HK1161686B - 7-氯-n，n，5-三甲基-4-氧代-3-苯基-3，5-二氢-4h-哒嗪并[4，5-b]吲哚-1-乙酰胺作为外周苯并二氮杂䓬受体水平的生物标志物的用途 - Google Patents

Description

7-氯-N,N,5-三甲基-4-氧代-3-苯基-3,5-二氢-4H-哒嗪并[4,5-B]吲哚-1-乙酰胺作为外周苯并二氮杂*受体水平的生物标志物的用途

技术领域

本发明涉及7-氯-N，N，5-三甲基-4-氧代-3-苯基-3，5-二氢-4H-哒嗪并[4，5-b]吲哚-1-乙酰胺作为生物标志物在个体内检测与正常状况和病理状况相关的PBR(外周苯并二氮杂 受体(peripheral benzodiazepine receptor))水平的用途。本发明还涉及为了上述目的检测PBR水平的方法。 

背景技术

在正常的生理条件下，PBR，也已知为易位体蛋白18kDa(TSPO)(Papadopoulos，B.et al.(2006)Trends Pharmacol.Sci.27：402-409)，以低水平表达在脑中、主要在小胶质细胞中，并且高度表达在大量的周缘组织(peripheral tissue)中，例如肾上腺、松果腺、唾液腺、生殖腺、肾、肺、心和骨骼肌(Chen，M-K.and Guilarte，T.(2008)Pharmacology and Therapeutics 118：1-17；Venneti，S.et al.(2006)Progress in Neurobiol.80：308-322)。参照PBR配体[³H]PK11195的亚细胞定位研究已经显示出PBR位于外部线粒体膜中(Anholt，R.R.et al.(1986)J.Biol.Chem.261：576-583；Antkiewicz-Michaluk，L.et al.(1988)Mol.Pharmacol.34：272-278)。然而，免疫组织化学研究还显示了PBR表达在血细胞(缺乏线粒体)中(Olson，J.M.et al.(1988)Eur.J.Pharmacol.152：47-53)，并且可以集中至质膜(O’Beirne，G.et al.(1990)Eur.J.Biochem.188：131-138；Woods，M.J.et al.(1996)Biochem.Pharmacol.51：1283-1292)。PBR的核定位或围核定位也已经在乳腺癌(Hardwick，M.et al.(1999)Cancer Res.59：831-842)、人神经胶质瘤细胞(Brown，R.C.et al.(2000)Cancer Lett.156：125-132)、肝肿瘤细胞(Corsi，L.et al.(2005)Life Sci.76：2523-2533)和神经胶质细胞(Kuhlmann，A.C.and Guilarte，T.R.(2000)J.Neurochem.74：1694-1704)中观察到。 

PBR水平的显著增加在细胞损伤、炎症或增殖后观察到，并且与众多急性或慢性病理状况相关(Chen，M-K.and Guilarte，T.(2008)Pharmacology  and Therapeutics 118：1-17；Venneti，S.et al.(2006)Progress in Neurobiology 80：308-322)。这些包括：脑损伤，例如中风和缺血-再灌注损伤(Gerhard，A.et al.(2000)Neuroreport 11：2957-2960；Gerhard，A.et al.(2005)Neuroimage 24：404-412)、外伤性脑损伤(Raghavendra，R.et al.(2000)Exp.Neurol.161：102-114)；脑感染，例如脑炎(Banati，R.B.et al.(1999)Neurology 53：2199-2203；Cagin，A.et al.(2001)Brain 124：2014-2027)；神经疾病，例如多发性硬化(Banati，R.B.et al.(2000)Brain 123：2321-2337)，阿尔茨海默病和痴呆(Cagnin，A.et al.(2001)Lancet 358：461-467；Versijpt，J.J.et al.(2003)Eur.Neurol.50：39-47)，帕金森病(Ouchi，Y.et al.(2005)Ann.Neurol.57：168-175；Gerhard，A.et al.(2006)Neurobiol.Dis.21：404-412)，肌萎缩侧索硬化(Turner，M.R.et al.(2004)Neurobiol.Dis.15：601-609)，皮质基底变性(cortico-basal degeneration)(Gerhard A.et al.(2004)Mov.Disord.19：1221-1226；Henkel，K.et al.(2004)Mov.Disord.19：817-821)，亨廷顿病(Messmer，K.and Reynolds，G.P.(1998)Neurosci.Lett.241：53-56；Pavese，N.et al.(2006)Neurology 66：1638-1643)和癫痫(Sauvageau，A.et al.(2002)Metab.Brain Dis.17：3-11)。在CNS病理中的PBR水平的增加主要在小胶质细胞中观察到(Chen，M-K.and Guilarte，T.(2008)Pharmacology and Therapeutics 118：1-17；Venneti，S.et al.(2006)Progress in Neurobiology 80：308-322)。 

PBR的大量增加也在癌症(Cornu，P.et al.(1992)Acta.Neurichir.119：146-152；Hardwick，M.et al.(1999)Cancer Res.59：831-842；Maaser，K.et al.(2002)Cancer Res.8：3205-3209)、肺部炎症(Audi，S.H.et al.(2002)Lung.180：241-250；Hardwick，M.J.et al.(2005)Mol.Imaging.4：432-438)、心肌缺血(Mazzone，A.et al.(2000)J.Am.Coll.Cardiol.36：746-750)、肾缺血(Zhang，K.et al.(2006)J.Am.Coll.Surg.203：353-364)、风湿病(纤维肌痛)(Faggioli，P.et al.(2004)Rheumatology(Oxford)43：1224-1225)、坐骨神经再生(Mills，C.D.et al.(2005)Mol.Cell.Neurosci.30：228-237)、牛皮癣关节炎(Guisti，L.et al.(2004)Clin.Biochem.37：61-66)和动脉粥样硬化(Fujimura，Y.et al.(2008)Atherosclerosis，201：108-111；Laitinen，I.et al.(2008)Eur.J.Nuc.Med.Mol.Imaging 36：73-80)中观察到。 

相反的是，PBR水平的降低在精神分裂症患者的脑中(Kurumaji，A.et al. (1997)J.Neural.Transm.104：1361-1370；Wodarz，N.et al.(1998)Psychiatry Res.14：363-369)和在类风湿性关节炎(Bribes，E.et al.(2002)Eur.J.Pharmacol.452：111-122)和骨关节炎(Bazzichi，L.et al.(2003)Clin.Biochem.36：57-60)中被观察到。 

因此，在脑和其他组织中体内成像PBR水平的能力可以用作疾病发展的重要生物标志物，从而确定和评估治疗性治疗的功效和评估体内PBR受体占有率。 

参照PET PBR配体，[¹¹C]PK11195，已经被广泛地用于在众多神经病理状况下体内成像PBR水平(Chen，M-K and Guilarte，T.(2008)Pharmacology and Therapeutics 118：1-17；Venneti，S.et al.(2006)Progress in Neurobiology 80：308-322)。然而，[¹¹C]PK11195显示较低地脑吸收、高的非特异性结合和糟糕的信噪比。这些性质限制了[¹¹C]PK11195在CNS中用于PBR水平的PET成像和占有率研究(occupancy study)的敏感性。研发了改善的PBR PET配体，其具有比[¹¹C]PK11195更高的特异性结合和更高的敏感性，因此提供了在脑和其他组织中成像PBR水平的重要进步。 

在文献WO99/06406和WO00/44384记载和要求保护的化合物中，哒嗪并[4，5-b]吲哚衍生物，7-氯-N，N，5-三甲基-4-氧代-3-苯基-3，5-二氢-4H-哒嗪并[4，5-b]吲哚-1-乙酰胺，被鉴定为特别适用作PBR的PET(或SPECT)配体。该化合物在体外和体内对PBR的亲合性高(Ferzaz，B.et al.(2002)J.Pharm.Exp.Therap.301：1067-1078)。 

发明概述 

本发明涉及放射性标记形式的7-氯-N，N，5-三甲基-4-氧代-3-苯基-3，5-二氢-4H-哒嗪并[4，5-b]吲哚-1-乙酰胺作为生物标志物检测与正常状况相关的PBR水平和与病理状况相关的PBR水平的用途。 

本发明还涉及使用放射性标记形式的7-氯-N，N，5-三甲基-4-氧代-3-苯基-3，5-二氢-4H-哒嗪并[4，5-b]吲哚-1-乙酰胺检测与正常状况相关的PBR水平和与病理状况相关的PBR水平的方法。 

本发明还涉及用于检测PBR水平的诊断试剂盒。 

定义 

出于便利原因并帮助阅读，化合物7-氯-N，N，5-三甲基-4-氧代-3-苯基-3，5-二氢-4H-哒嗪并[4，5-b]吲哚-1-乙酰胺在本申请的一些章节中被重命名为“A”。 

