HK1162315B - 抗再吸收的和造骨的食物增补剂和使用方法 - Google Patents

Description

抗再吸收的和造骨的食物增补剂和使用方法

本申请是以下申请的分案申请：申请日：2007年10月24日；申请号：200780039411.X(PCT/US2007/022619)；发明名称：“抗再吸收的和造骨的食物增补剂和使用方法”。

本申请要求2006年10月24日提交的美国临时申请顺序号60/854,312和2007年4月23日提交的美国临时申请顺序号60/925,914的优先权，其全部内容通过引用结合到本文中。

背景技术

健康的骨连续地进行重建过程，其中通过活性骨细胞，即形成骨的成骨细胞和再吸收骨的破骨细胞的协调作用，在骨再吸收和骨形成之间达到平衡。骨的重建过程开始于覆盖未矿化的骨的细胞即衬细胞的活化。衬细胞再吸收未矿化的骨，然后回缩并为再吸收旧的、矿化的骨的破骨细胞留出空间，并创造吸引成骨细胞至相同位置的环境。然后成骨细胞沉降有机基质，该有机基质随后矿化以形成新骨。因此骨量(bone mass)取决于破骨细胞的骨再吸收与成骨细胞的骨形成之间的平衡。

骨中矿物质的量主要负责其硬度，而如结构蛋白胶原的物质也促成骨的机械强度。致密的最外面的骨称为骨皮质，而更具多孔性的内部形式称为骨松质或骨小梁。

大多数骨疾病归因于骨重建过程的平衡的受破环。一般地，该破裂为骨再吸收的增加。例如，骨质疏松症，最常见骨疾病中的一种，其特征为：伴随骨显微结构变化的骨量下降，但对引起骨折易感性增加的骨本身的化学成分没有影响。具体地说，骨皮质变薄且多孔，同时骨小梁变薄、穿孔、和分离。骨质疏松症可认为是骨重建循环中负平衡的结果，即形成的骨少于再吸收的骨。

因此，用于治疗骨病症的治疗剂针对抑制骨再吸收和增加骨形成。骨的重建过程涉及许多不同的分子和途径，当前可用的各种治疗剂靶向不同的分子和途径。例如，双膦酸盐(如阿仑膦酸盐和利塞膦酸盐)通过阻断破骨细胞的活性而抑制骨再吸收。其它治疗剂设法通过阻断与TNF受体/配体家族的成员的结合来抑制骨再吸收，所述成员例如作为活化破骨细胞的细胞因子的细胞核因子κB受体激活蛋白配体(Receptor Activator for Nuclear Factor κB Ligand)(RANK-L)，而破骨细胞是与骨再吸收有关的细胞。抑制RANK-L的释放可防止骨矿物质流失。

还有其它治疗剂以增加骨形成为目标。例如，已知激活的骨形态发生蛋白基因对引发成骨细胞分化和促进骨形成有直接作用。业已显示重组骨形态发生蛋白-2(BMP-2)的释放诱导骨或软骨的形成。然而，药物制剂和生物制剂，例如重组BMP-2的全身用药，可对肠和其它组织产生有害作用。因此，在本领域中需要可用于食物增补剂介入以通过抑制骨再吸收和/或增加骨形成来预防和/或治疗骨病症的天然的和植物来源的提取物。

发明内容

本发明基于以下发现：各种天然的和植物来源的提取物的新组合可以(1)通过抑制、减少、或预防RANK-L的表达和/或释放，和/或通过预防钙从骨释放而抑制骨再吸收；(2)通过增加或刺激BMP-2的基因和/或蛋白表达而增加骨生长；和(3)改善或维持骨强度。

在一个实施方案中，本发明为用于增加或刺激骨生长的组合物，该组合物包含天然的、植物来源的提取物，该提取物包括以下中的至少两种的组合：二水合槲皮素、脱水槲皮素、地黄(Rehmannia sp.)提取物、地黄(Rehmannia sp.)根提取物、西伯利亚人参(Siberian ginseng)提取物、槐角(Sophora fructus japonica)提取物、槐(Sophora japonica)提取物、甘草提取物、和依普黄酮，其中该组合增加BMP-2的基因或蛋白表达。

在另一个实施方案中，本发明为用于增加或刺激骨生长的组合物，该组合物包含脱水槲皮素或二水合槲皮素、西伯利亚人参提取物、槐(Sophora japonica)提取物、和甘草提取物的组合，其中该组合增加BMP-2的基因或蛋白表达。

在另一个实施方案中，本发明为用于增加或刺激骨生长的组合物，该组合物包含约10-1000mg的脱水槲皮素或二水合槲皮素、约100-800mg的西伯利亚人参提取物、和约10-500mg的甘草提取物的组合，其中该组合增加BMP-2的基因或蛋白表达。

在又一个实施方案中，本发明为用于增加或刺激骨生长的组合物，该组合物包含约10-1000mg的脱水槲皮素或二水合槲皮素、和约10-500mg的甘草提取物的组合，其中该组合增加BMP-2的基因或蛋白表达。

在另一个实施方案中，本发明为用于增加或刺激骨生长的组合物，该组合物包含约10-1000mg的脱水槲皮素或二水合槲皮素、和约100-800mg的西伯利亚人参提取物的组合，其中该组合增加BMP-2的基因或蛋白表达。

在又一个实施方案中，本发明为在受试者中增加或刺激骨生长的方法，该方法包括将包含以下中的至少两种的组合的组合物给予该受试者：脱水槲皮素、二水合槲皮素、地黄(Rehmannia sp.)提取物、地黄(Rehmannia sp.)根提取物、西伯利亚人参提取物、槐(Sophorajaponica)提取物、甘草提取物、和依普黄酮，其中该组合增加受试者中的BMP-2的基因或蛋白表达。

本发明的又一个实施方案为在受试者中增加或刺激骨生长的方法，该方法包括给予该受试者包含约10-1000mg的脱水槲皮素或二水合槲皮素、约100-800mg的西伯利亚人参提取物、和约10-500mg的甘草提取物的组合的组合物，其中该组合增加受试者中的BMP-2的基因或蛋白表达。

本发明的另一个实施方案为在受试者中增加或刺激骨生长的方法，该方法包括给予该受试者包含约10-1000mg的脱水槲皮素或二水合槲皮素、和约10-500mg的甘草提取物的组合的组合物，其中该组合增加受试者中BMP-2的基因或蛋白表达。

本发明的另一个实施方案为在受试者中增加或刺激骨生长的方法，该方法包括给予该受试者包含约10-1000mg的脱水槲皮素或二水合槲皮素、和约10-800mg的西伯利亚人参提取物的组合的组合物，其中该组合增加受试者中BMP-2的基因或蛋白表达。

在另一个实施方案中，本发明可为用于抑制、减少、或预防骨再吸收的组合物，该组合物包含与以下中的一种或多种组合的石榴提取物、安石榴甙(punicalagin)、或两者：二水合槲皮素、脱水槲皮素、地黄(Rehmannia sp.)提取物、地黄(Rehmannia sp.)根提取物、西伯利亚人参提取物、槐角(Sophora fructus japonica)提取物、槐(Sophorajaponica)提取物、甘草提取物、和依普黄酮，其中石榴提取物、安石榴甙、或两者抑制RANK-L的表达、产生和/或释放。

在一个实施方案中，本发明的组合物和方法使用含有称为安石榴甙的化合物的石榴(Punica granatum)果实和果皮提取物，以抑制或减少骨再吸收。本发明使用的石榴提取物，例如包含安石榴甙的石榴提取物，可以在用于抑制、减少、或预防骨再吸收的组合物和方法中使用，其中该石榴提取物抑制、减少或预防RANK-L的表达、产生、和/或释放。因此，在一个实施方案中，本发明为用于抑制、减少、或预防骨再吸收的组合物，该组合物包含石榴提取物、至少一种安石榴甙、或两者。备选地，本发明考虑抑制、减少、或预防骨再吸收的方法，该方法包括给予包含石榴提取物、至少一种安石榴甙、或两者的组合物，其中该组合物抑制RANK-L的表达、产生、和/或释放中的一个。

在还另一个实施方案中，本发明为用于抑制、减少、或预防骨再吸收的组合物，该组合物包含天然的、植物来源的提取物，该提取物包括以下中的至少两种的组合：优选包含安石榴甙的石榴提取物、橄榄提取物、西伯利亚人参提取物、银杏(Ginkgo biloba)提取物、绿茶提取物、槐(Sophora japonica)提取物、地黄(Rehmannia sp.)提取物、葡萄籽提取物、当归(Dong Quai)提取物、和依普黄酮，其中该组合抑制RANK-L的表达、产生、和/或释放。

在还一个实施方案中，本发明为用于抑制、减少、或预防骨再吸收的组合物，该组合物包含石榴提取物、葡萄籽提取物、依普黄酮、和绿茶提取物的组合，其中该组合抑制RANK-L的表达、产生、和/或释放。

在另一个实施方案中，本发明为用于抑制、减少、或预防骨再吸收的组合物，该组合物包含约10-2000mg的石榴提取物、约35-250mg的葡萄籽提取物、和约400-700mg的依普黄酮的组合，其中该组合抑制RANK-L的表达、产生、和/或释放。

在还另一个实施方案中，本发明为用于抑制、减少、或预防骨再吸收的组合物，该组合物包含约10-2000mg的石榴提取物、约35-250mg的葡萄籽提取物、和约400-700mg的依普黄酮，其中该组合物抑制钙从骨释放。

本发明的另一个实施方案为在受试者中抑制、减少、或预防骨再吸收的方法，该方法包括给予该受试者包含天然的、植物来源的提取物的组合物，该提取物包括以下提取物中的至少两种：石榴提取物、橄榄提取物、西伯利亚人参提取物、银杏(Ginkgo biloba)提取物、绿茶提取物、槐(Sophora japonica)提取物、地黄(Rehmannia sp.)提取物、葡萄籽提取物、当归提取物、和依普黄酮，其中该组合抑制RANK-L的表达、产生、和/或释放。

在还一个实施方案中，本发明为在受试者中抑制、减少、或预防骨再吸收的方法，该方法包括给予该受试者包含石榴提取物、葡萄籽提取物、依普黄酮、和绿茶提取物的组合的组合物，其中该组合抑制RANK-L的表达、产生、和/或释放。

在还一个实施方案中，本发明为在受试者中抑制、减少、或预防骨再吸收的方法，该方法包括给予该受试者包含约10-2000mg的石榴提取物、约35-250mg的葡萄籽提取物、和约400-700mg的依普黄酮的组合的组合物，其中该组合抑制RANK-L的表达、产生、和/或释放。

在还另一个实施方案中，本发明为在受试者中抑制、减少、或预防骨再吸收的方法，该方法包括给予该受试者包含约10-2000mg的石榴提取物、约35-250mg的葡萄籽提取物、和约400-700mg的依普黄酮的组合的组合物，其中该组合抑制钙从骨释放。

在还一个实施方案中，本发明为用于增加或刺激骨生长和抑制、减少、或预防骨再吸收的食物增补疗法，该疗法包括第一组合物和第二组合物，该第一组合物包含以下中的至少两种的组合：二水合槲皮素、脱水槲皮素、地黄(Rehmannia sp.)提取物、地黄(Rehmanniasp.)根提取物、西伯利亚人参提取物、槐(Sophora japonica)提取物、甘草提取物、和依普黄酮，其中该第一组合物的组合增加BMP-2的表达和/或活性；该第二组合物包含以下中的至少两种的组合：石榴提取物、橄榄提取物、西伯利亚人参提取物、银杏(Ginkgo biloba)提取物、绿茶提取物、槐(Sophora japonica)提取物、地黄(Rehmannia sp.)提取物、葡萄籽提取物、当归提取物、和依普黄酮，其中该第二组合物的组合抑制RANK-L的表达。

具体实施方式

应理解：本发明不限于本文描述的具体组合物、方法、或方案。此外，除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的意义。还应理解的是，本文使用的术语仅为了描述具体实施方案的目的，不意欲限制本发明的范围，本发明的范围将仅由权利要求书限定。

