HK1168545B - 冻干的重组vwf配方 - Google Patents

Description

冻干的重组VWF配方

技术领域

一般来说，本发明涉及冻干的重组VWF的配方和生产包含重组VWF的冻干组合物的方法。背景技术

冯维勒布兰特因子(VWF)是一种糖蛋白，它以一系列大小从约500至20,000kD的多聚体形式在血浆中循环。多聚体形式的VWF是由250kD的多肽亚单位通过二硫键相连而组成。VWF介导最初的血小板粘附于受损血管壁的内皮下膜。只有较大的多聚体表现出止血活性。据推测，内皮细胞分泌较大的聚合形式的VWF，并且那些具有低分子量的形式的VWF(低分子量VWF)由蛋白质裂解产生。大分子质量的多聚体存储在内皮细胞的怀布尔-帕拉德体(Weibel-Pallade bodies)内，并一旦受刺激就释放。

VWF由内皮细胞和巨核细胞作为预前体VWF(prepro-VWF)合成，该前原肽在很大程度上由重复的结构域组成。一旦信号肽裂解，原VWF通过在其C-末端结构域的二硫键连接而二聚化。二聚体充当多聚体化的原体，多聚体化受自由末端之间的二硫键连接的控制。在装配成多聚体后，蛋白水解除去原肽序列(Leyte et al.，Biochem.J.274(1991)，257-261)。

从克隆的VWF的cDNA预测的初级翻译产物是有2813个残基的前体多肽(预前体VWF)。预前体VWF由一段22个氨基酸的信号肽和一段741个氨基酸的原肽组成，成熟的VWF包含2050个氨基酸(Ruggeri ZA，and Ware，J.，FASEB J.，308-316(1993))。

VWF的缺陷是冯维勒布兰特疾病(VWD)的病因，该病的特征为或多或少地表现有出血表型。3型VWD是最严重的形式，其VWF完全缺失，而1型VWD涉及VWF在数量上的损失，其表型可以是非常温和的。2型VWD涉及到VWF性质上的缺陷，可以如3型VWD那样严重。2型VWD有很多亚型，有的与高分子量多聚体的丧失或减少有关。冯维勒布兰特疾病2A型(VWS-2A)的特征是中等的和大的多聚体同时丢失。VWS-2B的特征是最高分子量多聚体的丧失。其他与VWF有关的疾病和紊乱是本领域已知的。

美国专利No.6,531,577、7,166,709和欧洲专利申请No.04380188.5描述了血浆来源的VWF的配方。然而，除了与血浆来源的VWF的数量和纯度问题以外，还有血源性病原体(如病毒和变异克雅氏病(vCJD))的风险。此外，已知VWF在应激条件下形成聚集。

因此，本领域存在对开发一种稳定的含有重组VWF的药品配方的需求。发明内容

本发明提供了对冻干的重组VWF有用的配方，产生一种高度稳定的药物组合物。对于那些能受益于给药重组VWF的紊乱或症状，该稳定的药物组合物可用作一种治疗剂来治疗受此类紊乱或症状折磨的个体。

在一个实施方式中，所提供的一种稳定的冻干重组冯维勒布兰特因子(rVWF)的药品配方包含：(a)rVWF；(b)一种以上缓冲剂；(c)一种以上氨基酸；(d)一种以上稳定剂；和(e)一种以上表面活性剂；所述rVWF包含一种选自下组的多肽：a)SEQ IDNo.：3所示的氨基酸序列；b)所述a)的生物活性类似物、片段或变体；c)由SEQ ID No.：1所示多核苷酸编码的多肽；d)所述c)的生物活性类似物、片段或变体；和e)由可在适度严格的杂交条件下与SEQ ID No.：1所示多核苷酸杂交的多核苷酸所编码的多肽；所述缓冲液包含pH缓冲剂，其浓度在约0.1mM到约500mM范围内，且pH在约2.0至约12.0范围内；所述氨基酸的浓度在约1到约500mM；所述稳定剂的浓度在约0.1至约1000mM；并且所述表面活性剂的浓度在约0.01g/L到约0.5克/L。

在另一实施方式中，所述rVWF包含SEQ ID No.：3所示的氨基酸序列。在又一个实施方式中，所述缓冲剂选自由柠檬酸盐、甘氨酸、组氨酸、HEPES、Tris及它们的组合物所组成的组。在另一个实施方式中，所述缓冲剂为柠檬酸盐。在各种实施方式中，pH在约6.0到约8.0、约6.5到约7.5的范围内、或约7.3。在另一个实施方式中，pH值约为7.3。

在另一个实施方式中，上述氨基酸选自由甘氨酸、组氨酸、脯氨酸、丝氨酸、丙氨酸、精氨酸所组成的组。在另一实施方式中，所述氨基酸的浓度在约0.5mM到约300mM。在还有一个实施方式中，所述氨基酸是浓度为约15mM的甘氨酸。

在本发明的一个实施方式中，所述rVWF包含SEQ ID No.：3所示的氨基酸序列；其中所述缓冲剂是柠檬酸盐且pH值约为7.3；并且其中所述氨基酸是浓度约为15mM的甘氨酸。

在本发明的还有另一种实施方式中，上述的一种以上稳定剂是选自由甘露醇、乳糖、山梨醇、木糖醇、蔗糖、海藻糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖、葡萄糖、棉子糖、纤维二糖、龙胆二糖、异麦芽糖、阿拉伯糖、葡糖胺、果糖和这些稳定剂的组合物所组成的组。在一个实施方式中，所述稳定剂是浓度约为10g/LmM的海藻糖和浓度约为20g/L的甘露醇。

在本发明的又一个实施方式中，上述表面活性剂是选自由毛地黄皂苷、TritonX-100、Triton X-114、吐温20、吐温80和这些表面活性剂的组合物所组成的组。在又一个实施方式中，所述表面活性剂为约0.01g/L的吐温80。

在本发明的另一个实施方式中，rVWF包含SEQ ID No.：3所示的氨基酸序列；其中所述缓冲剂是约15mM的柠檬酸盐且pH约7.3；其中所述氨基酸是浓度约为15mM的甘氨酸；其中所述稳定剂为浓度约10g/L的海藻糖和浓度约20g/L的甘露醇；并且其中所述表面活性剂为约0.1g/L的吐温80。附图说明

图1显示了稳定性评估的各批次的合并VWF:RCo活性的ANCOVA分析(存储于5℃±3℃)。

图2显示了存储于5℃±3℃的rVWF FDP中残余水分的增加。

图3显示了存储于40℃±2℃的rVWF FDP中残余水分的增加。具体实施方式术语定义

除非另行定义，此处使用的所有技术和科学术语，均与本发明所属领域的技术人员的常规理解的意义相同。下列参考文献为技术人员提供了本发明所用的许多术语的一般定义：Singleton，et al.，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULARBIOLOGY(《微生物学与分子生物学词典》，第二版，1994)；THE CAMBRIDGEDICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY(《剑桥科技词典》，Walker版，1988)；THE GLOSSARY OF GENETICS(《遗传学词汇》，第五版，R.Rieger等编著，SpringerVerlag，1991)；和Hale与Marham的THE HARPER COLLINS DICTIONARY OFBIOLOGY(生物学辞典1991)。

在此引用的每一种出版物、专利申请、专利及其他参考文献均全文纳入本文，原文不与本公开的内容不一致。

在此应当注意，除非在上下文中明确表明，否则本说明书及其所附权利要求书中所用的单数形式“一种”、“一个”、和“该”包括相应的复数参考。

除非另有规定，本文中所使用的下列术语均表示其给定的意思。

对于肽类化合物，术语“包含”是指一种化合物可以在给定序列的氨基端和羧基端中的一端或两端包括附加的氨基酸。当然，这些附加的氨基酸不应显著地干扰化合物的活性。对于本发明的组合物，术语“包含”是指组合物可能包括其它组分。这些组分不应显著地干扰组合物的活性。

