HK1098178B - 定量測量固定的石蠟包埋的組織樣品中靶基因表達的方法 - Google Patents

Description

定量测量固定的石蜡包埋的组织样品中靶基因表达的方法

本申请是2000年10月31日提交的，题为“用于从福尔马林固定的石蜡包埋的组织样品中分离RNA的方法”的中国专利申请00817474.1的分案申请。

政府支持

依照来自国家健康研究所的国家癌症研究所的资金号R01CA71716，政府在本发明中享有某些权利。

技术领域

本发明涉及从生物组织样品中纯化RNA、DNA和蛋白质。

背景技术

组织中的基因表达水平的确定对于人疾病的准确诊断非常重要，并且越来越多地用于确定患者的治疗过程。药物遗传学方法能够鉴定对特定药物反应的患者，并且为新的治疗方法指明方向。

例如，胸苷酸合成酶(TS)是DNA生物合成中的整合酶(integralenzyme)，它催化脱氧尿苷一磷酸(dUMP)还原甲基化为脱氧胸苷-磷酸(dTMP)，并且为细胞内的嘧啶核苷的从头合成提供唯一的途径(Johnston等，1995)。胸苷酸合成酶是化疗药，最常见是叶酸拮抗药5-氟尿嘧啶(5-FU)的靶。作为最有效的结肠、头颈和乳腺癌治疗的单一药物，5-FU的主要作用是阻断TS活性，导致细胞内胸腺嘧啶水平降低，随后导致细胞死亡。

已报道，TS表达在来自原发肿瘤(Johnston等，1995；Lenz等，1995)和转移肿瘤(Farrugia等，1997；Leichmann等，1997)的临床肿瘤样品中都有显著变化。例如在结肠直肠癌中，肿瘤组织中与正常胃肠粘膜组织的TS表达比为2至10(Ardalan和Zang，1996)。

也已知胸苷酸合成酶在肿瘤耐药性的发展中具有临床重要性，研究证明，在暴露于5-FU后，肿瘤细胞中的TS蛋白的急性诱导和TS酶水平的增加(Spears等，1982；Swain等，1989)。肿瘤对诸如5-FU的细胞毒性药物反应引起的急性超量表达TS的能力可能在氟尿嘧啶耐药性中起作用。以前的一些研究显示，TS蛋白的水平直接与5-FU治疗的有效性相关，蛋白和RNA表达之间直接相关(Jackman等，1985)，并且TS表达是结肠直肠癌和乳腺癌中的有效预后标志(Jackman等，1985；Horikoshi等，1992)。

在晚期转移疾病中，已证明由RT-PCR定量的高TS mRNA，以及高TS蛋白质表达都预期对结肠癌(Johnston等，1995；Farrugia等，1997；Leichman等，1997)、胃癌(Lenz等，1995；Alexander等，1995)、头颈癌(Johnston等，1997)的基于氟嘧啶的治疗的弱反应。在低TS人群中经常存在反应者和无反应者之间的显著重叠，但是TS水平高于中值的患者主要是无反应者。如果与其他分子特性结合，TS超量表达的预测价值可以进一步增加，所述分子特性如二氢嘧啶脱氢酶(DPD)和胸苷磷酸化酶(TP)的表达水平、复制错误阳性(RER+)状态(Kitchens和Berger，1997)和p53状态(Lenz等，1997)。目前评价TS在人类肿瘤中的表达的研究提示基于人中的TS表达而预测反应和结果的能力可以在将来提供机会以选择最有可能受益于TS指导的治疗的患者。

至今，包括TS表达研究在内的定量组织基因表达研究限于反转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)从冷冻组织中扩增RNA。然而，大多数病理样品不是制备成冷冻组织，而通常是制备成福尔马林固定的石蜡包埋的(FFPE)，以便于进行组织学分析和档案存储。在这种固定的包埋的样品中，通过使用免疫组织化学染色监测蛋白表达水平，可以半定量地、间接地监测基因表达水平。由于石蜡包埋的样品广泛存在，因此需要快速可靠的方法来从这种样品中分离核酸，尤其是RNA。

已存在许多从生物样品中纯化RNA的技术，但没有一种可靠地从FFPE样品中分离RNA。例如，Chomczynski(美国专利5,346,994)描述了一种用于从组织中纯化RNA的方法，该方法基于使用苯酚和异硫氰酸胍的液相分离。将生物样品在苯酚和异硫氰酸胍的水溶液中均化，之后将匀浆与氯仿混合。离心后，将匀浆分离为有机相，界面和水相。蛋白质隔离在有机相中，DNA在界面上，RNA在水相中。可以将RNA从水相中沉淀出来。这种方法不能可靠地从福尔马林固定的石蜡包埋的组织样品中分离RNA。