本发明基于令人意想不到的发现：下文更充分描述的包括以下中的两种或多种的成分的独特组合通过增加或刺激BMP-2的启动子、基因、和/或蛋白质的表达和/或活性而增加骨生长，或者通过抑制、减少、或预防RANK-L的表达、产生、或释放，或通过抑制、减少、或预防钙从骨的释放而抑制骨再吸收：脱水槲皮素、二水合槲皮素、地黄(Rehmannia sp.)提取物、地黄(Rehmannia sp.)根提取物、西伯利亚人参提取物、槐(Sophora japonica)提取物、甘草提取物、依普黄酮提取物、石榴提取物、橄榄提取物、银杏(Ginkgo biloba)提取物、绿茶提取物、葡萄籽提取物、和当归提取物。

BMP-2是骨形态发生蛋白家族的成员，骨形态发生蛋白是扩展的转化生长因子B超家族中的新因子。当局部注入大鼠的皮下组织时，重组BMP-2和BMP-4可以诱导新骨形成(Wozney J.Molec(1992)32：160-67)。BMP-2和BMP-4随着正常的成骨细胞的分化而被表达，其已显示在体外刺激成骨细胞分化和骨小结(bone nodule)形成以及在体内刺激骨形成。因此，通过增加或刺激BMP-2的启动子活性、基因表达、和/或蛋白表达，本发明的独特组合物用于增加或刺激骨生长和治疗或预防各种骨病症。

肿瘤坏死因子(TNF)家族成员RANK-L，即细胞核因子(NF)-κB受体激活蛋白配体(也作为：护骨蛋白配体，OPGL)，是成熟破骨细胞形成的主要刺激因子，对其生存必不可少，破骨细胞是帮助骨再吸收的骨细胞。RANK-L由成骨细胞的谱系细胞(osteoblasticlineage cell)和活化的T淋巴细胞产生。它激活位于破骨细胞和树突状细胞上的特异性受体RANK。本发明制剂的一种策略为当用IL-1刺激时直接抑制RANK-L表达。当用IL-1刺激时，RANK-L的激活可以直接触发破骨细胞形成(从而触发骨再吸收)。因此，通过抑制、减少、或预防RANK-L表达、产生、或释放，本发明的独特组合物用于抑制、减少、或预防骨再吸收和治疗或预防包括骨丢失、骨质疏松症、溶骨等各种骨病症。

槲皮素，涉及槲皮素提取物和各种形式的槲皮素，例如二水合槲皮素、脱水槲皮素等，是用于本发明的独特组合物中的一种化合物。槲皮素是形成许多其它类黄酮，包括柑橘类黄酮芸香苷、橙皮苷、柚皮苷和柑桔黄酮的″骨架″的类黄酮。在研究中发现槲皮素是最具活性的类黄酮，许多药用植物的大部分活性归因于其高槲皮素含量。槲皮素因为对炎症的几个初始过程的直接抑制已显示出显著的抗炎活性。例如，它同时抑制组胺和其它过敏性/炎性介体的产生和释放。此外，它产生有效的抗氧化剂活性和节省维生素C的作用。

槲皮素也在对抗或帮助预防癌症、前列腺炎、心脏病、白内障、变态反应、炎症、和呼吸系统疾病例如支气管炎和哮喘有积极的作用。此外，依照美国专利第5,478,579号，当按50-1500mg/天的量使用时，脱水槲皮素和/或二水合槲皮素可以增强钙进入骨组织的吸收。

富含槲皮素的食物包括苹果、红茶和绿茶、洋葱、覆盆子、红酒、红葡萄、柑橘类水果、青花椰菜、蚕豆、其它多叶青菜、和樱桃。

如下文更充分地论述，本发明部分地基于发现：槲皮素是BMP-2启动子活性和蛋白表达的有效激活剂。此外，下文论述的试验结果表明：当将二水合槲皮素与西伯利亚人参、甘草、或两者联合给药时，达到意想不到的协同作用，引起超过任何成分所单独能达到的BMP-2启动子活性和蛋白表达。

用于本发明的槲皮素成分可市购自各种来源，包括例如Twinlab(American Fork，Utah)、Jarrow Formulas(Los Angeles，California)、Natural Factors(Coquitlam，British Columbia，Canada)、和NOW Foods(Bloomingdale，Illinois)。此外，槲皮素可由下文更充分讨论的、或在本领域中描述的或已知的任何提取方法来获得。

地黄（Rehmannia)，用于本发明的独特组合物中的另一植物，是中国特有的唇形目（Lamiales)中六个种的有花植物的属。在中文称为dihuang(地黄)，该草药用于许多种疾病例如贫血、眩晕和便秘。地黄（Rehmannia)包含维生素A、B、C、和D，以及其它有用的化合物。

地黄(Rehmannia sp.)提取物即地黄(Rehmannia sp.)的提取物包括地黄(Rehmannia sp.)根提取物即地黄(Rehmannia sp.)根的提取物，可购自各种来源，包括EUL Herb Manufacturing (La Verne，California)和NuPharma Neutraceuticals(Miami Beach，Florida)。此外，地黄(Rehmannia sp.)提取物可由下文更充分讨论的、或在本领域中描述的或已知的任何提取方法来获得。

西伯利亚人参，用于本发明的独特组合物的化合物中的一种，也称为刺五加(Eleutherococcus senticosus)，是原产于东北亚的五加科(Araliaceae)中的一类小的、木质灌木。西伯利亚人参是具有许多健康益处的有效滋补药草。例如，西伯利亚人参具有抗乳(乳腺)癌、胃癌、口腔癌、皮肤黑素瘤和卵巢癌的免疫保护性作用。发现它对T淋巴细胞，主要是辅助型/诱导型T淋巴细胞有显著影响，而且还对细胞毒细胞和自然杀伤细胞有显著影响。此外，已知西伯利亚人参具有抗骨质疏松症的保护作用。见，例如，Kropotov等，″西伯利亚人参提取物和依普黄酮对糖皮质激素诱导的骨质疏松症发展的作用″(“Effects of Siberian ginseng extract and ipriflavone on the developmentof glucocorticoid-induced osteoporosis.”)Bull Exp Biol Med.，2002.133(3)：252-4。

如下文更充分地论述，本发明部分地基于发现：西伯利亚人参的提取物(即西伯利亚人参提取物)是BMP-2的启动子活性、BMP-2的基因表达和BMP-2的蛋白表达的有效激活剂。此外，下文论述的试验结果表明，当将西伯利亚人参提取物与二水合槲皮素联合给药时，这样的组合获得意想不到的协同作用，引起超过任一成分所单独达到的BMP-2的启动子活性、基因表达和蛋白表达。

西伯利亚人参提取物可购自多个供应商例如Xi′anTianxingjian Natural Bio-products Group(Xi′an，Shaanxi，China)。此外，西伯利亚人参(Rehmannia ginseng)提取物可使用下文更充分讨论的、或在本领域中描述的或已知的任何提取技术获得。在一个实例中，西伯利亚人参提取物可作为西伯利亚人参根和/或根茎的醇提取液而获得。

槐(Sophora japonica)、或槐角(Sophora fructus japonica)，用于本发明的独特组合物中的另一种化合物，也称为Pagoda Tree，原产于东亚。芸香苷，可在槐(Sophora japonica)提取物中找到的活性化合物，可用于增加毛细血管的通透性(例如，扩张的再溶解和多孔性)。除芸香苷之外，可从自槐(Sophora japonica)植物，包括叶、茎、花、种子、根等中提取脱水槲皮素和二水合槲皮素。

如下文所更充分地讨论，本发明部分地基于发现：槐(Sophora japonica)的提取物(即槐(Sophora japonica)提取物)是BMP-2的启动子活性、基因表达和蛋白表达的有效激活剂。

槐(Sophora japonica)提取物可购自各种供应商例如NuPharma Nutraceuticals(Miami Beach，Florida)。此外，槐(Sophorajaponica)提取物可使用下文更充分讨论的、或在本领域中描述的或已知的任何提取技术获得。在一个实施方案中，可使用槐(Sophorajaponica)的成熟种子来获得用于本发明的槐(Sophora japonica)提取物。

用于本发明的独特组合物的甘草提取物，一般广泛地用于治疗支气管问题例如卡他、支气管炎和咳嗽。甘草也在控制消化性溃疡生成、胃炎和溃疡中形成重要的成分。依照日本专利2002 179585和美国专利20020009506，当按50-100mg/日给药时，甘草可以用于治疗骨质疏松症、改善骨代谢、和促进钙化。

如下文更充分地论述，本发明部分地基于发现：甘草提取物(即甘草的提取物)，例如甘草的乙醇提取物和乙醇-水提取物，是BMP-2的启动子活性、基因表达和蛋白表达的有效激活剂。此外，下文讨论的分析结果表明：当将甘草提取物与二水合槲皮素联合给药时，这样的组合达到意想不到的协同作用，引起超过任一成分所单独达到的BMP-2的启动子活性、基因表达和蛋白表达。

甘草提取物可购自多个供应商例如Herbs Forever，Inc.(LosAngeles，California)。此外，甘草提取物可使用下文更充分讨论的或在本领域中已知的任何提取技术获得。在一个实施方案中，甘草提取物可以是得自洋甘草(Glycyrrhiza glabra)的根、长匐茎、和/或根茎的甘草的乙醇提取物。

依普黄酮，用于本发明的独特组合物中的另一化合物是异黄酮。虽然可在豆科植物例如苜蓿中发现少量的依普黄酮，但是依普黄酮一般使用多酚类作为起始材料，合成制备为7-异丙氧基异黄酮。

如下文所更充分地讨论，本发明部分地基于发现：依普黄酮是RANK-L表达的有效抑制剂。依普黄酮可购自各种来源。例如，是得自Technical Sourcing International，Inc.(Missoula，Montana)的合成的依普黄酮化合物。

可以提取石榴，以产生用于本发明的独特组合物的石榴提取物(石榴提取物)。当提取时，石榴，称为Punica granatum，一般被标准化为鞣花酸或安石榴甙含量。安石榴甙以2，3，六羟基二苯甲酰基-没食子酸基-D-葡萄糖的异构体存在。例示性结构显示如下：

石榴提取物还可富含多酚类，例如可水解的鞣质，特别是安石榴甙，安石榴甙可为造成石榴汁的自由基清除能力的原因。

在日本，石榴已被用于抑制骨量减少。见日本专利19990049884。本发明部分基于发现：石榴提取物是RANK-L表达、产生、或释放的有效抑制剂。在一个实例中，于石榴提取物中存在的安石榴甙抑制或减少RANK-L的表达。因此，包含安石榴甙、鞣花酸或两者的石榴提取物在用于抑制、减少、或预防RANK-L的产生、释放、和/或表达的组合物和方法中使用。

石榴提取物可购自各种来源，包括Nature′s Way(Springville，Utah)、Nature′s Herbs(AmericanFork，Utah)，Swansen′sHealth Products(Fargo，North Dakota)和Doctor′s Trust Vitamins(Orlando，Florida)。此外，石榴提取物可使用下文更充分讨论的或在本领域中已知的任何提取技术获得。

银杏(Ginkgo biloba)的提取物(即银杏(Ginkgo biloba)提取物)，用于本发明的独特组合物的另一提取物，已知具有三种作用：(1)改善血液流到大多数组织和器官(包括小毛细血管中的微循环)；(2)防止自由基损害氧化细胞(抗氧化剂)；和(3)阻断血小板聚集和血液凝固的作用。

银杏(Ginkgo biloba)提取物可购自各种来源，包括Puritan′sPride(Long Island，New York)。此外，银杏(Ginkgo biloba)提取物可使用本文公开的或在本领域中已知的任何提取方法获得。例如，银杏(Ginkgo biloba)提取物可使用本文公开的或在本领域中已知的任何提取方法提取银杏(Gindgo biloba)的干燥或新鲜叶子、或种子获得。