对于本发明而言，下列词语应当被相应地理解。 

-生物标志物(biomarker)：可以被客观测量的特征(即具有可接受的精确性和重现性)，并可以用作正常生理或病理过程的指示，用来评估医药治疗的作用。生物标志物可以为能在组织或生物学流体中被检测到的生物学、解剖学、生理学、生物化学或分子的参数。 

-炎症：对组织损伤或破坏的响应。在外周(periphery)中，急性炎症由以多形核细胞(中性白细胞)为特征的白细胞浸润组成，慢性炎症由单核细胞(巨噬细胞、淋巴细胞、浆细胞)组成。在脑中，炎症结合了广泛的细胞响应(包括激活小胶质细胞和星形胶质细胞)，以及细胞因子和趋化因子、补体蛋白、急性期蛋白、氧化性损伤和相关的分子过程的参与。这些事件可能具有对神经元功能的有害作用，导致了神经元损伤以及进一步的神经胶质激活和最终的神经变性。在响应脑部炎症时，胶质细胞(大多数为小胶质细胞)被激活，并过表达PBR。PBR在脑中的水平因此为神经炎症的指征，并可以被认为是用于本发明的神经炎症的生物标志物。 

-病理状况：这些状况可以包括神经疾病：影响中枢神经系统功能的任何损伤、病症或疾病。这些可以包括急性脑损伤，如中风、缺血-再灌注损伤和外伤性脑损伤；脑感染，如脑炎；神经疾病，如多发性硬化，阿尔茨海默病，帕金森病，肌萎缩侧索硬化，痴呆，皮质基底变性，亨廷顿病和癫痫；病理状况还可以包括精神疾病，如精神分裂症；外周炎性过程，如肺部炎症，动脉粥样硬化，心肌缺血，肾缺血，风湿病(纤维肌痛)，银屑病性关节炎，类风湿性关节炎和骨关节炎；增殖性疾病，如癌症。 

-受体占有率(Receptor occupancy)：结合至生物化学靶标或受体的量的量度。药物的受体占有率的水平可以通过比较仅使用放射性标记的PET配体以及当在给药未标记药物后给予PET配体时得到的时间-活性测量结果而测量。PET配体必须结合至与未标记药物一样的受体。在未标记药物的浓度增加时，放射性标记的PET配体结合至受体的量降低。这种降低的程度定义为未标记药物的受体占有率。 

-PET成像：正电子放射断层扫描术为一种产生体内功能性过程的三维 图像或图谱的成像技术。该系统检测直接通过发射正电子的放射性核素(示踪物(tracer))发射的成对的伽马射线，该放射性核素在生物活性分子上引入至体内。示踪物的浓度在体内三维空间的成像然后通过电脑分析重建。用于PET的材料为闪烁剂如锗酸铋、氧原硅酸镥(lutetium oxy-orthosilicate)或原硅酸钆(gadolinium orthosilicate)，因为它们具有高的γ-射线阻止能力和信号转化速度。Micro PET为针对小型动物成像的PET的应用。 

-SPECT成像：单光子发射计算机断层扫描术为另一种产生体内功能性过程的三维图像或图谱的成像技术。该系统通过发射单个光子的放射性核素(示踪物)并将将该放射性核素在生物活性分子上引入至体内的而直接检测伽马射线。示踪物的浓度在体内三维空间的成像然后也通过电脑分析重建。 

-放射性标记形式：一个或多个原子被能够检测到的同位素置换的任何分子。最经常用于PET成像的发射正电子的放射性同位素有：碳-11(或 ¹¹C，t_1/2＝20分钟)，氮-13(或¹³N，t_1/2＝10分钟)，氧-15(或¹⁵O，t_1/2＝2分钟)。还可以考虑如下的分子，其中加入了额外原子从而用其他发射正电子的放射性同位素标记该衍生物以用于PET成像，如氟-18(或¹⁸F，t_1/2＝110分钟)，还有镓-68(⁶⁸Ga，t_1/2＝68分钟)，铜-64(⁶⁴Cu，t_1/2＝12.7小时)，溴-76(或⁷⁶Br，t_1/2＝16.1小时)和碘-124(或¹²⁴I，t_1/2＝4.2天)。最后还可以考虑如下的分子，其中加入了其他额外的原子从而用发射单个光子的放射性同位素标记该衍生物以用于SPECT成像，如碘-123(或¹²³I，t_1/2＝13.1小时)或锝-99m(或^99mTc，t_1/2＝6.0小时)。 

合成放射性标记配体以及用同位素取代原子可以通过本领域技术人员已知的多种技术实施。例如，对于用碳-11取代碳原子而言，我们可以使用多种衍生物如[¹¹C]甲基碘或[¹¹C]甲基三氟甲磺酸酯(Welch M.J.et al.(2003)In Handbook of Radiopharmaceuticals-Radiochemistry and Applications(Welch MJ，Redvanly CS Eds.)，New York-Chichester-Brisbane-Toronto，Wiley-Interscience Pub.，1-848)。在A的情况下，多个甲基可以被碳-11标记，例如N，N-二甲基乙酰胺或N-甲基吲哚官能团。 

在用氟-18标记的情况下，放射性同位素可通过亲核脂族或芳族(包括杂芳族)(Dollé F.et al.(2005)Curr.Pharm.Design 11：3221-3235))取代或亲电取代直接连接至核结构(A)或者通过添加间隔基团进行连接，这两种技术 都是本领域技术人员已知的(Kilbourn MR.(1990)In Fluorine-18 Labeling of Radiopharmaceuticals，Nuclear Science Series(Kilbourn MR Ed.)，National Academy Press，Washington，D.C.，1-149；Lasne M.-C.et al.(2002)Topics in Current Chemistry 222：201-258；Cai L.et al.(2008)Eur.J.Org.Chem.17：2853-2873；Dollé F.et al.(2008)In Fluorine and Health：Molecular Imaging，Biomedical Materials and Pharmaceuticals，Tressaud A，Haufe G(Eds).Elsevier：Amsterdam-Boston-Heidelberg-London-New York-Oxford-Paris-San Diego-San Francisco-Singapore-Sydney-Tokyo，3-65)。特别感兴趣的是使用烷基、烯基或炔基连接基用于添加氟-18原子(Damont A.et al.(2008)J.Label.Compds Radiopharm.51：286-292；Dollé F.et al.(2006)Bioorg.Med.Chem.14：1115-1125；Dollé F.et al.(2007)J.Label.Compds Radiopharm.50：716-723)。 

在用其他卤素(如溴-76、碘-123或碘-124)标记的情况下，放射性同位素也可以直接通过亲核或亲电取代连接至核结构(A)或者通过添加间隔基团进行连接，这两种技术都是本领域技术人员已知的(Mazière B.et al.(2001)Curr.Pharm.Des.7：1931-1943；Coenen H.H.et al.(2006)In Radioiodination reactions for pharmaceuticals-Compendium for effective synthesis strategies，Coenen H.H.，Mertens J.，Mazière B.(Eds)，Springer Verlag，Berlin-Heidelberg，1-101)。 

在用金属放射性同位素(例如镓-68、铜-64或锝-99m)标记的情况下，本领域技术人员认为优选使用的方法是使用基于以下的双官能螯合剂，例如开链多氨基羧酸(open-chain polyaminocarboxylates)乙二胺四乙酸(EDTA)和二乙烯三胺五乙酸(DTPA)，多氨基羧酸大环(polyaminocarboxylic macrocycle)1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸(DOTA)，巯基乙酰基二-甘油和三-甘油(MAG2，MAG3)，二-(S-苯甲酰基-硫代乙醇酰基)二氨基丙酸酯((SBT)₂DAP)和肼基烟酸(HYNIC)，促进放射性金属阳离子在一个官能团处的络合作用以及共价连接至在另一官能团处的核分子(Brunner U.K.et al.(1995)Radiotracer production-Radiometals and their chelates In Principle of Nuclear Medecine，Wagner H.N.(Ed).Saunders：Philadelphia，220-228；Weiner  R.E.et al.(2003)Chemistry of gallium and indium radiopharmaceuticals In Handbook of Radiopharmaceuticals-Radiochemistry  and Applications(Welch MJ，Redvanly CS Eds.)，New York-Chichester-Brisbane-Toronto，Wiley-Interscience Pub.，363-400；Anderson C.J.et al.(2003)Chemistry of copper radionucleides and radiopharmaceutical products In Handbook of Radiopharmaceuticals-Radiochemistry and Applications(Welch MJ，Redvanly CS Eds.)，New York-Chichester-Brisbane-Toronto，Wiley-Interscience Pub.，401-422；Mahmood A.et al.(2003)Technetium radiopharmaceuticals In Handbook of Radiopharmaceuticals-Radiochemistry and Applications(Welch MJ，Redvanly CS Eds.)，New York-Chichester-Brisbane-Toronto，Wiley-Interscience Pub.，323-362)。 

