HK1161110A1 - 中和抗甲型流感病毒抗体及其用途 - Google Patents

Description

中和抗甲型流感病毒抗体及其用途

本专利申请要求分别于2008年7月25日和2009年5月27日提交的美国临时专利申请第61/083,838号和61/181,582号的优先权，上述专利申请公开的全文援引加入本文，如同在本文中记载一样。 

背景技术

据认为，对甲型流感病毒的中和抗体应答对于给定的病毒亚型是特异性的。有16种通过血凝素(HA)定义的甲型流感亚型。16种HA(H1-H16)可被分为两组。组1由H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13和H16亚型组成，组2包括H3、H4、H7、H10、H14和H15亚型。尽管所有的亚型病毒都存在于鸟类，但主要是H1、H2和H3在人类中引发疾病。H5、H7和H9亚型在人类中引起偶发性严重感染并可能引起新的大流行。H1和H3病毒不断地进化形成新的变体，这种现象被称为抗原漂移。由此，应答过去的病毒而产生的抗体对于新的漂移病毒保护性很差或没有保护性。其结果是每年必须要制备新疫苗用于抵抗预计要出现的H1和H3病毒，这个过程很昂贵且并不总是奏效。这同样适用于H5流感疫苗的制备。还不清楚基于越南和印度尼西亚甲型流感病毒分离体的现有H5疫苗是否能抵抗未来的流行性H5病毒。 

由于这些原因，非常希望拥有诱导能够中和所有甲型流感病毒亚型及其每年的变体(2006年，由Gerhard等人进行了综述)的广谱中和抗体的疫苗。此外，广谱中和异亚型抗体也可用在预防和治疗中。 

已经表征了识别甲型流感病毒的抗体。M2的抗体(只在被感染细胞上表达而不在感染性病毒上表达的一种不变的小蛋白)已经显示出一些体内保护效果，这些保护效果可能是通过用NK细胞或胞毒性T细胞靶向感染的细胞加以破坏来实现的。但是，HA是中和抗体的首 要目标。它包括约500个氨基酸的大胞外域，该胞外域被源自宿主的酶裂解以产生通过二硫键连接的两个多肽。较大的N-末端片段(HA1，320至330个氨基酸)形成包含受体结合位点和大部分被病毒中和抗体识别的决定簇的膜远端球状域。较小的C-末端部分(HA2，约180个氨基酸)形成将球状域锚定在细胞或病毒膜的茎状结构。亚型之间的序列同源性的程度，在HA1多肽(亚型之间34％至59％的同源性)中比在HA2多肽(51％至80％的同源性)中小。最保守的区是裂解位点周围的序列，特别是HA2N-末端的11个氨基酸，被命名为融合肽，它在所有的甲型流感病毒亚型中均是保守的。这个区的一部分以表面环暴露在HA前体分子(HA0)中，但是当HA0裂解为HA1/HA2时，则变得不可接近。总之，在不同的HA亚型之中，特别是在HA1-HA2连接区和在HA2区中都有保守区。但是，这些区对于中和抗体可能是不易接近的。 

在确认中和一种以上甲型流感病毒的亚型的抗体中只取得了有限的成功，并且其中和宽度窄和其效力低。Okuno等人用流感病毒A/Okuda/57(H2N2)免疫小鼠并分离了单克隆抗体(C179)，该单克隆抗体(C179)结合HA2中的保守构象表位并在动物模型中在体外和体内中和组1的H2、H1和H5亚型甲型流感病毒(Okuno等人，1993；Smirnov等人，1999；Smirnov等人，2000)。 

最近，Gioia等人描述了在接种了传统季节性流感疫苗的某些个体的血清中有H5N1病毒中和抗体的存在(Gioia等人，2008)。作者认为中和活性可能是来自神经氨酸酶(N1)的抗体。可是没有分离出单克隆抗体，也没有表征靶表位。目前尚不清楚血清抗体是否中和其它的甲流病毒亚型。 

尽管经过了数十年的研究，但是还没有投入市场的广谱中和或抑制甲型流感病毒感染或缓解由甲型流感病毒引发的疾病的抗体。因此，需要鉴定新的抵御多种甲型流感病毒亚型的抗体。 

发明内容

本发明部分地基于从接种了季节性流感疫苗的个体中分离出结合至HA并中和一种以上甲型流感病毒亚型感染的自然产生的人单克隆抗体以及本发明的抗体结合的新型表位。因此，在本发明的一个方面中，本发明包括一种中和一种以上选自组1和组2亚型的甲型流感病毒亚型的感染的抗体及其抗原结合片段。 

在本发明的一个实施方案中，本发明包括中和甲型流感病毒的组1亚型和组2亚型感染的抗体或其抗原结合片段。在本发明的另一个实施方案中，本发明包括一种抗体或其抗原结合片段，其包含至少一个互补决定区(CDR)序列，该序列与SEQ ID NO：1-6或17-22中的任一个有至少95％的序列同一性，其中所述抗体中和甲型流感病毒。 

在本发明的又一个实施方案中，本发明包括具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：17的氨基酸序列的重链CDR1；具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：18的氨基酸序列的重链CDR2；和具有SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：19的氨基酸序列的重链CDR3，其中所述抗体中和甲型流感病毒。在本发明的另一个实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含具有SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：20的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：21的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：22的氨基酸序列的轻链CDR3，其中所述抗体中和甲型流感病毒。 

在本发明的又一个实施方案中，本发明包括一种抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的重链可变区和含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的轻链可变区；或包含含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的重链可变区和含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的轻链可变区；或包含含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的重链可变区和含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的轻链可变区；或包含含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的重链可变区和含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的轻链可变区，并且其中所述抗体中和甲型流感病毒。本 发明进一步包括一种抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是FI6变体1或FI6变体2。 

在本发明的另一个实施方案中，本发明包括一种抗体或其抗原结合片段，其中和甲型流感病毒的组1亚型和组2亚型的感染，其中所述抗体或其片段被永生B细胞克隆表达。 

在另一个方面，本发明包括一种含有编码本发明的抗体或抗体片段的多核苷酸的核酸分子。在另一个方面，本发明包括一种含有本发明的核酸分子的载体或表达本发明的抗体或其抗原结合片段的细胞。在又一个方面，本发明包括含有结合本发明的抗体或其抗原结合片段的表位的分离的或纯化的免疫原性多肽。 

本发明进一步包括一种药物组合物，其包含本发明的抗体或其抗原结合片段、本发明的核酸分子、含有本发明的核酸分子的载体、表达本发明的抗体或抗体片段的细胞、或本发明的免疫原性多肽以及药学可接受的稀释剂或载体(carrier)。本发明还包括一种药物组合物，其含有第一抗体或其抗原结合片段以及第二抗体或其抗原结合片段，其中所述第一抗体是本发明的抗体，第二抗体是能中和甲型流感病毒感染的抗体或其抗原结合片段。 

本发明的抗体或其抗原结合片段、本发明的核酸、含本发明的核酸的载体、表达本发明的载体的细胞、包含结合本发明的抗体或抗体片段的表位的分离的或纯化的免疫原性多肽、或本发明的药物组合物(i)在制备治疗甲型流感病毒感染的药物中；(ii)在疫苗中；或(iii)在甲型流感病毒感染的诊断中的用途也预期包括在本发明的范围之内。进一步，本发明的抗体或其抗原结合片段在通过检测抗甲型流感病毒疫苗的抗原是否含有正确构象的特异表位来监测所述疫苗的质量中的用途也预期包括在本发明的范围之内。 

在另一方面，本发明包括一种减少甲型流感病毒感染或降低甲型流感病毒感染风险的方法，其包括向有需要的对象施用治疗有效量的本发明的抗体或其抗原结合抗体片段。 

在另一方面，本发明包括一种特异性地结合本发明的抗体或其抗原结合片段的表位，其用于：(i)治疗中；(ii)制备治疗甲型流感病毒感染的药物；(iii)作为疫苗；或(iv)筛选能中和甲型流感病毒感染的配体。 

发明详述 

本发明部分地基于从接种了季节性甲型流感疫苗的个体中发现和分离能广谱中和不同甲型流感病毒亚型的自然产生的人抗体以及本发明的抗体结合的新型表位。希望得到这些抗体，因为只要一种或少数几种抗体就可以中和不同的甲型流感病毒亚型。此外，被这些抗体识别的表位可以是能够诱导广谱抗不同亚型的季节性和候选流行分离体的疫苗的一部分。 

因此，在一方面，本发明提供了一种能中和至少两种组1和组2亚型中的甲型流感病毒的抗体和其抗原结合片段。在一个实施方案中，本发明提供了一种中和甲型流感病毒的组1亚型和组2亚型的感染的抗体或其抗原结合片段。 

