HK1098177B - 用於检测生物学样品中核酸的设备和方法 - Google Patents

Description

用于检测生物学样品中核酸的设备和方法

发明领域

本发明涉及用于检测生物学样品中核酸的设备和方法。本发明特别涉及一种使用场辅助(field-assisted)的核酸杂交以检测DNA序列的新颖的设备和方法，和涉及使该设备的性能最优化的方法，本发明进一步延伸至场辅助杂交在包括带电实体的任何生物学方法中的应用。

发明背景

高密度多核苷酸(例如DNA或RNA)阵列技术的出现已经改变了基因组学和蛋白质学分析的基本概念。通过使大规模的临床诊断试验和筛选过程变为可实际应用，从“斑点印迹”到“载玻片上的阵列”然后到DNA微阵列(也被认为是DNA芯片)的转变已经改革了工业。众所周知，一个在基质上预定结构中具有反应位点的典型微阵列，暴露于一种具有与粘附在反应位点上的捕获片段互补的碱基序列的目标核酸片段的样品时，会显示一种结合模式。当使用一个合适的检测机理时，可通过光学或电子方法检测结合模式和结合效率，其可以包括例如荧光标记、电流检测或阻抗测量。

电辅助(electrically-assisted)核酸杂交的使用是一种在包含DNA的生物学样品例如血液、血浆、尿等分析中已知的技术。常规地，用于DNA检测的芯片是由多种物质包括玻璃、二氧化硅和金属中的一种形成的。在芯片表面上，用已知技术形成许多电接触。为了在生物学样品中检测特定的DNA序列，依靠常为琼脂糖凝胶的粘附层，由互补DNA片段组成的捕获探针粘附于芯片表面。如果一个生物学样品含有目标DNA，则该目标DNA将通过杂交结合于互补DNA片段，可使用各种成像技术检测这样的杂交，从而检测样品中目标DNA的存在。

现有技术

核酸片段是带电荷的，通过使用电极产生静电吸引，将核酸片段向特定位点吸引，因而通过运用适当的电流，可加速杂交过程，从而也加速检测过程。然而，由于样品的电化学降解或电解的危险，使用电极直接与核酸片段接触是不可能的。因此，常规地，渗透/粘附层通常涂在电极上，如US 5605662和6306348中所示。渗透/粘附层通常由多孔物质组成，例如溶胶-凝胶物质、多孔水凝胶物质、多孔氧化物，且提供允许小离子的选择性扩散，也作为一种捕获探针的粘附表面。由于多孔物质的孔的大小，该多孔物质一般太小以至于不允许较大的核酸片段通过，因而减少了核酸片段与电极的直接接触。

当施加电压于渗透/粘附层下面的电极时，现有技术中的装置可提供电泳传输效应，其没有样品的电化学降解，从而可以提高杂交。然而，这种能够电诱导的杂交的现有技术不是没有它们的缺点。例如，在与水溶液、各种化学制品和许多周围环境因子接触下，多孔物质例如水凝胶和聚合物容易退化。溶胶-凝胶物质的制备是昂贵的且复杂的，增加了生产成本。而且，多孔物质天然易碎，且容易吸附和诱捕不需要的外源物质如空气中的潮湿烃，导致装置较短的货架期。

发明概述

根据本发明，提供了一种用于检测样品中目标核酸的设备，其包含一种与至少一个反应单元形成的基质，其中所述的反应单元包括一个由电介质物质形成的粘附表面，以粘附核酸捕获探针，其中提供一种金属电极直接与所述的电介质物质接触。样品可以包含生物学底物，该样品可以是废水、溶液或试剂。样品也可以是生物学样品如血液、血浆或尿。

优选地，电极被提供在粘附表面的下面，也就是说与相对于粘附表面的电介质物质的一边接触。然而，可以想到的是，其可能被应用与电介质物质的一边接触或甚至与粘附表面自身接触。