直接加入氟-18原子(或溴-76、碘-123或碘-124)可以例如在3-苯基和/或哒嗪并[4，5-b]吲哚芳香环上以及在任何其他化学上可接近的位置上进行(如乙酰胺官能团)。间接加入这些放射性卤素(例如通过使用间隔基团)，或者加入上述的金属放射性同位素(镓-68、铜-64或锝-99m，通过使用螯合剂)也可以在N，N，5-三甲基-4-氧代-3-苯基-3，5-二氢-4H-哒嗪并[4，5-b]吲哚-1-乙酰胺(A)核的化学上可接近的位置处进行(参见上述参考)。 

-给药：放射性标记的生物标志物的优选给药是通过静脉内途径给予。 

本发明的第一实施方案是使用7-氯-N，N，5-三甲基-4-氧代-3-苯基-3，5-二氢-4H-哒嗪并[4，5-b]吲哚-1-乙酰胺作为生物标志物用于在个体内检测与病理状况相关的PBR(外周苯并二氮杂 受体)水平和炎症，其中所述化合物为放射性标记的，其中该放射性标记选自碳-11、放射性卤素和放射性金属。优选地，所述化合物用碳-11进行放射性标记，更优选地，用碳-11在位于吲哚核5位的甲基碳上进行放射性标记。 

在另一实施方案中，7-氯-N，N，5-三甲基-4-氧代-3-苯基-3，5-二氢-4H-哒嗪并[4，5-b]吲哚-1-乙酰胺用放射性金属进行放射性标记，优选在3-苯基环的对位、在哒嗪并[4，5-b]吲哚的7-位代替氯原子(有或没有间隔基，参见下文)，或者在任何N-甲基位置(N，N-二甲基乙酰胺官能团或位于吲哚核5位的甲基)。 

在另一实施方案中，7-氯-N，N，5-三甲基-4-氧代-3-苯基-3，5-二氢-4H-哒嗪并[4，5-b]吲哚-1-乙酰胺用放射性卤素进行放射性标记，优选用放射性卤素氟-18进行放射性标记，优选在3-苯基环的对位、在哒嗪并[4，5-b]吲哚的 7-位代替氯原子(有或没有间隔基，参见下文)，或者在任何N-甲基位置(N，N-二甲基乙酰胺官能团或位于吲哚核5位的甲基)。 

在一些实施方案中，检测PBR水平和炎症通过PET成像(正电子放射断层扫描术)或通过SPECT成像(单光子发射计算机断层扫描术)进行。 

在本发明的一些实施方案中，放射性标记形式的7-氯-N，N，5-三甲基-4-氧代-3-苯基-3，5-二氢-4H-哒嗪并[4，5-b]吲哚-1-乙酰胺作为生物标志物用于检测与病理状况相关的PBR水平变化或炎症，其中所述病理状况选自脑损伤，如中风、缺血-再灌注损伤和外伤性脑损伤；脑感染，如脑炎；神经疾病，如多发性硬化，阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)，帕金森病，肌萎缩侧索硬化，痴呆，皮质基底变性，亨廷顿病(Huntington’s disease)和癫痫；精神疾病，如精神分裂症；外周炎性过程，如肺部炎症，动脉粥样硬化，心肌缺血，肾缺血，风湿病(纤维肌痛)，银屑病性关节炎(psoriasic arthritis)，类风湿性关节炎和骨关节炎；增殖性疾病(proliferative diseases)，如癌症。 

在本发明的一些实施方案中，放射性标记形式的7-氯-N，N，5-三甲基-4-氧代-3-苯基-3，5-二氢-4H-哒嗪并[4，5-b]吲哚-1-乙酰胺用作PBR水平和炎症的生物标志物，其中炎症为神经炎症(neuroinflammation)。 

在本发明的一些实施方案中，放射性标记形式的7-氯-N，N，5-三甲基-4-氧代-3-苯基-3，5-二氢-4H-哒嗪并[4，5-b]吲哚-1-乙酰胺用于评估治疗性治疗的功效。 

本发明还涉及使用放射性标记形式的7-氯-N，N，5-三甲基-4-氧代-3-苯基-3，5-二氢-4H-哒嗪并[4，5-b]吲哚-1-乙酰胺用于检测与病理状况相关的PBR和炎症的方法。 

在一些实施方案中，该放射性标记形式的7-氯-N，N，5-三甲基-4-氧代-3-苯基-3，5-二氢-4H-哒嗪并[4，5-b]吲哚-1-乙酰胺含有选自碳-11、放射性卤素和放射性金属的放射性标记。在一些实施方案中，放射性标记形式的7-氯-N，N，5-三甲基-4-氧代-3-苯基-3，5-二氢-4H-哒嗪并[4，5-b]吲哚-1-乙酰胺为用碳-11标记的。 

在一些实施方案中，放射性标记形式的7-氯-N，N，5-三甲基-4-氧代-3-苯基-3，5-二氢-4H-哒嗪并[4，5-b]吲哚-1-乙酰胺在位于吲哚核5位的甲基碳上进行放射性标记。 

在一些实施方案中，7-氯-N，N，5-三甲基-4-氧代-3-苯基-3，5-二氢-4H-哒 嗪并[4，5-b]吲哚-1-乙酰胺用放射性金属进行放射性标记，优选在3-苯基环的对位、在哒嗪并[4，5-b]吲哚的7-位代替氯原子(有或没有间隔基，参见下文)，或者在任何N-甲基位置(N，N-二甲基乙酰胺官能团或位于吲哚核5位的甲基)。 

在一些实施方案中，7-氯-N，N，5-三甲基-4-氧代-3-苯基-3，5-二氢-4H-哒嗪并[4，5-b]吲哚-1-乙酰胺用放射性卤素进行放射性标记，优选用放射性卤素氟-18进行放射性标记，优选在3-苯基环的对位、在哒嗪并[4，5-b]吲哚的7-位代替氯原子(有或没有间隔基，参见下文)，或者在任何N-甲基位置(N，N-二甲基乙酰胺官能团或位于吲哚核5位的甲基)。 

在本发明的一些实施方案中，病理状况选自：脑损伤，如中风，缺血-再灌注损伤，外伤性脑损伤；脑感染，如脑炎；神经疾病，如多发性硬化，阿尔茨海默病，帕金森病，肌萎缩侧索硬化，痴呆，皮质基底变性，亨廷顿病和癫痫；精神疾病，如精神分裂症；外周炎性过程，如肺部炎症，动脉粥样硬化，心肌缺血，肾缺血，风湿病(纤维肌痛)，银屑病性关节炎，类风湿性关节炎和骨关节炎；增殖性疾病，如癌症。 

根据本发明的另一实施方案为检测与病理状况相关的PBR和炎症的方法，其中炎症为神经炎症。 

根据本发明的另一实施方案为检测与病理状况相关的PBR和炎症的方法，该方法为了占有率研究而进行。 

另一实施方案为检测与病理状况相关的PBR和炎症的方法，所述方法包括下列步骤： 

a)给予放射性标记形式的7-氯-N，N，5-三甲基-4-氧代-3-苯基-3，5-二氢-4H-哒嗪并[4，5-b]吲哚-1-乙酰胺； 

b)使用PET(或SPECT)技术获得在脑或其他外周组织的关注区域中的图像； 

c)通过定量在该关注区域中与放射性标记形式的7-氯-N，N，5-三甲基-4-氧代-3-苯基-3，5-二氢-4H-哒嗪并[4，5-b]吲哚-1-乙酰胺相关的PET信号而定量该关注区域中的PBR水平； 

d)比较在步骤c)中得到的PET(SPECT)信号与在对照关注区域中得到的信号； 

e)确定与病理状况相关的炎症的存在。 

本发明还涉及诊断试剂盒，其用来检测与正常状况相关的PBR水平和与病理状况相关的PBR水平的变化，该诊断试剂盒包括放射性标记形式的7-氯-N，N，5-三甲基-4-氧代-3-苯基-3，5-二氢-4H-哒嗪并[4，5-b]吲哚-1-乙酰胺。 

下列实施例进一步解释了本发明，并不意在限制本发明。出于便利性原因和方便阅读，化合物7-氯-N，N，5-三甲基-4-氧代-3-苯基-3，5-二氢-4H-哒嗪并[4，5-b]吲哚-1-乙酰胺已经在图和结果中被重命名为“A”。 

图1：[¹¹C]-A和[¹¹C]PK11195在受损的和完整的大鼠纹状体中的时间-活性-曲线。数据表达为每立方厘米注射剂量的百分比，为注射后时间(分钟)的函数。 

图2：[¹¹C]-A和[¹¹C]PK11195在受损的与完整的对侧大鼠纹状体中吸收的比值。 

图3：[¹¹C]-A在受损的(ipsi)和完整的大鼠纹状体(contro)中的时间-活性-曲线。箭头指示在注射[¹¹C]-A后20分钟在受损的(ipsi+PK)和完整的对侧(contro+PK)大鼠纹状体中添加过量的1mg/kg的K11195。数据表达为每立方厘米注射剂量的百分比，为注射后时间(分钟)的函数。 