在本发明的另一方面，本发明提供了一种对不同的甲型流感病毒亚型的HA具有广谱特异性的中和抗体和其抗原结合片段。在一个实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段特异性地结合在两种或两种以上选自组1和组2的甲型流感病毒亚型之中是保守的HA的茎区的表位。在另一个实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段特异性地结合包含SEQ ID NO：37、38、39或40的任一个的氨基酸序列的多肽。 

人单克隆抗体、分泌本发明的抗体的永生B细胞克隆或转染的宿主细胞、以及编码本发明的抗体的核酸也包括在本发明的范围之内。 

如本文所用，术语“抗原结合片段”、“片段”和“抗体片段”可以互换地使用，是指本发明的保持抗体的抗原结合活性的抗 体的任何片段。示例性的抗体片段包括但不限于单链抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或scFv。如本文所用，术语“抗体”包括抗体和其抗原结合片段。 

如本文所用，术语“广谱特异性”用来指能结合和/或中和甲型流感病毒的一或多种组1亚型和一或多种组2亚型的本发明的抗体或抗原结合片段。 

如本文所用，“中和抗体”是指一种能中和，即防止、抑制、减少、阻碍或干扰病原体引发和/或持续宿主内的感染的能力的抗体。术语“中和抗体”和“中和…抗体”在本文中可以互换地使用。如本文所述，这些抗体可单独使用，或作为预防剂或治疗剂在合适的制剂中结合使用，作为诊断工具或制备工具与活性接种疫苗配合使用。 

本发明的抗体或抗原结合片段中和一或多种组1(H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13、和H16以及它们的变体)的甲型流感病毒和一或多种组2(H3、H4、H7、H10、H14和H15以及它们的变体)的甲型流感病毒。在一个实施方案中，示例性的组1亚型包括H1、H2、H5、H6和H9，示例性的组2亚型包括H3和H7。 

本发明的抗体和抗体片段能够中和甲型流感病毒亚型的各种组合。在一个实施方案中，抗体能中和甲型流感病毒H1和H3亚型、或H2和H3亚型、或H3和H5亚型、或H3和H9亚型、或H1和H7亚型、或H2和H7亚型，或H5和H7亚型、或H7和H9亚型。 

在另一个实施方案中，本发明的抗体和抗体片段能中和甲型流感病毒H1、H2和H3亚型、或H1、H3和H5亚型、或H1、H3和H9亚型、或H2、H3和H5亚型、或H2、H3和H9亚型、或H3、H5和H9亚型，或H1、H2和H7亚型、或H1、H5和H7亚型，或H1、H7和H9亚型、或H2、H5和H7亚型、或H2、H7和H9亚型、或H5、H7和H9亚型、或H1、H3和H7亚型、或H2、H3和H7亚型、或H3、H5和H7亚型、或H3、H7和H9亚型。 

在又一个实施方案中，抗体能中和甲型流感病毒H1、H2、H3和H7亚型、或H1、H3、H5和H7亚型、或H1、H3、H7和H9亚型、或H2、H3、H5和H7亚型、和H2、H3、H7和H9亚型、或H3、H5、H7和H9亚型或H1、H2、H3和H5亚型、或H1、H2、H3和H9亚型、或H1、H3、H5和H9亚型、或H2、H3、H5和H9亚型、或H1、H2、H5和H7亚型、或H1、H2、H7和H9亚型、或H1、H5、H7和H9亚型、或H2、H5、H7和H9亚型。 

在又一实施方案中，本发明的抗体可以中和甲型流感病毒H1、H2、H3、H5和H7亚型、或H1、H2、H3、H7和H9亚型、或H1、H3、H5、H7和H9亚型、或H2、H3、H5、H7和H9亚型、或H1、H2、H3、H5和H9亚型、或H1、H2、H5、H7和H9亚型、或H1、H2、H3、H5、H7和H9亚型。在另一个实施方案中，除了中和甲型流感病毒H6亚型外，本发明的抗体和抗原结合片段还中和一或多种上述组合。 

本发明的抗体和抗原结合片段具有高中和能力。中和50％甲型流感病毒所需要的本发明的抗体浓度可例如为约50μg/ml或更低。在一个实施方案中，中和50％甲型流感病毒所需要的本发明的抗体浓度是约50、45、40、35、30、25、20、17.5、15、12.5、11、10、9、8、7、6、5、4.5、4、3.5、3、2.5、2、1.5或约1μg/ml或更低。在另一个实施方案中，中和50％甲型流感病毒所需要的本发明的抗体浓度是约0.9、0.8、0.75、0.7、0.65、0.6、0.55、0.5、0.45、0.4、0.35、0.3、0.25、0.2、0.15、0.1、0.075、0.05、0.04、0.03、0.02、0.01、0.008、0.006、0.004、0.003、0.002或约0.001μg/ml或更低。这意味着仅需低浓度的抗体来中和50％的甲型流感病毒。可使用本领域技术人员已知的标准中和试验来测定特异性和中和能力。 

本发明的抗体 

本发明提供了一种对于HA具有特定广谱特异性且中和一或多种组1的甲型流感病毒亚型或一或多种组2的甲型流感病毒亚型的抗 体。本发明的抗体结合在选自组1和组2的两或多种甲型流感病毒亚型之中是保守的HA的区中的表位。 

在一个实施方案中，本发明提供了一种抗体如分离的抗体或纯化的抗体，其特异性地结合组1和组2的甲型流感病毒亚型的在HA的茎区中的保守表位并干扰病毒的复制和扩散。本发明还提供了一种抗体如分离的抗体或纯化的抗体，其特异性地结合组1和组2的亚型的在HA的茎区的保守表位并抑制病毒进入细胞。不受任何理论的约束，在一个示例性实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段结合到在甲型流感病毒的茎区中的保守表位并通过干扰融合步骤来抑制病毒进入细胞。蛋白的表位或抗原决定簇对应于由抗体的结合位点(或互补位)特异性地识别的分子的那些部分。因此，表位是需要互补性互补位来进行操作性识别的相关实体。在蛋白的不同变体中保守的表位是指相同的互补位能通过接触这些分子的相同部分而特异性地识别这些不同的变体。 

本发明的抗体可以是单克隆的诸如人单克隆抗体或重组抗体。本发明还提供了本发明的抗体片段，尤其是保留了抗体抗原结合活性的片段。尽管在某些地方，说明书包括权利要求书明确指出是抗原结合片段、抗体片段、抗体的变体和/或衍生物，但是应当理解，术语“抗体”或“本发明的抗体”包括所有的抗体类别，即抗原结合片段、抗体片段、抗体的变体和衍生物。 

在一个实施方案中，本发明的抗体和抗体片段中和组1和组2的两或更多种甲型流感病毒亚型的组合。示例性甲型流感病毒亚型包括但不限于H5N1(A/Vietnam/1203/04)、H1N1(A/New Caledonia/20/99)、H1N1(A/Salomon Island/3/2006)、H3N2(A/Wyoming/3/03)以及H9N2(A/chicken/Hong Kong/G9/97)。在另一个实施方案中，抗体中和和/或特异于3、4、5、6、7或更多的组1和组2甲型流感病毒亚型的组合。 

在示例性实施方案中，本发明包括一种对甲型流感病毒亚型H1和H3(例如H1N1和H3N2)或H1、H3、H5和H9(例如H1N1、 H3N2、H5N1和H9N2)是特异性的抗体或其抗体片段。在另一个实施方案中，抗体或其抗体片段对H1、H3、H5、H7和H9(例如H1N1、H3N2、H5N1、H7N1、H7N7、H9N2)是特异性的。在本申请的前面部分提供了其它的甲型流感病毒的亚型的示例性组合。 

本发明的示例性抗体的重链可变区(V_H)和轻链可变区(V_L)的氨基酸序列的SEQ ID序列号以及编码它们的核酸序列的SEQ ID序列号列于表1。 

表1.示例性甲型流感病毒中和抗体的V_H和V_L多肽和多核苷酸的SEQ ID序列号 

在一个实施方案中，本发明的抗体或抗体片段含有重链可变区，其具有与SEQ ID NO：13、33、29或35中任一所述的序列约70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在另一个实施方案中，本发明的抗体或抗体片段含有轻链可变区，其具有与SEQ ID NO：14或30中所述的序列约70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。 

在另一个实施方案中，本发明的抗体的重链可变区可以被核酸编码，该核酸具有与SEQ ID NO：15、34、31或36中任一所述的序列约70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在另一个实施方案中，本发明的抗体的轻链可变区可以被核酸编码，该核酸具有与SEQ ID NO：16或32中所述的序列约70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的序列。 

