HK1099550A

HK1099550A - 肿瘤靶向酶的鉴定方法

Info

Publication number: HK1099550A
Application number: HK07106671.6A
Authority: HK
Inventors: 石塚秀夫; 冈部尚文; 新间信夫; 佃拓夫; 梅田勳
Original assignee: 中外制药株式会社
Priority date: 2001-11-23
Filing date: 2005-10-21
Publication date: 2007-08-17

Description

肿瘤靶向酶的鉴定方法

本申请是中国发明专利申请(申请日：2002年11月18日；申请号：02827424.5；发明名称：肿瘤靶向酶的鉴定方法)的分案申请。

本发明涉及一种鉴别与快速生长的正常细胞或组织相比优先表达在某些肿瘤组织中的酶的方法，该酶在设计选择性地在肿瘤细胞中产生活性抗癌物质的化合物中的用途，基于这种酶设计的化合物，其可药用盐及其药物组合物。

在药物的使用中一种最严重但也是最重要的问题是副作用。药物的副作用主要是由药物的非特异性作用引起的；药物不但与药物的靶分子而且与其他分子相互作用和影响，这在正常生理过程的维持中发挥重要作用。副作用的另一主要诱因是药物在许多组织中的非特异性分布造成的；药物不但存在于被感染的组织内，而且存在于那些仍然未被感染保持正常生理功能的组织中。大多数抗癌药的靶向分子广泛表达在许多组织中而并非对某些组织特异性的。另一方面，疾病通常由某些分子在某种组织中的失调引起的。因此，为了避免副作用，必须建立药物只作用于某些组织内存在的构成致病原因的某些分子的方法，并且通过提供这样的方法设计药物。

在许多疾病中，药物的副作用与癌症患者的治疗极其相关。细胞毒性药物已经广泛应用于癌症的治疗中并且在今后十年内将继续应用于癌症化疗中。然而，细胞毒性药物的使用受到其效力不够和副作用严重的限制。在肿瘤组织中，当DNA合成或有丝分裂发生时，许多细胞毒性药物包括5-FU，2′-脱氧胞苷类，甲氨喋呤，喜树碱类和紫杉烷类作用于细胞周期的S和M期的肿瘤细胞。然而，肿瘤组织内生长的肿瘤细胞处于不同的细胞周期阶段，并且只有小部分的肿瘤细胞处于S或M期。所以，理想的药物接触时间应当是，至少比完成一个细胞周期所需时间要更长(在20-40小时内)，并且细胞毒性药物的理想给药方案是每天连用或者持续治疗以影响肿瘤组织中的全部癌细胞。然而，细胞毒性药物的治疗在这样的给药方案中对快速生长的正常细胞带来严重的毒性，特别是对造血始祖细胞和肠隐窝细胞。由造血始祖细胞中毒引起的脊髓抑制，在不同类型的细胞毒性药物的副作用中最常见并且常常造成宿主免疫反应的损伤和胎儿感染。一旦出现脊髓抑制，脊髓中毒一般需要2-3周才能恢复，并且这就是为何许多细胞毒性药物每3-4周给药1次的主要原因。然而，这种间断给药方案无法充分发挥绝大多数现有细胞毒性药物的功效。

一些具有新的作用方式的新抗肿瘤药物目前处于开发中。然而，它们也由于其肿瘤选择性不够而存在一些安全问题。事实上，大多数法呢基转移酶抑制剂和表皮生长因子(EGF)受体酪氨酸激酶抑制剂的主要毒性分别出现脊髓毒性和皮肤疹。人们推测这是因为靶向酶或蛋白质不仅在肿瘤组织中过度表达，而且过度表达在其他正常组织例如骨髓和皮肤中。

另一方面，卡培他滨(一种口服氟嘧啶)是一种细胞毒性药物，其在高度表达于肝脏和肿瘤内的酶的作用下转化为药物5-FU，而且在生长的骨髓细胞中也如此[Miwa.M.等“口服氟嘧啶氨基甲酸盐(卡培他滨)的设计，其在浓集在人肝脏和癌组织内的酶的作用下在肿瘤中选择性生成5-氟尿嘧啶”，Eur.J.Cancer 34，1274-1281(1998)]。因此，选择性地在肿瘤组织中达到高浓度的5-FU且与5-FU的那些化合物具有更好的分布性能。此外，它几乎不诱发脊髓毒性。这些特征使该药物可以以高剂量长时间用于每日使用的疗法。现在已经作为乳腺、结肠直肠和其他癌症的治疗的处方药。然而，仍然难以确定如同卡培他滨这样的具有较高效力和安全范围的抗癌药，因为没有建立从那些表达在许多不同组织中准确鉴定出酶和/或蛋白质的方法。

本发明涉及鉴定用于设计可以选择性地在肿瘤中而不是正常细胞(此后称作肿瘤靶向细胞毒素(TTC))，特别是主要存在于骨髓中的粒细胞祖细胞(progenitor)中转化为活性物质的化合物的酶的方法。肿瘤靶向细胞毒素，应具有肿瘤选择性作用并且几乎没有脊髓毒性。此类化合物可以在较高剂量下长时间安全给药，具有比现有细胞毒素更加改进的安全性和效力分布。这些化合物由此可以减少与副作用有关的住院并且可以安全处方开药给门诊病人。肿瘤靶向细胞毒素的其他优点包括他们能够通过测定其活化酶(TTC-活化酶)的表达水平来安排个性化健康治疗(定制疗法)。高表达水平的TTC-活化酶的各种肿瘤应有效由肿瘤靶向细胞毒素产生活性药物，因此，可能对肿瘤靶向细胞毒素非常敏感。

本发明的一个目的在于提供鉴定用于设计选择性地在肿瘤内转化为活性物质的抗癌化合物酶的方法，该方法包括测量基因和/或蛋白质在正常和肿瘤来源的人体组织和/或细胞中的表达水平，比较测得的表达水平并且选择酶，该酶的mRNA和/或蛋白质水平在肿瘤组织中比在正常生长的造血祖细胞，肠和/或皮肤中高两倍以上。

本发明的另一目的在于提供一种鉴定可以选择性地在肿瘤中转化为活性物质的抗癌化合物的方法，其包括产生表达酶的细胞，该酶的蛋白质水平在肿瘤组织中比在正常细胞或组织中高两倍以上且测定该抗癌化合物的生长抑制活性。

本发明的另一目的在于提供式(I)的抗癌化合物，

X-Y-Q (I)

其中

X是前部分，其设计为通过本发明的酶选择性地在肿瘤内产生活性抗癌物质(Q-Y-H)；

Q-Y-是衍生自活性抗癌物质(Q-Y-H)的基团，其中Y是-O-，-S-或-N-，和其可药用盐。

本发明的另一目的是提供式(II)表示的抗癌化合物，

其中

Q和Y与上述定义相同，

R⁰是天然或非天然氨基酸的侧链，

Z是(C₁-C₃)亚烷基或-O-CH(R³)-其中R³是氢或直链(C₁-C₄)烷基，

R¹是氢或甲基，和

R²是氢，支链(C₃-C₁₀)烷基或(C₃-C₈)环烷基，

和其可药用盐。

本发明的另一目的在于提供式(III)的抗癌化合物，

其中

R⁰如同上述定义，

R⁴是苯甲酰基或叔丁氧基羰基，和

R⁵是氢或乙酰基，

和其可药用盐。

本发明的另一目的在于提供式(IV)表示的抗癌化合物，

其中

R⁰，R¹，R²和R³与上述定义相同，

R⁶是氢，氟，羟基或氰基，

R⁷是氢，氟或羟基，

或R⁶和R⁷一起构成亚甲基或氟代亚甲基，

R⁸是氢或乙炔基，

R⁹是氢，氟，乙烯基或乙炔基，和

R¹⁰是氢或羟基

和其可药用盐。

本发明的另一目的在于提供式(V)所示的抗癌化合物，

其中

m是2或3的整数，

R⁰，R²，R⁶，R⁷，R⁸，R⁹和R¹⁰与上述定义相同，

和其可药用盐。

本发明的另一目的在于提供式(VI)的抗癌化合物，

其中

m是1-3的整数，

n是0-1的整数，

R⁰如同上述定义，

R¹¹是氢或氟，

R¹²是氢，氟，甲基或羟基，

R¹³是氢，氨基，硝基，或(二甲基氨基)甲基，

R¹⁴是氢，(C₁-C₄)烷基，4-甲基哌嗪基甲基，叔丁氧基亚氨基甲基

或R¹³和R¹⁴，或R¹¹和R¹²可以一起构成5或6员环，其可以含有一个或两个杂原子，和可以任选被(C₁-C₈)烷基，氨基，(C₁-C₈)烷基氨基，和二-(C₁-C₄)烷基氨基取代，

和其可药用盐。

本发明中术语“(C₁-C₃)亚烷基”是指二基的含有1-3个碳原子的支链或非支链烃链，例如亚甲基，亚乙基，亚丙基和三亚甲基，最优选亚乙基。

在本发明中术语“-O-CH(R³)-“是指-O-CH₂-，-O-CH(CH₃)-，-O-CH(CH₂CH₃)-，-O-CH(CH₂CH₂CH₃)-，-O-CH(CH₂CH₂CH₂CH₃)-；优选-O-CH₂-，-O-CH(CH₃)-，和最优选-O-CH(CH₃)-。

术语“乙酰基”是指CH₃CO-。

术语“环烷基”表示含有3-7个碳原子，优选含有4-7个碳原子，更优选4-6个碳原子的饱和、环状烃基，即环丙基，环丁基，环戊基和环己基等。

术语“杂原子”是指氧，氮和硫。

术语“一-和二-烷基氨基”是指被定义如上的烷基或二-烷基取代的氨基，即烷基-NH-和二-烷基-N-“(C₁-C₈)烷基氨基”是指甲基氨基，乙基氨基，丙基氨基，异丙基氨基，丁基氨基，叔丁基氨基，戊基氨基，己基氨基，庚基氨基和辛基氨基；优选丁基氨基和戊基氨基。

术语“二-(C₁-C₄)烷基氨基”是指二-甲基氨基，二-乙基氨基，二-丙基氨基，二-丁基氨基；优选二-甲基氨基和二-乙基氨基。

在式(II)的R⁰的定义中，术语“天然氨基酸的侧链”优选是指天然氨基酸的侧链，例如甲基，异丙基，2-甲基丙基，1-甲基丙基，苄基，吲哚-3-基甲基，2-(甲硫基)乙基和4-氨基丁基，3-氨基丙基；更优选是指天然亲脂性氨基酸的侧链，例如甲基，2-甲基丙基，苄基和吲哚-3-基甲基。

术语“非天然氨基酸的侧链”优选是指(C₅-C₁₂)烷基，环烷基甲基，取代的或未取代的芳基甲基，(环烷硫基)甲基，烷硫基-(CH₂)_r-，其中r是1或2的整数，等。

上文中，术语“(C₅-C₁₂)烷基”是指含有5-12个碳原子的直链或支链烷基链，更优选(C8-C12)直链烷基链，例如正辛基，壬基，癸基，十一烷基和十二烷基。

术语“烷硫基-(CH₂)_r-”是指具有含2-10个碳原子的直链、支链烷基链的烷硫基-甲基或烷硫基乙基，例如乙硫基甲基，乙硫基乙基，正丙硫基甲基，正丁硫基甲基，正戊硫基甲基，正辛硫基甲基，正壬硫基甲基，正癸硫基甲基，叔丁硫基甲基等；更优选乙硫基乙基，正丙硫基甲基和正丁硫基甲基。

术语“取代的或未取代的芳基甲基”优选是指4-苯基苄基，萘-2-基甲基，[4-(4-羟基苯氧基)苯基]甲基和(4-低级烷氧基苯基)甲基，其中术语“低级烷氧基”是指含有1-6个碳原子的直链或支链烷基链；优选甲氧基，乙氧基，丙氧基，丁氧基和异丙氧基。“取代的或未取代的芳基甲基”的最优选实施方案是4-苯基苄基，萘-2-基甲基，(4-甲氧基苯基)甲基和[4-(4-羟基苯氧基)苯基]甲基。

在式(II)的R²的定义中，术语“支链(C₃-C₁₀)烷基”是指含有3-6个碳原子的支链烷基链，和优选是指异丙基，2-丁基，3-戊基，新戊基等，更优选异丙基和3-戊基。术语“(C₃-C₈)环烷基”是指由3-8个碳原子组成的的碳环，例如环丙基，环丁基，环戊基，环己基等；更优选环戊基和环己基。

在式(II)的R³的定义中，术语“直链(C₁-C₄)烷基”是指含有1-4个碳原子的直链烷基链，和优选是指甲基，乙基和正丙基。

术语″可药用盐″是指那些保留游离碱或游离酸的生物有效性和性质的盐，它在生物学上或其他方面不是不利的。所述的盐与无机酸形成，所述无机酸有例如盐酸，氢溴酸，硫酸，硝酸，磷酸等，和与有机酸形成，所述有机酸有例如乙酸，丙酸，羟基乙酸，丙酮酸，草酸，马来酸，丙二酸，琥珀酸，富马酸，酒石酸，柠檬酸，苯甲酸，肉桂酸，扁桃酸，甲磺酸，乙磺酸，对甲苯磺酸，水杨酸，N-乙酰基半胱氨酸等。此外这些盐可以由无机碱或有机碱与游离酸的加成制得。衍生自无机碱的盐包括，但不限于，钠，钾，锂，铵，钙，镁盐等。衍生自有机碱的盐包括，但不限于伯，仲，和叔胺，取代胺，包括天然取代的胺，环状胺和碱性离子交换树脂，例如异丙基胺，三甲基胺，二乙胺，三乙胺，三丙基胺，乙醇胺，赖氨酸，精氨酸，N-乙基哌啶，哌啶，聚乙烯亚胺树脂等的盐。优选的盐是盐酸盐。盐游离化合物可以通过所属领域的已知方法制备。

在本发明中所述的“前部分(X)”是在肿瘤内在给药式(I)或(II)的化合物之后通过上述酶裂解的离去基团，例如(X)是下式的基团

在本发明中，术语“紫杉烷类”是指紫杉醇[Front.Biotechnol.Pharm.(2000)，1，336-348]，多西他赛[J.Med.Aromat.Plant Sci.(2001)，22/4A-23/1A 4-5]，IDN 5109[Chirality，(2000)，12(5/6)，431-441]，BMS188797[Clinical Cancer Research.5(suppl.)，3859，Nov 1999]，BMS184476[J.Clinical Oncology19：2493-2503，1 May 2001]。

术语“喜树碱类”[(a)Cancer Chemotherapy和Biotherapy：Principle andPractice，2^nd Ed.，Lippincott-Ravenmeans，page 463-484，(b)Biochim.Biophys.Acta(1998)，1400(1-3)，107-119]是指任何具有喜树碱骨架的化合物，例如喜树碱，拓扑替康，SN-38，9-氨基喜树碱，9-硝基喜树碱，勒托替康[Br.J.Cancer(1998)，78(10)，1329-1336]，DX-8951f[Ann.N.Y. Acad.Sci.(2000)，922(喜树碱)，260-273]，BN-80915[Anti-cancer Drugs(2001)，12(1)，9-19]等。

术语“抗癌核苷”是指胞苷衍生物[Cancer Chemotherapy andBiotherapy：Principle and Practice，2^nd Ed.，Lippincott-Ravenmeans，page213-233]例如DFDC(吉西他滨)，DMDC[Clin.Cancer Res.(2000)，6(6)，2288-2294]，FMDC[Curr.Opin.Invest.药物(PharmaPress Ltd.)(2000)，1(1)，135-140]，Ara-C，地西他滨[IDrugs(2000)，3(12)，1525-1533]，曲沙他滨[Clin.Cancer Res.(2000)，6(4)，1574-1588]，2′-氰基-2′-脱氧胞苷(CNDAC)，3′-乙炔基胞苷(TAS106)[Jpn.J.Cancer Res.(2001)，92(3)，343-351]，5-氟-5′-脱氧胞苷[Bioorg.Med.Che.Lett.，(2000)，8，1697-1706]，5-乙烯基-5′-脱氧胞苷，或腺苷衍生物[Cancer Chemotherapy and Biotherapy：Principle andPractice，2^nd Ed.，Lippincott-Ravenmeans，page 235-252]例如氟达拉滨，克拉立平等。

术语“多拉司他汀”是指多拉司他汀10[Curr.Pharm.Des.(1999)，5(3)，139-162]，多拉司他汀14，TZT1027[Drugs Future(1999)，24(4)，404-409]，西马多丁等。

术语“蒽环类抗生素”[Cancer Chemotherapy and Biotherapy：Principleand Practice，2^nd Ed.，Lippincott-Ravenmeans，page 409-434]是指阿霉素，柔红霉素，去甲氧基柔红霉素等。

术语“法呢基转移酶抑制剂”是指R115777[Cancer Res.(2001)，61(1)，131-137]，等。

术语“EGF受体酪氨酸激酶抑制剂”是指ZD1839[Drugs(2000)，60(Suppl.1)，33-40]，CP 358774(OSI-774)[J.Pharmacol.Exp.Thr.(1999)，291(2)，739-748]，PD 158780[J.Med.Chem.(2001)，44(3)，429-440]，GW2016等。

在本说明书中，下列符号或缩写是指下列各化合物。

a)紫杉醇

[2aR-[2aα，4β，4aβ，6β，9α(αR^*，βS^*)，11α，12α，12aα，12bα]]-β-(苯甲酰基氨基)-α-羟基苯丙酸6，12b-二(乙酰氧基)-12-(苯甲酰氧基)-2a，3，4，4a，5，6，9，10，11，12，12a，12b-十二氢-4，11-二羟基-4a，8，13，13-四甲基-5-氧代-7，11-桥亚甲基-1H-环癸并[3，4]苯并[1，2-b]氧杂环丁烷-9-基(oxet-9-yl)酯，

b)多西他赛

[2aR-[2aα，4β，4aα，6β，9α(αR^*，βS^*，11α，12α，12aα，12bα)]-β-[[(1，1-二甲基乙氧基)羰基]氨基]-α-羟基苯丙酸12b-(乙酰氧基)-12-(苯甲酰氧基)-2a，3，4，4a，5，6，9，10，11，12，12a，12b-十二氢-4，6，11-三羟基-4a，8，13，13-四甲基-5-氧代-7，11-桥亚甲基-1H-环癸并[3，4]苯并[1，2-b]氧杂环丁烷-9-基酯，

c)IDN 5109

(2R，3S)-3-[[(1，1-二甲基乙氧基)羰基]氨基]-2-羟基-5-甲基-4-己烯酸(3aS，4R，7R，8aS，9S，10aR，12aS，12bR，13S，13aS)-7，12a-二(乙酰氧基)-13-(苄氧基)-3a，4，7，8，8a，9，10，10a，12，12a，12b，13-十二氢-9-羟基-5，8a，14，14-四甲基-2，8-二氧代-6，13a-桥亚甲基-13aH-氧杂环丁烷并[2″，3″：5′，6′]苯并[1′，2′：4，5]环癸并[1，2-d]-1，3-二氧杂环戊烯-4-基酯，

d)BMS 188797

(2R，3S)-β-(苯甲酰基氨基)-α-羟基苯丙酸(2aR，4S，4aS，6R，9S，11S，12S，12aR，12bS)-6-(乙酰氧基)-12-(苯甲酰氧基)-2a，3，4，4a，5，6，9，10，11，12，12a，12b-十二氢-4，11-二羟基-12b-[(甲氧基羰基)氧基]-4a，8，13，13-四甲基-5-氧代-7，11-桥亚甲基-1H-环癸并[3，4]苯并[1，2-b]氧杂环丁烷-9-基酯，和

e)BMS 184476

(2R，3S)-β-(苯甲酰基氨基)-α-羟基苯丙酸(2aR，4S，4aS，6R，9S，11S，12S，12aR，12bS)-6，12b-二(乙酰氧基)-12-(苯甲酰氧基)-2a，3，4，4a，5，6，9，10，11，12，12a，12b-十二氢-11-羟基-4a，8，13，13-四甲基-4-[(甲硫基)甲氧基]-5-氧代-7，11-桥亚甲基-1H-环癸并[3，4]苯并[1，2-b]氧杂环丁烷-9-基酯。

f)喜树碱

4(S)-乙基-4-羟基-1H-吡喃并[3′，4′：6，7]吲嗪并[1，2-b]喹啉-3，14(4H，12H)-二酮，

g)拓扑替康

(4S)-10-[(二甲基氨基)甲基]-4-乙基-4，9-二羟基-1H-吡喃并[3′，4′：6，7]吲嗪并[1，2-b]喹啉-3，14(4H，12H)-二酮一盐酸盐

h)DX-8951f

(1S，9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-2，3，9，10，13，15-六氢-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3′，4′：6，7]吲嗪并[1，2-b]喹啉-10，13-二酮，

i)BN-80915

5(R)-乙基-9，10-二氟-1，4，5，13-四氢-5-羟基-3H，15H-氧杂环庚三烯并[3′，4′：6，7]吲嗪并[1，2-b]喹啉-3，15-二酮，

j)9-氨基喜树碱

(S)-10-氨基-4-乙基-4-羟基-1H-吡喃并[3′，4′：6，7]吲嗪并[1，2-b]喹啉-3，14(4H，12H)-二酮，和

k)9-硝基喜树碱

4(S)-乙基-4-羟基-10-硝基-1H-吡喃并[3′，4′，：6，7]-吲嗪并[1，2-b]喹啉-3，14(4H，12H)-二酮。

l)DFDC

2′-脱氧-2′，2′-二氟胞苷，

m)DMDC

2′-脱氧-2′-亚甲基胞苷，

n)FMDC

(E)-2′-脱氧-2′-(氟代亚甲基)胞苷，

o)Ara-C

1-(β-D-阿拉伯呋喃糖基)胞嘧啶，

p)地西他滨

4-氨基-1-(2-脱氧-β-D-赤型-戊呋喃糖基)-1，3，5-三嗪-2(1H)-酮，

q)曲沙他滨

4-氨基-1-[(2S，4S)-2-(羟基甲基)-1，3-二氧杂环戊烷-4-基]-2(1H)-嘧啶酮，

r)氟达拉滨

2-氟-9-(5-O-膦酰基-β-D-阿拉伯呋喃糖基)-9H-嘌呤-6-胺，

s)克拉屈滨

2-氯-2′-脱氧腺苷。

t)多拉司他汀10

N，N-二甲基-L-缬氨酰基-N-[(1S，2R)-2-甲氧基-4-[(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-[[(1S)-2-苯基-1-(2-噻唑基)乙基]氨基]丙基]-1-吡咯烷基]-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基]-N-甲基-L-缬氨酰胺，

u)多拉司他汀14

环[N-甲基丙氨酰基-(2E，4E，10E)-15-羟基-7-甲氧基-2-甲基-2，4，10-十六碳三烯酰基-L-缬氨酰基-N-甲基-L-苯基丙氨酰基-N-甲基-L-缬氨酰基-N-甲基-L-缬氨酰基-L-脯氨酰基-N2-甲基天天冬氨酰基]，

v)多拉司他汀15

(1S)-1-[[(2S)-2，5-二氢-3-甲氧基-5-氧代-2-(苯基甲基)-1H-吡咯-1-基]羰基]-2-甲基丙基酯N，N-二甲基-L-缬氨酰基-L-缬氨酰基-N-甲基-L-缬氨酰基-L-脯氨酰基-L-脯氨酸，

w)TZT 1027

N，N-二甲基-L-缬氨酰基-N-[(1S，2R)-2-甲氧基-4-[(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-[(2-苯基乙基)氨基]丙基]-1-吡咯烷基]-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基]-N-甲基-L-缬氨酰胺，

x)西马多丁

N，N-二甲基-L-缬氨酰基-L-缬氨酰基-N-甲基-L-缬氨酰基-L-脯氨酰基-N-(苯基甲基)-L-脯氨酸酰胺，

y)阿霉素

(8S，10S)-10-[(3-氨基-2，3，6-三脱氧-L-来苏糖型-己吡喃糖基)氧基]-7，8，9，10-四氢-6，8，11-三羟基-8-(羟基乙酰基)-1-甲氧基-并四苯-5，12-二酮盐酸盐，

z)柔红霉素

8-乙酰基-10-[(3-氨基-2，3，6-三脱氧-L-来苏糖型-己吡喃糖基)氧基]-7，8，9，10-四氢-6，8，11-三羟基-1-甲氧基-并四苯-5，12-二酮，盐酸盐，

aa)去甲氧基柔红霉素

(7S，9S)-9-乙酰基-7-[(3-氨基-2，3，6-三脱氧-L-来苏糖型-己吡喃糖基)氧基]-7，8，9，10-四氢-6，9，11-三羟基-并四苯-5，12-二酮。

bb)ZD 1839

N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-[3-(4-吗啉基)丙氧基]-4-喹唑啉胺，

cc)CP 358774

N-(3-乙炔基苯基)-6，7-二(2-甲氧基乙氧基)-4-喹唑啉胺，

dd)PD 158780

N⁴-(3-溴苯基)-N6-甲基吡啶并[3，4-d]嘧啶-4，6-二胺，和d

ee)GW 2016

N-(3-氯-4-((3-氟苄基)氧基)苯基)-6-(5-(((2-甲基磺酰基)乙基)氨基)甲基)-2-呋喃基)-4-喹唑啉胺。

ff)R 115777

6-[1-氨基-1-(4-氯苯基)-1-(1-甲基咪唑-5-基)甲基]-4-(3-氯苯基)-1-甲基喹啉-2(1H)-酮。

在本发明中，通过分析人体组织的mRNAs和/或蛋白质的水平来鉴定优先表达在肿瘤组织中由此选择性激活化合物的酶。随后由已知的和/或新的细胞毒性药物通过引入用于掩蔽该细胞毒性药物的生物活性但可以被选择性存在于靶向肿瘤组织内的酶识别且脱去的部分而设计化合物。

用于分析的正常和肿瘤的人体组织包括来自脑，食道，心脏，肺，乳房，胃，肝脏，胰腺，胆囊，小肠，结肠，直肠，肾，膀胱，卵巢，子宫，睾丸，前列腺，皮肤，骨，骨髓，和血液的人体组织。优选地，作为正常细胞，粒细胞祖细胞用来比较基因和/或蛋白质在肿瘤和正常组织之间的表达水平且选择优先表达在肿瘤组织内的基因和/或蛋白质。当手术过程中切除人体组织后，优选立即冷冻在液氮或含有干冰的丙酮中并且置于或不置于O.C.T.化合物(Sakura-Seiki，Tokyo，Japan，目录号4583)中并且储存在低于-70或-80℃的温度下直至使用。

如果肿瘤组织含有大部分的正常细胞，利用激光捕获显微解剖法从嵌入OCT前药中的组织分离出肿瘤细胞(Ohyama H，等“激光捕获显微解剖法得到的靶向样本用于高密度低聚核苷酸排列杂化”，Biotechniques29，530-536(2000)，Leethanakul C，等，“口腔的鳞状细胞癌中的基因表达性能：使用激光捕获显微解剖法来构建和分析阶段特异性cDNA文库”，Oral Oncol 36，474-83(2000))。对于显微解剖法，6-10微米厚的冷冻切片用70％乙醇固定，用Mayer苏木精染色，并且随后用乙醇梯度和二甲苯脱水。肿瘤细胞的显微解剖使用激光捕获显微解剖仪器(Olympus，Tokyo，Japan，Model LM200)，和肿瘤细胞中的RNA用市售试剂盒萃取(MicroRNA isolation Kit，Stratagene，La Jolla，CA，USA)。

通过使CD34-阳性单核细胞在若干细胞因子(包括Flt3-配体，干细胞因子(SCF)和血小板生成素(TPO))的存在下扩展在小鼠基质细胞上来制备对细胞毒性药物最敏感的人体粒细胞祖细胞。人脐带血或骨髓中的CD34-阳性单核细胞与抗-CD34抗体一起温育并结合，该抗体与磁珠偶联并且通过磁性辅助细胞分选法(MACS)纯化(Miltenyi，等在：Hematopoieticstem细胞：The mulhouse mannual，201-213，AlphaMed press，Dayton(1994))。保持分化为多种造血细胞的纯化CD34-阳性单核细胞扩展在培养皿中且通过检测用荧光-偶联的抗-CD 34抗体染色细胞后CD34的表达来确定培养基中粒细胞祖细胞的百分比。通常，培养基中90％以上的细胞在扩展后变为CD34-阳性粒细胞祖细胞。这些粒细胞祖细胞分化为成髓细胞且随后分化为髓细胞和粒细胞的能力是通过用粒细胞集落刺激因子(G-CSF)或白介素-3(IL3)与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和G-CSF联合处理它们来测试的。细胞系和分化的阶段是通过监测细胞表面抗原(CD抗原)例如CD11，CD13，和CD15通过荧光辅助的细胞分选(FACS)用FACSCalibur(Becton Dickinson，Franklin Lakes，NewJersey，USA)和/或在细胞用吉姆沙染色剂染色后(Diff-Quick)(Midori-Juji.Co.Osaka，Japan，目录号16920)或利什曼氏染色后(Merck，Darmstadt，Germany，目录号1.05387.0500)后通过显微镜检查来证实。FACS数据是通过FACSCalibur CELLQuest软件按照FACSCalibur手册，FACStation ver.1.1(Becton-Dickinson，Franklin Lakes，New Jersey，USA.)进行分析。

表达在某些肿瘤组织中的酶和蛋白质是通过测定其在在人体组织和细胞中的mRNAs和/或蛋白质水平来搜索。MRNAs的表达水平是通过已知方法测定，例如DNA微陈(Schena，M.等“基因表达模式用补充DNA微测定法的定量监测”，Science 270，467-470(1995)，和Lipshutz，R.J.等“高密度合成寡核苷酸测定”Nature Genetics 21，20-24(1999))，反转录聚合酶反应(此后创造RT-PCR)(Weis，J.H.等“稀有mRNAs经定量RT-PCR的检测”，Trends Genetics 8，263-264(1992)，和Bustin，S.A.“mRNA用实时反转录聚合酶链反应检测法的绝对定量”，J.Mol.Endocrinol.25，169-193(2000))，RNA印迹法和原位杂交(Parker，R.M.& Barnes，N.M.mRNA：原位检测和RNA杂交，Methods Mol.Biol.106，247-283(1999))，RNase保护分析(Hod，Y.A.简单化核糖核酸酶保护实验，Biotechniques 13，852-854(1992)，Saccomanno，C.F.等快速核糖核酸酶保护实验，Biotechniques 13，846-850(1992))，蛋白质印迹(Towbin，H.等“蛋白质由聚丙烯酰胺凝胶向硝基纤维素膜的电泳传递”，Proc.Natl.Acad.Sci.U S A 76，4350-4354(1979)，Burnette，W.N.“蛋白质印迹：蛋白质由十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶向未改性硝基纤维素和放射性碘化蛋白质A的电泳转移”，Anal.Biochem.112，195-203(1981))，ELISA分析法(Engvall，E.& Perlman，P.酶联免疫吸附测定(ELISA)：免疫球蛋白G的定量分析，Immunochemistry 8：871-879(1971))，和蛋白质列阵(Merchant，M.& Weinberger，S.R.综述：飞行质谱的表面增强激光解吸/电离-时间值的最新进展，Electrophoresis 21，1164-1177(2000)，Paweletz，C.P.等“利用蛋白质生物芯片对直接得自人体组织的癌症进程的快速蛋白质显示分布”，Drug Development Research 49，34-42(2000))。更优选，DNA微阵和RT-PCR分别用于高通量分析和mRNA表达的定量分析。

为了进行DNA微阵，由一小片速冻在液氮或丙酮-干冰中的组织和/或细胞萃取RNA，和储存在低于-70℃或-80℃的温度下直至使用。将组织和细胞匀化，和组织和细胞匀浆中的RNAs用氯仿萃取且用异丙醇沉淀。污染在RNA标本中的DNA用DNase I消化，和RNA进一步通过凝胶过滤柱色谱纯化。在琼脂糖凝胶电泳和用溴化乙锭染色RNA后由28S和18S核糖RNA的比例来判断全RNA的质量。

利用全RNA作为模板，cDNA用含有T7启动子和反转录酶的序列的低聚-dT引物(Sawady Technology，Tokyo，Japan)合成。所得cDNA用苯酚和氯仿的混合物萃取且由短的低聚核苷酸利用凝胶过滤柱色谱分离。

用cDNA作为模板，cRNA用T7聚合酶，三磷酸腺苷(ATP)，三磷酸鸟苷(GTP)，三磷酸胞苷(CTP)，三磷酸尿苷(UTP)，Bio-11-CTP和Bio-16-UTP(ENZO Diagnostics，Farmingdale，USA，目录号分别为42818和42814)在37℃下合成6小时。所得cRNA通过凝胶过滤柱色谱与核苷酸分离。在琼脂糖凝胶电泳和用溴化乙锭染色cRNA后由cRNA的长度判断cRNA的质量。

