毒素多肽的所有生物学特性。在另一方面，变体可以是具有改进或改变了的生物学特性的神经毒素，例如，它们可以包含在酶的识别上被改善的切割位点、或可以在受体结合或以上述及的任何其它特性上被改进。可想到的是，本发明的概念依赖于神经毒素多肽的轻链和重链之间两个或更多个切割位点的存在，而切割位点的性质以及它们之间的具体氨基酸序列并不重要，只要其特异于部分加工或未加工的神经毒素多肽即可。因此，另一方面是替换神经毒素多肽的重链和轻链之间的蛋白酶识别位点和接头肽。

在另一方面，依照本发明方法的神经毒素多肽可以是嵌合分子。所述嵌合分子，在一方面，可以是单结构域被取代的。因此，在另一方面，神经毒素重链的部分被抗体的FC结构域的部分取代。

本发明的方法中所使用的术语“量”涵盖多肽的绝对量、相对量或所述多肽的浓度、以及与其相关或能从其衍生出的任何值或参数。

在此所用的术语“溶液”是指包含成熟神经毒素多肽以及其部分加工和/或未加工的神经毒素多肽前体的任何溶剂体系。此外，该溶剂体系还包含溶剂。在本发明的各个方面，溶剂涵盖水、水性缓冲体系、有机溶剂和离子液体。在本发明的一方面，其是水性溶剂体系。此外，溶剂体系，除了成熟的神经毒素多肽和部分加工或未加工的前体神经毒素多肽以及溶剂以外，可以还包含其它分子，包括其它细菌多肽。在一方面，在本发明的方法中应用的溶液为细菌细胞培养物或来源于该细菌细胞培养物的部分纯化或纯化了的制品。

依照本发明的方法所使用的术语“部分”，是指溶液的试样或等分试样。在本发明的方法的一方面，本发明所提及的第一部分和第二部分在其体积和内容上是基本相同的。这可以通过例如测定第一和第二部分中的总蛋白含量来达成，其中基本上一致的总蛋白含量指示第一和第二部分具有基本上相同的内容。然而，在另一方面，作为第一或第二部分被使用的部分可以是溶液的试样或等分试样的稀释液。应理解的是，根据要被测定的神经毒素多肽(即部分加工或未加工神经毒素多肽或总的神经毒素)的量，可能需要进行稀释以允许最优的定性和定量测定。怎样进行这样的稀释为本领域技术人员所熟知。

依照本发明的方法所使用的术语“接触”是指(i)使上述捕获抗体和溶液中包含的神经毒素、或(ii)使抗体复合物和检测抗体在物理上接近以致其可以发生物理和/或化学相互作用。允许特异性相互作用的合适的条件为技术人员所熟知。所述条件将取决于本发明的方法中所要使用的抗体和溶液，并且能够很容易被技术人员进行适应性调整。此外，足以允许相互作用的时间也能够被技术人员很容易地确定。此外，可以理解的是，在本发明的方法中所描述的各单个接触步骤之间，可以进行洗涤步骤以获得对接触合适的条件。例如，在步骤a)中的第一抗体复合物形成之后，在将检测抗体应用于所述抗体复合物之前，应该除去剩余的溶液。此外，在步骤b)中的第一检测复合物形成之后，在步骤c)中测定第一检测复合物的量之前，可能需要除去剩余的(未复合的)检测抗体。相应地，这当然同样适用于步骤d)至f)。

