HK1150059B - 用於扩增来自麻疯树的细胞组织的方法 - Google Patents

Description

用于扩增来自麻疯树的细胞组织的方法

技术领域

本发明涉及扩增来源于含油植物种子的细胞，以及获得来自所产生细胞的油。

背景技术

含油植物的种子已被确定为生产可用作生物柴油等用途的油的来源。

一个实例是麻疯树(Jatropha curcas)植物，其具有含油的种子。除了用于医学、兽医学和制皂等以外，所述油还被认为适合作为高品质的生物柴油。来源于麻疯树种子的油具有与发动机所用柴油类似的物理化学性质和输出特性(参见Murali等的美国专利申请公开No.2008/0194026A1，第0008-0010段)。

因此，在现有技术中，已经描述了用于从器官、组织、细胞或原生质体产生麻疯树植物的微繁殖方法。(参见Murali等，第0014、0017和0024段)。所产生的植物可用作用于生产油的种子来源(参见Shuyi Qiu等的中国(CN)专利公开No.11225416A，摘要)。

遗憾的是，以用于生物柴油用途的大产量从麻疯树种子来产生油的可能性受到限制，这是因为收获通过微繁殖或传统繁育所产生的植物需要巨大的土地面积。

本发明提供了一种不需要植物栽培的生产来自麻疯树的油的方法。因此，本发明的方法不需要使用土地面积来生产来自麻疯树或来自其它含油植物的油。

发明内容

本发明提供了一种用于从由麻疯树种子组织扩增之细胞来产生油的方法，其中所述方法还适用于其它含油植物种子。所述方法包括从麻疯树种子的子叶获得外植体，将所述外植体接种到含有破坏细胞间结合的酶的培养基中，通过搅拌下进行的孵育产生扩增的独立细胞，从由麻疯树种子子叶组织得到的独立细胞而扩增的细胞中提取可用作生物柴油的油。

具体地，本发明的方法包括：从麻疯树种子获得外植体；将来源于麻疯树种子的所述外植体置于液体培养基中；在所述培养中破坏来自麻疯树种子的组织外植体的细胞间结合，其中所述外植体产生独立细胞；将所述培养基与由来源于麻疯树种子之外植体所产生的独立细胞孵育确定的时间，其中所述独立细胞在所述确定的时间内扩增；以及从由来源于麻疯树种子之外植体所产生的独立细胞而扩增的细胞中提取油。

在本发明方法的一个方面中，通过包括下列步骤的方法从麻疯树种子获得外植体：用乙醇对麻疯树种子消毒，其中用乙醇浸浴所述种子；用无菌水浸湿的纸将所述消毒的麻疯树种子水化，其中利用所述用无菌水浸湿的纸裹住麻疯树种子；用次氯酸钠对水化的麻疯树种子灭菌，其中用次氯酸钠浸浴所述水化的麻疯树种子；除去所述已灭菌麻疯树种子的皮，使得种子子叶从麻疯树种子中释放出来；以及从所述麻疯树种子子叶获得外植体。

本发明的方法可应用于任何含油植物。适用于任何含油植物的所述方法包括：

A.从含油植物种子获得外植体；

B.将来自所述种子的外植体置于培养基中；

C.破坏所述培养基中来自所述种子的外植体组织的细胞间结合，其中所述外植体产生独立细胞；

D.将所述培养基与由来源于所述种子的外植体所产生的独立细胞孵育确定的时间，其中所述独立细胞在所述确定的时间内扩增；以及

E.从由来源于所述种子的外植体所产生的独立细胞而扩增的细胞中提取油。

在本发明方法的另一个方面中，优选地，所述培养基至少含有NH₄NO₃、CaNO₃、CuSO₄、MnSO₄、ZnSO₄、H₃BO₃、KH₂PO₄、Na₂MoO₄、EDTA、FeSO₄、CaCl₂、CaCO₃、NaC₆H₇O₇(柠檬酸钠)、MgSO₄、K₂SO₄、硫胺素、甘氨酸、环己六醇(inositol)、烟酸、吡哆醇、生物素、谷氨酰胺、萘乙酸、玉米素和碳源。在本发明方法的培养基的一个方面中，所述培养基可含有选自CaNO₃和KNO₃的盐。