DNA微阵是利用高密度低聚核苷酸碎片按照制造商的说明书来进行(HuGeneFL array，Affymetrix，Santa Clara，USA，目录号510137)(Lipshutz，R.L.等Nature Genet.21，20-24(1999))。按照制造商的说明书cRNA在95℃下片段化，杂交和洗涤。用激光扫描仪(Affymetrix，Santa Clara，USA)收集各象素水平且各cDNA的表达水平和可靠性(有/无信号)用AffymetrixGeneChip ver.3.3和Affymetrix Microarray Suite ver.4.0软件计算。

除了DNA微阵，其他方法包括RT-PCR(Weis，J.H.等“稀有mRNAs通过定量RT-PCR的检测”.Trends in Genetics，8，263-264(1992)，和Bustin，S.A.“mRNA用实时反转录聚合酶链反应检测法的绝对定量”J.MolecularEndocrinology 25，169-193(2000))，RNA印迹法和原位杂交(Parker，R.M.和Barnes，N.M.mRNA：原位检测和RNA杂交，Methods in MolecularBiology，106，247-283(1999))，差别展示(differential displays)(Zhu，W.和Liang，P.通过差别展示检测和分离分化表达的基因，Methods Mol.Biol.68，211-20(1997)，Liang P.和Pardee A.B.“真核信使RNA通过聚合酶链反应的方式的差别展示”.Science.257，967-971(1992))，RNase保护试验(Hod，Y.A“简单化核糖核酸酶保护试验”.Biotechniques 13，852-854(1992)，Saccomanno，C.F.等，“快速核糖核酸酶保护试验”，Biotechniques 13，846-850(1992))，蛋白质列阵(Merchant，M.和Weinberger，S.R.综述：飞行质谱的表面增强激光解吸/电离-时间值的最新进展，Electrophoresis 21：1164-1177(2000)，Paweletz，C.P.等“利用蛋白质生物芯片对直接得自人体组织的癌症进程的快速蛋白质显示分布”，DrugDevelopment Research 49：34-42(2000))，蛋白质印迹(Towbin，H.等“蛋白质由聚丙烯酰胺凝胶向硝基纤维素膜的电泳传递”.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76：4350-4354(1979)，Burnette，W.N.蛋白质印迹：蛋白质由十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶向未改性硝基纤维素和放射性碘化蛋白质A的电泳转移”.Anal.Biochem.112：195-203(1981))，二维凝胶电泳(O′Farrell，P.H.“蛋白质的高分辨二维电泳”.J.Biol.Chem.250：4007-4021(1975))，ELISA分析(Engvall，E.和Perlman，P.“酶联免疫吸附测定(ELISA)：免疫球蛋白G的定量分析”，Immunochemistry 8：871-879(1971))也用于测定mRNA和/或蛋白质的水平。

优选表达在某些肿瘤而不是粒细胞祖细胞和其他正常组织中的酶和/或蛋白质通过比较肿瘤组织内的mRNAs和蛋白质的水平与正常组织中mRNAs和蛋白质的水平来鉴定。在某些肿瘤和粒细胞祖细胞中其表达水平相差2倍以上的基因和/或蛋白质被选择作为候选基因用于符合激活TTC资格的酶和/或蛋白质。在某些肿瘤和粒细胞祖细胞之间表达水平具有较大差异的基因和/或蛋白质更为优选。此后，将高度表达在某些肿瘤组织而不是粒细胞祖细胞之间的mRNA的水平与其他正常组织，特别是与正常肝脏进行比较，因为肝脏是大多数药物代谢的主要器官。尤其优选其水平在某些肿瘤组织中比在造血祖细胞和其他正常组织，特别是肝脏组织中高的mRNA。

在按照在肿瘤组织和粒细胞祖细胞和其他正常组织(例如肝脏)之间的表达水平的差异选择的酶和/或蛋白质中，进一步选择具有相对宽泛底物特异性且酶反应机理适合化合物设计的那些酶和/或蛋白质。

所述酶，包括磷脂酶C，微粒体二肽酶，芳基硫酸酯酶A，DT-黄递酶，吡咯啉5′-羧基还原酶，脱氢二醇脱氢酶，羰基还原酶，赖氨酰羟化酶，脯氨酸肽酶，二氢嘧啶酶，谷酰胺：果糖-6-磷酸酰胺基转移酶，UDP-半乳糖神经酰胺半乳糖基转移酶，赖氨酰氧化酶，烯醇化酶，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，硬脂酰-辅酶A去饱和酶，环氧化物水解酶和醛缩酶C。

对于TTC设计更优选的酶是微粒体二肽酶，磷脂酶C，DT-黄递酶，二氢二醇脱氢酶，吡咯啉5′-羧基还原酶，羰基还原酶，赖氨酰羟化酶或基质金属蛋白质酶。

这些酶可以用来设计式(I)的化合物，

X-Y-Q (I)

其中

X是前部分，其设计为选择性地在肿瘤内在通过本发明方法发现的酶的作用下产生活性抗癌物质(Q-Y-H)；(Q-Y-)衍生自活性抗癌物质(Q-Y-H)的基团，其中Y是-O-，-S-或-N-。

式(I)的化合物可以在下文中详细描述。活性抗癌物质，(Q-Y-H)可以是任何抗-肿瘤药物。他们可以经(Q-Y-H)的结构中的-Y-H基团例如伯或仲氨基，羟基，或巯基与前部分相连，以这种方式其可以在通过本发明方法发现的酶的作用下自发地释放活性抗癌物质。更加具体地，(Q-Y-H)为细胞毒性剂，例如紫杉烷，喜树碱，抗癌核苷，多拉司他汀，和anthracyclin和法呢基转移酶抑制剂，EGF受体酪氨酸激酶抑制剂等。

优选的化合物是其中该活性抗癌物质(Q-Y-H)是选自下列的紫杉烷类

a)紫杉醇

[2aR-[2aα，4β，4aβ，6β，9α(αR^*，βS^*)，11α，12α，12aα，12bα]]-β-(苯甲酰基氨基)-α-羟基苯丙酸6，12b-二(乙酰氧基)-12-(苯甲酰氧基)-2a，评3，4，4a，5，6，9，10，11，12，12a，12b-十二氢-4，11-二羟基-4a，8，13，13-四甲基-5-氧代-7，11-桥亚甲基-1H-环癸并[3，4]苯并[1，2-b]氧杂环丁烷-9-基酯，

b)多西他赛

c)IDN 5109

d)BMS 188797

e)BMS 184476

还优选其中该活性抗癌物质(Q-Y-H)是选自下列的喜树碱的化合物

a)喜树碱

4(S)-乙基-4-羟基-1H-吡喃并[3′，4′：6，7]吲嗪并[1，2-b]喹啉-3，联14(4H，12H)-二酮，

b)拓扑替康

c)DX-8951f

d)BN-80915

e)9-氨基喜树碱

f)9-硝基喜树碱

4(S)-乙基-4-羟基-10-硝基-1H-吡喃并[3′，4′，：6，7]-吲嗪并[1，2-b]喹啉-3，14(4H，12H)-二酮，

g)(9S)-9-乙基-9-羟基-1-戊基-1H，12H吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮

h)(9S)-9-乙基-9-羟基-2-甲基-1-戊基-1H，12H吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮，

i)(9S)-9-乙基-9-羟基-2-羟基甲基-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′7′]吲嗪并[1′2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮。

还优选其中该活性抗癌物质(Q-Y-H)是选自下列的抗癌核苷的化合物

a)DFDC

2′-脱氧-2′，2′-二氟胞苷，

b)DMDC

2′-脱氧-2′-亚甲基胞苷，

c)FMDC

(E)-2′-脱氧-2′-(氟代亚甲基)胞苷，

d)Ara-C

1-(β-D-阿拉伯呋喃糖基)胞嘧啶，

e)地西他滨

4-氨基-1-(2-脱氧-β-D-赤型-戊呋喃糖基)-1，3，5-三嗪-2(1H)-酮，

f)曲沙他滨

g)氟达拉滨

2-氟-9-(5-O-膦酰基-β-D-阿拉伯呋喃糖基)-9H-嘌呤-6-胺，和

h)克拉屈滨

2-氯-2′-脱氧腺苷。

还优选其中该活性抗癌物质(Q-Y-H)是选自下列的多拉司他汀类的化合物

a)多拉司他汀10

b)多拉司他汀14

c)多拉司他汀15

d)TZT 1027

N，N-二甲基-L-缬氨酰基-N-[(1S，2R)-2-甲氧基-4-[(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-[(2-苯基乙基)氨基]丙基]-1-吡咯烷基]-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基]-N-甲基-L-缬氨酰胺，和

e)西马多丁

N，N-二甲基-L-缬氨酰基-L-缬氨酰基-N-甲基-L-缬氨酰基-L-脯氨酰基-N-(苯基甲基)-L-脯氨酸酰胺。

还优选其中该活性抗癌物质(Q-Y-H)是选自下列的蒽环(anthracycline)类的化合物

a)阿霉素

b)柔红霉素

8-乙酰基-10-[(3-氨基-2，3，6-三脱氧-L-来苏糖型-己吡喃糖基)氧基]-7，8，9，10-四氢-6，8，11-三羟基-1-甲氧基-并四苯-5，12-二酮，盐酸盐，和

c)去甲氧基柔红霉素：

还优选其中该活性抗癌物质(Q-Y-H)是选自下列的EGF受体酪氨酸激酶抑制剂的化合物

a)ZD 1839

b)CP 358774

N-(3-乙炔基苯基)-6，7-二(2-甲氧基乙氧基)-4-喹唑啉胺，

c)PD 158780

N⁴-(3-溴苯基)-N6-甲基吡啶并[3，4-d]嘧啶-4，6-二胺，和

d)GW 2016

还优选其中该活性抗癌物质(Q-Y-H)是法呢基转移酶抑制剂式6-[1-氨基-1-(4-氯苯基)-1-(1-甲基咪唑-5-基)甲基]-4-(3-氯苯基)-1-甲基喹啉-2(1H)-酮的R 115777的化合物。

本发明的式(II)的肿瘤靶向化合物，

其中Q和Y与上述定义相同；R⁰是天然或非天然氨基酸的侧链；Z是(C₁-C₃)亚烷基或-O-CH(R³)-，其中R³是氢或直链(C₁-C₄)烷基，R¹是氢或甲基；R²是氢，支链(C₃-C₁₀)烷基或(C₃-C₈)环烷基，其在微粒体二肽酶的作用下选择性地在肿瘤内产生活性抗癌物质，是下面例举说明的作为用上述方法发现的用酶设计的化合物的实例。但这些不限制本发明的范围。式(II)的化合物还包括其可药用盐。

在本发明中，用紫杉烷类作为活性抗癌药物和微粒体二肽酶作为活化酶设计的肿瘤靶向化合物的第一实例为通式(III)化合物

其中R⁰如同上述定义，R⁴是苯甲酰基或叔丁氧基羰基，和R⁵是氢或乙酰基，和其可药用盐。

式(III)中R⁰的优选实施方案为甲基，异丙基，2-甲基丙基，1-甲基丙基，苄基，吲哚-3-基甲基，和2-(甲硫基)乙基；更优选甲基，苄基，和2-甲基丙基。

本发明式(III)的优选化合物是下列化合物：

a)13-((2R，3S)-2-{(5S)-[5-((2S)-2-氨基-4-甲基-戊酰基氨基)-5-羟基羰基]戊酰基氧基}-3-苯甲酰基氨基-3-苯基丙酰氧基)-2α-苄氧基-4α，10β-二乙酰氧基-1β，7β-二羟基-5β，20-桥氧-tax-11-烯-9-酮，

b)13α-((2R，3S)-2-{(5S)-[5-((2S)-2-氨基-丙酰氧基氨基)-5-羟基羰基]戊酰基氧基}-3-苯甲酰基氨基-3-苯基丙酰氧基)-2α-苄氧基-4α，10β-二乙酰氧基-1β，7β-二羟基-5β，20-桥氧-tax-11-烯-9-酮，和d

c)13-((2R，3S)-2-{(5S)-[5-((2S)-2-氨基-3-苯基-丙酰氧基氨基)-5-羟基羰基]戊酰基氧基}-3-苯甲酰基氨基-3-苯基丙酰氧基)-2α-苄氧基-4α，10β-二乙酰氧基-1β，7β-二羟基-5β，20-桥氧-tax-11-烯-9-酮，

和其可药用盐。

微粒体二肽酶作用下肿瘤的选择性激活式(III)的化合物如图1所示。

图1

用核苷衍生物作为活性抗癌药物和微粒体二肽酶作为活化酶设计的肿瘤靶向化合物的第二实例如式(IV)所示，

其中R⁰，R¹，R²和R³与式(II)中定义相同，R⁶是氢，氟，羟基或氰基，R⁷是氢，氟或羟基或R⁶和R⁷一起构成亚甲基或氟代亚甲基，R⁸是氢或乙炔基，R⁹是氢，氟，乙烯基或乙炔基，和R¹⁰是氢或羟基，和其可药用盐。

本发明的一个优选实施方案涉及定义如上的式(IV)的化合物，其中R⁶是氢，氟，羟基，R⁷是氟或羟基或R⁶和R⁷一起构成亚甲基或氟代亚甲基。在本发明的另一优选实施方案中涉及上述式(IV)的化合物，其中R⁰是2-甲基丙基，环己基甲基，2-萘基甲基，4-苯基苄基，(4-环己基环己基)甲基，烷硫基甲基，环己硫基甲基或4-烷氧基苄基，和R³是氢或甲基。

包括在式(IV)中的活性核苷的优选实例是DFDC，DMDC，FMDC，Ara-C，地西他滨，曲沙他滨，2′-氰基-2′-脱氧胞苷，3′-乙炔基胞苷，5-氟-5′-脱氧胞苷，5-乙烯基-5′-脱氧胞苷等；更优选DFDC，DMDC和FMDC。

在式(IV)中R⁰的优选实施方案是亲脂性天然氨基酸的残基，(C8-C12)烷基，(C₃-C₈)环烷基甲基，取代的或未取代的苄基或萘基甲基，(C8-C12)烷硫基甲基，(C₃-C₈)环烷硫基甲基，更优选2-甲基丙基，环己基甲基，苄基，萘-2-基甲基，4-苯基苄基，甲硫基乙基，环己基硫甲基等。

本发明优选的式(IV)的化合物可以选自：

a)(2R)-((2S)-氨基-3-环己基-丙酰基氨基)-(3S)-[1-((4S)-羟基-(5R)-羟基甲基-3-亚甲基-四氢-呋喃-(2R)-基)-2-氧代-1，2-二氢-嘧啶-4-基氨基甲酰氧基]-丁酸，

b)(2R)-((2S)-氨基-4-甲基-戊酰基氨基)-(3S)-[1-((4S)-羟基-(5R)-羟基甲基-3-亚甲基-四氢-呋喃-(2R)-基)-2-氧代-1，2-二氢-嘧啶-4-基氨基甲酰氧基]-丁酸，

c)(2R)-((2S)-氨基-3-联苯基-4-基-丙酰基氨基)-(3S)-[1-((4S)-羟基-(5R)-羟基甲基-3-亚甲基-四氢-呋喃-(2R)-基)-2-氧代-1，2-二氢-嘧啶-4-基氨基甲酰氧基]-丁酸，

d)2(R)-[2(S)-氨基-3-联苯基-4-基-丙酰基氨基]-3-{1-[4(S)-羟基-5(R)-羟基甲基-3-亚甲基-四氢-呋喃-2(R)-基]-2-氧代-1，2-二氢-嘧啶-4-基氨基甲酰氧基}-丙酸，

e)(2R)-((2S)-氨基-3-萘-2-基-丙酰基氨基)-(3S)-[1-((4S)-羟基-(5R)-羟基甲基-3-亚甲基-四氢-呋喃-(2R)-基)-2-氧代-1，2-二氢-嘧啶-4-基氨基甲酰氧基]-丁酸，

f)(2R)-{(2S)-氨基-3-[4-(4-羟基-苯氧基)-苯基]-丙酰基氨基}-3-[1-((4S)-羟基-(5R)-羟基甲基-3-亚甲基-四氢-呋喃-2-基)-2-氧代-1，2-二氢-嘧啶-4-基氨基甲酰氧基]-丁酸，

g)(2R)-[(2S)-氨基-3-(4-甲氧基-苯基)-丙酰基氨基]-(3S)-[1-[(4S)-羟基-(5R)-羟基甲基-3-亚甲基-四氢-呋喃-2-基]-2-氧代-1，2-二氢-嘧啶-4-基氨基甲酰氧基]-丁酸，

h)(2R)-[(2S)-氨基-4-乙基硫烷基-丁酰基氨基]-(3S)-[1-[(4S)-羟基-(5R)-羟基甲基-3-亚甲基-四氢-呋喃-(2R)-基]-2-氧代-1，2-二氢-嘧啶-4-基氨基甲酰基]-丁酸，

i)(2R)-((2S)-氨基-3-环己基-丙酰基氨基)-(3S)-[1-(3，3-二氟-(4R)-羟基-(5R)-羟基甲基-四氢-呋喃-2-基)-2-氧代-1，2-二氢-嘧啶-4-基氨基甲酰氧基]-丁酸，

j)2(S)-[2(S)-氨基-3-环己基-丙酰基氨基)-3-[1-(3，3-二氟-4(R)-羟基-5(R)-羟基甲基-四氢-呋喃-2(R)-基)-2-氧代-1，2-二氢-嘧啶-4-基氨基甲酰氧基]-2(S)-甲基-丙酸，

k)2(R)-[2(S)-氨基-3-环己基-丙酰基氨基]-3-{1-[3，3-二氟-4(R)-羟基-5(R)-羟基甲基-四氢-呋喃-2(R)-基]-2-氧代-1，2-二氢-嘧啶-4-基氨基甲酰氧基}-2(R)-甲基-丙酸，

l)(2S，3S)-2-(2-氨基-3-环己基-丙酰基氨基)-3-[1-{(4R，5R)-3，3-二氟-4-羟基-5-羟基甲基-四氢-呋喃-2-基}-2-氧代-1，2-二氢-吡啶-4-基氨基甲酰氧基]-2-甲基-丁酸，

m)(2R，3R)-2-(2-氨基-3-环己基-丙酰基氨基)-3-[1-{(4R，5R)-3，3-二氟-4-羟基-5-羟基甲基-四氢-呋喃-2-基}-2-氧代-1，2-二氢-吡啶-4-基氨基甲酰氧基]-2-甲基-丁酸，和

n)(2R)-[(2S)-氨基-3-环己基-丙酰基氨基]-(3S)-[1-[(4S)-羟基-(5R)-羟基甲基-3-亚甲基-四氢-呋喃-(2R)-基]-2-氧代-1，2-二氢-嘧啶-4-基氨基甲酰氧基]-丁酸异丙酯，和

其可药用盐。

用核苷作为活性抗癌药物和微粒体二肽酶作为活化酶设计的肿瘤靶向化合物第三实例如式(V)所示，

其中m是2或3的整数，和R⁰，R²，R⁶，R⁷，R⁸，R⁹和R¹⁰与上述定义相同。

属于式(V)中的活性胞苷类似物的优选实施方案为DFDC，DMDC，FMDC，Ara-C，地西他滨，曲沙他滨，2′-氰基-2′-脱氧胞苷，3′-乙炔基胞苷，5-氟-5′-脱氧胞苷，5-乙烯-5′-脱氧胞苷等；更优选DFDC，DMDC，和FMDC。

在式(V)中R⁰的优选实施方案为环己基甲基，萘-2-基甲基，4-苯基苄基，苄基，吲哚-3-基甲基或4-烷氧基苄基，例如(4-低级烷氧基苯基)甲基例如4-甲氧基苄基，4-乙氧基苄基等。

本发明优选的式(V)化合物是下列化合物：

a)(2R)-[(2S)-氨基-3-(1H-吲哚-3-基)丙酰基氨基]-4-[1-((4S)-羟基-(5R)-羟基甲基-3-亚甲基四氢呋喃-2-基)-2-氧代-1，2-二氢嘧啶-4-基氨基甲酰基]-丁酸，

b)(2R)-((2S)-氨基-3-环己基丙酰基氨基)-4-[1-((4S)-羟基-(5R)-羟基甲基-3-亚甲基四氢呋喃-2-基)-2-氧代-1，2-二氢嘧啶-4-基氨基甲酰基]丁酸，

c)(2R)-((2S)-氨基-3-联苯基-4-基丙酰基氨基)-4-[1-((4S)-羟基-(5R)-羟基甲基-3-亚甲基四氢呋喃-2-基)-2-氧代-1，2-二氢嘧啶-4-基氨基甲酰基]丁酸，和

d)(2R)-((2S)-氨基-3-萘-2-基丙酰基氨基)-4-[1-((4S)-羟基-(5R)-羟基甲基-3-亚甲基四氢呋喃-2-基)-2-氧代-1，2-二氢嘧啶-4-基氨基甲酰基]丁酸，

和其可药用盐。

用喜树碱类作为活性抗癌药物和微粒体二肽酶作为活化酶设计的肿瘤靶向化合物的第四种实例如式(VI)所示，

其中m是1-3的整数，n是0-1的整数，R⁰如同式(II)中定义，R¹¹是氢或氟，R¹²是氢，氟，甲基或羟基，R¹³是氢，氨基，硝基，或(二-甲基氨基)甲基，R¹⁴是氢，(C₁-C₄)烷基，(4-甲基哌嗪基)甲基，(叔丁氧基亚氨基)甲基，或R¹³和R¹⁴，或R¹¹和R¹²一起构成5或6员环，其任选地含有1或2杂原子(s)并且可以任选地被1-3选自下列的取代基取代：(C₁-C₈)烷基，氨基，(C₁-C₈)烷基氨基和/或二-(C₁-C₄)烷基氨基，和其可药用盐。更优选，式(VI)的化合物特征在于R¹¹是氢，R¹²是氢或羟基，R¹³是氢或(二甲基氨基)甲基和R¹⁴是氢或乙基。在式(VI)中R⁰的优选实施方案为2-甲基丙基，环己基甲基，苄基，吲哚-3-基甲基，4-氨基丁基，4-氨基丙基；更优选2-甲基丙基，环己基甲基，苄基和吲哚-3-基甲基。

式(VI)的活性喜树碱类似物的优选实施方案为喜树碱，拓扑替康，SN-38，勒托替康，9-氨基喜树碱，9-硝基喜树碱，DX-8951f，BN-80915，(9S)-9-乙基-9-羟基-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮，9S)-9-乙基-9-羟基-2-甲基-1-戊基-1H，12H吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮和(9S)-9-乙基-9-羟基-2-羟基甲基-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′7′]吲嗪并[1′2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮等。

在式(VI)中R⁰的优选实施方案为2-甲基丙基，环己基甲基，苄基，吲哚-3-基甲基，4-氨基丁基，4-氨基丙基；更优选2-甲基丙基，环己基甲基，苄基和吲哚-3-基甲基。

本发明的式(VI)的优选化合物是下列化合物：

a)20-O-[(S)-色氨酰基-γ-(S)-谷氨酰基]-20-(S)-喜树碱，

b)20-O-[(S)-缬氨酰基-γ-(S)-谷氨酰基]-20(S)-喜树碱，

c)20-O-[(S)-苯基丙氨酰基-γ-(S)-谷氨酰基]-20(S)-喜树碱，

d)20-O-[(S)-亮氨酰基-γ-(S)-谷氨酰基]-20(S)-喜树碱，

e)20-O-[(R)-亮氨酰基-γ-(S)-谷氨酰基]-20(S)-喜树碱，

f)20-O-[(R)-苯基丙氨酰基-γ-(S)-谷氨酰基]-20(S)-喜树碱，

g)20-O-[(S)-色氨酰基-γ-(R)-谷氨酰基]-20(S)-喜树碱，

h)20-O-[(R)-色氨酰基-γ-(R)-谷氨酰基]-20(S)-喜树碱，

i)20-O-[(S)-苯基丙氨酰基-γ-(R)-谷氨酰基]-20(S)-喜树碱，

j)20-O-[(S)-亮氨酰基-γ-(R)-谷氨酰基]-20(S)-喜树碱，

k)20-O-[(R)-色氨酰基-γ-(S)-谷氨酰基]-20(S)-喜树碱，

l)20-O-[(R)-苯基丙氨酰基-γ-(R)-谷氨酰基]-20(S)-喜树碱，

m)20-O-[(R)-亮氨酰基-γ-(R)-谷氨酰基]-20(S)-喜树碱，

n)7-乙基-10-羟基-20-O-[(R)-色氨酰基-(R)-高谷氨酰基]-20(S)-喜树碱，

o)7-乙基-10-羟基-20-O-[(R)-色氨酰基-γ-(R)-谷氨酰基]-20(S)-喜树碱，

p)7-乙基-10-羟基-20-O-[(S)-苯基丙氨酰基-γ-(R)-谷氨酰基]-20(S)-喜树碱，

q)7-乙基-10-羟基-20-O-[(S)-苯基丙氨酰基-γ-(S)-天冬氨酰基]-20(S)-喜树碱，

r)7-乙基-10-羟基-20-O-[(S)-亮氨酰基-γ-(S)-天冬氨酰基]-20(S)-喜树碱，

s)20-O-[(S)-色氨酰基-β-(R)-天冬氨酰基]-20(S)-喜树碱，

t)20-O-[(S)-苯基丙氨酰基-β-(R)-天冬氨酰基]-20(S)-喜树碱，

u)20-O-[(R)-苯基丙氨酰基-β-(R)-天冬氨酰基]-20(S)-喜树碱，

v)20-O-[(S)-苯基丙氨酰基-β-(S)-天冬氨酰基]-20(S)-喜树碱，

w)20-O-[(S)-亮氨酰基-β-(R)-天冬氨酰基]-20(S)-喜树碱，

x)20-O-[(S)-缬氨酰基-β-(R)-天冬氨酰基]-20(S)-喜树碱，

y)7-乙基-10-羟基-20-O-[(S)-环己基丙氨酰基-(R)-谷氨酰基]-20(S)-喜树碱，

z)7-乙基-10-羟基-20-O-[(S)-环己基丙氨酰基-(S)-谷氨酰基]-20(S)-喜树碱，

aa)20-O-[(S)-赖氨酰基-γ-(S)-谷氨酰基]-20-(S)-喜树碱，和

bb)20-O-[(S)-鸟氨酰基-γ-(S)-谷氨酰基]-20-(S)-喜树碱，

cc)(9S)-9-乙基-9-[(L)-色氨酰基-(L)-γ-谷氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮盐酸盐，

dd)(9S)-9-乙基-9-[(L)-环己基丙氨酰基-(D)-γ-谷氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮盐酸盐，

ee)(9S)-9-乙基-9-[(L)-苯基丙氨酰基-(D)-γ-谷氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮盐酸盐，

ff)(9S)-9-乙基-9-[(L)-亮氨酰基-(D)-γ-谷氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮盐酸盐，

gg)(9S)-9-乙基-9-[(L)-赖氨酰基-(L)-γ-谷氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮二盐酸盐，

hh)(9S)-9-乙基-9-[(L)-缬氨酰基-(D)-γ-谷氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮盐酸盐，

ii)(9S)-9-乙基-9-[(L)-鸟氨酰基-(L)-γ-谷氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮二盐酸盐，

jj)(9S)-9-乙基-9-[(L)-亮氨酰基-(D)-γ-谷氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮甲磺酸盐，

kk)(9S)-9-乙基-9-[(D)-赖氨酰基-(L)-γ-谷氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮二盐酸盐，

ll)(9S)-9-乙基-9-[(L)-苯基丙氨酰基-(L)-γ-天冬氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮盐酸盐，

mm)(9S)-9-乙基-9-[(L)-环己基丙氨酰基-(D)-γ-天冬氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮盐酸盐，

nn)(9S)-9-乙基-9-[(L)-环己基丙氨酰基-(L)-γ-天冬氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮盐酸盐，

oo)(9S)-9-乙基-9-[(L)-色氨酰基-(L)-γ-天冬氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮盐酸盐，

pp)(9S)-9-乙基-9-[(L)-鸟氨酰基-(D)-γ-谷氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮二盐酸盐，

qq)(9S)-9-乙基-9-[(L)-亮氨酰基-(D)-γ-天冬氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮盐酸盐，

rr)(9S)-9-乙基-9-[(L)-缬氨酰基-(D)-γ-天冬氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮盐酸盐，

ss)(9S)-9-乙基-9-[(L)-亮氨酰基-(L)-γ-天冬氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮盐酸盐，

tt)(9S)-9-乙基-9-[(L)-环己基甘氨酰基-(L)-γ-谷氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮盐酸盐，

uu)(9S)-9-乙基-9-[(D)-环己基丙氨酰基-(L)-γ-谷氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮盐酸盐，

vv)(9S)-9-乙基-9-[(L)-赖氨酰基-(D)-γ-谷氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮二盐酸盐，

ww)(9S)-9-乙基-9-[(L)-色氨酰基-(D)-γ-谷氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮盐酸盐，

xx)(9S)-9-乙基-9-[(L)-亮氨酰基-(L)-γ-谷氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮盐酸盐，

yy)(9S)-9-乙基-9-[甘氨酰基-(D)-γ-谷氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮盐酸盐，

zz)(9S)-9-乙基-9-[(L)-丙氨酰基-(D)-γ-谷氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮盐酸盐，

aaa)(9S)-9-乙基-9-[(L)-苯基丙氨酰基-(D)-γ-天冬氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮盐酸盐

所述盐游离化合物和其可药用盐。

式(VI)化合物的更优选实施方案是下列化合物：

a)20-O-[(S)-色氨酰基-γ-(S)-谷氨酰基]-20(S)-喜树碱，

b)20-O-[(S)-亮氨酰基-γ-(S)-谷氨酰基]-20(S)-喜树碱，

c)20-O-[(S)-色氨酰基-γ-(R)-谷氨酰基]-20(S)-喜树碱，

d)20-O-[(S)-亮氨酰基-γ-(R)-谷氨酰基]-20(S)-喜树碱，

e)7-乙基-10-羟基-20-O-[(S)-苯基丙氨酰基-β-(R)-谷氨酰基]-20(S)-喜树碱，

f)7-乙基-10-羟基-20-O-[(S)-苯基丙氨酰基-β-(S)-天冬氨酰基]-20(S)-喜树碱，

g)20-O-[(S)-苯基丙氨酰基-β-(S)-天冬氨酰基]-20(S)-喜树碱，

h)7-乙基-10-羟基-20-O-[(S)-环己基丙氨酰基-(R)-谷氨酰基]-20(S)-喜树碱，

i)7-乙基-10-羟基-20-O-[(S)-环己基丙氨酰基-(S)-谷氨酰基]-20(S)-喜树碱，

j)9S)-9-乙基-9-[(L)-色氨酰基-(L)-γ-谷氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮盐酸盐，

k)(9S)-9-乙基-9-[(L)-环己基丙氨酰基-(D)-γ-谷氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮盐酸盐，

l)(9S)-9-乙基-9-[(L)-苯基丙氨酰基-(D)-γ-谷氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮盐酸盐，

m)(9S)-9-乙基-9-[(L)-亮氨酰基-(D)-γ-谷氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮盐酸盐，

n)(9S)-9-乙基-9-[(L)-赖氨酰基-(L)-γ-谷氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮二盐酸盐，

o)(9S)-9-乙基-9-[(L)-缬氨酰基-(D)-γ-谷氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮盐酸盐，

p)(9S)-9-乙基-9-[(L)-鸟氨酰基-(L)-γ-谷氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮二盐酸盐，

q)(9S)-9-乙基-9-[(L)-亮氨酰基-(D)-γ-谷氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮甲磺酸盐，

r)(9S)-9-乙基-9-[(D)-赖氨酰基-(L)-γ-谷氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮二盐酸盐，

s)(9S)-9-乙基-9-[(L)-苯基丙氨酰基-(L)-β-天冬氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮盐酸盐，

t)(9S)-9-乙基-9-[(L)-环己基丙氨酰基-(D)-β-天冬氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮盐酸盐，

u)(9S)-9-乙基-9-[(L)-环己基丙氨酰基-(L)-β-天冬氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮盐酸盐，

v)(9S)-9-乙基-9-[(L)-色氨酰基-(L)-β-天冬氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮盐酸盐，

w)(9S)-9-乙基-9-[(L)-鸟氨酰基-(D)-γ-谷氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮二盐酸盐，

x)(9S)-9-乙基-9-[(L)-亮氨酰基-(D)-β-天冬氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮盐酸盐，

y)(9S)-9-乙基-9-[(L)-缬氨酰基-(D)-β-天冬氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮盐酸盐，

z)(9S)-9-乙基-9-[(L)-亮氨酰基-(L)-β-天冬氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮盐酸盐，

aa)(9S)-9-乙基-9-[(L)-环己基甘氨酰基-(L)-γ-谷氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮盐酸盐，

bb)(9S)-9-乙基-9-[(D)-环己基丙氨酰基-(L)-γ-谷氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮盐酸盐，

cc)(9S)-9-乙基-9-[(L)-赖氨酰基-(D)-γ-谷氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮二盐酸盐，

dd)(9S)-9-乙基-9-[(L)-色氨酰基-(D)-γ-谷氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮盐酸盐，

ee)(9S)-9-乙基-9-[(L)-亮氨酰基-(L)-γ-谷氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮盐酸盐，

ff)(9S)-9-乙基-9-[甘氨酰基-(D)-γ-谷氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮盐酸盐，

gg)(9S)-9-乙基-9-[(L)-丙氨酰基-(D)-γ-谷氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮盐酸盐，

hh)(9S)-9-乙基-9-[(L)-苯基丙氨酰基-(D)-β-天冬氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮盐酸盐