在本发明优选的实施方案中，电介质物质优选为氧化物，例如其可以是选自Al₂O₃、SiO₂和Ta₂O₅。金属电极例如可以由铝形成。

在本发明优选的实施方案中，该设备可包含一个多层结构，其包含首先是一个基底层，其次是一个在所述基底层上形成的绝缘层，第三层形成在所述的绝缘层上且包含定义了至少一种金属电极的模式传导区域，第四层包含至少一种电介质物质的区域，其中在所述第三层中每一个所述的金属电极被所述的第四层中的电介质物质区域覆盖。优选地，第三层的模式传导区域被电介质物质形成的区域分离。更优选地，所述第四层中的电介质物质区域被钝化物质区域分离，该钝化物质区域可延伸至所述电介质物质区域的边缘，以定义所述的反应单元。

从另一个主要方面看，本发明提供了一种在生物学样品的核酸目标的检测中进行场辅助杂交的方法，其包含以下步骤：提供一个具有由电介质物质形成的粘附表面的反应单元，在下面提供一个金属电极直接与所述的电介质物质接触，将核酸捕获探针粘附到所述的粘附表面，将样品加入到所述的反应单元，并提供电压至所述的电极。样品可以包含生物学底物且该样品可以是废水、溶液或试剂。样品也可以是生物学样品如血浆或尿。

电压可以被适用为持续电压，或可以是平稳变化的或脉冲的电压。

从另一个主要方面看，当进行生物学反应时，本发明也提供一种吸引带电实体至反应单元的表面或从反应单元的表面排斥带电实体的方法，其包含以下步骤：提供一种电介质物质作为所述的表面，通过在所述电介质物质中诱导电荷分离产生一个电场。该带电实体可以是核酸分子。

从更进一步方面看，本发明也延伸为一种形成一列进行生物学分析的反应单元的方法，其包含以下步骤：在一种绝缘物质上制定金属电极模式，在所述金属电极上沉积电介质物质区域，在所述电介质物质区域的上表面的边缘四周形成边框，以限定所述的反应单元。

优选地，例如，该方法可包含：在绝缘表面上沉积一层金属，用光刻胶覆盖所述金属层的所需模式，通过蚀刻处理除去剩余的所述金属层，在所述模式金属的上面沉积一层所述电介质物质，由此所述电介质物质覆盖所述模式金属且占有介于所述模式电极之间的区域，在所述电介质物质层的上面沉积一个钝化层，用光刻胶将所述钝化层模式化，除去所述钝化层以展现覆盖所述金属电极的所述电介质物质以限定所述反应单元。

附图简述

现通过实施例的方式和参照附图来描述本发明的一些实施方案，其中：

图1是根据本发明的一个实施方案的贯穿芯片的剖面图，

图2是类似于图1但表示使用的芯片的视图，

图3是表示构成本发明优选实施方案的根本原理的示意图，

图4阐明了可能的制作过程中的步骤，

图5(a)和(b)表示第一次测试结果，

图6(a)和(b)表示第二次测试结果，和

图7(a)和(b)表示第三次测试结果。

优选实施方案详述

图1用剖面图表示了本发明的一部分实施方案，其包括用于接受含有样品缓冲液的三个单元，但可以理解的是可以提供任何数量的单元，且它们通常以矩阵列形成。

根据本发明的一个实施方案的装置是通过使用常规沉积技术在硅基质上连续沉积而制作的。首先，(图4(a))通过任何合适的技术包括热氧化或通过任何合适的沉积技术例如喷镀、电子束蒸发等，由厚度介于约200nm至500nm之间SiO₂形成的绝缘层在硅基质上形成。在绝缘层的顶端上，使用任何常规的沉积技术，再形成一层厚度介于约500nm至1000nm之间的铝层(图4(b))。

一旦铝层已经形成，则使用一层光刻胶将其模式化(图4(c))，通过蚀刻除去暴露区域(图4(d))并除去光刻胶(图4(e))。然后用Al₂O₃涂布芯片(图4(f))至厚度介于50-500nm之间，在二氧化硅基质上形成的铝区域之间形成Al₂O₃区域。然后通过电浆辅助化学气相沉积(plasma enhanced)或类似技术，在Al₂O₃上沉淀(例如)Si₃N₄的钝化层(图4(g))。然后用光刻胶将钝化层模式化(图4(h))，然后将钝化层蚀刻(图4(i))以展开Al₂O₃区域，其成为反应单元粘附表面。最后除去光刻胶(图4(j))。