术语“药理活性的”是指以此描述的物质被确定具有影响医学参数(例如，但不限于血压、血细胞数、胆固醇水平)或疾病状态(例如，但并不限于癌症、自身免疫性疾病)的活性。

此处所使用的术语“表达”是指在使得或导致基因或DNA序列中的信息得以显现，例如，通过激活与相应的基因或DNA序列的转录和翻译有关的细胞功能来生产蛋白质。表达的DNA序列在细胞内表达或由细胞表达形成“表达产物”，如蛋白质。表达产物本身，如所形成的蛋白质，也可说是“被表达”。表达产物可以区分为胞内的、胞外的或者分泌的。术语“胞内”是指在细胞内部。术语“胞外”是指在细胞外部，如跨膜蛋白。一种物质如果有显著的量从细胞上或内部的某些位置到细胞外部出现，那么就是被细胞“分泌”了。

此处所用的术语“多肽”是指由氨基酸残基、结构变体、相关自然产生的结构变体、及其合成的非天然产生的类似物通过肽键连接组成的聚合物。合成多肽可通过如使用自动多肽合成仪来制备。术语“蛋白质”通常指较大的多肽。术语“肽”通常是指较短的多肽。

此处使用的多肽的“片段”是指任何一种多肽或蛋白质中任何比全长多肽或蛋白质表达产物小的部分。

此处所用的术语“类似物”是指结构大致相同、并具有相同生物活性但可以有不同程度活性的任何两个以上的多肽、或者是整个分子或者是其中片段。基于一个或多个涉及一个或多个氨基酸对其它氨基酸取代、删除、插入和/或添加的突变，类似物的氨基酸序列的组成不同。基于被替换的氨基酸以及替换它的氨基酸之间理化或功能性的相关度，取代可以是保守性或非保守性的。

此处所用“变体”是指多肽、蛋白质或其类似物被修饰为包含其它的通常不是该分子一部分的化学部分。这些部分可以调节分子的溶解度、吸收性、生物半衰期、等等。或者，这些部分可以降低分子的毒性并消除或减轻分子的任何不期望有的副作用等。适于介入这些效果的部分在Remington′s Pharmaceutical Sciences(1980)中已公开。把这些部分偶联到分子上的工艺是本领域已知的。例如但不限于，在一个方面，变体是具有赋予蛋白更长体内半衰期的化学修饰的凝血因子。在其它方面，多肽通过糖基化、聚乙二醇化、和/或聚唾液酸化而被修饰。重组VWF

预前体VWF的多核苷酸和氨基酸序列分别由SEQ ID No：1和SEQ ID No：2给出，并分别可用GenBank登录号NM_000552和NP_000543得到。对应于成熟VWF蛋白的氨基酸序列由SEQ ID No：3给出(对应于全长预前体VWF氨基酸序列中的764-2813位氨基酸)。

一种有用的rVWF形式至少具有体内稳定的性质，例如结合至少一个因子VIII(FVIII)分子，并可选地具有药理上可接受的糖基化模式。其中具体的例子包括无A2域从而抗蛋白水解的VWF(Lankhof等，Thromb.Haemost.77：1008-1013，1997)，和包括了糖蛋白lb结构域和对胶原蛋白及肝素的结合位点的从Val 449至Asn 730的VWF片段(Pietu等，Biochem.Biophys.Res.Commun.164：1339-1347，1989)。在一个方面，VWF稳定至少一个FVIII分子的能力的确定是按照本领域已知方法在VWF缺陷型哺乳动物中进行的。

本发明所述rVWF可用本领域已知的任何方法生产得到。1986年10月23日公布的WO86/06096和1990年7月23日递交的美国专利申请07/559,509公开了一种具体的例子，将其中涉及的生产rVWF的方法纳入此文作为参考。因此，所用具有下列步骤的方法都是本领域已知的：(i)通过基因工程例如通过RNA的逆转录和/或DNA扩增来生产重组DNA；(ii)通过转染例如通过电穿孔或显微注射将重组DNA引入原核或真核细胞；(iii)培养转染细胞，例如以连续或批式方式；(iv)表达VWF，例如组成型地或经诱导地表达，以及(v)例如从培养基中或者通过收集转染细胞来分离VWF，以便(vi)例如通过阴离子交换色谱法或亲和层析获得纯化的rVWF。在一个方面，重组VWF是在转化的宿主细胞内用本领域公知的重组DNA技术制得。例如，编码多肽的序列可以用合适的限制性酶从DNA上切下。另外，在另一个方面，DNA分子可利用化学合成技术如磷酰胺法合成得到。此外，在又一个方面，这些技术被组合使用。

本发明还提供了在合适的宿主中编码本发明多肽的载体。所述载体包含可操作地连接于合适的表达控制序列的编码所述多肽的多核苷酸。在多核苷酸插入载体之前或之后有效实现这一可操作的连接的方法是公知的。表达控制序列包括启动子、激活子、增强子、操纵子、核糖体结合蛋白、启动信号、终止信号、帽信号、聚腺苷酸信号、以及转录或翻译控制涉及的其它信号。由此产生的具有多核苷酸的载体被用于转染合适的宿主。这种转染可以用本领域已知的方法来进行。

大量现有公知的宿主细胞中的任意细胞可用于本发明的实践。具体宿主的选择取决于本领域已认知的一些因素，例如包括与所选表达载体的兼容性、DNA分子所编码的肽的毒性、转染率、肽回收的难易、表达特性、生物安全和成本。达成这些因素的平衡时还必须理解并非所有宿主细胞对于表达一种特定的DNA序列都同样有效。在这些一般准则中，有用的微生物宿主包括但不限于：培养的细菌、酵母和其他真菌、昆虫、植物、哺乳动物(包括人类)的细胞，或本领域已知的其他宿主。

被转染的宿主细胞在传统发酵条件下培养，使预期的化合物得以表达。这些发酵条件是本领域已知的。最后，多肽从培养基或宿主细胞本身中用本领域公知的方法纯化得到。

取决于被用来表达本发明化合物的宿主细胞，可把碳水化合物(寡糖)基团可选地结合到蛋白质上已知的糖基化位点上。一般而言，在Asn-X-Ser/Thr序列中，O-连接的寡糖结合在丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)残基上，而N-连接的寡糖结合在天冬酰胺(Asn)残基上，其中X可以是脯氨酸之外的任何氨基酸。X优选为除了脯氨酸之外的19种天然氨基酸中的一种。N-连接的寡糖和O-连接的寡糖的结构和每个类型中发现的糖残基是不同的。一种在N-连接和O-连接的寡糖中都能找到的糖类型是N-乙酰神经氨酸(称为唾液酸)。唾液酸通常是N-连接和O-连接的寡糖的末端残基，在一个方面，唾液酸凭借其自身的负电荷赋予糖基化化合物以酸性性质。这样的位点可以引入本发明化合物的连接物中，并优选在多肽化合物的重组生产中被细胞(例如在如CHO、BHK、COS这些哺乳动物细胞)所糖基化。在其他方面，这些位点通过本领域已知的合成法或半合成工艺而被糖基化。

另外，所述化合物可由合成方法使用如固相合成技术来制得。合适的技术是本领域公知的，并包括Merrifield在1973年发表于Chem.Polypeptides的335-61页(Katsoyannis and Panayotis eds.)、Merrifield在1963年发表于J.Am.Chem.Soc.85：2149、Davis等人在1985年发表于Biochem.Intl.10：394-414、Stewart和Young在1969年发表于Solid Phase Peptide Synthesis、美国专利3,941,763、Finn等人1976年发表于The Proteins(第三版)2：105-253、以及Erickson等人在1976发表于The Proteins(第三版)2：257-527中所述的那些。因为在制造小分子肽的方法中最具成本效益，固相合成是制造单个肽所优选的技术。VWF片段、变体和类似物

制备多肽片段、变体或类似物的方法是本领域公知的。

多肽的片段是利用，但不限于，酶法裂解(如胰蛋白酶、糜蛋白酶)，也可利用重组方式来产生具有特定氨基酸序列的多肽的片段。生产的多肽片段可以包含蛋白质具有特定活性的结构域，如多聚体化结构域或任何其他本领域已知的可识别的VWF结构域。

制备多肽类似物的方法也是公知的。多肽的氨基酸序列类似物可以是取代型的、插入型的、添加型的或删除型的类似物。删除型类似物包括多肽的片段，缺乏一个或多个天然蛋白质所具有的对于功能或免疫活性并非必须的残基。插入型类似物涉及在多肽的非末端位点添加例如氨基酸。这一类似物可以包括，例如但不限于，插入一种免疫反应性的表位或只是一个残基。添加型类似物包括多肽的片段，包括在蛋白质的任一端或两端添加一个或多个氨基酸，并包括例如融合蛋白。上述类似物的组合也应是可设想的。