所述盐游离化合物和其他可药用盐。

式(VI)的化合物的最优选实施方案为(9S)-9-乙基-9-[(L)-赖氨酰基-(L)-γ-谷氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮二盐酸盐，该盐游离化合物和其他可药用盐。

式(I)的化合物可以通过化合物Q-Y-H与X的反应性衍生物的缩合反应来制备。这些反应是所属领域已知的，例如式(II)，(III)，(V)和(VI)的化合物可以通过式(VII)的化合物的缩合反应来制备，并且式(IV)的化合物可以通过式(VIII)的化合物按照下述的缩合反应来制备。

式(II)，(III)，(V)和(VI)的化合物可以通过式(VII)化合物，

其中P₁和P₂分别为氨基和羧基保护基，R⁰和m与上述定义相同，和适当保护的抗癌物质例如紫杉醇，胞苷衍生物或喜树碱类用缩合剂例如二环己基碳二亚胺，BOP，HBTU，TNTU，PyBroP^TM，PyBOP^TM，TBTU，TSTU，HOBt[市售偶联剂：参见The Combinatorial Chemistry Catalog，Feb.，1997；Novabiochem.]等的缩合反应，随后脱除保护基来制备。

在上文中，氨基和羧基保护基P1和P2，以及缩合反应本身是所属领域技术人员已知的。[参见The practice of Peptide Synthesis，M.Bodansky和A.Bodansky/第2版，1994(Springer-Verlag)]。

式(IV)的化合物可以通过式(VIII)的化合物的缩合反应，

其中P₁，P₂，R⁰，R¹，和R³与上述定义相同，和适当保护的胞苷衍生物用缩合剂例如氯甲酸4-硝基苯基酯和光气的缩合反应，随后除去保护基来制备。

该反应可以在溶剂例如二氯甲烷，吡啶，N，N-二甲基甲酰胺，N-甲基吡咯烷酮，乙腈等中在存在或不存在碱例如三乙胺，二-异丙基乙胺，吡啶，N，N-二甲基氨基吡啶等下在-20℃至+50℃，优选0℃至+25℃的温度下进行。

当使用氨基和/或羧基-保护的二肽用于该缩合反应时，可以通过所属领域技术人员已知的方法进行氨基保护基的脱除，例如用三氟乙酸处理脱除Boc基团，哌啶用于Fmoc基团，或四丁基氟化铵用于2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基(Teoc)，三甲基甲硅烷基乙基和叔丁基二甲基甲硅烷基，和催化氢化用于Cbz基团。

用于制备式(VII)和(VIII)的二肽衍生物的氨基酸衍生物或者可商购或者通过文献中所述的已知方法来制备(例如J.Am.Chem.Soc.2000，122，762-766；J.Org.Chem.1998 5240；Tetrahedron Asymmetry 1995，1741；Tetrahedron Asymmetry 1998，4249)。S-烷基-半胱氨酸衍生物或者通过氨基/羧基-保护的半胱氨酸衍生物与烷化剂的S-烷基化反应制备，或氨基/羧基-保护的丝氨酸衍生物的羟基被溴原子置换、随后与硫醇衍生物的取代反应来制备。O-烷基-酪氨酸衍生物通过氨基/羧基-保护的酪氨酸衍生物与烷化剂的O-烷化反应来制备。

这些二肽衍生物可以通过所属领域技术人员已知的常规肽化学来制备[参见The practice of Peptide Synthesis，M.Bodansky和A.Bodansky/第二版，1994(Springer-Verlag)]。

随后用重组酶和/或表达或不表达高水平的TTC-活化酶的细胞提取物来测试TTCs在某些酶作用下的选择性活化作用。人体造血祖细胞也用作不表达或只表达低水平的TTC-活化酶的细胞。通过表达该酶的cDNAs在细菌和其他细胞(包括昆虫细胞和哺乳动物细胞)中可以产生TTC-活化酶的重组蛋白质。基本表达高水平的TTC-活化酶的细胞系也通过转染质粒来产生，其中TTC-活化酶的cDNA是强组成型启动子的克隆下游，包括巨细胞病毒(CMV)启动子(Foecking，M.K.和Hofstetter，H.“哺乳动物表达载体的有力且多用增强启动子单位”Gene.45，101-105(1986))。由此，TTC-活化酶在转染子中的转录是在强组成型启动子的控制下。通过将TTCs与重组TTC-活化酶和/或表达或不表达TTC-活化酶的细胞提取物一起温育，并且通过用HPLC和/或LCMS测量TTCs和活性药物的量来测试TTCs的活化作用。

除了带有TTC-活化酶的cDNAs的附加模板的细胞以外，人体和动物的不同组织提取物也用来确定TTCs的肿瘤特异性活化作用。分析所用的肿瘤和正常组织包括得自小鼠、大鼠、猴子和人的脑，心脏、肺、胃、肠、结肠、肝脏、肾脏、血液和骨髓的组织。

TTCs的选择性作用进一步通过比较表达高水平的TTC-活化酶的细胞与那些表达非常低水平的TTC-活化酶的细胞之间TTCs对细胞的生长抑制作用来确定。细胞的生长抑制通过在TTCs存在或不存在下培养细胞后定量分析成活细胞来测定。

其活化由微粒体二肽酶介导的化合物是由该化合物对表达低水平的微粒体二肽酶的细胞、那些表达高水平微粒体二肽酶的细胞，和离体扩展的粒细胞祖细胞的生长的抑制活性来判断。人结肠癌细胞系，HCT116(American Type Culture Collection No.CCL-247)，和粒细胞祖细胞用作只表达低水平的微粒体二肽酶的细胞。一种稳定的转染子HCT116c/S5用作表达高水平的微粒体二肽酶的细胞，与CMV启动子相连的人体微粒体二肽酶cDNA(此后称作MDP)被转染在其中。二肽酶cDNA(Satoh等，Biotechnol.Prog.10(2)，134-140(1994))和其他参考文献)和所述克隆方法是所属领域已知的。将HCT116，HCT116/S5，和粒细胞祖细胞在药物存在和不存在的条件下培养，并且测定与没有用药物培养的细胞相比表示产生50％生长抑制作用所需的药物的浓度的IC50值，和将HCT116，HCT116/S5，和粒细胞祖细胞进行比较。虽然细胞暴露于药物下的持续时间依赖于细胞和药物而变化，但可以是24小时，96或168小时。当细胞在药物的存在下培养24小时时，通过更换培养基除去培养基中的药物，并且细胞继续温育72小时，之后测量药物的IC50值。

各实施例4，16，17，31，39，49-1，49-2，49-3，49-4和49-11中的化合物的生物学数据

细胞毒性(IC50nM)[药物接触时间：24小时]
细胞毒性(IC50nM)[药物接触时间：24小时]				化合物	HCT116	HCT116/S5	CFU-GM
紫杉醇实施例4喜树碱实施例31SN38实施例39实施例49-1实施例49-2实施例49-4实施例49-3实施例49-11	2.551193003.723331815＞50＞50	2.45.15.6182.22.83.32.62.12.913	16546.11701.820613154250120	化合物	HCT116	HCT116/S5	CFU-GM

细胞毒性(IC50nM)[药物接触时间：96小时] [药物接触时间：168小时]
细胞毒性(IC50nM)[药物接触时间：96小时] [药物接触时间：168小时]				化合物	HCT116	HCT116/S5	CFU-GM
DMDC实施例16实施例17	0.21.70.99	0.30.230.098	0.072.81.1	化合物	HCT116	HCT116/S5	CFU-GM

HCT116：人结肠癌细胞系，HCT116/S5：HCT116转染有人微粒体二肽酶cDNA，CFU-GM：人造血祖细胞

由此，与那些现有细胞毒性剂相比，在临床情况下希望TTCs的显著改进的功效和安全性能，尤其是脊髓毒性。

本发明的另一实施方案涉及含有上述化合物的药物组合物。优选这些组合物适合于口服或非肠道给药。

如上所述，含有式I的化合物的药物也是本发明的目的，以及制备此类药物的方法，该方法包括使一种或多种式I的化合物与，如果需要，一种或多种其他治疗上有价值的物质形成盖伦制剂给药形式。

药物组合物可以经口服给药，例如以片剂、包衣片、糖锭剂、硬或软明胶胶囊、溶液剂、乳液剂或混悬剂的形式。给药也可以经直肠进行，例如利用栓剂；局部或经皮，例如利用软膏、霜剂、凝胶或溶液；或经非肠道，例如利用可注射溶液。

为了制备药物制剂(片剂、包衣片、糖锭剂或硬明胶胶囊)这些化合物可以与治疗上惰性的、无机或有机载体一起配制。乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石粉、硬脂酸或其盐可以作为载体用于片剂、包衣片、糖锭剂和硬明胶胶囊。适合软明胶胶囊的载体是植物油、蜡、脂肪、半固体或液体多元醇。然而，在软明胶胶囊的情况中一般需要依赖于活性物质非载体的性质。制备溶液和糖浆剂的适合载体是水、多元醇、蔗糖、转化糖和葡萄糖。注射溶液的适合载体是水、醇、多元醇、甘油和植物油。栓剂的适合载体是天然或硬化油、蜡、脂肪和半液体多元醇。

药物制剂也可以含有防腐剂、增溶剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、甜味剂、着色剂、矫味剂、改变渗透压的盐、缓冲剂、包衣剂或抗氧剂。它们也可以含有其他治疗上有价值的物质。

剂量可以在宽范围内变化并且当然将在各种具体情况中针对个体要求来调整。通常，在口服或非肠道给药成年人的情况中，约5mg/m²-500mg/m²的日剂量是适宜的。虽然当作为权宜之计时可以超过上限。日剂量可以以单剂量或分份剂量给药，或用于口服或非肠道给药，可以连续输注给药。

本发明的另一实施方案涉及上述抗癌化合物在制备药物中的用途，所述药物优选用于细胞增殖性疾病的治疗，例如用于癌症，例如结肠直肠癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、子宫颈癌和膀胱癌的治疗。

本发明还涉及一种治疗细胞增殖性疾病的方法，所述疾病例如癌症，例如实体肿瘤，或结肠直肠癌，肺癌，乳腺癌，胃癌，子宫颈癌和膀胱癌，包括向需要的患者给药治疗有效量的上述抗癌化合物。

本发明还涉及治疗中使用的上述化合物。

具体而言，本发明涉及以下内容：

第一项：一种鉴定用于设计在肿瘤中选择性地转化为活性物质的抗癌化合物酶的方法，该方法包括比较基因和/或蛋白质在正常和肿瘤来源的人体组织和/或细胞中的表达水平，并且选择其mRNA和/或蛋白质水平在肿瘤组织中比在正常细胞或组织中高两倍以上的酶。

第二项：第一项的方法，其中所述的酶是通过DNA微阵、聚合酶链反应、RNA印迹和原位杂交、差别展示、RNase保护分析、蛋白质列阵、蛋白质印迹、双向凝胶电泳或酶联免疫吸附测定的分析来鉴定。

第三项：第二项的方法，其中该酶通过DNA微阵或聚合酶链反应的分析来测定。

第四项：第一至第三项中任一项的方法，其中正常细胞或组织来自由骨髓或脐带血、肠或皮肤的造血祖细胞。

第五项：第一至第三项中任一项的方法，其中人体肿瘤的组织和/或细胞来自脑、肺、食道、乳腺、胃、胰腺、肝脏、结肠、直肠、肾脏、卵巢、子宫、膀胱、前列腺、皮肤和血液。

第六项：通过第一至第五项中任一项的方法鉴定的酶在获得、鉴定和/或设计可以选择性地在肿瘤中转化为活性物质的抗癌化合物中的用途。

第七项：第六项的用途，其中该酶是微粒体二肽酶，芳基硫酸酯酶A，吡咯啉5′-羧基还原酶，脱氢二醇脱氢酶，羰基还原酶，赖氨酰羟化酶，氨酰脯氨酸二肽酶，二氢嘧啶酶，谷氨酰胺：果糖-6-磷酸酰胺基转移酶，UDP-半乳糖神经酰胺半乳糖基转移酶，赖氨酰氧化酶，烯醇化酶，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，硬脂酰-辅酶A去饱和酶，环氧化物水解酶或醛缩酶C。

第八项：第七项的用途，其中该酶是微粒体二肽酶，二氢二醇脱氢酶，吡咯啉5′-羧基还原酶，羰基还原酶和赖氨酰基羟化酶，优选微粒体二肽酶。

第九项：一种鉴定可以选择性地在肿瘤内转化为活性物质的抗癌化合物的方法，包括下列步骤

(a)产生表达酶的细胞，其蛋白质水平在肿瘤组织中比在正常细胞或组织中高两倍以上；和

(b)测定抗癌化合物的生长抑制活性。

第十项：第九项的方法，其中该酶是第六至第九项的酶。

第十一项：式(I)的抗癌化合物，

X-Y-Q (I)

其中X是前部分，其设计为通过权利要求6-9任一项的酶选择性地在肿瘤内产生活性抗癌物质(Q-Y-H)；Q-Y-衍生自活性抗癌物质(Q-Y-H)的基团，其中Y是-O-，-S-或-N-，

和其可药用盐。

第十二项：第十一项的化合物，其中活性抗癌物质(Q-Y-H)的基团(Q-Y-)是紫杉烷类，喜树碱类，抗癌核苷，多拉司他汀，蒽环霉素，法呢基转移酶抑制剂或EGF受体酪氨酸激酶抑制剂的。

第十三项：第十二项的化合物，其中该活性抗癌物质(Q-Y-H)是选自下列的紫杉烷类

a)紫杉醇

[2aR-[2aα，4β，4aβ，6β，9α(αR^*，βS^*)，11α，12α，12aα，12bα]]-β-(苯甲酰基氨基)-α-羟基苯丙酸6，12b-二(乙酰氧基)-12-(苯甲酰氧基)-2a，3，4，4a，5，6，9，10，11，12，12a，12b-十二氢-4，11-二羟基-4a，8，13，13-四甲基-5-氧代-7，11-桥亚甲基-1H-环癸并[3，4]苯并[1，2-b]oxet-9-基酯，

b)多西他赛

[2aR-[2aα，4β，4aα，6β，9α(αR^*，βS^*，11α，12α，12aα，12bα)]-β-[[(1，1-二甲基乙氧基)羰基]氨基]-α-羟基苯丙酸12b-(乙酰氧基)-12-(苯甲酰氧基)-2a，3，4，4a，5，6，9，10，11，12，12a，12b-十二氢-4，6，11-三羟基-4a，8，13，13-四甲基-5-氧代-7，11-桥亚甲基-1H-环癸并[3，4]苯并[1，2-b]oxet-9-基酯，

c)IDN 5109

(2R，3S)-3-[[(1，1-二甲基乙氧基)羰基]氨基]-2-羟基-5-甲基-4-己烯酸(3aS，4R，7R，8aS，9S，10aR，12aS，12bR，13S，13aS)-7，12a-二(乙酰氧基)-13-(苄氧基)-3a，4，7，8，8a，9，10，10a，12，12a，12b，13-十二氢-9-羟基-5，8a，14，14-四甲基-2，8-二氧代-6，13a-桥亚甲基-13aH-oxeto[2″，3″：5′，6′]苯并[1′，2′：4，5]环癸并[1，2-d]-1，3-二氧杂环戊烯-4-基酯，

d)BMS 188797

(2R，3S)-β-(苯甲酰基氨基)-α-羟基苯丙酸(2aR，4S，4aS，6R，9S，11S，12S，12aR，12bS)-6-(乙酰氧基)-12-(苯甲酰氧基)-2a，3，4，4a，5，6，9，10，11，12，12a，12b-十二氢-4，11-二羟基-12b-[(甲氧基羰基)氧基]-4a，8，13，13-四甲基-5-氧代-7，11-桥亚甲基-1H-环癸并[3，4]苯并[1，2-b]oxet-9-基酯，和

e)BMS 184476

(2R，3S)-β-(苯甲酰基氨基)-α-羟基苯丙酸(2aR，4S，4aS，6R，9S，11S，12S，12aR，12bS)-6，12b-二(乙酰氧基)-12-(苯甲酰氧基)-2a，3，4，4a，5，6，9，10，11，12，12a，12b-十二氢-11-羟基-4a，8，13，13-四甲基-4-[(甲硫基)甲氧基]-5-氧代-7，11-桥亚甲基-1H-环癸并[3，4]苯并[1，2-b]oxet-9-基酯。

第十四项：第十二项的化合物，其中该活性抗癌物质(Q-Y-H)是选自下列的喜树碱类

a)喜树碱：

b)拓扑替康：

c)DX-8951f

d)BN-80915

c)9-氨基喜树碱

f)9-硝基喜树碱

g)(9S)-9-乙基-9-羟基-1-戊基-1H，12H吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮，

第十五项：第十二项的化合物，其中该活性抗癌物质(Q-Y-H)是选自下列的抗癌核苷类

a)DFDC

2′-脱氧-2′，2′-二氟胞苷，

b)DMDC

2′-脱氧-2′-亚甲基胞苷，

c)FMDC

(E)-2′-脱氧-2′-(氟代亚甲基)胞苷，

d)Ara-C

1-(β-D-阿拉伯呋喃糖基)胞嘧啶，

e)地西他滨

4-氨基-1-(2-脱氧-β-D-赤型-戊呋喃糖基)-1，3，5-三嗪-2(1H)-酮，

f)曲沙他滨

g)氟达拉滨

2-氟-9-(5-O-膦酰基-β-D-阿拉伯呋喃糖基)-9H-嘌呤-6-胺，和

h)克拉屈滨

2-氯-2′-脱氧腺苷。

第十六项：第十二项的化合物，其中该活性抗癌物质(Q-Y-H)是选自下列的多拉司他汀类

a)多拉司他汀10

b)多拉司他汀14

c)多拉司他汀15

d)TZT 1027

e)西马多丁

第十七项：第十二项的化合物，其中该活性抗癌物质(Q-Y-H)是选自下列的蒽环类

a)阿霉素

b)柔红霉素

c)去甲氧基柔红霉素：

第十八项：第十二项的化合物，其中该活性抗癌物质(Q-Y-H)是EGF受体酪氨酸激酶抑制剂或法呢基转移酶抑制剂。

第十九项：第十八项的化合物，其中该活性抗癌物质(Q-Y-H)是选自下列的EGF受体酪氨酸激酶抑制剂：

a)ZD 1839

b)CP 358774

N-(3-乙炔基苯基)-6，7-二(2-甲氧基乙氧基)-4-喹唑啉胺，

c)PD 158780

N⁴-(3-溴苯基)-N6-甲基吡啶并[3，4-d]嘧啶-4，6-二胺，和

d)GW 2016

第二十项：第十八项的化合物，其中该活性抗癌物质(Q-Y-H)是法呢基转移酶抑制剂式6-[1-氨基-1-(4-氯苯基)-1-(1-甲基咪唑-5-基)甲基]-4-(3-氯苯基)-1-甲基喹啉-2(1H)-酮的R 115777。

第二十一项：第十一项的式(II)表示的化合物，

其中

Q和Y如权利要求11中定义，

R⁰是天然或非天然氨基酸的侧链

Z是(C₁-C₃)亚烷基或-O-CH(R³)-，其中R³是氢或直链(C₁-C₄)烷基，

R¹是氢或甲基，和

R²是氢，支链(C₃-C₁₀)烷基或(C₃-C₈)环烷基，

或其可药用盐。

第二十二项：第二十一项的化合物，其中(Q-Y-H)是紫杉醇或式(III)的多西他赛，

其中

R⁰如权利要求21定义，

R⁴是苯甲酰基或叔丁氧基羰基，和

R⁵是氢或乙酰基，

或其可药用盐。

第二十三项：第二十二项的化合物其中R⁰是甲基，苄基或2-甲基丙基。

第二十四项：第二十二项和第二十三项的化合物，选自

b)13α-((2R，3S)-2-{(5S)-[5-((2S)-2-氨基-丙酰氧基氨基)-5-羟基羰基]戊酰基氧基}-3-苯甲酰基氨基-3-苯基丙酰氧基)-2α-苄氧基-4α，10β-二乙酰氧基-1β，7β-二羟基-5β，20-桥氧-tax-11-烯-9-酮，和

和其可药用盐。

第二十五项：第二十一项的化合物，其中(Q-Y-H)是抗癌核苷，由式(IV)所示，

其中

R⁰，R¹，R²和R³如权利要求21定义，

R⁶是氢，氟，羟基或氰基，

R⁷是氢，氟或羟基，

或R⁶和R⁷一起构成亚甲基或氟代亚甲基，

R⁸是氢或乙炔基，

R⁹是氢，氟，乙烯基或乙炔基，和

R¹⁰是氢或羟基，

和其可药用盐。

第二十六项：第二十五项的化合物，其中

R⁶是氢，氟，羟基，

R⁷是氟或羟基

或R⁶和R⁷一起构成亚甲基或氟代亚甲基。

第二十七项：第二十五项和/或第二十六项的化合物，其中

R⁰是2-甲基丙基，环己基甲基，2-萘基甲基，4-苯基苄基，(4-环己基环己基)甲基，烷硫基甲基，环己硫基甲基或4-烷氧基苄基，和

R³是氢或甲基。

第二十八项：第二十五项-二十七项中任一项的化合物，选自

c)(2R)-((2S)-氨基-3-联苯-4-基-丙酰基氨基)-(3S)-[1-((4S)-羟基-(5R)-羟基甲基-3-亚甲基-四氢-呋喃-(2R)-基)-2-氧代-1，2-二氢-嘧啶-4-基氨基甲酰氧基]-丁酸，

d)2(R)-[2(S)-氨基-3-联苯-4-基-丙酰基氨基]-3-{1-[4(S)-羟基-5(R)-羟基甲基-3-亚甲基-四氢-呋喃-2(R)-基]-2-氧代-1，2-二氢-嘧啶-4-基氨基甲酰氧基}-丙酸，

h)(2R)-[(2S)-氨基-4-乙基硫基-丁酰基氨基]-(3S)-[1-[(4S)-羟基-(5R)-羟基甲基-3-亚甲基-四氢-呋喃-(2R)-基]-2-氧代-1，2-二氢-嘧啶-4-基氨基甲酰基]-丁酸，

j)2(-S)-[2(S)-氨基-3-环己基-丙酰基氨基)-3-[1-(3，3-二氟-4(R)-羟基-5(R)-羟基甲基-四氢-呋喃-2(R)-基)-2-氧代-1，2-二氢-嘧啶-4-基氨基甲酰氧基]-2(S)-甲基-丙酸，

其可药用盐。

第二十九项：第二十一项的化合物，其中(Q-Y-H)是抗癌核苷，由式(V)所示，

其中

m是2或3的整数，和

R⁰，R²，R⁶，R⁷，R⁸，R⁹和R¹⁰如权利要求25定义，

和其可药用盐。

第三十项：第二十九项的化合物，其中

R⁶是氢，氟或羟基，

R⁷是氟或羟基，

或R⁶和R⁷一起构成亚甲基或氟代亚甲基。

第三十一项：第二十九项和第三十项的化合物，其中R⁰是环己基甲基，2-萘基甲基，4-苯基苄基，苄基，吲哚-3-基甲基或4-烷氧基苄基。

第三十二项：第二十九项至第三十一项中任一项的化合物，选自

和其可药用盐。

第三十三项：第二十一项的化合物，其中(Q-Y-H)是喜树碱或其衍生物，由式(VI)所示，

其中

m是1-3的整数，

n是0-1的整数，

R⁰如权利要求22定义，

R¹¹是氢或氟，

R¹²是氢，氟，甲基或羟基，

R¹³是氢，氨基，硝基或(二甲基氨基)甲基，

R¹⁴是氢，(C₁-C₄)烷基，(4-甲基哌嗪基)甲基或(叔丁氧基亚氨基)甲基

或R¹³和R¹⁴，或R¹¹和R¹²一起构成5或6员环，其任选含有1或2个杂原子(s)，并且任选被1-3个选自(C₁-C₈)烷基，氨基，(C₁-C₈)烷基氨基和/或二-(C₁-C₄)烷基氨基的取代基取代，

和其可药用盐。

第三十四项：第三十三项的化合物，其中R¹¹是氢，R¹²是氢或羟基，R¹³是氢或(二甲基氨基)甲基和R¹⁴是氢或乙基。

第三十五项：第三十三项和第三十四项的化合物，其中R⁰是2-甲基丙基，环己基甲基，苄基，吲哚-3-基甲基，4-氨基丁基，或4-氨基丙基。

第三十六项：第三十三项至第三十五项中任一项的化合物，选自

a)20-O-[(S)-色氨酰基-γ-(S)-谷氨酰基]-20-(S)-喜树碱，

b)20-O-[(S)-缬氨酰基-γ-(S)-谷氨酰基]-20(S)-喜树碱，

c)20-O-[(S)-苯基丙氨酰基-γ-(S)-谷氨酰基]-20(S)-喜树碱，

d)20-O-[(S)-亮氨酰基-γ-(S)-谷氨酰基]-20(S)-喜树碱，

e)20-O-[(R)-亮氨酰基-γ-(S)-谷氨酰基]-20(S)-喜树碱，

f)20-O-[(R)-苯基丙氨酰基-γ-(S)-谷氨酰基]-20(S)-喜树碱，

g)20-O-[(S)-色氨酰基-γ-(R)-谷氨酰基]-20(S)-喜树碱，

h)20-O-[(R)-色氨酰基-γ-(R)-谷氨酰基]-20(S)-喜树碱，

i)20-O-[(S)-苯基丙氨酰基-γ-(R)-谷氨酰基]-20(S)-喜树碱，

j)20-O-[(S)-亮氨酰基-γ-(R)-谷氨酰基]-20(S)-喜树碱，

k)20-O-[(R)-色氨酰基-γ-(S)-谷氨酰基]-20(S)-喜树碱，

l)20-O-[(R)-苯基丙氨酰基-γ-(R)-谷氨酰基]-20(S)-喜树碱，

m)20-O-[(R)-亮氨酰基-γ-(R)-谷氨酰基]-20(S)-喜树碱，

s)20-O-[(S)-色氨酰基-β-(R)-天冬氨酰基]-20(S)-喜树碱，

t)20-O-[(S)-苯基丙氨酰基-β-(R)-天冬氨酰基]-20(S)-喜树碱，

u)20-O-[(R)-苯基丙氨酰基-β-(R)-天冬氨酰基]-20(S)-喜树碱，

v)20-O-[(S)-苯基丙氨酰基-β-(S)-天冬氨酰基]-20(S)-喜树碱，

w)20-O-[(S)-亮氨酰基-β-(R)-天冬氨酰基]-20(S)-喜树碱，

x)20-O-[(S)-缬氨酰基-β-(R)-天冬氨酰基]-20(S)-喜树碱，

aa)20-O-[(S)-赖氨酰基-γ-(S)-谷氨酰基]-20-(S)-喜树碱，和

bb)20-O-[(S)-鸟氨酰基-γ-(S)-谷氨酰基]-20-(S)-喜树碱，

hh)(9S)-9-乙基-9-[(L)-缬氨酰基-(D)-γ-谷氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮盐酸盐

ll)(9S)-9-乙基-9-[(L)-苯基丙氨酰基-(L)-β-天冬氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮盐酸盐，

mm)(9S)-9-乙基-9-[(L)-环己基丙氨酰基-(D)-β-天冬氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮盐酸盐，

nn)(9S)-9-乙基-9-[(L)-环己基丙氨酰基-(L)-β-天冬氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮盐酸盐，

oo)(9S)-9-乙基-9-[(L)-色氨酰基-(L)-β-天冬氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮盐酸盐，

qq)(9S)-9-乙基-9-[(L)-亮氨酰基-(D)-β-天冬氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮盐酸盐，

rr)(9S)-9-乙基-9-[(L)-缬氨酰基-(D)-β-天冬氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮盐酸盐，

ss)(9S)-9-乙基-9-[(L)-亮氨酰基-(L)-β-天冬氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮盐酸盐，

aaa)(9S)-9-乙基-9-[(L)-苯基丙氨酰基-(D)-β-天冬氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮盐酸盐，

所述盐游离化合物和其他可药用盐。

第三十七项：第三十三项和第三十四项的化合物，其是(9S)-9-乙基-9-[(L)-赖氨酰基-(L)-γ-谷氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮二盐酸盐，该盐游离化合物和其他可药用盐。

第三十八项：第十一项至第三十七项中任一项的式(I)的化合物的方法，其中化合物Q-Y-H与X的反应性衍生物缩合。

第三十九项：一种含有第十一项至第三十七项中任一项的化合物的药物组合物。

第四十项：适合口服或非肠道给药的第三十九项的药物组合物。

第四十一项：第十一项至第三十七项中任一项的抗癌化合物在制备药物中的用途。

第四十二项：第四十一项的用途，用于制备治疗细胞增殖性疾病的药物。

第四十三项：第四十一项或第四十二项的用途，用于制备治疗癌症的药物。

第四十四项：第四十一项至第四十三项中任一项的用途，用于制备治疗结肠直肠癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、子宫颈癌和膀胱癌的药物。

第四十五项：一种治疗细胞增殖性疾病的方法，包括向需要的患者给药治疗有效量的第十一项至第三十七项中任一项的抗癌化合物。

第四十六项：第四十四项的方法，其中所述的细胞增殖性疾病是癌症。

第四十七项：第四十五项和第四十六项的方法，其中癌症为实体瘤。

第四十八项：第四十五项至第四十七项中任一项的方法，其中所述的癌症为结肠直肠癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、子宫颈癌和膀胱癌。

第四十九项：用于治疗的第十一项至第三十七项中任一项的化合物。

下列实施例仅仅举例说明鉴定酶和/或在所述酶的作用下能够激活化合物的蛋白质的方法和制备本发明化合物的方法，其不限制本发明的范围。

实施例

实施例1

通过低聚核苷酸微阵法和RT-PCR测定在人体肿瘤和

正常人体组织中的不同mRNA水平

1-1.由人体组织萃取RNA

将41个人体结肠直肠肿瘤，30个胃部肿瘤，41个非小细胞肺癌，24个乳腺肿瘤，15个卵巢肿瘤，53个肝细胞癌，和15个非肿瘤性肝脏组织小片(各约125mm³)和10⁷离体扩展的粒细胞祖细胞在液氮中快速冷冻。为了由人体组织和细胞萃取RNA，使它们悬浮在TRIZOL(Life Technologies，Gaithersburg，USA，目录号15596-018)或Sepasol-RNAI(Nacalai tesque，Kyoto，Japan，目录号306-55)并且用Polytron(Kinematica，Littau，Switzerland)均化两次(在最高速下5秒)。加入三氯甲烷之后，将组织匀浆在15,000xg下离心10分钟，并且收集含有RNA的水相。全细胞RNA用异丙醇沉淀，用70％乙醇洗涤1次并且悬浮在DEPC-处理的水中(LifeTechnologies，Gaithersburg，USA，目录号10813-012)。RNA用1.5单位的DNase I(Life Technologies，Gaithersburg，USA，目录号18068-015)处理之后，RNA再用TRIZOL/三氯甲烷萃取，用乙醇沉淀且溶于DEPC-处理的水中。此后，小分子量的核苷酸用RNeasy小试剂盒(QIAGEN，Hilden，Germany，目录号74104)按照制造商的说明手册除去。当纯化的RNA在琼脂糖凝胶上电泳并用溴化乙锭染色时，清楚地检测出28S和18S核糖体RNA，并且溴化乙锭结合28S RNA产生的荧光高于由与18S RNA结合所产生的荧光。纯化的全RNA储存在-80℃的70％乙醇溶液中直至用于cDNA合成。

1.2cDNA和标记cRNA探针的合成

cDNA是利用反相SuperScript Choice System(Life Technologies，Gaithersburg，USA，目录号18090-019)按照制造商的说明手册合成。将5微克纯化的全RNA用低聚-dT引物杂交(Sawady Technology，Tokyo，Japan)，该引物含有T7启动子的序列和200单位的SuperScriptII反转录酶，并且在42℃下温育1小时。所得cDNA用苯酚/三氯甲烷萃取且用Phase Lock Gel^TM Light(Eppendorf，Hamburg，Germany，目录号0032005.101)纯化。

CRNA也是用MEGAscript T7试剂盒(Ambion，Austin，USA，目录号1334)并且用cDNA作为模板按照制造商的说明合成。约5μg的cDNA与2μl酶混合物一起在37℃下温育6小时，该混合物含有T7聚合酶，各7.5mM的三磷酸腺苷(ATP)和三磷酸鸟苷(GTP)，各5.625mM的三磷酸胞苷(CTP)和三磷酸尿苷(UTP)，各1.875mM的Bio-11-CTP和Bio-16-UTP(ENZO Diagnostics，Farmingdale，USA，目录号分别为42818和42814)。通过在CHROMA SPIN+STE-100柱(CLONTECH，Palo Alto，USA，目录号K1302-2)上的柱色谱除去单核苷酸和短的低聚核苷酸，和洗脱液中的cRNA通过加入乙醇沉积。当通过凝胶琼脂糖电泳分离出0.1微克的cRNA且用溴化乙锭染色时，cRNA的长度在300个碱基-3千个碱基。纯化的cRNA储存在低于-80℃的70％乙醇溶液中直至使用为止。