其他用于分离RNA的已知技术通常使用胍盐或苯酚提取，例如Sambrook，J.等，(1989)，pp.7.3-7.24，和Ausubel，F.M.等，(1994)，pp.4.0.3-4.4.7中所描述。然而，在从福尔马林固定的石蜡包埋的组织样品中分离RNA的方面，还没有一种已知方法提供可重复的定量结果。

从石蜡包埋的组织中分离RNA的技术在肿瘤组织的基因表达研究中是尤其需要的。某种受体或酶的表达水平可以预示特定治疗获得成功的可能性。

正确的定量TS基因表达研究限于从冷冻组织RT-PCR，而在固定于载玻片上的档案病理材料中，可以通过免疫组织化学染色进行TS蛋白表达的半定量监测。但由于从档案病理材料中分离RNA的限制，用于从这种样品测定基因表达水平的定量技术迄今仍没有。

发明内容

本发明的一个方面是提供可靠的用于从生物组织样品中分离RNA、DNA或蛋白质的方法。本发明还提供用于从包埋于石蜡的组织中分离RNA、DNA或蛋白质的简单、有效和可重复的方法。

本发明提供从生物组织样品中纯化RNA的方法，其通过将样品在有效浓度的离液剂溶液中，在约50℃至约100℃的温度下加热约5至约120分钟而进行。在一个实施方案中，离液剂是胍鎓化合物。然后从所述溶液中回收RNA。例如，可以通过氯仿提取实现RNA回收。

在本发明的方法中，RNA分离自档案病理样品。在一个实施方案中，石蜡包埋的样品首先脱蜡。示例性的脱蜡方法包括用有机溶剂，优选用二甲苯洗涤石蜡样品。脱蜡的样品可以用低级醇的水溶液再水化。合适的低级醇包括甲醇、乙醇、丙醇和丁醇。在一个实施方案中，脱蜡的样品通过用浓度逐渐降低的低级醇溶液连续洗涤而再水化。在另一实施方案中，样品同时脱蜡和再水化。

脱蜡的样品可以用机械、声或其他均化方式均化。在一个实施方案中，再水化的样品在包含离液剂，如硫氰酸胍(也以异硫氰酸胍出售)的溶液中均化。

将均化的样品在包含有效浓度的离液剂的离液溶液中加热到约50℃至约100℃的温度范围内。在一个实施方案中，离液剂是胍鎓化合物。优选的离液剂是硫氰酸胍。

然后通过例如苯酚氯仿提取、离子交换层析或大小排阻层析从溶液中回收RNA。

接着可以采用提取、电泳、层析、沉淀或其他适宜的技术进一步纯化RNA。

由本发明的方法分离的RNA适于分子生物学中的许多应用，包括用随机引物反转录以提供cDNA文库。

通过反转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增，纯化的RNA可以用于确定福尔马林固定的石蜡包埋的组织样品中的基因表达水平。使用适当的PCR引物，可以通过本发明的方法确定任何信使RNA的表达水平。定量RT-PCR技术允许将石蜡包埋的蛋白表达水平(通过免疫组织化学方法)与相同样品中的基因表达水平(使用RT-PCR)进行比较。

本发明的方法可用于多种组织和肿瘤类型以及靶基因，因此可以用于治疗评价以及用作多种癌症，包括乳腺癌、头颈癌、食管癌、结肠直肠癌和其他的诊断工具。对于本发明的方法而言，特别优选的基因是胸苷酸合成酶基因。在FFPE组织中，本发明的方法实现了TS基因表达的可重复的定量，类似于从冷冻组织获得的结果。

附图说明

图1显示不同加热时间的β-肌动蛋白和TS表达水平。这些数据表明没有加热步骤，从石蜡提取的RNA收率最小。

图2显示在正常(N)或来自结肠直肠癌患者的肿瘤(T)组织中的β-肌动蛋白表达水平，数据由在95℃提取0至40分钟的RNA的定量PCR测得。这些数据提示30分钟是最优的加热时间。

图3显示温度和时间对β-肌动蛋白RNA的收率和DNA的分离的影响。这些数据表明，在加热时间较长时(在60至120分钟之间)，RNA发生降解，而能够生成DNA PCR信号的污染DNA增加。条形代表在所示的各种时间和温度下进行的三重试验的值。

图4显示各种加热溶液对分离的RNA收率的影响。这些数据表明，溶液中的离液剂，在该例中是异硫氰酸胍(GITC)，是RNA提取溶液的必需成分，如果没有离液剂，提取的RNA的收率至少低10倍。