取代型类似物典型地将蛋白质中的一个或多个位点上的野生型氨基酸替换成其它氨基酸，还可以设计成在不完全丧失其它功能或特性的前提下调节多肽的一个或多个性质。在一个方面，取代型类似物为保守型取代。“保守型氨基酸取代”是用带有侧链的或者类似化学性质的氨基酸替代一种氨基酸。进行保守型取代的相似的氨基酸包括那些有酸性侧链(谷氨酸，天门冬氨酸)、碱性侧链(精氨酸，赖氨酸，组氨酸)、极性酰胺侧链(谷氨酰胺，天冬酰胺)、疏水的脂肪侧链(亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸，丙氨酸，甘氨酸)、芳香侧链(苯丙氨酸，色氨酸，酪氨酸)、小的侧链(甘氨酸，丙氨酸，丝氨酸，苏氨酸，蛋氨酸)或脂肪族羟基侧链(丝氨酸，苏氨酸)的氨基酸。

在一个方面，类似物与作为其衍生基础的重组VWF实质上同源或实质上相同。类似物包括那些至少保留了一些野生型多肽的生物活性例如凝血活性的类似物。

所设想的多肽变体包括，但不限于，用诸如泛素化、糖基化包括多唾液酸化(polysialation)、共轭于治疗或诊断试剂、标记、共价连接聚合物如聚乙二醇化(聚乙二醇衍生化)、引入非水解键、以及插入或替代通常不出现在人类蛋白质中的化学合成氨基酸如鸟氨酸等技术进行化学修饰的多肽。变体保留了与本发明中未修饰分子相同或实质相同的结合特性。这样的化学修饰可以包括直接或间接的(如通过连接物)把一种试剂结合到VWF多肽上。若为间接结合，则连接物设想为可以是可水解的或不可水解的。

在一个方面，聚乙二醇化多肽类似物的制备将包括：步骤(a)使多肽与聚乙二醇(如反应性的酯或聚乙二醇的醛类衍生物)在使待连接的多肽能与一个或多个PEG基团结合的条件下反应，和步骤(b)获得反应产物。一般来讲，酰化反应的最佳反应条件是根据已知的参数和期望的结果来决定的。例如，PEG：蛋白质的比率越大，聚乙二醇化产物的百分比就越高。在一些实施方式中，待结合的构建体在N-末端具有单个聚乙二醇部分。聚乙二醇(PEG)可以与凝血因子结合，例如提供一个更长的体内半衰期。PEG基团可以是任何方便的分子量，也可以是直链型或者支链型。PEG的平均分子量在约2kDa(道尔顿)到约100kDa之间、约5kDa到约50kDa之间、或约5kDa到约10kDa之间。在某些方面，PEG基团与凝血因子的连接通过PEG部分上天然的或者工程化的活性基团(如醛、氨基、巯基、或酯基)与凝血因子上的活性基团(如醛、氨基、或酯基)经过酰化或还原性烷基化、或者通过任何本领域已知的其它技术来实现。

美国专利公开号20060160948、文献Fernandes et Gregoriadis；Biochim.Biophys.Acta 1341：26-34，1997和Saenko et al.，Haemophilia 12：42-51，2006中描述了制备聚唾液酸化多肽的方法。简单地说，室温下在暗处搅拌含有0.1M NaIO₄的聚唾液酸(CA)溶液把CA氧化。被激活的CA溶液用例如pH 7.2的0.05M磷酸钠缓冲液在暗处透析，经透析的溶液被加入到rVWF溶液中于室温暗处在温和摇动下孵育18小时。可选地，通过例如超滤/渗滤把游离试剂与rVWF-聚唾液酸共轭物相分离。利用戊二醛作为交联剂实现rVWF与聚唾液酸的共轭(Migneault et al.，Biotechniques 37：790-796，2004)。

在另一种实施方式中，进一步考虑本发明的多肽是一种融合蛋白，融合的第二试剂是一种多肽。在一种实施方式中，所述多肽第二试剂不仅限于是酶、生长因子、抗体、细胞因子、趋化因子、细胞表面受体、细胞表面受体的胞外结构域、细胞粘附分子、或上述蛋白的片段或活性结构域。在一种相关的实施方式中，第二试剂为凝血因子，如因子VIII(FactorVIII)、因子VII(FactorVII)、因子IX(Factor IX)。融合蛋白可考虑用本领域公知的化学或重组技术制得。

在另一种实施方式中，还考虑到预前体VWF和前VWF多肽在本发明的配方中将提供治疗的益处。例如，美国专利No.7,005,502描述了一种包含大量前VWF的药物制品能在体外诱导凝血酶生成。除了在自然产生的成熟VWF的重组体、生物活性片段、变体、或其它类似物之外，本发明还考虑在所述配方中使用预前体VWF(SEQ ID NO：2所示)或前VWF(SEQ ID NO：2中23到764位的氨基酸残基)的重组生物活性片段、变体、或类似物。

编码片段、变体和类似物的多核苷酸可以方便地由本领域技术人员生成，来编码自然产生的分子的生物活性片段、变体、或类似物，所得到的产物具有与该自然产生的分子相同或相似的生物活性。在各种实施方式中，这些多核苷酸用PCR技术、编码该分子的DNA的消化/连接、和类似技术制得。因此，本领域技术人员能够利用本领域已知的任何方法生成DNA链上的单个碱基变化，从而导致密码子改变和错义突变。此处所用的短语“适度严格的杂交条件”是指，例如42℃下在50％的甲酰胺中杂交，并在60℃下的0.1x SSC，0.1％SDS中洗涤。本领域技术人员应理解，这些条件的变化根据待杂交序列的长度和GC核苷碱基含量而发生。本领域的规则标准适合用来确定确切的杂交条件。见Sambrook等所著Molecular Cloning(《分子克隆》)的9.47-9.51(冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989年)。冷冻干燥

在一个方面，包含本发明VWF多肽的所述配方在给药前被冷冻干燥。使用本领域通用技术进行冷冻干燥，并应针对所开发的组合物进行优化[Tang et al.，Pharm Res.21：191-200，(2004)和Chang et al.，Pharm Res.13：243-9(1996)]。

在一个方面，冻干周期由三个步骤组成：冷冻、初级干燥、以及二级干燥[APMackenzie，Phil Trans R Soc London，Ser B，Biol 278：167(1977)]。在冷冻步骤中，溶液被冷却，以便启动冰的形成。此外，这一步引起填充剂的结晶。通过采用抽真空并导入热量来促进升华，把腔室内压力降至冰点蒸气压以下，进行冰在初级干燥阶段的升华。最后，在二级干燥阶段，在降低的腔内压力和升高的存放温度下除去吸附或结合的水。这一过程生产出被称为冻干块的材料。其后，冻干块可以用无菌水或合适的注射用稀释剂重新配制。

冻干周期不但决定赋形剂的最终物理状态，还影响到其它参数如重新配制时间、外观、稳定性、和最终水分含量。组合物在冷冻状态下的结构经过几次在特定温度下发生的转变(如玻璃态转化、润湿、和结晶化)，所述结构可以用来理解和优化冻干工艺。玻璃态转变温度(Tg和/或Tg′)可以提供关于溶质物理状态的信息，并且可以通过差示扫描量热法(DSC)来确定。Tg和Tg′是在设计冻干周期中必须考虑的重要参数。例如，Tg′对于初级干燥很重要。此外，在干燥状态下，玻璃态转变温度提供了最终产品的储存温度信息。配方和一般赋形剂

赋形剂是赋予或增强药物产品(如蛋白质)稳定性和释放性能的添加剂。无论其被包含的原因如何，赋形剂成为配方中不可缺的组成部分，因此需要是安全的并且患者耐受性良好的。对于蛋白质药物，赋形剂的选择尤为重要，因为它们影响药物的疗效和免疫原性。因此，蛋白质配方需要通过赋形剂的适当选择来进行开发，以提供合适的稳定性、安全性、适销性。

在一个方面，冻干剂型至少由一种以上缓冲液、填充剂和稳定剂组成。在该方面，当聚集成为冻干步骤或重新配制过程中的问题时，要评估并选择表面活性剂的使用。适当的缓冲剂被包含来保持配方在冻干过程中处于稳定的pH范围内。表A中提供了用于液体和冻干蛋白质配方的赋形剂组分的比较。