这个制作过程的结果是图1的多层结构。铝区域在二氧化硅绝缘层上形成，且这些铝区域被Al₂O₃分离。在铝和Al₂O₃层的顶端形成的是一层包含位于铝区域上面的且被钝化物质Si₃N₄互相分离的Al₂O₃区域，钝化物质Si₃N₄随后覆盖Al₂O₃区域，分离较低层上铝区域。钝化物质也延伸覆盖顶部Al₂O₃的边缘，以限定放置用于分析的生物学样品的表面。

因而可以理解的是，在图1中表示的实施例中，用三个单元1-3形成芯片，每个由下面垫有铝的Al₂O₃形成。当通过蚀刻形成铝区域时，虽然图1中没有表示，也可以形成电连接以允许施加电压到铝区域。

一旦已经制作了图1的芯片，则其可被用作许多不同生物学测试和分析的基础。特别地，图1中单元1-3的每一个可以用合适的捕获探针提供如图2所示。依据要进行的测试，每一单元可以用相同的捕获探针或用不同的捕获探针提供，该捕获探针具有核酸片段，其与测试或分析要寻找的样品中的片段互补。在图2的实施例中，单元1-3都是同样的且将一滴含有缓冲液的样品加入到单元上以覆盖所有的三个单元。

本领域的技术人员所理解的是，如果样品含有互补于捕获探针的核酸片段，则它们会通过杂交过程结合于捕获探针，这可以通过已知技术检测到。由于核酸片段是有电荷的，通过提供一个电场可增强该杂交，该电场将吸引所需核酸片段朝向粘附表面和捕获探针。可实施该方案的机理示于图3。

特别地，如图3所示，如果施加一个电压至单元下面的铝电极，由于Al₂O₃是电介质物质，则电荷分离将在Al₂O₃内发生，其极性将依据施加于Al₂O₃下面的铝电极的电压的极性。如图3的左边所示，如果对铝电极施加一个正电压，则Al₂O₃的上表面也会具有正电压，其吸引负电荷片段且排斥正电荷片段。相反地，如果对铝电极施加一个负电压，则Al₂O₃的上表面也会具有负电压，其吸引正电荷片段且排斥负电荷片段，如图3的右手边所示。因而对直接在下面的且直接与Al₂O₃粘附表面接触的铝电极选择性地施加一个电压，能选择性地吸引/排斥核酸片段，因而能电诱导杂交。应当理解的是，能以许多不同的方式施加电压。该电压可能是例如一个恒定连续的电压，可以是平稳变化，或者可以是脉冲的，其具有规则脉冲或以任何所需模式。

本发明的特定优势，至少在其优选的形式中，与现有技术相比较在于可以完全避免不想要的电化学反应和/或电解，因为在样品溶液和电介质层的表面之间没有电子转移。因而可以将核酸片段电牵引至粘附表面且没有电化学降解。本发明的场辅助杂交方法和设备的一个更加重要的优势，至少在优选的形式中，在于样品的盐浓度和pH值不会改变。这些参数是影响杂交效率和杂交的核酸片段的稳定性的关键因素。现有技术的电辅助杂交技术由于电化学反应而导致盐浓度和pH显著的变化，其它技术如特定缓冲液是需要的，以补偿这些效果。本发明的一个进一步的优势是没有电化学反应发生，反过来这表明检测过程中涉及的溶液/试剂不会被扰乱。在检测过程中没有起泡形成和/或沉淀，这在提高检测信号的质量中是重要的。

也应当理解的是，本发明优选的实施方案在检测核酸片段中的加速杂交的上下文中被描述，本发明更加普遍地适用于任何包括带电实体的生物学过程，其中期望的是通过吸引该实体至一个表面或从一个表面排斥该实体控制这样的带电实体的移动。