在本发明方法的培养基的一个方面中，所述培养基可含有选自CaCl₂和KCl的盐。

在本发明方法的培养基的另一个方面中，所述培养基可含有选自吲哚乙酸(IAA)、萘乙酸(NAA)和吲哚丁酸(IBA)的激素。

在本发明方法的培养基的一个方面中，所述培养基可含有选自激动素、苄基腺嘌呤(BA)、赤霉素(GA)和玉米素的激素。

在本发明方法的培养基的一个方面中，所述培养基可含有选自蔗糖、果糖和葡萄糖的碳源。

在本发明方法的培养基的另一个方面中，将纤维素酶、果胶酶和半纤维素酶添加到培养基中，其中所述纤维素酶、果胶酶和半纤维素酶破坏所述培养基中来自于麻疯树种子之外植体的组织的细胞间结合。

在本发明方法的另一个方面中，通过下述步骤从含有独立细胞的培养基中提取油，所述独立细胞由来自疯树种子的外植体所产生的独立细胞扩增而来，所述步骤包括：添加有机溶剂；超声；离心；取出上层；以及蒸发并干燥所述溶剂。

本发明还提供了培养基，其中所述培养基含有NH₄NO₃、CaNO₃、CuSO₄、MnSO₄、ZnSO₄、H₃BO₃、KH₂PO₄、Na₂MoO₄、EDTA、FeSO₄、CaCl₂、CaCO₃、NaC₆H7O₇(柠檬酸钠)、MgSO₄、K₂SO₄、硫胺素、甘氨酸、环己六醇、烟酸、吡哆醇、生物素、谷氨酰胺、萘乙酸、玉米素和碳源。

在本发明培养基的一个方面中，所述培养基含有纤维素酶、果胶酶和半纤维素酶，其中所述纤维素酶、果胶酶和半纤维素酶破坏所述培养基中来自于麻疯树种子之外植体的组织的细胞间结合。

在本发明培养基的一个方面中，所述培养基可含有选自CaNO₃和KNO₃的盐。

在本发明培养基的一个方面中，所述培养基可含有选自CaCl₂和KCl的盐。

在本发明培养基的一个方面中，所述培养基可含有选自吲哚乙酸(IAA)、萘乙酸(NAA)和吲哚丁酸(IBA)的激素。

在本发明培养基的一个方面中，所述培养基可含有选自激动素、苄基腺嘌呤(BA)、赤霉素(GA)和玉米素的激素。

在本发明培养基的一个方面中，所述培养基可含有选自蔗糖、果糖和葡萄糖的碳源。

通过以下对本发明具体实施方式的详细描述和权利要求，本发明的其它目的和优点将更明显。

具体实施方式

本发明的方法包括：从麻疯树种子获得外植体；将来源于麻疯树种子之外植体置于培养基中；破坏所述培养基中来自麻疯树种子的组织外植体的细胞间结合，其中所述外植体产生独立细胞；将所述培养基与由来源于麻疯树种子之外植体所产生的独立细胞孵育确定的时间，其中所述独立细胞在所述确定的时间内扩增；以及从由来源于麻疯树种子之外植体所产生的独立细胞而扩增的细胞中提取油。

在本发明方法的优选形式中，优选的孵育时间是从所述外植体被置于培养基中起至少3天。在一种更优选的形式中，所述孵育时间是从所述外植体被置于培养基中起至少8天。在一种更优选的形式中，所述孵育时间是从所述外植体被置于培养基中起至少14天。所述孵育优选在黑暗中于室温下在恒定搅拌下进行。

所述孵育还可在发射确定波长光线(例如红外光)的光源或发射对来自于特定含油植物种子的细胞扩增最佳之波长光线的光源的照射下进行。

一旦在培养基中孵育至少3天之后细胞间结合被破坏，由来源于麻疯树种子之外植体所产生的独立细胞就可以用作再接种于新鲜培养基中的细胞来源，不断重复再接种到新鲜培养基中，由此产生所述独立细胞的持续扩增。再接种到新鲜培养基中的独立细胞的优选量是1至2×10⁵个细胞/毫升，将所述新鲜的再接种培养基孵育确定的时间，直至细胞达到扩增稳定期。