表A：冻干蛋白质配方的赋形剂组分

在蛋白质配方的开发中的主要挑战是稳定产品，以对抗制造、运输和贮存中的压力。剂型赋形剂的作用在于提供稳定化来应对这些压力。赋形剂还被用来降低高浓度蛋白质配方的粘度以便于其释药并加强患者的便利。一般来说，赋形剂可根据它们稳定蛋白质应对各种化学和物理压力的机理进行分类。一些赋形剂被用来减轻特定压力的影响或调节特定蛋白质的特定易感性。其它赋形剂对于对蛋白质的物理和共价稳定性有更广泛的影响。此处所述的赋形剂按照其化学类型或它们在配方中的功能作用来安排。在讨论每个赋形剂类型时，提供了其稳定模式的简要说明。

基于此处提供的教导和指导，本领域的技术人员会知道，为获得本发明的生物药物配方，在任何特定配方中可以包括什么样的赋形剂用量或范围能促进保留生物药物(如蛋白质)的稳定性。例如本发明的生物药物配方中包含的盐的量和种类是根据最终溶液的所需渗透浓度(即：等渗、低渗或高渗)和配方内包含的其它成分的量和渗透浓度来选择的。

举例来说，加入约5％的山梨醇可以获得等渗性，而达到等渗性需要约11％的蔗糖赋形剂。包含在本发明的生物药物配方中的一种或多种赋形剂的用量或浓度范围的选择已经在上文中以盐、多元醇和糖为例进行了举例说明。但是，本领域技术人员应理解，此处所述的考虑事项和进一步参照的特定赋形剂示例同样适用于所有类型的赋形剂及其组合，例如包括盐、氨基酸、其它高渗剂、表面活性剂、稳定剂、填充剂、低温保护剂、冻干保护剂、螯合剂和/或防腐剂。

此外，如果在一个特定的赋形剂以摩尔浓度被报道，则本领域的技术人员将认识到，等效的溶液的百分浓度(％)w/v(如(溶液样品中物质的克数/溶液毫升数)×100％)也已考虑到。

当然，本领域普通技术人员将认识到，在此描述的赋形剂浓度在特定配方中相互依赖。举例来说，当例如有较高的蛋白质浓度时或者当例如有较高的稳定剂浓度时，填充剂的浓度可能会较低。此外，本领域普通技术人员将认识到，在没有填充剂时，为了维持特定配方的等渗性，稳定剂的浓度会被相应调整(即使用“张力性”剂量的稳定剂)。常规的赋形剂是本领域已知的，并可从Powell等人的Compendium of Excipients firParenteral Formulations(1998)，PDA J.Pharm.Sci.Technology，52：238-311中找到。缓冲液和缓冲剂

药理活性蛋白配方的稳定性通常在一个狭窄的pH值范围内观察到最大。这种稳定性的最适pH范围需要在预配方研究中确定。几种办法比如加速稳定性研究和比热筛选研究对这一尝试是有用的(Remmele R.L.Jr.，et al.，Biochemistry，38(16)：5241-7(1999))。一旦配方被确定，蛋白质必须在其保质期内生产并保持。因此，缓冲剂几乎总被用来控制配方的pH值。

缓冲体系的缓冲能力在pH等于pKa值时最大，并随着pH值的升高或降低而下降。若pH值与pKa相差在1个单位内，则有百分之九十的缓冲能力。缓冲能力也随缓冲液浓度的增加而成比例地增加。

选择缓冲剂时有几个因素需要考虑。第一个也是最重要的，需要根据pKa及所需的配方pH来确定缓冲体系及其浓度。同样重要的是要确保该缓冲体系与蛋白质和其他剂型赋形剂相兼容，且不催化任何降解反应。第三个要考虑的重要方面是缓冲剂可能在给药时引起的刺痛和刺激的知觉。例如，已知柠檬酸盐会在注射时导致刺痛(Laursen T，etal.，Basic Clin Pharmacol Toxicol.，98(2)：218-21(2006))。对于那些通过皮下(SC)或肌内注射(IM)途径给药的药物来说，刺痛和刺激可能性会更大，与静脉注射(IV)途径相比这些途径中药物溶液在给药部位会停留相对较长的时间，IV途径中制剂在给药后被迅速稀释到血液中。对于那些通过直接静脉输液给药的配方，需要监测缓冲剂(和任何其他配方成分)的总量。对于以磷酸钾形式使用的钾离子必须特别小心，它会引起患者的心血管效应(Hollander-Rodriguez JC，et al.，Am.Fam.Physician.，73(2)：283-90(2006))。

用于冻干配方的缓冲剂需要额外考虑。一些缓冲剂如磷酸钠会在冷冻过程中从蛋白质非晶相中结晶出来，导致pH值的改变。其它常见的缓冲剂如醋酸和咪唑可能在冻干过程中升华或蒸发，从而改变冻干中或重新配制后配方的pH值。

组合物中出现的缓冲体系选定为具有生理上的兼容性并维持所期望的药物配方pH值。在一种实施方式中，溶液的pH值在pH 2.0和pH值12.0之间。例如，溶液的pH值可以是2.0、2.3、2.5、2.7、3.0、3.3、3.5、3.7、4.0、4.3、4.5、4.7、5.0、5.3、5.5、5.7、6.0、6.3、6.5、6.7、7.0、7.3、7.5、7.7、8.0、8.3、8.5、8.7、9.0、9.3、9.5、9.7、10.0、10.3、10.5、10.7、11.0、11.3、11.5、11.7或12.0。

pH缓冲性化合物的存在可以是任何能使配方的pH维持在预定水平的适当的量。在一个实施方式中，pH值缓冲浓度在0.1mM和500mM(1M)之间。例如，设想的pH缓冲剂至少为0.1、0.5、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.5、1.7、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200或500mM。

本文罗列的用来缓冲配方的pH缓冲剂包括但不限于：有机酸、甘氨酸、组氨酸、谷氨酸、琥珀酸盐、磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐、Tris、HEPES、和下述氨基酸或氨基酸混合物：包括但不限于天门冬氨酸、组氨酸和甘氨酸。在本发明的一种实施方式中，缓冲剂是柠檬酸盐。稳定剂和填充剂

在本发明药物配方的一个方面，添加稳定剂(或稳定剂的组合)以避免或降低由储存引起的聚集和化学降解。重新配制后的模糊或混浊的溶液表明蛋白质发生沉淀或者至少发生聚集。术语“稳定剂”是指一种能防止水溶液中聚集或物理降解、包括化学降解(例如：自溶、去酰胺化，氧化等)的赋形剂。考虑的稳定剂包括但不限于：蔗糖，海藻糖，甘露糖，麦芽糖，乳糖，葡萄糖，棉子糖，纤维二糖，龙胆二糖，异麦芽糖，阿拉伯糖，葡萄糖胺，果糖，甘露醇，山梨醇，甘氨酸，精氨酸盐酸盐，下述多羟基化合物：包括多糖如葡聚糖、淀粉、羟乙基淀粉、环糊精、N-甲基吡咯烷酮(N-methylpyrollidene)、纤维素和透明质酸，氯化钠[Carpenter et al.，Develop.Biol.Standard 74：225，(1991)]。在本发明的配方中，包含的稳定剂的浓度为约0.1、0.5、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.5、1.7、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、500、700、900或1000mM。在本发明的一种实施方式中，甘露醇和海藻糖被用作稳定剂。

如果需要，配方还包括适量的填充剂和渗透压调节剂。填充剂包括，例如但不限于，甘露醇、甘氨酸、蔗糖、聚合物如葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素、乳糖、山梨醇、海藻糖、木糖醇。在一个实施例中，所述填充剂为甘露醇。包含的填充剂的浓度为约0.1、0.5、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.5、1.7、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、500、700、900或1000mM。表面活性剂

蛋白质具有较高的与表面相互作用的倾向，这使它们在气-液、瓶-液、和液-液(硅油)界面容易经受吸附和变性。这种降解途径已被发现是与蛋白浓度成反比，并导致形成可溶性的和不可溶的蛋白质聚集体、或者溶液中的蛋白质通过吸附到表面而丢失。除了容器表面吸附，表面引发的降解由于如产品的运输和处理过程中经受的物理搅拌而被加剧。

