HK1091205B - 选择性cdk4抑制剂的羟乙基磺酸盐 - Google Patents

Description

选择性CDK4抑制剂的羟乙基磺酸盐

发明背景

发明领域

本发明涉及6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮的盐形式，其为选择性的细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)抑制剂，可用于治疗炎症和细胞增殖性疾病例如癌症和再狭窄。

相关讨论

细胞周期蛋白依赖性激酶以及相关丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶是在调节细胞分化和增殖中起重要作用的细胞酶。细胞周期蛋白依赖性激酶的催化单元由称作细胞周期蛋白的调节亚单元激活。目前已经鉴定了至少十六种哺乳动物的细胞周期蛋白(D.G.Johnson和C.L.Walker，Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.(1999)39：295-312)。细胞周期蛋白B/CDK1、细胞周期蛋白A/CDK2、细胞周期蛋白E/CDK2、细胞周期蛋白D/CDK4、细胞周期蛋白D/CDK6、以及可能其它异二聚体包括CDK3和CDK7是细胞周期进展中重要的调节子。细胞周期蛋白/CDK异二聚体的其它作用包括调节转录、DNA修补、分化和凋亡(D.O.Morgan，Annu.Rev.Cell.Dev.Biol.(1997)13261-13291)。

细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂被证明可用于治疗癌症。据表明，细胞周期蛋白依赖性激酶活性增强或者暂时性异常激活将导致人肿瘤的形成(C.J.Sherr，Science(1996)274：1672-1677)。确实，人肿瘤的形成通常与CDK蛋白自身或者它们的调节子的变异有关(C.Cordon-Cardo，Am.J.Pathol.(1995)147：545-560；J.E.Karp和S.Broder，Nat.Med.(1995)1：309-320；M.Hall等人，Adv.Cancer Res.(1996)68：67-108)。CDK的天然存在的蛋白抑制剂例如p16和p27在体外可引起肺癌细胞系的生长抑制作用(A.Kamb，Curr.Top.Microbiol.Immunol.(1998)227：139-148)。

小分子CDK抑制剂还可用于治疗心血管疾病例如再狭窄和动脉粥样硬化以及其它归因于细胞增殖异常的血管疾病。通过过度表达细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂蛋白p21来抑制血管平滑肌增殖以及进行气囊血管成形术后出现的内膜过度增生(M.W.Chang等人，J.Clin.Invest.(1995)96：2260；Z-Y.Yang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)(1996)93：9905)。此外，嘌呤CDK2抑制剂CVT-313(Ki＝95nM)在大鼠中可抑制超过80％的新内膜形成(E.E.Brooks等人，J.BioLChem.(1997)29207-29211)。

CDK抑制剂可用于治疗由各种传染原引起的疾病，包括真菌、原生动物寄生虫例如恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、以及DNA和RNA病毒。例如，单纯疱疹病毒(HSV)感染之后的病毒复制需要细胞周期蛋白依赖性激酶(L.M.Schang等人，J.Virol.(1998)72：5626)，并且已知CDK同系物在酵母菌(yeast)中起着重要作用。

选择性CDK抑制剂可用于缓解各种自身免疫疾病的影响。类风湿性关节炎作为一种慢性炎性疾病，其特征在于滑液组织过度增生。抑制滑液组织的增生应当使炎症达到最小化，同时防止关节被破坏。已经发现，CDK抑制剂蛋白p16在滑液成纤维细胞中的表达可以抑制生长(K.Taniguchi等人，Nat.Med.(1999)5：760-767)。类似地，在关节炎的大鼠模型中，使用p16表达的腺病毒治疗基本上可以抑制关节肿胀。CDK抑制剂可有效对抗其它细胞增殖疾病，包括牛皮癣(其特征在于角化细胞过度增生)、肾小球肾炎和狼疮。

某些CDK抑制剂借助于其抑制正常非变形细胞的细胞周期进展的能力可用作化学保护剂(Chen等人.J.Natl.Cancer Institute(2000)92：1999-2008)。在使用细胞毒素剂之前利用CDK抑制剂预先治疗癌症患者可以降低通常与化疗有关的副作用。正常的增生组织不受选择性CDK抑制剂作用所产生的细胞毒素效应影响。

关于小分子细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂的综述性文章已经指出鉴定仅仅抑制特定CDK蛋白而不抑制其它酶的化合物具有困难。因此，尽管它们可潜在地用于治疗各种疾病，但是目前尚无CDK抑制剂获得许可用于商业(P.M.Fischer，Curr.Opin.Drug Discovery(2001)4：623-634；D.W.Fry和M.D.Garrett，Curr.Opin.Oncologic，Endocrine&Metabolic Invest.(2000)2：40-59；K.R.Webster和D.Kimball，Emerging Drugs(2000)5：45-59；T.M.Sielecki等人，J.Med.Chem.(2000)43：1-18)。