图5显示来自六种细胞系的石蜡包埋的(白色条形)和冷冻的细胞沉淀(黑色条形)的TS基因表达的比较。这些数据表明，对石蜡提取的RNA的分析可靠地反映新鲜冷冻组织中的基因表达值。

图6显示正常或有肿瘤的结肠和有肿瘤的食管组织中的TS基因表达水平的比较，所述组织是福尔马林固定的石蜡包埋的或是冷冻的。

图7显示在来自对5-FU/LV的反应以前已经与TS基因表达相连的患者的石蜡切片中测得的TS/β-肌动蛋白比。

图8显示四种恶性标记基因(TS；胸苷磷酸酶(TP)；环加氧酶-2(COX-2)；和血管内皮生长因子(VEGF))在原发结肠癌和同一患者一年后复发的肝转移癌的FFPE样品中的表达水平。这些数据表明，如可以预期的，四种恶性标记中的三种在转移肿瘤组织中提高。

具体实施方式

本发明的方法涉及从生物样品中纯化RNA。在一个实施方案中，样品是石蜡包埋的组织样品，且该方法包括包埋样品的脱蜡，脱蜡组织的均化，以及在约50℃至约100℃的温度范围内，加热处于包含有效量的胍鎓化合物的离液溶液中的组织，加热约5分钟至约120分钟。加热步骤增加从样品扩增的cDNA的量，比不经加热的样品高1000倍。

尽管冷冻组织不是普遍地可以获得，但手术后，通常从每种类型的肿瘤制备石蜡块，从而允许大规模追溯研究TS表达和化疗反应。

此外，该技术可以应用于多种肿瘤类型的任何一种，不限于一定范围的靶基因。这暗示将来可以制备各肿瘤“基因表达分布图”，从而可以确定各患者样品中已知影响临床结果和对各种化疗药反应的一系列基因的表达水平。FFPE样品的自动实时PCR允许各肿瘤的靶向治疗。

组织样品

使用本发明的方法，可以从任何生物样品中分离RNA。生物样品经常用固定剂固定。通常使用醛类固定剂，如福尔马林(甲醛)和戊二醛。用其他固定技术如醇浸(Battifora和Kopinski，J.Histochem.Cytochem.(1986)34：1095)固定的组织样品也是适宜的。所使用的样品还包埋在石蜡中。通过本发明的方法，可以从任何石蜡包埋的生物组织样品中分离RNA。在一个实施方案中，样品是福尔马林固定的和石蜡包埋的。

样品脱蜡

脱蜡将石蜡的大部分从石蜡包埋的样品中除去。已知许多用于脱蜡的技术，且任何适当的技术都可以用于本发明。本发明的优选的方法是用有机溶剂洗涤来溶解石蜡。这种溶剂能够有效地从组织样品中除去石蜡，而不对RNA分离造成不利影响。适合的溶剂可以选自溶剂如苯、甲苯、乙基苯、二甲苯以及它们的混合物。二甲苯是用于本发明的方法的优选溶剂。本发明的方法中单独或组合使用的溶剂优选是高纯度的，通常纯度大于99％。

通常通过用有机溶剂洗涤，剧烈混合接着离心来除去石蜡。样品的离心速度足以导致组织在试管内沉淀，通常为约10000至约20000xg。在离心后，弃去有机溶剂上清液。组织学领域的技术人员将认识到，所用的有机溶剂的体积以及所需的洗涤次数取决于样品的大小以及要除去的石蜡的量。需要除去的石蜡越多，所需的洗涤次数越多。通常，样品洗涤1至约10次，优选约2至约4次。对于10μm组织样品，通常的有机溶剂体积为约500μl。

本领域技术人员已知的其他用于脱蜡的方法也可以用于本发明的方法。这些方法包括直接熔化(Banerjee等，1995)。

样品在脱蜡以后优选再水化。优选的再水化方法是用浓度逐渐降低的低级醇水溶液分步洗涤。乙醇是优选的用于再水化的低级醇。其他醇也可以适用于本发明，包括甲醇、异丙醇和其他在C1-C5范围内的类似的醇。样品交替与醇溶液剧烈混合和离心。在一个优选的实施方案中，醇的浓度范围逐步降低，在约3至5个步骤中从约100％降至约70％，其中每一步溶液浓度的改变通常小于约10％(即依次为：100％，95％，90％，80％，70％)。在另一实施方案中，使用诸如EZ-DEWAX (BioGenex，San Ramon，CA)的试剂，脱蜡和再水化同时进行。

均化

脱蜡再水化的样品可以用任何标准机械、声或其他适宜的技术均化。优选用机械组织匀浆器，根据标准步骤进行组织均化。许多商品化的匀浆器适用于本发明，包括：Ultra-Turrax匀浆器(IKA-Works，Inc.，Wilmington，NC)；Tissumizer(Tekmar-Dohrmann，Cincinnai，OH)；和Polytron(Brinkmann，Westbury，NY)。