本文所使用的“抗体”涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、合成抗体、或任何所述抗体的片段。所述抗体的片段包括Fab、Fv或scFv片段，或这些片段任何一个的化学修饰衍生物。抗体可以用例如Harlow and Lane″Antibodies，A Laboratory Manual″，CSH Press，Cold Spring Harbor，1988中所描述的方法来制备。单克隆抗体可以用最初在1975，Nature 256，495中、以及Galfr é1981，MethEnzymol 73，3中所描述的技术制备。该技术包含将小鼠骨髓瘤细胞与来源于免疫后的哺乳动物的脾细胞相融合。可以进一步利用本领域熟知的技术对抗体进行改进。例如，BIACORE(R)系统中所使用的表面等离子体共振可以被用于提高和表位结合的噬菌体抗体的效率，见Schier 1996，HumanAntibodies Hybridomas 7，97；Malmborg 1995，J.Immunol Methods 183，7。在此所使用的抗体还包括抗体的功能等同物，即能够特异地结合到神经毒素多肽的期望表位或部分的试剂。在一方面，这种功能等同物包括在本说明书其它地方提及的受体或结合蛋白、或其能够介导所述特异性结合的结构域。

根据本发明的方法，“第一捕获抗体”特异地结合包含在成熟神经毒素多肽的轻链中的、以及包含在部分加工和/或未加工的神经毒素多肽中的表位。在此所使用的特异性结合，通常是指抗体不与待测定的神经毒素多肽的重链或接头上的或其它多肽上的其它表位产生显著的交叉反应。在此所指的特异性结合能够以各种熟知的技术来测试，包括例如竞争性实验以及Western印迹。依照本发明所使用的表位涉及到被抗体识别的抗原决定簇。

在另一方面，可以用不同的捕获抗体来替代第一捕获抗体。为此，至少一种捕获抗体可以特异地结合未加工的神经毒素多肽的轻链上的表位，至少一种其它的捕获抗体可以特异地结合部分加工的神经毒素多肽的轻链上的表位，以及至少一种其它的捕获抗体可以特异地结合已加工好的神经毒素多肽的轻链上的表位。可以理解的是，对于本发明方法的目的，这三类抗体在功能上类似于第一捕获抗体。类似地，特异地结合部分加工的和未加工的神经毒素多肽的轻链表位的捕获抗体能够与特异地结合到已加工好的神经毒素多肽的轻链表位的捕获抗体组合使用。

在一方面，所述的第一捕获抗体应该是被固定的。所述的抗体的固定化，原则上，在一方面，可以通过将抗体可逆或不可逆、直接或间接(通过接头分子)地结合到固相支持物上来实现。在一方面，在执行本发明方法之前，第一捕获抗体是固定的。在另一方面，在第一抗体复合物形成之后但在该复合物与检测抗体接触之前，第一捕获抗体是固定的。用于固相支持物的材料为本领域技术人员熟知，包括例如可商业获得的多糖基质，选自：Sepharose、Sephadex、琼脂糖、Sephace、微纤维素、以及藻酸盐珠；多肽基质、聚苯乙烯珠、胶乳珠、磁珠、胶态金属粒、玻璃、塑料和/或硅片和表面、硝酸纤维素条，膜、薄片、Duracytes、反应盘的孔和壁、塑料管。在本发明的一方面，所述的固相支持物用γ-射线辐照的聚苯乙烯制成。

术语“第一抗体复合物”是指包含特异地结合到加工好的、部分加工的或未加工的神经毒素多肽上的第一捕获抗体的复合物。如上所述，所述的抗体复合物的形成是第一捕获抗体与含有所述已加工好的、部分加工的和/或未加工的神经毒素多肽的溶液相接触后的结果。

根据本发明的方法，“第二捕获抗体”特异地结合到包含未加工和/或部分加工的神经毒素多肽或其部分的接头的表位上。在没有接头序列的情况下，可以考虑，所述第二捕获抗体特异地结合到包含未经切割的蛋白酶解切割位点或其部分的表位上。在本发明的一方面，第二捕获抗体不与已加工好的神经毒素多肽发生显著的交叉反应。在一方面，所述的第二固定化的捕获抗体特异地结合到基本上由SEQ ID NO：1至16所示的氨基酸序列(见以下表2或表3)组成的、或包含、或包含于该氨基酸序列的表位上。

