HK1168127B - Method of increasing the expression yield of vitamin k-dependent proteins - Google Patents

Claims (15)

1. Verfahren zur Fermentation von eukaryotischen Zellen, die ein oder mehrere Vitamin-K-abhängige Proteine exprimieren, bei welchem dem Zellkulturmedium eine oder mehrere Verbindungen ausgewählt aus einer Liste umfassend

   i) reduzierte Formen von Vitamin K und/oder

   ii) reduzierte Formen eines Vitamin-K-Analogons und/oder

   iii) reduzierte Formen einer Vitamin-K-Vorstufe

   vor und/oder während des Fermentationsprozesses zugesetzt werden, wobei das Vitamin-K-Analogon eine 2-Methyl-1,4-naphthochinon-Ringstruktur enthält und Vitamin K1 bei der Vitamin-K-zyklusabhängigen gamma-Carboxylierung von Glutaminsäureresten zu Gla-Resten in Vitamin-K-abhängigen Proteinen funktionell ersetzen kann.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Vitamin-K-abhängigen Koagulationsfaktoren ausgewählt sind aus einer Liste bestehend aus FIX, FVII, FX, FII, Protein C, Protein S, Protein Z, Osteocalcin, dem calcifizierungshemmenden Matrix-Gla-Protein (MGP) und dem zellwachstumsregulierenden Growth-Arrest-Specific-Gene-6-Protein (Gas6).
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei es sich bei dem Vitamin-K-abhängigen Koagulationsfaktoren um FIX oder FVII handelt.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei es sich bei dem reduzierten Vitamin-K-Analogon um reduziertes Menadionbisulfit handelt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Expression in einem Bioreaktor durchgeführt wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Fermentation in einem semikontinuierlichen Betrieb (Draw-Fill-Betrieb), in einem Batch-Betrieb oder in einem kontinuierlichen Betrieb durchgeführt wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Fermentation entweder unter Verwendung von Zellen in Suspension oder mit adhärenten Zellen durchgeführt wird.
8. Verwendung einer oder mehrerer Verbindungen ausgewählt aus einer Liste umfassend:

   i) reduzierte Formen von Vitamin K und/oder

   ii) reduzierte Formen eines Vitamin-K-Analogons und/oder

   iii) reduzierte Formen einer Vitamin-K-Vorstufe

   zur Expression eines oder mehrerer funktionaler Vitamin-K-abhängiger Proteine in Zellkultur durch Zugabe dieser Verbindungen zum Zellkulturmedium, wobei das Vitamin-K-Analogon eine 2-Methyl-1,4-naphthochinon-Ringstruktur enthält und Vitamin K1 bei der Vitamin-K-zyklusabhängigen gamma-Carboxylierung von Glutaminsäureresten zu Gla-Resten in Vitamin-K-abhängigen Proteinen funktionell ersetzen kann.
9. Verwendung nach Anspruch 8, wobei das Verhältnis von Aktivität zu Antigenniveauexpression des Vitamin-K-abhängigen Proteins erhöht ist.
10. Verwendung nach Anspruch 8 oder 9, wobei es sich bei dem reduzierten Vitamin-K-Analogon um reduziertes Menadionbisulfit handelt.
11. Verwendung nach einem der Ansprüche 8 bis 10, wobei die Expression in einem Bioreaktor durchgeführt wird.
12. Verwendung nach einem der Ansprüche 8 bis 11, wobei die Fermentation in semikontinuierlichem Betrieb (Draw-Fill-Betrieb) durchgeführt wird.
13. Medium zur Fermentation von Vitamin-K-abhängigen Proteinen ergänzt mit einer reduzierten Form von Vitamin K und/oder einem Vitamin-K-Analogon und/oder einer Vitamin-K-Vorstufe, wobei das Vitamin-K-Analogon eine 2-Methyl-1,4-naphthochinon-Ringstruktur enthält und Vitamin K1 bei der Vitamin-K-zyklusabhängigen gamma-Carboxylierung von Glutaminsäureresten zu Gla-Resten in Vitamin-K-abhängigen Proteinen funktionell ersetzen kann.
14. Medium nach Anspruch 13, ergänzt mit reduziertem Menadionbisulfit.
15. Verwendung von reduzierten Formen von Vitamin K und/oder einem Vitamin-K-Analogon und/oder einer Vitamin-K-Vorstufe im Zellkulturmedium zur Verbesserung der Lebensfähigkeit von Zellen bei der Fermentation, wobei das Vitamin-K-Analogon eine 2-Methyl-1,4-naphthochinon-Ringstruktur enthält und Vitamin K1 bei der Vitamin-K-zyklusabhängigen gamma-Carboxylierung von Glutaminsäureresten zu Gla-Resten in Vitamin-K-abhängigen Proteinen funktionell ersetzen kann.