在一个实施方案中，样品在离液剂的存在下均化。选择离液剂，使从石蜡包埋的样品中纯化的有效浓度的RNA比离液剂不存在的情况下高约10倍。离液剂包括：胍鎓化合物、尿素、甲酰胺、碘化(iodiode)钾、硫氰酸钾以及类似的化合物。对本发明的方法而言，优选的离液剂是胍鎓化合物，如异硫氰酸胍(也以硫氰酸胍出售)和盐酸胍。许多阴离子抗衡离子是有用的，本领域技术人员可以制备许多具有这种适当阴离子的胍鎓盐。本发明使用的胍鎓溶液的浓度通常在约1至约5M的范围内，优选值约为4M。如果RNA已经存在于溶液中，胍鎓溶液可以是更高的浓度，使其在样品中的终浓度在约1至约5M的范围内。胍鎓溶液优选用合适的生化缓冲液如Tris-Cl缓冲至pH为约3至约6，更优选为约4。离液溶液也可以含有还原剂，如二硫苏糖醇(DTT)和β-巯基乙醇(BME)。离液溶液也可以含有RNAse抑制剂。

加热

样品在离液溶液中加热，加热温度为约60℃至约100℃，加热时间为约5分钟至约2小时。或者，样品在离液溶液中在约50℃至约100℃的温度下加热，加热时间为约5分钟至约2小时。通常选择加热时间，使所纯化的RNA的量比不加热的样品的高至少100倍，更优选高约1000倍。在一个优选的实施方案中，样品在约75℃至约100℃之间加热约20分钟。更优选地，样品在约95℃加热30至60分钟。

RNA回收

在通过导致RNA与离液溶液的至少一种成分分离的适当的技术加热后，可以从离液溶液中回收RNA。将RNA从离液溶液中回收的方法可以是：用有机溶剂提取，氯仿提取、苯酚-氯仿提取，用乙醇、异丙醇或其他低级醇沉淀，层析法，包括离子交换层析、大小排阻层析、硅胶层析和反相层析，或者电泳方法，包括聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳，对于本领域技术人员来说这些方法将是明显的。优选使用苯酚-氯仿提取从离液溶液中回收RNA。

在RNA回收后，RNA可以任选地进一步纯化。进一步纯化得到基本上没有污染DNA或蛋白质的RNA。进一步纯化可以通过前述用于RNA回收的任何技术进行。优选通过用低级醇，尤其是乙醇或异丙醇沉淀而纯化RNA。沉淀优选在促进沉淀的载体如糖原的存在下进行。

DNA和蛋白质回收

本发明的方法也可以用于从组织样品中纯化DNA或蛋白质。在样品与有机溶剂如氯仿混合后，接着离心，溶液具有三个相，下层有机相、界面和上层水相。使用适当的离液剂，特别是胍鎓化合物，样品的生物成分将分别进入三相。上层水相将含有RNA，界面将含有DNA，而有机相含有蛋白。本领域技术人员将认识到，本发明的方法适于回收DNA和蛋白质相，以及含有RNA的相。通过本发明的方法，DNA回收得以增加。

纯化的RNA

通过本发明的方法纯化的RNA适于多种目的和分子生物学方法，包括但不限于：反转录为cDNA；生产放射性的、荧光的或其它标记的cDNA来进行基因芯片、寡核苷酸微列阵等的分析；丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳；层析(例如离子交换、硅胶、反相或大小排阻层析)纯化；用核酸探针杂交；通过机械、声或其它方式破碎。

实施例

材料和方法

这些材料和方法是下面的实施例所共同使用的。

样品制备

人细胞系SK1、H157、A431、HT29、HCC298和HH30的特征以前已有描述。细胞通过胰蛋白酶消化从它们的单层移开，通过在3000rpm下离心5分钟沉淀细胞。细胞沉淀可以在-70℃冷冻或者用福尔马林固定24小时，然后用石蜡包埋。

肿瘤组织代表性切片在外科手术时获得，通过临床病理学实验室的常规方法将其固定于福尔马林中，并且包埋在石蜡中。用切片机切下组织横切片(5μm)。

RNA分离

从石蜡包埋的组织中如下分离RNA。将单个5μm石蜡包埋的组织切片置于Eppendorf管中，用二甲苯洗涤两次，每次15分钟，进行脱蜡。用级配的乙醇(100％、95％、80％和70％)连续洗涤15分钟进行再水化。将产生的沉淀悬浮在含有0.5％肌氨酸和20mM二硫苏糖醇(DTT)的4M异硫氰酸胍中。均化悬浮液，然后在约50℃至约95℃下加热0至60分钟；每一样品都有零加热时间点作为对照。加入醋酸钠(pH 4.0)至0.2M，溶液用苯酚/氯仿提取，并用异丙醇和10mg糖原沉淀。在离心(13000rpm，4℃，15分钟)后，RNA沉淀用1ml75％的乙醇洗涤两次，然后重新悬浮在无RNase的水中。