图5至7表示使用图1至3的结构在用和不用电压施加于单元下面的铝电极情况下的许多实验结果。当然可以理解的是，在所有这些实施例中，反应时间、施加的电压和其它参数是完全可效仿的并根据需要是可以改变的。

图5(a)和(b)表示在两种情况下都没有向铝电极施加电压的对照，因此杂交在没有电辅助下进行。在该实施例中，样品中的目标寡聚体是合成的β-肌动蛋白(91个碱基，纯的)且杂交时间为90分钟。图5(a)的样品中存在该目标寡聚体而在图5(b)的样品中不存在。在图5(a)或5(b)中都没有施加一个电压至铝电极，但图5(a)中的单元比5(b)中要明显地暗，这是由于图5(a)的样品中存在目标寡聚体。

在图6(a)和(b)中情形与图5(a)和(b)中相同，是由于图6(a)的样品中提供了相同的目标寡聚体而图6(b)的样品中没有提供目标寡聚体。然而，在该实施例中，施加了+10V电压至铝电极且杂交时间减少到10分钟。图5(a)和6(a)的比较表明即使杂交时间已经充分地减少，在图6(a)中单元明显更加暗，证明在加速杂交中施加电压的有效性。在图5(b)和6(b)之间存在相似性，其中不存在目标寡聚体，显示了施加的电压不会导致任何假阳性结果。

图7(a)-(c)阐明了第三个实施例，其中样品中的目标寡聚体是avarian流感病毒(AIV)。H5亚型(250个碱基与其它非特异性寡聚体混合)。在所有三种情形(a)-(c)中，杂交时间都为10分钟。图7(a)-(c)之间的区别在于如下：在图7(a)中目标寡聚体存在于样品中且施加+10V电压至单元下面的铝电极；在图7(b)中没有目标寡聚体存在于样品中且施加+10V电压至单元下面的铝电极；在图7(c)中目标寡聚体存在于样品中但没有电压施加至单元下面的铝电极。该实施例再次显示了在只有10分钟的杂交时间下，施加+10V电压至电极导致杂交加速且强烈的信号(在图7(a)的单元中很暗的区域)。在比较中，图7(b)(没有目标且施加电压)和图7(c)(有目标但没有施加电压)之间表征的相似性显示了在没有电辅助杂交下在相同时间周期(10分钟)内不可能获得有效的杂交。

本发明至少在其应用的形式中提供了一种简单的低耗费的装置，其允许核酸场辅助杂交和/或其它生物学过程以更快的速度高性能地进行，这可被应用于很多可能的应用。本发明在电介质物质中使用电荷分离原理，该物质与施加了电压的电极接触。在上述实施方案中，电极是铝且电介质物质是Al₂O₃，但其它金属电极和电介质粘附表面的结合也是可能的。例如，SiO2、Ta2O5可用作基于氧化物的电介质物质的粘附表面。

与现有技术使用一个渗透层的装置比较，直接与电极接触的基于氧化物的电介质层提供了一个坚固的、紧凑的、对多数酸、碱金属和其它常用于生物学反应的试剂呈化学惰性的结构。该结构对于周围因素如温度和湿度也是稳定的，且更少受到物理损坏。生产费用会更低且可以使用标准的沉积技术和其它微电子学制造技术很容易地制造该装置。的确在本发明装置的制造中微电子学沉积和制作技术的使用也具有优势，即能将该装置容易地结合到其它使用相同或相似技术生产的装置中。

Claims (27)

1.一种用于检测样品中目标核酸的设备，包括由至少一个反应单元形成的基质，其中所述的反应单元包括由电介质层限定的用于粘附核酸捕获探针并且用于吸引或排斥带电实体的粘附表面，其中提供一个直接与所述的电介质层接触的金属电极，以及其中所述的设备用于在所述电介质层中产生电荷分离，但是在所述电介质层与样品之间没有电流流动或电子转移。