图4：[¹¹C]-A在受损的(ipsi A)和完整的大鼠纹状体(contro A)中的时间-活性-曲线。箭头指示在注射[¹¹C]-A后20分钟在受损的(ipsi+A+A)和完整的对侧(contro+A+A)大鼠纹状体中添加过量的1mg/kg的A。数据表达为每立方厘米注射剂量的百分比，为注射后时间(分钟)的函数。 

图5：在大鼠受损7-8天后的脑切片(20μm)中的[¹¹C]-A(18nM)放射自显影。非特异性结合使用过量的未标记PK11195(23μM)或A(22μM)来评估。PBR对中枢苯并二氮杂 结合位点的特异性使用过量的未标记氟马西尼(27μM)来评估。数据表达为每任意面积单位(per arbitrary area)的dpm。^*表示相对于在受损纹状体中的[¹¹C]-A(18nM)结合有显著差异。 

图6：在11-12个月APP/S1和野生型PS1转基因小鼠的整个脑(排除小脑)中的[¹¹C]-A和[¹¹C]PK11195时间-活性-曲线。数据表达为每立方厘米注射剂量的百分比，为注射后时间(分钟)的函数。 

图7：从20-23月大的APP/PS1和野生型PS1转基因小鼠的脑切片中的[¹¹C]-A(18nM)放射自显影。非特异性结合使用过量的未标记PK11195(23μM)或A(22μM)来评估。PBR对中枢苯并二氮杂 结合位点的特异性 使用过量的未标记氟马西尼(27μM)来评估。数据表达为每任意面积单位的dpm。 

图8：在非人灵长类的4个不同脑区域(右纹状体和左纹状体，前额皮质，小脑)中的[¹¹C]-A时间-活性-曲线，和在研究的不同时间点处经120分钟的所选冠状脑切片的相应PET图像集(summation images)：基线(A，B)和在右纹状体受损24小时后(C，D)。组(E，F)显示了在左纹状体中受损48小时后和在右纹状体中受损后7个月的[¹¹C]-A时间活性曲线。数据表达为每100mL注射剂量的百分比(％ID/100mL)，为注射后时间(分钟)的函数。 

图9：在4个不同脑区域(右纹状体和左纹状体，前额皮质，小脑)中的[¹¹C]-A时间-活性-曲线，和在研究的四个不同时间点处经120分钟的所选冠状脑切片的相应PET图像集：基线(A，B)，在左纹状体受损后48小时(C，D)，在左纹状体受损后9天(E，F)，在左纹状体受损后16天，和在右纹状体受损后48小时(G，H)。箭头指示给予过量未标记PK11195(1mg/kg)的时间。数据表达为每100mL注射剂量的百分比(％ID/100mL)，为注射后时间(分钟)的函数。 

图10：在血浆和脑中分析[¹¹C]-A代谢产物。 

图11：选择的碳-11标记形式和氟-18标记的形式的A。 

方法 

放射合成配体 

用碳-11标记 

[¹¹C]PK11195((R)-N-[¹¹C]甲基-N-(1-甲基丙基)-1-(2-氯苯基)异喹啉-3-甲酰胺，R-对映异构体)。[¹¹C]PK11195的制备基于经微调节的公布方法(Camsonne C.et al.(1984)J.Label.Comp.Radiopharm 21：985-991；Cremer J.E.et al.(1992)Int.J.Rad.Appl.Instrum.B.19：159-66；Boutin，H.et al.(2007)Glia 55：1459-68；Boutin，H.et al.(2007)J.Nucl.Med.48：573-581)，并包括下列步骤：(1)在-10℃将[¹¹C]甲基碘捕获(trapping)在DMF/DMSO(2/1(v∶v)，300μL)中，该DMF/DMSO含有1.5至2.0mg用于标记的前体和15-20mg的粉末状氢氧化物(过量)；(2)在110℃加热3分钟；(3)用0.5mL的HPLC流动相吸收混合物，和(4)使用半制备型HPLC纯化。质量控制特别是放射性化学物质以及化学物质纯度确定在等分的最终制备批次上进 行。 

在N-甲基吲哚官能团处的[¹¹C]-A标记：7-氯-N，N-二甲基-5-[¹¹C]甲基-4-氧代-3-苯基-3，5-二氢-4H-哒嗪并[4，5-b]吲哚-1-乙酰胺)。[¹¹C]-A的制备包括下列步骤：(1)在-10℃将[¹¹C]甲基三氟甲磺酸酯捕获在DMF(300μL)中，该DMF含有0.2至0.3mg的用于标记的前体和4mg粉末状碳酸钾(过量)；(2)在120℃加热3分钟；(3)用0.5mL的HPLC流动相吸收该混合物，和(4)使用半制备型HPLC纯化。质量控制特别是放射性化学物质以及化学物质纯度确定在等分的最终制备批次上进行。 

[¹¹C]-A(在N，N-二甲基乙酰胺官能团处标记：7-氯-N-[¹¹C]甲基-N，5-二甲基-4-氧代-3-苯基-3，5-二氢-4H-哒嗪并[4，5-b]吲哚-1-乙酰胺)。制备[¹¹C]-A还包括下列步骤：(1)在-10℃将[¹¹C]甲基碘捕获在DMF和DMSO(100/200μL)的1/2(v∶v)混合物中，该混合物含有0.5至1.0mg的用于标记的前体和5μL的1M四丁基氢氧化铵的甲醇溶液；(2)在120℃加热3分钟；(3)用0.5mL的HPLC流动相吸收该混合物，和(4)使用半制备型HPLC纯化。质量控制特别是放射性化学物质以及化学物质纯度确定在等分的最终制备批次上进行。 

用氟-18标记 

所有的A的氟-18-标记的衍生物的制备包括至少下列步骤：(1)使用[¹⁸F]氟化物源于中等温度至高温在含有1至10mg用于标记的合适前体的所选溶剂(300至900μL)中进行氟化，和(2)使用例如半制备型HPLC纯化。如上所述，质量控制特别是放射性化学物质以及化学物质纯度确定在等分的最终制备批次上进行。 

对在该反应中使用的[¹⁸F]氟化物阴离子源的性质没有特别限制，在该类型反应中常规使用的任何来源[¹⁸F]氟化物阴离子都可以在这里等同地使用，条件是其对分子的其他部分没有不利作用。合适来源的[¹⁸F]氟化物阴离子的实例包括：碱金属[¹⁸F]氟化物，如，[¹⁸F]氟化钠，[¹⁸F]氟化钾，[¹⁸F]氟化铯；[¹⁸F]氟化铵，四烷基[¹⁸F]氟化铵，如四丁基[¹⁸F]氟化铵。其中，优选碱金属[¹⁸F]氟化物，特别优选氟化钾。[¹⁸F]氟化物阴离子的来源可以通过能够复合[¹⁸F]氟化物阴离子源的抗衡阳离子种类的配体的存在而被活化。该配体可以为可以特别为环状或多环状多齿配体。合适配体的实例特别包 括冠醚，如1，4，7，10，13-五氧杂环十八烷(18-C-6)，或穴状配体，如以名称K222销售的4，7，13，16，21，24-六氧杂-1，10-二氮杂双环-[8，8，8]二十六烷。优选地，[¹⁸F]氟化物阴离子的来源为碱金属[¹⁸F]氟化物-穴状化合物(cryptate)络合物，特别为[¹⁸F]氟化钾-穴状化合物络合物，优选为[¹⁸F]氟化钾-4，7，13，16，21，24-六氧杂-1，10-二氮杂双环-[8，8，8]二十六烷(K[¹⁸F]/K222)。络合物K[¹⁸F]/K222可以通过任何常规方法(Dollé F.et al.(1999)J.Med.Chem.42：2251-2259 or Dolci L.et al.(1999)Bioorg.Med.Chem.7：467-479)制备。 

氟化反应可以在各种溶剂中进行，并且可以在宽的温度范围上发生。一般来说，方便在约50℃至约200℃的温度进行反应，较常使用的溶剂有二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)和乙腈。反应所需的时间也可以根据许多因素在宽的范围内变化(例如，从约5分钟至15分钟)，所述因素特别为反应温度、试剂和溶剂的性质、所使用的标记前体的量(Kilbourn MR.(1990)In Fluorine-18 Labeling of Radiopharmaceuticals，Nuclear Science Series(Kilbourn MR Ed.)，National Academy Press，Washington，D.C.，1-149；Lasne M.-C.et al.(2002)Topics in Current Chemistry，222：201-258；Dollé F.et al.(2005)Curr.Pharm.Design 11：3221-3235；Cai L.et al.(2008)Eur.J.Org.Chem.17：2853-2873；Dollé F.et al.(2008)In Fluorine and Health：Molecular Imaging，Biomedical Materials and Pharmaceuticals，Tressaud A，Haufe G(Eds).Elsevier：Amsterdam-Boston-Heidelberg-London-New York-Oxford-Paris-San Diego-San Francisco-Singapore-Sydney-Tokyo，3-65)。这样制备的放射性氟化的化合物通常通过HPLC来纯化，如对碳-11-标记的衍生物所描述的，但是还可以通过使用其他已知的色谱技术从反应混合物中回收或预纯化，或者简单地通过在预填充分离柱上过滤回收或预纯化。 