反转录(RT)

在加热后，使用随机六聚体将全部RNA转化为cDNA。RT条件与以前描述的用于冷冻组织的条件(Horikoshi等，1992)相同。每一样品都有不加反转录酶(No-RT)的对照。

TS和β-肌动蛋白基因表达的实时PCR定量使用Perkin ElmerCetus 7700PCR仪(Taqman)。mRNA水平的定量使用基于以前描述的荧光检测方法(Heid等，1996；Eads等，1999)的实时PCR进行。CDNA如上述制备。将感兴趣的cDNA和参考cDNA分别扩增，扩增使用具有5′-荧光报道染料(6FAM)和3′-淬灭染料(TAMRA)的探针。TAQ聚合酶的5′-核酸外切酶活性使探针断裂，释放出报道分子，其荧光用ABI Prism测序系统(Taqman)检测。在越过荧光检测临界值后，PCR扩增产生的荧光信号与产生的PCR产物量成比例。起始模板浓度由荧光信号越过临界值进入PCR反应指数期的循环数确定。相对基因表达基于所感兴趣的基因和参考基因的临界循环数而确定。参考基因的使用避免了直接定量RNA的需要，而RNA直接定量是误差的主要来源。

引物和探针的序列如下：

TS：SEQ ID NO：1：GGC CTC GGT GTG CCT TT；

    SEQ ID：2：AAC ATC GCC AGC TAC GCC CTG；

    SEO ID NO：3：GAT GTG CGC AAT CAT GTA CGT。

β-肌动蛋白：SEQ ID NO：4：TGA GCG CGG CTA CAG CTT；

             SEQ ID NO：5：ACC ACC ACG GCC GAG CGG；

             SEQ ID NO：6：TCC TTA ATG TCA CGC ACG ATT T。

如上所讨论，对于实时PCR试验，报道寡核苷酸(SEQ ID NOS：2和5)5′端用6FAM标记，3′端用TAMRA标记。

每一PCR还包括“无反转录酶”(NRT或No-RT)对照。这样做的目的是矫正来源于残余基因组DNA污染的任何背景扩增。因此，每一TS和β-肌动蛋白的总值是RT值减去NRT值(RT-NRT)。

统计学分析

进行均值非参数对照检验来确定同一肿瘤的冷冻组织和FFPE样品间TS水平的差异是显著性的或非显著性的。

实施例1常规RNA分离步骤

通过下述步骤从石蜡包埋的组织中提取RNA：

A.切片的脱蜡和再水化：

(1)将约10μM的切片部分置于1.5ml塑料离心管中；

(2)加入600μl二甲苯，在室温下(约20-25℃)将混合物剧烈震荡约10分钟。

(3)在室温下将样品离心约7分钟，离心速度为台式离心机的最大速度(约10-20000xg)。

(4)重复步骤2和3，直到大多数石蜡溶解。通常需要两次或更多次，取决于原始样品部分中包含的石蜡量。

(5)通过与低级醇，优选是100％乙醇(约600μl)一起剧烈震荡约3分钟，将二甲苯溶液移去。

(6)将试管步骤(3)中一样离心7分钟。将上清液轻轻移出并弃去。沉淀变成白色。

(7)用连续稀释的乙醇溶液重复步骤5和6：先用约95％的乙醇，接着用约80％的，最后用约70％的。

(8)样品如在步骤(3)中一样在室温下离心7分钟。弃去上清，使沉淀在室温下干燥约5分钟。

B.用苯酚-氯仿分离RNA

(1)加入包含0.5％肌氨酸和8μl1M二硫苏糖醇的400μl异硫氰酸胍。

(2)然后用组织匀浆器(Ultre-Turrax，IKA-Works，Inc.，Wilmington，NC)将样品均化约2至3分钟，同时从低速(速度1)到高速(速度5)逐渐提速。

(3)然后样品在约95℃下加热约5至20分钟。优选在加热前用细针刺穿含有样品的管的盖子。或者，管盖也可以用塑料夹子或实验膜(laboratory film)固定。

(4)然后用50μl2M醋酸钠在pH4.0，以及600μl苯酚/氯仿/异戊醇(10∶1.93∶0.036)提取样品，所述苯酚/氯仿/异戊醇是通过混合18ml苯酚和3.6ml 1∶49的异戊醇∶氯仿溶液而新鲜配制的。溶液剧 烈震荡约10秒钟，在冰上冷却约15分钟。