表面活性剂通常用于蛋白质配方以防止表面引发的降解。表面活性剂为两性分子，对于界面位置能竞争过蛋白质。表面活性剂分子中的疏水部分占据界面位置(如，气/液)，而分子中的亲水部分保持指向溶剂主体。在足够的浓度下(通常在清洁剂的临界胶束浓度左右)，表面活性剂分子的表面层起到防止蛋白质分子在界面吸附的作用。因此，由表面引发的降解被减至最低。本文设想的表面活性剂包括但不限于：聚乙氧基山梨醇脂肪酸酯，即聚山梨酯20和聚山梨酯80。两者仅在赋予分子疏水性特征的脂肪链长度上不相同，分别为C-12和C-18。因此，聚山梨酯80更具表面活性，且临界胶束浓度比聚山梨酯20低。

洗涤剂也可影响蛋白质的热力学构象稳定性。在此，给定的洗涤剂赋形剂的影响是蛋白特异性的。例如，聚山梨酯显示出降低一些蛋白质的稳定性而提高另一些蛋白质的稳定性。蛋白质的洗涤剂不稳定化可以由洗涤剂分子的疏水尾部合理地说明，该尾部能参与与部分地或者完全地展开的蛋白质状态的特异性结合。这些类型的相互作用可能导致构象平衡向更为舒展的蛋白质状态移动(即增加了蛋白质分子疏水部分的暴露来弥补与聚山梨酯的结合)。另外，若天然状态的蛋白质展示一些疏水表面，则洗涤剂与天然状态的结合会稳定那种构象。

聚山梨酯的另一个方面是，它们本身易受氧化降解。通常，作为原料，它们含有足量的过氧化物来引起蛋白质尤其是蛋氨酸上残基侧链的氧化。由添加稳定剂所产生的氧化损害的可能性强调了配方中应当使用赋形剂的最低有效浓度这一点。对于表面活性剂，针对特定蛋白质的有效浓度将取决于稳定化的机理。

表面活性剂也被适量添加，以防止在冷冻和干燥过程中的聚集现象[Chang，B，J.Pharm.Sci.85：1325，(1996)]。因此，表面活性剂的示例包括但不限于：阴离子型、阳离子型、非离子型、两性离子型及两性表面活性剂，包括由天然产生的氨基酸衍生的表面活性剂。阴离子表面活性剂包括但不限于：十二烷基硫酸钠、磺基琥珀酸二辛酯钠和二辛酯磺酸钠、鹅去氧胆酸、N-月桂酰肌氨酸钠盐、十二烷基硫酸锂、1-辛烷磺酸钠盐、水合胆酸钠、脱氧胆酸钠、和甘油脱氧胆酸钠盐。阳离子表面活性剂包括但不限于：苯扎氯或苄索氯铵、十六烷基氯化吡啶一水合物、和十六烷基三甲基溴化铵。两性离子表面活性剂包括但不限于：CHAPS、CHAPSO、SB3-10、和SB3-12。非离子表面活性剂包括但不限于：毛地黄皂苷，Triton X-100，Triton X-114，吐温20，吐温80。表面活性剂还包括但不限于：聚桂醇400，聚烃氧40硬脂酸酯，聚氧乙烯氢化蓖麻油10、40、50和60，甘油单硬脂酸酯，聚山梨酯40、60、65和80，大豆卵磷脂，以及其它磷脂比如二油酸磷脂酰胆碱(DOPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、和二油酸磷脂酰甘油(DOPG)；蔗糖脂肪酸酯、甲基纤维素和羧甲基纤维素。因此，可进一步提供含有这些表面活性剂的组合物，所含表面活性剂或为单一表面活性剂、或为不同比例的混合物。在本发明的一种实施方式中，表面活性剂吐温80。在本发明的配方中，包含的表面活性剂浓度为约0.01到约0.5g/L。在提供的配方中，表面活性剂浓度为0.005、0.01、0.02、0.03、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0g/L。盐

盐往往被添加以提高配方的离子强度，离子强度对于蛋白质的溶解度、物理稳定性、等渗性很重要。盐能以各种方式影响蛋白质的物理稳定性。离子能通过结合的蛋白质表面的带电残基的来稳定蛋白质的天然状态。另外，盐能通过与沿蛋白质基干(-CONH-)的肽群结合来稳定蛋白质的变性状态。盐也能通过屏蔽稳定在一个蛋白质分子内残基之间的静电斥力相互作用来稳定蛋白质的天然构象。蛋白质配方中的盐也能屏蔽蛋白质分子之间能导致蛋白质聚集和不溶性的吸引性静电相互作用。在提供的配方中，盐浓度在0.1、1、10、20、30、40、50、80、100、120、150、200、300、和500mM之间。其他常用的赋形剂成分氨基酸

已发现氨基酸在蛋白质配方中作为缓冲剂、填充剂、稳定剂和抗氧化剂的多种用途。因此，在一个方面，组氨酸和谷氨酸被用来缓冲蛋白质配方的pH值分别在5.5-6.5和4.0-5.5之间。组氨酸咪唑基团的pKa＝6.0，谷氨酸侧链羧基基团的pKa为4.3，使得这些氨基酸适用于在它们各自的pH值范围进行缓冲。谷氨酸是在这种情况下尤其有用。组氨酸常见于市售蛋白质配方，这种氨基酸提供了一种柠檬酸盐的替代品，柠檬酸盐缓冲剂注射时的刺痛是公知的。有趣的是，组氨酸还被报告当以高浓度用在液体和冻干制品中时，有针对聚集的稳定作用(Chen B，et al.，Pharm Res.，20(12)：1952-60(2003))。组氨酸还被其他人观察到能降低高蛋白质浓度配方的粘度。然而，在同一研究中，在不锈钢容器内进行抗体的冻融研究中，作者在含有组氨酸的配方中观察到聚合增加和脱色。对于组氨酸还需要注意到的一点是，在金属离子存在时，它会经受光氧化(Tomita M，et al.，Biochemistry，8(12)：5149-60(1969))。配方中使用蛋氨酸作为抗氧化配方显得有希望，它已被发现对多种氧化压力有效(Lam XM，et al.，J Pharm ScL，86(11)：1250-5(1997))。

在各种实施方式中，提供的配方中包括一种或多种氨基酸，甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸、精氨酸、丙氨酸已显示出能通过优先排阻机制稳定蛋白质。甘氨酸也是一种冻干配方中常用的填充剂。精氨酸已显示是抑制聚合的一种有效试剂，并已在液体和冻干配方中使用。

在所提供的配方中，氨基酸浓度在0.1、1、10、20、30、40、50、80、100、120、150、200、300、和500mM之间。在本发明的一种实施方式中，所述氨基酸是甘氨酸。抗氧化剂

蛋白质残基的氧化由多种不同原因产生。除了添加特定的抗氧化剂外，蛋白质的氧化损伤的预防涉及在整个制造过程和产品储存中小心控制比如大气含氧、温度、光照、和化学污染等多个因素。因此，本发明设想使用的药物的抗氧化剂包括但不限于：还原剂、氧清除剂/自由基清除剂、或螯合剂。在一个方面，治疗性蛋白质配方中的抗氧化剂是水溶性的，并在整个产品保质期内保持活性。还原剂和氧/自由基清除剂通过烧蚀溶液中的活性氧而起作用。螯合剂如EDTA通过结合促进自由基形成的微量金属污染物而有效。例如，在酸性成纤维细胞生长因子的液体配方中利用EDTA抑制金属离子催化的半胱氨酸残基氧化。

除了各种赋形剂在防止蛋白质氧化中的有效性外，还需要关注抗氧化剂本身对于引起蛋白质的其它共价或者物理变化的可能性。例如，还原剂可引起分子内二硫键连接的断裂，从而导致二硫键洗牌。在过渡金属离子存在时，抗坏血酸和EDTA已显示在一些蛋白质和肽中促进蛋氨酸的氧化(Akers MJ和Defelippis MR.Peptides and Proteins asParenteral Solutions.In：Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins.Sven Frokjaer，Lars Hovgaard编辑。Pharmaceutical Science.Taylor and Francis，UK(1999))；Fransson J.R.，/.Pharm.Sci.86(9)：4046-1050(1997)；Yin J，et al.，Pharm Res.，21(12)：2377-83(2004))。硫代硫酸钠已被报道在rhuMab HER2中能降低光和温度诱导的蛋氨酸氧化水平；然而，该报告中还报道了硫代硫酸-蛋白加合物的形成(Lam XM，Yang JY，et al.，JPharm Sci.86(11)：1250-5(1997))。合适的抗氧化剂的选择应根据具体压力和蛋白质的敏感性做出。在某些方面考虑到的抗氧化剂包括但不限于：还原剂和氧清除剂/自由基清除剂、EDTA、和硫代硫酸钠。金属离子