1-3.肿瘤和正常组织的基因表达分析

来自肝癌患者的人体原发性肿瘤的基因表达模式通过高密度低聚核苷酸微阵(microarrays)(HuGeneFL array，Affymetrix，Santa Clara，USA，目录号510137)(Lipshutz，R.L.等Nature Genet.21，20-24(1999))检测。为了使低聚核苷酸杂交在碎片上，cRNA在95℃下在含有40mM Tris(Sigma，St.Louis，USA，目录号T1503)-乙酸(Wako，Osaka，Japan，目录号017-00256)(pH8.1)，100mM乙酸钾(Wako，Osaka，Japan，目录号160-03175)，和30mM乙酸镁(Wako，Osaka，Japan，目录号130-00095)的缓冲剂中片段化35分钟。杂交在200μl的含有0.1M 2-(N-Morpholino)乙磺酸(MES)(Sigma，St.Louis，USA，目录号M-3885)，(pH6.7)，1MNaCl(Nacalai tescque，Tokyo，Japan，目录号313-20)，0.01％聚氧化烯(10)辛基苯基醚(Wako，Osaka，Japan，目录号168-11805)，20μg青鱼精液DNA(Promega，Maddison，USA，目录号D181B)，100μg乙酰化牛血清白蛋白(Sigma，St.Louis，USA，目录号B-8894)，10μg的片段化cRNA，和生物素化控制的低聚核苷酸，生物素-5′-CTGAACGGTAGCATCTTGAC-3′(Sawady technology，Tokyo，Japan)的缓冲液中在45℃下进行12小时。该碎片用含有0.01M MES(pH6.7)，0.1MNaCl，0.001％聚氧化乙烯(10)辛基苯基醚缓冲液洗涤后，该碎片用生物素化的抗-链霉抗生物素抗体(Funakoshi，Tokyo，Japan，目录号BA0500)温育并且按照说明手册(Affymetrix，Santa Clara，USA)所述用链霉抗生物素R-藻红蛋白(Molecular Probes，Eugene，USA，目录号S-866)染色来增强杂交信号。用激光扫描器(Affymetrix，Santa Clara，USA)收集各像素水平且各cDNA的表达水平和可靠性(有/无信号)用Affymetrix GeneChip ver.3.3和Affymetrix Microarray Suite ver.4.0软件计算。由该实验，测定出约6000基因表达在41个人体结肠直肠肿瘤，30个胃肿瘤，41个非小细胞肺癌，24个乳腺肿瘤，15个卵巢肿瘤，53个肝细胞癌，和15个非肿瘤性肝脏组织和10批独立培养的粒细胞祖细胞(每批10⁷细胞)中。

实施例2

优先表达在肿瘤而不是粒细胞祖细胞和肝脏中的酶的选择

2-1.离体粒细胞祖细胞的扩展

得自人体脐带血和骨髓的CD34-阳性单核细胞购自Veritas(Veritas Co，Tokyo，Japan，目录号CB009F，ABM019F)，和在汇合成片的单层MS5(Itoh，K.，等“鼠科骨髓的造血基质细胞的繁殖建立”Exp.Hematol.17，145-153(1989))上培养。小鼠基质细胞系处于37℃和5％CO₂加湿空气下在αMEM培养基中(Life Technologies，Gaithersburg，USA，目录号12571-0063)，该培养基补充有10％(v/v)马血清(HS)(Stem细胞Technologies，Vancouver，Canada，目录号06750)，10％(v/v)胎牛血清(FBS)(Stem细胞Technologies，Vancouver，Canada，目录号06450)，50ng/ml Flt3配体(PeproTec EC.，London，UK.，目录号300-19)，100ng/mlSCF(PeproTech EC，London，UK.，目录号300-07)，和50ng/mlTPO(PeproTech EC，London，England，目录号300-18)。收集漂浮的造血细胞且用抗PerCP-抗-CD34的单克隆抗体(BD pharMingen，SanDiego，USA，目录号340430)，PE-抗-CD13(BD pharMingen，SanDiego，USA，目录号30525X)和FITC-抗-15(BD pharMingen，SanDiego，USA，目录号PM30525X)染色。将5微升的各抗体加入到50μl的细胞混悬液中且在4℃下温育25分钟。用含有10％(v/v)FCS的PBS洗涤后，用FACSCalibur，(Becton Dickinson，Franklin Lakes，New Jersey，USA)按照FACSCalibur培养手册(FACStation ver1.1.Becton Dickinson，Franklin Lakes，New Jersey，USA.)检测CD抗原的表达。FACS分析揭示了90％以上的单核细胞在上述条件下扩展后表达CD34祖细胞标记。当这些CD34阳性细胞用50ng/ml的G-CSF处理时(Souza，L.M.，等“重组人体粒细胞集落刺激因子：作用于正常和白血病性骨髓细胞”.Science 232，61-65(1986)。Pepro Tech EC，London，UK.目录号300-23.)，80％以上的细胞在7天中分化为CD34-阴性，CD13-和CD15-阳性成髓细胞和髓细胞，并且进一步在14天中在加入G-CSF后分化为嗜中性白细胞。

2-2.优先表达在肿瘤而不是粒细胞祖细胞和其他非肿瘤性组织中的cDNAs

DNA碎片实验在粒细胞祖细胞和肝脏中产生数百cDNAs，其中mRNA被认为不存在(通过无信号判断)或只表达为非常低的水平(通过平均差小于50来判断)，但在50％以上的患者中在乳腺、肝脏、胃、结肠直肠、胰腺或卵巢的肿瘤中表达(通过有信号判断)达到一定水平(通过片剂差高于200判断)。在这样的cDNAs中，选择编码具有已知催化活性的蛋白质的150个以上的cDNAs。那些酶包括磷脂酶C，微粒体二肽酶，芳基硫酸酯酶A，DT-黄递酶，吡咯啉5′-羧基还原酶，脱氢二醇脱氢酶，羰基还原酶，赖氨酰基羟化酶，脯肽酶，二氢嘧啶酶，γ-谷氨酰基转肽酶，谷酰胺：果糖-6-磷酸酰胺转移酶，UDP-半乳糖神经酰胺半乳糖基转移酶，赖氨酰氧化酶，烯醇化酶，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，尿苷磷酸化酶，硬脂酰-辅酶去饱和酶，环氧化物水解酶，醛缩酶C。

2-3.动力学RT-PCR分析

TTC-活化酶的cDNA的mRNA的水平也通过动力学RT-PCR检验。动力学RT-PCR通过实时荧光PCR体系来完成。利用LightCycler体系(RocheDiagnostics，Mannheim，Germany，目录号2011468)的PCR扩增在20μl的反应混合物中进行，该混合物由含有Taq DNA聚合酶，反应缓冲剂，dNTP混合物和SYBR Green I染料(LightCycler-DNA Master SYBR Green I，Roche Diagnostics，Mannheim，Germany，目录号2158817)，4mM氯化镁(Nacalai tescque，Tokyo，Japan，目录号7791-18-6)，10μmoles的PCR引物(Sawady Technology，Tokyo，Japan)的主要混合物，和2μl的存在于LightCycler毛细管(Roche Diagnostics，Mannheim，Germany，目录号1909339)中的模板cDNA组成。扩展人体微粒体二肽酶cDNA引物的序列为ATCGACTTGGCTCACGTGTCTGTGG，和TGTGATCCAGATGGTCGGCCACTTG。扩展在LightCycler中通过40个循环的95℃下温育0秒用于变性、57-60℃下3-10秒用于退火和在72℃下10秒用于扩展，并且温度斜率为20℃/秒。通过测量各扩增循环中退火期结束时的荧光信号达到实时PCR监测。正常肺、心脏、肝脏、肾脏、肠、结肠、皮肤和脑的cDNAs用购自Strate Gene的RNA(Strategene，La Jolla，USA，目录号：脑为D6030-01，结肠为D6050-01，心脏D6064-01，小肠为D6065-01，肾脏为D6070-01，肝脏为D6080-01，皮肤为D6115-01)合成。

为了使分离的RNA的完整性合格且规范化靶向序列的拷贝数，对于甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的动力学RT-PCR分析也利用杂交探针进行。靶向mRNA和GAPDH mRNA的外标通过质粒DNA的10倍连续稀释液(10³-10⁸)来制备。各样本中mRNA的评定参考标准曲线，在各时间点，按照LightCycler软件(LightCycler software version 3，Roche Diagnostics，Mannheim，Germany)自动进行。扩增GAPDH cDNA的引物的序列为

TCTCCAGAACATCATCCCTGCCTCTAC和TGCTGTAGCCAAATTCGTTGTCATACC。

尽管在肾脏和小肠中检测到微粒体二肽酶，但在肺、心脏、胃、结肠和肝脏中未检测到。然而，在12个结肠肿瘤中检测到的微粒体二肽酶mRNA的水平明显高于在肾脏和小肠中的。

微粒体二肽酶mRNA在人体组织中的水平

mRNA水平(与GAPDH mRNA的比例)

组织微粒体二肽酶mRNA/GAPDH mRNA

结肠直肠肿瘤 2.6

粒细胞祖细胞 0.02

结肠 0.06

皮肤＜0.01

脑＜0.01

心脏＜0.01

肝脏 0.03

肾脏 0.58

小肠 0.37

实施例3

13α-((2R，3S)-2-{(5S)-[5-((2S)-2-氨基-4-甲基-戊酰基氨基)-5-羟基羰基]戊酰基氧基}-3-苯甲酰基氨基-3-苯基丙酰氧基)-2α-苄氧基-4α，10β-二乙酰氧基-1β，7β-二羟基-5β，20-桥氧-tax-11-烯-9-酮甲酸盐

a)2α-苄氧基-13α-((2R，3S)-3-苯甲酰基氨基-2-羟基-3-苯基丙酰氧基)-4α，10β-二乙酰氧基-1β，7β-二羟基-5β，20-桥氧-tax-11-烯-9-酮(紫杉醇)(50.6mg)，1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(13.9mg)，二甲基氨基吡啶(1.0mg)，和(2S)-2-((2S)-2-苄氧基羰基氨基-4-甲基-戊酰基氨基)己二酸1-苄酯(31.9mg)在二氯甲烷(2.0ml)中的混合物在室温下搅拌22小时。该反应用水(3ml)中止，并且分离有机层。水层用二氯甲烷萃取2次。合并的有机层用盐水洗涤并且用无水硫酸钠干燥，随后真空浓缩。该混合物通过硅胶柱色谱纯化，用二氯甲烷-乙酸乙酯(2∶1)洗脱，得到13α-((2R，3S)-2-{(5S)-[5-((2S)-2-苄氧基羰基氨基-4-甲基-戊酰基氨基)-5-苄氧基羰基]戊酰基氧基}-3-苯甲酰基氨基-3-苯基丙酰氧基)-2α-苄氧基-4α，10β-二乙酰氧基-1β，7β-二羟基-5β，20-桥氧-tax-11-烯-9-酮，其为黄色固体(74.8mg，97.6％)。

b)上面获得的13α-((2R，3S)-2-{(5S)-[5-((2S)-2-苄氧基羰基氨基-4-甲基-戊酰基氨基)-5-苄氧基羰基]戊酰基氧基}-3-苯甲酰基氨基-3-苯基丙酰氧基)-2α-苄氧基-4α，10β-二乙酰氧基-1β，7β-二羟基-5β，20-桥氧-tax-11-烯-9-酮(31.3mg)，10％Pd/C(7.1mg)，和甲酸(0.42ml)在甲醇(6.0ml)中的混合物在H₂的存在下于室温下搅拌6.5小时。过滤该混合物和真空浓缩滤液得到13α-((2R，3S)-2-{(5S)-[5-((2S)-2-氨基-4-甲基-戊酰基氨基)-5-羟基羰基]戊酰基氧基}-3-苯甲酰基氨基-3-苯基丙酰氧基)-2α-苄氧基-4α，10β-二乙酰氧基-1β，7β-二羟基-5β，20-桥氧-tax-11-烯-9-酮甲酸盐盐，其为浅黄色固体(23.6mg，91％)。

¹H-NMR(CDCl₃)：δ0.8～0.9(6H，m)，0.98(3H，s)，1.20(3H，s)，1.48(3H，s)，1.2～1.6(2H，m)，1.55～1.8(7H，m)，1.75(3H，s)，2.16(3H，s)，2.3～2.5(6H，m)，2.25(3H，s)，3.50(1H，br)，3.80(1H，m)，3.95(2H，m)，4.08(1H，m)，4.7～4.9(3H，m)，5.32(1H，d，J＝11Hz)，5.39(1H，d，J＝8Hz)，5.50(1H，t，J＝9Hz)，5.78(1H，drt，J＝8.8Hz)，6.29(1H，s)，7.17(1H，m)，7.4～7.8(11H，m)，7.87(2H，m)，7.98(2H，m)，9.28(1H，d，J＝11Hz)；ESI-MS：m/z1110(M⁺-HCO₂H)。

下列实施例4和5中的化合物由(2S)-2-((2S)-2-苄氧基羰基氨基-3-苯基-丙酰基氨基)己二酸1-苄酯或(2S)-2-((2S)-2-苄氧基羰基氨基-丙酰基氨基)己二酸1-苄酯、以类似于实施例3的方法制备。

实施例4

13α-((2R，3S)-2-{(5S)-[5-((2S)-2-氨基-丙酰氧基氨基)-5-羟基羰基]戊酰基氧基}-3-苯甲酰基氨基-3-苯基丙酰氧基)-2α-苄氧基-4α，10β-二乙酰氧基-1β，7β-二羟基-5β，20-桥氧-tax-11-烯-9-酮甲酸盐

¹H-NMR(CDCl₃)：δ1.04(3H，s)，1.10(3H，s)，1.20(3H，d，J＝11Hz)，1.49(3H，s)，1.5～1.8(6H，m)，1.75(3H，s)，2.14(3H，s)，2.3～2.5(6H，m)，2.25(3H，s)，3.50(1H，br)，3.80(1H，m)，3.98(2H，m)，4.12(1H，m)，4.7～4.9(3H，m)，5.32(1H，d，J＝11Hz)，5.42(1H，d，J＝8Hz)，5.52(1H，t，J＝9Hz)，5.80(1H，drt，J＝8.8Hz)，6.39(1H，s)，7.18(1H，m)，7.4～7.8(11H，m)，7.87(2H，m)，7.98(2H，m)，9.31(1H，d，J＝11Hz)；ESI-MS：m/z1068(M⁺-HCO₂H)。

实施例5

13α-((2R，3S)-2-{(5S)-[5-((2S)-2-氨基-3-苯基-丙酰氧基氨基)-5-羟基羰基]戊酰基氧基}-3-苯甲酰基氨基-3-苯基丙酰氧基)-2α-苄氧基-4α，10β-二乙酰氧基-1β，7β-二羟基-5β，20-桥氧-tax-11-烯-9-酮甲酸盐

¹H-NMR(CDCl₃)：δ0.98(3H，s)，1.00(3H，s)，1.47(3H，s)，1.4～1.8(6H，m)，1.75(3H，s)，2.08(3H，s)，2.3～2.5(8H，m)，2.20(3H，s)，3.60(1H，br)，3.80(1H，m)，3.98(2H，m)，4.10(1H，m)，4.70(1H，br)4.9(2H，br)，5.31(1H，d，J＝11Hz)，5.40(1H，d，J＝8Hz)，5.53(1H，t，J＝9Hz)，5.79(1H，drt，J＝8.8Hz)，6.29(1H，s)，7.15～7.30(6H，m)，7.4～7.8(11H，m)，7.87(2H，m)，7.98(2H，m)，9.31(1H，d，J＝11Hz)；ESI-MS：m/z 1144(M⁺-HCO₂H)。

实施例6

(2R)-((2S)-氨基-3-环己基-丙酰基氨基)-(3S)-[1-((4S)-羟基-(5R)-羟基甲基-3-亚甲基-四氢-呋喃-(2R)-基)-2-氧代-1，2-二氢-嘧啶-4-基氨基甲酰氧基]-丁酸。

a)向搅拌的2.5g(8.09mmol)BOC-D-Thr(Bzl)-OH在200mLCH₂Cl₂(脱水)中的溶液内加入1.3mL(8.9mmol)的2-(三甲基甲硅烷基)乙醇，0.5g(4.04mmol)的DMAP和2.3g(12.13mmol)的WSC HCl。该混合物在Ar下室温下搅拌5小时。该反应通过加入水中止，并且分离有机层。水层用EtOAc萃取。合并的有机层用水和盐水洗涤。该萃取液用无水Na₂SO₄干燥并且过滤。减压下除去溶剂。粗产物通过在SiO₂上快速色谱纯化(洗脱剂：20％EtOAc/己烷)，得到(3S)-苄氧基-(2R)-叔丁氧基羰基氨基-丁酸2-三甲基甲硅烷基-乙酯，其为无色粘性油(2.66g，79％)。

¹H-NMR：(270MHz，CDCl₃)δ0.02(9H，s)，0.90(2H，d.d.d，J＝6.6，3.3，2.6Hz)，1.23(3H，d，J＝6.3Hz)，1.43(9H，s)，4.03-4.26(4H，m)，4.34(1H，d，J＝12.0Hz AB)，4.54(1H，d，J＝12.0Hz AB)，5.26(1H，d，J＝9.6Hz)，7.18-7.33(5H，m)；MS：(LCMS)m/z 410[M+H]⁺，432[M+Na]⁺。

b)室温下向搅拌的2.68g(6.55mmol)的(3S)-苄氧基-(2R)-叔丁氧基羰基氨基-丁酸2-三甲基甲硅烷基-乙酯在50mL CH₂Cl₂(脱水)中的溶液内加入4.5ml TFA。将该混合物搅拌7小时且该混合物在减压下浓缩得到(2R)-氨基-(3S)-苄氧基-丁酸2-三甲基甲硅烷基-乙酯三氟-乙酸盐，其为浅黄色粘性油(3.555g，定量)。该产物用于下面反应步骤无需进一步纯化。

¹H-NMR：(270MHz，CDCl₃)δ0.03(9H，s)，0.88(2H，d.d.d，J＝11.9，5.9，5.3Hz)，1.36(3H，d，J＝6.3Hz)，3.94(1H，d，J＝3.3Hz)，4.11(2H，m)，4.23(1H，d.d，J＝10.2，6.9Hz)4.37(1H，d，J＝11.9Hz AB)，4.61(1H，d，J＝11.9Hz AB)，5.26(1H，d，J＝9.6Hz)，7.18-7.34(5H，m)；MS：(LCMS)m/z 310[M+H]⁺。

c)向搅拌的181.6mg(0.439mmol)的(2R)-氨基-(3S)-苄氧基-丁酸2-三甲基甲硅烷基-乙酯三氟-乙酸盐在5mL CH₂Cl₂(脱水)中的溶液内室温下加入131mg(0.484mmol)N-BOC-(L)-环己基丙氨酸和170mg(0.878mmol)WSC+HCl。

将该混合物在Ar下室温下搅拌18小时。该反应通过加入水中止，并且分离有机层。水层用EtOAc萃取。合并的有机层用水和盐水洗涤。该萃取液用无水Na₂SO₄并且过滤。减压下除去溶剂。粗产物通过在SiO₂上快速色谱纯化(洗脱剂：10％EtOAc/己烷)得到(3S)-苄氧基-(2R)-((2S)-叔丁氧基羰基氨基-3-环己基-丙酰基氨基)-丁酸2-三甲基甲硅烷基-乙酯，其为无色粘性油(63.1mg，26％)。

¹H-NMR：(270MHz，CDCl₃)δ0.02(9H，s)，0.91(2H，d.d.d，J＝10.2，7.5，6.9Hz)，0.24-1.82(13H，m)，1.21(3H，d，J＝6.3Hz)，1.43(9H，s)，4.03-4.26(3H，m)，4.37(1H，d，J＝11.9Hz AB)，4.57(1H，d，J＝11.9Hz AB)，4.59(1H，d.d，J＝9.6，2.3Hz)，4.83(1H，m)，6.77(1H，d，J＝8.9Hz)，7.21-7.64(5H，m)；MS：(LCMS)m/z 563[M+H]⁺。

d)室温下向搅拌的61.3mg(0.109mmol)(3S)-苄氧基-(2R)-((2S)-叔丁氧基羰基氨基-3-环己基-丙酰基氨基)-丁酸2-三甲基甲硅烷基-乙酯在10mL CH₂Cl₂(脱水)中的溶液内加入1.0mL TFA。将该混合物搅拌1小时且随后减压下浓缩得到(2R)-((2S)-氨基-3-环己基-丙酰基氨基)-3-苄氧基-丁酸2-三甲基甲硅烷基-乙酯三氟-乙酸盐，其为无色粘性油(77.9mg，定量)。该产物用于下面反应步骤无需进一步纯化。

¹H-NMR(270MHz，CDCl₃)：δ0.02(9H，s)，0.88(2H，m)，0.8-1.74(13H，m)，1.19(3H，d，J＝6.3Hz)，4.00-4.21(3H，m)，4.11(2H，m)，4.35(1H，d，J＝11.9Hz AB)，4.54(1H，d.d，J＝8.2，2.3Hz)，4.57(1H，d，J＝11.9Hz AB)，7.20-7.35(5H，m)；MS：(LCMS)m/z 463[M+H]⁺。

e)室温下向搅拌的75.5mg(0.131mmol)的(2R)-((2S)-氨基-3-环己基-丙酰基氨基)-3-苄氧基-丁酸2-三甲基甲硅烷基-乙酯三氟-乙酸盐在5.0mL THF中的溶液内滴加到130mL 1mol/l NaOH。反应混合物的pH调整至pH 7。随后，将74mg(0.262mmol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基对硝基苯基碳酸酯加入到该反应混合物且该混合物在油浴中升温至60℃。在60℃下搅拌1天后，该混合物冷却至室温且该混合物用EtOAc(20mL)和水(20mL)稀释，并且分离有机层。水层用EtOAc萃取。合并的有机层用水和盐水洗涤。该萃取液用无水Na₂SO₄干燥并且过滤。减压下除去溶剂。粗产物通过在SiO₂上快速色谱纯化(洗脱剂：10％to15％EtOAc/己烷)得到(3S)-苄氧基-(2R)-[3-环己基-(2S)-(2-三甲基甲硅烷基-乙氧基羰基氨基)-丙酰基氨基]-丁酸2-三甲基甲硅烷基-乙酯，其为无色粘性油(49.2mg，62％)。

¹H-NMR：(270MHz，CDCl₃)δ0.02(18H，s)，0.87-1.04(6H，m)，1.10-1.28(2H，m)，1.21(3H，d，J＝6.3Hz)，1.37-1.57(3H，m)，1.67-1.83(6H，m)，4.03-4.23(4H，m)，4.36(1H，m)，4.38(1H，d，J＝11.9Hz AB)，4.58(1H，d，J＝11.9Hz AB)，4.59(1H，d.d，J＝9.2，2.3Hz)，4.97(1H，m)，6.68(1H，d，J＝9.2Hz)，7.23-7.36(5H，m)；MS：(LCMS)m/z 607[M+H]⁺，629[M+Na]⁺。

f)向38.9mg(0.064mmol)的(3S)-苄氧基-(2R)-[3-环己基-(2S)-(2-三甲基甲硅烷基-乙氧基羰基氨基)-丙酰基氨基]-丁酸2-三甲基甲硅烷基-乙酯在10mL EtOAc中的搅拌溶液内加入10％Pd/C。该反应混合物在H₂氛下剧烈搅拌。搅拌2小时后，经短塞力特硅藻土填料柱过滤该混合物。减压下浓缩滤液得到(2R)-[3-环己基-(2S)-(2-三甲基甲硅烷基-乙氧基羰基氨基)-丙酰基氨基]-(3S)-羟基-丁酸2-三甲基甲硅烷基-乙酯，其为无色粘性油。该产物用于下面反应步骤无需进一步纯化。

¹H-NMR(270MHz，CDCl₃)：δ0.04(9H，s)，0.05(9H，s)，0.09-1.07(6H，m)，1.11-1.30(2H，m)，1.22(3H，d，J＝6.3Hz)，1.37-1.56(3H，m)，1.67-1.82(6H，m)，2.09(1H，d，J＝5.3Hz)，4.15-4.36(7H，m)，4.54(1H，d.d，J＝8.9，2.6Hz)，4.95(1H，d，J＝7.6Hz)，6.76(1H，d，J＝8.6Hz)；MS：(LCMS)m/z 517[M+H]⁺，539[M+Na]⁺。

g)室温下向搅拌的39.1mg(0.075mmol)的(2R)-[3-环己基-(2S)-(2-三甲基甲硅烷基-乙氧基羰基氨基)-丙酰基氨基]-(3S)-羟基-丁酸2-三甲基甲硅烷基-乙酯在5.0mL CH₂Cl₂(脱水)中的溶液内加入30mg(0.151mmol)的三氯甲酸4-硝基苯基酯和1.0mL吡啶。

搅拌3小时后，该反应通过加入水中止，和分离有机层。水层用EtOAc萃取。合并的有机层用水和盐水洗涤。该萃取液用无水Na₂SO₄干燥并且过滤。减压下除去溶剂。粗产物通过在SiO₂上快速色谱纯化(洗脱剂：20％EtOAc/己烷)得到(2R)-[3-环己基-(2S)-(2-三甲基甲硅烷基-乙氧基羰基氨基)-丙酰基氨基]-(3S)-(4-硝基-苯氧基羰氧基)-丁酸2-三甲基甲硅烷基-乙酯，其为无色固体(64.7mg)。

¹H-NMR(270MHz，CDCl₃)：δ0.02(9H，s)，0.04(9H，s)，0.97-1.04(6H，m)，1.17-1.38(3H，m)，1.41(3H，d，J＝6.3Hz)，1.47-1.83(8H，m)，4.16-4.33(5H，m)，4.84(1H，d.d，J＝9.2，2.6Hz)，4.90(1H，m)，7.38(2H，d，J＝9.2Hz)，8.2(2H，d，J＝9.2Hz)；MS：(LCMS)m/z 681[M+H]⁺。

h)室温下向搅拌的62.2mg(0.09mmol)的(2R)-[3-环己基-(2S)-(2-三甲基甲硅烷基-乙氧基羰基氨基)-丙酰基氨基]-(3S)-(4-硝基-苯氧基羰氧基)-丁酸2-三甲基甲硅烷基-乙酯在5mL THF(脱水)中的溶液内加入到85mg(0.182mmol)3′，5′-二-叔丁基二甲基甲硅烷基-DMDC。油浴中使该反应混合物升温至60℃。搅拌4天后，该混合物冷却至室温并且该混合物减压下浓缩。油性残余物溶于EtOAc且用饱和NaHCO₃，水和盐水洗涤。有机层用无水Na₂SO₄干燥并且过滤。减压下除去溶剂。粗产物通过在SiO₂上快速色谱纯化(洗脱剂：20％to 30％EtOAc/己烷)得到(2R)-[3-环己基-(2S)-(2-三甲基甲硅烷基-乙氧基羰基氨基)-丙酰基氨基]-(3S)-{1-[(4S)-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-(5R)-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基甲基)-3-亚甲基-四氢-呋喃-(2R)-基]-2-氧代-1，2-二氢-嘧啶-4-基氨基甲酰氧基}-丁酸2-三甲基甲硅烷基-乙酯，其为无色固体(38.8mg，50％2步)。

¹H-NMR(270MHz，CDCl₃)：δ0.00(12H，s)，0.01(9H，s)，0.02(9H，s)，0.92(9H，s)，0.95(9H，s)，0.86-1.81(13H，m)，1.33(3H，d，J＝6.3Hz)，3.82(2H，m)，4.17(4H，m)，4.40(1H，br.s)，4.78(2H，m)，5.32(3H，m)，5.66(1H，br.s)，6.79(1H，br.s)，7.1(1H，br.d，J＝6.9Hz)，7.65(1H，br.s)，8.16(1H，br.d，J＝6.9Hz)，9.80(1H，br.s)；MS：(LCMS)m/z 1010[M+H]⁺。

i)室温下向搅拌的37.3mg(0.037mmol)的(2R)-[3-环己基-(2S)-(2-三甲基甲硅烷基-乙氧基羰基氨基)-丙酰基氨基]-(3S)-{1-[(4S)-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-(5R)-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基甲基)-3-亚甲基-四氢-呋喃-(2R)-基]-2-氧代-1，2-二氢-嘧啶-4-基氨基甲酰氧基}-丁酸2-三甲基甲硅烷基-乙酯在5.0mL THF(脱水)中的溶液内加入220mL正四丁基氟化铵(1mol/L in THF)。

搅拌1小时后，减压下除去溶剂，黄色油性残余物用制备HPLC(C18)^*纯化得到(2R)-((2S)-氨基-3-环己基-丙酰基氨基)-(3S)-[1-((4S)-羟基-(5R)-羟基甲基-3-亚甲基-四氢-呋喃-(2R)-基)-2-氧代-1，2-二氢-嘧啶-4-基氨基甲酰氧基]-丁酸，其为无色固体(12.1mg，61％)。

^*HPLC条件：柱；2×25cm(TSK-凝胶80-TS ODS)，洗脱剂；5％MeCN/H₂O to 100％MeCN(30分钟线性梯度)，流量：9mL/分钟，检测：光电二极管阵列。

¹H-NMR(270MHz，CD₃OD)：δ0.95-1.82(13H，m)，2.65(3H，d，J＝6.6Hz)，3.79(2H，m)，3.95(2H，m)，4.46(1H，d，J＝4.3Hz)，4.68(1H，m)，5.42(1H，d.d，J＝6.6，4.3Hz)，5.47(2H，t，J＝2.0Hz)，6.67(1H，d，J＝1.3Hz)，7.26(1H，d，J＝7.6Hz)，8.20(1H，d，J＝7.6Hz)；MS：(FABMS)m/z 538[M+H]⁺。

下列实施例7-13中的化合物是由DMDC、利用不同的式(VIII)的二肽(苏氨酸)衍生物，通过类似于实施例6的方法制备。

实施例7

(2R)-((2S)-氨基-4-甲基-戊酰基氨基)-(3S)-[1-((4S)-羟基-(5R)-羟基甲基-3-亚甲基-四氢-呋喃-(2R)-基)-2-氧代-1，2-二氢-嘧啶-4-基氨基甲酰氧基]-丁酸由(3S)-羟基-(2R)-[4-甲基-(2S)-(2-三甲基甲硅烷基-乙氧基羰基氨基)-戊酰基氨基]-丁酸2-三甲基甲硅烷基-乙酯制备。

¹H-NMR：(270MHz，CD₃OD)δ0.98(6H，d，J＝4.9Hz)，1.31(3H，d，J＝6.3Hz)，1.63-1.76(3H，m)，3.77-3.99(4H，m)，4.46(1H，d，J＝4.0Hz)，4.73(1H，m)，5.41(1H，m)，5.46(2H，s)，6.66(1H，s)，7.26(1H，d，J＝7.3Hz)，8.19(1H，d，J＝7.3Hz)；MS：(FABMS)m/z 498[M+H]⁺。

实施例8

(2R)-((2S)-氨基-3-联苯基-4-基-丙酰基氨基)-(3S)-[1-((4S)-羟基-(5R)-羟基甲基-3-亚甲基-四氢-呋喃-(2R)-基)-2-氧代-1，2-二氢-嘧啶-4-基氨基甲酰氧基]-丁酸由(2R)-[3-联苯基-4-基-(2S)-(2-三甲基甲硅烷基-乙氧基羰基氨基)-丙酰基氨基]-(3S)-羟基-丁酸2-三甲基甲硅烷基-乙酯制备。

¹H-NMR：(270MHz，CD₃OD)δ0.92(3H，d，J＝6.6Hz)，3.20(2H，m)，3.76(2H，m)，3.84(1H，m)，4.26(1H，t，J＝7.56Hz)，4.35(1H，d，J＝3.3Hz)，4.68(1H，m)，5.28(1H，d.d，J＝6.3，3.0Hz)，5.47(2H，m)，6.54(1H，d，J＝1.6Hz)，7.11(1H，d，J＝7.6Hz)，7.23-7.60(9H，m)，8.13(1H，d，J＝7.6Hz)；MS：(FABMS)m/z 608[M+H]⁺。

实施例9

2(R)-[2(S)-氨基-3-联苯基-4-基-丙酰基氨基]-3-{1-[4(S)-羟基-5(R)-羟基甲基-3-亚甲基-四氢-呋喃-2(R)-基]-2-氧代-1，2-二氢-嘧啶-4-基氨基甲酰氧基}-丙酸由2(R)-[3-联苯基-4-基-2(S)-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-丙酰基氨基]-3-羟基-丙酸2-三甲基甲硅烷基-乙酯。