(5)溶液在最高速度下离心约7分钟。将上层(水)相转移到新的试管中。

(6)在-20℃下，用约10μl糖原和400μl异丙醇沉淀RNA 30分钟。

(7)在台式离心机中以最高速度离心约7分钟，将RNA沉淀；将上清液轻轻移走并弃去；沉淀物用约500μl约70％至75％的乙醇洗涤。

(8)再次以最高速度离心样品7分钟。将上清液轻轻移走，风干沉淀。然后将沉淀溶解在适当的缓冲液(例如50μl 5mM Tris-Cl，pH8.0)中，用于进一步试验。

实施例2加热时间

本实施例说明加热时间对RNA收率的影响。

如图1中所示，在沉淀和反转录之前，在95℃下加热离液溶液显著提高TS和β-肌动蛋白靶的检测效率。当不包括加热步骤时，TS和β-肌动蛋白都未能检测到(0分钟时间点)。20分钟后在95℃，两种转录物都可检测；继续加热到60分钟，TS的检测灵敏度增加3倍，β-肌动蛋白的检测灵敏度增加4.5倍。(NRT＝无反转录酶对照；RT-NRT＝总相对基因表达水平，即反转录酶减去无反转录酶)。

图2显示β-肌动蛋白基因在正常(N)和肿瘤(T)组织中的RNA表达量。样品在95℃下加热0至40分钟。从大多数样品观察到，优选的加热时间为约30分钟。

图3显示加热时间大于约60分钟，提取的RNA的量开始下降，提示RNA的热降解，而提取的DNA的量开始增加。这是不希望的，因为DNA的存在在一些情况下可能给出假PCR信号。

实施例3加热溶液

本实施例说明在离液剂的存在下加热RNA溶液对于获得RNA高收率是重要的。这是RT-PCR试验，将β-肌动蛋白基因表达检测用作从各种溶液中分离的RNA的相对量的量度。

根据前述方法处理食管癌FFPE组织样品的临床样品，但是脱蜡后获得的初始沉淀溶解或悬浮在4M异硫氰酸胍(GITC)，4M异硫氰酸胍+100μM β-巯基乙醇(GITC+BME)，4M异硫氰酸胍+20μM二硫苏糖醇(GITC+DTT)或Tris-Cl缓冲液(10mM，pH 7.5)或Tris-Cl缓冲液+20μM DTT(Tris/Cl+DTT)。接着将样品在95℃加热30分钟或不加热(0分钟，95℃)。然后Tris/Cl样品用4M异硫氰酸胍处理。通过RT-PCR和实时PCR检测β-肌动蛋白确定RNA水平。如图4所示，在加热时，离液剂异硫氰酸胍的存在对于RNA的高收率回收是重要的。还原剂如DTT或BME的存在不是RNA高收率回收所必需的。4M异硫氰酸胍溶液含有50mM Tris-HCl(pH 7.5)、25mM EDTA和0.5％肌氨酸。

实施例4在相同来源的FFPE和冷冻组织中测定的基因表达值的比较

本实施例表明，本发明的方法提供的来自福尔马林固定的石蜡包埋的样品的基因表达值与从冷冻组织获得的相当。

来自六种细胞系的样品采用本发明的方法进行FFPE处理和TS定量(包括在95℃加热30分钟)。获得的相对TS值(图5)与用已知方法从冷冻细胞沉淀获得的值比较。冷冻细胞中的相对TS表达水平是3.0-19.5(平均＝8.5)，而FFPE样品为3.0-25.0(平均＝9.0)。对两个均值之间的差异的统计学分析显示p值为0.726，表明从使用原先的RT-PCR方法的冷冻细胞沉淀获得的TS值与从使用本发明的方法的FFPE细胞沉淀获得的TS值没有显著性差异。

无论样品是福尔马林固定的石蜡包埋的，还是冷冻的，肿瘤组织样品中的RNA表达水平和正常(无肿瘤的)组织样品也是相当的。对5个正常结肠组织、6个肿瘤结肠组织和4个食管肿瘤组织进行对比的石蜡包埋的和冷冻组织(FT)的TS基因表达的比较。结果显示在图6中。没有发现同一组织的冷冻组织样品和FFPE样品的TS水平有显著性差异。这在结肠和食管组织类型中都是真的(结肠FT样品平均＝3.46，结肠FFPE样品平均＝3.06，p＝0.395；食管FT样品平均＝13.9，食管FFPE样品平均＝15.93，p＝0.21)。