在本发明方法的一个方面中，通过包括下列步骤的方法从麻疯树种子获得外植体：用乙醇将麻疯树种子消毒，其中用乙醇浸浴所述种子；用无菌水浸湿的纸将所述消毒的麻疯树种子水化，其中以所述用无菌水浸湿的纸包裹麻疯树种子；用次氯酸钠将所述水化的麻疯树种子灭菌，其中用次氯酸钠浸浴所述水化的麻疯树种子；除去所述已灭菌麻疯树种子的外皮，使得种子子叶从麻疯树种子中释放出来；以及从所述麻疯树种子子叶获得外植体。

对本发明应用的目的而言，术语外植体指来自麻疯树种子的子叶的一部分。在优选形式中，从麻疯树种子子叶获得的外植体由1至2毫米厚的层状子叶横切部分构成。外植体也可以是来自于麻疯树种子或其它含油植物种子的具有不同形状的其它类型的子叶部分。在本发明的优选形式中，所述外植体的量可以是1至7克/100毫升培养基。

可将本发明的方法应用于任何含油植物。适用于任何含油植物的所述方法包括：

A.从含油植物种子获得外植体；

B.将来自所述种子的外植体置于培养基中；

C.破坏所述培养基中来自所述种子之外植体组织的细胞间结合，其中所述外植体产生独立细胞；

D.将所述培养基与由来源于所述种子的外植体所产生的独立细胞孵育确定的时间，其中所述独立细胞在所述确定的时间内扩增；以及

E.从由来源于所述种子的外植体所产生的独立细胞而扩增的细胞中提取油。

术语“含油植物”指可从其种子或果实中提取油的任何植物，所述植物在一些情况下是可食用的，在另一些情况下可用于工业，在又一些情况下可用于医药。含油植物包括：

大豆(Glycine max)(大豆)

非洲油棕榈(Elaeis guineensis)(非洲棕榈)

美洲油棕榈(Elaeis oleifera)(美洲油棕榈)

花生(Arachis hypogaea)(花生)

向日葵(Helianthus annuus)(向日葵)

玉米(Zea mays)(玉米)

亚麻(Linum usitatissimum)(亚麻种子)

油菜(Brassica napus)(芸苔、油菜、菜籽或nabicol)

油橄榄(Olea europaea L.)(橄榄)

蓖麻(Ricinus communis)(蓖麻油)

芝麻()(芝麻)

希蒙得木(Simmondsia chinensis)(荷荷巴油)

油桐(Vernicia fordii)(桐树)

山杏(Prunus dulcis)(杏仁)

红花(Carthamus tinctorius)(红花或藏红花(alazor))

陆地棉(Gossypium hirsutum)(棉花)

辣木(Moringa oleifera)(鼓槌树)

小麦(Triticum aestivum)(小麦)

以及所有种类的种子中含有油的植物。

在本发明方法的另一些方面中，优选地，所述培养基至少含有NH₄NO₃、CaNO₃、CuSO₄、MnSO₄、ZnSO₄、H₃BO₃、KH₂PO₄、Na₂MoO₄、EDTA、FeSO₄、CaCl₂、CaCO₃、NaC₆H₇O₇(柠檬酸钠)、MgSO₄、K₂SO₄、硫胺素、甘氨酸、环己六醇、烟酸、吡哆醇、生物素、谷氨酰胺、萘乙酸、玉米素和碳源。