2.如权利要求1中所要求的设备，其中所述电极与相对于所述的粘附表面的所述电介质层的一边接触。

3.如权利要求1中所要求的设备，其中所述的电介质是一种氧化物。

4.如权利要求3中所要求的设备，其中所述的电介质选自Al₂O₃、SiO₂或Ta₂O₅。

5.如权利要求1中所要求的设备，其中所述的电极是由铝形成的。

6.如权利要求1中所要求的设备，其中所述的电介质包含Al₂O₃且所述的电极是由铝形成的。

7.如权利要求1中所要求的设备包含多层：其包括第一个基底层，在所述基底层上形成的第二个绝缘层，在所述绝缘层上形成的第三层且包含模式化的限定了至少一个金属电极的传导区域，和包含至少一个电介质物质区域的第四层，其中在所述第三层中每一个所述的金属电极被所述第四层中的电介质物质区域覆盖。

8.如权利要求7中所要求的设备，其中所述第三层的模式化的传导区域被电介质物质形成的区域分离。

9.如权利要求7中所要求的设备，其中在所述第四层中所述的电介质物质区域被一种钝化物质区域分离。

10.如权利要求9中所要求的设备，其中所述的钝化物质区域延伸至所述电介质物质区域的边缘以限定所述的反应单元。

11.如权利要求1中所要求的设备，其中所述样品包含生物学底物。

12.一种用于检测样品中带电实体的目标生物学物质的设备，其包含：一种由至少一个反应单元形成的基质，其中所述反应单元包括一个由电介质层限定的用于吸引或排斥带电实体的表面，其中提供一个直接与所述电介质层接触的金属电极，以及其中所述的设备用于在所述电介质层中产生电荷分离，但是在所述电介质层与样品之间没有电流流动或电子转移。

13.一种在检测样品中的目标核酸中进行场辅助杂交的方法，包含以下步骤：提供一种反应单元，其具有一个由用于限定粘附表面的电介质物质层形成的粘附表面，提供一个直接与电介质粘附层接触的金属电极，将核酸捕获探针粘附于所述的电介质粘附层，将样品加入到所述反应单元中，并对所述金属电极提供一个电压，用于在所述电介质粘附层中产生电荷分离，但是在所述电介质粘附层与样品之间不产生电流流动或电子转移。

14.如权利要求13所要求的方法，其中提供的所述电极与相对于所述粘附表面的所述电介质粘附层的一面接触。

15.如权利要求13所要求的方法，其中所述电压是一种持续施加的电压。

16.如权利要求13所要求的方法，其中所述电压是作为一系列脉冲施加的。

17.如权利要求13所要求的方法，其中所述样品包含生物学底物。

18.一种在进行生物学反应时吸引带电实体至反应单元的表面或从反应单元的表面排斥带电实体的方法，其包含以下步骤：提供用于限定所述表面的电介质层，通过在所述电介质层中诱导电荷分离而产生一种电场，但是在所述电介质层与样品之间不产生电流流动或电子转移。

19.如权利要求18所要求的方法，其中在所述电介质层中的电荷分离是通过放置电极直接与所述电介质层接触且对所述电极施加一个电压而诱导的。

20.如权利要求19所要求的方法，其中对所述电极施加一个持续的电压。

21.如权利要求19所要求的方法，其中对所述电极施加一个脉冲电压。

22.如权利要求19所要求的方法，其中所述电极放置在与电介质层的表面接触，该电介质层的表面与带电实体被吸引或排斥的表面相对。

23.如权利要求13中所要求的方法，其中所述电极与相对于所述粘附表面的所述电介质层的一边接触。

24.如权利要求13中所要求的方法，其中所述的电介质物质是一种氧化物。

25.如权利要求13中所要求的方法，其中所述的电极是由铝形成的。

26.如权利要求13中所要求的方法，其中所述的电介质物质包含Al₂O₃且所述的电极是由铝形成的。

27.如权利要求13中所要求的方法，其中所述的电介质物质选自Al₂O₃、SiO₂或Ta₂O₅。