实施例5反应和无反应肿瘤组织中的TS水平比较

冷冻组织和对比的FFPE样品中的TS水平与IV期结肠癌中的对5-FU/甲酰四氢叶酸的相关性。先前的基于来自冷冻组织的RT-PCR数据的报导发现，肿瘤中的高TS水平(相对基因表达≥4.0)指示对TS治疗的弱反应。有反应的肿瘤以TS低水平表达为特征。确定了来自17个患者的石蜡切片的TS/β-肌动蛋白比，之前这17个患者对5FU/LV的反应已经通过分析冷冻组织样品与TS基因表达有关(图7)。在这17个患者中，已知有6个对TS有反应，11个对TS治疗反应不佳。发现对比的石蜡组织的TS结果也预示对这种治疗的反应(平均反应者FT＝2.87，平均反应者FFPE＝2.37，P＝0.641；平均无反应者FT＝7.66，平均无反应者FFPE＝7.84，P＝0.537)。来自冷冻组织的TS水平和来自对比的FFPE的TS水平间没有显著性差异。

实施例6原发结肠癌和肝转移中的TS基因表达水平

本实施例显示来自同一患者的原发结肠癌和复发的肝转移中的TS和其他基因表达的分析。

图8显示来自同一患者的原发结肠癌和一年后复发的肝转移(met)的FPEP样品中4种基因的表达水平：TS；TP；环加氧酶-2(COX-2)；以及血管内皮生长因子(VEGF)。结果表明，虽然原发肿瘤对5-FU治疗敏感(TS＝2.32)，但转移肿瘤将是难治的(TS met＝11.58)。COX-2和VEGF表达水平与已经公布的结果相关，即它们在攻击性疾病中表达增加，并且是相互调控的(coregulate)。(COX-2原发＝1.35；COX-2met＝5.4；VEGF原发＝5.02；VEGF met＝14.4)。如上所述将RNA从原发结肠癌的5μM FFPE切片和肝转移的FFPE切片中分离出来。在有反应的原发肿瘤中相对TS基因表达是2.32，而在转移疾病中是11.58(图8)。通过这里所报导的RT-PCR方法确定的TS表达的5倍增加表明继发疾病对5-FU无反应，提示其他治疗如CPT-11可能是合适的。

本文引用的所有参考文献均引入本文作参考。

参考文献

Ardalan，B.和Dang，Z.(1996)Proc.Annu.Meet.Am.Assoc.Cancer Res.37：A1376.

Ausubel，F.M.等，《分子生物学中的现有策略》，John Wiley&Sons，Inc.，第1卷，第2.2.1-2.4.5页(1994).

Bannenee，S.K.，Makdisi，W.F.，Weston，A.P.，Mitchell，S.M.，和Campbell，D.R.(1995)生物技术，18：768-773.

Chomczynski等，″通过酸性硫氰酸胍鎓-苯酚-氯仿提取的单步RNA分离，分析生物化学，162：156-159(1987).

Eads，C.A.，Danenberg，K.D.，Kawakami，K.，Saltz，L.B.，Danenberg，P.V.和Laird，P.W.(1999)人结肠直肠肿瘤中的CpG岛的过甲基化(hypermethylation)与DNA甲基转移酶超量表达无关，癌症研究，59：2302-2306.

Farrugia，D.Cunningham D.Danenberg P.Danenberg K.Metzger R.Mitchell F.MacVicar D.McCarthy K.Aherne G.W.Norman A.Jackrnan A.L.(1997)Proc.Annu.Meet Am.Assoc.Cancer Res.38：A4132.

Heid，C.A.，Stevens，J.，Livak，K.J.和Williams，P.M.(1996)实时定量PCR.基因组研究，6：986-994.

Horikoshi，T.，Danenberg，K.D.，Stadlbauer，T.H.W.，Volkenandt，M.，Shea，L.L.C.，Aigner，K.，Gustavsson，B.，Leichman，L.，Frosing，R.，Ray，M.，Gibson，N.W.，Spears，C.P.和Danenberg，P.V.用聚合酶链反应定量人肿瘤中的胸苷酸合成酶、二氢叶酸还原酶和DT-心肌黄酶基因表达，癌症研究，52：108-116，1992.

Jackman，A.L.，Jones，T.R.，Calvert，A.H.癌症化疗中的实验和临床进展(F.M.Muggia ED.)Martinus Nijhoff，波士顿(1985).

Johnston，P.G.，Lenz，H.J.，Leichinan，C.G.，Danenberg，K.D.，Allegra，C.J.，Danenberg，P.V.，Leichman，L.(1995)癌症研究，55：1407-1412.