尽管存在上述困难，但是最新研究已经鉴定出许多如前面所讨论的选择性CDK4抑制剂，它们被证明可用于治疗癌症(既可以作为抗癌剂，也可以作为化学保护剂)、心血管疾病(例如再狭窄和动脉粥样硬化)、由各种传染原引起的疾病、以及自身免疫疾病(包括类风湿性关节炎)。有关这些选择性CDK4抑制剂的披露可参见申请于2003年1月10日的普通指定国际专利申请PCT/IB03/00059(′059申请)，在此将其全部内容引入作为参考以实现所有目的。

该′059申请公开了一种特别有效的选择性CDK4抑制剂，6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮：

在标准酶测试中，式1化合物针对CDK4和CDK2抑制所具有的IC₅₀浓度(25℃下)分别为0.011μM和＞5μM。有关IC₅₀测定的标准CDK4和CDK2测试的讨论可参见D.W.Fry等人，J.Biol.Chem.(2001)16617-16623。

虽然式1化合物是一种有效的选择性CDK4抑制剂，但是它在药物产品中的应用仍然存在问题。例如，该游离碱具有较差的水溶性(9μg/mL)，同时在动物研究中具有较低的生物利用度。式1化合物的二盐酸盐似乎具有足够的水溶性。然而，吸湿研究显示，即使在低的相对湿度(10％RH)下，该二盐酸盐仍然吸收了含量超过其质量2％的水分，因而不适合用于固体药物产品中。式1化合物的单盐酸盐具有勉强合格的吸湿性，在相对湿度大于80％时吸收超过其质量2％的水分。然而，制备该单盐酸盐的方法通常得到部分结晶固体物质，这意味着在规模放大方面存在潜在问题。因此，需要式1化合物的其它盐形式。

发明概述

本发明提供了6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮的单羟乙基磺酸盐，其如式2所示：

该羟乙基磺酸盐可以以一种或多种多晶型形式存在，包括形式A、形式B和形式D。各多晶型可以通过其粉末X-射线衍射(PXRD)图样(衍射图)、或拉曼光谱、或差示扫描量热法(DSC)热谱图、或者PXRD图样、拉曼光谱和DSC热谱图的某些组合加以区分。该羟乙基磺酸盐可以是无水的，也可以含有可变含量的水或者一种或多种溶剂。

因此，本发明一方面提供了被指定为形式A的6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮的单羟乙基磺酸盐，其特征在于下述中的一种或多种：具有位于大约为8.7、13.5和17.6的2θ值位置的峰的粉末X射线衍射图样，或具有位于大约为1600cm^-1、1290cm^-1、675cm^-1、470cm^-1、450cm^-1和425cm^-1的拉曼位移值位置的峰的拉曼光谱，或者具有位于273℃的尖吸热峰的DSC热谱图。

本发明另一方面提供了被指定为形式B的6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮的单羟乙基磺酸盐，其特征在于下述中的一种或多种：具有位于大约为5.1、11.8、12.1、12.8、13.1和14.7的2θ值位置的峰的粉末X射线衍射图样，或具有位于大约为1600cm^-1、1290cm^-1、470cm^-1、450cm^-1和425cm^-1的拉曼位移值位置的峰、但在675cm^-1位置基本上无峰的拉曼光谱，或者具有位于271℃的尖吸热峰的DSC热谱图。

本发明再一方面提供了被指定为形式D的6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮的单羟乙基磺酸盐，其特征在于下述中的一种或多种：具有位于大约为8.4、8.9和21.9的2θ值位置的峰的粉末X射线衍射图样，或具有位于大约为463cm^-1的拉曼位移值位置的峰的拉曼光谱，或者具有位于277℃的尖吸热峰的DSC热谱图。对于各种盐形式，粉末X射线衍射图样使用CuK_α辐射获得，DSC热谱图使用5℃/分钟的加热速率获得。

本发明还提供了含有6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮的羟乙基磺酸盐和一种或多种可药用赋型剂的药物剂型。有用的赋型剂包括崩解剂、粘合剂、稀释剂、表面活性剂、润滑剂、防腐剂、抗氧化剂、芳香剂、着色剂等。

本发明还提供了制备6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮的羟乙基磺酸盐的方法。一种方法包括将羟乙基磺酸和第一溶剂的溶液加入至6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮的含水浆液中得到第一混合物。所述方法还包括冷冻干燥所述混合物得到无定形盐，然后将其与第二溶剂混合得到含有6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-a]嘧啶-7-酮的羟乙基磺酸盐的第二混合物。