在本发明方法的培养基的一个方面中，所述培养基可含有选自CaNO₃和KNO₃的盐。

在本发明方法的培养基的一个方面中，所述培养基可含有选自CaCl₂和KCl的盐。

在本发明方法的培养基的一个方面中，所述培养基可含有选自吲哚乙酸(IAA)、萘乙酸(NAA)和吲哚丁酸(IBA)的激素。

在本发明方法的培养基的一个方面中，所述培养基可含有选自激动素、苄基腺嘌呤(BA)、赤霉素(GA)和玉米素的激素。

在本发明方法的培养基的一个方面中，所述培养基可含有选自蔗糖、果糖和葡萄糖的碳源。

在本发明方法的培养基的一个方面中，将纤维素酶、果胶酶和半纤维素酶添加到培养基中，其中所述纤维素酶、果胶酶和半纤维素酶破坏所述培养基中来自于麻疯树种子之外植体的组织的细胞间结合。可通过其它酶促或非酶促过程来破坏所述来自于麻疯树种子之外植体组织的细胞间结合。

在优选形式中，本发明培养基的成分浓度范围如下：

NH₄NO₃                 100-500mg/L

CaNO₃或KNO₃            200-400mg/L

CuSO₄                  0.1-5mg/L

MnSO₄                  10-40mg/L

ZnSO₄                  20-50mg/L

H₃BO₃                  10-20mg/L

KH₂PO₄                 50-200mg/L

Na₂MoO₄                0.1-5mg/L

EDTA(乙二胺四乙酸)     10-50mg/L

FeSO₄                  10-50mg/L

CaCl₂或KCl             50-100mg/L

CaCO₃                  30-50mg/L

NaC₆H₇O₇(柠檬酸钠)     0.1-10mg/L

MgSO₄                  50-300mg/L

K₂SO₄                  700-1500mg/L

硫胺素                 0.5-3mg/L

甘氨酸                 0.5-3mg/L

环己六醇               50-200mg/L

烟酸                   0.1-10mg/L

吡哆醇                   0.1-10mg/L

生物素                   0.1-10mg/L

谷氨酰胺                 20-50mg/L

IAA或NAA或IBA            0.5-10mg/L

玉米素或激动素或BA或GA   0.5-10mg/L

蔗糖或葡萄糖或果糖       30000-100000mg/L，以及

半纤维素酶和果胶酶以及纤维素酶3000-10000mg/L

在本发明方法的优选形式中，EDTA是二钠盐。在本发明的方法中也可使用单钠-EDTA。

在本发明方法的优选形式中，所述环己六醇是肌醇(myo-inositol)。在本发明方法的优选形式中，将所述培养基的pH值调节至4.8至6.5。

在本发明方法的另一个方面中，通过包括下述步骤的过程从含有所述独立细胞的培养基中提取油，所述独立细胞由来自麻疯树种子的外植体所产生的独立细胞扩增而来，所述过程包括：添加有机溶剂；超声；离心；取出上层；和蒸发并干燥所述溶剂。

对于麻疯树或任何其它含油植物，当细胞量在培养基中达到稳定期时从细胞中进行油提取，所述细胞由来自种子子叶的外植体所产生的独立细胞扩增而来。将有机溶剂添加到含有所扩增细胞的培养基中。优选的有机溶剂是己烷，但也可使用其它溶剂，如异丙醇或乙醇等。

当混合溶剂时所述独立细胞的壁被破坏，对培养基和所述独立细胞进行超声，将油从所述细胞中释放出来。对溶剂和含有被破坏细胞以及所释放油的培养基的混合物进行离心，从而将所述混合物分为两相：上层相和下层相。上层相含有溶剂和所释放的油，下层相含有所述细胞残余物和培养基。将含有溶剂和油的上层相分离出来，然后通过旋转蒸发和加热来蒸发掉所述相的溶剂，从而实现油的纯化。

本发明还提供了培养基，其中所述培养基含有NH₄NO₃、CaNO₃、CuSO₄、MnSO₄、ZnSO₄、H₃BO₃、KH₂PO₄、Na₂MoO₄、EDTA、FeSO₄、CaCl₂、CaCO₃、NaC₆H₇O₇(柠檬酸钠)、MgSO₄、K₂SO₄、硫胺素、甘氨酸、环己六醇、烟酸、吡哆醇、生物素、谷氨酰胺、萘乙酸、玉米素和碳源。

在本发明培养基的一个方面中，所述培养基含有纤维素酶、果胶酶和半纤维素酶，其中所述纤维素酶、果胶酶和半纤维素酶破坏所述培养基中来自于麻疯树种子之外植体组织的细胞间结合。