绿茶，可经提取以产生用于本发明的独特组合物中的一种化合物，一直就被中国人用作药物来治疗头痛、身体疼痛、消化不良、促进健康和延年益寿。绿茶提取物富含生物类黄酮，包括抗氧化剂表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)。绿茶提取物中的EGCG防止消化道和呼吸道感染，阻断致癌物质的作用，可以起抗菌剂的作用，也可以帮助降低胆固醇含量。

如下文所更充分地讨论，本发明部分地基于发现：绿茶提取物(或绿茶的提取物)是RANK-L表达的有效抑制剂。绿茶提取物可购自各种来源，包括Life Extension (Fort Lauderdale，Florida)。此外，绿茶提取物可使用下文更充分讨论的或在本领域中已知的任何提取技术获得。

葡萄籽提取物(或葡萄籽的提取物)，用于本发明的独特组合物中的另一种化合物，含有在人体内充当抗氧化剂(自由基清除剂)的被称为低聚原花色素或OPC的一类类黄酮复合物。OPC可帮助防止内部应激和环境应激(即，吸烟、污染、和支持正常的身体代谢过程)的作用。

用于本发明的葡萄籽提取物可得自市售的来源。例如，葡萄籽提取物可得自Kikkoman Corporation(Tokyo，Japan)、Polyphenols，Inc.(Madera，California)、Bio Serae Laboratories SA(Bram，France)、OptiPure(Los Angeles，California)、Dry Creek Nutrition，Inc.(Modesto，California)、或其它合适的来源。此外，可使用下文更充分讨论的、或在本领域中已知的或描述的那些提取技术以产生用于本发明的葡萄籽提取物。

当归，用于本发明的独特组合物中的一种提取物，也称为Angelica sinensis或″femail ginseng″，是伞形科(Apiaceae)的草药，原产于中国。它的根中文通常称为当归或danggui(中文：当归；拼音：dāngguī)，并被广泛地用于中国传统医学中以治疗妇科疾病、疲劳、轻度贫血和高血压。当归具有止痛、抗炎、止痉和镇静作用。该植物的植物化学成分包含香豆素、植物甾醇、多糖、阿魏酸盐、和类黄酮。

当归提取物(即当归的提取物)可购自各种不同来源，包括Capricorns Lair(Ogden，Utah)。此外，当归可使用下文更充分描述的任何提取技术、或在本领域中已知的任何提取技术提取。

虽然用于本发明的每一提取物均为市售，但有许多提取方法可以用来制备用于本发明提取物而不需要市购该提取物。可用来产生用于本发明提取物的提取方法的一些实例在下文描述。其它实例为已知的，在本领域包括各种出版物和专利中描述。下文更充分地描述的提取方法为例示性的，本领域的普通技术人员应理解可以使用其它提取技术和方法来获得用于本发明提取物。

用于本发明提取物可从许多来源中获得，包括不同的品种和物种。例如，得自任何颜色或品种的葡萄的葡萄籽均可用来获得葡萄籽提取物。此外，可提取植物的任何部分，包括果实、果皮、种子、茎、叶、根、茎皮、根茎、长匐茎等。

在一个实施方案中，可使用有机溶剂萃取技术获得用于本发明的独特组合物提取物。更具体地讲，用于本发明提取物，例如甘草提取物或甘草根提取物，可以通过用有机溶剂，例如己烷、醋酸乙酯、乙醇、或水-乙醇提取甘草或甘草根来制备。

在另一个实施方案中，可用溶剂顺序分级分离法(solventsequential fractionation)获得用于本发明的独特组合物提取物。例如，使用该技术，可用己烷、醋酸乙酯、乙醇、和水-乙醇相继提取葡萄籽来获得葡萄籽提取物。在所述顺序的每一步之后获得的提取物(级分(fraction))将会含有极性类似于用来提取它们的溶剂且极性次序递增的化合物。将所述级分干燥以蒸发溶剂，得到葡萄籽提取物。本领域的那些技术人员应理解许多其它溶剂可用于实行溶剂顺序分级分离提取法。

也可使用总水-乙醇提取技术(total hydro-ethanolicextraction technique)以获得用于本发明的独特组合物提取物。总而言之，这称为一次性提取(lump-sum extraction)。该方法所产生的提取物包含在提取材料中存在的多种植物化学成分，包括脂溶物和水溶物。在收集提取溶液之后，将溶剂蒸发，得到提取物。在一个实施方案中，可使用该技术提取石榴。

总乙醇提取法也可用于本发明。该技术使用乙醇作为溶剂，而不是水-乙醇(hydro-ethanol)。该提取技术产生的提取物除包括水溶性化合物之外还可包括脂溶性的和/或亲脂化合物。绿茶提取物可使用该技术获得。

可用来获得用于本发明提取物的提取技术的另一实例是超临界流体二氧化碳萃取法(SFE)。在该提取方法中，被提取材料不暴露于任何有机溶剂。相反，提取溶剂为超临界条件(＞31.3℃和＞73.8巴)下的二氧化碳，含或不含改性剂。本领域技术人员应理解可改变温度和压力条件以获得最好提取物产量。该技术产生脂溶性的化合物和/或亲脂化合物提取物，类似于上述总己烷和醋酸乙酯提取技术。

本领域的那些技术人员应理解：有许多其它提取方法，在本领域中已知的和在各种专利和出版物中描述的提取方法都可用来获得用于实践本发明提取物。例如，在以下文献中描述的提取方法可用于实践本发明：Murga等，″使用超临界的二氧化碳和乙醇的混合物从葡萄籽中提取天然复合酚类和鞣质。″(“Extraction of naturalcomplex phenols and tannins from grape seeds by using supercriticalmixtures of carbon dioxide and alcohol.”)J.Agric Food Chem.2000年8月：48(8)：3408-12；Hong等，″葡萄籽中酚类化合物微波辅助提取。″(“Microwave-assisted extraction of phenolic compounds from grapeseed.”)Nat Prod Lett.2001；15(3)：197-204；Ashraf-Khorassani等，″通过使用基于CO₂流体的单一系统将葡萄籽顺序分级分离成油、多酚、和原花青素。″(“Sequential fractionation of grape seeds into oils，polyphenols，and procyanidins via a single system employing CO2-basedfluids.”)J.Agric Food Chem.，2004年5月；52(9)：2440-4，这些文献通过引用结合到本文中。

本发明的组合物

本发明的组合物可在可接受的载体中配制，并可制备、包装和贴签，用于增加或刺激骨生长，抑制、减少、或预防骨再吸收，增加骨强度，改善骨结构，改善骨构造，或各种骨病症的治疗、预防或处理，所述骨病症包括但不限于骨折、骨质疏松症、牙周病、转移性骨病、和溶骨性骨病。

在一个实施方案中，本发明为用于增加或刺激骨生长的组合物，该组合物包含以下中的至少两种的组合：脱水槲皮素、二水合槲皮素、地黄(Rehmannia sp.)提取物、西伯利亚人参提取物、槐(Sophorajaponica)提取物、甘草提取物、和依普黄酮，其中该组合增加BMP-2的基因或蛋白表达。

在另一个实施方案中，本发明为用于增加骨生长的组合物，该组合物包含以下中的至少两种的组合：脱水槲皮素、二水合槲皮素、地黄(Rehmannia sp.)提取物、西伯利亚人参提取物、槐(Sophorajaponica)提取物、甘草提取物、和依普黄酮，其中该组合增加BMP-2的基因或蛋白表达，并还其中，假如存在下列组分的话，那么：脱水槲皮素或二水合槲皮素，则占约10-1000mg，更优选占约200-750mg，更优选占约300-700mg，更优选占约400-600mg，更优选占约500mg；地黄(Rehmannia sp.)提取物占约10-1000mg，更优选占约100-900mg，更优选占约200-800mg，更优选占约300-700mg，更优选占约400-600mg，更优选占约500mg；西伯利亚人参提取物占100-800mg，更优选占约200-750mg，更优选占约300-700mg，更优选占约400-600mg，更优选占约500mg；槐(Sophora japonica)提取物占10-1000mg，更优选占约100-900mg，更优选占约200-800mg，更优选占约300-700mg，更优选占约400-600mg，更优选占约500mg；甘草提取物占约10-500mg，更优选占约25-450mg，更优选占约50-400mg，更优选占约75-350mg，更优选占约100-300mg，更优选占约125-250mg，更优选占约25-175mg；而依普黄酮占200-700mg，更优选占约250-650mg，更优选占约300-600mg，更优选占约400-500mg，更优选占约600mg。

在另一个实施方案中，本发明为用于增加或刺激骨生长的组合物，该组合物包含脱水槲皮素、二水合槲皮素、西伯利亚人参提取物、槐(Sophora japonica)提取物、和甘草提取物的组合，其中该组合增加BMP-2的基因或蛋白表达，并还其中脱水槲皮素或二水合槲皮素占约10-1000mg，更优选占约200-750mg，更优选占约300-700mg，更优选占约400-600mg，更优选占约500mg；西伯利亚人参提取物占约100-800mg，更优选占约200-750mg，更优选占约300-700mg，更优选占约400-600mg，更优选占约500mg；槐(Sophora japonica)提取物占约10-1000mg，更优选占约100-900mg，更优选占约200-800mg，更优选占约300-700mg，更优选占约400-600mg，更优选占约500mg；而甘草提取物占10-500mg，更优选占约25-450mg，更优选占约50-400

mg，更优选占约75-350mg，更优选占约100-300mg，更优选占约125-250mg，更优选占约25-175mg。

在另一个实施方案中，本发明为用于增加或刺激骨生长的组合物，该组合物包含以下的组合：约10-1000mg的脱水槲皮素、二水合槲皮素，更优选约250-750mg，更优选约300-700mg，更优选约400-600mg，更优选约500mg的脱水槲皮素、二水合槲皮素；约100-800mg的西伯利亚人参，更优选约200-750mg，更优选约300-700mg，更优选约400-600mg，更优选约500mg的西伯利亚人参；和约10-500mg的甘草提取物，更优选约25-450mg，更优选约50-400mg，更优选约75-350mg，更优选约100-300mg，更优选约125-250mg，更优选约25-175mg的甘草提取物，其中该组合增加BMP-2的基因或蛋白表达。

在还一个实施方案中，本发明为用于增加或刺激骨生长的组合物，该组合物包含脱水槲皮素或二水合槲皮素、西伯利亚人参提取物、和甘草提取物的组合，其中该组合增加BMP-2的基因或蛋白表达，并还其中脱水槲皮素或二水合槲皮素、西伯利亚人参提取物、和甘草提取物占等份量，更优选其中西伯利亚人参提取物以脱水槲皮素或二水合槲皮素量的1/2的量存在，甘草提取物以脱水槲皮素或二水合槲皮素量的1/10的量存在。

在另一个实施方案中，本发明为用于增加或刺激骨生长的组合物，该组合物包含脱水槲皮素或二水合槲皮素、和西伯利亚人参提取物的组合，其中脱水槲皮素或二水合槲皮素占该组合物的约10-75％w/w，更优选占该组合物的约50％w/w，西伯利亚人参提取物占该组合物的约10-75％w/w，更优选占该组合物的约50％w/w，其中脱水槲皮素或二水合槲皮素和西伯利亚人参提取物的组合增加BMP-2的基因或蛋白表达。

在还另一个实施方案中，本发明为用于增加或刺激骨生长的组合物，该组合物包含以下中的至少两种的组合：脱水槲皮素、二水合槲皮素、西伯利亚人参提取物、槐(Sophora japonica)提取物、和甘草提取物，其中假如存在下列组分的话，那么脱水槲皮素或二水合槲皮素占该组合物的约10-75％w/w，更优选占该组合物的约50％w/w；西伯利亚人参提取物占该组合物的约10-75％w/w，更优选占该组合物的约50％w/w；槐(Sophora japonica)提取物占该组合物的约1-50％w/w，更优选占该组合物的约2-15％w/w，更优选占该组合物的约5-10％w/w；而甘草提取物占该组合物的约1-50％w/w，更优选占该组合物的约2-15％w/w，更优选占该组合物的约5-10％w/w，还其中该组合增加BMP-2的基因或蛋白表达。