¹H-NMR：(270MHz，CD₃OD)δ3.13(2H，ddd，J＝13.2，8.9，8.2Hz)，3.76(1H，m)，3.87(2H，m)，4.13(1H，dd，J＝8.2，6.9Hz)，4.21(1H，dd，J＝10.9，3.3Hz)，4.35(1H，dd，J＝10.9，5.3Hz)，4.59(1H，dd，J＝5.2，3.0Hz)，4.70(1H，m)，5.48(2H，d，J＝2.3Hz)，6.62(1H，d，J＝1.3Hz)，6.98(1H，d，J＝7.6Hz)，7.20-7.57(9H，m)，8.04(1H，d，J＝7.6Hz)；MS：(FABMS)m/z 594[M+H]⁺。

实施例10

(2R)-((2S)-氨基-3-萘-2-基-丙酰基氨基)-(3S)-[1-((4S)-羟基-(5R)-羟基甲基-3-亚甲基-四氢-呋喃-(2R)-基)-2-氧代-1，2-二氢-嘧啶-4-基氨基甲酰氧基]-丁酸由(3S)-羟基-(2R)-[3-萘-2-基-(2S)-(2-三甲基甲硅烷基-乙氧基羰基氨基)-丙酰基氨基]-丁酸2-三甲基甲硅烷基-乙酯制备。

¹H-NMR：(270MHz，CD₃OD)δ0.69(3H，d，J＝6.6Hz)，3.20(2H，m)，3.80(1H，m)，3.90(2H，m)，4.29-4.35(2H，m)，4.67(1H，m)，5.24(1H，d.d，J＝6.6，3.0Hz)，5.46(2H，s)，6.65(1H，d，J＝1.7Hz)，7.12(1H，d，J＝7.5Hz)，7.38-7.47(3H，m)，7.81-7.87(4H，m)，8.13(1H，d，J＝7.5Hz)；MS：(FABMS)m/z 582[M+H]⁺。

实施例11

(2R)-{(2S)-氨基-3-[4-(4-羟基-苯氧基)-苯基]-丙酰基氨基}-3-[1-((4S)-羟基-(5R)-羟基甲基-3-亚甲基-四氢-呋喃-2-基)-2-氧代-1，2-二氢-嘧啶-4-基氨基甲酰氧基]-丁酸由(3S)-羟基-(2R)-[3-{4-[4-(叔丁基-二甲基-甲硅烷氧基)-苯氧基]-苯基}-(2S)-(2-三甲基甲硅烷基-乙氧基羰基氨基)-丙酰基氨基]-丁酸2-三甲基甲硅烷基-乙酯制备。

¹H-NMR(CD₃OD)：δ0.95(3H，d，J＝6.2Hz)，2.89-3.08(2H，m)，3.74-3.98(3H，m)，4.34(1H，d，J＝2.9Hz)，4.66(1H，m)，5.30(1H，m)，5.44(2H，s)，6.65(1H，s)，6.72(2H，d，J＝7.1Hz)，6.80(2H，d，J＝7.0)，6.82(2H，d，J＝8.5Hz)，7.18(2H，d，J＝8.6Hz)，7.22(1H，d，J＝7.6Hz)，8.13(1H，d，J＝7.6Hz)；MS：LC-MS m/z 640.0[M+H]⁺。

实施例12

(2R)-[(2S)-氨基-3-(4-甲氧基-苯基)-丙酰基氨基]-(3S)-[1-[(4S)-羟基-(5R)-羟基甲基-3-亚甲基-四氢-呋喃-2-基]-2-氧代-1，2-二氢-嘧啶-4-基氨基甲酰氧基]-丁酸由(3S)-羟基-(2R)-[3-(4-甲氧基-苯基)-(2S)-(2-三甲基甲硅烷基-乙氧基羰基氨基)-丙酰基氨基]-丁酸2-三甲基甲硅烷基-乙酯制备。

¹H-NMR(CD₃OD)δ0.93(3H，d，J＝6.6Hz)，2.91-3.14(2H，m)，3.72(s，3H)，3.73-3.95(3H，m)，4.11(1H，t，J＝6.7Hz)，4.34(1H，br)，4.65(1H，m)，5.31(1H，m)，5.45(2H，s)，6.65(1H，s)，6.86(2H，d，J＝6.9Hz)，7.17(2H，d，J＝7.0)，7.21(1H，d，8.6Hz)，8.15(1H，d，J＝6.9Hz)；ESI-MS m/z 561.9[M+H]⁺，434，297，150。

实施例13

(2R)-[(2S)-氨基-4-乙基硫烷基-丁酰基氨基]-(3S)-[1-[(4S)-羟基-(5R)-羟基甲基-3-亚甲基-四氢-呋喃-(2R)-基]-2-氧代-1，2-二氢-嘧啶-4-基氨基甲酰基]-丁酸由(2R)-[4-乙基硫烷基-(2S)-(3-三甲基甲硅烷基-丙酰基氨基)-丁基氨基]-(3S)-羟基-丁酸2-三甲基甲硅烷基-乙酯制备。

H-NMR：(400MHz，CD₃OD)δ1.22(3H，t，J＝7.6Hz)，1.34(3H，d，J＝6.4Hz)，2.05(1H，m)，2.14(1H，m)，2.52-2.62(4H，m)，3.80(2H，m)，3.93(1H，m)，4.08(1H，t，J＝6.6Hz)，4.49(1H，d，J＝4.0Hz)，4.68(1H，m)，5.42(1H，dd，J＝6.4，4.0Hz)，5.47(2H，br)，6.67(1H，s)，7.25(1H，d，J＝7.2Hz)，8.20(1H，d，J＝7.6Hz)；MS：(FAB-MS)m/z 530[M+H]⁺。

实施例14

(2R)-[(2S)-氨基-3-(1H-吲哚-3-基)丙酰基氨基]-4-[1-((4S)-羟基-(5R)-羟基甲基-3-亚甲基四氢呋喃-2-基)-2-氧代-1，2-二氢嘧啶-4-基氨基甲酰基]丁酸。

(a)按照文献方法(Pacofsky，Gregory J；J.Med.Chem，41，11，1998，1894-1908.)制备的Teoc-L-Trp-OH(25g)，(2R)-氨基戊二酸5-苄酯-1-(2-三甲基甲硅烷基乙基)酯盐酸盐(23g)、WSCI(14g)和二异丙基乙胺(25ml)在二氯甲烷(250ml)中的混合物在室温Ar气氛下搅拌22小时。该反应混合物用水中止且分离有机层。水层用二氯甲烷萃取。合并的有机层用盐水洗涤并且用无水硫酸钠干燥随后真空浓缩。

粗残余物通过硅胶柱色谱纯化用正己烷-乙酸乙酯(2∶1)洗脱得到(2R)-[3-(1H-吲哚-3-基)-2S-(2-三甲基甲硅烷基乙氧基羰基氨基)丙酰基氨基]戊二酸5-苄酯1-(2-三甲基甲硅烷基乙基)酯，其为无色油(39g，93.2％)。

¹H-NMR：[270MHz：CDCl₃]：δ0.023-0.005(18H，m)，0.88-0.98(4H，m)，0.6-2.0(4H，m)，3.07-3.15(1H，m)，3.25-3.30(1H，m)，4.06-4.17(4H，m)，4.4-4.6(2H，m)，5.08(2H，s)，5.2-5.3(1H，brs)，6.18(1H，d，J＝7.6Hz)，6.96(1H，s)，7.0-7.25(3H，m)，7.3-7.4(5H，m)，7.66(1H，d，J＝7.3Hz)，7.81(1H，brs)；FAB-MS：m/z 668[[M+H]⁺。

(b)(2R)-[3-(1H-吲哚-3-基)-2S-(2-三甲基甲硅烷基乙氧基羰基氨基)丙酰基氨基]戊二酸5-苄基酯-(2-三甲基甲硅烷基乙基)酯(36g)和10％Pd-C(3.6g)在乙酸乙酯(350ml)中的混合物在H₂气存在下和室温下搅拌22小时。

过滤该反应混合物且真空蒸发该滤液得到(2R)-[3-(1H-吲哚-3-基)-2S-(2-三甲基甲硅烷基乙氧基羰基氨基)丙酰基氨基]戊二酸1-(2-三甲基甲硅烷基乙基)酯，其为无色油(32g，)。

¹H-NMR：[270MHz：CDCl₃]：δ0.018-0.01(18H，m)，0.85-1.0(4H，m)，0.6-2.1(4H，m)，3.1-3.4(2H，m)，4.0-4.2(4H，m)，4.4-4.6(2H，m)，5.3-5.4(1H，brs)，6.5-6.6(1H，brs)，7.0-7.2(3H，m)，7.33(1H，d，J＝7.6Hz)，7.61(1H，d，J＝8.2Hz)，8.33(1H，brs)；LC-MS：m/z 578[M+H]⁺。

(c)(2R)-[3-(1H-吲哚-3-基)-2S-(2-三甲基甲硅烷基乙氧基羰基氨基)丙酰基氨基]戊二酸1-(2-三甲基甲硅烷基乙基)酯(29g)，3′，5′-二-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-2′-脱氧-2′-亚甲基胞苷(24g)，BOP试剂(27g)和二异丙基乙胺(12ml)在二氯甲烷(500ml)中的混合物在室温和Ar气氛下搅拌19小时。该反应混合物用水中止且分离有机层。水层用二氯甲烷萃取。合并的有机层用盐水洗涤并且用无水硫酸钠干燥随后真空浓缩。

粗残余物通过硅胶柱色谱纯化，用正己烷-丙酮(3∶1)洗脱得到4-[1-(4S-叔丁基二甲基甲硅烷氧基-5R-叔丁基二甲基甲硅烷氧基甲基-3-亚甲基四氢呋喃-2-基)-2-氧代-1，2-二氢嘧啶-4-基氨基甲酰基]-2R-[3-(1H-吲哚-3-基)-2S-(2-三甲基甲硅烷基乙氧基羰基氨基)丙酰基氨基]丁酸1-(2-三甲基甲硅烷基乙基)酯，其为无色无定形固体(45g，86.4％)。

¹H-NMR：[270MHz：CDCl₃]：δ0.01-0.13(30H，m)，0.8-1.0(22H，m)，1.6-2.1(4H，m)，3.1-3.3(2H，m)，3.78-3.85(2H，m)，4.0-4.2(5H，m)，4.35-4.45(1H，m)，4.45-4.65(1H，m)，4.77-4.79(1H，m)，5.33-5.34(1H，m)，5.44(1H，d，J＝7.6Hz)，5.6-5.7(1H，m)，6.51(1H，d，J＝7.9Hz)，6.78(1H，d，J＝1.3Hz)，7.07-7.23(4H，m)，7.35-7.38(1H，m)，7.64(1H，d，J＝7.3Hz)，8.17(1H，d，J＝7.6Hz)，8.63(1H，brs)，8.86(1H，brs)；FAB-MS：m/z 1027[M+H]⁺。

(d)4-[1-((4S)-叔丁基二甲基甲硅烷氧基-(5R)-叔丁基二甲基甲硅烷氧基甲基-3-亚甲基四氢呋喃-2-基)-2-氧代-1，2-二氢嘧啶-4-基氨基甲酰基]-(2R)-[3-(1H-吲哚-3-基)-(2S)-(2-三甲基甲硅烷基乙氧基羰基氨基)丙酰基氨基]丁酸1-(2-三甲基甲硅烷基乙基)酯(2g)和TBAF[1mol/l THF中](39ml)在四氢呋喃(20ml)中的混合物在室温和Ar气氛下搅拌23小时。该反应混合物真空蒸发。粗残余物通过离子交换色谱纯化[Amberlite_CG-50]，用甲醇洗脱且随后利用制备反相HPLC纯化，用H₂O-乙腈(85∶15)洗脱得到(2R)-[(2S)-氨基-3-(1H-吲哚-3-基)丙酰基氨基]-4-[1β-((4S)-羟基-(5R)-羟基甲基-3-亚甲基四氢呋喃-2-基)-2-氧代-1，2-二氢嘧啶-4-基氨基甲酰基]丁酸，其为白色固体(449mg，41.6％)。

¹H-NMR：[270MHz：CD3OD]：δ1.6-2.0(4H，m)，3.17(1H，dd，J＝7.3，14.2Hz)，3.2-3.4(1H，m)，3.76-3.83(2H，m)，3.93(1H，dd，J＝3.3，13.2Hz)，4.06-4.17(2H，m)，4.66-4.69(1H，m)，5.44-5.47(2H，m)，6.67(1H，d，J＝1.7Hz)，6.98-7.08(2H，m)，7.17(1H，s)，7.29-7.32(2H，m)，7.58-7.61(1H，m)，8.16(1H，d，J＝7.6Hz)；FAB-MS：m/z 555[M+H]⁺。

下列实施例15-18中的化合物由DMDC，利用不同的式(VII)的二肽(谷氨酸)衍生物，利用类似于实施例14的方法制备。

实施例15

(2R)-((2S)-氨基-3-环己基丙酰基氨基)-4-[1-((4S)-羟基-(5R)-羟基甲基-3-亚甲基四氢呋喃-2-基)-2-氧代-1，2-二氢嘧啶-4-基氨基甲酰基]丁酸由(2R)-[3-环己基-(2S)-(2-三甲基甲硅烷基乙氧基羰基氨基)丙酰基氨基]戊二酸1-(2-三甲基甲硅烷基乙基)酯制备。

¹H-NMR：[270MHz：DMSO-d6]：δ0.7-1.0(2H，m)，1.0-1.8(11H，m)，1.8-2.0(2H，m)，2.3-2.5(2H，m)，3.5-3.8(4H，m)，4.0(1H，m)，4.51-4.53(1H，m)，5.31(1H，s)，5.34(1H，s)，6.55(1H，s)，7.20(1H，d，J＝7.6Hz)，8.10(1H，d，J＝7.3Hz；FAB-MS：m/z 522[M+H]⁺。

实施例16

(2R)-((2S)-氨基-3-联苯基-4-基丙酰基氨基)-4-[1-((4S)-羟基-(5R)-羟基甲基-3-亚甲基四氢呋喃-2-基)-2-氧代-1，2-二氢嘧啶-4-基氨基甲酰基]丁酸由(2R)-[3-联苯基-4-基-(2S)-(2-三甲基甲硅烷基乙氧基羰基氨基)丙酰基氨基]戊二酸1-(2-三甲基甲硅烷基乙基)酯制备。

¹H-NMR：[500MHz：DMSO-d6]：δ1.7-1.8(1H，m)，1.9-2.0(1H，m)，2.2-2.4(2H，m)，2.76-2.80(1H，m)，3.0-3.04(1H，m)，3.5-4.0(4H，m)，4.08(1H，m)，4.52-4.54(1H，m)，5.12(1H，brs)，5.32(1H，s)，5.35(1H，s)，5.74(1H，brs)，6.55(1H，s)，7.17(1H，d，J＝8.0Hz)，7.28-7.40(5H，m)，7.55-7.60(4H，m)，8.09(1H，d，J＝7.5Hz)，8.11(1H，brs)，11.0(1H，brs)；FAB-MS：m/z 592[M+H]⁺。

实施例17

(2R)-((2S)-氨基-3-萘-2-基丙酰基氨基)-4-[1-((4S)-羟基-(5R)-羟基甲基-3-亚甲基四氢呋喃-2-基)-2-氧代-1，2-二氢嘧啶-4-基氨基甲酰基]丁酸由(2R)-[3-萘-2-基-(2S)-(2-三甲基甲硅烷基乙氧基羰基氨基)丙酰基氨基]戊二酸1-(2-三甲基甲硅烷基乙基)酯制备。

¹H-NMR：[270MHz：DMSO-d6]：δ1.7-2.0(2H，m)，2.3-2.35(2H，m)，2.89(1H，dd，J＝8.6，13.5Hz)，3.19(1H，dd，J＝5.3，13.5Hz)，3.5-4.0(4H，m)，4.0-4.1(1H，m)，4.51-4.54(1H，m)，5.31(1H，s)，5.34(1H，s)，6.55(1H，s)，7.19(1H，d，J＝7.6Hz)，7.39-7.47(3H，m)，7.73(1H，s)，7.80-7.84(3H，m)，8.11(1H，d，J＝7.6Hz)，8.20(1H，brs)；FAB-MS：m/z 566[M+H]⁺。

实施例18

(2R)-((2S)-氨基-3-环己基-丙酰基氨基)-(3S)-[1-(3，3-二氟-(4R)-羟基-(5R)-羟基甲基-四氢-呋喃-2-基)-2-氧代-1，2-二氢-嘧啶-4-基氨基甲酰氧基]-丁酸由DFDC和(2R)-[3-环己基-(2S)-(2-三甲基甲硅烷基-乙氧基羰基氨基)-丙酰基氨基]-(3S)-羟基-丁酸2-三甲基甲硅烷基-乙酯，通过类似于实施例6的方法制备。

¹H-NMR：(270MHz，CD₃OD)：δ0.89-1.05(2H，m)，1.16-1.25(2H，m)，1.40-1.82(9H，m)，1.32(3H，d，J＝6.3)，3.80(1H，dd，J＝2.9，12.5)，3.93-4.05(3H，m)，4.30，(1H，dq，J＝4.3，8.3)，4.44，(1H，d，J＝3.9)，5.42(1H，dt，J＝2.0，4.3)，6.24(1H，t，J＝6.5)，7.31(1H，d，J＝7.6)，8.33(1H，d，J＝7.6Hz)；LC-MS：m/z 561.9[M+H]⁺。

实施例19

(S)-[2(S)-氨基-3-环己基-丙酰基氨基)-3-[1-(3，3-二氟-4(R)-羟基-5(R)-羟基甲基-四氢-呋喃-2(R)-基)-2-氧代-1，2-二氢-嘧啶-4-基氨基甲酰氧基]-2(S)-甲基-丙酸。

a)室温下向搅拌的255.1mg(0.514mmol)的2(S)-[2(S)-苄氧基羰基氨基-3-环己基-丙酰基氨基]-3-羟基-2(S)-甲基-丙酸苄基酯在10.0mLCH₂Cl₂(脱水)中的溶液内加入207mg(1.028mmol)三氯甲酸4-硝基苯基酯和83微升的吡啶。

搅拌1.5小时后，该反应通过加入水中止，和分离有机层。水层用EtOAc萃取。合并的有机层用水和盐水洗涤。该萃取液用无水Na₂SO₄干燥并且过滤。减压下除去溶剂。

粗产物通过在SiO₂上快速色谱纯化(洗脱剂：20％EtOAc/己烷)得到2(S)-[2(S)-苄氧基羰基氨基-3-环己基-丙酰基氨基]-2(S)-甲基-3-(4-硝基-苯氧基羰氧基)-丙酸苄基酯，其为黄色固体(342.3mg，定量；包括一些对硝基苯酚)

¹H-NMR：(270MHz，CDCl₃)δ0.97(2H，m)，1.13-1.50(5H，m)，1.61(3H，s)，1.62-1.77(6H，m)，4.20(1H，m)，4.66(1H，d，J＝10.9Hz，AB)，4.92(1H，d，J＝10.9Hz，AB)，4.98(1H，br.d)，5.08(2H，m)，5.22(2H，m)，6.92(1H，br.s)，7.30(2H，d，J＝9.6Hz)，7.34(10H，s)，8.22(2H，d，J＝9.6Hz)；MS：(LCMS)m/z662[M+H]⁺。

b)室温下向搅拌的337mg(0.509mmol)的2(S)-[2(S)-苄氧基羰基氨基-3-环己基-丙酰基氨基]-2(S)-甲基-3-(4-硝基-苯氧基羰氧基)-丙酸苄基酯在5mL ofTHF(脱水)中的溶液内加入310mg(0.611mmol)3′，5′-二-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-DFDC。

将该反应混合物在油浴中升温至60℃。搅拌18小时后，该混合物冷却至室温和该混合物在减压下浓缩。油性残余物溶于EtOAc且用饱和NaHCO₃、水和盐水。有机层用无水Na₂SO₄干燥并且过滤。减压下除去溶剂。粗产物通过在SiO₂上快速色谱(洗脱剂：20％-40％EtOAc/己烷)得到偶联产物，其为无色固体(437.7mg，85％)。随后，室温下将该产物(106mg；0.105mmol)溶于10ml的THF(脱水)和随后加入200mL正四丁基氟化铵(1mol/L，在THF中)。

搅拌2小时后，减压下除去溶剂，黄色油性残余物通过在SiO2上快速色谱纯化(洗脱剂：70％EtOAc-100％EtOAc)得到2(S)-[2(S)-苄氧基羰基氨基-3-环己基-丙酰基氨基)-3-[1-(3，3-二氟-4(R)-羟基-5(R)-羟基甲基-四氢-呋喃-2(R)-基)-2-氧代-1，2-二氢-嘧啶-4-基氨基甲酰氧基]-2(S)-甲基-丙酸苄基酯，其为无色固体(67.9mg，82％)。

¹H-NMR：(270MHz，CD₃OD)δ0.75(2H，m)，1.03-1.37(4H，m)，1.43(3H，s)，1.52-1.62(7H，m)，3.79(2H，m)，3.85(1H，m)，4.13(1H，m)，4.19(2H，m)，4.80(1H，br.s)，4.90(1H，d，J＝12.5Hz，AB)，4.99(1H，d，J＝12.5Hz，AB)，5.02(2H，s)，6.16(1H，dd，J＝7.9，6.9Hz)，7.19(1H，d，J＝7.6Hz)，7.20(5H，s)，7.21(5H，s)，8.21(1H，d，J＝7.6Hz)；MS：(LCMS)m/z 786[M+H]⁺。

c)向62.1mg(0.079mmol)的2(S)-[2(S)-苄氧基羰基氨基-3-环己基-丙酰基氨基)-3-[1-(3，3-二氟-4(R)-羟基-5(R)-羟基甲基-四氢-呋喃-2(R)-基)-2-氧代-1，2-二氢-嘧啶-4-基氨基甲酰氧基]-2(S)-甲基-丙酸苄基酯在5mL MeOH中的溶液内加入10％Pd/C。

该反应混合物在H₂氛下剧烈搅拌。搅拌15分钟后，经短塞力特硅藻土填料柱过滤该混合物。滤液在减压下浓缩且粗产物通过制备HPLC(ODS)纯化得到2(S)-[2(S)-氨基-3-环己基-丙酰基氨基)-3-[1-(3，3-二氟-4(R)-羟基-5(R)-羟基甲基-四氢-呋喃-2(R)-基)-2-氧代-1，2-二氢-嘧啶-4-基氨基甲酰氧基]-2(S)-甲基-丙酸，其为无色固体.(35.8mg，81％)

HPLC条件：柱；5×30cm(TSK-gel 80-TS ODS)，洗脱剂：5％MeCN/H₂O-100％MeCN(40分钟，线性梯度)，流量：50mL/分钟，检测：光电二极管阵列。

¹H-NMR：(270MHz，CD₃OD)δ0.90(2H，m)，1.01-1.34(4H，m)，1.50(3H，s)，1.54-1.75(7H，m)，3.76(2H，m)，3.95(2H，m)，4.27(1H，dd，J＝12.2，8.2Hz)，4.48(1H，d，J＝10.9Hz，AB)，4.92(1H，d，J＝10.9Hz，AB)，6.25(1H，dd，J＝7.6，6.9Hz)，7.28(1H，d，J＝7.6Hz)，8.30(1H，d，J＝7.6Hz)；MS：(LCMS)m/z 562[M+H]⁺。

下列实施例20-22中的化合物由DFDC、用式(VIII)的不同二肽衍生物，以类似于实施例19的方法制备。

实施例20

2(R)-[2(S)-氨基-3-环己基-丙酰基氨基]-3-{1-[3，3-二氟-4(R)-羟基-5(R)-羟基甲基-四氢-呋喃-2(R)-基]-2-氧代-1，2-二氢-嘧啶-4-基氨基甲酰氧基}-2(R)-甲基-丙酸由DFDC和2(R)-[2(S)-苄氧基羰基氨基-3-环己基-丙酰基氨基]-3-羟基-2(R)-甲基-丙酸苄酯制备。

¹H-NMR：(270MHz，CD₃OD)δ0.90(2H，m)，1.02-1.45(4H，m)，1.55(3H，s)，1.62-1.75(7H，m)，3.80(1H，m)，3.93(3H，m)，4.21(1H，m)，4.27(1H，d，J＝10.5Hz，AB)，5.00(1H，d，J＝10.5Hz，AB)，6.24(1H，dd，J＝7.6，7.3Hz)，7.27(1H，d，J＝7.6Hz)，8.28(1H，d，J＝7.6Hz)；MS：(LCMS)m/z 562[M+H]⁺。

实施例21

(2S，3S)-2-(2-氨基-3-环己基-丙酰基氨基)-3-[1-{(4R，5R)-3，3-二氟-4-羟基-5-羟基甲基-四氢-呋喃-2-基}-2-氧代-1，2-二氢-吡啶-4-基氨基甲酰氧基]-2-甲基-丁酸由DFDC和(2S，3S)-2-(2-苄氧基羰基氨基-3-环己基-丙酰基氨基)-3-羟基-2-甲基-丁酸苄酯制备。

¹H-NMR：(270MHz，CD₃OD)δ0.91-1.70(13H，m)，1.34(3H，d，J＝6.3Hz)，1.56(3H，s)，3.73-3.94(4H，m)，4.25(1H，td，J＝12.2，8.6Hz)，5.50(1H，q，J＝6.6Hz)，6.20(1H，t，J＝7.3Hz)，7.19(1H，d，J＝7.6Hz)，8.25(1H，d，J＝7.6Hz)；MS：(LC-MS)m/z 576[M+H]⁺。

实施例22

(2R，3R)-2-(2-氨基-3-环己基-丙酰基氨基)-3-[1-{(4R，5R)-3，3-二氟-4-羟基-5-羟基甲基-四氢-呋喃-2-基}-2-氧代-1，2-二氢-吡啶-4-基氨基甲酰氧基]-2-甲基-丁酸由DFDC和(2R，3R)-2-(2-苄氧基羰基氨基-3-环己基-丙酰基氨基)-3-羟基-2-甲基-丁酸苄酯制备。

¹H-NMR：(270MHz，CD₃OD)δ0.77-1.75(13H，m)，1.42(3H，d，J＝6.6Hz)，1.63(3H，s)，3.77-3.99(4H，m)，4.27(1H，td，J＝12.2，8.3Hz)，5.54(1H，q，J＝6.6Hz)，6.26(1H，dd，J＝7.6，7.3Hz)，7.31(1H，d，J＝7.6Hz)，8.29(1H，d，J＝7.6Hz)；MS：(LC-MS)m/z 576[M+H]⁺。

实施例23

2R-(2S-氨基-3-环己基-丙酰基氨基)-3S-[1-(4S-羟基-5R-羟基甲基-3-亚甲基-四氢-呋喃-2R-基)-2-氧代-1，2-二氢-嘧啶-4-基氨基甲酰氧基]-丁酸异丙酯。

a)在0℃下向搅拌的5.5g(17.8mmol)BOC-D-Thr(Bzl)-OH，280mg(2.3mmol)DMAP和2.7ml(35.6mmol)2-丙醇在50ml二氯甲烷(脱水)中的溶液内加入4.41g(23.1mmol)WSC HCl。该混合物在Ar和室温下搅拌5小时。该反应用300ml水中止，并且分离有机层。水层用EtOAc萃取(300ml×2)。合并的有机层用水(300ml)和盐水(300ml)洗涤，用无水Na₂SO₄干燥且过滤。减压下除去溶剂。粗产物通过硅胶柱纯化(100g，洗脱剂：20％EtOAc/正己烷)得到3S-苄氧基-2R-叔丁氧基羰基氨基-丁酸异丙酯，其为无色浆液(6.372g，定量)。

¹H-NMR：(270MHz，CDCl₃)δ1.10-1.30(9H，m)，1.43(9H，s)，4.03-4.26(2H，m)，4.34(1H，d，J＝11.6)，4.51(1H，d，J＝11.6)，4.99(1H，heptet，J＝6.6)，5.24(1H，br.d，J＝8.9)，7.11-7.35(5H，m)；MS：(LCMS)m/z373.9(M+Na)。

b)向6.372g(18.1mmol)3S-苄氧基-2R-叔丁氧基羰基氨基-丁酸异丙酯在200ml EtOAc中的溶液内悬浮在10％Pd/C中且在H₂氛下剧烈搅拌3小时。过滤催化剂且用EtOAc充分洗涤。滤液在减压下浓缩得到2R-叔丁氧基羰基氨基-3S-羟基-丁酸异丙酯，其为无色浆液(4.74g，定量)。该产物用于下面反应步骤无需进一步纯化。

¹H-NMR：(270MHz，CDCl₃)δ1.16(6H，d，J＝6.3)，1.23(3H，d，J＝6.3)，1.43(9H，s)，2.05(1H，br.s)，4.14-4.25(2H，m)，5.06(1H，heptet，J＝6.3)，5.27(1H，d，J＝4.3)；MS：(LCMS)m/z 262.1[M+H]⁺。

c)室温下向4.74g(18.1mmol)2R-叔丁氧基羰基氨基-3S-羟基-丁酸异丙酯在50mL EtOAc中的溶液内加入18ml 4N HCl的EtOAc溶液。该混合物搅拌14小时并且减压下浓缩得到2R-氨基-3S-羟基-丁酸异丙酯盐酸盐，其为无色浆液(3.60g，定量)。该产物用于下面反应步骤无需进一步纯化。

¹H-NMR：(270MHz，DMSO-d₆)δ1.21(6H，d，J＝6.6)，1.25(3H，d，J＝6.3)，3.83(1H，d，J＝4.0)，4.05-4.15(1H，m)，5.00(1H，heptet，J＝6.3)，5.65(1H，d，J＝5.3)，8.40(3H，br.s )；MS：(LCMS)m/z 162.0[M+H]⁺。

d)将3.7g(17.8mmol)3-环己基-2S-氨基-丙酸盐酸盐，6.3g(18.7mmol)FmocOSu和2.47ml(21.5mmol)三乙胺在30ml二_烷和15ml水中的溶液室温下搅拌8小时。将该反应混合物减压下浓缩且残余物在EtOAc(200ml)和0.1N柠檬酸盐水溶液之间分配。水层用EtOAc萃取(200ml)。合并的有机层用水(100ml)洗涤，用无水Na₂SO₄干燥且经玻璃滤器过滤。滤液在减压下浓缩且残余固体由20％EtOAc/正己烷(100ml)研制得到3-环己基-2S-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-丙酸，其为无色结晶(6.8g，97％)。

¹H-NMR：(270MHz，DMSO-d₆)δ0.76-0.96(2H，m)，1.10-1.20(4H，m)，1.25-1.35(1H，m)，1.50-1.70(6H，m)，4.00(1H，dd，J＝8.9，5.6)，4.21-4.30(2H，m)，7.32(2H，t，J＝7.6)，7.41(2H，t，J＝7.6)，7.64(1H，d，J＝8.3)，7.90(2H，d，J＝7.3)，12.5(1H，s)；MS：(LCMS)m/z 393.9[M+H]⁺。

e)0℃下向搅拌的6.8g(17.3mmol)3-环己基-2S-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-丙酸和2.0g(17.3mmol)N-羟基琥珀酰亚胺在60ml 50％二_烷/EtOAc中的混悬液内一次加入3.92g二环己基碳二亚胺。室温下将该反应混合物搅拌6小时。在玻璃滤器上过滤出沉淀且用EtOAc彻底洗涤。滤液在减压下浓缩得到粗N-羟基琥珀酰亚胺酯。将该残余物溶于100ml二氯甲烷并加入3.52g(17.8mmol)2R-氨基-3S-羟基-丁酸异丙酯盐酸盐和5.18ml(37.4mmol)，室温下搅拌9小时。该反应用0.1N柠檬酸盐水溶液(100ml)中止且分离有机层。水层用EtOAc萃取(200ml×2)且合并的有机层用盐水(100ml)洗涤，用无水Na₂SO₄干燥，和减压下浓缩。残余物由20％EtOAc/正己烷重结晶得到2R-[3-环己基-2S-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-丙酰基氨基]-3S-羟基-丁酸异丙酯，其为无色结晶(8.432g，91％)。

¹H-NMR：(270MHz，DMSO-d₆)δ0.86-0.96(2H，m)，1.03(3H，d，J＝6.3)，1.00-1.40(11H，m)，1.50-1.75(6H，m)，4.08-4.30(5H，m)，4.90(1H，heptet，J＝5.6)，4.97(1H，d，J＝5.6)，7.28-7.53(4H，m)，7.60-7.78(3H，m)，7.90(2H，d，J＝7.3)；MS：(LCMS)m/z 537.0[M+H]⁺。

f)室温下向搅拌的8.40g(15.7mmol)2R-[3-环己基-2S-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-丙酰基氨基]-3S-羟基-丁酸异丙酯在200mL二氯甲烷(脱水)中的溶液内加入8.2g(4.1mmol)三氯甲酸4-硝基苯基酯和3.29mL吡啶。

搅拌2小时后，该反应通过加入水中止，分离有机层。水层用EtOAc(200ml)萃取。合并的有机层用水(200ml×2)和盐水(200ml)洗涤，用无水Na₂SO₄干燥和减压下浓缩.粗产物由EtOAc和正己烷重结晶得到2R-[3-环己基-2S-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-丙酰基氨基]-3S-(4-硝基-苯氧基羰氧基-丁酸异丙酯，其为无色结晶(10.6g，96％)。