表2、不同神经毒素多肽的切割位点及侧翼序列的氨基酸序列

表3、接头区域的氨基酸序列

由于上述表位的存在，未加工或部分加工的神经毒素多肽能够被第二捕获抗体特异地结合，从而形成第二抗体复合物。在一方面，所述的第二捕获抗体是如上面详细解释的那样被固定的。

据此，术语“第二抗体复合物”指包含特异地结合到部分加工或未加工神经毒素多肽上的第二捕获抗体的复合物。然而，所述的第二抗体复合物应该不包含已加工好的神经毒素多肽。

根据本发明的方法，“检测抗体”特异地结合到第一和/或第二抗体复合物上。在一方面，针对第一和第二抗体复合物的检测抗体是一致的。然而，在另一方面，针对第一和第二抗体复合物，可以使用不同的检测抗体。在一方面，检测抗体特异地结合到加工好的、部分加工和未加工的神经毒素多肽的重链表位上。由于在两种复合物中存在相同的表位，第一抗体复合物或第二抗体复合物能够被检测抗体特异地结合，从而，在本发明的所述方面被检测。

检测抗体特异性结合的结果是分别形成第一检测复合物或第二检测复合物。

因此，术语“第一检测复合物”指包含第一抗体复合物和检测抗体的复合物。同样，术语“第二检测复合物”指包含第二抗体复合物和检测抗体的复合物。

在本发明的方法的一方面，所述的第一或第二检测复合物中包含的检测抗体和可检测标记偶联，从而可以测定与检测复合物结合的检测抗体的量。通过测定所结合的检测抗体的所述量，可以确定第一或第二抗体复合物的量，这是因为检测复合物中结合的检测抗体的量与检测复合物中包含的抗体复合物的量相关。可以通过直接或间接的方法进行标记。直接标记涉及标记物直接(共价地或非共价地)和第一检测抗体结合。间接标记涉及和检测抗体特异地结合并携带可检测标记的试剂的结合(共价地或非共价地)。这样的试剂可以是例如特异地结合到检测抗体的二级(高级)抗体。在这种情况下，二级抗体将与可检测标记偶联。可以理解的是，还可以使用更高级的抗体用于检测复合物的检测。高级抗体通常被用来增强信号。合适的高级抗体也可以包括熟知的链霉抗生物素-生物素体系(VectorLaboratories公司)、熟知的Dako LSAB^TM 2与LSAB^TM+(标记的链霉抗生物素-生物素)、或Dako PAP(Peroxidase Anti-Peroxidase，过氧化物酶-抗过氧化物酶)。在另一方面，所述第一检测抗体的标记选自：荧光染料、化学发光分子、放射性标记以及能够产生可检测信号的酶。典型的荧光标记包括荧光蛋白(例如GFP及其衍生物)、Cy3、Cy5、德克萨斯红(TexasRed)、荧光素以及Alexa染料(例如Alexa 568)。典型的放射性标记包括³⁵S，¹²⁵I，³²P，³³P等。可选择的是，和所述第一检测抗体偶联的可检测标记物也可以是能够产生可检测信号(例如通过底物的转化)的酶。在一方面，这样的酶可以是过氧化物酶(例如辣根过氧化物酶)或碱性磷酸酶。

本说明书使用的术语“测定量”涉及以定量或半定量的方式测定绝对量、相对量或浓度。测量可以基于和第一检测抗体偶联的可检测标记物的化学、物理或生物学特性进行。对检测合适的测量手段为本领域技术人员熟知并取决于如上所述可检测标记物的性质。然而，可以理解的是，可被测定的可检测标记物的量与检测复合物的量直接相关，而检测复合物的量又与抗体复合物的量相关，并因此与要被测定的神经毒素类型的量相关，即与总的(加工好的、未加工的和部分加工的神经毒素)、或未加工和部分加工的神经毒素的量相关。可以理解的是，神经毒素多肽量的测定，在一方面，也需要通过应用具有预先确定量的神经毒素多肽的标准溶液，对测定方法进行校正。怎样进行这样的校正为本领域技术人员所熟知。