在还一个实施方案中，本发明为用于增加或刺激骨生长的组合物，该组合物包含以下的组合：约10-1000mg的脱水槲皮素或二水合槲皮素，更优选约250-750mg，更优选约300-700mg，更优选约400-600mg，更优选约500mg的脱水槲皮素或二水合槲皮素；和约10-500mg的甘草提取物，更优选约20-125mg，更优选约20-100mg，更优选约25-75mg，更优选约50mg的甘草提取物，其中该组合增加BMP-2的基因或蛋白表达。

在另一个实施方案中，本发明为用于增加或刺激骨生长的组合物，该组合物包含以下的组合：约10-1000mg的脱水槲皮素或二水合槲皮素，更优选约250-750mg，更优选约300-700mg，更优选约400-600mg，更优选约500mg的脱水槲皮素或二水合槲皮素；和约100-800mg的西伯利亚人参提取物，更优选约200-750mg，更优选约300-700mg，更优选约400-600mg，更优选约500mg的西伯利亚人参提取物，其中脱水槲皮素或二水合槲皮素、和西伯利亚人参提取物的组合增加BMP-2的基因或蛋白表达。

在还一个实施方案中，本发明为在受试者中增加或刺激骨生长的方法，该方法包括给予该受试者包含以下中的至少两种的组合的组合物：脱水槲皮素、二水合槲皮素、地黄(Rehmannia sp.)提取物、地黄(Rehmannia sp.)根提取物、西伯利亚人参提取物、槐(Sophorajaponica)提取物、甘草提取物、和依普黄酮，其中该组合增加受试者的BMP-2的基因或蛋白表达。

本发明的还一个实施方案是在受试者中增加或刺激骨生长的方法，该方法包括给予该受试者包含以下组合的组合物：约10-1000mg的脱水槲皮素或二水合槲皮素，更优选约250-750mg，更优选约300-700mg，更优选约400-600mg，更优选约500mg的脱水槲皮素或二水合槲皮素；约100-800mg的西伯利亚人参提取物，更优选约200-750mg，更优选约300-700mg，更优选约400-600mg，更优选约500mg的西伯利亚人参提取物；和约10-500mg的甘草提取物，更优选约25-450mg，更优选约50-400mg，更优选约75-350mg，更优选约100-300mg，更优选约125-250mg，更优选约25-75mg的甘草提取物，其中该组合增加BMP-2的基因或蛋白表达。

本发明的另一个实施方案是在受试者中增加或刺激骨生长的方法，该方法包括给予该受试者包含以下组合的组合物：约10-1000mg的脱水槲皮素或二水合槲皮素，更优选约250-750mg，更优选约300-700mg，更优选约400-600mg，更优选约500mg的脱水槲皮素或二水合槲皮素；和约10-500mg的甘草提取物，更优选约20-125mg，更优选约20-100mg，更优选约25-75mg，更优选约50mg的甘草提取物，其中该组合增加BMP-2的基因或蛋白表达。

本发明的还一个实施方案是在受试者中增加或刺激骨生长的方法，该方法包括给予该受试者包含以下组合的组合物：约10-1000mg的脱水槲皮素或二水合槲皮素，更优选约250-750mg，更优选约300-700mg，更优选约400-600mg，更优选约500mg的脱水槲皮素或二水合槲皮素；和约100-800mg的西伯利亚人参提取物，更优选约200-750mg，更优选约300-700mg，更优选约400-600mg，更优选约500mg的西伯利亚人参提取物，其中脱水槲皮素或二水合槲皮素、和西伯利亚人参提取物的组合增加受试者的BMP-2基因或蛋白的表达和/或活性。

在另一个实施方案中，本发明为用于抑制、减少、或预防骨再吸收的组合物，该组合物包含石榴提取物和以下天然的、植物来源的提取物中的至少一种：西伯利亚人参提取物、银杏(Ginkgo biloba)提取物、绿茶提取物、槐(Sophorajaponica)提取物、地黄(Rehmannia sp.)提取物、葡萄籽提取物、当归提取物、和依普黄酮，其中该组合物抑制RANK-L的表达、产生、和/或释放，并还其中石榴提取物占约10-2000mg，更优选占约300-1700mg，更优选占约400-1500mg，更优选占约500-1250mg，更优选占约600-1000mg，更优选占约700-900mg；更优选占约500mg；并且假如存在下列组分的话，那么：西伯利亚人参提取物占约100-2000mg，更优选占约300-1700mg，更优选占约400-1500mg，更优选占约500-1250mg，更优选占约600-1000mg，更优选占约700-900mg；更优选占约500mg；银杏(Ginkgo biloba)提取物占约10-1000mg，更优选占约100-900mg，更优选占约200-800mg，更优选占约300-700mg，更优选占约400-600mg，更优选占约500mg；绿茶提取物占约300-700，更优选占约350-650mg，更优选占约400-600mg，更优选占约500mg；槐(Sophora japonica)提取物占10-1000mg，更优选占约100-900mg，更优选占约200-800mg，更优选占约300-700mg，更优选占约400-600mg，更优选占约500mg；地黄(Rehmannia sp.)提取物占约10-1000mg，更优选占约100-900mg，更优选占约200-800mg，更优选占约300-700mg，更优选占约400-600mg，更优选占约500mg；葡萄籽提取物占35-250mg，更优选占约50-150mg，更优选占约75-125mg；当归提取物占约10-1000mg，更优选占约100-900mg，更优选占约200-800mg，更优选占约300-700mg，更优选占约400-600mg，更优选占约500mg；而依普黄酮占约400-700mg，更优选占约450-650mg，更优选占约500-600mg，更优选占约600mg；其中该组合抑制RANK-L的表达、产生和/或释放或抑制钙从骨的释放。

在还一个实施方案中，本发明为用于抑制、减少、或预防骨再吸收的组合物，该组合物包含以下的组合：约10-2000mg的石榴提取物，更优选约400-1700mg，更优选约500-1500mg，更优选约600-1250mg，更优选约700-1000mg，更优选约800-900mg的石榴提取物；约35-250mg的葡萄籽提取物，更优选约50-150mg，更优选约75-125mg的葡萄籽提取物；约400-700mg的依普黄酮，更优选约450-650mg，更优选约500-600mg，更优选约600mg的依普黄酮；和约300-700mg的绿茶提取物，更优选约350-650mg，更优选约400-600mg，更优选约500mg的绿茶提取物，其中该组合抑制RANK-L的表达、产生、和/或释放或者抑制钙从骨的释放。

在另一个实施方案中，本发明为用于抑制、减少、或预防骨再吸收的组合物，该组合物包含以下的组合：约10-2000mg的石榴提取物，更优选约400-1700mg，更优选约500-1500mg，更优选约600-1250mg，更优选约700-1000mg，更优选约800-900mg的石榴提取物；约35-250mg的葡萄籽提取物，更优选约50-150mg，更优选约75-125mg的葡萄籽提取物；和约400-700mg的依普黄酮，更优选约450-650mg，更优选约500-600mg，更优选约600mg的依普黄酮，其中该组合抑制RANK-L的表达、产生、和/或释放或者抑制钙从骨的释放。

在另一个实施方案中，本发明为用于抑制、减少、或预防骨再吸收的组合物，该组合物包含石榴提取物、葡萄籽提取物、和依普黄酮的组合，其中葡萄籽提取物占约1/10，石榴提取物和依普黄酮占约400-700mg，更优选占约450-650mg，更优选占约500-600mg，更优选占约600mg，其中该组合抑制RANK-L的表达、产生、和/或释放或者抑制钙从骨的释放。

在还一个实施方案中，本发明为用于抑制、减少、或预防骨再吸收的组合物，该组合物包含石榴提取物、葡萄籽提取物、依普黄酮、和绿茶提取物中的至少两种的组合，其中，假如存在下列组分的话，那么：石榴提取物占该组合物的约25-100％w/w，更优选占该组合物的约30-90％w/w，更优选占该组合物的约40-80％w/w，更优选占该组合物的约45-60％w/w，更优选占该组合物的约50％w/w；葡萄籽提取物占该组合物的约1-25％w/w，更优选占该组合物的约2-15％w/w，更优选占该组合物的约5-10％w/w；依普黄酮占该组合物的约25-100％w/w，更优选占该组合物的约30-90％w/w，更优选占该组合物的约40-80％w/w，更优选占该组合物的约45-60％w/w，更优选占该组合物的约50％w/w；而绿茶提取物占该组合物的约1-25％w/w，更优选占该组合物的约2-15％w/w，更优选占该组合物的约5-10％w/w，还其中该组合抑制RANK-L的表达、产生、和/或释放或者抑制钙从骨的释放。

本发明的另一个实施方案是在受试者中抑制、减少、或预防骨再吸收的方法，该方法包括给予该受试者包含天然的、植物来源的提取物的组合物，该提取物包括以下提取物中的至少一种：石榴提取物、西伯利亚人参提取物、银杏(Ginkgo biloba)提取物、绿茶提取物、槐(Sophora japonica)提取物、地黄(Rehmannia sp.)提取物、葡萄籽提取物、当归提取物、和依普黄酮，其中该组合物抑制RANK-L的表达、产生、和/或释放或者抑制钙从骨的释放。

在还一个实施方案中，本发明为在受试者中抑制、减少、或预防骨再吸收的方法，该方法包括给予该受试者包含以下的组合的组合物：约10-2000mg的石榴提取物，更优选约400-1700mg，更优选约500-1500mg，更优选约600-1250mg，更优选约700-1000mg，更优选约800-900mg的石榴提取物；约35-250mg的葡萄籽提取物，更优选约50-150mg，更优选约75-125mg的葡萄籽提取物；约400-700mg的依普黄酮，更优选约450-650mg，更优选约500-600mg，更优选约600mg的依普黄酮；和约300-700mg的绿茶提取物，更优选约350-650mg，更优选约400-600mg，更优选约500mg的绿茶提取物，其中该组合抑制RANK-L的表达、产生、和/或释放或者抑制钙从骨的释放。

在还一个实施方案中，本发明为在受试者中抑制、减少、或预防骨再吸收的方法，该方法包括给予该受试者包含以下的组合的组合物：约10-2000mg的石榴提取物，更优选约400-1700mg，更优选约500-1500mg，更优选约600-1250mg，更优选约700-1000mg，更优选约800-900mg的石榴提取物；约35-250mg的葡萄籽提取物，更优选约50-125mg，更优选约75-100mg的葡萄籽提取物；和约400-700mg的依普黄酮，更优选约450-650mg，更优选约500-600mg，更优选约600mg的依普黄酮，其中该组合抑制RANK-L的表达、产生、和/或释放或者抑制钙从骨的释放。

在还一个实施方案中，本发明为用于增加刺激骨生长并抑制、减少、或预防骨再吸收的食物增补剂疗法，该食物增补剂疗法包括第一组合物和第二组合物，该第一组合物包含以下中的至少两种的组合：二水合槲皮素、脱水槲皮素、西伯利亚人参提取物、甘草提取物、和槐(Sophora japonica)提取物，其中该第一组合物的组合增加BMP-2的表达和/或活性；该第二组合物包含以下中的至少两种的组合：石榴提取物、葡萄籽提取物、依普黄酮、和绿茶提取物，其中该第二组合物的组合抑制RANK-L的表达或者抑制钙从骨的释放。