¹H-NMR：(270MHz，DMSO-d₆)δ0.86-0.96(2H，m)，1.29(3H，d，J＝6.3)，1.00-1.40(11H，m)，1.50-1.75(6H，m)，4.21-4.35(5H，m)，4.68(1H，dd，J＝4.3，8.6)，4.93(1H，heptet，J＝6.3)，5.26(1H，m)，7.29-7.55(6H，m)，7.60-7.78(2H，m)，7.90(2H，d，J＝7.3)，8.31(2H，dd，J＝2.3，6.9)，8.54(1H，d，J＝8.6)；MS：(LCMS)m/z 702.1[M+H]⁺。

g)将5.0g(7.0mmol)2R-[3-环己基-2S-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-丙酰基氨基]-3S-(4-硝基-苯氧基羰氧基-丁酸异丙酯和3.8g(8.12mmol)3′，5′-二-叔丁基二甲基甲硅烷基-DMDC在40mL THF(脱水)中的溶液在70℃下搅拌2天。该混合物在减压下浓缩。油性残余物在EtOAc(150ml×2)和饱和NaHCO₃溶液之间分配。合并的有机层用水(100ml)和盐水(100ml×2)洗涤，用无水Na₂SO₄干燥和减压下浓缩。粗产物通过硅胶柱纯化(洗脱剂：25％EtOAc/正己烷)得到2R-[3-环己基-2S-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-丙酰基氨基]-3S-{1-[4S-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-5R-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基甲基)-3-亚甲基-四氢-呋喃-2R-基]-2-氧代-1，2-二氢-嘧啶-4-基氨基甲酰氧基}-丁酸异丙酯，其为无色无定形物(6.6g，90％)。

¹H-NMR：(270MHz，DMSO-d₆)δ0.06(3H，s)，0.06(3H，s)，0.07(6H，s)，0.83(9H，s)，0.88(9H，s)，0.83-1.81(22H，m)，3.70-3.80(2H，m)，3.82(1H，d，J＝6.8)，4.15-4.25(4H，m)，4.54(1H，dd，J＝4.3，8.6)，4.74(1H，d，J＝5.3)，4.86(1H，heptet，J＝6.3)，5.23(1H，m)，5.29(1H，s)，5.37(1H，s)，6.57(1H，s)，6.94(1H，d，J＝5.0)，7.29(2H，t，J＝7.3)，7.39(2H，t，J＝7.3)，7.61(1H，d，J＝8.3)，7.73(2H，dd，J＝3.3，7.6)，7.87(2H，d，J＝7.3)，7.98(2H，m)；MS：(LCMS)m/z 1030.3[M+H]⁺。

h)室温下向200mg(0.194mmol)的2R-[3-环己基-2S-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-丙酰基氨基]-3S-{1-[4S-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-5R-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基甲基)-3-亚甲基-四氢-呋喃-2R-基]-2-氧代-1，2-二氢-嘧啶-4-基氨基甲酰氧基}-丁酸异丙酯在3mL THF(脱水)中的溶液内加入323μL(1.941mmol)HF三乙胺(98％)。搅拌14小时后，该反应混合物在减压下浓缩且残余物通过硅胶柱纯化(洗脱剂：6.25％甲醇/二氯甲烷)得到2R-[3-环己基-2S-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-丙酰基氨基]-3S-[1-(4S-羟基-5R-羟基甲基-3-亚甲基-四氢-呋喃-2R-基)-2-氧代-1，2-二氢-嘧啶-4-基氨基甲酰氧基]-丁酸异丙酯，其为无色无定形物(145.7mg，94％)。

¹H-NMR：(270MHz，DMSO-d₆)δ0.80-0.99(2H，m)，1.10-1.81(20H，m)，3.55-3.80(3H，m)，4.15-4.30(4H，m)，4.50(1H，m)，4.58(1H，dd，J＝3.3，8.9)，4.86(1H，heptet，J＝6.3)，5.01(1H，m)，5.20(1H，m)，5.30(1H，s)，5.34(1H，s)，5.66(1H，br.d)，6.53(1H，s)，6.90(1H，d，J＝7.6)，7.30(2H，t，J＝7.3)，7.39(2H，t，J＝7.2)，7.65(1H，d，J＝8.2)，7.72(2H，dd，J＝3.3，7.6)，7.88(2H，d，J＝7.3)，7.94(1H，d，J＝8.2)，8.10(1H，d，J＝7.6)；MS：(LCMS)m/z 802.0[M+H]⁺。

i)室温下向136mg(0.17mmol)2R-[3-环己基-2S-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-丙酰基氨基]-3S-[1-(4S-羟基-5R-羟基甲基-3-亚甲基-四氢-呋喃-2R-基)-2-氧代-1，2-二氢-嘧啶-4-基氨基甲酰氧基]-丁酸异丙酯在1mlDMF(脱水)中的溶液内加入100μL哌啶。

搅拌3小时后，减压下除去溶剂。黄色残余物通过硅胶柱纯化(洗脱剂：10％甲醇/二氯甲烷)得到2R-(2S-氨基-3-环己基-丙酰基氨基)-3S-[1-(4S-羟基-5R-羟基甲基-3-亚甲基-四氢-呋喃-2R-基)-2-氧代-1，2-二氢-嘧啶-4-基氨基甲酰氧基]-丁酸异丙酯，其为无色固体(28.6mg，29％)。

¹H-NMR：(270MHz，DMSO-d₆)δ0.75-0.95(2H，m)，1.12-1.80(20H，m)，3.55-3.80(3H，m)，4.50(1H，m)，4.60(1H，m)，4.88(1H，heptet，J＝6.3)，5.03(1H，m)，5.30-5.35(4H，m)，5.70(1H，br.d)，6.53(1H，s)，6.93(1H，d，J＝7.6)，8.06(1H，br.s)，8.10(1H，d，J＝7.6)；MS：(LCMS)m/z 579.9[M+H]⁺。

参考实施例2.1

(20S)-9-硝基喜树碱-N-氧化物20-乙酸盐的制备

室温下向9-硝基喜树碱20-乙酸盐(8.62g，19.8mmol)在三氟乙酸(65ml)中的溶液内加入脲-过氧化氢(3.11g，33.1mmol)。室温下搅拌4小时后，该混合物减压下浓缩至约半体积且倾入冰-水混合物。通过过滤收集生成的沉淀，用蒸馏水洗涤，并且真空干燥得到该标题化合物(8.35g，93％收率)。

¹H NMR(270MHz)δ(CDCl₃)0.98(t，J＝7.6Hz，3H)，2.08-2.33(m，2H)，2.23(s，3H)，5.38(s，2H)，5.40(d.J＝17.7Hz，1H)，5.67(d，J＝17.7Hz，1H)，7.96(s，1H)，7.96(dd，J＝7.6和7.8Hz，1H)，8.67(s，1H)，9.16(d，J＝7.6Hz，1H)；MS m/z(ES)452(M⁺+1)。

参考实施例3.1

(20S)-7-氯-9-硝基喜树碱20-乙酸盐的制备

在0℃下向参考实施例2.1的(20S)-9-硝基喜树碱-N-氧化物20-乙酸盐(10.88g，24.1mmol)在N，N-二甲基甲酰胺(196ml)中的溶液内加入草酰氯(4.2ml，48.2mmol)，并且该混合物在15℃下搅拌3小时。将该混合物倾入冰-水(500ml)，用乙酸乙酯(500ml×1，250ml×2)萃取。有机层用无水硫酸钠干燥，和减压下浓缩。该残余物通过硅胶柱色谱纯化(乙酸乙酯/己烷＝1/1)得到该标题化合物(5.54g，49％)，其为黄色固体。

¹H NMR(270MHz)δ(CDCl₃)0.99(t，J＝7.6Hz，3H)，2.07-2.33(m，2H)，2.23(s，3H)，5.33(s，2H)，5.41(d，J＝17.8Hz，1H)，5.69(d，J＝17.8Hz，1H)，7.20(s，1H)，7.87-7.95(m，2H)，8.44(dd，J＝2.3和7.6Hz，1H)；MSm/z(ES)470(M⁺+1)。

参考实施例4.1

(20S)-9-硝基-7-(戊基氨基)喜树碱20-乙酸盐的制备

向参考实施例3.1的(20S)-7-氯-9-硝基喜树碱20-乙酸盐(2.58g，5.49mmol)在1，4-二_烷中的混悬液(29ml)加入正戊胺(2.55ml，21.96mmol)且该混合物在80℃下搅拌2小时，随后减压下浓缩。所得残余物通过硅胶柱色谱纯化(二氯甲烷/丙酮＝30/1-20/1)得到该标题化合物(1.80g，63％)，其为褐色油。

¹H NMR(270MHz)δ(CDCl₃)0.86-1.01(m，6H)，1.22-1.59(m，4H)，1.60-1.78(m，2H)，2.03-2.37(m，5H)，3.57-3.68(m，2H)，5.02(br，1H)，5.40(d，J＝17.2Hz，1H)，5.47(s，2H)，5.67(d，J＝17.2Hz，1H)，7.13(s，1H)，7.66(dd，J＝2.0，7.9Hz，1H)，7.71(t，J＝7.9Hz，1H)，8.23(dd，J＝2.0，7.9Hz，1H)；MS(ES)m/z 521(M⁺+1)。

参考实施例4.15

(20S)-7-丁基氨基-9-硝基喜树碱20-乙酸盐的制备

该化合物是由参考实施例3.1的(20S)-7-氯-9-硝基喜树碱20-乙酸盐和丁胺按照类似于参考实施例4.1的方法制备。

¹H NMR(270MHz)δ(CDCl₃)0.97(t，J＝7.6Hz，3H)，1.00(t，J＝7.3Hz，3H)，1.43-1.52(m，2H)，1.63-1.71(m，2H)，2.13-2.32(m，2H)，2.22(s，3H)，3.62-3.69(m，2H)，5.02(brt，1H)，5.40(d，J＝17.2Hz，1H)，5.47(s，2H)，5.66(d，J＝17.2Hz，1H)，7.14(s，1H)，7.65-7.74(m，2H)，8.23(dd，J＝1.6和7.9Hz，1H)；MS m/z(ES)507(M⁺+1)。

参考实施例5.1

(20S)-9-氨基-7-(丁基氨基)喜树碱20-乙酸盐的制备

将参考实施例4.15的(20S)-7-丁基氨基-9-硝基喜树碱20-乙酸盐(156mg，0.31mmol)溶于MeOH(10ml)且加入1N HCl水溶液(2ml)和5％Pd-C(15mg)并且在H₂氛下利用气瓶室温下氢化1小时。过滤除去Pd-C之后，滤液在减压下浓缩得到产物(137mg，87％收率)。

¹H NMR(270MHz)δ(CDCl₃)0.95(t，J＝7.6Hz，3H)，1.01(t，J＝7.3Hz，3H)，1.48-1.60(m，2H)，1.68-1.78(m，2H)，2.10-2.31(m，2H)，2.20(s，3H)，3.60-3.67(m，2H)，3.90(brs，2H)，5.39(d，J＝17.0Hz，1H)，5.41(s，2H)，5.66(d，J＝17.0Hz，1H)，6.85(d，J＝7.3Hz，1H)，7.11(s，1H)，7.45(dd，J＝7.3和8.3Hz，1H)，7.64(d，J＝8.3Hz，1H)，8.77(brs，1H)；MS(ES)m/z477(M⁺+1)。

参考实施例5.14

(20S)-9-氨基-7-(戊基氨基)喜树碱20-乙酸盐盐酸盐的制备

该化合物是由参考实施例4.1的(20S)-9-硝基-7-(戊基氨基)喜树碱20-乙酸盐按照类似于参考实施例5.1的方法制备。

MS(ES)m/z 491(M⁺+1)。

实施例1.1

(9S)-1-丁基-9-乙基-9-羟基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-2，10，13(3H，9H，15H)-三酮的制备

该制备方法包括经化合物(a)下列两个步骤。

(a)(9S)-9-乙酰氧基-1-丁基-9-乙基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-2，10，13(3H，9H，15H)-三酮

将参考实施例5.1的(20S)-9-氨基-7-(丁基氨基)喜树碱20-乙酸盐盐酸盐(123mg，0.24mmol)溶于干燥CH₂Cl₂(5ml)并且在冰浴中篮球。连续加入DIEA(390l，2.3mmol)和三光气(67mg，0.23mmol)并且该混合物在冰浴中搅拌1小时。该反应混合物用1N HCl水溶液在0℃下中止，并且用CH₂Cl₂(20ml)萃取。CH₂Cl₂层用盐水洗涤，用MgSO₄干燥，并且在减压下蒸发。所得残余物通过柱色谱(二氯甲烷/丙酮＝15/1-7/1)纯化得到纯产物(70mg，56％)。

¹H NMR(270MHz)δ(CDCl₃)0.98(t，J＝7.7Hz，3H)，1.00(t，J＝7.3Hz，3H)，1.43-1.59(m，2H)，1.66-1.77(m，2H)，2.07-2.35(m，2H)，2.23(s，3H)，4.12-4.18(m，2H)，5.36(s，2H)，5.40(d，J＝17.4Hz，1H)，5.68(d，J＝17.4Hz，1H)，6.76(dd，J＝1.5和6.7Hz，1H)，7.16(s，1H)，7.56-7.67(m，2H)，9.24(s，1H)；MS(ES)m/z 503(M⁺+1)。

(b)(9S)-1-丁基-9-乙基-9-羟基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-2，10，13(3H，9H，15H)-三酮

向在冰浴中冷却的(9S)-9-乙酰氧基-1-丁基-9-乙基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-2，10，13(3H，9H，15H)-三酮(11.5mg，0.023mmol)在MeOH(3ml)中的溶液内加入无水肼(100μl)。该混合物升至室温且搅拌1小时。滴加1N HCl水溶液酸化该反应混合物且室温下该混合物搅拌1小时。减压下浓缩，所得残余物用CH₂Cl₂(20ml×3)萃取。合并的CH₂Cl₂溶液用盐水洗涤，用MgSO₄干燥并蒸发。残余物通过柱色谱纯化(二氯甲烷/甲醇＝30/1)得到纯产物(6.1mg，58％)。

¹H NMR(400MHz)δ(DMSO)0.87(t，J＝7.2Hz，3H)，0.96(t，J＝7.6Hz，3H)，1.39-1.47(m，2H)，1.64-1.70(m，2H)，1.81-1.91(m，2H)，4.03-4.07(m，2H)，5.42(s，2H)，5.43(s，2H)，6.51(s，1H)，6.77(d，J＝7.2Hz，1H)，7.24(s，1H)，7.41(d，J＝7.6Hz，1H)，7.61(dd，J＝7.2和7.6Hz，1H)，11.15(brs，1H)；MS(ES)m/z 461(M⁺+1)。

实施例1.14

(9S)-9-乙基-9-羟基-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-2，10，13(3H，9H，15H)-三酮的制备

该化合物由参考实施例5.14的(20S)-9-氨基-7-(戊基氨基)喜树碱20-乙酸盐按照类似于实施例1.1的方法以两步经化合物(a)制备。

(a)(9S)-9-乙酰氧基-9-乙基-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-2，10，13(3H，9H，15H)-三酮

¹H NMR(270MHz)δ(CDCl₃)0.92(t，J＝6.9Hz，3H)，0.98(t，J＝7.6Hz，3H)，1.29-1.53(m，4H)，1.65-1.76(m，2H)，2.12-2.30(m，5H)，3.75-4.17(m，2H)，5.36(s，2H)，5.40(d，J＝17.5Hz，1H)，5.68(d，J＝17.5Hz，1H)，6.75(dd，J＝1.7，6.9Hz，1H)，7.15(s，1H)，7.58(dd，J＝1.7，6.9Hz，1H)，7.64(dd，J＝6.9，8.6Hz，1H)，8.88(br，1H)；MS(ES)m/z 517(M⁺+1)。

(b)(9S)-9-乙基-9-羟基-1-戊基1H，12H吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-2，10，13(3H，9H，15H)-三酮

¹H NMR(270MHz)δ(DMSO-d₆)0.85-0.93(m，6H)，1.36-1.38(m，4H)，1.69-1.88(m，4H)，4.05(m，2H)，5.43(s，4H)，6.49(s，1H)，6.78(d，J＝8.0Hz，1H)，7.25(s，1H)，7.42(d，J＝8.0Hz，1H)，7.61(t，J＝8.0Hz，1H)，11.13(br，1H)；MS(ES)m/z 475(M⁺+1)。

实施例2.1

(9S)-1-丁基-9-乙基-9-羟基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮的制备

该制备方法包括下列经过化合物(a)的两个步骤。

(a)(9S)-9-乙酰氧基-1-丁基-9-乙基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮

向参考实施例5.1的(20S)-9-氨基-7-(丁基氨基)喜树碱20-乙酸盐盐酸盐(14.9mg，0.029mmol)在干燥CH₂Cl₂(5ml)中的溶液内加入原甲酸三甲基酯(100μl)和对甲苯磺酸一水合物(5mg)。该混合物在油浴中加热回流1小时。冷却至室温后，该混合物用1％NaHCO₃水溶液和盐水连续洗涤，用MgSO₄干燥和减压下浓缩。所得残余物通过柱色谱纯化(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇＝20/1)得到纯产物(12.6mg，89％)。

¹H NMR(400MHz)δ(CDCl₃)0.96(t，J＝7.6Hz，3H)，1.01(t，J＝7.4Hz，3H)，1.49-1.58(m，2H)，1.74-1.82(m，2H)，2.09-2.17(m，2H)，2.21(s，3H)，2.24-2.31(m，1H)，3.84(t，J＝7.4Hz，2H)，5.22(d，J＝17.8Hz，1H)，5.25(d，J＝17.8Hz，1H)，5.39(d，J＝17.2Hz，1H)，5.65(d，J＝17.2Hz，1H)，7.10(s，1H)，7.16(d，J＝7.2Hz，1H)，7.40(s，1H)，7.62(d，J＝8.4Hz，1H)，7.68(dd，J＝7.2和8.4Hz，1H)；MS(ES)m/z 487(M⁺+1)。

(b)(9S)-1-丁基-9-乙基-9-羟基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮

向在冰浴中冷却的(9S)-9-乙酰氧基-1-丁基-9-乙基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮(6.1mg，0.013mmol)在MeOH(2ml)中的溶液内加入无水肼(100μl)并将该混合物在室温下搅拌1小时。滴加1N HCl水溶液酸化该反应混合物，并且室温下将该混合物搅拌1小时。减压下浓缩，该残余物用CH₂Cl₂(30ml)萃取且该CH₂Cl₂溶液用盐水洗涤，用MgSO₄干燥并蒸发。该残余物通过柱色谱纯化(二氯甲烷/甲醇＝20/1)得到纯产物(3.9mg，70％)。

¹H NMR(400MHz)δ(DMSO-d₆)1.02(t，J＝7.2Hz，6H)，1.50-1.59(m，2H)，1.76-1.93(m，4H)，3.82(t，J＝7.2Hz，2H)，3.88(brs，1H)，5.21(s，2H)，5.27(d，J＝16.2Hz，1H)，5.70(d，J＝16.2Hz，1H)，7.11(dd，J＝1.6和7.4Hz，1H)，7.37(s，1H)，7.51(s，1H)，7.59-7.67(m，2H)；MS(ES)m/z 445(M⁺+1)。

实施例2.15

(9S)-9-乙基-9-羟基-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮的制备

该化合物由参考实施例5.14的(20S)-9-氨基-7-(戊基氨基)喜树碱20-乙酸盐，按照类似于实施例2.1的方法以两个步骤经化合物(a)制得。

(a)(9S)-9-乙酰氧基-9-乙基-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮

¹H NMR(270MHz)δ(CDCl₃)0.91-0.99(m，6H)，1.26-1.58(m，4H)，1.74-1.82(m，2H)，2.09-2.31(m，5H)，3.83(t，J＝7.3Hz，2H)，5.23(s，2H)，5.39(d，J＝17.2Hz，1H)，5.65(d，J＝17.2Hz，1H)，7.09(s，1H)，7.17(dd，J＝1.5，6.9Hz，1H)，7.40(s，1H)，7.62(dd，J＝1.5，8.6Hz，1H)，7.68(dd，J＝6.9，8.6Hz，1H)；

(b)(9S)-9-乙基-9-羟基-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮

¹H NMR(270MHz)δ(DMSO-d₆)0.85-0.92(m，6H)，1.35-1.38(m，4H)，1.75-1.93(m，4H)，3.89-3.94(m，2H)，5.29(s，2H)，5.40(s，2H)，6.46(s，1H)，6.99(dd，J＝1.0，7.4Hz，1H)，7.18(s，1H)，7.47(dd，J＝1.0，8.6Hz，1H)，7.62(dd，J＝7.4，8.6Hz，1H)，7.86(s，1H)；MS(ES)m/z 459(M⁺+1)。

实施例2.28

(9S)-9-乙基-9-羟基-2-甲基-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮的制备

该化合物由参考实施例5.14的(20S)-9-氨基-7-(戊基氨基)喜树碱20-乙酸盐和原乙酸三甲基酯、按照类似于实施例2.1的方法以两个步骤经化合物(a)制得。

(a)(9S)-9-乙酰氧基-9-乙基-2-甲基-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮

¹H NMR(270MHz)δ(CDCl₃)0.94(t，J＝6.9Hz，3H)，0.97(t，J＝7.3Hz，3H)，1.30-1.56(m，4H)，1.65-1.89(m，2H)，2.05-2.35(m，2H)，2.21(s，3H)，2.49(s，3H)，3.79-4.01(m，2H)，5.24(brs，2H)，5.39和5.66(q，J＝17.2Hz，1H×2)，7.04-7.12(m，1H)，7.08(s，1H)，7.52-7.71(m，2H)；MS(ES)m/z515(M⁺+1)。

(b)(9S)-9-乙基-9-羟基-2-甲基-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮

¹H NMR(270MHz)δ(DMSO-d₆)0.87(t，J＝7.3Hz，3H)，0.91(t，J＝7.3Hz，3H)，1.30-1.60(m，4H)，1.66-1.94(m，4H)，2.45(d，J＝2.6Hz，3H)，3.93(br，2H)，5.23-5.44(m，2H)，5.41(brs，2H)，6.50(brs，1H)，6.89-7.00(m，1H)，7.19(d，J＝2.3Hz，1H)，7.38-7.49(m，1H)，7.62(dt，J＝3.6和7.9Hz，1H)；MS(FAB)m/z 473(M⁺+1)

实施例3.1

(9S)-9-乙基-9-羟基-2-羟基甲基-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′7′]吲嗪并[1′2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮的制备

该制备方法包括下列经过化合物(a)的两个步骤。

(a)(9S)-9-乙酰氧基-2-乙酰氧基甲基-9-乙基-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′7′]吲嗪并[1′2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮

向在冰浴内冷却的参考实施例5.14的(20S)-9-氨基-7-(戊基氨基)喜树碱20-乙酸盐盐酸盐(1.61g，3.07mmol)在干燥二氯甲烷(120ml)中的溶液中连续加入乙酰氧基乙酰氯(4.3ml)和二异丙基乙胺(1.07ml)。加料后，该混合物升至室温且搅拌过夜。加入水(50ml)且该混合物用二氯甲烷(100ml)萃取。二氯甲烷层用盐水洗涤，用MgSO₄干燥和减压下浓缩。所得残余物通过柱色谱纯化(洗脱剂：乙酸乙酯/己烷＝8/1)得到纯产物(1.72g，98％)。

¹H NMR(400MHz)δ(CDCl₃)0.91(t，J＝7.3Hz，3H)，0.97(t，J＝7.5Hz，3H)，1.31-1.48(m，4H)，1.70-1.82(m，2H)，2.08-2.30(m，2H)，2.22(s，3H)，2.25(s，3H)，3.86(t，J＝7.9Hz，2H)，5.04(s，2H)，5.26(s，2H)，5.39(d，J＝17.1Hz，1H)，5.66(d，J＝17.1Hz，1H)，7.13(s，1H)，7.19(dd，J＝2.0和6.6Hz，1H)，7.63-7.73(m，2H)；MS(ES)m/z 573(M⁺+1)。

(b)(9S)-9-乙基-9-羟基-2-羟基甲基-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′7′]吲嗪并[1′2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮

向在冰浴内冷却的(9S)-9-乙酰氧基-2-乙酰氧基甲基-9-乙基-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′7′]吲嗪并[1′2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮(34mg，0.059mmol)在甲醇(3ml)中的溶液中加入无水肼(100μl)且该混合物在室温下搅拌2小时。滴加1N盐酸水溶液(5ml)酸化该反应混合物，并且室温下搅拌该混合物1小时。该混合物用二氯甲烷(50ml)萃取且二氯甲烷层用盐水洗涤，用MgSO₄干燥并蒸发。该残余物通过柱色谱纯化(二氯甲烷/甲醇＝25/1)得到纯产物(19mg，65％)。

¹H NMR(400MHz)δ(DMSO-d₆)0.87(t，J＝7.6Hz，3H)，0.90(t，J＝6.9Hz，3H)，1.32-1.45(m，4H)，1.74-1.90(m，4H)，4.04(m，2H)，4.43(d，J＝5.6Hz，2H)，5.36(s，2H)，5.41(s，2H)，5.79(t，J＝5.6Hz，1H)，6.50(s，1H)，7.03(dd，J＝1.0和7.3Hz，1H)，7.20(s，1H)，7.50(dd，J＝1.0和8.6Hz，1H)，7.66(dd，J＝7.3和8.6Hz，1H)；MS(ES)m/z 489(M⁺+1)。

实施例24

20-O-[(S)-色氨酰基-γ-(S)-谷氨酰基]-20-(S)-喜树碱盐酸盐的制备

a)向搅拌的2.5g(7.58mmol)的L-谷氨酸α-t-丁基-γ-苄基二酯盐酸盐在75mL的二氯甲烷中的溶液内加入3.65g(9.10mmol)的N-α-Boc-L-色氨酸羟基琥珀酰亚胺和1.59mL(9.10mmol)的N，N-二异丙基乙胺。该混合物在氮气氛室温下搅拌过夜。该反应通过加入饱和氯化铵溶液中止，并且分离有机层。水层用二氯甲烷萃取。合并的有机层用水和盐水洗涤。该萃取液用无水硫酸镁并且过滤。减压下除去溶剂。粗产物通过用LobarLiChroprep Si-60 Grobe C的中压液相色谱(洗脱剂：乙酸乙酯/二氯甲烷＝1/1)纯化得到2(S)-[2(S)-叔丁氧基羰基氨基-3-(1H-吲哚-3-基)-丙酰基氨基]-戊二酸5-苄基酯1-叔丁酯，其为白色无定形物(4.38g，定量)。

¹H-NMR：(270MHz，CDCL₃)δ1.30-1.49(15H，m)，1.62(3H，s)，1.73-1.95(1H，m)，2.02-2.25(3H，m)，3.13(1H，dd，J＝14.5，6.3Hz)，3.27-3.43(1H，m)，4.33-4.56(2H，m)，4.90-5.15(3H，m)，5.08(2H，s)，6.52(1H，d，J＝7.3Hz)，7.00(1H，d，J＝2.3Hz)，7.03-7.28(3H，m)，7.30-7.47(5H，m)，7.59(1H，dd，J＝5.6，1.7Hz)，7.90(1H，brs)；MS：(LCMS)m/z 580[M+H]⁺。

b)向搅拌的4.33g(7.47mmol)的2(S)-[2(S)-叔丁氧基羰基氨基-3-(1H-吲哚-3-基)-丙酰基氨基]-戊二酸5-苄基酯1-叔丁酯在80mL乙酸乙酯中的溶液内加入催化量的钯炭。在氢气氛室温下搅拌该混合物过夜。过滤该反应混合物除去催化剂且减压下除去溶剂得到2(S)-[2(S)-叔丁氧基羰基氨基-3-(1H-吲哚-3-基)-丙酰基氨基]-戊二酸1-叔丁酯，其为白色无定形物(3.70g，定量)。该产物用于下面反应步骤无需进一步纯化。MS：(LCMS)m/z 490[M+H]⁺。

c)向搅拌的3.70g(7.56mmol)的2(S)-[2(S)-叔丁氧基羰基氨基-3-(1H-吲哚-3-基)-丙酰基氨基]-戊二酸1-叔丁酯在200mL二氯甲烷中的溶液内加入1.83g(14.9mmol)的4-(二甲基氨基)吡啶，5.73g(29.9mmol)的1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1.73g(4.98mmol)的喜树碱。该混合物在氮气、室温下搅拌2小时。该反应通过加入水中止，并且分离有机层。水层用二氯甲烷萃取。合并的有机层用0.5N盐酸水溶液，饱和碳酸氢钠溶液、水和盐水洗涤。该萃取液用无水硫酸镁干燥并且过滤。减压下除去溶剂。粗产物通过用Lobar LiChroprep Si-60 Grobe C的中压液体色谱(洗脱剂：乙酸乙酯/二氯甲烷＝20/1)纯化得到2(S)-[2(S)-叔丁氧基羰基氨基-3-(1H-吲哚-3-基)-丙酰基氨基]-戊二酸1-叔丁酯5-(4(S)-乙基-3，13-二氧代-3，4，12，13-四氢-1H-2-氧杂-6，12a-二氮杂-二苯并[b，h]芴-4-基)酯，其为黄色无定形物(3.95g，97％)。MS：(LCMS)m/z 820[M+H]⁺。

d)向搅拌的3.95g(4.82mmol)的2(S)-[2(S)-叔丁氧基羰基氨基-3-(1H-吲哚-3-基)-丙酰基氨基]-戊二酸1-叔丁酯α5-(4(S)-乙基-3，13-二氧代-3，4，12，13-四氢-1H-2-氧杂-6，12a-二氮杂-二苯并[b，h]芴-4-基)酯在20mL乙酸乙酯中的溶液内加入40mL的1N氯化氢的乙酸溶液和20mL三氟乙酸。该混合物在氮气、室温下搅拌过夜。该反应混合物加入800mL乙酸乙酯，并且随后过滤出沉淀得到20-O-[(S)-色氨酰基-γ-(S)-谷氨酰基]-20-(S)-喜树碱盐酸盐，其为红色固体(3.2g，95％)。

¹H-NMR：(270MHz，CD₃OD)δ1.03(3H，t，J＝7.5Hz)，2.02-2.39(4H，m)，2.68-2.83(2H，m)，3.06-3.23(2H，m)，3.27-3.35(m)，3.38-3.50(2H，m)，4.17-4.33(1H，m)，4.42-4.57(1H，m)，4.79-4.97(m)，5.20-5.38(2H，m)，5.55(2H，dd，J＝38.6，16.8Hz)，6.97(1H，t，J＝7.6Hz)，7.11(1H，t，J＝7.9Hz)，7.19(1H，s)，7.36(2H，d，J＝8.3Hz)，7.58(1H，s)，7.65(1H，d，J＝7.9Hz)，7.76(1H，t，J＝6.9Hz)，7.83-7.93(1H，m)，8.11(1H，d，J＝8.6Hz)，8.25(1H，d，J＝8.3Hz)，8.77(1H，s)；MS：(LCMS)m/z 664[M+H]⁺。

下列实施例25-49的化合物由喜树碱或SN38、利用式(VII)的不同二肽衍生物，通过类似于实施例24的方法制备。

实施例25

20-O-[(S)-缬氨酰基-γ-(S)-谷氨酰基]-20(S)-喜树碱盐酸盐由2(S)-[(2(S)-叔丁氧基羰基氨基-3-甲基-丁酰基氨基]-戊二酸1-叔丁酯制备。

¹H-NMR：(270MHz，CD₃OD)δ0.97-1.14(9H，m)，1.93-2.38(6H，m)，2.63-2.92(2H，m)，3.27-3.34(m)，3.81(1H，d，J＝5.3Hz)，4.48-4.59(1H，m)，4.80-4.97(m)，5.38(2H，brs)，5.55(2H，dd，J＝35.6，17.2Hz)，7.69(1H，s)，7.80(1H，t，J＝8.3Hz)，8.00(1H，td，J＝8.6，1.3Hz)，8.18(1H，d，J＝8.3Hz)，8.33(1H，d，J＝8.6Hz)，8.88(1H，s)；MS：(LCMS)m/z 577[M+H]⁺。

实施例26

20-O-[(S)-苯基丙氨酰基-γ-(S)-谷氨酰基]-20(S)-喜树碱盐酸盐由2(S)-[(2(S)-叔丁氧基羰基氨基-3-苯基-丙酰基氨基]-戊二酸1-叔丁酯制备。

¹H-NMR：(270MHz，CD₃OD)δ0.99-1.10(3H，m)，1.33-1.42(1H，m)，1.97-2.42(4H，m)，2.73(1H，t，J＝9.6Hz)，2.93-3.12(1H，m)，3.19-3.40(m)，3.52-3.82(2H，m)，4.02-4.26(1H，m)，4.40-4.60(1H，m)，4.71-4.91(m)，5.28-5.39(2H，m)，5.56(2H，dd，J＝38.3，17.2Hz)，7.14-7.23(1H，m)，7.25-7.43(6H，m)，7.73(1H，t，J＝6.9Hz)，7.88(1H，t，J＝8.6Hz)，8.09(1H，d，J＝8.3Hz)，8.13-8.22(1H，m)，8.64(1H，d，J＝8.3Hz)；MS：(LCMS)m/z625[M+H]⁺。