依照本发明的方法所使用的术语“计算”涉及数学运算，利用该数学运算可以根据总的神经毒素(即加工好的、未加工的和部分加工的神经毒素)的量以及部分加工和未加工的神经毒素的量来确定加工好的神经毒素的量。在本发明的方法的一方面，所述的计算包括以总的神经毒素的量减去部分加工和未加工神经毒素的量。

有利的是，使用本发明的方法可以对给定制品中的加工好的神经毒素的量进行可靠的测定。据此，由于能够检查制品是否具有恒定量的期望的加工好的神经毒素多肽，从而可以提高神经毒素制品的质量。

原则上，本发明的方法可以通过将第一捕获抗体偶联到诸如反应瓶等固相支持物上来执行。类似地，第二捕获抗体可以被偶联到另外的物理上分离的固相支持物(例如，另一反应瓶)上。随后，偶联在固相支持物上的两捕获抗体可以与待确定的含有加工好的、未加工和/或部分加工的神经毒素多肽的溶液的所述部分接触。该溶液可以是例如纯化了的来源于梭菌的细菌细胞培养物。可以理解的是，溶液的第一部分将与第一固相支持物上的第一捕获抗体接触，溶液的第二部分将与第二固相支持物上的第二捕获抗体接触。这些部分通常是等体积的，并且就其内容(例如它们的总蛋白量)被标化。以足够的时间进行接触以使第一和第二捕获抗体能够特异地结合到它们各自的抗原上。例如可以在室温进行约一小时的接触。随后，弃去第一溶液部分和第二溶液部分，并在不影响固相支持物上此时已经与捕获抗体形成的第一和第二抗体复合物的条件下，以缓冲液对固相支持物(例如，反应瓶)进行一次或两次清洗。在进行清洗步骤后，将(第一)检测抗体在允许检测抗体进行特异性结合的条件下添加到固相支持物上。过量的检测抗体可以通过使用合适的缓冲液进行另外的清洗步骤而被去除。随后，第一和第二检测复合物的量可以通过测定已特异性结合的检测抗体的量而被确定。这可以依据检测抗体的标记物的性质而实现，例如，通过测定光密度或荧光强度而实现。测量到的可检测标记物的量可以用来与校正标准进行比较，以确定第一或第二检测复合物中神经毒素类型，即总的(加工好的、未加工和部分加工的神经毒素)或未加工和部分加工的神经毒素的量。可以理解的是，第一检测复合物代表总的神经毒素的量，而第二检测复合物仅代表部分加工和未加工的神经毒素多肽的量。据此，在上述设置中，加工好的神经毒素多肽的量可以通过以总的神经毒素多肽的量减去部分加工或未加工神经毒素多肽的量计算出来。

应理解的是，除非另有说明，以上对术语的定义和解释在经必要修正后适用于本说明书的下述所有方面。

本发明也涉及一种用于确定在含有加工好的神经毒素多肽和部分加工和/或未加工的神经毒素多肽的溶液中加工好的(活性)神经毒素多肽量的方法，包括以下步骤：

a)使所述溶液的第一部分与第一捕获抗体接触，从而形成第一抗体复合物，其中所述第一捕获抗体特异性结合成熟神经毒素多肽、部分加工和未加工神经毒素多肽的重链，所述接触在允许所述抗体结合到所述成熟神经毒素、部分加工和未加工的神经毒素多肽上的条件下进行；

b)使检测抗体与第一抗体复合物接触，从而形成第一检测复合物，其中所述检测抗体特异性结合在步骤a)中形成的抗体复合物中的所述成熟神经毒素、部分加工和未加工的神经毒素多肽的轻链；

c)使所述溶液的第二部分与第二捕获抗体接触，从而形成第二抗体复合物，其中所述第二捕获抗体特异性结合所述部分加工和未加工神经毒素多肽的接头，所述接触在允许所述抗体结合到所述部分加工和未加工的神经毒素多肽上的条件下进行；