一般而言，蛋白质配方中的过渡金属离子是不受欢迎的，因为它们能催化蛋白质的物理和化学降解反应。然而，可作为蛋白质辅因子、以及在蛋白质悬浮液配方中能形成配位复合物(如胰岛素的锌悬浮液)的某些金属离子被包括在配方中。最近，有人提出镁离子(10-120mM)可用来抑制天门冬氨酸异构成异天门冬氨酸(WO 2004039337)。

金属离子赋予蛋白质稳定性或活性提高的两个例子是人脱氧核糖核酸酶(rhDNase，Pulmozyme)和因子VIII。在rhDNase一例中，Ca⁺²离子(不超过100mM)通过特定的结合位点提高了酶的稳定性(Chen B，et al.，/Pharm Sci.，88(4)：477-82(1999))。事实上，用EGTA除去溶液中的钙离子会导致去酰胺化和聚集的增加。然而，这种作用只有用Ca⁺²离子时才观察到；其他二价阳离子镁⁺²、锰⁺²、和锌⁺²都观察到使rhDNase不稳定。对因子VIII的研究发现类似的效果。Ca⁺²和Sr⁺²离子使蛋白质稳定，而其他如Mg⁺²、Mn⁺²和Zn⁺²、Cu⁺²和Fe⁺²使酶不稳定(Fatouros，A.，et al.，Int.J.Pharm.，155，121-131(1997))。在另一项因子VIII的研究中，发现Al⁺³离子存在下聚集率显著升高(Derrick TS，et al.，Pharm.Sci.，93(10)：2549-57(2004))。作者注意到其它赋形剂比如缓冲盐往往被Al⁺³离子污染，并表明需要在配制产品中使用合适质量的赋形剂。防腐剂

在开发涉及从同一容器中多次取用的多用途肠胃外配方时，防腐剂是必须的。其主要功能是抑制微生物生长，并确保在整个保质期或药物产品使用期限内产品无菌。常用的防腐剂包括但不限于：苯甲醇、苯酚、间甲酚。虽然防腐剂的使用历史悠久，开发包含防腐剂的蛋白质配方可能具有挑战性。防腐剂几乎总会对蛋白质有不稳定效应(聚集)，这已成为限制其在多剂量蛋白质剂型中使用的主要因素((Roy S，et al.，J Pharm ScL，94(2)：382-96(2005))。

目前，大多数蛋白质药物配制成仅供单次使用。但是，如果多剂量配方是可能的，它们具有方便病人、和提高适销性的额外优势。一个好的例子是，人类生长激素(hGH)的防腐剂型的开发导致了更多方便的、多次使用注射笔式制品的上市。目前市场上至少有四种这样的含有hGH防腐剂型的笔式装置。Norditropin(液体，诺和诺德)，Nutropin AQ(液体，基因技术公司)及Genotropin(冻干-双室芯，Pharmacia & Upjohn)含有酚，而Somatrope(礼来公司)含有间甲酚。

有几个方面需要在开发防腐剂型配方时加以考虑。药物产品中的有效的防腐剂浓度必须优化。这要求测试一个给定的防腐剂在剂型配方内赋予抗微生物有效性而不影响蛋白质稳定性的浓度范围。例如，利用差示扫描量热法(DSC)为开发白细胞介素1受体(I型)的液体配方成功地筛选出了三个防腐剂。防腐剂被根据其在市售产品中的常用浓度下对稳定性的影响进行排序(Remmele RL Jr.，et al.，Pharm Res.，15(2)：200-8(1998))。

含有防腐剂的液体剂型的开发比冻干剂型更有挑战性。冷冻干燥产品可无需防腐剂而被冻干，在再使用时用含有防腐剂的稀释剂重新配制。这缩短了防腐剂与蛋白质的接触时间，显著降低了相关的稳定性风险。对于液体配方，必须在整个产品保质期内(约18-24个月)保持防腐剂的有效性和稳定性。需要注意的一个重点是，防腐剂有效性必须在含有活性药物和所有赋形剂成分的最终配方中得到证明。

一些防腐剂会引起注射部位反应，这是另一个在选择防腐剂时需要考虑的因素。在Norditropin的针对防腐剂和缓冲剂评价的临床试验中，观察到含有苯酚和苯甲醇的配方的疼痛感觉比含有甲酚的配方低(Kappelgaard AM，Horm Res.62 Suppl 3：98-103(2004))。有趣的是，在常用的防腐剂中，苯甲醇具有麻醉作用(Minogue SC，and Sun DA.，AnesthAnalg.，100(3)：683-6(2005))。在各个方面，防腐剂的使用提供的好处胜过任何副作用。制备方法

本发明还进一步考虑用于制备药物配方的方法。

本方法进一步包括下列步骤中的一个或多个：冻干之前向所述混合物中添加本文所述稳定剂，冻干之前向所述混合物中添加填充剂、渗透压调节剂、以及表面活性剂中的至少一种试剂，其中每种试剂都如本文所述。

冻干材料的标准重配做法是回加一定体积(通常相当于冻干过程中除去的体积)的注射用(WFI)纯水或无菌水，尽管抗菌剂的稀释溶液有时会在肠胃外给药的药物生产中使用[Chen，Drug Development and Industrial Pharmacy，18：1311-1354(1992)]。因此，提供的用于制备重新配制rVWF组合物的方法包括添加稀释剂到本发明的冻干rVWF组合物中。

冻干材料可以重新配制为水溶液。各种水性载体，如无菌注射用水、用于多剂量使用的含防腐剂的水、或含适量表面活性剂的水(如水悬液，其中混合物中含有活性化合物，该混合物中有适于用在水悬浮液生产的赋形剂)。在各种实施方式中，这些赋形剂是悬浮剂，例如但不限于：羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯胶；分散剂或润湿剂是一种天然产生的磷脂，例如但不限于：卵磷脂、或烯氧化物与硬脂酸的缩合产物，例如但不限于聚氧乙烯硬脂酸、或环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物，例如但不限于十七乙基-苯氧基十六烷醇(heptadecaethyl-eneoxycetanol)、或环氧乙烷与脂肪酸和己糖醇所衍生的偏酯的缩合产物比如聚氧乙烯山梨醇单油酸酯、或环氧乙烷与脂肪酸和无水己糖醇所衍生的偏酯的缩合产物，例如但不限于聚乙烯山梨醇单油酸酯。在各种实施方式中，水悬浮液还含有一种或多种防腐剂，例如但不限于：乙基苯甲酸、或正丙基苯甲酸、对羟基苯甲酸。给药

在一个方面，为了对人体或测试动物使用组合物，组合物包含一种或多种药学上可接受的载体。如下所述，短语“药学”或“药理学”可接受的是指，在使用本领域公知的途径给药时，分子实体和组合物是稳定的、可抑制蛋白降解比如产物聚合和裂解、并且还不产生过敏、或其他不良反应。“药学上可接受的载体”包括任何及所有对临床有用的溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗和延缓吸收剂等等，包括上文公开的试剂。

药物配方经口服、外用、透皮、非内服(肠胃外)、吸入喷雾、阴道、直肠、或颅内注射给药。此处所用术语“肠胃外”包括皮下注射、静脉注射、肌肉注射、脑池内注射或输液技术。还考虑到通过静脉注射、皮内、肌肉、乳内、腹腔内、鞘内、眼球后、肺内注射和或手术植入特定的部位。一般来说，组合物基本上不含热原及其它对受体有害的杂质。

组合物的单次或多次给药按主治医师选择的剂量水平和方式进行。为预防或治疗疾病，适当的剂量取决于如上定义的被治疗疾病的类型、严重程度和病程、药物是否用于预防或治疗目的、此前的治疗、病人的临床病史以及对药物的反应、以及主治医师的决定。试剂盒