实施例27

20-O-[(S)-亮氨酰基-γ-(S)-谷氨酰基]-20(S)-喜树碱盐酸盐由2(S)-[2(S)-叔丁氧基羰基氨基-4-甲基-戊酰基氨基]-戊二酸1-叔丁酯制备。

¹H-NMR：(270MHz，CD₃OD)δ0.89-1.12(11H，m)，1.58-2.41(8H，m)，2.60-2.99(2H，m)，3.23-3.36(m)，3.51-3.79(7H，m)，3.87(1H，brs)，4.00-4.11(1H，m)，4.47-4.63(1H，m)，4.74-5.00(m)，5.39(2H，brs)，5.54(2H，dd，J＝36.0，17.5Hz)，7.78-7.94(2H，m)，7.98-8.11(1H，m)，8.24(1H，d，J＝8.3Hz)，8.42(1H，d，J＝8.6Hz)，8.99(1H，s)；MS：(LCMS)m/z 591[M+H]⁺。

实施例28

20-O-[(R)-亮氨酰基-γ-(S)-谷氨酰基]-20(S)-喜树碱盐酸盐由2(S)-[2(R)-叔丁氧基羰基氨基-4-甲基-戊酰基氨基]-戊二酸1-叔丁酯制备。

¹H-NMR：(270MHz，CD₃OD)δ0.83-1.12(10H，m)，1.60-1.82(3H，m)，1.90-2.40(3H，m)，2.54-2.80(2H，m)，3.17-3.40(m)，3.51-3.80(3H，m)，3.81-3.97(1H，m)，4.43-4.60(1H，m)，4.62-5.00(m)，5.32(2H，brs)，5.54(2H，dd，J＝37.3，17.0Hz)，7.38(1H，s)，7.71(1H，t，J＝7.3Hz)，7.87(1H，t，J＝7.8Hz)，8.06(1H，d，J＝7.6Hz)，8.16(1H，d，J＝8.4Hz)，8.63(1H，s)；MS：(LCMS)m/z591[M+H]⁺。

实施例29

20-O-[(R)-苯基丙氨酰基-γ-(S)-谷氨酰基]-20(S)-喜树碱三氟乙酸由2(S)-[(2(R)-叔丁氧基羰基氨基-3-苯基-丙酰基氨基]-戊二酸1-叔丁酯制备。

¹H-NMR：(270MHz，CD₃OD)γ1.05(3H，t，J＝7.6Hz)，1.70-1.99(1H，m)，2.02-2.47(5H，m)，2.95-3.22(2H，m)，3.23-3.41(m)，4.09(1H，t，J＝7.9Hz)，4.43(1H，dd，J＝9.2，4.6Hz)，4.70-4.90(m)，5.29(2H，d，J＝3.3Hz)，5.54(2H，dd，J＝38.3，17.2Hz)，7.19-7.49(6H，m)，7.72(1H，td，J＝6.9，1.3Hz)，7.88(1H，td，J＝6.9，1.3Hz)，8.08(1H，d，J＝7.3Hz)，8.17(1H，d，J＝8.6Hz)，8.62(1H，s)；MS：(LCMS)m/z 625[M+H]⁺。

实施例30

20-O-[(S)-色氨酰基-γ-(R)-谷氨酰基]-20(S)-喜树碱盐酸盐由2(R)-[2(S)-叔丁氧基羰基氨基-3-(1H-吲哚-3-基)-丙酰基氨基]-戊二酸1-叔丁酯制备。

¹H-NMR：(270MHz，CD₃OD)δ1.03(3H，t，J＝7.6Hz)，1.69-1.98(1H，m)，2.05-2.36(5H，m)，3.14(2H，d，J＝36.6Hz)，3.22-3.39(m)，4.09(1H，t，J＝6.9Hz)，4.33-4.46(1H，m)，4.72-5.02(m)，5.03(2H，dd，J＝42.2，18.8Hz)，5.53(2H，dd，J＝45.5，16.8Hz)，6.80-6.98(2H，m)，7.10(1H，t，J＝7.3Hz)，7.29(1H，d，J＝7.9Hz)，7.32-7.41(2H，m)，7.69(1H，td，J＝13.9，6.9Hz)，7.78-7.89(1H，m)，8.00(1H，d，J＝7.9Hz)，8.10(1H，d，J＝8.6Hz)，8.44(1H，s)；MS：(LCMS)m/z664[M+H]⁺。

实施例31

20-O-[(R)-色氨酰基-γ-(R)-谷氨酰基]-20(S)-喜树碱盐酸盐由2(R)-[2(R)-叔丁氧基羰基氨基-3-(1H-吲哚-3-基)-丙酰基氨基]-戊二酸1-叔丁酯制备。

¹H-NMR：(270MHz，CD₃OD)δ1.03(3H，t，J＝7.3Hz)，1.94-2.40(6H，m)，2.73(2H，t，J＝7.3Hz)，3.00-3.17(1H，m)，3.19-3.48(m)，3.53-4.78(2H，m)，4.08-4.23(1H，m)，4.45-4.58(1H，m)，4.72-5.00(m)，5.21(2H，dd，J＝40.9，19.8Hz)，5.52(2H，dd，J＝40.9，16.8Hz)，6.94-7.19(3H，m)，7.32-7.40(2H，m)，7.60(1H，d，J＝7.9Hz)，7.70(1H，td，J＝8.3，1.3Hz)，7.87(1H，td，J＝8.6，1.3Hz)，8.08(1H，d，J＝7.3Hz)，8.17(1H，d，J＝8.6Hz)，8.59(1H，s)；MS：(LCMS)m/z664[M+H]⁺。

实施例32：

20-O-[(S)-苯基丙氨酰基-γ-(R)-谷氨酰基]-20(S)-喜树碱盐酸盐由2(R)-[(2(S)-叔丁氧基羰基氨基-3-苯基-丙酰基氨基]-戊二酸1-叔丁酯制备。

¹H-NMR：(270MHz，CD₃OD)δ0.97(3H，t，J＝7.3Hz)，1.60-2.38(7H，m)，2.98(2H，d，J＝7.9Hz)，3.14-3.29(m)，4.00(1H，t，J＝7.3Hz)，4.28-4.39(1H，m)，4.70-4.89(m)，5.29(2H，d，J＝4.6Hz)，5.54(2H，dd，J＝40.3，16.8Hz)，7.02-7.32(7H，m)，7.62(1H，td，J＝7.3，1.0Hz)，7.77(1H，td，J＝8.6，1.7Hz)，7.99(1H，d，J＝8.2Hz)，8.05(1H，d，J＝8.6Hz)，8.52(1H，s)；MS：(LCMS)m/z625[M+H]⁺。

实施例33

20-O-[(S)-亮氨酰基-γ-(R)-谷氨酰基]-20(S)-喜树碱盐酸盐由2(R)-[2(S)-叔丁氧基羰基氨基-4-甲基-戊酰基氨基]-戊二酸1-叔丁酯制备。

¹H-NMR：(270MHz，CD₃OD)δ0.91-1.09(10H，m)，1.60-1.81(2H，m)，1.94-2.41(3H，m)，2.70(2H，d，J＝8.6Hz)，3.23-3.38(m)，3.82-3.98(1H，m)，4.43-4.54(1H，m)，4.79-4.97(m)，5.32(2H，brs)，5.54(2H，dd，J＝38.9，16.8Hz)，7.40(1H，s)，7.71(1H，td，J＝7.3，1.3Hz)，7.82-7.93(1H，m)，8.08(1H，d，J＝7.3Hz)，8.18(1H，d，J＝8.6Hz)，8.64(1H，s)；MS：(LCMS)m/z 591[M+H]⁺。

实施例34

20-O-[(R)-色氨酰基-γ-(S)-谷氨酰基]-20(S)-喜树碱盐酸盐由2(S)-[2(R)-叔丁氧基羰基氨基-3-(1H-吲哚-3-基)-丙酰基氨基]-戊二酸1-叔丁酯制备。

¹H-NMR：(270MHz，CD₃OD)δ0.97-1.10(3H，m)，1.68-2.48(9H，m)，2.62-2.78(1H，m)，2.94-3.47(m)，3.93-4.36(3H，m)，4.46-4.58(1H，m)，4.80-4.98(m)，5.02-5.29(2H，m)，5.52(2H，dd，J＝40.3，17.2Hz)，6.85(1H，s)，6.96-7.24(5H，m)，7.34(2H，s)，7.39(1H，s)，7.44(2H，t，J＝7.6Hz)，7.62(1H，d，J＝7.9Hz)，7.71(2H，t，J＝6.9Hz)，7.78-7.90(2H，m)，8.00-8.18(4H，m)，8.49(1H，s)，8.58(1H，s)；MS：(LCMS)m/z 664[M+H]⁺。

实施例35

20-O-[(R)-苯基丙氨酰基-γ-(R)-谷氨酰基]-20(S)-喜树碱盐酸盐由2(R)-[(2(R)-叔丁氧基羰基氨基-3-苯基-丙酰基氨基]-戊二酸1-叔丁酯制备。

¹H-NMR：(270MHz，CD₃OD)δ1.03(3H，t，J＝7.6Hz)，1.90-2.38(4H，m)，2.65-2.78(2H，m)，2.94-3.08(1H，m)，3.22-3.34(m)，4.10-4.22(1H，m)，4.48-4.57(1H，m)，4.73-4.98(m)，5.30(2H，brs)，5.54(2H，dd，J＝40.3，16.8Hz)，7.21-7.43(6H，m)，7.70(1H，t，J＝7.9Hz)，7.81-7.92(1H，m)，8.08(1H，d，J＝8.2Hz)，8.17(1H，d，J＝8.6Hz)，8.62(1H，s)；MS：(LCMS)m/z 625[M+H]⁺。

实施例36

20-O-[(R)-亮氨酰基-γ-(R)-谷氨酰基]-20(S)-喜树碱盐酸盐由2(R)-[2(R)-叔丁氧基羰基氨基-4-甲基-戊酰基氨基]-戊二酸1-叔丁酯制备。

¹H-NMR：(270MHz，CD₃OD)δ0.91-1.09(9H，m)，1.58-2.39(8H，m)，2.68-2.80(2H，m)，3.25-3.34(m)，3.86-3.98(1H，m)，4.49-4.60(1H，m)，4.79-4.97(m)，5.31(2H，brs)，5.54(2H，dd，J＝38.9，16.8Hz)，7.40(1H，s)，7.68-7.75(1H，m)，7.83-7.93(1H，m)，8.08(1H，d，J＝8.2Hz)，8.18(1H，d，J＝8.3Hz)，8.64(1H，s)；MS：(LCMS)m/z 591[M+H]⁺。

实施例37

7-乙基-10-羟基-20-O-[(R)-色氨酰基-γ-(R)-高谷氨酰基]-20(S)-喜树碱盐酸盐由2(R)-[2(R)-叔丁氧基羰基氨基-3-(1H-吲哚-3-基)-丙酰基氨基]-己二酸1-叔丁酯制备。

¹H-NMR：(270MHz，CD₃OD)δ1.04(3H，t，J＝7.6Hz)，1.39(3H，t，J＝7.6Hz)，1.60-2.34(6H，m)，2.53-2.70(2H，m)，3.02-3.49(m)，4.09-4.19(1H，m)，4.38-4.52(1H，m)，5.16-5.33(2H，m)，5.52(2H，dd，J＝41.2，17.3Hz)，6.92-7.48(8H，m)，7.65(1H，d，J＝8.1Hz)，7.98-8.08(1H，m)；MS：(LCMS)m/z[M+H]⁺。

实施例38

7-乙基-10-羟基-20-O-[(R)-色氨酰基-γ-(R)-谷氨酰基]-20(S)-喜树碱盐酸盐由2(R)-[2(R)-叔丁氧基羰基氨基-3-(1H-吲哚-3-基)-丙酰基氨基]-戊二酸1-叔丁酯制备。

¹H-NMR：(270MHz，CD₃OD)δ1.03(3H，t，J＝7.3Hz)，1.36(3H，t，J＝7.6Hz)，2.01-2.36(4H，m)，2.73(2H，t，J＝7.3Hz)，3.02-3.18(3H，m)，3.26-3.44(m)，4.15(1H，dd，J＝8.9，5.4Hz)，4.52(1H，dd，J＝9.2，4.6Hz)，4.82-4.98(m)，5.09(2H，dd，J＝44.6，18.6Hz)，5.52(2H，dd，J＝44.0，16.7Hz)，6.99-7.15(4H，m)，7.29(1H，s)，7.34-7.43(3H，m)，7.60(1H，d，J＝8.1Hz)，8.00(1H，d，J＝9.7Hz)；MS：(LCMS)m/z 708[M+H]⁺。

实施例39

7-乙基-10-羟基-20-O-[(S)-苯基丙氨酰基-γ-(R)-谷氨酰基]-20(S)-喜树碱盐酸盐由2(R)-[2(S)-叔丁氧基羰基氨基-3-苯基-丙酰基氨基)-]-戊二酸1-叔丁酯制备。

¹H-NMR：(270MHz，CD₃OD)δ1.05(3H，t，J＝7.4Hz)，1.38(3H，t，J＝7.6Hz)，1.86(1H，m)，2.05-2.40(5H，m)，3.04(2H，br.d)，3.14(2H，br.q)，4.08(1H，t，J＝7.4Hz)，4.42(1H，m)，5.16(1H，d，J＝18.8Hz)，5.26(1H，d，J＝18.8Hz)，5.46(1H，d，J＝16.8Hz)，5.62(1H，d，J＝16.8Hz)，7.13(2H，m)，7.28(4H，m)，7.42(2H，m)，8.00(1H，d，J＝7.3Hz)；MS：(FABMS)m/z 669[M+H]⁺。

实施例40

7-乙基-10-羟基-20-O-[(S)-苯基丙氨酰基-β-(S)-天冬氨酰基]-20(S)-喜树碱盐酸盐由2(S)-[(2(S)-叔丁氧基羰基氨基-3-苯基-丙酰基氨基)-琥珀酸1-叔丁酯制备。

¹H-NMR：(270MHz，CD₃OD)δ1.04(3H，t，J＝7.4Hz)，1.43(3H，t，J＝7.6Hz)，2.22(2H，m)，2.97-3.35(6H，m)，4.15(1H，m)，4.83(1H，m)，5.38(2H，s)，5.50(1H，d，J＝17.2Hz)，5.63(1H，d，J＝17.2Hz)，7.30(5H，s)，7.57-7.68(3H，m)，8.23(1H，m)；MS：(FABMS)m/z 655[M+H]⁺。

实施例41

7-乙基-10-羟基-20-O-[(S)-亮氨酰基-β-(S)-天冬氨酰基]-20(S)-喜树碱盐酸盐由2(S)-[(2(S)-叔丁氧基羰基氨基-4-甲基-戊酰基氨基)-琥珀酸1-叔丁酯制备。

¹H-NMR：(270MHz，CD₃OD)δ0.94-1.08(9H，m)，1.42(3H，t，J＝7.6Hz)，1.61-1.83(3H，m)，2.12-2.31(2H，m)，3.18-3.35(4H，m)，3.88(1H，m)，4.85(1H，m)，5.38(2H，s)，5.50(1H，d，J＝17.2Hz)，5.63(1H，d，J＝17.2Hz)，7.50-7.61(3H，m)，8.16(1H，d，J＝9.2Hz)；MS：(FABMS)m/z 621[M+H]⁺。

实施例42

20-O-[(S)-色氨酰基-β-(R)-天冬氨酰基]-20(S)-喜树碱盐酸盐由2(R)-[(2(S)-叔丁氧基羰基氨基-3-(1H-吲哚-3-基)-丙酰基氨基]-琥珀酸1-叔丁酯制备。

¹H-NMR：(270MHz，DMSO-d6)δ0.87(3H，t，J＝7.6Hz)，2.18(2H，m)，2.70-3.03(4H，m)，3.84(1H，m)，4.34(1H，d，J＝19.2Hz)，4.70(1H，m)，4.98(1H，d，J＝19.2Hz)，5.49(2H，s)，6.56(1H，t，J＝7.5Hz)，6.77(1H，s)，6.93(1H，t，J＝7.2Hz)，7.07(1H，d，J＝7.9Hz)，7.14(1H，s)，7.25(1H，d，J＝7.9Hz)，7.70(1H，t，J＝7.0Hz)，7.84(4H，m)，8.01(1H，d，J＝7.6Hz)，8.11(1H，d，J＝8.6Hz)，8.25(1H，s)，9.05(1H，d，J＝8.6Hz)，10.8(1H，s)；MS：(FABMS)m/z 650[M+H]⁺。

实施例43

20-O-[(S)-苯基丙氨酰基-β-(R)-天冬氨酰基]-20(S)-喜树碱盐酸盐由2(R)-[(2(S)-叔丁氧基羰基氨基-3-苯基-丙酰基氨基)-琥珀酸1-叔丁酯制备。

¹H-NMR：(270MHz，DMSO-d6)δ0.90(3H，t，J＝7.3Hz)，2.18(2H，m)，2.55-3.05(4H，m)，3.95(1H，m)，4.68(1H，m)，4.74(1H，d，J＝19.3Hz)，5.13(1H，d，J＝19.3Hz)，5.50(2H，s)，6.76(2H，d，J＝7.3Hz)，6.99(2H，t，J＝7.5Hz)，7.13(1H，t，J＝7.6Hz)，7.14(1H，s)，7.73(1H，t，J＝7.6Hz)，7.88(1H，t，J＝7.3Hz)，7.94(3H，m)，8.14(2H，br.t)，8.53(1H，s)，9.03(1H，d，J＝8.6Hz)；MS：(FABMS)m/z 611[M+H]⁺。

实施例44

20-O-[(R)-苯基丙氨酰基-β-(R)-天冬氨酰基]-20(S)-喜树碱盐酸盐由2(R)-[(2(R)-叔丁氧基羰基氨基-3-苯基-丙酰基氨基)-琥珀酸1-叔丁酯制备。

¹H-NMR：(270MHz，DMSO-d6)δ0.91(3H，t，J＝7.5Hz)，2.18(2H，m)，2.87-3.09(4H，m)，3.99(1H，m)，4.67(1H，m)，5.26(2H，br.s)，5.50(2H，br.s)，7.16-7.27(6H，m)，7.74(1H，br.t)，7.88(1H，br.t)，8.03(3H，m)，8.16(2H，br.t)，8.69(1H，s)，9.12(1H，d，J＝7.9Hz)；MS：(FABMS)m/z 611[M+H]⁺。

实施例45

20-O-[(S)-苯基丙氨酰基-β-(S)-天冬氨酰基]-20(S)-喜树碱盐酸盐由2(S)-[(2(S)-叔丁氧基羰基氨基-3-苯基-丙酰基氨基)-琥珀酸1-叔丁酯制备。

¹H-NMR：(270MHz，CD₃OD)δ1.04(3H，t，J＝7.4Hz)，2.13-2.32(2H，m)，2.96-3.37(4H，m)，4.13(1H，m)，4.85(1H，m)，5.36(2H，s)，5.49(1H，d，J＝17.2Hz)，5.62(1H，d，J＝17.2Hz)，7.30(5H，br.s)，7.50(1H，s)，7.76(1H，br.t)，7.93(1H，br.t)，8.14(1H，d，J＝7.6Hz)，8.22(1H，d，J＝8.6Hz)，8.76(1H，s)；MS：(FABMS)m/z 611[M+H]⁺.

实施例46

20-O-[(S)-亮氨酰基-β-(R)-天冬氨酰基]-20(S)-喜树碱盐酸盐由2(R)-[(2(S)-叔丁氧基羰基氨基-4-甲基-戊酰基氨基)-琥珀酸1-叔丁酯制备。

¹H-NMR：(270MHz，DMSO-d6)δ0.67(3H，d，J＝7.4Hz)，0.68(3H，d，J＝7.4Hz)，0.89(3H，t，J＝7.6Hz)，1.43-1.62(3H，m)，2.15(2H，m)，3.03(2H，m)，3.78(1H，m)，4.64(1H，m)，5.32(2H，br.s)，5.48(2H，br.s)，7.17(1H，s)，7.74(1H，br.t)，7.89(1H，br.t)，8.16(5H，m)，8.72(1H，s)，8.95(1H，d，J＝7.3Hz)；MS：(FABMS)m/z 577[M+H]⁺。

实施例47

20-O-[(S)-缬氨酰基-β-(R)-天冬氨酰基]-20(S)-喜树碱盐酸盐由2(R)-[(2(S)-叔丁氧基羰基氨基-3-甲基-丁酰基氨基]-琥珀酸1-叔丁酯制备。

¹H-NMR：(270MHz，CD₃OD)δ0.66(3H，d，J＝6.9Hz)，0.70(3H，d，J＝6.9Hz)，1.03(3H，t，J＝7.5Hz)，1.98(1H，m)，2.22(2H，m)，3.22(2H，m)，3.64(1H，d，J＝5.3Hz)，4.85(1H，m)，5.38(2H，br.s)，5.48(1H，d，J＝16.8Hz)，5.61(1H，d，J＝16.8Hz)，7.47(1H，s)，7.77(1H，br.t)，7.94(1H，br.t)，8.13(1H，br.d)，8.22(1H，br.d)，8.75(1H，s)；MS：(FABMS)m/z 563[M+H]⁺。

实施例48

7-乙基-10-羟基-20-O-[(S)-环己基丙氨酰基-γ-(R)-谷氨酰基]-20(S)-喜树碱盐酸盐由2(R)-[(2(S)-叔丁氧基羰基氨基-3-环己基-丙酰基氨基)-戊二酸1-叔丁酯制备。

¹H-NMR：(270MHz，DMSO-D6)δ0.81-2.66(22H，m)，0.92(3H，t，J＝7.3Hz)，1.29(3H，t，J＝7.6Hz)，3.02-3.17(2H，m)，3.76-3.88(1H，m)，4.27-4.39(1H，m)，5.30(1H，s)，5.49(1H，s)，7.00(1H，d，J＝8.2Hz)，7.43-7.47(2H，m)，8.03(1H，dd，J＝3.0，8.2Hz)，8.22(2H，bs)，8.94(1H，d，J＝4.9Hz)；MS：(FABMS)m/z 675[M+H]⁺。

实施例49

7-乙基-10-羟基-20-O-[(S)-环己基丙氨酰基-γ-(S)-谷氨酰基]-20(S)-喜树碱盐酸盐由2(S)-[(2(S)-叔丁氧基羰基氨基-3-环己基-丙酰基氨基)-戊二酸1-叔丁酯制备。

¹H-NMR：(270MHz，DMSO-d6)δ0.77-2.85(22H，m)，0.92(3H，t，J＝7.3Hz)，1.29(3H，t，J＝7.6Hz)，3.01-3.17(2H，m)，3.76-3.90(1H，m)，4.30-4.45(1H，m)，5.31(1H，s)，5.50(1H，s)，7.02(1H，d，J＝4.6Hz)，7.40-7.50(2H，m)，8.04(1H，d，J＝9.6Hz)，8.22(2H，bs)，8.78(1H，d，J＝7.6Hz)；MS：(FABMS)m/z 675[M+H]⁺。

实施例49-1至实施例49-25的化合物由(9S)-9-乙基-9-羟基-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮，利用式(VII)的不同二肽衍生物通过类似于实施例24的方法制备。二肽列于下表中

实施例	二肽部分
实施例	二肽部分	49-1	HCL.(L)Trp-(L)-γ-Glu-
49-2	HCL.(L)环己基丙氨酰基-(D)-γ-Glu-	49-1	HCL.(L)Trp-(L)-γ-Glu-
49-2	HCL.(L)环己基丙氨酰基-(D)-γ-Glu-	49-3	HCL.(L)Phe-(D)-γ-Glu-
49-4	HCL.(L)Leu-(D)-γ-Glu-	49-3	HCL.(L)Phe-(D)-γ-Glu-
49-4	HCL.(L)Leu-(D)-γ-Glu-	49-5	2HCL.(L)Lys-(L)-γ-Glu-
49-6	HCL.(L)Val-(D)-γ-Glu-	49-5	2HCL.(L)Lys-(L)-γ-Glu-
49-6	HCL.(L)Val-(D)-γ-Glu-	49-7	2HCL.(L)Orn-(L)-γ-Glu-
49-8	MsOH.(L)Leu-(D)-γ-Glu-	49-7	2HCL.(L)Orn-(L)-γ-Glu-
49-8	MsOH.(L)Leu-(D)-γ-Glu-	49-9	2HCL.(D)Lys-(L)-γ-Glu-
49-10	HCL.(L)Phe-(L)-β-Asp-	49-9	2HCL.(D)Lys-(L)-γ-Glu-
49-10	HCL.(L)Phe-(L)-β-Asp-	49-11	HCL.(L)环己基alanyk-(D)-β-Asp-
49-12	HCL.(L)环己基丙氨酰基-(L)-β-Asp-	49-11	HCL.(L)环己基alanyk-(D)-β-Asp-
49-12	HCL.(L)环己基丙氨酰基-(L)-β-Asp-	49-13	HCL.(L)Trp-(L)-β-Asp-
49-14	2HCL.(L)Orn-(D)-γ-Glu-	49-13	HCL.(L)Trp-(L)-β-Asp-
49-14	2HCL.(L)Orn-(D)-γ-Glu-	49-15	HCL.(L)Leu-(D)-β-Asp-
49-16	HCL.(L)Val-(D)-β-Asp-	49-15	HCL.(L)Leu-(D)-β-Asp-
49-16	HCL.(L)Val-(D)-β-Asp-	49-17	HCL.(L)Leu-(L)-β-Asp-
49-18	HCL.(L)环己基甘氨酰基-(L)-γ-Glu-	49-17	HCL.(L)Leu-(L)-β-Asp-
49-18	HCL.(L)环己基甘氨酰基-(L)-γ-Glu-	49-19	HCL.(D)环己基丙氨酰基-(L)-γ-Glu-
49-20	2HCL.(L)Lys-(D)-γ-Glu-	49-19	HCL.(D)环己基丙氨酰基-(L)-γ-Glu-
49-20	2HCL.(L)Lys-(D)-γ-Glu-	49-21	HCL..(L)Trp-(D)-γ-Glu-
49-22	HCL.(L)Leu-(L)-γ-Glu-	49-21	HCL..(L)Trp-(D)-γ-Glu-
49-22	HCL.(L)Leu-(L)-γ-Glu-	49-23	HCL.Gly-(D)-γ-Glu-
49-24	HCL.(L)Ala-(D)-γ-Glu-	49-23	HCL.Gly-(D)-γ-Glu-
49-24	HCL.(L)Ala-(D)-γ-Glu-	49-25	HCL.(L)Phe-(D)-γ-Glu-

实施例49-1

(9S)-9-乙基-9-[(L)-色氨酰基-(L)-γ-谷氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮盐酸盐

MS(FAB)m/z 774(MH⁺)；¹H NMR(270MHz，CD₃OD)δ0.98(t，J＝7.0Hz，3H)，1.03(t，J＝7.6Hz，3H)，1.39-2.32(m，10H)，2.71-3.47(m，4H)，4.10-4.23(m，2H)，4.35(m，2H)，5.28(d，J＝17.2Hz，1H)，5.38(d，J＝17.2Hz，1H)，5.48(d，J＝17.2Hz，1H)，5.63(d，J＝17.2Hz，1H)，6.83(t，J＝7.3Hz，1H)，7.05(br.t，1H)，7.11(s，1H)，7.34(d，J＝7.9Hz，1H)，7.48(d，J＝7.3Hz，1H)，7.62(d，J＝7.9Hz，1H)，7.92(t，J＝7.6Hz，1H)，7.97(br.d，1H)，8.00(s，1H)，8.27(s，1H)。

实施例49-2

(9S)-9-乙基-9-[(L)-环己基丙氨酰基-(D)-γ-谷氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮盐酸盐

MS(FAB)m/z 741(MH⁺)；¹H NMR(270MHz，CD₃OD)δ0.99(t，J＝7.3Hz，3H)，1.04(t，J＝7.3Hz，3H)，1.00-2.36(m，23H)，2.70-2.85(m，2H)，2.95(br.t，J＝7.8Hz，2H)，4.01(m，1H)，4.24(br.t，2H)，4.42(m，1H)，5.48(d，J＝17.5Hz，1H)，5.51(s，2H)，5.63(d，J＝17.5Hz，1H)，7.54(d，J＝7.9Hz，1H)，7.83(s，1H)，7.95(d，J＝7.6Hz，1H)，8.06(br.t，1H)，8.36(s，1H)。

实施例49-3

(9S)-9-乙基-9-[(L)-苯基丙氨酰基-(D)-γ-谷氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮盐酸盐

MS(FAB)m/z 735(MH⁺)；¹H NMR(270MHz，CD₃OD)δ0.99(t，J＝7.3Hz，3H)，1.06(t，J＝7.3Hz，3H)，1.39-1.60(m，4H)，1.86-2.31(m，6H)，2.34-2.74(m，2H)，3.05-3.25(m，2H)，4.15-4.25(m，3H)，4.42(m，1H)，5.46(s，2H)，5.48(d，J＝17.2Hz，1H)，5.62(d，J＝17.2Hz，1H)，7.20-7.31(m，5H)，7.50(d，J＝7.6Hz，1H)，7.82(s，1H)，7.90(d，J＝8.3Hz，1H)，8.00(br.t，1H)，8.32(s，1H)。

实施例49-4

(9S)-9-乙基-9-[(L)-亮氨酰基-(D)-γ-谷氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮盐酸盐

MS(FAB)m/z 701(MH⁺)；¹H NMR(270MHz，CD₃OD)δ0.94-1.08(m，12H)，1.39-2.35(m，13H)，2.65-2.85(m，2H)，3.98(m，1H)，4.23(br.t，2H)，4.42(m，1H)，5.49(d，J＝17.5Hz，1H)，5.50(s，2H)，5.63(d，J＝17.5Hz，1H)，7.53(d，J＝7.9Hz，1H)，7.79(s，1H)，7.92(d，J＝8.3Hz，1H)，8.06(br.t，1H)，8.35(s，1H)。

实施例49-5

(9S)-9-乙基-9-[(L)-赖氨酰基-(L)-γ-谷氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮二盐酸盐

MS(FAB)m/z 716(MH⁺)；¹H NMR(400MHz，CD₃OD)δ0.99(t，J＝7.2Hz，3H)，1.04(t，J＝7.2Hz，3H)，1.46-2.30(m，16H)，2.76-2.90(m，2H)，2.95(br.t，J＝7.8Hz，2H)，4.07(t，J＝6.6Hz，1H)，4.22(br.t，2H)，4.55(dd，J＝10.0，4.4Hz，1H)，5.49(d，J＝16.8Hz，1H)，5.50(s，2H)，5.63(d，J＝16.8Hz，1H)，7.51(d，J＝8.0Hz，1H)，7.81(s，1H)，7.93(d，J＝8.0Hz，1H)，8.06(t，J＝8.0Hz，1H)，8.30(s，1H)。

实施例49-6

(9S)-9-乙基-9-[(L)-缬氨酰基-(D)-γ-谷氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮盐酸盐

MS(FAB)m/z 687(MH⁺)；¹H NMR(270MHz，CD₃OD)δ0.97-1.11(m，12H)，1.40-1.59(m，4H)，1.88-2.33(m，7H)，2.66-2.89(m，2H)，3.80(d，J＝5.6Hz，1H)，4.23(br.t，2H)，4.43(dd，J＝9.2，4.6Hz，1H)，5.49(d，J＝17.5Hz，1H)，5.51(s，2H)，5.63(d，J＝17.5Hz，1H)，7.54(d，J＝7.6Hz，1H)，7.80(s，1H)，7.93(d，J＝7.6Hz，1H)，8.08(br.t，1H)，8.35(s，1H)。

实施例49-7

(9S)-9-乙基-9-[(L)-鸟氨酰基-(L)-γ-谷氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮二盐酸盐

MS(FAB)m/z 702(MH⁺)；¹H NMR(270MHz，CD₃OD)δ0.99(t，J＝7.3Hz，3H)，1.04(t，J＝7.3Hz，3H)，1.40-2.38(m，14H)，2.68-3.00(m，2H)，3.01(br.t，2H)，4.11(m，1H)，4.24(br.t，2H)，4.57(m，1H)，5.48(d，J＝17.2Hz，1H)，5.51(s，2H)，5.64(d，J＝17.2Hz，1H)，7.57(d，J＝7.3Hz，1H)，7.93(s，1H)，8.01(d，J＝8.3Hz，1H)，8.11(br.t，1H)，8.33(s，1H)。

实施例49-8

(9S)-9-乙基-9-[(L)-亮氨酰基-(D)-γ-谷氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮甲磺酸盐