在本发明方法的培养基的一个方面中，所述培养基可含有选自CaNO₃和KNO₃的盐。

在本发明方法的培养基的一个方面中，所述培养基可含有选自CaCl₂和KCl的盐。

在本发明培养基的一个方面中，所述培养基可含有选自吲哚乙酸(IAA)、萘乙酸(NAA)和吲哚丁酸(IBA)的激素。

在本发明培养基的一个方面中，所述培养基可含有选自激动素、苄基腺嘌呤(BA)、赤霉素(GA)和玉米素的激素。

在本发明培养基的另一个方面中，所述培养基可含有选自蔗糖、果糖和葡萄糖的碳源。

在优选形式中，本发明培养基的成分浓度范围如下：

NH₄NO₃           100-500mg/L

CaNO₃或KNO₃      200-400mg/L

CuSO₄            0.1-5mg/L

MnSO₄            10-40mg/L

ZnSO₄            20-50mg/L

H₃BO₃            10-20mg/L

KH₂PO₄                  50-200mg/L

Na₂MoO₄                 0.1-5mg/L

EDTA(乙二胺四乙酸)      10-50mg/L

FeSO₄                   10-50mg/L

CaCl₂或KCl              50-100mg/L

CaCO₃                   30-50mg/L

NaC₆H₇O₇(柠檬酸钠)      0.1-10mg/L

MgSO₄                   50-300mg/L

K₂SO₄                   700-1500mg/L

硫胺素                  0.5-3mg/L

甘氨酸                  0.5-3mg/L

环己六醇                50-200mg/L

烟酸                    0.1-10mg/L

吡哆醇                  0.1-10mg/L

生物素                  0.1-10mg/L

谷氨酰胺                20-50mg/L

IAA或NAA或IBA           0.5-10mg/L

玉米素或激动素或BA或GA  0.5-10mg/L

蔗糖或葡萄糖或果糖      30000-100000mg/L，以及

半纤维素酶和果胶酶以及纤维素酶3000-5000mg/L

在本发明培养基的优选形式中，EDTA是二钠盐。在本发明的方法中也可使用单钠-EDTA。

在本发明培养基的优选形式中，所述环己六醇是肌醇。

在本发明培养基的优选形式中，将pH值调节至4.8至6.5。

尽管本说明书给出了本发明的一些优选实施方案，但是在不背离权利要求所涵盖的构思和基本原则的情况下，可对其中部分的形式和配置进行另外的改变。

实施例

将成熟的麻疯树种子预先用水和皂进行清洁和洗涤，利用乙醇浸浴对所述种子进行消毒；然后，通过以用无菌水浸湿的纸包裹所述种子而将其水化；随后，利用3％次氯酸钠浸浴对所述种子进行灭菌；之后，用刀除去种子的皮；从所得麻疯树种子的子叶切割成1至2毫米厚的外植体或横切层状部分。

将1至3克的麻疯树种子子叶的外植体置于具有下述组成和浓度的100毫升培养基中：

NH₄NO₃                    400mg/L

CaNO₃                     383mg/L

CuSO₄                     0.25mg/L

MnSO₄                     22.3mg/L

ZnSO₄                     8.6mg/L

H₃BO₃                     6.2mg/L

KH₂PO₄                    170mg/L

Na₂MoO₄                   0.25mg/L

Na₂EDTA(乙二胺四乙酸)     37.3mg/L

FeSO₄                     27.85mg/L

CaCl₂                 72.5mg/L

CaCO₃                 20mg/L

NaC₆H₇O₇(柠檬酸钠)    0.5mg/L

MgSO₄                 180.7mg/L

K₂SO₄                 990mg/L

硫胺素                1mg/L

甘氨酸                2mg/L

肌醇                  100mg/L

烟酸                  0.5mg/L

吡哆醇                0.5mg/L

生物素                1mg/L

谷氨酰胺              30mg/L

IAA                   2mg/L

激动素                1mg/L

蔗糖                  50000mg/L，以及

果胶酶和纤维素酶      5000mg/L

用0.1N的HCl和/或NaOH溶液将培养基的pH值调节至5.8。

将所述培养基在室温下于黑暗中在恒定搅拌下孵育15天，这时观察到外植体组织转变为独立的扩增细胞，其密度约为2×10⁵个独立细胞/毫升。

从培养基中分离出细胞，再接种到具有相同组成和浓度的100毫升新鲜培养基中，继续在黑暗中在恒定搅拌下再孵育约10天，这时细胞扩增达到稳定期(约2×10⁶个独立细胞/毫升)。