在还一个实施方案中，本发明为用于增加或刺激骨生长并抑制、减少、或预防骨再吸收的食物增补剂疗法，该食物增补剂疗法包括第一组合物和第二组合物，该第一组合物包含以下中的至少两种的组合：脱水槲皮素、二水合槲皮素、西伯利亚人参提取物、甘草提取物、和槐(Sophora japonica)提取物，其中，假如存在的话，则脱水槲皮素或二水合槲皮素占约10-1000mg，更优选占约200-750mg，更优选占约300-700mg，更优选占约400-600mg，更优选占约500mg；其中，假如存在的话，则西伯利亚人参提取物占约100-800mg，更优选占约200-750mg，更优选占约300-700mg，更优选占约400-600mg，更优选占约500mg；其中，假如存在的话，则甘草提取物占10-500mg，更优选占约25-450mg，更优选占约50-400mg，更优选占约75-350mg，更优选占约100-300mg，更优选占约125-250mg，更优选占约25-175mg；和其中假如存在的话，则槐(Sophora japonica)提取物占约10-1000mg，更优选占约100-900mg，更优选占约200-800mg，更优选占约300-700mg，更优选占约400-600mg，更优选占约500mg，并还其中该第一组合物的组合增加BMP-2的表达和/或活性；该第二组合物包含以下中的至少两种的组合：石榴提取物、葡萄籽提取物、依普黄酮、和绿茶提取物，其中，假如存在的话，则石榴提取物占约10-2000mg，更优选占约400-1700mg，更优选占约500-1500mg，更优选占约600-1250mg，更优选占约700-1000mg，更优选占约800-900mg；其中，假如存在的话，则葡萄籽提取物占约35-250mg，更优选占约50-150mg，更优选占约75-125mg；其中，假如存在的话，则依普黄酮占约400-700mg，更优选占约450-650mg，更优选占约500-600mg，更优选占约600mg；和其中，假如存在的话，则绿茶提取物占约300-700mg，更优选占约350-650mg，更优选占约400-600mg，更优选占约500mg，并还其中该第二组合物的组合抑制RANK-L的表达或者释放或抑制钙从骨的释放。

给药方式

本发明的组合物可全身给药或局部给药。对于全身使用，本发明的组合物经配制用于依照常规方法的胃肠外(例如，静脉内、皮下、肌内、腹膜内、鼻内或经皮)递药或肠内(例如，经口或直肠)递药。静脉内给药可以通过一系列的注射或通过较长时间内的连续输注。注射给药或其它途径的分开间隔给药可以按从每周一次到每天三次的间隔来进行行。备选地，本文所公开的组合物可以以循环的方式(给予所公开的组合物；随后不给药；随后再给予所公开的组合物；等)来给予。可以连续进行治疗直至达到所需效果。备选地，本发明的组合物的给药可以是持续的，因此它是预防性给药，而不是用于治疗的给药。

一般而言，本发明的组合物可以包括化妆品上或药学上可接受的载体，例如盐水、缓冲盐水、5％葡萄糖水、含有痕量金属的硼酸-缓冲盐水等。本发明的组合物还可包括一种或多种辅料，例如，维生素A、维生素D、或钙；防腐剂；增溶剂；缓冲剂；白蛋白以预防小瓶表面上的蛋白质损失；润滑剂；填充剂；稳定剂；等。配制方法为本领域熟知的，在例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，Gennaro，Mack Publishing Co.，Easton PA，1990中公开，该文献通过引用结合到本文中。

本发明内使用的组合物可为无菌的、无热原的液体溶液或混悬液、包衣的胶囊、栓剂、冻干粉剂、透皮贴剂的形式或本领域已知的其它形式。局部给药可通过在受伤或损伤部位注射、或通过在该部位的固体载体的插入或附着、或通过粘性液体的直接、局部施用等来进行。对于局部给药，递药载体优选提供用于使骨或软骨生长的基质，并更优选为可以被受试者吸收而没有不良反应的载体。

水悬浮液可包含本发明提取物成分与以下物质的混合物：药理学上可接受的赋形剂例如维生素A、维生素D、和钙；悬浮剂例如甲基纤维素；和润湿剂例如软磷脂、溶血卵磷脂或长链-脂肪醇。所述水悬浮液还可包含依照工业标准的防腐剂、着色剂、矫味剂、甜味剂等。

优选地，本发明的组合物以丸剂、片剂、粉末、条、食物、饮料、锭剂等形式口服。另外，本发明的组合物可作为干燥的或粉状的制品存在，以在使用之前用水或其它合适的溶媒重新配制。可用以下药学上可接受的添加剂通过常规方法制备液体制剂：例如悬浮剂(例如，山梨醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂肪)；乳化剂(例如，卵磷脂或阿拉伯胶)；无水载体(例如，扁桃仁油、油酯、或经分馏的植物油)；和防腐剂(例如，对羟基苯酸甲酯或对羟基苯酸丙酯或山梨酸)。

当以饮料的形式给药时，本发明的组合物可基于水、基于奶、基于茶、基于果汁、或它们的一些组合。

本发明的组合物也可以通过常规方法用以下药学上可接受的赋形剂制备的固体形式口服：例如粘合剂(例如，预胶化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如，乳糖，微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石或硅石)；崩解剂(例如，马铃薯淀粉或淀粉羟基乙酸钠)；或润湿剂(例如，十二烷基硫酸钠)。可通过本领域熟知的方法包衣该固体。在优选的实施方案中，本发明的组合物可采取双片型硬壳胶囊(two-piece hard shell capsule)、软胶胶囊、或粉末的形式，以溶于用于口服的液体中。可适当地配制用于口服的制剂，以实现活性化合物的控释。

口服给药的本发明组合物还可包含增稠剂，所述增稠剂包括黄原胶、羧甲基-纤维素、羧乙基-纤维素、羟丙基-纤维素、甲基-纤维素、微晶纤维素、淀粉、糊精、发酵乳清、豆腐、麦芽糖糊精、多元醇包括糖醇(例如，山梨醇和甘露醇)、碳水化合物(例如乳糖)、藻酸丙二醇酯、结冷胶(gellan gum)、瓜尔豆胶(guar)、果胶、黄蓍胶、阿拉伯胶、槐豆胶、阿拉伯胶、明胶，以及这些增稠剂的混合物。这些增稠剂典型地以至多约0.1％的水平包含在本发明的制剂中，视所包含的具体增稠剂和所需粘性效果而定。

口服给药的本发明组合物可以，且典型地将会，含有有效量的一种或多种甜味剂，包括碳水化合物甜味剂和天然的和/或人造的无/低热量甜味剂。用于本发明的制剂的甜味剂的量将有所不同，但通常取决于使用的甜味剂的类型和所需的甜度。

除先前描述的制剂之外，该化合物也可配制为持续的和/或定时释放的制剂。常见的定时和/或控释释放系统包括，但不限于：淀粉、渗透泵、或明胶微胶囊。

若有需要，所述组合物可存在于包装或分配装置中，该包装或分配装置可包含一个或多个含本发明的组合物的单位剂型。所述包装可例如包含金属或塑料薄片，例如泡罩包装。包装或分配装置可附有给药说明书。

局部(topical and local)施用的本发明组合物的制剂包括在化妆品上或药学上合适的载体中的气溶胶喷雾剂、洗剂、凝胶剂和软膏剂，所述载体可包含低级脂族醇、聚乙二醇类(polyglycol)例如甘油、聚乙二醇、脂肪酸酯、油和脂肪、和硅酮。该制剂还可包含抗氧化剂例如抗坏血酸或生育酚，和防腐剂例如对羟基苯甲酸酯。

胃肠外制剂尤其包含无菌的或已灭菌的制品。

可提供包含本发明提取物和任何已知的可注射载体的组合的可注射组合物。这些组合物可含有调节渗透压的盐。

其它有用的剂型可以通过本领域的那些技术人员充分了解的方法和技术制备，并可包括在制备片剂、胶囊、或液体剂型时使用的附加成分。虽然本文讨论了例示性的剂量、给药频率、和给药方法，但这些仅仅是例示性的，并且应理解的是，剂量、给药频率、和给药方式可依照个体消费者或患者的年龄、体重、条件和反应、及所使用的本发明的具体组合物而改变。

实施例

进行动物试验不是申请人的策略。然而，申请人通过本发明的组合物和方法所使用的潜在成分的体外试验得到了显著结果，虽然体外试验可以提供有用的信息，但是这样的试验不能代替动物研究，因为骨作为器官连同控制它的复杂机制不能在实验室中被模仿。因此，申请人进行了如下所述的几个动物研究，以确定用于本发明的组合物和方法的活性。在进行所有的动物研究中，申请人遵循如以下文献所概述的对动物的操作和人道处理的指南：例如，由Food andDrug Administration在1994年4月公布的Guidelines for Preclinical andClinical Evaluation of Agents Used in the Prevention or Treatment ofPostmenopausal Osteoporosis，Division of Metabolic and Endocrine DrugProducts，其全部内容通过引用结合到本文中。也见World HealthOrganization在1998年公布的Guidelines for Preclinical Evaluation andClinical Trials in Osteoporosis(ISBN号9789241545228)和Wark，JohnD.和Westmore，Ann的Studies of drugs and other measures to preventand treat osteoporosis；可在www.who.int/entity/ageing/publications/noncommunicable/alc osteoporosis bhef.pdf-(最后访问时间：2007年10月21日)得到为非专家提供的指南，其全部内容通过引用结合到本文中。

实施例1：BMP-2的启动子、基因、和蛋白质的表达/活性

使用具有1％青霉素/链霉素和1％谷酰胺的10％FCS的α-MEM培养2T3-BMP2-萤光素酶细胞，并每周分出1/5一次，所述细胞为转染有与萤光素酶标记基因连接的BMP-2启动子的鼠成纤维细胞。以5×10³细胞/100μl/孔的细胞密度将该细胞接种到微量滴定板中。经过5％CO₂37℃下的24小时预孵育期允许细胞粘附和稳定。去除培养基，用50μl的4％FCS的α-MEM代替。将包含待测试化合物或因子(2x)的50μl无血清培养基(Serum Free)(0.1％BSA)加入每个孔中。最终体积为100ul，最终血清浓度为2％FCS。使用的常规阳性对照是以重组人BMP2(″rhBMP2″)或中国仓鼠卵巢-BMP2(″CHO-BMP2″)为条件的培养基。然后在37℃、5％CO₂下将所处理的细胞孵育48小时。然后去除培养基，用PBS将细胞洗涤3次。将过量的PBS从孔中去除，将100μl的细胞培养物溶解剂(Promega#E153A)加入到每一孔中，并孵育至少10分钟。将10μl的细胞溶解产物加入到含100μl有底物(Promega#E152A)的萤光素酶测定缓冲液的96孔白色发光测定板(Dynatech Labs#0010107100)中。使用Dynatech ML2250自动96孔发光计读取萤光素酶活性。然后将该数据表示为萤光素酶活性/孔的百分数或者萤光素酶活性/μg蛋白质的百分数。

测试以下化合物激活BMP-2的启动子的能力：槲皮素、地黄(Rehmannia sp.)提取物、地黄(Rehmannia sp.)根提取物、西伯利亚人参提取物、槐(Sophora japonica)提取物、甘草提取物、依普黄酮、和cal-z-bone。测试的结果和浓度报道于下面的表1中：

表1：BMP2的启动子分析(与对照的比例)

在表1中，R-1＝地黄(Rehmannia sp.)提取物(EUL)，R-2＝地黄(Rehmannia sp.)提取物(Draco)，R-3＝地黄(Rehmannia sp.)根(NuPharma)，SFJ＝槐角(Sophora fructusjaponica)，SJ＝槐(Sophorajaponica)(NuPharma)，SG＝西伯利亚人参，Q＝槲皮素，I＝依普黄酮，L＝甘草，CZB＝Cal-Z-bone。^*注意：如果倍数值为2或更大，那么该处理显著地激活BMP-2启动子。如果倍数值小于2，那么该处理对BMP-2启动子无效。因此，依照该试验，二水合槲皮素和依普黄酮是BMP-2启动子的最有效激活剂。

也可能使用类似于上述用于测试BMP-2启动子活性的那些测定法来测试BMP-2基因表达和蛋白表达。具体而言，对于基因表达而言，在37℃和5％CO₂下将人骨肉瘤细胞系，MG-63(ATCC#CRL-1427)维持在含酚红的MEM(如由ATCC所推荐的)中。在实验之前24小时，将3×10⁵个细胞接种到不含酚红的MEM中的12孔板中。对于每一实验，按10、1、和0.1μg/ml的处理浓度，用试验提取物处理细胞。经过夜孵育之后，使用常规的基于trizol/异硫氰酸胍的溶胞作用提取RNA。分离得到的RNA用不含RNA酶的DNA酶I消化，以去除任何DNA污染物，然后依照制造厂家(Stratagene)的说明书，使用随机六聚体以及寡脱氧胸苷(oligo(dT))引物逆转录形成cDNA。使用对BMP-2的FAM-标记的特异性引物和对18S rRNA的HEX-标记的特异性引物(Invitrogen)进行定量实时PCR测定。所有的反应进行三个重复，并使用Applied Biosystems(2001)建立的比较C_τ方法，计算处理的样品中的mRNA与未处理的样品中的mRNA比较的相对量。2倍或更大的基因表达变化被认为是显著的。