MS(FAB)m/z 701(MH⁺)；¹H NMR(270MHz，CD₃OD)δ0.95-1.08(m，12H)，1.39-2.35(m，13H)，2.66-2.75(m，2H)，2.72(s，9H)，3.96(m，1H)，4.25(br.t，2H)，4.45(m，1H)，5.49(d，J＝17.5Hz，1H)，5.51(s，2H)，5.63(d，J＝17.5Hz，1H)，7.52(s，1H)，7.54(d，J＝7.9Hz，1H)，7.88(d，J＝8.6Hz，1H)，8.09(br.t，1H)，8.38(s，1H)。

实施例49-9

(9S)-9-乙基-9-[(D)-赖氨酰基-(L)-γ-谷氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮二盐酸盐

MS(FAB)m/z 716(MH⁺)；¹H NMR(400MHz，CD₃OD)δ0.95-1.07(m，6H)，1.42-2.30(m，16H)，2.64-2.95(m，2H)，2.99(br.t，2H)，4.02(br.t，1H)，4.26(m，2H)，4.39(m，1H)，5.51(d，J＝17.2Hz，1H)，5.52(s，2H)，5.63(d，J＝17.2Hz，1H)，7.55(d，J＝7.2Hz，1H)，7.96(s，1H)，7.99(br.d，1H)，8.09(br.t，1H)，8.33(s，1H)

实施例49-10

(9S)-9-乙基-9-[(L)-苯基丙氨酰基-(L)-β-天冬氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮盐酸盐

MS(FAB)m/z 721(MH⁺)；¹H NMR(270MHz，CD₃OD)δ0.99(t，J＝7.3Hz，3H)，1.04(t，J＝7.3Hz，3H)，1.42-2.30(m，8H)，2.98-3.37(m，4H)，4.17(m，1H)，4.24(br.t，2H)，4.82(m，1H)，5.50(s，2H)，5.51(d，J＝17.2Hz，1H)，5.62(d，J＝17.2Hz，1H)，7.31(br.s，5H)，7.53(d，J＝7.3Hz，1H)，7.68(s，1H)，7.83(d，J＝7.6Hz，1H)，8.08(br.t，1H)，8.36(s，1H)

实施例49-11

(9S)-9-乙基-9-[(L)-环己基丙氨酰基-(D)-β-天冬氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮盐酸盐

MS(FAB)m/z 727(MH⁺)；¹H NMR(270MHz，CD₃OD)δ0.98(t，J＝7.3Hz，3H)，1.04(t，J＝7.3Hz，3H)，0.80-2.27(m，21H)，3.23(br.d，J＝6.0Hz，2H)，3.98(m，1H)，4.24(br.t，2H)，4.85(m，1H)，5.50(d，J＝17.2Hz，1H)，5.52(s，2H)，5.63(d，J＝17.2Hz，1H)，7.54(d，J＝7.6Hz，1H)，7.72(s，1H)，7.87(d，J＝7.6Hz，1H)，8.09(t，J＝7.6Hz，1H)，8.36(s，1H)

实施例49-12

(9S)-9-乙基-9-[(L)-环己基丙氨酰基-(L)-β-天冬氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮盐酸盐

MS(FAB)m/z 727(MH⁺)；¹H NMR(270MHz，CD₃OD)δ0.98(t，J＝7.3Hz，3H)，1.04(t，J＝7.3Hz，3H)，0.90-2.30(m，21H)，3.12-3.34(m，2H)，3.93(m，1H)，4.22(br.t，2H)，4.83(m，1H)，5.50(s，2H)，5.51(d，J＝17.5Hz，1H)，5.63(d，J＝17.5Hz，1H)，7.47(br.d，1H)，7.65(br.s，1H)，7.82(br.d，1H)，8.03(br.t，1H)，8.30(s，1H)

实施例49-13

(9S)-9-乙基-9-[(L)-色氨酰基-(L)-β-天冬氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮盐酸盐

MS(FAB)m/z 760(MH⁺)；¹H NMR(270MHz，CD₃OD)δ0.98(t，J＝6.9Hz，3H)，1.00(t，J＝7.3Hz，3H)，1.39-1.60(m，4H)，1.83-1.97(m，2H)，2.13-2.30(m，2H)，3.05-3.40(m，4H)，4.12(m，2H)，4.29(m，1H)，4.79(m，1H)，5.27(d，J＝17.8Hz，1H)，5.36(d，J＝17.8Hz，1H)，5.51(d，J＝17.5Hz，1H)，5.63(d，J＝17.5Hz，1H)，6.86(br.t，1H)，7.06(br.t，1H)，7.10(s，1H)，7.29(d，J＝8.3Hz，1H)，7.43(d，J＝7.9Hz，1H)，7.53(d，J＝7.3Hz，1H)，7.84(s，1H)，7.85(d，J＝8.3Hz，1H)，8.06(br.t，1H)，8.30(s，1H)

实施例49-14

(9S)-9-乙基-9-[(L)-鸟氨酰基-(D)-γ-谷氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮二盐酸盐

MS(LCMS)m/z 702(MH⁺)；¹H NMR(400MHz，CD₃OD)δ0.98(t，J＝7.0Hz，3H)，1.04(t，J＝7.4Hz，3H)，1.46-2.21(m，14H)，2.77-2.81(m，2H)，3.01(br.t，J＝7.4Hz，2H)，4.03(t，J＝6.6Hz，1H)，4.24(m，2H)，4.44(m，1H)，5.50(d，J＝16.8Hz，1H)，5.51(s，2H)，5.63(d，J＝16.8Hz，1H)，7.54(d，J＝8.0Hz，1H)，7.91(s，1H)，7.95(d，J＝8.0Hz，1H)，8.09(t，J＝8.0Hz，1H)，8.34(s，1H)

实施例49-15

(9S)-9-乙基-9-[(L)-亮氨酰基-(D)-β-天冬氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮盐酸盐

¹H NMR(270MHz)δ(CD₃OD)0.80-0.91(m，6H)，0.91-1.06(m，6H)，1.37-1.80(m，7H)，2.83-2.01(m，2H)，2.07-2.30(m，2H)，3.15-3.40(m，2H)，3.88-4.00(m，1H)，4.25(br.t，2H)，4.74-4.93(m，1H)，5.50(d，J＝17.2Hz，1H)，5.52(s，2H)，5.62(d，J＝17.2Hz，1H)，7.55(d，J＝7.9Hz，1H)，7.75(s，1H)，7.88(d，J＝8.6Hz，1H)，8.10(br.t，1H)，8.37(s，1H)；MS(FAB)m/z 687(MH⁺)

实施例49-16

(9S)-9-乙基-9-[(L)-缬氨酰基-(D)-β-天冬氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮盐酸盐

¹H NMR(270MHz)δ(CD₃OD)0.86(d，J＝6.9Hz，3H)，0.88(d，J＝6.9Hz，3H)，0.94-1.08(m，6H)，1.40-1.61(m，4H)，1.89-2.05(m，2H)，2.05-2.28(m，3H)，3.13-3.38(m，2H)，3.77(d，J＝5.3Hz，1H)，4.25(br.t，2H)，4.77-4.91(m，1H)，5.49(d，J＝17.2Hz，1H)，5.53(s，2H)，5.62(d，J＝17.2Hz，1H)，7.55(d，J＝7.3Hz，1H)，7.79(s，1H)，7.91(d，J＝7.6Hz，1H)，8.10(br.t，1H)，8.37(s，1H)；MS(FAB)m/z 673(MH⁺)

实施例49-17

(9S)-9-乙基-9-[(L)-亮氨酰基-(L)-β-天冬氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮盐酸盐

¹H NMR(270MHz)δ(CD₃OD)0.79-1.00(m，12H)，1.30-1.51(m，4H)，1.30-1.75(m，3H)，1.75-1.92(m，2H)，2.00-2.21(m，2H)，3.00-3.30(m，2H)，3.76-3.85(m，1H)，4.09-4.20(m，2H)，4.68-4.85(m，1H)，5.41(d，J＝17.3Hz，1H)5.43(s，2H)，5.57(d，J＝17.3Hz，1H)，7.43(d，J＝7.6Hz，1H)，7.65(s，1H)，7.76(d，J＝8.2Hz，1H)，7.99(br.t，1H)，8.27(s，1H)；MS(FAB)m/z 687(MH⁺)

实施例49-18

(9S)-9-乙基-9-[(L)-环己基甘氨酰基-(L)-γ-谷氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮盐酸盐

¹H NMR(270MHz)δ(CD₃OD)0.92-1.07(m，6H)，1.7.-2.30(m，21H)，2.62-3.09(m，2H)，3.87(d，J＝5.6Hz，1H)，4.24(br.t，2H)，4.40-4.51(m，1H)，5.48(d，J＝17.2Hz，1H)，5.51(s，2H)，5.63(d，J＝17.2Hz，1H)，7.53(d，J＝7.6Hz，1H)，7.88(s，1H)，7.97(d，J＝8.0Hz，1H)，8.06(br.t，1H)，8.32(s，1H)；MS(FAB)m/z 727(MH⁺)

实施例49-19

(9S)-9-乙基-9-[(D)-环己基丙氨酰基-(L)-γ-谷氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮盐酸盐

¹H NMR(270MHz)δ(CD₃OD)0.93-1.08(m，6H)，1.15-2.36(m，23H)，2.60-2.94(m，2H)，3.99(br.t，1H)，4.22(br.t，2H)，4.37-4.45(m，1H)，5.49(d，J＝17.3Hz，1H)，5.50(s，2H)，5.62(d，J＝17.3Hz，1H)，7.51(d，J＝7.9Hz，1H)，7.80(s，1H)，7.91(d，J＝8.2Hz，1H)，8.05(br.t，1H)，8.32(s，1H)；MS(FAB)m/z 741(MH⁺)

实施例49-20

(9S)-9-乙基-9-[(L)-赖氨酰基-(D)-γ-谷氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮二盐酸盐

¹H NMR(270MHz)δ(CD₃OD)0.92-1.10(m，6H)，1.40-1.62(m，6H)，1.62-1.80(m，2H)，1.83-2.41(m，8H)，2.70-2.82(m，2H)，2.89-3.00(m，2H)，3.93-4.03(m，1H)，4.16-4.31(m，2H)，4.40-4.50(m，1H)，5.30(d，J＝17.2Hz，1H)，5.53(s，2H)，5.63(d，J＝17.2Hz，1H)，7.54(d，J＝7.6Hz，1H)，7.87(s，1H)，7.94(d，J＝8.2Hz，1H)，8.10(br.t，1H)，8.35(s，1H)；MS(FAB)m/z716(MH⁺)

实施例49-21

(9S)-9-乙基-9-[(L)-色氨酰基-(D)-γ-谷氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮盐酸盐

¹H NMR(270MHz，CD₃OD)δ0.99(t，J＝7.3Hz，3H)，1.04(t，J＝7.3Hz，3H)，1.40-2.39(m，9H)，2.19(t，J＝7.3Hz，1H)，2.58-2.74(m，1H)，2.91-3.05(m，1H)，3.10(dd，J＝15.2，5.6Hz，1H)，3.40(dd，J＝15.2，5.6Hz，1H)，3.95-4.15(m，2H)，4.21(br.t，J＝5.6Hz，1H)，4.58-4.69(m，1H)，5.00(d，J＝8.3Hz，1H)，5.20(d，J＝8.3Hz，1H)，5.48(d，J＝7.3Hz，1H)，5.67(d，J＝7.3Hz，1H)，6.59(t，J＝7.3Hz，1H)，6.66(s，1H)，6.94-7.03(m，2H)，7.25(d，J＝7.9Hz，1H)，7.45(d，J＝7.6Hz，1H)，7.87(d，J＝7.6Hz，1H)，7.92(s，1H)，7.97(t，J＝7.6Hz，1H)，8.18(s，1H)；MS(FAB)m/z 774(MH⁺)

实施例49-22

(9S)-9-乙基-9-[(L)-亮氨酰基-(L)-γ-谷氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮盐酸盐

¹H NMR(270MHz)δ(CD₃OD)1.01-1.06(m，12H)，1.39-2.32(m，13H)，2.67-2.79(m，1H)，2.89-2.98(m，1H)，4.08(br.t，J＝5.6Hz，1H)，4.23(br.t，2H)，4.50(dd，J＝9.6，4.6Hz，1H)，5.49(d，J＝17.2Hz，1H)，5.51(s，2H)，5.63(d，J＝17.2Hz，1H)，7.52(dd，J＝7.6，1.0Hz，1H)，7.88(s，1H)，7.96(dd，J＝8.2，1.0Hz，1H)，8.05(br.t，1H)，8.30(s，1H)；MS(ES)m/z 701(MH⁺)

实施例49-23

(9S)-9-乙基-9-[甘氨酰基-(D)-γ-谷氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮盐酸盐

¹H NMR(270MHz)δ(CD₃OD)0.95-1.05(m，6H)，1.39-2.30(m，10H)，2.62-2.89(m，2H)，3.48(d，J＝16.0Hz，1H)，3.86(d，J＝16.0Hz，1H)，4.23(br.t，7.7Hz，2H)，4.51(dd，J＝9.4，4.5Hz，1H)，5.48(d，J＝17.2Hz，1H)，5.50(s，2H)，5.62(d，J＝17.2Hz，1H)，7.51(d，J＝7.9Hz，1H)，7.77(s，1H)，7.91(d，J＝7.6Hz，1H)，8.06(br.t，1H)，8.31(s，1H)；MS(ES)m/z 645(MH⁺)

实施例49-24

(9S)-9-乙基-9-[(L)-丙氨酰基-(D)-γ-谷氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮盐酸盐

¹H NMR(270MHz)δ(CD₃OD)0.98(t，J＝7.3Hz，3H)，1.03(t，J＝7.3Hz，3H)，1.56(d，J＝6.9Hz，3H)，1.39-2.34(m，10H)，2.64-2.85(m，2H)，4.03(q，J＝6.9Hz，1H)，4.23(br.t，J＝7.6Hz，2H)，4.44(dd，J＝9.4，4.8Hz，1H)，5.48(d，J＝17.2Hz，1H)，5.50(s，2H)，5.62(d，J＝17.2Hz，1H)，7.51(d，J＝7.9Hz，1H)，7.76(s，1H)，7.89(d，J＝8.2Hz，1H)，8.06(br.t，1H)，8.32(s，1H)；MS(ES)m/z 659(MH⁺)

实施例49-25

(9S)-9-乙基-9-[(L)-苯基丙氨酰基-(D)-β-天冬氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮盐酸盐

¹H NMR(270MHz)δ(CD₃OD)1.01(t，J＝7.3Hz，3H)，1.04(t，J＝7.3Hz，3H)，1.40-2.25(m，7H)，2.62(dd，J＝14.5，9.9Hz，1H)，3.02(dd，J＝14.5，4.3Hz，1H)，3.33-3.47(m，2H)，4.10-4.20(m，3H)，4.93-5.01(m，2H)，5.12(d，J＝18.5Hz，1H)，5.32(d，J＝18.5Hz，1H)，5.48(d，J＝17.2Hz，1H)，5.64(d，J＝17.2Hz，1H)，6.81-6.88(m，4H)，7.01(m，1H)，7.53(d，J＝7.6Hz，1H)，7.91(s，1H)，7.93(br.d，1H)，8.09(br.t，1H)，8.24(s，1H)；MS(FAB)m/z721(MH⁺)

实施例50：肿瘤特异性活化和TTCs的作用

50-1.组成性表达高水平的微粒体二肽酶的细胞的生成

按照低聚核苷酸列阵的结果选择的酶中，微粒体二肽酶(MDP)的全长cDNAs(GenBank Accession No.J05257.Adachi，H.，等“由分子克隆推测的人体微粒体二肽酶的初级结构，J.Biol.Chem，265，3992-3995(1990))克隆在pRC/CMV载体的HindIII位点(Invitrogen，San Diego，USA，目录号V750-20)并且转染到人体肿瘤细胞系HCT116(ATCC号，CCL-247)，该细胞系只表达低水平的微粒体二肽酶mRNA。无cDNA的pRC/CMV运载体也转染到相同的细胞系来产生对照细胞系。DNA的转染使用TransIT-LT2(PanVera，Madison，USA，目录号MIR2320)按照制造商的说明书进行。所得转染子在MaCoy5A培养基(Sigma，St Louis，USA，目录号M8403)中培养，该培养基补充有10％(v/v)胎牛血清和1mg/ml二硫酸遗传霉素(Wako，Osaka，Japan，目录号535-24624)。收集在1mg/ml G418存在下生长的细胞且在MaCoy5A培养基中培养。

为了测定细胞中的微粒体二肽酶活性，带有pRC/CMV的HCT116的会合的单层培养物，携带pRC/CMV-MDP的HCT116(下文称作HCTS5)用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤，用细胞刮器收获，悬浮在PBS中，并且通过低速离心在1000xg下收获5分钟。将细胞沉淀物悬浮在PBS中且通过用Polytron超声溶解细胞(在最高速5秒)。利用相同的方法，粒细胞祖细胞的细胞萃取液也由来源于人体脐带血的CD34-阳性单核细胞制备。收集在会合的单层的MS5上在50ng/ml Flt3配体、100ng/ml SCF和50ng/ml TPO的存在下培养的漂浮粒细胞祖细胞，用PBS洗涤，悬浮在PBS中，并且通过用polytron均化裂解。通过在15,000xg下离心15分钟来除去细胞碎片，上清液用于实验。

当细胞萃取物的蛋白质浓度用DC蛋白质分析试剂盒(Bio-Rad，Hercules，USA，目录号500-0116)按照制造商的说明书测定后，微粒体二肽酶活性也按照Watanabe等(Watanabe，T.等，Biochim.Biophys.Acta.1298，109-118((1996))的方法测定。该细胞萃取物在37℃下于100μl的反应混合物中温育30分钟，该反应混合物含有25mM Tris-HCl(pH8.0)，10μM ZnCl₂，10mM甘氨酸-(D)-丙氨酸，20μM FAD，3.75unit/ml D-氨基酸氧化酶(Roche Diagnostics，Mannheim，Germany，目录号102 784)。通过加入40μl的25％(w/v)三氯乙酸中止该反应。在10,000xg下离心5分钟后，100μl的上清液与20μl溶于2M HCl的0.1％(w/v)2，4-二硝基苯基肼混和，并且在37℃下温育15分钟。此后，该溶液与3.75M的NaOH混和且进一步在室温下温育10分钟。由细胞萃取物的甘氨酸-(D)-丙氨酸制备的(D)-丙氨酸的量由在445nm下的吸光度以及标准(D)-丙氨酸计算。

与载体转染的HCT116(每分钟每mg蛋白质产生小于1nmole(D)-丙氨酸)和粒细胞祖细胞(每分钟每mg蛋白质产生小于1nmole(D)-丙氨酸)相比，一种携带pRC/CMV-MDP的克隆HCTS5的酶活性具有高水平的微粒体二肽酶活性(每分钟每mg蛋白质产生430hmole(D)-丙氨酸)。

50-2.TTCs的生长抑制活性，其依赖于微粒体二肽酶

利用96多孔平板，约2×10³细胞/孔的携带pRC/CMV的HCT116和携带pRC/CMV-MDP的HCT116S5在200μl的McCoy5A培养基中在指定浓度的药物存在或不存在下于37℃和5％CO₂加湿空气中培养，该培养基补充有10％FBS。该细胞与药物接触24小时(紫杉醇，喜树碱类及其前药)或96小时(DMDC及其化合物)。当药物与细胞的接触时间为24小时时，除去含有药物的培养基，并且洗涤细胞且悬浮在新的不合药物的培养基中并且进一步在37℃和5％CO₂的加湿空气下培养规定的天数。随后向培养物中加入10μl的WST-8(细胞计数试剂盒-8，Wako，Osaka，Japan，目录号343-07623)，并且细胞进一步在37℃下培养1或2小时。细胞生长抑制率是根据在450nm和655nm下的光密度计算作IC₅₀值。为了测试药物对粒细胞祖细胞的影响，收集在单层的MS-5扩展7天的粒细胞祖细胞并且用RPMIl640培养基洗涤。约5000细胞悬浮在200μl存在或不存在药物的、补充有10％FBS和50ng/ml G-CSF的RPMI培养基中，并且于存在药物和37℃和5％CO₂的加湿空气下培养24小时(紫杉醇，喜树碱类和其前药)或7天(DMDC和其前药)。当药物与细胞的接触时间为24小时时，在加入药物后24小时时通过用上述培养基洗涤细胞除去药物，并且该细胞进一步在不含药物的相同培养基中培养6天。此后，向培养基中加入20μl的WST-1(Roche Diagnostics，Mannheim，Germany，目录号1644807)，并且该细胞进一步在37℃下培养6小时。细胞生长抑制率是根据在450nm和655nm下的光密度计算作IC₅₀值。紫杉醇、喜树碱或DMDC的生长抑制率在HCT116、HCT116/S5和粒细胞祖细胞之间没有明显差异。然而，这些化合物对表达较高微粒体二肽酶活性的HCT116/S5表现出强于对具有极低微粒体二肽酶活性的HCT116和粒细胞祖细胞的抗增殖活性(参见实施例的生物活性)。

实施例A

含有下列组分的片剂可以以常规方法制备：

组分	每片
组分	每片	实施例4的化合物	10.0-300.0mg
乳糖	125.0mg	实施例4的化合物	10.0-300.0mg
乳糖	125.0mg	玉米淀粉	75.0mg
滑石粉	4.0mg	玉米淀粉	75.0mg
滑石粉	4.0mg	硬脂酸镁	1.0mg

实施例B

含有下列组分的胶囊可以以常规方法制备：

组分	每胶囊
组分	每胶囊	实施例4的化合物	100.0mg
乳糖	150.0mg	实施例4的化合物	100.0mg
乳糖	150.0mg	玉米淀粉	20.0mg
滑石	5.0mg	玉米淀粉	20.0mg

实施例C

注射溶液可以具有下列组成：

实施例4的化合物	10.0mg
实施例4的化合物	10.0mg	氯化钠	适量mg
注射液用水	至2.0ml	氯化钠	适量mg

Claims

1.式(II)表示的抗癌化合物或其可药用盐，

其中Q-Y-是衍生自活性抗癌物质(Q-Y-H)的基团，其中Y是-O-，-S-或-N-，其中活性抗癌物质(Q-Y-H)的基团(Q-Y-)是紫杉烷类，喜树碱类，抗癌核苷，多拉司他汀，蒽环霉素，法呢基转移酶抑制剂或EGF受体酪氨酸激酶抑制剂的基团，

R⁰是天然或非天然氨基酸的侧链，

R¹是氢或甲基，和

R²是氢，支链(C₃-C₁₀)烷基或(C₃-C₈)环烷基。

2.权利要求1的抗癌化合物或其可药用盐，其中所述酶是微粒体二肽酶，芳基硫酸酯酶A，吡咯啉5′-羧基还原酶，脱氢二醇脱氢酶，羰基还原酶，赖氨酰羟化酶，氨酰脯氨酸二肽酶，二氢嘧啶酶，谷氨酰胺：果糖-6-磷酸酰胺基转移酶，UDP-半乳糖神经酰胺半乳糖基转移酶，赖氨酰氧化酶，烯醇化酶，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，硬脂酰-辅酶A去饱和酶，环氧化物水解酶或醛缩酶C。

3.权利要求1的抗癌化合物或其可药用盐，其中该酶是微粒体二肽酶，二氢二醇脱氢酶，吡咯啉5′-羧基还原酶，羰基还原酶和赖氨酰基羟化酶。

4.权利要求1的抗癌化合物或其可药用盐，其中该酶是微粒体二肽酶。

5.权利要求1的化合物，其中该活性抗癌物质(Q-Y-H)是选自下列的紫杉烷类

a)紫杉醇

[2aR-[2aα，4β，4aβ，6β，9α(αR^*，βS^*)，11α，12α，12aα，12bα]]-β-(苯甲酰基氨基)-α-羟基苯丙酸6，12b-二(乙酰氧基)-12-(苯甲酰氧基)-2a，3，4，4a，5，6，9，10，11，12，12a，12b-十二氢-4，11-二羟基-4a，8，13，13-四甲基-5-氧代-7，11-桥亚甲基-1H-环癸并[3，4]苯并[1，2-b]氧杂环丁烷-9-基酯，

b)多西他赛

c)IDN 5109

d)BMS 188797

e)BMS 184476

6.权利要求1的化合物，其中该活性抗癌物质(Q-Y-H)是选自下列的喜树碱类

a)喜树碱：

b)拓扑替康：

c)DX-8951f

d)BN-80915

c)9-氨基喜树碱

f)9-硝基喜树碱

7.权利要求1的化合物，其中该活性抗癌物质(Q-Y-H)是选自下列的抗癌核苷类

a)DFDC

2′-脱氧-2′，2′-二氟胞苷，

b)DMDC

2′-脱氧-2′-亚甲基胞苷，

c)FMDC

(E)-2′-脱氧-2′-(氟代亚甲基)胞苷，

d)Ara-C

1-(β-D-阿拉伯呋喃糖基)胞嘧啶，

e)地西他滨

4-氨基-1-(2-脱氧-β-D-赤型-戊呋喃糖基)-1，3，5-三嗪-2(1H)-酮，

f)曲沙他滨

g)氟达拉滨

2-氟-9-(5-O-膦酰基-β-D-阿拉伯呋喃糖基)-9H-嘌呤-6-胺，和

h)克拉屈滨

2-氯-2′-脱氧腺苷。

8.权利要求1的化合物，其中该活性抗癌物质(Q-Y-H)是选自下列的多拉司他汀类

a)多拉司他汀10

b)多拉司他汀14

c)多拉司他汀15

d)TZT 1027

e)西马多丁

9.权利要求1的化合物，其中该活性抗癌物质(Q-Y-H)是选自下列的蒽环类

a)阿霉素

b)柔红霉素

c)去甲氧基柔红霉素：

10.权利要求1的化合物，其中该活性抗癌物质(Q-Y-H)是EGF受体酪氨酸激酶抑制剂或法呢基转移酶抑制剂。

11.权利要求10的化合物，其中该活性抗癌物质(Q-Y-H)是选自下列的EGF受体酪氨酸激酶抑制剂：

a)ZD 1839

b)CP 358774

N-(3-乙炔基苯基)-6，7-二(2-甲氧基乙氧基)-4-喹唑啉胺，

c)PD 158780

N⁴-(3-溴苯基)-N6-甲基吡啶并[3，4-d]嘧啶-4，6-二胺，和

d)GW 2016

12.权利要求10的化合物，其中该活性抗癌物质(Q-Y-H)是其式为6-[1-氨基-1-(4-氯苯基)-1-(1-甲基咪唑-5-基)甲基]-4-(3-氯苯基)-1-甲基喹啉-2(1H)-酮的法呢基转移酶抑制剂R 115777。

13.权利要求1的化合物，其中(Q-Y-H)是紫杉醇或式(III)表示的多西他赛，

其中

R⁰如权利要求1定义，

R⁴是苯甲酰基或叔丁氧基羰基，和

R⁵是氢或乙酰基，

或其可药用盐。

14.权利要求13的化合物其中R⁰是甲基，苄基或2-甲基丙基。

15.权利要求13和14的化合物，选自

和其可药用盐。

16.权利要求1的化合物，其中(Q-Y-H)是抗癌核苷，由式(IV)所示，

其中

R⁰，R¹，R²和R³如权利要求1定义，

R⁶是氢，氟，羟基或氰基，

R⁷是氢，氟或羟基，

或R⁶和R⁷一起构成亚甲基或氟代亚甲基，

R⁸是氢或乙炔基，

R⁹是氢，氟，乙烯基或乙炔基，和

R¹⁰是氢或羟基，

和其可药用盐。

17.权利要求16的化合物，其中

R⁶是氢，氟，羟基，

R⁷是氟或羟基

或R⁶和R⁷一起构成亚甲基或氟代亚甲基。

18.权利要求16和/或17的化合物，其中

R³是氢或甲基。

19.权利要求16-18任一项的化合物，选自

其可药用盐。

20.权利要求1的化合物，其中(Q-Y-H)是抗癌核苷，由式(V)所示，

其中

m是2或3的整数，和

R⁰，R²，R⁶，R⁷，R⁸，R⁹和R¹⁰如权利要求16定义，

和其可药用盐。

21.权利要求20的化合物，其中

R⁶是氢，氟或羟基，

R⁷是氟或羟基，

或R⁶和R⁷一起构成亚甲基或氟代亚甲基。

22.权利要求20和21的化合物，其中R⁰是环己基甲基，2-萘基甲基，4-苯基苄基，苄基，吲哚-3-基甲基或4-烷氧基苄基。

23.权利要求20-22的任一项的化合物，选自

和其可药用盐。

24.权利要求1的化合物，其中(Q-Y-H)是喜树碱或其衍生物，由式(VI)所示，

其中

m是1-3的整数，

n是0-1的整数，

R⁰如权利要求13定义，

R¹¹是氢或氟，

R¹²是氢，氟，甲基或羟基，

R¹³是氢，氨基，硝基或(二甲基氨基)甲基，

或R¹³和R¹⁴，或R¹¹和R¹²一起构成5或6员环，其任选含有1或2个杂原子，并且任选被1-3个选自(C₁-C₈)烷基，氨基，(C₁-C₈)烷基氨基和/或二-(C₁-C₄)烷基氨基的取代基取代，

和其可药用盐。

25.权利要求24的化合物，其中R¹¹是氢，R¹²是氢或羟基，R¹³是氢或(二甲基氨基)甲基和R¹⁴是氢或乙基。

26.权利要求24和25的化合物，其中R⁰是2-甲基丙基，环己基甲基，苄基，吲哚-3-基甲基，4-氨基丁基，或4-氨基丙基。

27.权利要求24-26任一项的化合物，选自

a)20-O-[(S)-色氨酰基-γ-(S)-谷氨酰基]-20-(S)-喜树碱，

b)20-O-[(S)-缬氨酰基-γ-(S)-谷氨酰基]-20(S)-喜树碱，

c)20-O-[(S)-苯基丙氨酰基-γ-(S)-谷氨酰基]-20(S)-喜树碱，

d)20-O-[(S)-亮氨酰基-γ-(S)-谷氨酰基]-20(S)-喜树碱，

e)20-O-[(R)-亮氨酰基-γ-(S)-谷氨酰基]-20(S)-喜树碱，

f)20-O-[(R)-苯基丙氨酰基-γ-(S)-谷氨酰基]-20(S)-喜树碱，

g)20-O-[(S)-色氨酰基-γ-(R)-谷氨酰基]-20(S)-喜树碱，

h)20-O-[(R)-色氨酰基-γ-(R)-谷氨酰基]-20(S)-喜树碱，

i)20-O-[(S)-苯基丙氨酰基-γ-(R)-谷氨酰基]-20(S)-喜树碱，

j)20-O-[(S)-亮氨酰基-γ-(R)-谷氨酰基]-20(S)-喜树碱，

k)20-O-[(R)-色氨酰基-γ-(S)-谷氨酰基]-20(S)-喜树碱，

l)20-O-[(R)-苯基丙氨酰基-γ-(R)-谷氨酰基]-20(S)-喜树碱，

m)20-O-[(R)-亮氨酰基-γ-(R)-谷氨酰基]-20(S)-喜树碱，

s)20-O-[(S)-色氨酰基-β-(R)-天冬氨酰基]-20(S)-喜树碱，

t)20-O-[(S)-苯基丙氨酰基-β-(R)-天冬氨酰基]-20(S)-喜树碱，

u)20-O-[(R)-苯基丙氨酰基-β-(R)-天冬氨酰基]-20(S)-喜树碱，

v)20-O-[(S)-苯基丙氨酰基-β-(S)-天冬氨酰基]-20(S)-喜树碱，

w)20-O-[(S)-亮氨酰基-β-(R)-天冬氨酰基]-20(S)-喜树碱，

x)20-O-[(S)-缬氨酰基-β-(R)-天冬氨酰基]-20(S)-喜树碱，

aa)20-O-[(S)-赖氨酰基-γ-(S)-谷氨酰基]-20-(S)-喜树碱，和

bb)20-O-[(S)-鸟氨酰基-γ-(S)-谷氨酰基]-20-(S)-喜树碱，

所述盐游离的化合物和其他可药用盐。

28.权利要求24和25的化合物，其是(9S)-9-乙基-9-[(L)-赖氨酰基-(L)-γ-谷氨酰氧基]-1-戊基-1H，12H-吡喃并[3”，4”：6′，7′]吲嗪并[1′，2′：6，5]吡啶并[4，3，2-de]喹唑啉-10，13(9H，15H)-二酮二盐酸盐，该盐游离化合物和其他可药用盐。

29.一种制备权利要求1-28任一项的式(I)的化合物的方法，其中化合物Q-Y-H与X的反应性衍生物缩合。

30.一种含有权利要求1-28任一项的化合物的药物组合物。

31.适合口服或非肠道给药的权利要求30的药物组合物。

32.权利要求1-28任一项的抗癌化合物在制备药物中的用途。

33.权利要求32的用途，用于制备治疗细胞增殖性疾病的药物。

34.权利要求32或33的用途，用于制备治疗癌症的药物。

35.权利要求32-34任一项的用途，用于制备治疗结肠直肠癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、子宫颈癌和膀胱癌的药物。

36.权利要求33和34的用途，其中癌症为实体瘤。