抗体重链的CDR分别指CDRH1、CDRH2和CDRH3。相似地，抗体轻链的CDR分别指CDRL1、CDRL2和CDRL3。CDR氨基酸的位置根据IMGT编号系统被定义为CDR1-IMGT位置27到38、CDR2-IMGT位置56到65以及CDR3-IMGT位置105到117。 

表2分别提供了本发明的示例性抗体的重链和轻链的六个CDR的氨基酸序列的SEQ ID序列号。 

表2.示例性甲型流感病毒中和抗体的CDR多肽的SEQ ID序列号 

在一个实施方案中，本发明的抗体或抗体片段包含至少一个具有与SEQ ID NO：1-6或17-22中的任一个有至少95％序列同一性的序列的CDR。 

在另一个实施方案中，本发明提供了含有重链的抗体，所述重链包含一或多种(即一种、两种或所有三种)FI6变体1、FI6变体2、FI28变体1或FI28变体2的重链CDR。在示例性实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段包括具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：17的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：18的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：19的氨基酸序列的重链CDR3。在某些实施方案中，如本发明提供的抗体或抗体片段包括重链，该重链包含CDRH1的SEQ ID NO：1、CDRH2的SEQ ID NO：2和CDRH3的SEQ ID NO：3，或(ii)CDRH1的SEQ ID NO：17、CDRH2的SEQ ID NO：18和CDRH3的SEQ ID NO：19。 

本发明还提供了一种含有轻链的抗体，所述轻链包含一或多种（即一种、两种或所有三种）FI6变体1、FI6变体2、FI28变体1或FI28变体2的轻链CDR。在示例性实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段包括具有SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:20的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链CDR3。在某些实施方案中，如本发明提供的抗体包括轻链，该轻链包含(i)CDRL1的SEQ ID NO:4、CDRL2的SEQ ID NO:5和CDRL3的SEQ ID NO:6；或(ii)CDRL1的SEQ ID NO:20、CDRL2的SEQ ID NO:21和CDRL3的SEQ ID NO:22。 

在一个实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段含有表2中列出的抗体FI6变体1的所有CDR，并中和甲型流感病毒感染。在另一个实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段含有表2中列出的抗体FI6变体2的所有CDR，并中和甲型流感病毒感染。在又一实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段含有表2中列出的抗体FI28变体1的所有CDR，并中和甲型流感病毒感染。在另一个实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段含有表2中列出的抗体FI28变体2的所有CDR，并中和甲型流感病毒感染。 

本发明的示例性抗体包括但不限于FI6变体1、FI6变体2、FI28变体1或FI28变体2。 

本发明进一步包括与本发明的抗体结合相同的表位的抗体或其片段，或包括与本发明的抗体或抗原结合片段竞争的抗体。 

本发明的抗体还包括杂合抗体分子，其含有本发明的抗体的一或多种CDR和针对相同表位的另一抗体的一或多种CDR。在一个实施方案中，这样的杂合抗体含有三种本发明的抗体的CDR和三种针对相同表位的另一抗体的CDR。示例性杂合抗体包括i)三种本发明抗体的轻链CDR和三种针对相同表位的另一抗体的重链CDR；或ii)三种本发明抗体的重链CDR和三种针对相同表位的另一抗体的轻链CDR。 

变体抗体也包括在本发明的范围之内。因此，在本申请中列举的序列的变体也包括在本发明的范围之内。这样的变体包括通过在免疫应答中体内体细胞突变或通过培养永生B细胞克隆时在体外产生的自然变体。或者，也可能因为遗传密码简并性而产生变体，如上所述，或由于转录和翻译错误而生成变体。 

进一步地，具有改进的亲合力和/或效能的抗体序列的变体可以通过采用在本领域已知的方法来获得，并包括在本发明的范围之内。例如，氨基酸取代可以用于获得具有进一步改善亲合力的抗体。或者，核苷酸序列的密码子优化也可以被用来提高用于抗体产生的表达系统中的翻译效率。此外，包含通过对本发明的任何核酸序列应用定向进化法优化抗体特异性或中和活性的序列的多核苷酸也属于本发明的范围之内。 

在一个实施方案中，变体抗体的序列可与在本申请中引用的序列有70％或更多的(即75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或更多)氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，这样的序列同一性是相对于参考序列(即本发明中引用的序列)的全长来计算的。在另外一些实施方案中，如在本文中使用的百分比同一性是通过使用BLAST版本2.1.3使用由NCBI(the National Center for Biotechnology Information；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)指定的默认参数[Blosum 62matrix；gap open penalty＝11和gap extension penalty＝1]来测定的。 

在另一方面，本发明还包括编码本发明的抗体的轻链和重链以及CDR的部分或全部的核酸序列。本文提供了编码本发明的示例性抗体的轻链和重链以及CDR的部分或全部的核酸序列。表1提供了编码本发明的示例性抗体的重链和轻链可变区的核酸序列。例如，本文提供的核酸序列包括SEQ ID NO：15(编码FI6变体1重链可变区)、SEQ ID NO：34(编码FI6变体2重链可变区)、SEQ ID NO：16(编码FI6变体1和FI6变体2轻链可变区)、SEQ ID NO：31(编码FI28变体1重链可变区)、SEQ ID NO：36(编码FI28变体2重 链可变区)和SEQ ID NO：32(编码FI28变体1和变体2轻链可变区)。 

表3提供了编码本发明的示例性抗体的CDR的核酸序列的SEQ ID序列号。由于遗传密码的冗余，存在编码相同氨基酸序列的这些序列的变体。 

表3.示例性甲型流感病毒中和抗体的CDR多核苷酸的SEQ ID序列号 

在一个实施方案中，根据本发明的核酸序列包括与编码本发明的抗体的重链或轻链的核酸具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列。在另一个实施方案中，本发明的核酸序列具有编码本发明的抗体的重链或轻链CDR的核酸的序列。例如，根据本发明的核酸序列包含与SEQ ID NO：7-12、15、16、34、23-28、31、32或36的核酸序列至少75％相同的序列。 

在本发明的范围内，进一步包括包含根据本发明的核酸序列的载体，如表达载体。用这样的载体转化的细胞也包括在本发明的范围之内。这些细胞的例子包括但不限于真核细胞诸如酵母细胞、动物细胞或植物细胞。在一个实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞，诸如人细胞、CHO、HEK293T、PERC6、NS0、骨髓瘤细胞或杂交瘤细胞。 

本发明还涉及结合能够结合本发明的抗体的表位的单克隆抗体，包括但不限于选自由FI6变体1、FI6变体2、FI28变体1和FI28变体2组成的组的单克隆抗体。 

单克隆和重组抗体对于其针对的个别多肽或其它抗原的鉴定和纯化特别有用。本发明的抗体还有其它效用，其中它们可用作免疫测定、放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附法(ELISA)测定中的试剂。在这些应用中，可以用诸如放射性同位素、荧光分子或酶的分析上可检测的试剂来标记抗体。这些抗体还可用于抗原的分子鉴定和表征(表位作图)。 

本发明的抗体可被偶联到用于递送到治疗位点的药物或偶联到可检测标记以有助于含有诸如感染有甲型流感病毒的细胞的所关注细胞的位点的成像。将抗体偶联到药物或可检测标记的方法在本领域中是已知的，同样采用可检测标记进行成像的方法在本领域中也是已知的。标记的抗体可以通过使用各种标记应用于各种测定中。在本发明的抗体和所关注的表位(甲型流感病毒表位)之间形成的抗体-抗原复合物的检测可以通过将可检测物质附着到抗体来便利地实现。合适的检测方法包括诸如放射性核素、酶、辅酶、荧光剂、化学发光剂、色原体、酶底物或辅因子、酶抑制剂、酶活动基(prosthetic)复合物、自由基、粒子、染料等的标记的使用。合适的酶的例子包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、或乙酰胆碱酯酶；合适的酶活动基复合物的例子包括链霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光材料的例子包括伞形酮、荧光素、荧光素异硫氰酸酯、罗丹明、二氯三嗪基氨荧光素、丹酰氯或藻红素；发光材料的例子是鲁米诺；生物发光材料的例子包括萤光素酶、萤光素和水母发光蛋白；以及合适的放射性材料的例子包括¹²⁵I、¹³¹I、³⁵S或³H。这样标记的试剂可用于各种已知的测定中，诸如放射性免疫测定、酶免疫测定如ELISA、荧光免疫测定等。(参见如美国专利第3,766,162号、3,791,932号、3,817,837号和4,233,402号)。 

根据本发明的抗体可以被偶联到诸如细胞毒素、治疗剂、或放射性金属离子或放射性同位素的治疗部分。放射性同位素的例子包括但不限于I-131、I-123、I-125、Y-90、Re-188、Re-186、At-211、 Cu-67、Bi-212、Bi-213、Pd-109、Tc-99、In-111等。这样的抗体偶联物可被用于修饰给定生物应答，不应将药物部分解释为仅限于传统的化学治疗剂。例如，药物部分可以是具有所希望的生物学活性的蛋白或多肽。这样的蛋白可以包括如相思豆毒蛋白、蓖麻蛋白A、假单胞菌外毒素、或白喉毒素的毒素。 