d)使第二抗体复合物与检测抗体接触，从而形成第二检测复合物，

e)测定步骤b)和d)中形成的第一和第二检测复合物的量。

f)根据步骤e)中测定的第一和第二检测复合物的量，计算成熟神经毒素多肽的量。

在本发明的方法的另一方面，所述的方法进一步包含测定神经毒素多肽的结合活性。

依照本发明的方法所使用的术语“结合活性”涉及，加工好的神经毒素多肽结合存在于例如外周胆碱能神经末梢上的表面受体蛋白的能力。在一个方面，受体蛋白包括BoNT/A结合的SV2、BoNT/B和BoNT/G结合的突触结合蛋白I和II、以及神经节苷脂(GT_1B)共受体。在本发明的方法的一方面，可以使用模拟底物对所述的结合活性进行离体测定，该模拟底物通过模拟表面蛋白受体的结合结构域而替代表面蛋白受体。在一方面，所述的模拟底物是来源于上述受体蛋白的标记了的肽。在另一方面，合适的标记物包括在本说明书中其它地方所提到的那些标记物，特别是生物素。

因此，本发明也涉及测定神经毒素多肽的结合活性的方法，它包括以下步骤：

a)使含有神经毒素多肽的溶液的一部分与标记的肽接触，由此形成复合物，以及

b)基于标记物测定在步骤a)中形成的所述复合物，其中，复合物的存在或缺乏、或复合物的量指示所述溶液中神经毒素多肽的结合活性。

复合物可以根据用于标记肽的标记物的性质来测定。在一方面，例如，复合物包含的生物素化肽可以通过利用能够产生可检测信号的链霉抗生物素缀合物来测定。信号的存在、缺乏或强度将指示溶液中的神经毒素多肽的结合活性或其强度。

在本发明的方法的另一方面，所述的方法还包括检测神经毒素多肽的蛋白酶解活性。

依照本发明的方法所使用的术语“蛋白酶解活性”涉及，加工好的神经毒素蛋白酶解切割涉及突触小泡膜融合的N-乙基马来酰亚胺敏感性附着受体(SNARE)蛋白的能力。在一方面，所述切割是锌(II)依赖的。所述的蛋白酶解活性可以利用替代天然SNARE蛋白的模拟底物来测定。此外，切割之后，诸如染料等可检测标记物将会从所述模拟底物中被释放出来。在一方面，模拟底物是具有通式X-对硝基苯酰胺(nitroanilid)的化合物，其中X为精氨酸或具有序列“精氨酸-Y”的肽，其中Y代表一个或多个氨基酸，在另一方面，化合物为精氨酸-对硝基苯酰胺。

因此，本发明还涉及测定神经毒素的蛋白酶解活性的方法，它包括以下步骤：

a)使含有神经毒素多肽的溶液的一部分与具有通式X-对硝基苯酰胺的化合物接触，其中X为精氨酸或具有序列“精氨酸-Y”的肽，其中Y代表一个或多个氨基酸，以及

b)根据与神经毒素多肽的量相关的、自步骤a)中释放的对硝基苯酰胺的量，测定所述溶液中神经毒素的蛋白酶解活性。

在一方面，Y代表具有如SEQ ID NOs：25或26中任何一个所示的氨基酸序列的肽残基。

所述的溶液部分中包含的加工好的神经毒素多肽能够切割、并因此将对硝基苯胺从剩余的肽中释放出来。对硝基苯胺是一种本领域所熟知的染料。所述溶液中神经毒素多肽的蛋白酶解活性的测定是根据与神经毒素多肽的量相关的、释放的对硝基苯胺的量来进行的。