作为一种补充的方面，本发明包括试剂盒，其中包含以有利于向对象给药的方式包装的一种以上的冻干组合物。在一种实施方式中，所述试剂盒包括本文所述的药物配方(例如，含有治疗性蛋白质或肽的组合物)，所述配方被包装在一种容器比如密封的瓶子或容器中，所述试剂盒还具有被粘贴在容器上或收入包装内的标签，其描述实施该方法时化合物或组合物的具体使用。在一种实施方式中，药物配方被包装在容器中使得容器内的顶空量(例如，液体配方与容器顶部之间空气的量)非常小。优选该顶空量可以忽略不计(即，几乎没有)。在一种实施方式中，该试剂盒包含了装有治疗性蛋白质或肽的组合物的第一容器和装有用于组合物的药学上可接受重新配制溶液的第二容器。在一个方面，药物配方以单位剂量的形式包装。所述试剂盒可以进一步包括一种适用于按特定给药途径进行所述药物配方给药的装置。优选地，所述试剂盒含有标签来介绍所述药物配方的使用。剂量

考虑到各种因素会影响药物的作用，例如年龄、身体状况、体重、性别及患者的饮食、任何感染的严重程度、给药时间和其他临床因素，本文所述的治疗病症的方法中涉及的剂量方案由主治医生决定。作为例子，本发明的重组VWF的典型剂量约为50U/kg，等于500μg/kg。

在一个方面，本发明的配方的给药由初始的药丸开始，接着连续输注以保持药物产品的治疗循环水平。作为另一个实施例，本发明的化合物按一次性剂量给药。本领域普通技术人员能容易地优化通过优质医疗实践与患者个体临床状况所确定的有效剂量和给药方案。给药频率取决于药剂的药代动力学参数及给药途径。最佳药物剂型由本领域技术人员根据给药途径和所需剂量来确定。例如，参见Remington′s PharmaceuticalSciences，18th Ed.(1990，Mack Publishing Co.，Easton，PA 18042)中1435至1712页，现将其公开内容纳入本文作为参考。这些剂型影响所给药剂的物理状态、稳定性、体内释放速度、和体内清除速度。取决于给药途径，按照体重、体表面积或器官大小计算合适的剂量。适当的剂量可以通过使用用来确定血药水平的既定分析方法、结合适当的剂量反应数据来确定。考虑到多种因素会影响药物的作用，例如药物的比活性、损伤的严重程度和患者的响应性、年龄、身体状况、体重、性别及患者的饮食、任何感染的严重程度、给药时间和其他临床因素，最终的剂量方案由主治医生决定。随着研究的进行，关于针对不同疾病与症状的合适剂量水平与治疗持续时间的进一步信息将会出现。

下列实施例仅作为本发明具体实施方式的示例而不是作为限定。实施例1摇动实验

为了确定在不同配方中rVWF沉淀的量，在各种条件下测试了剧烈摇动后rVWF聚集的程度。

如表1所示，在20mM柠檬酸盐缓冲液，pH 7.3中评估了各种rVWF配方。摇动实验的目的是模拟机械压力条件。每种配方取1-2ml在实验室摇床上于1200rpm下转10分钟。表1

对可目测的VWF聚集的评估按照如下所示的方案进行。在大多数情况下，“可见的聚集”是大小从约100纳米到1-2厘米不等的胶质纤维。方案

颗粒
		A	无颗粒
B	若干颗粒，很少看见(小点)
		B1	较多颗粒，很少看见(小点)
C	若干颗粒，易于看见(纤维)
		D	较多颗粒，易于看见(纤维)
E	可见颗粒(＞1mm纤维)
		E1	蓬松的白色沉淀(浮游于表面)
E2	海蜇状

摇动实验的结果见下面表2。表2

总之，上述摇动实验表明，含吐温80和甘露醇的配方提供了最佳的结果(即聚集量最少)。实施例2冻融实验

冻融试验的目的在于评估由反复冻融造成的压力的影响。除了上述摇动实验中的配方(见表1)以外，还评估了下列配方(表3和表4)。表3表4

所有配方在-20℃的冰箱中冷冻约1小时，然后在室温下解冻。结果见下面表5。表5

如上所示，海藻糖提供了最好的结果(即聚集量最少)。实施例3冷冻干燥实验

冷冻干燥实验的目的是评估各种配方允许形成能在不到10分钟内溶解并成为澄清溶液的冻干块的能力。还进行了加速稳定性研究来证明生物活性没有显著损失。

下面表6所示配方使用氮冻干机TS20002按照厂商指示来进行冻干。冻干的总时间为约72小时。下面每个配方还含有20g/L甘露醇和0.1g/L的吐温80。

冻干实验的结果见下面表7。

如上表所示，柠檬酸盐或HEPES与氨基酸的组合提供了最澄清的溶液。

为了评估重新配制的冻干rVWF的稳定性，进行了VWF:Ag和VWF:RCo测试。VWF:Ag对应于使用多克隆抗VWF抗体的VWF特异性ELISA可检测到的VWF的量，而VWF:RCo对应于在瑞斯西丁素存在下导致稳定化的血小板凝集的VWF的量。样品在40℃保存。假设阿伦尼乌斯(Arrhenius)方程适用，在40℃下一个月的稳定性相当于4℃下约一年。稳定性实验的结果见下面表8和表9所示。表8表9

ELISA的标准偏差在10-20％范围内。上述结果表明，所有被测配方在40℃下整个8周时间内都提供了良好的稳定性。

进行了补充的稳定性实验，其中在配方中使用了不同的氨基酸(如15mM或20mM的甘氨酸、赖氨酸或组氨酸)，并且柠檬酸盐缓冲液也有变化(例如：15、20或25mM)。如上所述，使用VWF:RCo活性分析法来监测rVWF的稳定性。即使在13个月后，40℃保存的rVWF稳定性样品仍未观察到VWF:RCo活性值的显著差异。测量的显著性由t-检验进行测试。分析方法的中等精密度通过计算变异系数(Coefficient of Variance)得到。在所有系列的稳定性数据中变异系数(CV)都低于20％，达到了CV＜20％的验证标准。根据以上结果，可以得出结论，在测试的所有柠檬酸盐缓冲液体系中，不管缓冲液摩尔浓度和添加的氨基酸如何，rVWF都是稳定的。即便在40℃下保存，rVWF至少13个月保持稳定。使用VWF:RCo活性分析法进行的效价测定显示了良好的中等精密度，CV值低于20％。

因此，根据本文显示的数据，提出了一种rVWF的配方，其中包含15mM柠檬酸盐(二水柠檬酸三钠)，15mM甘氨酸，10g/L海藻糖，20g/L甘露醇，0.1g/L吐温80，pH值7.3。实施例4长期稳定性

加速和长期稳定性测试

进行研究以评估rVWF的最终药物产品(FDP)在推荐并升温的储存条件下保存的稳定性。高温储存条件所得到的数据可确保温度偏差不会影响到rVWF FDP的质量，并可以在没有实时、真实条件的稳定性数据时用来外推材料的可接受的失效条件。

目前的规格是＜3.0％的残余水份(采用卡尔费休Karl Fischer法确定)。批号rVWFF#4FC、rVWFF#5FC、rVWFF#6FC和rVWFF#7FC释出的水分含量分别为1.2％、1.3％、1.2％和1.5％。根据过去其它使用相似小瓶和瓶塞配置的产品的经验，预计可释出任何残余水分约1.3％的rVWF批次将能在拟议的保质期(即在意向储存温度5℃±3℃下24个月)结束时满足≤3.0％的规格界限。

用生产出的四个rVWF FDP批次进行了在推荐的储存条件(即5℃±3℃)和高温(即40℃±2℃)下的长期稳定性研究。这些研究提供了足够的数据来比较单个临床批次的稳定表现。

稳定性的实验方案，包括稳定性指示分析和稳定性接受标准的说明，可以在表10中找到，表中还也包含稳定性研究中所评估的rVWF FDP的批号相关的信息。表10

总稳定性的总结与讨论(24个月)