将这样的治疗部分偶联到抗体的技术是众所周知的。参见例如Arnon等人.(1985)″Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy，″in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，ed.；Reisfeld等人.(Alan R.Liss，Inc.)，pp.243-256；ed.；Hellstrom等人.(1987)″Antibodies for Drug Delivery，″in Controlled Drug Delivery，ed.；Robinson等人.(2d ed；Marcel Dekker，Inc.)，pp.623-653；Thorpe(1985)″Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy：A Review，″in Monoclonal Antibodies′84：Biological and Clinical Applications，ed.；Pinchera等人.pp.475-506(Editrice Kurtis，Milano，Italy，1985)；“Analysis，Results，and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy，”in Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy，ed.；Baldwin 等人.(Academic Press，New York，1985)，pp.303-316；和Thorpe等人.(1982)Immunol.Rev.62：119-158。 

或者，抗体或其抗体片段可以被偶联到第二抗体或其抗体片段以形成在美国专利第4,676,980号描述的抗体异偶联物(heteroconjugate)。此外，在本发明的抗体和标记之间可以使用接头(如美国专利第4,831,175号)。抗体或其抗原结合片段可以直接地用放射性碘、铟、钇或其它本领域中已知的其它放射性粒子标记(例如美国专利第5,595,721号)。治疗由同时或相继地施用偶联的和非偶联的抗体治疗组合组成(例如WO00/52031；WO00/52473)。 

本发明的抗体还可以被附着到固体支持物。另外，本发明的抗体或其功能性抗体片段可以通过共价偶联到聚合物被化学修饰以例如增加其循环半衰期。聚合物的例子以及将它们附着到肽的方法在 美国专利第4,766,106号、4,179,337号、4,495,285号和4,609,546号中给出。在一些实施方案中，这些聚合物可以选自多元醇聚氧乙烯醚和聚乙二醇(PEG)。PEG在室温下溶于水并具有下列通式：R(O--CH₂--CH₂)_nO--R，其中R可以是氢、或诸如烷基或烷醇基的保护基团。在一个实施方案中，保护基团可以有1到8个碳原子。在另一个实施方案中，保护基团是甲基。符号n是正整数。在一个实施方案中，n为1至1,000。在另一个实施方案中，n为2至500。在一个实施方案中，PEG具有1,000至40,000的平均分子量。在另一个实施方案中，PEG具有2,000至20,000的平均分子量。在另一个实施方案中，PEG具有3,000至12,000的平均分子量。在一个实施方案中，PEG具有至少一个羟基基团。在另一个实施方案中，PEG具有末端羟基基团。在另一个实施方案中，末端羟基基团被活化来与抑制剂上的自由氨基反应。然而，应当理解，可以调节反应性基团的种类和数量来获得本发明中的共价偶联的PEG/抗体。 

水溶性的多元醇聚氧乙烯醚在本发明中也有用。它们包括山梨醇聚氧乙烯醚、葡萄糖聚氧乙烯醚、聚氧乙烯醚丙三醇(POG)等。在一个实施方案中，使用了POG。不受任何理论的约束，由于聚氧乙烯醚丙三醇的甘油主链与天然产生在诸如动物和人中的甘油单酯、二酯和三酯的主链相同，所以这种支化不一定在体内被看作为外来物质。在一些实施方案中，POG具有与PEG相同范围内的分子量。另一种用于延长循环半衰期的药物递送系统是脂质体。制备脂质体递送系统的方法在Gabizon等人(1982)，Cafiso(1981)和Szoka(1980)中有所讨论。其它的药物递送系统在本领域中是已知的，并在诸如引用的Poznansky等(1980)和Poznansky(1984)中有所描述。 

本发明中的抗体可以是以纯化的形式提供。典型地，抗体将存在于基本上不含其它多肽的组合物中，例如其中少于90重量％、通常少于60重量％以及更常见地少于50重量％的组合物是由其它多肽构成的。 

本发明的抗体在诸如小鼠的非人(或异种)宿主中可以是免疫 原性的。特别是抗体可以具有在非人宿主中是免疫原性的、而在人宿主中是非免疫原性的独特位。用于人的本发明的抗体包括那些不容易从诸如小鼠、山羊、兔、大鼠、非灵长类哺乳动物等的宿主中分离、并通常不能通过人源化或从异种鼠获得的抗体。 

本发明的抗体可以是任何的同种型(如IgA、IgG、IgM，也就是α、γ、或μ重链)，但一般为IgG。在IgG同种型中，抗体可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚类。本发明的抗体可以有κ或λ轻链。 

抗体的制备 

根据本发明的抗体可以用本领域中已知的任何方法来制备。例如采用杂交瘤技术制备单克隆抗体的常用方法是已知的(Kohler，G.和Milstein，C，.1975；Kozbar等人1983)。在一个实施方案中，使用了可选的在WO2004/076677中描述的EBV永生方法。 

使用在WO2004/076677中描述的方法，产生本发明的抗体的B细胞可在多克隆B细胞激活剂存在的情况下用EBV转化。用EBV转化是标准技术，并可以容易地加以调节来包括多克隆B细胞激活剂。 

任选地，在转化步骤中可以加入另外的细胞生长和细胞分化的刺激物以进一步提高效率。这些刺激物可以是诸如IL-2和IL-15的细胞因子。在一方面，在永生步骤中加入IL-2以进一步提高永生的效率，但是其使用并不是必需的。然后，使用这些方法制备的永生B细胞可采用本领域中已知的方法来培养，并将抗体从其中分离。 

使用在英国专利申请第0819376.5号中描述的方法，可以在微孔培养板中培养单浆细胞。可以从单浆细胞培养物中分离抗体。进一步，从单浆细胞培养物中可以提取RNA，并且采用本领域中已知的方法实施单细胞PCR。抗体的VH和VL区可以通过RT-PCR扩增、测序并克隆到随后被转染进HEK293T细胞或其它宿主细胞的表达载体中。可以采用本领域技术人员已知的任何方法来完成核酸在 表达载体中的克隆、宿主细胞的转染、转染的宿主细胞的培养以及产生的抗体的分离。 

如果需要，也可以采用过滤、离心和各种色谱法诸如HPLC或亲和色谱法进一步纯化抗体。如单克隆抗体的抗体纯化技术，包括制备药物级抗体的技术，在本领域中是已知的。 

本发明的抗体的片段可以通过包括利用诸如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶的酶消化、和/或通过化学还原二硫键的裂解的方法从抗体中获得。或者，抗体的片段可以通过克隆或表达部分的重链或轻链的序列来获得。抗体“片段”可以包括Fab、Fab’F(ab′)₂和Fv片段。本发明还包含源自本发明的抗体的重链和轻链的单链Fv片段(scFv)，例如本发明包括含有本发明的抗体的CDR的scFv。本发明还包括重链或轻链的单体和二聚体、单结构域重链抗体、单结构域轻链抗体、以及单链抗体，例如重链和轻链可变域被肽接头连接的单链Fv。 

本发明的抗体片段可以被赋予单价或多价相互作用并可以包含在上述的多种结构中。例如，可以合成scFv分子来产生三价的“三链抗体”和四价的“四链抗体”。scFv分子可以包含形成二价微型体(minibody)的Fc区的结构域。此外，本发明的序列可以是多特异性分子的组分，其中本发明的序列靶向本发明的表位并且分子的其它区结合到其它靶。示例性分子包括但不限于双特异性Fab2、三特异性Fab3、双特异性scFv和双抗体(Holliger和Hudson，2005，Nature Biotechnology 9：1126-1136)。 

分子生物学的标准技术可以用于制备编码本发明的抗体或抗体片段的DNA序列。可以采用寡核苷酸合成技术部分地或全部地合成所需的DNA序列。也可以适当地使用定点诱变和聚合酶链反应(PCR)技术。 

任何合适的宿主细胞/载体系统都可被用于编码本发明的抗体分子或其片段的DNA序列的表达。诸如大肠杆菌的细菌和其它微生物系统可以部分地用于抗体片段诸如Fab和F(ab’)₂片段、和特别是 Fv片段和诸如单链Fv的单链抗体片段的表达。如哺乳动物的真核细胞宿主细胞表达系统可以用于包括完整抗体分子在内的较大抗体分子的制备。合适的哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO、HEK293T、PER.C6、NS0、骨髓瘤或杂交瘤细胞。 

本发明还提供了一种用于制备根据本发明的抗体分子的方法，其包括在适用于导致从编码本发明的抗体分子的DNA表达蛋白的条件下培养包含编码本发明的核酸的载体的宿主细胞并分离抗体分子。 