本发明也涉及测定溶液中加工好的神经毒素多肽量的装置，包括：

a)第一捕获抗体、第二捕获抗体和检测抗体的布置(arrangement)，其中所述布置使得上述方法中的步骤a)至e)可以得到执行；以及

b)根据利用a)中的布置所确定的第一和第二检测复合物的量，计算成熟神经毒素多肽量的计算工具。

在此所使用的术语“装置”涉及包括至少上述布置和工具的系统，其中所述布置和工具可操作地彼此连接以允许所述测定的实现。在一方面，所述布置可以是以上所提及的、其上有固定化的捕获抗体的固相支持物，该固相支持物可以是物理上分开的小瓶，从而允许分开进行溶液的第一部分和第二部分的接触。此外，在一方面，该装置可以包括用于测定检测复合物量的组件。取决于所使用的检测抗体的类型，该组件将包括用于检测抗体产生的信号的检测器。此外，在一方面，该组件还可以包括用于校正的工具，例如基于计算机的算法，用于与校正标准比较所测定的信号以便确定溶液或其部分中含有的神经毒素多肽的量。装置还可以包括根据第一和第二检测复合物的量来计算成熟神经毒素的量的工具，例如，用于进行该计算的基于计算机的算法。

本发明还涉及适用于实施上述方法的试剂盒，所述试剂盒包括：

a)第一捕获抗体、第二捕获抗体和检测抗体的布置，其中所述布置使得上述方法中的步骤a)至e)可以得到执行；

b)根据利用a)的布置测定的第一和第二检测复合物的量、计算成熟神经毒素多肽量的工具；和

c)执行所述方法的说明书。

在此所使用的术语“试剂盒”是指本发明上述工具或试剂的集合，它们可以被或可以不被包装在一起。该试剂盒的组分可以包含在分开的小瓶中(即，作为成套试剂盒)或在单个小瓶中提供。此外，应理解的是，本发明的试剂盒用于实施上文述及的方法。在一方面，可以考虑的是，所有的组分以即用的方式提供以用于实施所述方法。在另一方面，该试剂盒包括执行所述方法的说明书。说明书可以通过纸质或电子形式的用户手册的方式提供。例如，手册可以包含对使用本发明试剂盒执行上述方法所获得的结果进行解释的说明。

本说明书引用的所有参考文献，就其全部公开内容以及在本说明书中特别提到的公开内容，而特此并入作为参考。

附图说明

图1、至少一个(或更多)检测抗体的结合示意图。

图2、第二捕获抗体特异地结合到部分加工或未加工前体神经毒素多肽上以及随后结合至少一个(或多个)检测抗体的示意图。

图3、测定神经毒素多肽的结合活性的示意图。

图4、测定神经毒素多肽的蛋白酶解活性的示意图。

Claims (12)

1.一种在含有加工好的神经毒素多肽和部分加工和/或未加工的神经毒素多肽的溶液中确定加工好的神经毒素多肽量的方法，包括以下步骤：

a)使所述溶液的第一部分与第一捕获抗体接触，从而形成第一抗体复合物，其中所述第一捕获抗体特异性结合加工好的、部分加工和未加工的神经毒素多肽的轻链，其中所述接触在允许所述抗体结合到所述加工好的、部分加工的和未加工的神经毒素多肽上的条件下进行，

b)使第一抗体复合物与检测抗体接触，从而形成第一检测复合物，其中所述检测抗体特异性结合步骤a)形成的抗体复合物中的所述加工好的、未加工的和部分加工的神经毒素多肽的重链，

c)使所述溶液的第二部分与第二捕获抗体接触，从而形成第二抗体复合物，其中所述第二捕获抗体特异性结合所述部分加工的或未加工的神经毒素多肽的肽表位，其中所述肽表位具有SEQ ID NO:1至16中任何一个所示的氨基酸序列，其中所述接触在允许所述抗体结合到所述部分加工的或未加工的神经毒素多肽上的条件下进行，