列出的rVWF FDP的稳定性数据包括以下数据：

1.批号rVWF#1FC在5℃±3℃下24个月的长期研究数据(完整测试)和在30℃±2℃下6个月的中间数据(完整测试)；

2.批号rVWF#2FC在5℃±3℃下6个月的数据(完整测试)；

3.批号rVWF#3FC在2-8℃下24个月的长期研究数据(完整测试)、在30℃±2℃下6个月的数据和在40℃±2℃下3个月的数据(完整测试)；

4.批号rVWF#4FC在5℃±3℃下24个月的稳定性数据和在40℃±2℃下9个月的数据；

5.批号rVWF#5FC在5℃±3℃下24个月的稳定性数据和在40℃±2℃下9个月的数据；

6.批号rVWF#6FC在5℃±3℃下12个月的稳定性数据和在40℃±2℃下9个月的数据；以及

7.批号rVWF#7FC在5℃±3℃下12个月的稳定性数据和在40℃±2℃下9个月的数据

批号rVWFF#4FC、rVWFF#5FC、rVWFF#6FC和rVWFF#7FC中观察到的残余水分保持在远低于合格标准≤3％，并没有影响功能活性(VWF:RCo)。对于为适用于非临床和临床研究而生产的批次，在定性分析技术(即外观、SDS-PAGE电泳分析等)未见可观测到的变化。类似地，总蛋白质分析、VWF:Ag分析或贮藏过程中观察到的VWF多聚体数量均未见稳定性降低的趋势。

批号rVWF#1FC、rVWF#2FC和rVWF#3FC中出现的VWF:RCo活性与VWF:Ag活性的比值、以及VWF:RCo数据的变化可能是测试方法中变化的结果，事实上，单独的VWF:RCo稳定性试验结果由单个稳定性样品的单次确定的数据、和/或从非欧洲药典一致性的分析方法得到的数据所组成。在检测方法修改成符合欧洲药典的测试方法后，非临床批次的所有测试时间点都使用原始和新的测定方法进行测试。

大规模生产的rVWF FDP表现出与实验规模生产的rVWF FDP相似的稳定性特点。这些批次的rVWF FDP至少在5℃±3℃下保存24个月后保持了VWF:RCo活性。即使在30℃±2℃保存6个月或者40℃±2℃保存9个月，目前测试的大规模批次的稳定性样品中都未见VWF多聚体模式的变化。表11列出了rVWF#4FC、rVWF#5FC、rVWF#6FC和rVWF#7FC在40℃±2℃的条件压力下保存的VWF:RCo、VWF:Ag和VWF多聚体模式的结果。结果显示了在升高温度下贮藏9个月的稳定性，这可以外推为常温下超过3年或在冷藏条件下甚至更长的保质期。表11

协方差分析(ANCOVA分析)表明，回归线斜率的差异(在5℃±3℃下保存的批号rVWFF#4FC、rVWFF#5FC、rVWFF#6FC和rVWFF#7FC)不显著(p＝0.906)，允许VWF:RCo活性数据按照ICH Q1A(R2)所述进行合并。单个批次的趋势线高差也并不显著。如图1所示，外推合并的较差情况斜率显示，对于24月的最低值，置信区间完全在接受标准范围内。到51月时，平均曲线的下置信区间降到80％的初始活性(80％也是欧洲药典中人冯维勒布兰特因子给出的预测效力和标注效力的最大差异)。合并的较劣情况斜率显示每月降低0.0344U VWF:RCo。这一比较显示，rVWF FDP的稳定性特征，特别是VWF:RCo活性，没有由于生产工艺变化而变化。以上外推支持了可延长rVWF FDP在建议储存温度下的临时保质期至24个月。

水分从瓶塞到冻干产品的转移取决于瓶塞材料，并受瓶塞灭菌后残留水分、样品存储的湿度以及瓶塞的固有水分转移速度影响。如图2所示，批号rVWFF#4FC、rVWFF#5FC、rVWFF#6FC和rVWFF#7FC在5℃±3℃下保存的残余水分相似(斜率之间比较的差异不显著，p＝0.734)。在升高温度40℃±2℃条件下储存9个月的批次表现出了相对应的残余水分增加(图3)。在此，ANCOVA分析显示表明在回归线的斜率差异是可比的(p＝0.546)。图3显示了较差情况合并斜率至24个月的外推情况。

这些充分的数据支持了如果在5℃±3℃下保存，可在所述24个月的保质期时间内使用批号rVWFF#6FC和rVWFF#7FC。

建议的贮存条件和保质期

推荐的rVWF FDP储存条件为5℃±3℃。因此，建议若保存在推荐储存条件下，则rVWF FDP的暂定保质期为24个月。基于更长保存时间获得的补充数据，rVWF FDP的保质期可能可以进一步延长。

Claims (16)

1.一种重组冯维勒布兰特因子（rVWF）的稳定的冻干药物制剂，其包含：（a）rVWF；（b）一种以上缓冲剂；（c）一种以上氨基酸；（d）一种以上稳定剂；以及（e）一种以上表面活性剂；

所述rVWF包含选自下组中的多肽：

a）SEQ ID No:3所示的氨基酸序列；

b）所述a）的生物活性类似物、片段或变体；

c）由SEQ ID No:1所示多核苷酸编码的多肽；

d）所述c）的生物活性类似物、片段或变体；以及

e）由可在适度严格的杂交条件下与SEQ ID No.:1所示多核苷酸杂交的多核苷酸所编码的多肽，其中所述适度严格的杂交条件是指如下条件：于42℃下在50%的甲酰胺中杂交，并在60℃下的0.1x SSC,0.1%SDS中洗涤；

所述缓冲液包含pH缓冲剂，缓冲剂浓度在1mM到100mM范围内，且所述pH在6.0至8.0范围内；

所述氨基酸的浓度为1mM到100mM；

所述稳定剂的浓度为1g/L到50g/L；并且

所述表面活性剂的浓度为0.05g/L到0.5g/L。

2.如权利要求1所述的制剂，其特征在于，所述rVWF包含SEQ ID No:3所示的氨基酸序列。

3.如权利要求1所述的制剂，其特征在于，所述缓冲剂选自由柠檬酸盐、甘氨酸、组氨酸、HEPES、Tris和这些试剂的组合所组成的组。

4.如权利要求3所述的制剂，其特征在于，所述缓冲剂是柠檬酸盐。

5.如权利要求1所述的制剂，其特征在于，pH在6.5到7.5的范围内。

6.如权利要求5所述的制剂，其特征在于，pH为7.3。

7.如权利要求1所述的制剂，其特征在于，所述缓冲剂为柠檬酸盐，pH为7.3。

8.如权利要求1所述的制剂，其特征在于，所述氨基酸选自由甘氨酸、组氨酸、脯氨酸、丝氨酸、丙氨酸和精氨酸所组成的组。

9.如权利要求8所述的制剂，其特征在于，所述氨基酸在5mM到50mM的浓度范围内。

10.如权利要求9所述的制剂，其特征在于，所述氨基酸是浓度为15mM的甘氨酸。

11.如权利要求1所述的制剂，其特征在于，所述rVWF包含SEQ ID No:3所示的氨基酸序列；所述缓冲剂是柠檬酸盐且pH值为7.3；并且所述氨基酸是浓度为15mM的甘氨酸。

12.如权利要求1所述的制剂，其特征在于，所述一种以上的稳定剂选自由甘露醇、乳糖、山梨醇、木糖醇、蔗糖、海藻糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖、葡萄糖、棉子糖、纤维二糖、龙胆二糖、异麦芽糖、阿拉伯糖、葡萄糖胺、果糖和这些稳定剂的组合所组成的组。

13.如权利要求12所述的制剂，其特征在于，所述稳定剂是浓度为10g/L mM的海藻糖和浓度为20g/L的甘露醇。

14.如权利要求1所述的制剂，其特征在于，所述表面活性剂选自由毛地黄皂苷、Triton X-100，Triton X-114、吐温-20、吐温-80和这些表面活性剂组合所组成的组。

15.如权利要求14所述的制剂，其特征在于，所述表面活性剂为0.01g/L的吐温-80。

16.如权利要求1所述的制剂，其特征在于，所述rVWF包含SEQ ID No:3所示的氨基酸序列；所述缓冲剂是浓度为15mM的柠檬酸盐且pH值为7.3；所述氨基酸是浓度为15mM的甘氨酸；所述稳定剂是浓度为10g/L的海藻糖和浓度为20g/L的甘露醇；并且所述表面活性剂是浓度为0.1g/L的吐温-80。