抗体分子可以仅包含重链或轻链多肽，在这种情况下，仅需要重链或轻链多肽编码序列来转染宿主细胞。要制备既含有重链又含有轻链的产物时，可以用两种载体转染细胞系，其中第一载体编码轻链多肽而第二载体编码重链多肽。或者，可以使用单个载体，该载体包含编码轻链和重链多肽的序列。 

或者，本发明的抗体可以通过以下步骤制备：i)在宿主细胞中表达根据本发明的核酸序列，和ii)分离被表达的抗体产物。此外，该方法还可包括iii)纯化抗体。 

转化的B细胞、培养的单浆细胞和转染的HEK293T细胞的筛选 

可对转化的B细胞和培养的单浆细胞进行筛选以用于制备那些具有所需的特异性或功能的抗体。 

筛选步骤可以通过如下方法来完成：诸如ELISA的任何免疫测定、对组织或细胞(包括转染的细胞)染色、中和测定或在本领域中已知的用于鉴定所需的特异性或功能的多种其它方法中的一种。测定可以基于一种或多种抗原的简单识别来选取；或还可以基于所需的功能来选取，例如选择中和抗体而不仅仅是抗原结合抗体，选择能改变被靶向细胞的特性的抗体，该特性为诸如它们的信号转导级联放大、它们的形状、它们的生长速度、它们影响其它细胞的能力、它们对来自其它细胞或其它试剂或条件改变的应答、它们的分化状态等。 

个别转化的B细胞克隆可以通过阳性转化的B细胞培养来制备。用于从阳性细胞的混合物中分离单独的克隆的克隆步骤可以通过使用有限稀释、显微操作术、通过细胞分选的单一细胞沉积以及在本领域中其它已知的方法来完成。 

采用本领域中已知的方法将来自培养的单浆细胞的核酸进行分离、克隆并在HEK293T细胞或其它宿主细胞中表达。 

本发明的永生B细胞克隆或转染的HEK293T细胞可以用于多种用途：如作为单克隆抗体的来源、作为编码所关注的单克隆抗体的核酸(DNA或mRNA)的来源，以用于科研等。 

本发明提供了一种组合物，其包含产生中和至少两种选自组1和组2亚型的甲型流感病毒的不同亚型的抗体的永生B记忆细胞或转染的宿主细胞。 

表位 

如上所述，本发明的抗体可以用于对所述抗体结合的表位进行作图。本发明人已经发现中和甲型流感病毒感染的抗体针对在HA上发现的表位。在一个实施方案中，抗体针对在一或多种甲型流感病毒的组1和组2亚型之中是保守的HA的茎区的一或多个表位。本发明的抗体结合的表位可以是线性的(连续的)或构象的(不连续的)。在一个实施方案中，如本文中所讨论，本发明的抗体和抗体片段结合包含SEQ ID NO：37、38、39或40的多肽区。 

由本发明中的抗体识别的表位可以有多种用途。纯化或合成形式的表位及其模拟表位可以用于提高免疫应答(即作为疫苗、或用于其它用途的抗体的制备)、或用于筛选与表位或其模拟表位发生免疫应答的抗体的血清。在一个实施方案中，这样的表位或模拟表位、或含有这样的表位或模拟表位的抗原可以被用作疫苗以提高免疫应答。本发明的抗体或抗体片段还可以在监测疫苗质量的方法中使用。具体地，抗体可用于检测疫苗中的抗原是否包含在正确构象的正确的免疫原性表位。 

表位还可以用于筛选结合所述表位的配体。这样的配体包括但不限于抗体(包括来自骆驼、鲨鱼和其它物种的那些)、抗体片段、肽、噬菌体展示技术产物、适配体、adnectin或其它病毒或细胞蛋白的片段，可以阻断表位并因此预防感染。这些配体包括在本发明的范围之内。 

重组表达 

本发明的永生B细胞克隆或培养的浆细胞还可以用作克隆随后重组表达的抗体基因的核酸的来源。用于药物目的时，重组源的表达比B细胞或杂交瘤的表达更常见，这是基于诸如稳定性、再现性、培养容易度等的原因。 

因此，本发明提供了一种制备重组细胞的方法，其包括如下步骤：(i)从B细胞克隆或培养的单浆细胞获得一种或多种编码所关注的抗体的核酸(如重链和/或轻链mRNA)；(ii)将核酸插入表达载体以及(iii)将载体转染入宿主细胞以允许所关注的抗体在该宿主细胞中表达。 

相似地，本发明提供了一种制备重组细胞的方法，其包括如下步骤：(i)对来自B细胞克隆或培养的单浆细胞的编码所关注的抗体的核酸测序；和(ii)用从步骤(i)中获得的序列信息制备用于插入宿主细胞以允许所关注的抗体在该宿主细胞中表达的核酸。核酸可以(但不是必需)在步骤(i)和步骤(ii)之间操作以引入限制位点、修改密码子使用、和/或优化转录和/或翻译调节序列。 

本发明还提供了一种制备转染的宿主细胞的方法，其包括用一种或多种编码所关注的抗体的核酸转染宿主细胞的步骤，其中所述的核酸是源自本发明的永生B细胞克隆或培养的单浆细胞的核酸。因此，首先制备核酸、然后用其转染宿主细胞的步骤可以在不同的时间、由不同的人员、在不同的地点(例如，在不同的国家)来进行。 

然后，本发明的这些重组细胞可用于表达和培养目的。它们对 于用于大规模药物制备的抗体的表达特别地有用。它们还可以用作药物组合物的活性成分。可以使用任何合适的培养技术，包括但不限于静置培养、转瓶培养、腹水、中空纤维型生物反应器盒、模式微型发酵器、搅拌槽、微载体培养、陶瓷芯灌注等。 

从B细胞或浆细胞中获得和测序免疫球蛋白基因的方法在本领域中是已知的(如参见Chapter 4 of Kuby Immunology，4th edition，2000)。 

转染的宿主细胞可以是真核细胞，包括酵母和动物细胞、特别是哺乳动物细胞(例如CHO细胞、NS0细胞、诸如PER.C6(Jones等人2003)或HKB-11(Cho等人2001；Cho等人2003)的人细胞、骨髓瘤细胞(美国专利第5,807,715号和6,300,104号等))以及植物细胞。优选的表达宿主能够使本发明的抗体糖基化，特别是用在人体内其本身不是免疫原性的碳水化合物结构进行糖基化。在一个实施方案中，转染的宿主细胞可以在没有血清的培养基中生长。在另一个实施方案中，转染的宿主细胞可以在没有任何来自动物的产物的培养物中生长。可培养转染的宿主细胞以产生细胞系。 

本发明提供了一种制备一种或多种编码所关注的抗体的核酸分子(例如重链和轻链基因)的方法，其包括如下步骤：(i)制备本发明永生B细胞克隆或培养本发明的浆细胞；(ii)从B细胞克隆或培养的单浆细胞中获得编码所关注的抗体的核酸。本发明还提供了一种获得编码所关注的抗体的核酸序列的方法，其包括如下步骤：(i)制备本发明的永生B细胞克隆或培养本发明的单浆细胞；(ii)对来自B细胞克隆或培养的浆细胞的编码所关注的抗体的核酸进行测序。 

本发明还提供了一种制备编码所关注的抗体的核酸分子的方法，其包括获得从本发明的转化的B细胞克隆或培养的浆细胞中获得的核酸的步骤。因此，首先获得B细胞克隆或培养的浆细胞、然后从B细胞克隆或培养的浆细胞获得核酸的步骤可以在不同的时间、由不同的人员、在不同的地点(例如在不同的国家)来进行。 

本发明提供了一种制备抗体(如用于药物用途)的方法，其包 括如下步骤：(i)从表达所关注的抗体的所选B细胞克隆或培养的浆细胞获得一种或多种核酸(如重链和轻链基因)和/或对来自表达所关注的抗体的所选B细胞克隆或培养的浆细胞一种或多种核酸(如重链和轻链基因)进行测序；(ii)将核酸插入表达载体或用核酸序列制备表达载体；(iii)转染能表达所关注的抗体的宿主细胞；(iv)在所关注的抗体被表达的条件下培养或传代培养转染的宿主细胞；和任选地，(v)纯化所关注的抗体。 

本发明还提供了一种制备抗体的方法，其包括如下步骤：在所关注的抗体被表达的条件下培养或传代培养转染的宿主细胞群；和任选地，纯化所关注的抗体，其中所述的转染的宿主细胞群通过以下步骤制备：(i)提供编码所选的所关注的所选抗体的核酸，所述核酸如上所述由B细胞克隆或培养的浆细胞产生，(ii)将核酸插入表达载体，(iii)将载体转染能表达所关注的抗体的宿主细胞，以及(iv)培养或传代培养含有插入的核酸的转染的宿主细胞以制备所关注的抗体。因此，首先制备重组宿主细胞、然后培养重组宿主细胞以表达抗体的步骤可以在不同的时间、由不同的人员、在不同的地点(例如在不同的国家)来进行。 