为了测量BMP-2蛋白表达，以1×10⁴细胞/孔的密度将Hu09细胞接种到96孔培养板中，用补充了10％FCS的a-MEM培养24小时。用不同的蛋白酶体抑制剂将细胞处理24小时。在孵育之后，将经以上条件处理的培养基转移入微量离心管中，于14,000rpm离心2-3分钟，以去除细胞碎屑。然后使用标准BMP-2酶联免疫吸附测定试剂盒(R&D ELISA KIT DBP200)测定上清液中BMP-2蛋白的浓度。将重组体hBMP-2(R&D)用作标准。

测试以下化合物增加BMP-2的基因表达和蛋白表达的能力：槲皮素、地黄(Rehmannia sp.)提取物、地黄(Rehmannia sp.)根提取物、西伯利亚人参提取物、槐(Sophora japonica)提取物、甘草提取物、依普黄酮、和cal-z-bone。在蛋白表达测定中测试的结果和浓度报道于下面的表2中。

表2：BMP-2的蛋白表达分析

在表2中，R-1＝地黄(Rehmannia sp.)提取物(EUL)，R-2＝地黄(Rehmannia sp.)提取物(Draco)，R-3＝地黄(Rehmannia sp.)根(NuPharma)，SFJ＝槐角(Sophora fructus japonica)，SJ＝槐(Sophorajaponica)(NuPharma)，SG＝西伯利亚人参，Q＝槲皮素，I＝依普黄酮，L＝甘草，CZB＝CaI-Z-bone。^*注意：如果倍数值为2或更大，那么该处理显著地激活BMP-2蛋白表达。如果倍数值小于2，那么该处理对BMP-2的蛋白表达无效。

在基因表达测定中测试的结果和浓度于下面的表3中列出。2倍变化或更多的基因表达增加被认为是显著的。

表3：BMP-2的基因表达分析，10μg/ml

试验成分：	基因表达中的倍数变化：
		地黄(Rehmannia sp.)提取物(EUL)	28倍增加
地黄(Rehmannia sp.)提取物(Draco)	11.7倍增加
		地黄(Rehmannia sp.)根(NuPharma)	6.3倍增加
槐角(Sophora fructus japonica)	49倍增加
		槐(Sophora japonica)(NuPharma)	8.3倍增加
西伯利亚人参	27倍增加
		槲皮素	2.6倍增加
依普黄酮	无效
		甘草	45倍增加

基因表达测定的另外结果于下面的表4中列出。在表4中，Q＝槲皮素，SG＝西伯利亚人参，SJ＝槐(Sophora japonica)，L＝甘草。2倍的基因表达增加或更多被认为是显著的。发现在槲皮素对甘草的比值为10∶5即2∶1和10∶10即1∶1时超过单独的槲皮素，起协同作用。

表4：BMP-2的基因表达分析

实施例2：测量骨生长的颅盖分析

从4天大的瑞士白鼠上切除新生鼠颅盖，放入BGJ培养基(Sigma)，沿中缝(midline suture)切成两半。将一毫升补充了0.1％牛血清白蛋白(BSA)的BGJ培养基加入到12孔组织培养板(Costar)的每一孔，其中添加了相关的因子或载体。将每一半颅盖放在位于培养基上方的培养基/空气接触面上的不锈钢网格(stainless steel grid)上。通常每个实验组使用4块骨头。可以用重组BMP-2(5μg/ml)、FGF(100ng/ml)或胰岛素(10μg/ml)作为骨形成的阳性刺激物。在第0天(解剖那天)加入待测试的因子，在24和96小时时改变培养基(如果需要7天的试验)。将颅盖保持在37℃的湿润空气(5％CO₂)中。在培养期之后，然后将颅盖取出，在10％福尔马林中固定(fixed)过夜。然后在14％EDTA中将颅盖脱钙过夜，然后包埋在石蜡中。然后使用标准切片机，沿中缝进行切片，以显示冠缝和在该缝后方的区域。最初在两个连续的400nm深处取四微米切片。将切片置于涂布的载玻片上(Superfrost plus，FisherScientific，Pittsburgh，PA)，用苏木精和曙红染色。在矢状缝后方的切片中测定总骨面积和新骨面积(表示为mm²)、缝厚度(mm)、和衬在骨表面的细胞数目。使用Osteomeasure系统(Osteometries INC，Atlanta，GA)进行组织形态计量学分析。

在该测定中测试的提取物包括槐角(Sophora fructusjaponica)提取物、西伯利亚人参提取物、二水合槲皮素、脱水槲皮素、依普黄酮、甘草、和Cal-Z-bone。颅盖试验中提取物的测试结果于下面的表5和表6中报道。在表5中，SJ＝槐角(Sophora fructus japonica)，SG＝西伯利亚人参，Q＝槲皮素，I＝依普黄酮，L＝甘草，CZB＝Cal-Z-Bone。BMP-2和辛伐他汀(Simvastatin)被用作阳性对照。在下面的表格中，上标a(^a)指该结果显著不同(p＜0.05)于空白试样(浓度为0μg/ml)。p＜0.05的差异(即其中误差界限小于或等于5％)被认为是显著的。表5中的前四行数据基于各种比值的成分的混合物，例如″Q∶SG″下的1∶1表示二水合槲皮素和西伯利亚人参以相同的量存在于该混合物中。

表5：颅盖分析结果-骨形成

显然，上述结果表明：槲皮素和提取物之间的协同作用不止是累加的。具体而言，假定是累加作用，那么预期在1μg/ml的浓度下有约12mm²×10^-3的新骨形成。因此，在50％浓度的槲皮素和西伯利亚人参提取物时，预期结果为约6mm²×10^-3，但上述结果显示：槲皮素和西伯利亚人参提取物的组合实现约13mm²×10^-3的新骨形成。

使用用于本发明组合物提取物的各种组合重复上述颅盖试验。对于表6，Q＝槲皮素，SG＝西伯利亚人参，L＝甘草。在下面的表格中，上标a(^a)指该结果显著不同(p＜0.05)于空白试样(浓度为0μg/ml)。p＜0.05的差异被认为是显著的。每一制剂的结果于下面的表6中报道。

表6：颅盖分析结果-由提取物组合激发的骨形成

实施例3：测量骨生长的体内研究

在涉及约12-14周龄、近似体重为200-250克的雌性、完整大鼠的体内试验中测试三种不同的配方。配方1包括以下剂量的脱水槲皮素和甘草，250mg槲皮素：250mg甘草的乙醇提取物和500mg槲皮素：500mg甘草的乙醇提取物。配方2包括以下剂量脱水槲皮素和甘草，250mg槲皮素：125mg甘草的乙醇提取物；500mg槲皮素：250mg甘草的乙醇提取物；和1000mg槲皮素：500mg甘草的乙醇提取物。配方3包括以下剂量的脱水槲皮素和甘草，1000mg槲皮素：200mg甘草的乙醇提取物。该研究持续35天。试验了八个单独组别的大鼠，每组15只大鼠。试验的八组大鼠中的两组为作对照组进行检测。一组是安慰剂对照组，另一组接受50μg/kg(10μg/200g)/每周3次的甲状旁腺素。甲状旁腺素，被称为同化激素类药，用作阳性对照。见，例如，Turner等，″Disuse in adult male rats attenuates thebone anabolic response to a therapeutic dose of parathyroid hormone.″J.Appl Physiol.2006，第101卷：881-886，其全部内容通过引用结合到本文中。

下面的表7标明给予8个试验组中每一组的配方。表7中的剂量基于推荐的人每日剂量。使用FDA剂量换算公式(人等效剂量(HED，mg/kg)＝大鼠剂量mg/kg×(大鼠重量kg/人重量kg)^0.33)，以将人剂量转换至大鼠剂量。

HED＝大鼠NOAEL×(W-大鼠/W-人)^(1-6)，b＝0.67。

在表7中，Q＝槲皮素，L＝甘草。

表7：在体内研究中测试的配方

使用雌性、Sprague Dawley大鼠(每只200-250gm，约12-14周龄)。以15gm/天喂养动物，包括安慰剂饮食或上述配方中的一种，从实验的开始持续35天。每天早上以15克/大鼠/天的比例对大鼠喂食。在整个实验过程中，允许大鼠自由获取水，并将其关养在合适的笼子中。在整个实验期间允许无限制的活动，持续35天。

通过测量结果评估所述配方对骨形成的作用，该测量结果包括生物力学测量(以评估骨强度与功能信息)、微-CT (以分析实际的骨质量(bone quality)和功能信息)、和组织形态学测量(以分析骨质量和功能信息)。实施组织形态学测量的方法在Pa Revell，″骨的组织形态学″(“Histomorphometry of Bone”)J.Cline.Pathol.，1983年，第36卷：1321-1331中描述，其全部内容通过引用结合到本文中。使用的术语和单位是由the Histomorphometry Nomenclature Committee of theAmerican Society for Bone and Mineral Research推荐的。实施微CT测量的方法在以下文献中描述：Jiang等，″动物骨骼3D结构的微CT和微MR影像″(“Micro CT and Micro MR imagining of 3D architectureof animal skeleton.”)，J.Musculoskel Neuron Interact.2000.第1卷：45-51，其全部内容通过引用结合到本文中。在处理35天之后测定这些测量结果。

在处理之后的第35天处死每一组中的六只动物。股骨用于组织形态学分析。为了测定不同配方对骨形成的作用，通过组织形态学技术评估骨小梁体积(trabecula bone volumn)、小梁细胞数目(trabecular cell number)和小梁间距(trabecular separation)。在下面的表8中，上标a(^a)指该结果显著不同于(p＜0.05)安慰剂组(空白处理)。p＜0.05的差异被认为是显著的。如下面的表8所示，与安慰剂组相比，阳性对照组即PTH(旁甲状腺素)显示：在用PTH处理之后骨体积显著增加(55.83％)、梁细胞数目显著增加(19.57％)、小梁间距减少(38.30％)。同样地，与安慰剂组相比，给予组3的配方表明：骨体积显著增加(47.59％)、小梁细胞数目显著增加(24.19％)、小梁间距减少(23.52％)，其效果可比得上PTH处理。

表8：组织形态学测量结果

表8说明：给予组5的配方与安慰剂相比显示骨小梁骨体积有显著的差异(P＜0.05)。

此外，表8报道了对骨小梁骨厚度的测量。数值更高的骨厚度表明骨中有更大量的矿物质沉积，可以引起骨量增加。与安慰剂组相比，给予组3的配方显著地增加骨小梁厚度(13.04％)，其效果可比得上PTH处理(7.35％)。

骨矿物质沉积率(bone mineral apposition rate)(MAR)，也在表8中报道，通过测量平均标记间距除以两次给予flurorchrome之间的时间间隔(5天)来测定。更大的骨矿物质沉积率(或矿化表面)意味着有更多的新骨沉积。该结果应与骨小梁厚度结果相对应。实际上，经35天的处理之后，与安慰剂组相比，给予组3的配方显示骨矿物质沉积率显著增加(26.60％)，其效果可比得上PTH处理(28.51％)。

表8另外提供骨形成率(BFR)的值。BFR由用四环素(使用表面荧光观察)标记的骨表面的范围和其中2种标记(钙黄绿素和四环素)所存在的区域中的标记之间的距离计算，它表示为平方微米每立方微米每天(μm²/mm³/天)。较高的骨形成率意味着可以形成较多的新的骨组织。骨形成率的结果与观察到的骨矿物质沉积率的变化一致。与安慰剂组相比，给予组3的配方显示骨形成率显著增加(51.37％)，其效果可比得上PTH处理(45.83％)。