[¹⁸F]氟乙氧基-A(7-氯-N，N，5-三甲基-4-氧代-3-(4-[¹⁸F]氟乙氧基)-苯基-3，5-二氢-4H-哒嗪并[4，5-b]吲哚-1-乙酰胺) 

[¹⁸F]氟乙氧基-A的制备包括下列步骤：(1)用DMSO溶液(600μL)吸收K[¹⁸F]F-Kryptofix222络合物，所述DMSO溶液含有用于标记的甲苯磺酰基氧基前体(2.0-8.0mg)；(2)在165℃加热3-10分钟；(3)使用C-8或C-18PrepSep柱预纯化，和(4)使用半制备型HPLC纯化。质量控制特别是放射性化学物质以及化学物质纯度确定在等分的最终制备批次上进行。 

用其他卤素(溴-76，碘-123，碘-124)标记 

所有其他放射性卤素化的衍生物(溴-76，碘-123，碘-124)的制备依据本领域技术人员已知的标准技术和方法(Mazière B.et al.(2001)Curr.Pharm.Des.7：1931-1943；Coenen H.H.et al.(2006)In Radioiodination reactions for pharmaceuticals-Compendium for effective synthesis strategies，Coenen H.H.，Mertens J.，Mazière B.(Eds)，Springer Verlag，Berlin-Heidelberg，1-101)。 

用放射性金属(镓-68，铜-64和锝-99m)标记 

用放射性金属(镓-68、铜-64和锝-99m)标记的衍生物的制备也依照标准技术和本领域技术人员已知的方法(Brunner U.K.et al.(1995)Radiotracer production-Radiometals and their chelates In Principle of Nuclear Medecine，Wagner H.N.(Ed).Saunders：Philadelphia，220-228；Weiner R.E.et al.(2003)Chemistry of gallium and indium radiopharmaceuticals In Handbook of Radiopharmaceuticals-Radiochemistry and Applications(Welch MJ，Redvanly CS Eds.)，New York-Chichester-Brisbane-Toronto，Wiley-Interscience Pub.，363-400；Anderson C.J.et al.(2003)Chemistry of copper radionucleides and radiopharmaceuticals products In Handbook of Radiopharmaceuticals-Radiochemistry and Applications(Welch MJ，Redvanly CS Eds.)，New York-Chichester-Brisbane-Toronto，Wiley-Interscience Pub.，401-422；Mahmood A.et al.(2003)Technetium radiopharmaceuticals In Handbook of Radiopharmaceuticals-Radiochemistry and Applications(Welch MJ，Redvanly CS Eds.)，New York-Chichester-Brisbane-Toronto，Wiley-Interscience Pub.，323-362)。 

配制 

作为用于注射的静脉内(i.v.)溶液的[¹¹C]PK11195、[¹¹C]-A或任何其他放射性标记的A衍生物的配制常常包括基于Waters SepPak柱除去HPLC溶剂和/或用0.9％NaCl水溶液(生理盐水)简单稀释至乙醇浓度低于10％。 

动物模型 

所有的研究都根据法国法律和European导则的进行。 

神经炎症的大鼠模型 

将Wistar大鼠(平均体重300g，centre René Janvier，France)保持在调节温度的、控制湿度的装置中，经历12小时/12小时明/暗循环(在上午7点和下午7点之间为明)，允许自由获得食物和水。神经炎症如下诱导：通过立体定位(stereotaxic)注射AMPA(α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸酯(propionate))(15mM预PBS缓冲液中，Sigma )，使用1μL微量注射器和微泵(注射速率：0.5μL/分钟，UltraMicroPump II 和Micro4 Controller，WPI Inc.，USA)，如前所述的(Boutin，H.et al.(2007)Glia 55：1459-68.；Boutin，H.et al.(2007)J.Nucl.Med.48：573-581)。将AMPA(0.5μL)注射入右纹状体(Bregma+0.7mm，距离矢状缝：2.7mm，距离脑表面的深度：5.5mm)。手术期间通过使用加热毯(Homeothermic Blanket Control Unit，Harvard Apparatus Limited Edenbridge，Kent，UK)将动物保持在正常温度(体温：36.7±0.5℃，平均值±标准偏差)。 

神经炎症的灵长类模型 

体重为4-5kg的短尾猴(Cynomolgus macaques)(Macaca fascicularis)居住在调节温度的、控制湿度的装置中，经历12小时/12小时明/暗循环(在上午7点和下午7点之间为明)，允许自由获得食物和水。神经炎症如下诱导：在两个不同的外科手术介入期间，通过局部立体定位注射喹啉酸(喹啉酸，Sigma，St.Louis，MO；溶解在0.1M PBS中，pH 7.2)至灵长类纹状体(1个注射定位于尾状核(caudate)中，2个注射定位于壳核(putamen)内)，在这两个手术介入期间喹啉酸在第1天注射进入一个半球，在2周或7个月后注射进入第二半球(图8和9)。在每个外科手术期间，动物接收60nmol的喹啉酸，分布在三个不同的纹状体位点上，一个5μL定位于尾状核中，两个10μL定位于壳核中，使用10μL-Hamilton注射器，其连接26-量规注射针。根据Swabo和Cowan的立体定位的图(1984)确定的立体定位的坐标如下：尾状核位点[AP+19mm，ML±6mm，DV-14mm，距离窦]，壳核位点1[AP：+19mm，ML：±12mm，DV：-17mm，距离立体定位的零点]；壳核位点2[AP：+17mm，ML：±13mm，DV：-16mm，距离窦]。兴奋性毒素以0.1μL/分钟 的速率注射，注射器再留在原位5分钟，以避免毒素的回流。整个手术过程中，灵长类温度保持为正常温度(直肠温度，36℃±0.6℃，平均值±标准偏差)。在除去针后，缝合皮肤，动物从麻醉中苏醒，并在完全清醒后返回到它们的笼子中。 

转基因小鼠 

完成了单PS1M146L(PS1)和双APP751SL×PS1M146L(APP×PS1)转基因小鼠的产生和表征，如前所述(Blanchard，V.et al.(2003)Exp.Neurol.184：247-263)。在这些动物中，APP在所有的皮质神经元中在Thy-1启动子调控下以高水平表达。具有M146L突变的人PS1在HMG-CoA还原酶启动子的调控下表达。发现淀粉样蛋白荷载的水平在给定年龄非常具有重现性。Sanofi-Aventis提供的单个PS1和双重APP×PS1小鼠均用于在11-12月龄的PET成像和20-23月龄的放射自显影。 

MicroPET扫描和数据采集 

大鼠和转基因小鼠 

在AMPA注射后7日在大鼠和11-12月龄的转基因小鼠中实施MicroPET成像。在小鼠和大鼠中，麻醉均通过5％异氟烷诱导，然后通过2-2.5％异氟烷在70％/30％NO₂/O₂中的混合物保持。对于PET扫描，将大鼠的头部置于自制的与PET采集相容的立体定位框架(stereotaxic frame)中，将大鼠保持在正常温度(直肠温度：36.7±0.5℃，平均值±标准偏差)。将小鼠置于装配有允许加热空气流的麻醉罩的床上，直肠温度使用Homeothermic Blanket Control Unit监测。所有成像实验设计用Concorde Focus 220 PET扫描仪使用[¹¹C]PK11195或[¹¹C]-A进行。 

在大鼠中，放射性标记的化合物和未标记的配体使用24量规导管注射入尾静脉。放射性标记的化合物伴随着PET采集的开始注射，未标记的化合物在注射放射性示踪物后20分钟注射。采集PET数据80分钟。在小鼠中，紧接PET扫描启动之前，放射性标记的化合物使用28量规针注射在尾静脉中。采集PET数据60分钟。 

灵长类 

在注射喹啉酸之前和之后的不同时间点(损伤后24小时，48小时，9天，16天和7个月)实施成像阶段。注射[¹¹C]-A，测量脑动力学，接着进行PET 90分钟。 

PET成像前1小时，通过肌内注射氯胺酮/赛拉嗪混合物(15mg/kg/1.5mg/kg)麻醉动物，并且插管。然后将导管置于隐静脉中用于放射性示踪物注射，并且置于股动脉中用于血液采样。动物通过静脉内注射丙泊酚(Diprivan 1％；0.05mg.kg^-1.min^-1)保持麻醉。 