将100毫升己烷添加到含有密度约为2×10⁶个独立细胞/毫升的独立细胞的100毫升培养基中。对所得混合物进行90分钟的超声处理。然后，以2500rpm将混合物离心30分钟。离心后出现上层相和下层相。分离出上层相，将其转移到接收器中，在70℃下以180rpm旋转蒸发，然后将其置于75℃的炉上1小时。所得油重量为1.978克(所得产率为19.78克/L)。

对油进行分析，结果如下表所示：

表1：油样品的脂肪酸测定组成。

油样品的测定组成(气相色谱联用质谱)：

脂肪酸              保留时间(分钟)    组成％(p/p)

豆蔻酸              11.766            0.26

壬二酸              13.155            0.15

棕榈酸              13.460            19.96

棕榈油酸            13.698            0.61

硬脂酸(Estearic)    14.994            8.64

油酸                15.188            38.46

亚油酸              15.555            31.35

二十烷酸            16.387            0.56

通过本发明的方法从来自麻疯树种子子叶的独立细胞所得到的油的组成与文献中所报道的相似，例如下表所示，其来自于Akintayo等，Bioresource technology 92(2004)307-310。

Akintayo的表3(第309页)

派克木(PKBS(Parkia biglobbossa))和麻疯树(JTC(Jatropha curcas))种子油的脂肪酸组成(％)

脂肪酸                  PKBS              JTC

棕榈酸                  27.5±0.5         19.5±0.8

硬脂酸(Estearic)        10.5±0.4         6.8±0.6

油酸                    14.5±0.5         41.3±1.5

亚油酸                  44.5±1.5         31.4±1.2

亚麻酸                  3.0±0.2          -

饱和酸                  38                26.3

不饱和酸                62                72.7

所示值为两次测定的平均值±标准偏差。

由本发明方法所得到的来自麻疯树的油的组成与文献中所述的来自麻疯树的油的组成相当。因此，通过本发明的方法从麻疯树得到的油具有如有关麻疯树来源油的文献中所述的高品质生物柴油所需的特征。

Claims (23)