药物组合物 

本发明提供了一种药物组合物，其包含本发明的抗体和/或抗体片段和/或编码这样的抗体的核酸和/或由本发明的抗体所识别的表位。药物组合物还可以包含药学可接受的载体以进行施用。载体本身不应该诱导对接受组合物的个体有害的抗体的产生且不应有毒。合适的载体可以是大的、缓慢代谢的大分子，诸如蛋白、多肽、脂质体、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨基酸、氨基酸共聚物和非活性病毒粒子。 

可以使用药学可接受的盐，例如诸如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐和硫酸盐的矿物酸盐，或诸如醋酸盐、丙酸盐、丙二酸盐和苯甲酸盐的有机酸盐。 

治疗组合物中药学可接受的载体还可以另外包含诸如水、盐水、甘油和乙醇的液体。此外，诸如润湿剂或乳化剂或pH值缓冲物质的辅助物质也可以存在于这样的组合物中。这样的载体允许药物组合物被制成由受试者摄取的片剂、丸剂、锭剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆、膏剂和悬浮液的形式。 

在本发明的范围内，施用的方式可包括那些适用于非肠道施用的形式，如通过诸如弹丸注射或持续输液的注射或输液方式。当产物用于注射或输液时，其可以采用在油性或水性介质中的悬浮液、溶液或乳状液的形式，并且其可以含有诸如悬浮剂、防腐剂、稳定剂和/或分散剂的配方剂。或者，抗体分子可以是干粉形式，在使用前与适当的消毒液体复配。 

一旦配制好，本发明的组合物可以直接施用给受试者。在一个实施方案中，使组合物适合于施用给人受试者。 

本发明的药物组合物可以通过多种途径施用，包括但不限于口服、静脉内、肌内、动脉内、髓内、腹腔内、鞘内、心室内、透皮、经皮、局部、皮下、鼻内、肠道、舌下、阴道内或直肠途径。无针注射也可以用来施用本发明的药物组合物。典型地，治疗组合物可被制成诸如液体溶液或悬浮液的可注射剂。在注射前，还可以制备适用于液体媒介物中的溶液或悬浮液的固体形式。 

组合物的直接递送一般通过皮下、腹腔内、静脉内或肌肉注射、或通过递送至组织细胞间隙来完成。还可以将组合物施用到病变部位。治疗剂量可以是单剂量或多剂量用药疗程。已知的基于抗体的药物提供了关于例如是否应该每天、每周、每月等递送药物的施用频率的指导。频率和剂量还依据症状的严重程度而定。 

可以将本发明的组合物制成各种形式。例如，可将组合物制成或是液体溶液或是悬浮液的可注射剂。在注射前，还可以制备适用于液体媒介物中的溶液或悬浮液的固体形式(例如如Synagis^TM和Herceptin^TM的冻干的组合物，与含有防腐剂的消毒水复配)。可以将组合物制成诸如软膏剂、乳剂或粉末以用于局部施用。可以将组合 物制成诸如片剂或胶囊、喷剂、或糖浆(任选地调味的)以用于口服施用。使用细粉末或喷剂，可以将组合物制成诸如吸入剂以用于肺部施用。可以将组合物制成栓剂或阴道栓剂。可以将组合物制成诸如滴剂以用于鼻腔、耳部、或眼睛施用。组合物可以采用试剂盒的形式，对其进行设计从而使得在向受试者施用前复配组合的组合物。例如，可以将冻干的抗体与消毒水或消毒缓冲液一起以试剂盒的形式提供。 

应当理解，组合物中的活性成分会是抗体分子、抗体片段或其变体和衍生物。因此，组合物易于在胃肠道中降解。因此，如果组合物是通过使用胃肠道途径施用的话，则组合物将需要包含保护抗体免于降解、但一旦抗体从肠胃道中被吸收就释放抗体的物质。 

药学可接受的载体的深入讨论参见Gennaro(2000)Remington：The Science and Practice of Pharmacy，20th edition，ISBN：0683306472。 

本发明的药物组合物一般具有5.5至8.5的pH值，在一些实施方案中，该pH值可以6至8，并且在另一个实施方案中，pH值约为7。可以通过使用缓冲液来维持pH值。组合物可以是无菌的和/或不含热原的。对于人，组合物可以是等渗的。在一个实施方案中，本发明的药物组合物在密闭的容器中提供。 

药物组合物将包含有效量的本发明的一种或多种抗体和/或含有结合本发明的抗体的表位的多肽，即足以治疗、改善或预防希望的疾病或病症或显示出可检测的疗效的量。疗效还包括身体症状的缓解。对于任何特定的受试者的精确有效量将取决于他们的体重与健康状况、症状的性质和严重程度以及选择施用的治疗剂或治疗剂组合。对于给定情形下，有效量由常规实验来确定并且由临床医生决定。为本发明的目的，对个体所施用的本发明的组合物的有效剂量一般是从约0.01mg/kg至约50mg/kg或约0.05mg/kg至约10mg/kg。已知的基于抗体的药物提供了这方面的指导，例如Herceptin^TM是通过静脉输液21mg/ml的溶液来施用，初始给药剂量为4mg/kg体 重，每周维持剂量为2mg/kg体重；Rituxan^TM每周以375mg/m²施用等。 

在一个实施方案中，组合物可以包括一种以上(如两种、三种等)本发明的抗体以提供加合或协同疗效。在另一个实施方案中，组合物可以包括一种或多种(如两种、三种等)本发明的抗体和一种或多种(如两种、三种等)抵抗甲型流感病毒的额外抗体。例如，一种抗体可以结合HA表位，而另一种可以结合HA上不同的表位，或者结合神经氨酸酶和/或基质蛋白上的表位。进一步，本发明的抗体与甲型流感疫苗或与对除甲型流感病毒之外的有特异性的抗体一起施用都在本发明的范围内。本发明的抗体可以与流感疫苗或与对除甲型流感病毒之外的有特异性的抗体组合/同时或者在不同时间施用。 

在另一个实施方案中，本发明提供了一种包括两种或更多种抗体的药物组合物，其中第一抗体是本发明的抗体且对HA表位具有特异性，而第二抗体对于神经氨酸酶表位、第二HA表位和/或基质表位具有特异性。例如，本发明提供了一种包含两种或更多种抗体的药物组合物，其中第一抗体对于甲型流感病毒HA的茎中的表位具有特异性，而第二抗体对于神经氨酸酶表位、第二HA表位(例如，HA的球状头部中的表位、HA的茎中的第二表位)和/或基质表位具有特异性。甲型流感病毒HA的茎中的第二表位或球状头部中的表位可以(但不必需)在一种以上的甲型流感病毒亚型之中是保守的。 

在另一个实施方案中，本发明提供了一种包括两种或更多种抗体的药物组合物，其中第一抗体对于神经氨酸酶表位具有特异性，而第二抗体对于第二神经氨酸酶表位、HA表位和/或基质表位具有特异性。 

在又一个实施方案中，本发明提供了一种包括两种或更多种抗体的药物组合物，其中第一抗体对于基质表位具有特异性，而第二抗体对于第二基质表位、HA上的表位和/或神经氨酸酶上的表位具有特异性。 

对于甲型流感病毒靶蛋白具有特异性的本发明的示例性抗体包括但不限于FI6变体1、FI6变体2、FI28变体1或FI28变体2。 

在一个实施方案中，本发明提供了一种药物组合物，其包含抗体FI6变体1或其抗原结合片段、以及药学可接受的载体。在另一个实施方案中，本发明提供了一种药物组合物，其包含抗体FI6变体2或其抗原结合片段、以及药学可接受的载体。在另一个实施方案中，本发明提供了一种药物组合物，其包含抗体FI28变体1或其抗原结合片段、以及药学可接受的载体。在另一个实施方案中，本发明提供了一种药物组合物，其包含抗体FI28变体2或其抗原结合片段、以及药学可接受的载体。 

本发明的抗体可以与如化疗化合物、放疗等的其它治疗剂一起施用(组合地或单独地)。在一个实施方案中，治疗化合物包括诸如Tamiflu^TM的抗病毒化合物。相对于单独施用的单一治疗剂，这样的组合治疗提供了加合或协同改善的疗效。术语“协同”是用来描述两种或两种以上活性剂的组合效果比每种各自活性剂的单独疗效的加合要大。因此，如果两种或两种以上制剂的组合效果引起活性或过程的“协同抑制”，则是指活性或过程的抑制要比每种各自的活性剂的抑制效果的加合要大。术语“协同疗效”是指在用两种或两种以上治疗组合时所观察到的疗效，其中疗效(如通过若干参数中的任一个所测量的)要比用各自单独的治疗时所观察到的疗效的加合要大。 