用于本研究的另一效能测定技术是微-CT测量，微-CT测量可提供实际的骨质量、结构和功能信息。该分析的结果于下面的表9中报道。

对于定量和定性的骨结构评估，从许多参数例如骨矿物质密度(BMD)、骨体积(％骨体积/总体积)、小梁数目、和小梁间距获取信息是关键的。在这些参数中，骨体积、小梁数目、和小梁间距的结果与骨健康有关。

表9中报道的结果表明，与安慰剂组相比，给予组2和组5的配方有效地增强成骨细胞发生，显著地增加骨矿物质密度(BMD)，且它们的效果可比得上PTH处理。结果还表明，与安慰剂组相比，给予组1、2、和5的配方显著增加骨体积和小梁细胞数目，减少小梁间距，且它们的效果可比得上PTH处理。在表9中，上标a(^a)表示该结果显著不同(p＜0.05)于安慰剂组。p＜0.05的差异被认为是显著的。

表9：微-CT测量结果

除了骨量和骨体积评价之外，使用两个不同的参数对骨强度进行力学测试。一个参数测量使骨断裂所需要的最大力，另一个测定骨的刚度(弹性)。测定骨强度和刚度的方法在Sturmer等，″正常的和骨质疏松的大鼠干骺端胫骨的标准化弯曲试验和断裂试验：雌二醇、睾酮、和雷洛昔芬的作用″(“Standardized Bending and Breaking Testfor the Normal and Osteoporotic Metaphyseal Tibias of the Rat：Effectof Estradiol，Testosterone，and  Raloxifene”)J. Bone and MineralResearch，2006，第21卷(1)：89-96中描述，其全部内容通过引用结合到本文中。

在表10中，结果表明：在使骨断裂所需要的最大力和骨的刚度方面，在包括阳性对照组(PTH)和安慰剂组在内的任何处理组之间没有统计学差异。阳性对照组没有起作用可能是因为仅以3次/周的频率施用相对低剂量的PTH。虽然PTH是强效的同化激素类药，但PTH剂量是经过特别地选择，以提供对骨形成的适度作用而不诱导任何不良反应。

表10：生物力学测量结果

组编号	使骨破裂所需的最大力	骨刚度
			1	-0.1％	-0.1％
2	-0.1％	0.0％
			3	0.0％	0.0％
4	0.0％	0.0％
			5	-0.1％	-0.1％
6	0.0％	0.0％
			PTH	0.0％	0.0％

实施例4：RANK-L的抑制研究

称重150-250mg的每一成分，放入15ml锥形底管。使其溶于50％DMSO：30％乙醇：20％水的溶液，以得到50μg/ml的最终储液。对于溶剂对照，混合1.5ml DMSO、0.9ml乙醇、和0.6ml水。充分涡旋混匀。在室温下在水浴中声处理10分钟。再次充分涡旋混匀。在新鲜的不含酚红的培养基中稀释成分储液。

在37℃和5％CO₂时将人骨肉瘤细胞系，MG-63(ATCC#CRL-1427)维持在含有酚红的MEM(如ATCC推荐)中。在实验之前24小时，将3×10⁵个细胞接种到不含酚红的MEM中的12孔板中。将消耗的培养基从孔中去除，在37℃、5％CO₂下用1、0.1、0.01μg/ml的各测试成分或30ng/ml的TGF-β(阳性(+)对照)将MG-63细胞(ATCC编号CRL-1427)预处理4小时。TGF-β的储液为30μg/ml(得自R&D Systems，目录编号100-B-001)。

在预处理培养期之后，将10μg/ml的IL-lb(Calbiochem(目录编号407615)和10μg/ml的储液，目录编号407615)加入到细胞培养物中，37℃18小时。去除经处理和刺激的细胞的上层培养基，如制造厂商(来自APOTECH，目录编号APO-54N-016-k101)所述，使用RANK-L ELISA(重复三次)测量总RANK-L蛋白。将得到的蛋白量与经培养基(空白)处理刺激的细胞的蛋白量相比，以测定总RANK-L蛋白减少的百分数。

上述测定方法用于测定以下提取物抑制RANK-L的表达、产生、或释放的能力：银杏(Ginkgo biloba)提取物、绿茶提取物、槐角(Sophora fructua japonica)提取物、地黄(Rehmannia sp.)提取物、石榴提取物、西伯利亚人参提取物、依普黄酮、葡萄籽提取物、当归提取物、和槐(Sophora japonica)提取物。该测定的结果于下面的表11中报道。10％或更多的减少被认为是显著的。

表11：RANK-L蛋白的产生/释放(相对于未处理的对照)

基于表11报道的结果，可确定石榴提取物、依普黄酮(Ostivone)、葡萄籽提取物(40％原花色素)和绿茶提取物(40％EGCG)显示对RANK-L产生/释放的抑制有积极效应。因此，使用如上所述的RANK-L抑制试验测试这些成分的各种组合，以确定可以获得什么水平的RANK-L产生/释放抑制。结果于下面的表12中报道。如这些报道说明，发现10μg/ml的石榴提取物、10μg/ml依普黄酮、1μg/ml葡萄籽提取物、和1μg/ml绿茶提取物的组合是使对响应成骨细胞IL-1B蛋白质刺激的RANK-L合成的抑制最大化的配方。该结果也显示：具有石榴的任何组合一般均效果良好。此外，在该成分之中没有发现主要干扰(major interference)。

表12：RANK-L抑制

实施例5：从石榴分离安石榴甙

将新鲜石榴剥皮以使种子和果皮分离。使用水和乙醇组合(80∶20)分别提取种子、果皮、和果肉。果皮、种子、和果肉中的每一种都产生有安石榴甙提取物，但石榴果皮提取物得到最高水平的安石榴甙。此外，水显示为用于提取安石榴甙的最好提取溶剂。

实施例6：安石榴甙对RANK-L的抑制

使用100％DMSO以100mg/ml从石榴，包括从石榴果皮、外壳、肉果、和种子提取安石榴甙试样。不去除提取物中的颗粒物质。在不含酚红(雌激素)的MEM和0.1％FBS中稀释安石榴甙试样，以降低本底信号至十倍最终浓度。使最终DMSO浓度保持低于0.2％，在处理期间保持恒定。在未处理组中使用DMSO溶剂对照。

以200,000细胞每孔将MG63细胞(ATCC编号CRL-1472)，来源于人的骨肉瘤细胞系接种到10％FBS的不含酚红的MEM的12孔板中。第二天将培养基改为0.1％FBS的不含酚红的MEM。将细胞孵育四小时，然后以1、10、和100μg/ml的安石榴甙浓度处理试样。

在四小时的处理之后，将加入IL-1b(Calbiochem(目录编号407615)，10μg/ml的储液，目录编号407615)至3ng/mL的最终浓度。然后允许处理的细胞和刺激物IL-1b在37℃下孵育16小时。

在16小时之后将细胞溶解，用RNasy纯化试剂盒(Qiagen)从细胞提取RNA。将RNA逆转录形成cDNA，使用2-步骤qRT-PCR试剂(Invitrogen)和4μl的纯化的RNA通过qPCR定量。在50μL反应中，在具有1μl的RANK-L基因特异性引物的Stratagene Mx4000中退火温度为57℃(初始浓度10μM；HLUX3013920，Invitrogen Inc.)。

获得RANK-L和GAPDH基因表达Ct数据。用对GAPDH表达的调节来定量RNA。使用RANK-L表达的未处理对照值来评估处理影响。结果于下面的表13中报道。

表13：安石榴甙对RANK-L表达的影响

成分	N	RANK-L表达(增加倍数)
			未处理的	2	1.0±0.1
IL1B (3μg/ml)	2	3.3±0
			安石榴甙1μg/ml	2	2.6±0.5
安石榴甙10μg/ml	2	1.9±0.4
			安石榴甙100μg/ml	2	0.7±.02

如表13所示，从石榴提纯的安石榴甙以剂量依赖的形式抑制IL-1b刺激的RANK-L基因表达，在100μg/mL时完全抑制RANK-L表达。

实施例7：石榴的安石榴甙对IV型胶原酶(MMP9)蛋白表达的抑制。

在含有0.5％BSA的DMEM中共培养角质形成细胞和成纤维细胞。将共培养物暴露于各种浓度的从石榴中提取的安石榴甙(0.1％-10％)中。具体地说，测试浓度为1.0/ml、10μg/ml、和100μg/ml的石榴提取物抑制IV型胶原酶蛋白(基质金属蛋白酶-9/MMP9)表达的能力。在暴露于石榴提取物之后，用10ng/ml的IL-1B刺激共培养细胞18小时。在用IL-1B刺激18小时之后，测定培养基中的MMP9浓度，如下面的表14所示。

表14：石榴提取物对MMP9(IV型胶原酶)蛋白表达的影响

试验的石榴提取物	N	MMP9的抑制
			未处理的	2	1.0±0.1
1L1B(10ng/ml)	2	1.65
			安石榴甙1μg/ml	4	1.5±.06
安石榴甙10μg/ml	4	1.2±.04
			安石榴甙100μg/ml	4	1.0±0.1

表14报道的结果说明：在体外，石榴的安石榴甙抑制IL-1B刺激的胶原酶(MMP9)从角质形成细胞释放。这些结果表明，安石榴甙抑制炎症-刺激的胞外基质的分解。激活的破骨细胞通过分泌基质溶解酶(MMP)降低骨强度并增加骨丢失，以分解骨的胶原/磷酸钙构架。期望阻断对骨胶原/钙结构的破坏，以维持/改善骨强度和骨结构。增加的骨强度和骨结构的特点在于增加骨矿物质密度、增加骨体积、增加小梁细胞数目、减少小梁间距、改善骨构造、增加使断裂骨所需的最大力、和增加骨的刚度。

实施例8：葡萄籽提取物和石榴提取物对溶组织梭菌胶原酶活性的抑制

通过量取100mg的粉末制备样品。然后通过按顺序加入5∶3∶2比值的DMSO∶乙醇∶水制备50mg/ml的总样品提取物。因此对于100mg的粉末，可使用1ml DMSO、0.6ml乙醇、和0.4ml水。通过涡旋将溶液充分混合，然后在有声水浴中孵育10分钟。将样品由50mg/ml的储液浓度稀释至测试浓度。

使用市售的试剂盒(Molecular Probes，Eugene，OR)测定对胶原酶活性的抑制。该试剂盒基于消化用荧光标签标记的胶原底物的能力。在消化之前，将底物的荧光猝灭(quench)。在暴露于胶原酶之后，底物被切割，猝灭效应终止，结果荧光增强。首先将样品(依照上述方法制备)加入到试剂盒提供的胶原酶(0.2单位/ml)中。然后加入荧光底物(50μg/ml)，在室温下反应孵育1小时。在光吸收酶标仪(platereader)上在495/515nm的激发/发射波长处读取荧光。将数据表示为与不添加任何抑制剂的MMP相比的％对照。100％总的酶活性降低被认为是阳性反应。

对于石榴提取物和葡萄籽提取物，均观察到趋向于胶原酶活性减小的剂量依赖性反应(Table 15)。

激活的破骨细胞通过分泌基质消化酶(MMP)而降低骨强度和增加骨丢失，以分解骨的胶原/磷酸钙构架。依据本文提出的机制，发现特别是葡萄籽和石榴提取物为胶原酶活性的有效抑制剂。依据该活性，可获得胶原产生的净正平衡，引起骨强度和骨完整性的维持或改善。