为了确保动物在装置中的正确定位，将动物的头部固定在自制的立体定位框架中。PET扫描使用高分辨的Focus micro-PET(CTI-Siemens，Knoxville，TN)进行，其同时采集95个邻接平面。对于衰减校正，透射扫描首次使用⁶⁸Ge旋转棒源(rotating rod source)进行。向短尾猴经静脉内注射192.29±33.67MBq的[¹¹C]-A，采集进行90分钟。所有PET采集在列表模式(3D模式)进行，使用下列时间框架重建图像：(4个图像，25s)+(4个图像，30s)+(2个图像，1分钟)+(5个图像，2分钟)+(3个图像，5分钟)+(3个图像，10分钟)和(1个图像，15分钟)，对于[¹¹C]-A总计90分钟。 

成像分析 

PET成像分析使用ASIPro VM^TM(CTI Concorde Microsystems’Analysis Tools和System Setup/Diagnostics Tool)和Brainvisa/Anatomist(http://brainvisa.info/)进行。 

大鼠血液和脑中的代谢产物分析 

向对照(native)的或手术过的(operated)成年雄性Wistar大鼠(体重300-400g)的尾部静脉经静脉内注射[¹¹C]-A.。在10、20或30分钟后处死动物。收集血液样品，通过离心(5min，3000rpm)分离血浆。通过添加400μL的乙腈，血浆蛋白从400μL血清中析出。离心(5分钟，3000rpm)后，将上清液注射至HPLC柱上。除去大鼠脑，分离半球。超声匀化在每半球1mL乙腈中进行。在快速离心后，将上清液与团块分离并在减压条件下浓缩，然后注射至HPLC上(参见HPLC条件的放射性化学部分)。 

放射自显影 

[¹¹C]-A放射自显影使用来自大鼠(损伤后7-8天)或小鼠(20-23个月)的 20μm脑切片进行。非特异性结合使用过量的未标记PK11195或A进行评估。PBR对中枢苯并二氮杂 结合位点的特异性通过使用过量的未标记氟马西尼进行评估。切片在Tris Buffer(TRIZMA pre-set Crystals，Sigma 于4℃调节在pH 7.4，50mM，含NaCl 120mM)中培育20分钟，然后用冷的缓冲液漂洗2次每次2分钟，接着在冷的蒸馏水中快速洗涤。然后，将切片置于与Phosphor-Imager屏直接接触并暴露过夜。放射自显影图使用ImageQuant^TM软件分析。 

实施例1 

[¹¹C]PK11195放射合成：[¹¹C]PK11195的最终HPLC纯化在半制备型Waters SymmetryC-18 HPLC柱上进行(洗脱液：水/乙腈/TFA：40/60/0.1[v∶v∶v]；流速：7mL/分钟)，收集对应放射性化学纯的[¹¹C]PK11195的峰(Rt：6.5-7.0分钟)。通常，从55.5GBq[¹¹C]CO₂回旋加速器生产批量(cyclotron production batch)开始，在30分钟的放射合成(包括HPLC纯化和配制)得到约4.5-5.0GBq的[¹¹C]PK11195。放射性化学物质纯度(通过分析型HPLC在Waters Symmetry-MC-18柱上确定)大于95％，并且比放射活性(specific radioactivity)范围为50至90GBq/μmol(在放射合成结束时)。 

实施例2 

[¹¹C]-A放射合成(在N-甲基吲哚官能团处标记)：[¹¹C]-A的最终HPLC纯化在半制备型ZorbaxSB-C-18 HPLC柱上进行(洗脱液：0.9％NaCl水溶液/EtOH/1M磷酸盐缓冲水溶液(pH 2,3)：50/50/0.1[v∶v∶v]；流速：6mL/分钟)，收集对应于放射性化学纯的[¹¹C]-A的峰(Rt：8.0-8.5分钟)。通常，从55.5GBq[¹¹C]CO₂回旋加速器生产批量开始，在25分钟的放射合成(包括HPLC纯化和配制)内得到约4.5-6.0GBq的[¹¹C]-A。放射性化学物质纯度(通过分析型HPLC在Waters Symmetry-MC-18柱上确定)大于95％，并且比放射活性范围为50至90GBq/μmol(在放射合成结束时)。 

实施例3 

[¹¹C]-A放射合成(在N，N-二甲基乙酰胺官能团处标记)：[¹¹C]-A的最终HPLC纯化在半制备型SymmetryPrepC-18 HPLC柱上进行(洗脱液：水 /乙腈/TFA：50/50/0.1[v∶v∶v]；流速：5mL/分钟)，收集对应于放射性化学纯的[¹¹C]-A(Rt：8.0-8.5分钟)的峰。通常，从55.5GBq[¹¹C]CO₂回旋加速器生产批量开始，在25分钟的放射合成(包括HPLC纯化和配制)内得到约3.5-5.0GBq的[¹¹C]-A。放射性化学物质纯度(通过分析型HPLC在Waters Symmetry-MC-18柱上确定)大于95％，并且比放射活性范围为50至90GBq/μmol(在放射合成结束时)。 

实施例4 

i)4-羟基-A合成。4-羟基-A可以根据WO00/44384合成。R_f：0.15(SiO₂-TLC(CH₂Cl₂/MeOH：95/5v∶v)).¹H NMR(DMSO-d₆)δ9.71(s，1H)，7.94(s，1H)，7.86(d，1H，J：8.4Hz)，7.39(d，1H，J：8.4Hz)，7.32(d，2H，J：8.8Hz)，6.84(d，2H，J：8.8Hz)，4.27(s，3H)，4.20(s，2H)，3.16(s，3H)，2.84(s，3H). ¹³C NMR(DMSO-d₆)δ168.6[C]，157.1[C]，154.8[C]，141.2[C]，140.9[C]，133.6[C]，132.1[C]，130.9[C]，127.8[2.CH]，124.0[CH]，122.6[CH]，118.9[C]，117.3[C]，115.3[2.CH]，111.6[CH]，40.0[CH₂]，37.4[CH₃]，35.4[CH₃]，32.0[CH₃]. 

ii)[¹¹C]甲氧基-A放射合成。用碳-11标记以及最终HPLC纯化可以如制备[¹¹C]-A(实施例2/实施例3)的记载使用上面合成的A的4-羟基衍生物(实施例4i)进行。 

实施例5 

合成(氟)烷氧基-A和甲苯磺酰基氧基烷氧基-A的一般方法。向K₂CO₃(101mg，0.73mmol)在无水DMF(8-12mL)中的悬浮液中加入在无水DMF(2mL)中的A的4-羟基衍生物(150mg，0.36mmol，参见WO00/44384)溶液。室温搅拌反应混合物30分钟，接着逐步加入在DMF(2mL)中的合适的烷基化试剂(2当量)溶液。在70℃搅拌全部混合物2小时，并在室温再搅拌另一小时。然后混合物通过添加饱和的NH₄Cl水溶液中止，并用CH₂Cl₂萃取。合并有机层，并用盐水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并浓缩至干。残余物通过硅胶柱色谱法(CH₂Cl₂/MeOH 98∶2至95∶5v/v作为洗脱液)纯化，得到预期的(氟)烷氧基-A，为白色粉末或白色蓬松固体。 

实施例6 

甲氧基-A合成。使用上述一般方法(实施例5)和甲基碘得到目标化合物，产率40％。R_f：0.35(SiO₂-TLC(CH₂Cl₂/MeOH：95/5v∶v))。¹H NMR(CDCl₃)δ7.94(d，1H，J：8.4Hz)，7.53(m，3H)，7.33(dd，1H，J：8.4，1.6Hz)，7.00(d，2H，J：8.8Hz)，4.32(s，3H)，4.18(s，2H)，3.86(s，3H)，3.22(s，3H)，3.00(s，3H).¹³C NMR(CDCl₃)δ168.4[C]，158.9[C]，155.3[C]，141.6[C]，140.1[C]，134.6[C]，133.2[C]，131.3[C]，127.3[2.CH]，123.3[CH]，123.0[CH]，119.0[C]，117.4[C]，113.9[2.CH]，110.6[CH]，55.5[CH₃]，39.6[CH₂]，37.6[CH₃]，35.7[CH₃]，31.6[CH₃]. 