d)使第二抗体复合物与检测抗体接触，从而形成第二检测复合物，

e)测定步骤b)和d)中形成的第一和第二检测复合物的量，

f)根据步骤e)中测定的第一和第二检测复合物的量，计算加工好的神经毒素多肽的量。

2.一种在含有加工好的神经毒素多肽和部分加工和/或未加工的神经毒素多肽的溶液中测定加工好的神经毒素多肽量的方法，包括以下步骤：

a)使所述溶液的第一部分与第一捕获抗体接触，从而形成第一抗体复合物，其中所述第一捕获抗体特异性结合加工好的神经毒素多肽、部分加工的和未加工的神经毒素多肽的重链，其中所述接触在允许所述抗体结合到所述加工好的神经毒素、部分加工的和未加工的神经毒素多肽上的条件下进行，

b)使第一抗体复合物与检测抗体接触，从而形成第一检测复合物，其中所述检测抗体特异性结合步骤a)形成的抗体复合物中的所述加工好的神经毒素、部分加工的和未加工的神经毒素多肽的轻链，

c)使所述溶液的第二部分与第二捕获抗体接触，从而形成第二抗体复合物，其中所述第二捕获抗体特异性结合所述部分加工的和未加工的神经毒素多肽的肽表位，其中所述肽表位具有SEQ ID NO:1至16之任一所示的氨基酸序列，其中所述接触在允许所述抗体结合到所述部分加工的和未加工的神经毒素多肽上的条件下进行，

d)使第二抗体复合物与检测抗体接触，从而形成第二检测复合物，

e)测定步骤b)和d)中形成的第一和第二检测复合物的量，

f)根据步骤e)中测定的第一和第二检测复合物的量，计算加工好的神经毒素多肽的量。

3.权利要求1或2的方法，其中所述第一捕获抗体是固定化的。

4.权利要求1或2的方法，其中所述第二捕获抗体是固定化的。

5.权利要求1或2的方法，其中步骤f)中的计算包括从所测定的第一检测复合物的量中减去所测定的第二检测复合物的量。

6.权利要求1或2的方法，其中所述未加工的神经毒素多肽选自SEQID NO:17至24中任何一个所示的神经毒素多肽。

7.权利要求1或2的方法，其中所述方法还包括测定所述加工好的神经毒素多肽的结合活性。

8.权利要求7的方法，包括以下步骤：

a)使含有加工好的神经毒素多肽的溶液的一部分与生物素化的肽接触，从而形成复合物，以及

b)通过能够产生可检测信号的链霉抗生物素缀合物，测定步骤a)中形成的所述复合物，其中，复合物的存在、缺乏或其量指示所述溶液中的加工好的神经毒素多肽的结合活性,

其中所述生物素化的肽为经生物素标记的、来源于外周胆碱能神经末梢上表面受体蛋白的肽。

9.权利要求1或2的方法，其中所述方法还包括测定所述加工好的神经毒素多肽的蛋白酶解活性。

10.权利要求9的方法，包括以下步骤：

a)使含有神经毒素多肽的溶液的一部分与具有通式X-对硝基苯酰胺的化合物接触，其中X为精氨酸或具有序列“精氨酸-Y”的肽，其中Y代表一个或多个氨基酸，以及

b)根据与该神经毒素多肽的量相关的、步骤a)中释放的对硝基苯胺的量，确定所述溶液中该神经毒素多肽的蛋白酶解活性。

11.一种测定溶液中加工好的神经毒素多肽的量的装置，包括：

a)第一捕获抗体、第二捕获抗体和检测抗体的布置，其中所述布置允许权利要求1至10之任何一项的方法的步骤a)至e)得以实施；以及

b)计算工具，其中所述工具根据利用a)中的布置测定的第一和第二检测复合物的量，计算加工好的神经毒素多肽的量。

12.一种适用于执行权利要求1至10之任何一项的方法的试剂盒，所述试剂盒包括：

a)第一捕获抗体、第二捕获抗体和检测抗体的布置，其中所述布置允许权利要求1至10之任何一项的方法的步骤a)至e)得以实施；

b)计算工具，其中所述工具根据利用a)中的布置测定的第一和第二检测复合物的量，计算加工好的神经毒素多肽的量，

c)执行所述方法的说明书。