1.一种生产来源于由植物种子外植体扩增之独立细胞的油的方法，其中所述方法包括：

a.从所述种子获得外植体；

b.将来自所述种子的外植体置于培养基中；

c.通过向所述培养基添加能够破坏所述细胞间结合的酶来破坏来自所述种子之外植体组织的细胞间结合，其中所述外植体产生独立细胞；

d.在所述培养基中孵育和扩增由来源于所述种子的外植体所产生的独立细胞；以及

e.从由来源于所述植物种子的外植体所产生的独立细胞而扩增的细胞中提取油。

2.权利要求1的方法，其中所述植物种子是含油植物种子。

3.一种生产来源于由麻疯树种子外植体扩增之独立细胞的油的方法，其中所述方法包括：

a.从所述麻疯树种子获得外植体；

b.将来自所述麻疯树种子的所述外植体置于培养基中；

c.通过向所述培养基添加能够破坏所述细胞间结合的酶来破坏来自所述麻疯树种子之外植体组织的细胞间结合，其中所述外植体产生独立细胞；

d.在所述培养基中孵育和扩增由来源于所述麻疯树种子的外植体所产生的独立细胞；以及

e.从由来源于所述麻疯树种子的外植体所产生的独立细胞而扩增的细胞中提取油。

4.权利要求1至3中任一项的方法，其中所述外植体是通过包括以下步骤的方法自植物种子获得的：

a.用乙醇将植物种子消毒，其中用乙醇浸浴所述种子；

b.用无菌水浸湿的纸将所述消毒的植物种子水化，其中以所述用无菌水浸湿的纸包裹植物种子；

c.用次氯酸钠将所述水化的植物种子灭菌，其中用次氯酸钠浸浴所述水化的植物种子；

d.除去所述已灭菌植物种子的皮，使得种子子叶从植物种子中释放出来；以及

e.从所述植物种子子叶获得外植体。

5.权利要求1至3中任一项的方法，其中步骤(b)、(c)和(d)中使用的培养基至少包含NH₄NO₃、Ca(NO₃)₂、CuSO₄、MnSO₄、ZnSO₄、H₃BO₃、KH₂PO₄、Na₂MoO₄、EDTA、FeSO₄、CaCl₂、CaCO₃、NaC₆H₇O₇、MgSO₄、K₂SO₄、硫胺素、甘氨酸、环己六醇、烟酸、吡哆醇、生物素、谷氨酰胺、萘乙酸、玉米素和碳源。

6.权利要求1至3中任一项的方法，其中将纤维素酶、果胶酶和半纤维素酶添加到所述培养基中，其中所述纤维素酶、果胶酶和半纤维素酶破坏所述培养基中来自于植物种子的外植体组织的细胞间结合。

7.权利要求5的方法，其中步骤(b)、(c)和(d)中使用的所述培养基含有选自Ca(NO₃)₂和KNO₃的盐。

8.权利要求5的方法，其中步骤(b)、(c)和(d)中使用的所述培养基含有选自CaCl₂和KCl的盐。

9.权利要求5的方法，其中步骤(b)、(c)和(d)中使用的所述培养基含有选自吲哚乙酸、萘乙酸和吲哚丁酸的激素。

10.权利要求7至8中任一项的方法，其中步骤(b)、(c)和(d)中使用的所述培养基含有选自吲哚乙酸、萘乙酸和吲哚丁酸的激素。

11.权利要求5的方法，其中步骤(b)、(c)和(d)中使用的所述培养基含有选自激动素、苄基腺嘌呤、赤霉素和玉米素的激素。

12.权利要求7至8中任一项的方法，其中步骤(b)、(c)和(d)中使用的所述培养基含有选自激动素、苄基腺嘌呤、赤霉素和玉米素的激素。

13.权利要求9的方法，其中步骤(b)、(c)和(d)中使用的所述培养基含有选自激动素、苄基腺嘌呤、赤霉素和玉米素的激素。

14.权利要求5的方法，其中步骤(b)、(c)和(d)中使用的所述培养基含有选自蔗糖、果糖和葡萄糖的碳源。

15.权利要求7至8中任一项的方法，其中步骤(b)、(c)和(d)中使用的所述培养基含有选自蔗糖、果糖和葡萄糖的碳源。

16.权利要求9的方法，其中步骤(b)、(c)和(d)中使用的所述培养基含有选自蔗糖、果糖和葡萄糖的碳源。

17.权利要求10的方法，其中步骤(b)、(c)和(d)中使用的所述培养基含有选自蔗糖、果糖和葡萄糖的碳源。

18.权利要求11的方法，其中步骤(b)、(c)和(d)中使用的所述培养基含有选自蔗糖、果糖和葡萄糖的碳源。

19.权利要求1至3中任一项的方法，其中从所述外植体被置于培养基中算起的孵育时间为至少3天。

20.权利要求1至3中任一项的方法，其中从所述外植体被置于培养基中算起的孵育时间为至少8天。

21.权利要求1至3中任一项的方法，其中从所述外植体被置于培养基中算起的孵育时间为至少14天。

22.权利要求1至3中任一项的方法，其中从由所述外植体所产生的独立细胞被再接种于新鲜培养基中算起的孵育时间为至少10天。

23.权利要求1至3中任一项的方法，其中通过下述过程从含有所述独立细胞的培养基中提取油，所述独立细胞由来自植物种子的外植体所产生的独立细胞扩增而来，所述过程包括：

a.添加有机溶剂；

b.超声；

c.离心；

d.取出上层相；和

e.蒸发并干燥所述溶剂。