实施例7 

氟乙氧基-A合成。使用上述一般方法(实施例5)和2-氟乙基-4-甲基苯磺酸酯(根据Damont A.et al.(2008)J.label.Compds Radiopharm.51：286-292合成)，得到目标化合物，产率63％。R_f：0.38(SiO₂-TLC(CH₂Cl₂/MeOH：95/5v∶v)).¹H NMR(CD₂Cl₂)δ7.89(d，1H，J：8.8Hz)，7.58(d，1H，J：1.6Hz)，7.54(d，2H，J：9.2Hz)，7.34(dd，1H，J：8.8，1.6Hz)，7.03(d，2H，J：9.2Hz)，4.78(dt，2H，J² _H-F：47.6，J³ _H-H：4.0Hz)，4.32(s，3H)，4.27(dt，2H，J³ _H-F：28.4Hz，J³ _H-H：4.0Hz)，4.16(s，2H)，3.19(s，3H)，2.96(s，3H).¹³C NMR(CD₂Cl₂)δ168.2[C]，157.6[C]，155.1[C]，141.3[C]，140.7[C]，140.3[C]，135.4[C]，132.8[C]，127.4[2.CH]，123.2[CH]，122.6[CH]，118.9[C]，117.2[C]，114.3[2.CH]，110.7[CH]，82.0[d，J¹ _C-F：169Hz，CH₂]，67.5[d，J² _C-F：20Hz，CH₂]，39.5[CH₂]，37.4[CH₃]，35.2[CH₃]，31.6[CH₃].C₂₃H₂₂ClFN₄O₃.0.15H₂O的分析计算值：C，60.11，H，4.89，N，12.19，测量值：C，60.00，H，4.96，N，12.18。 

实施例8 

氟丙氧基-A合成。使用上述一般方法(实施例5)和3-氟丙基-4-甲基苯磺酸酯，得到目标化合物，产率58％。R_f：0.39(SiO₂-TLC(CH₂Cl₂/MeOH：95/5v∶v))。¹H NMR(CD₂Cl₂)δ7.89(d，1H，J：8.4Hz)，7.58(d，1H，J：1.6Hz)，7.52(d，2H，J：9.2Hz)，7.34(dd，1H，J：8.4，1.6Hz)，7.01(d，2H，J：9.2Hz)，4.67(dt，2H，J² _H-F：46.8Hz，J³ _H-H：6.0Hz)，4.31(s，3H)，4.16(m，4H)，3.19(s，3H)， 2.96(s，3H)，2.20(dq⁵，2H，J³ _H-F：26.0Hz，J³ _H-H：6.0).¹³C NMR(CD₂Cl₂)δ168.2[C]，158.0[C]，155.1[C]，141.3[C]，140.3[C]，135.0[C]，132.8[C]，131.3[C]，127.3[2.CH]，123.2[CH]，122.5[CH]，119.0[C]，117.2[C]，114.2[2.CH]，110.7[CH]，80.8[d，J¹ _C-F：163Hz，CH₂]，63.9[d，J³ _C-F：6.0Hz，CH₂]，39.5[CH₂]，37.4[CH₃]，35.2[CH₃]，31.5[CH₃]，30.3[CH₂，J² _C-F：20.0Hz]。 

实施例9 

氟丁氧基-A合成。使用上述一般方法(实施例5)和4-氟丁基溴得到目标化合物，产率70％。R_f：0.40(SiO₂-TLC(CH₂Cl₂/MeOH：95/5v∶v)).¹H NMR(CD₂Cl₂)δ7.90(d，1H，J：8.8Hz)，7.58(d，1H，J：1.6Hz)，7.51(d，2H，J：9.2Hz)，7.34(dd，1H，J：8.8，1.6Hz)，6.99(d，2H，J：9.2Hz)，4.54(dt，2H，J² _H-F：47.2Hz，J³ _H-H：5.6Hz)，4.33(s，3H)，4.16(s，2H)，4.08(t，2H，J：5.6Hz)，3.19(s，3H)，2.96(s，3H)，1.97-1.85(m，4H).¹³C NMR(CD₂Cl₂)δ168.2[C]，158.2[C]，155.1[C]，141.3[C]，140.2[C]，134.9[C]，132.8[C]，131.4[C]，127.3[2.CH]，123.2[CH]，122.5[CH]，119.0[C]，117.2[C]，114.2[2.CH]，110.7[CH]，83.8[d，J¹ _C-F：163Hz，CH₂]，67.6[CH₂]，39.5[CH₂]，37.4[CH₃]，35.2[CH₃]，31.5[CH₃]，27.1[CH₂，J² _C-F：20.0Hz]，25.1[CH₂，J³ _C-F：5.0Hz]。 

实施例10 

2-(氟乙氧基)乙氧基-A合成。使用上述一般方法(实施例5)和2-(2-氟乙氧基)乙基-4-甲基苯磺酸酯，得到目标化合物，产率69％。R_f：0.45(SiO₂-TLC(CH₂Cl₂/丙酮：80/20v∶v)).¹H NMR(CD₂Cl₂)δ7.91(d，1H，J：8.4Hz)，7.60(d，1H，J：1.6Hz)，7.54(d，2H，J：8.8Hz)，7.36(dd，1H，J：8.4，1.6Hz)，7.04(d，2H，J：8.8Hz)，4.61(dt，2H，J² _H-F：48.0Hz，J³ _H-H：4.0Hz)，4.34(s，3H)，4.22(t，2H，J：4.8Hz)，4.17(s，2H)，3.91(t，2H，J：4.8Hz)，3.83(dt，2H，J³ _H-F：30.0，J³ _H-H：4.0Hz)，3.21(s，3H)，2.98(s，3H).¹³C NMR(CD₂Cl₂)δ168.2[C]，157.9[C]，155.1[C]，141.3[C]，140.3[C]，135.1[C]，132.8[C]，131.4[C]，127.3[2.CH]，123.2[CH]，122.5[CH]，119.0[C]，117.2[C]，114.3[2.CH]，110.7[CH]，83.2[d，J¹ _C-F：167Hz，CH₂]，70.4[d，J² _C-F：19Hz，CH₂]，69.7[CH₂]，67.8[CH₂]，39.5[CH₂]，37.4[CH₃]，35.2[CH₃]，31.6[CH₃]。 

实施例11 

2-(2-(氟乙氧基)乙氧基)乙氧基-A合成。使用上述一般方法(实施例5)和2-(2-(2-氟乙氧基)乙氧基)乙基-4-甲基苯磺酸酯，得到目标化合物，产率63％。R_f：0.32(SiO₂-TLC(CH₂Cl₂/丙酮：80/20v∶v))。¹H NMR(CD₂Cl₂)δ7.91(d，1H，J：8.8Hz)，7.60(d，1H，J：1.6Hz)，7.54(d，2H，J：8.8Hz)，7.36(dd，1H，J：8.8，1.6Hz)，7.04(d，2H，J：8.8Hz)，4.57(dt，2H，J² _H-F：47.6Hz，J³ _H-H：4.4Hz)，4.33(s，3H)，4.21(t，2H，J：4.4Hz)，4.17(s，2H)，3.88(t，2H，J：4.8Hz)，3.80-3.65(m，6H)，3.21(s，3H)，2.98(s，3H).¹³C NMR(CD₂Cl₂)δ168.2[C]，158.0[C]，155.1[C]，141.3[C]，140.3[C]，135.1[C]，132.8[C]，131.4[C]，127.3[2.CH]，123.2[CH]，122.5[CH]，119.0[C]，117.2[C]，114.3[2.CH]，110.7[CH]，83.2[d，J¹ _C-F：167Hz，CH₂]，70.7[CH₂]，70.6[CH₂]，70.3[d，J² _C-F：19Hz，CH₂]，69.6[CH₂]，67.8[CH₂]，39.5[CH₂]，37.4[CH₃]，35.2[CH₃]，31.6[CH₃]。 

实施例12 

甲苯磺酰基氧基乙氧基-A合成。使用上述一般方法(实施例5)和乙烷-1，2-二基二(4-甲基苯磺酸酯)(根据Damont A.et al.(2008)J.label.Compds Radiopharm.51：286-292合成)，从而得到目标化合物45％产率。R_f：0.72(SiO₂-TLC(CH₂Cl₂/MeOH：95/5v∶v)).¹H NMR(CD₂Cl₂)δ7.89(d，1H，J：8.8Hz)，7.84(d，2H，J：8.4Hz)，7.60(d，1H，J：1.6Hz)，7.53(d，2H，J：8.8Hz)，7.41(d，2H，J：8.4Hz)，7.36(dd，1H，J：8.8，1.6Hz)，6.91(d，2H，J：8.8Hz)，4.40(t，2H，J：4.4Hz)，4.32(s，3H)，4.22(t，2H，J：4.4Hz)，4.17(s，2H)，3.21(s，3H)，2.98(s，3H)，2.48(s，3H).¹³C NMR(CD₂Cl₂)δ168.1[C]，157.2[C]，155.0[C]，145.2[C]，141.2[C]，140.3[C]，135.5[C]，132.8[C]，132.7[C]，131.3[C]，129.9[2.CH]，127.9[2.CH]，127.4[2.CH]，123.2[CH]，122.6[CH]，118.9[C]，117.2[C]，114.4[2.CH]，110.7[CH]，68.3[CH₂]，65.8[CH₂]，39.5[CH₂]，37.4[CH₃]，35.2[CH₃]，31.6[CH₃]，21.3[CH₃]。 

甲苯磺酰基氧基丙氧基-A、甲苯磺酰基氧基丁氧基-A、2-(甲苯磺酰基氧基乙氧基)乙氧基-A和2-(2-(甲苯磺酰基氧基乙氧基)乙氧基)乙氧基-A作为用于使用氟-18标记上述氟烷氧基-A衍生物的前体，它们可以用合适的烷基化试剂正如上所述制备。 