抗体可以施用给那些先前对于甲型流感病毒感染的治疗没有应答(即对于抗流感治疗显示是耐受的)的受试者。这种治疗可以包括先前用抗病毒剂进行的治疗。这可能是因为例如感染了甲型流感病毒的抗病毒抗性株。 

在一个实施方案中，本发明的组合物可以包括本发明的抗体，其中抗体可以构成组合物中总蛋白的至少50重量％(如60重量％、70重量％、75重量％、80重量％、85重量％、90重量％、95重量％、97重量％、98重量％、99重量％或更多)。在这样的组合物中， 抗体是纯化的形式。 

本发明提供了一种制备药物的方法，其包括以下步骤：(i)制备本发明的抗体；和(ii)将纯化的抗体与一种或多种药学可接受的载体混合。 

本发明还提供了一种制备药物的方法，其包括将抗体与一种或多种药学可接受的载体混合的步骤，其中抗体是从本发明的转化的B细胞或培养的浆细胞获得的单克隆抗体。因此，首先获得单克隆抗体、然后制备药物的步骤可以在不同的时间、由不同的人员、在不同的地点(如在不同的国家)来进行。 

作为一种可选的递送抗体或B细胞以用于治疗目的的方法，可以向受试者递送编码源自B细胞或培养的浆细胞的所关注的单克隆抗体(或其活性片段)的核酸(典型地为DNA)，使得核酸就可以在受试者的原位进行表达以获得理想的疗效。合适的基因治疗和核酸递送载体在现有技术中是已知的。 

本发明的组合物可以是免疫原性组合物，并且在一些实施方案中可以是包含含有由本发明的抗体所识别的表位的抗原的疫苗组合物。根据本发明的疫苗可以是预防性的(即预防感染)或者是治疗性的(即治疗感染)。在一个实施方案中，本发明提供了包含含SEQ ID NO：37、38、39或40的氨基酸序列的多肽的疫苗。 

组合物可以包含抗微生物剂，特别是在多剂量形式包装时。组合物可以包含诸如Tween 80的Tween(聚山梨醇酯)去垢剂。去垢剂一般是以低水平存在，如＜0.01％。组合物还可以含有钠盐(如氯化钠)以提供张度。典型地，NaCl的浓度为10±2mg/ml。 

进一步，组合物可以包含在诸如15-30mg/ml左右(例如25mg/ml)的糖醇(如甘露醇)或二糖(如蔗糖或海藻糖)，特别是这些组合物要被冻干或者包含已经与冻干的材料复配的材料。用于冻干的组合物的pH值可以在冻干之前调节至约6.1。 

本发明的组合物也可包含一种或多种免疫调节剂。在一个实施 方案中，一种或多种免疫调节剂包括佐剂。 

本发明的表位组合物可以诱发细胞介导的免疫应答以及体液免疫应答以有效地抗甲型流感病毒感染。这种免疫应答可以诱导持久的(如中和)抗体和在暴露于甲型流感病毒时可以迅速应答的细胞介导的免疫性。 

医学治疗和用途 

本发明的抗体和抗体片段或其衍生物和变体可用于甲型流感病毒感染的治疗、甲型流感病毒感染的预防或甲型流感病毒感染的诊断。 

诊断方法可以包括使抗体或抗体片段与样本接触。这些样本可能是从诸如鼻腔通道、鼻窦腔、唾液腺、肺、肝、胰腺、肾、耳、眼、胎盘、消化道、心脏、卵巢、垂体、肾上腺、甲状腺、大脑或皮肤提取的组织样本。诊断的方法还可以包括抗原/抗体复合物的检测。 

因此，本发明提供了(i)根据本发明的抗体、抗体片段、或其变体以及衍生物；(ii)根据本发明的永生B细胞克隆；(iii)能够结合本发明的抗体的表位或(iv)配体，优选为能够结合表位的抗体，该表位结合本发明的抗体以用于治疗中。 

本发明还提供了治疗受试者的方法，其包括向受试者施用根据本发明的抗体、抗体片段、或其变体和衍生物，或配体，优选地为能够结合表位的抗体，所述表位结合本发明的抗体。在一个实施方案中，该方法使得受试者中甲型流感病毒的感染减少。在另一个实施方案中，该方法预防、减少受试者中的甲型流感病毒感染的风险或延迟受试者中的甲型流感病毒感染。 

本发明还提供了(i)根据本发明的抗体、抗体片段、或其变体和衍生物；(ii)根据本发明的永生B细胞克隆；(iii)能够结合本发明的抗体的表位；或(iv)配体，优选地为结合表位的抗体，该表位结合本发明的抗体，在制备预防或治疗甲型流感病毒感染的药物中的用 途。 

本发明提供了用作预防或治疗甲型流感病毒感染的药物的本发明的组合物。本发明还提供了本发明的抗体和/或包含该抗体结合的表位的蛋白在制备治疗和/或诊断受试者的药物中的用途。本发明还提供了治疗受试者疾病的方法，其包括向受试者施用本发明的组合物的步骤。在一些实施方案中，受试者可以是人。一种检查疗效的方法包括在施用本发明的组合物后监测疾病症状。治疗可以采用单剂量或多剂量用药疗程。 

在一个实施方案中，向需要这样的治疗的受试者施用根据本发明的抗体、抗体片段、永生B细胞克隆、表位或组合物。这样的受试者包括但不限于、尤其是处于甲型流感病毒感染危险下或易于被该病毒感染的受试者，包括例如免疫功能低下的受试者。本发明的抗体或抗体片段也可用于被动免疫或主动免疫。 

本发明中所述的抗体及其片段也可以用于诊断甲型流感病毒感染的试剂盒中。此外，能够结合本发明的抗体的表位可以用在试剂盒中，以通过检测保护性抗甲型流感病毒抗体的存在来监测疫苗接种程序的功效。如本发明所述的抗体、抗体片段、或其变体及衍生物也可以用在试剂盒中，以监测具有所需的免疫原性的疫苗的生产。 

本发明还提供一种制备药物的方法，其包括将单克隆抗体与一种或多种药学可接受的载体混合的步骤，其中所述单克隆抗体是从本发明的转染宿主细胞中获得的单克隆抗体。因此，首先获得(如通过表达和/或纯化)单克隆抗体、然后将单克隆抗体与药物载体混合的步骤可以在不同的时间、由不同的人、在不同的地点(如在不同的国家)来进行。 

从本发明的转化的B细胞或培养的浆细胞开始，可进行以下各种步骤使由转化的B细胞或培养的浆细胞表达的抗体永存：培养、传代培养、克隆、亚克隆、测序、核酸制备等，对每一步骤可任选地优化。在优选的实施方案中，上述方法进一步包括应用于编码抗体的核酸的优化技术(如亲和力成熟或优化)。本发明涵盖了在这样 的步骤中使用和制备的所有细胞、核酸、载体、序列、抗体等。 

在所有这些方法中，可操作表达宿主中所用的核酸以插入、缺失或修饰某些核酸序列。这种操作的变化包括但不限于引入限制位点、修改密码子使用、增加或优化转录和/或翻译调控序列等的变化。也有可能改变核酸以改变编码的氨基酸。例如，其可能在抗体的氨基酸酸序列引入一个或多个(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等)氨基酸取代、缺失和/或插入是有用的。这样的点突变可以修改效应物功能、抗原结合亲和力、翻译后修饰、免疫原性等；还可以引入氨基酸以附着共价基团(如标记)或可以引入标签(如用于纯化目的)。突变可以被引入特异位点或可以随机引入，随后进行选择(如分子进化)。例如，一个或多个编码本发明的CDR区、重链可变区或轻链可变区中的任一个的核酸都可被随机地或定向地突变以在被编码的氨基酸中引入不同的特性。这种改变可能是迭代过程的结果，其中初始的改变被保留了下来且在其它核苷酸位置引入新改变。此外，可以合并在单独步骤中完成的变化。引入编码的氨基酸中的不同特性可以包括但不限于增强的亲和力。 

一般概念 

术语“包含”涵盖“包括”以及“由…组成”，如“包含”X的组合物可以全部由X组成或可以包括额外成分如X+Y。 

词“基本上”不排除“完全”，如“基本上不含”Y的组合物可以是完全不含Y。根据需要，可将词“基本上”从本发明的定义中略去。 

关于数值x的术语“约”是指例如x±10％。 

如本文所用的术语“疾病”是一般意义上同义的，并可与术语“失调”和“病症”(如在医学状况中)可互换地使用，且其中所有都反映了损害正常功能的人或动物身体或其一个部位的异常状况，通常通过区分病征和症状来表现，并使人或动物的寿命缩短或生存质量下降。 