表15：葡萄籽提取物和石榴提取物对C.溶组织胶原酶活性的抑制

实施例9：测量骨再吸收的抑制的颅盖分析

为了在子宫内标记新生小鼠的细胞，用⁴⁵Ca(25uCi/小鼠)注射怀孕的CD-1雌性小鼠(在按时间计算的第15天)。对4天大的小鼠进行解剖，取出颅盖(颅骨)，切成两半。将切开的一半颅盖置于1ml的BGJ生长培养基(Sigma)中的金属网格(在表面)上，该BGJ生长培养基包含0.1％BSA且添加有谷氨酰胺和青霉素/链霉素。在37℃下在5％CO₂增湿培养器中使骨孵育24小时，然后转移至含有1ml培养基且加有因子(IL-1、PTH和/或化合物)的孔中。在上述条件下将处理过的骨再孵育72小时。在该孵育期之后，取出骨，并放置在含20％TCA的闪烁瓶中1.5小时(以测量保留在骨中的标记的钙)，然后用闪烁液计数。此外，也对0.4ml的培养基计数(以测定从骨释放的标记的钙的量)。将结果表示为⁴⁵Ca释放的％，并还可以报道为T/C比值。

对于一些因子和化合物，可以使用该方法的修改。因为大部分破骨细胞在预孵育期之后在颅盖中形成，所以影响破骨细胞形成的因子在预孵育期间可能具有更大的作用。因此，对于许多化合物而言，将它们包括进预孵育培养基中。

在该试验中测试提取物包括银杏(Ginkgo biloba)提取物、绿茶提取物、槐角(Sophora fructus japonica)提取物、地黄(Rehmanniasp.)提取物、石榴提取物、西伯利亚人参、依普黄酮、葡萄籽提取物、和当归提取物。在颅盖试验中测试这些提取物的结果于下面的表16中报道。

在表16中，R-1＝地黄(Rehmannia sp.)(EUL)，SFJ＝槐角(Sophora fructus japonica)，SG＝西伯利亚人参，SJ＝槐(Sophorajaponica)(NuPharma)，I＝依普黄酮，GB＝银杏(Ginkgo biloba)，GT＝绿茶，P-1＝石榴提取物，P-2＝石榴提取物(Naturex)，GS＝葡萄籽，DQ＝当归提取物。在下面的表中，上标a(^a)指该结果显著不同于(p＜0.05)空白试样(浓度为0μg/ml)结果。p＜0.05的差异(即其中误差界限小于或等于5％)被认为是显著的。如表16所显示，石榴、依普黄酮、绿茶提取物、和葡萄籽提取物抑制IL-1b诱导的骨再吸收/钙释放。

表16：颅盖的数据-骨再吸收/Ca²⁺释放的抑制

用本发明的组合物中有用的提取物的各种组合重复上述颅盖试验。每一制剂的结果于下面的表16中报道。

在表17中，P＝石榴，I＝依普黄酮，GS＝葡萄籽，GT＝绿茶。阿伦膦酸盐用作阳性对照。在下面的表中，上标a(^a)指该结果显著不同于(p＜0.05)空白试样(浓度为0μg/ml)的结果。p＜0.05的差异(即其中误差界限小于或等于5％)被认为是显著的。如表17所示，所有的测试组合抑制IL-1b诱导的骨再吸收/钙的释放。

表17：颅盖的数据-提取物的组合对骨再吸收/钙释放的抑制

实施例10：测量对RANK-L的抑制和对骨再吸收的抑制的体内研究

在涉及约12-14周龄、近似体重为200-250克的雌性、完整大鼠的体内研究中，试验两种不同的配方。配方1包括不同剂量的依普黄酮、石榴提取物、和葡萄籽提取物，如在表18中所报道。配方2包括不同剂量的石榴提取物和葡萄籽提取物和固定剂量的依普黄酮，如在表18中所报道。对于每个配方试验三个剂量。该研究使用8组大鼠、每组15只大鼠，持续约35天。

下表18标明给予8个试验组中的每一个的配方。表18中的剂量基于推荐的人剂量，使用FDA换算公式：人等效剂量(HED，mg/kg)＝大鼠剂量mg/kg x(大鼠重量kg/人重量kg)^0.33，以转换成合适的相应大鼠剂量。

HED＝大鼠NOAEL x(W-大鼠/W-人)^(1-b)，b＝0.67。

在表18中，I＝依普黄酮，P＝石榴提取物，GS＝葡萄籽提取物。

表18：用于体内分析的剂量和配方

为了引入由雌激素禁断(estrogen withdrawal)引起的快速骨再吸收，在该研究中使用切除卵巢的(OVX)大鼠模型。见，例如Alam等，″红花籽油在诱导骨质疏松症的切除卵巢的大鼠中的作用″(“Effects of Safflower Seed Oil in Osteoporosis-induced OvariectomizedRats，”)Am.J.Chinese Medicine，2006，第34卷(4)：601-612，其内容通过引用结合到本文中。重要的是评估由卵巢切除步骤引起的骨再吸收的作用，因此在该研究中还包括假手术对照(n＝6)，一组没有经过卵巢切除术的雌性大鼠。

该研究使用随机化安慰剂作对照的剂量响应设计。将总共120个12-14周龄、体重约200-250克的大鼠(n＝15每组)随机分配到各组，持续35天。以15克/天喂养动物，包括安慰剂饮食或上述配方中的一种，从实验的开始持续35天。每天早上以15克/大鼠/天的比例对大鼠喂食。对于整个实验过程，允许大鼠自由获取水，将其关养在适当的笼子中。在整个实验期间允许无限制的活动。

通过测量结果评价该配方对抗再吸收的效果，所述测量结果包括DEXA扫描(以测定骨矿物质密度)、生物力学测量(以收集骨强度和功能信息)、微-CT测量(以评估实际的骨质量和功能信息)、和组织形态学测量(以评估骨质量和功能信息)。Pa Revell，″骨的组织形态测定术，″(“Histomorphometry of Bone，”)J.Clin.Pathol.，1983.第36卷：1321-1331描述了进行组织形态学测量的方法，其全部内容通过引用结合到本文中。使用的术语和单位是由the HistomorphometryNomenclature Committee of the American Society for Bone and MineralResearch推荐的。在以下文献中描述了进行微-CT测量的方法：Jiang等，″动物骨骼3D结构的微CT和微MR影像″(“Micro CT and MicroMR imagining of 3D architecture of animal skeleton.”)，J.MusculoskelNeuron Interact.2000.第1卷：45-51，其全部内容通过引用结合到本文中。在35天的处理之后测定这些测量结果。

DEXA扫描和微-CT测量结果都表明与假手术对照的(不切除卵巢的)大鼠相比，切除卵巢的(OVX)大鼠中的骨矿物质密度大量损失。如使骨断裂的最大力和骨刚度测量值所表明，骨强度也显著地降低，OVX大鼠的骨体积/总体积％和小梁细胞数目也降低。此外，在OVX大鼠中也观察到小梁间距(小梁彼此之间的平均距离)明显增加。用阿伦膦酸盐药物(已知减少破骨细胞发生的有效的抗再吸收剂)处理阳性对照组ALD。见，例如，Iwamoto等，″切除卵巢的大鼠中阿伦膦酸盐和阿法骨化醇对骨松质和骨密质质量和骨力学性质的影响的比较″(“Comparative effects of alendronate and alfacalcidol oncancellous and cortical bone mass and bone mechanical properties inovariectomized rats.”)Exp.Anim.2006.第55卷(4)：357-67，其全部内容通过引用结合到本文中。阳性对照组(ALD)的骨矿物质密度、骨体积/总体积％、和小梁数目得到增加，小梁间距得到显著减小。

用于本研究的一种效能测定技术是微-CT测量，微-CT测量提供实际的骨质量、结构和功能信息。如下面表19所示，在35天的处理之后，在预防骨再吸收上，给予组2、3、4、5、和6的配方比安慰剂(空白处理)更有效。骨矿物质密度(BMD)、骨体积、小梁数目和小梁间距的结果与骨健康有关。上标a(^a)指该结果显著不同于安慰剂组。p＜0.05的差异被认为是显著的。

表19：组织形态学测量结果

在表20中，骨矿物质密度的结果表明：给予组2、3、和4的配方有效地降低破骨细胞发生和增加骨矿物质密度。结果还表明：给予组1、2、3、和4的配方有效地减少破骨细胞发生、增加骨体积、增加小梁细胞数目和减小小梁细胞间距。上标a(^a)指该结果显著不同于安慰剂组。p＜0.05的差异被认为是显著的。

表20：DEXA测量结果

组编号	骨矿物质密度
		1	0％
2
		3
4
		5
6
		ALD
假手术

组织形态学测量也用作测定配方1和2的效能的工具，其中定量来自每组的骨小梁体积。该分析的结果报道于表21中。上标a(^a)表明该结果显著不同于安慰剂组。p＜0.05的差异被认为是显著的。

如表21所示，与安慰剂组相比，配方1引起骨小梁体积显著增加(61.4％)。在组2(13.5％)和组3(13.1％)中虽然观察到骨小梁体积增加，但幅度较小。

表21：组织形态学测量结果

组编号

％骨体积

1
		2	13.5％
3
		4	-12.9％
5	6.4％
		6	41.7％
ALD
		假手术

除了骨量和骨体积评价之外，依据两个不同的参数对骨强度进行力学测试。一项测试用以测定使骨断裂所需的最大力，另一项测试用以测定骨的刚度(弹性)。在Sturmer等，″用于正常的和骨质疏松的大鼠干骺端胫骨的标准化弯曲试验和断裂试验：雌二醇、睾酮、和雷洛昔芬的作用″“Standardized Bending and Breaking Test for theNormal and Osteoporotic Metaphyseal Tibias of the Rat：Effect ofEstradiol，Testosterone，and Raloxifene，”J.Boneand Mineral Research，2006.第21卷(1)：89-96中描述了测定骨强度和刚度的方法，其全部内容通过引用结合到本文中。该分析结果于下面的表22中报道。上标a(^a)指该结果显著不同于安慰剂组。p＜0.05的差异被认为是显著的。

表22中列出的结果表明：根据与安慰剂组相比，给予组2和3的配方1致使断裂骨所需的最大力增加8.3％和8.1％。相对于安慰剂处理，给予组3的配方1致使骨刚度增加16.0％。

表22：生物力学测量结果

组编号	使骨断烈所需的最大力	骨刚度
			1	-0.4	4.9
2		0.6
			3
4	-0.6	4.6
			5	0.9	10.2
6	3.0	3.3
			ALD	-0.4	0.2
假手术	-0.3	6.0

得自DEXA扫描、生物力学测量、微-CT测量、和组织形态学测量的结果清楚地说明：在雌激素禁断期间，由石榴和葡萄籽提取物组成的配方1显示出改善骨结构和构造并增加骨强度的能力。

意欲：将以上详细描述视为例证性的而非限制性，并理解以上的权利要求，包括所有的同等物，意欲定义本发明的精神和范围。

Claims (5)

1.用于抑制骨再吸收的方法的组合物，所述组合物包含石榴(pomegranate)提取物、葡萄籽(grape seed)提取物、绿茶提取物和依普黄酮，其中所述组合物抑制RANK-L的表达，并且其中所述石榴提取物、依普黄酮、葡萄籽提取物和绿茶提取物的比为10∶10∶1∶1。

2.用于抑制骨再吸收和增加骨生长的方法的食物增补组合物，所述食物增补组合物包括：

(a)第一组合物，所述第一组合物包括石榴提取物、葡萄籽提取物、绿茶提取物和依普黄酮，其中所述第一组合物抑制RANK-L的表达，并且其中所述石榴提取物、依普黄酮、葡萄籽提取物和绿茶提取物的比为10∶10∶1∶1；

(b)第二组合物，所述第二组合物包括以下组分中的至少两种：槲皮素、西伯利亚人参(Siberian ginseng)提取物、槐(Sophora japonica)提取物和甘草提取物，其中所述第二组合物增加骨形态发生蛋白-2的基因或蛋白的表达。

3.权利要求2的食物增补组合物，其中所述第二组合物包括槲皮素和西伯利亚人参提取物的组合。

4.权利要求2或3的食物增补组合物，其中所述第二组合物包含槲皮素和甘草提取物的组合。

5.权利要求2的食物增补组合物，其中所述第二组合物包含200-750mg槲皮素、100-800mg西伯利亚人参提取物和10-100mg甘草提取物。