实施例13 

[¹⁸F]氟乙氧基-A放射合成：[¹⁸F]氟乙氧基-A的最终HPLC纯化在半制备型SymmetryC-18 HPLC柱上进行(洗脱液：水/乙腈/TFA：60/40/0.1[v∶v∶v]；流速：5mL/min)，收集对应于放射性化学纯的[¹⁸F]氟乙氧基-A(Rt：11.0-13.0分钟)的峰。从37GBq[¹⁸F]氟化物回旋加速器生产批量(fluoride cyclotron production batch)开始，在90分钟的放射合成(包括HPLC纯化和配制)内得到约3.7GBq的[¹⁸F]氟乙氧基-A。放射性化学物质纯度(通过分析型HPLC在Waters Symmetry-MC-18柱上确定)大于95％，并且比放射活性大于50GBq/μmol(在放射合成结束时)。 

[¹⁸F]氟丙氧基-A、[¹⁸F]氟丁氧基-A、2-([¹⁸F]氟乙氧基)乙氧基-A和2-(2-([¹⁸F]氟乙氧基)乙氧基)乙氧基-A可以正如上所述的从相应的甲苯磺酰基氧基烷氧基-A衍生物(实施例12)作为氟-18-标记的前体制备。 

实施例14 

[¹¹C]-A的吸收在AMPA-注射的大鼠的受损纹状体(PBR表达被诱导的区域)中显著高于完整对侧纹状体，后者预期不表达或只表达非显著量的PBR(图1)。[¹¹C]-A的吸收在受损纹状体中也显著高于参照PBR PET配体[¹¹C]PK11195观察到的吸收(图1)。关于在受损的纹状体对完整的纹状体中的吸收比，[¹¹C]-A也显著高于[¹¹C]PK11195(图2)。关于结合能力和R1，[¹¹C]-A也显著高于[¹¹C]PK11195(BP＝1.65±0.36对(vs)0.66±0.15；R1＝1.26±0.08对1.10±0.05)。 

未标记的PK11195(图3)和A(图4)(1mg/kg经静脉内；[¹¹C]-A注射后20分钟)显著减少[¹¹C]-A在受损纹状体中的脑吸收。未标记化合物诱导了[¹¹C]-A结合在对侧的少量增加，这可能是由于因[¹¹C]-A从脑外结合位点释放引起的[¹¹C]-A的血液浓度的增加。 

在注射[¹¹C]-A后10和20分钟存在于大鼠血液和血浆中的代谢产物的分析，以及在注射[¹¹C]-A后10、20分钟和30分钟存在于大鼠脑中的代谢产物的分析基本上仅检测到母体化合物(图10)。 

此外，[¹¹C]-A结合在脑切片的放射自显影反映了具有高的同侧与对侧比值(3.8)的成像结果，该比值通过过量的未标记的PK11195或A消除(图 5)。在使用未标记的氟马西尼，苯并二氮杂 拮抗剂时，观察到少量但是显著减少的[¹¹C]-A结合(图5)。 

实施例15 

在APP×PS1和野生型PS1转基因小鼠中，[¹¹C]-A在整个脑中的吸收(排除小脑)高于[¹¹C]PK11195的吸收(图6)。但是，在APP×PS1对野生型PS1中，[¹¹C]-A和[¹¹C]PK11195的吸收均不是显著较高。与此相反，在来自APP×PS1小鼠的整个脑切片中的[³H]-A结合的特异性为来自野生型PS1小鼠的约2倍(图7)。 

这些数据显示了，在大鼠神经炎症的急性模型和在阿尔茨海默病的小鼠模型中，[¹¹C]-A可以特异性检测增加的PBR结合和炎症。体内PET成像证实了，[¹¹C]-A可以用来在啮齿动物中成像PBR受体过表达和神经炎症。此外，通过使用[¹¹C]-A的PET成像观察到的PBR受体结合大于用参照PBR受体PET配体[¹¹C]PK11195观察到的结合。 

实施例16 

在注射兴奋性毒素后24小时，在注射喹啉酸的灵长类的受损右纹状体中[¹¹C]-A的吸收显著高于在对侧未注射的纹状体和两个未注射的对照脑区域(小脑、前额皮质)中的[¹¹C]-A的吸收(图8)。在对侧未注射的纹状体中的[¹¹C]-A吸收保持稳定，且与未注射灵长类的脑区域中的[¹¹C]-A吸收水平相同(图8)。[¹¹C]-A吸收的增加在注射兴奋性毒素后48小时仍然可见(在左半球)，而在兴奋性毒素注射后7个月的[¹¹C]-A吸收(7个月之前受损的右纹状体中的动力学)已经回到基线水平。神经炎症早期的更详细的表征显示增加的[¹¹C]-A吸收可以从24小时至16天可见(图9)。在注射放射性示踪剂后30分钟，全身给药大量过量的未标记PK11195导致[¹¹C]-A结合在受损纹状体中的特异性取代(displacement)，而在非受损对照脑区域中没有观察到显著的改变(图9)。 

应用： 

本发明可以用作诊断工具，以及作为跟踪病理的演化和进展的工具，在该病理中PBR水平发生改变并且存在炎症。本发明还可以应用于受体占 有率研究，并用来评估在病理状况中的治疗性治疗的功效，以及作为翻译性生物标志物用于动物模型至人的研究。 

Claims (28)

1.放射性标记的7-氯-N，N，5-三甲基-4-氧代-3-苯基-3，5-二氢-4H-哒嗪并[4，5-b]吲哚-1-乙酰胺在制备用于在个体内检测与正常状况和病理状况相关的PBR水平的诊断试剂中的用途，其中

所述7-氯-N，N，5-三甲基-4-氧代-3-苯基-3,5-二氢-4H-哒嗪并[4，5-b]吲哚-1-乙酰胺用碳-11在位于吲哚核5位的甲基碳上进行放射性标记，或

所述7-氯-N，N，5-三甲基-4-氧代-3-苯基-3,5-二氢-4H-哒嗪并[4，5-b]吲哚-1-乙酰胺用碳-11在N，N-二甲基乙酰胺官能团处的甲基碳上进行放射性标记。

2.根据权利要求1的用途，其中所述PBR水平和炎症的检测通过PET成像或SPECT成像进行，其中所述PET成像是指正电子放射断层扫描术，所述SPECT成像是指单光子发射计算机断层扫描术。

3.根据权利要求1的用途，其中所述PBR水平和炎症的检测通过PET成像进行，其中所述PET成像是指正电子放射断层扫描术。

4.根据权利要求2的用途，其中所述PBR水平和炎症的检测通过PET成像进行。

5.根据权利要求1的用途，其中与PBR水平变化相关的病理状况选自脑损伤、脑感染和神经疾病。

6.根据权利要求2的用途，其中与PBR水平变化相关的病理状况选自脑损伤、脑感染和神经疾病。

7.根据权利要求3的用途，其中与PBR水平变化相关的病理状况选自脑损伤、脑感染和神经疾病。

8.根据权利要求4的用途，其中与PBR水平变化相关的病理状况选自脑损伤、脑感染和神经疾病。

9.根据权利要求1的用途，其中与PBR水平变化相关的病理状况选自精神疾病。

10.根据权利要求2的用途，其中与PBR水平变化相关的病理状况选自精神疾病。

11.根据权利要求3的用途，其中与PBR水平变化相关的病理状况选自精神疾病。

12.根据权利要求4的用途，其中与PBR水平变化相关的病理状况选自精神疾病。

13.根据权利要求1的用途，其中与PBR水平变化相关的病理状况选自增殖性疾病。

14.根据权利要求2的用途，其中与PBR水平变化相关的病理状况选自增殖性疾病。

15.根据权利要求3的用途，其中与PBR水平变化相关的病理状况选自增殖性疾病。

16.根据权利要求4的用途，其中与PBR水平变化相关的病理状况选自增殖性疾病。

17.根据权利要求1的用途，其中与PBR水平变化相关的病理状况选自外周炎性过程。

18.根据权利要求2的用途，其中与PBR水平变化相关的病理状况选自外周炎性过程。

19.根据权利要求3的用途，其中与PBR水平变化相关的病理状况选自外周炎性过程。

20.根据权利要求4的用途，其中与PBR水平变化相关的病理状况选自外周炎性过程。

21.根据权利要求1的用途，其中PBR水平的检测用于占有率研究。

22.根据权利要求2的用途，其中PBR水平的检测用于占有率研究。

23.根据权利要求3的用途，其中PBR水平的检测用于占有率研究。

24.根据权利要求4的用途，其中PBR水平的检测用于占有率研究。

25.根据权利要求1的用途，其中PBR水平的检测用于评估治疗性治疗的功效。

26.根据权利要求2的用途，其中PBR水平的检测用于评估治疗性治疗的功效。

27.根据权利要求3的用途，其中PBR水平的检测用于评估治疗性治疗的功效。

28.根据权利要求4的用途，其中PBR水平的检测用于评估治疗性治疗的功效。