Leichman，C.G.，Lenz，H.J.，Leichman，L.，Danenberg，K.，Baranda，J.，Groshen，S.，Boswell，W.，Metzger，R.，Tan，M.，Danenberg，P.V.(1997)临床肿瘤学杂志，15(10)：3223-9.

Lenz，H.J.，Danenberg，K.D.，Leichman，C.G.，Florentine，B.，Johnston，P.G.，Groshen，S.，Zhou，L.，Xiong，Y.P.，Danenberg，P.V.和Leichman，L.P.(1998)临床癌症研究，4(5)：1227-34.

Sambrook，J.等，″分子克隆″，Cold Spring Harbor Press，第2版，第9.14-9.23页(1989).

Spears，C.P.，Shahinian，A.H.，Moran，R.G.，Heidelberger，C.，和Corbett，T.H.(1982)癌症研究，42，450-456；Keyomarsi，K.和Moran，R.G.(1988)生物化学杂志，263，14402-14409.

Swain，S.M.，Lippman，M.E.，Egan，E.F.，Drake，J.C.，Steinberg，S.M.，和Allegra，C.J.(1989)临床肿瘤学杂志，7，890-899

Claims (26)

1.一种用于从福尔马林固定的石蜡包埋的组织样品回收DNA或RNA的方法及其用途，其包括：

将所述样品在包含有效浓度的胍鎓化合物的离液溶液中加热至在50至100℃范围内的温度，持续5至120分钟的时间；

从所述离液溶液中回收所述RNA或DNA；和

对所述RNA进行反转录、反转录及聚合酶链反应、电泳、层析、或碎裂。

2.权利要求1的方法，其还包括将所述样品脱蜡。

3.权利要求1或2的方法，其还包括在加热前将所述样品再水化。

4.权利要求3的方法，其还包括在加热前均化所述样品。

5.权利要求1-4之任一项的方法，其用于从福尔马林固定的石蜡包埋的组织样品中回收RNA，其中通过用水不溶性有机溶剂提取而从所述离液溶液中回收所述RNA。

6.权利要求5的方法，其中所述水不溶性有机溶剂基本上由氯仿组成。

7.权利要求6的方法，其还包括纯化所述RNA。

8.权利要求7的方法，其中通过乙醇沉淀法纯化所述RNA。

9.前述权利要求之任一项的方法，其中所述时间为20至60分钟。

10.前述权利要求之任一项的方法，其中所述时间为30至60分钟。

11.前述权利要求之任一项的方法，其中所述温度在75至100℃的范围内。

12.前述权利要求之任一项的方法，其中所述温度在95至100℃的范围内。

13.权利要求1或2的方法，其用于回收RNA，其中所述胍鎓化合物选自盐酸胍和异硫氰酸胍。

14.权利要求13的方法，其中所述胍鎓化合物为异硫氰酸胍，其浓度为2至5M。

15.权利要求14的方法，其中所述异硫氰酸胍的浓度为4M。

16.权利要求15的方法，其中所述离液溶液的pH为3～6。

17.权利要求16的方法，其中所述离液溶液的pH为4。

18.前述权利要求之任一项的方法，其中所述离液溶液还包含还原剂。

19.权利要求18的方法，其中所述还原剂选自β-巯基乙醇和二硫苏糖醇。

20.前述权利要求之任一项的方法，其中所述RNA用于测定靶基因的表达水平。

21.前述权利要求之任一项的方法，其中对所述RNA进行反转录，并且标记这样产生的cDNA。

22.权利要求21的方法，其中将该标记cDNA用于基因芯片或微阵列分析中。

23.一种用于定量测量靶基因的基因表达的方法，其包括通过任一前述权利要求所述的方法回收RNA，还包括：

通过反转录反应将该经纯化的RNA转化为cDNA；

使所述cDNA在聚合酶链反应溶液中进行PCR反应，所述聚合酶链反应溶液包含适于扩增至少指定序列的寡核苷酸探针、聚合酶及荧光染料；

测量作为所述PCR反应结果发生的荧光强度改变；和

基于所述荧光强度改变确定所述样品中存在的具有指定序列的核酸的量。

24.一种用于测定福尔马林固定的石蜡包埋的组织样品中靶基因表达水平的方法，其包括：

将所述组织样品脱蜡，以获得脱蜡样品；

如下从所述脱蜡样品中分离mRNA：首先将所述脱蜡组织样品在包含有效浓度的胍鎓化合物的溶液中加热至在50至100℃范围内的温度，并从所述溶液中回收所述mRNA；和

测定相对于内控基因mRNA的量的靶基因mRNA的量。

25.权利要求24的方法，其中所述内控基因为β-肌动蛋白。

26.权利要求24的方法，其中所述靶基因是胸苷酸合成酶(TS)。