如本文所用，对于受试者或患者的“治疗”旨在包括预防、防治和治疗。术语“受试者”或“患者”在本文中互换地使用来指包括人在内的所有哺乳动物。受试者的例子包括人、牛、狗、猫、马、山羊、绵羊、猪和兔。在一个实施方案中，患者是人。 

实施例

在以下的实施例中提供了本发明的示例性实施方案。以下的实施例仅通过示例的方式给出并用来帮助普通技术人员使用本发明。所述实施例并非旨在以任何方式来另外限制本发明的范围。 

实施例1.浆细胞的甲型流感病毒广谱中和抗体的生成与表征 

为了确定可以产生响应季节性流感疫苗(含H1和H3HA)的异亚型抗体的个体，我们通过ELISPOT筛选了在增强其分泌结合疫苗或无关的H5HA(A/VN/1203/04)的抗体的能力之后的第7天收集的循环浆细胞。然而令人惊讶的是，在受测的5个供体中的4个中没有检测到H5-特异性浆细胞，在一个供体中14％的IgG分泌浆细胞产生了对抗H5的抗体，而57％产生了对疫苗的抗体。通过磁微珠及随后的利用FACSAria仪的细胞分选，在接种疫苗7天后收集的外周血单个核细胞(PBMC)中分离了CD138⁺浆细胞。数量有限的浆细胞接种在微孔培养板中。利用重组H5或H9HA和不相关的抗原破伤风类毒素作为抗原用三个平行的ELISA测试培养上清液。在4,928种被筛选的培养上清液中，有12种结合H5而不结合H9HA、25种结合H9而不结合H5HA以及54种既结合H5又结合H9。将一些具有最高OD信号的54种培养物进行RT-PCR，得到了两个配对的VH和VL基因。 

VH和VL基因被克隆到表达载体，通过转染HEK293T细胞产生重组抗体。两个单克隆抗体FI6和FI28共享大部分的V、D和J基因片段(IGHV3-30*01、IGHD3-9*01、IGHJ4*02和IGKV4-1*01)，但有不同的N区、不同的IGKJ使用以及不同的体细胞突变模式，因此在克隆上是不相关的。 

采用属于不同亚型的HA的组，通过ELISA来研究重组抗体的特 异性。明显地，FI6结合了包括组1(H1、H5和H9)和组2(H3和H7)的所有的被测试的甲型流感病毒HA亚型，而不结合乙型流感病毒的HA。相反，FI28仅结合3个组1的HA(H1、H5和H9)。 

表4 

考虑到两种抗体的VH和VL序列的同源性，利用FI6、FI28和7I13的H和L链来进行改组实验，hCMV特异性抗体使用H链的同样的V、D和J元件。尽管结合H7需要FI6的H链和L链配对，但当FI6和FI28的L链改组时，保留了与H5的结合。此外，当FI6的H链配对到不相关的7I13的L链时也观察到H5结合。相反，当同源的7I13的H链与FI6的L链配对时没有观察到H5结合。不受任何特定理论的约束，这些结果表明H5结合的主要贡献来自H链，而H7结合则需要FI6的H链和L链之间的精确配对。 

然后利用假型病毒(表5)以及感染性病毒(表6)来测试FI6和FI28中和组1和组2甲型流感病毒亚型的能力。明显地，FI6中和了所有被测试的假型病毒，包括6个属于抗原性不同分支0、1、2.1、2.2和2.3的H5分离体和2个H7禽分离体。此外，FI6中和了所有被测试的传染性病毒，包括两个已存在数十年的H3N2病毒和四种H1N1病毒和最近的H1N1大流行分离体A/CA/04/09(表6)。FI28中和了所有的H5假型病毒，但却没有中和H7假型病毒以及所有被测试的传染性病毒。对假型病毒的中和滴度比对传染性病毒的滴度高。 

表5 

表6 

nd：未进行 

实施例2.FI6和FI28的抗原结合位点 

为了确定抗体FI6和FI28结合的抗原位点，我们首先测试了其抑制C179的结合的能力，C179是被作图到HA茎区的保守区的小鼠单克隆抗体(Y.Okuno，等人，J Virol 67，2552(1993))。FI6和FI28均完全抑制了C179与重组H5VN/1203/04HA的结合，表明它们可识别重叠表位。相反，FI6和FI28不与从H5N1免疫供体中分离的、识别HA的球状头部中不同表位的H5特异性抗体组竞争(C.P.Simmons等人，PLoS Med 4，e178(2007)；S.Khurana等人，PLoS Med 6，e 1000049(2009))。通过选择逃逸突变株(escape mutant)来作图FI6表位的尝试失败了，表明在不危害病毒适应性的情况下，其表位不会轻易突变。 

随后，我们利用HA A/VN/1194/04(HA)的线形和环化肽的文库 进行基于肽的作图以及利用Pepscan Presto BV(Lelystad，The Netherlands)的系统进行螺旋扫描。这种分析确定了如下的F16结合区：其包括HA2融合肽FGAIAG(根据H3编号为SEQ ID NO：37的氨基酸3-8)、HA2的A螺旋肽DGVTNKVNS(SEQ ID NO：38的氨基酸46-54)，HA2的B-螺旋肽MENERTLDFHDSNVK(SEQ ID NO：39的氨基酸102-116)和HA1的C-末端肽LVLATGLRNSP(SEQ ID NO：40的氨基酸315-325)。由于FI28不与HA1的C-末端肽和HA2的B-螺旋肽反应，所以FI28的结合区与FI6的不同。 

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Claims (24)

1.一种中和甲型流感病毒的组1亚型和组2亚型的感染的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗体片段包含SEQ ID NO:1、2和3分别所示的重链互补决定区（CDR）1、2和3序列以及SEQ ID NO:4、5和6分别所示的轻链CDR1、2和3序列。

2.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体特异性地结合血凝素的茎区中的表位，并且其中所述表位在两种或更多种选自组1和组2的甲型流感病毒亚型之中是保守的。

3.如权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗体片段结合包含SEQ ID NO:37、38、39或40任一个的氨基酸序列的多肽。

4.如权利要求1、2或3所述的抗体，其中中和50%甲型流感病毒所需的所述抗体浓度是20μg/ml或更低。

5.如权利要求1、2或3所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述组1亚型是H1、H2、H5或H9。

6.如权利要求1、2或3所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述组2亚型是H3或H7。

7.如权利要求1至6中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体中和以下甲型流感病毒亚型的感染：(i)H1和H3；(ii)H1和H7；(iii)H3和H5；(iv)H3和H9；(v)H5和H7；(vi)H7和H9；(vii)H1、H3、H5和H7；或(viii)H1、H3、H5、H7和H9。

8.一种抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含含有SEQ IDNO:13的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链可变区；或含有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链可变区，并且其中所述抗体中和甲型流感病毒组1亚型和组2亚型。

9.如前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是人抗体。

10.如前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是单克隆抗体。

11.如前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是纯化的抗体。

12.如前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是分离的抗体。

13.如前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是Fab、Fab’、F(ab')2、Fv或scFv。

14.如前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是单链抗体。

15.如前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其用于治疗甲型流感病毒感染。

16.包含编码前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸的核酸分子。

17.如权利要求16所述的核酸分子，其中所述多核苷酸包含SEQID NO:7-12、15、16或34中的任一个的核酸序列所示的序列。

18.一种包含如权利要求16或17中所述的核酸分子的载体。

19.一种细胞，其表达如权利要求1至15中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或包含如权利要求18所述的载体。

20.一种药物组合物，其包含权利要求1至15中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求16或权利要求17所述的核酸分子、权利要求18所述的载体或权利要求19所述的细胞以及药学可接受的稀释剂或载体。

21.一种药物组合物，其包含第一抗体或其抗原结合片段和第二抗体或其抗原结合片段，其中所述第一抗体是如权利要求1至15中任一项所述的抗体，并且所述第二抗体中和甲型流感病毒感染。

22.如权利要求1至15中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、如权利要求16或权利要求17所述的核酸分子、如权利要求18所述的载体、如权利要求19所述的细胞、或如权利要求20或权利要求21所述的药物组合物(i)在制备治疗甲型流感病毒感染的药物中的用途；(ii)在制备甲型流感病毒疫苗中的用途；或(iii)在制备诊断甲型流感病毒感染的药物中的用途。

23.如权利要求1至15中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在通过检测抗甲型流感病毒疫苗的抗原是否含有正确构象的特异性表位来监测所述疫苗的质量中的用途。

24.权利要求1至15中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于减少甲型流感病毒感染或降低甲型流感病毒感染的风险的药物中的用途。