另一方法包括提供6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮的羟乙基磺酸盐的籽晶，然后将该籽晶加入至6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮和第一溶剂的分散体中得到第一混合物。所述方法还包括将第一混合物与羟乙基磺酸和第二溶剂的溶液混合得到含有6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮的羟乙基磺酸盐的第二混合物。

在上述两种方法中，第一和第二溶剂可以相同或不同，并且可以是水混溶性溶剂，包括MeOH、EtOH以及其它醇类。为了提高收率，所述方法可以包括将第二混合物加热、冷却或加热并冷却至高于或低于室温的温度。例如，可以将第二混合物加热至大约30℃至大约60℃的温度，然后使其冷却至室温。或者，也可以将第二混合物置于室温下，然后冷却至等于或低于大约0℃的温度。类似地，可以将第二混合物加热至大约30℃至大约60℃的温度，然后冷却至等于或低于大约0℃的温度。

另一方法包括将4-{6-[6-(1-丁氧基-乙烯基)-8-环戊基-5-甲基-7-氧代-7，8-二氢-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基]-吡啶-3-基)-哌嗪-1-羧酸叔丁酯与羟乙基磺酸在溶剂和水中反应，得到含有6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮的二-羟乙基磺酸盐的混合物。所述方法任选包括向该反应混合物中加入位阻碱(hindered base)生成6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮的单-羟乙基磺酸盐。

本发明进一步提供了一种治疗哺乳动物包括人类中由细胞增殖异常、或病毒或真菌感染、或自身免疫疾病引起的障碍或病症的方法。所述方法包括向该哺乳动物施用有效治疗该障碍或病症用量的6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮的羟乙基磺酸盐。由细胞增殖异常引起的障碍或病症包括癌症以及与动脉粥样硬化、术后血管狭窄和再狭窄以及子宫内膜异位相关的血管平滑肌增殖。自身免疫疾病包括牛皮癣、炎症样的类风湿性关节炎、狼疮、1型糖尿病、糖尿病性肾病、多发性硬化症、肾小球肾炎和器官移植排斥，包括宿主对抗移植物疾病。

相对于游离碱(式1)以及其它盐形式包括单和二盐酸加成盐而言，该羟乙基磺酸盐提供了诸多优势。与游离碱相比较，该羟乙基磺酸盐的水溶性提高了20,000倍。然而，这与二盐酸盐不同的是，上述溶解性的提高并未同时伴随着吸湿性的实质性提高。另外，该羟乙基磺酸盐基本上为结晶，因而不存在与单盐酸盐相关的规模放大方面的潜在问题。上述以及其它的优势将有助于克服开发含有式1的选择性CDK4抑制剂的药物产品所面临的各种挑战。

附图简述

通过参照下面的描述以及附图，本发明所具有的各种特征、优势以及其它应用将更加明显。

图1示出了6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮的单-羟乙基磺酸盐(形式A)的PXRD图样；

图2示出了6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮的单-羟乙基磺酸盐(形式B和形式D)的PXRD图样；

图3示出了6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮的单-甲磺酸盐(形式A、形式B、形式C和形式D)的PXRD图样；

图4示出了6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮的二-甲磺酸盐的PXRD图样；

图5示出了6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮的单-HCl盐的PXRD图样；

图6示出了6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮的二-HCl盐的PXRD图样；

图7示出了6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮的单-羟乙基磺酸盐(形式A、形式B和形式D)的拉曼光谱，所具有的拉曼位移为0cm^-1至1850cm^-1；

图8示出了6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮的单-羟乙基磺酸盐(形式A、形式B和形式D)的拉曼光谱，所具有的拉曼位移为1350cm^-1至1800cm^-1；

图9示出了6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮的单-羟乙基磺酸盐(形式A、形式B和形式D)的拉曼光谱，所具有的拉曼位移为1100cm^-1至1350cm^-1；

图10示出了6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮的单-羟乙基磺酸盐(形式A、形式B和形式D)的拉曼光谱，所具有的拉曼位移为500cm^-1至850cm^-1；

图11示出了6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮的单-羟乙基磺酸盐(形式A、形式B和形式D)的拉曼光谱，所具有的拉曼位移为340cm^-1至550cm^-1；

图12示出了6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮的单-羟乙基磺酸盐(形式A)的DSC热谱图；

图13示出了6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮的单-羟乙基磺酸盐(形式B和形式D)的DSC热谱图；

图14示出了6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮的单-甲磺酸盐(形式A、形式B、形式C和形式D)的DSC热谱图；

图15示出了6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮的二-甲磺酸盐的DSC热谱图；

图16示出了6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮的二-HCl盐的DSC热谱图；

图17示出了6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮的游离碱的水吸附/解吸等温线；以及

图18示出了6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮的各种盐包括单-羟乙基磺酸盐(形式B和形式D)、单-和二-HCl、单-甲磺酸盐(形式A和形式C)、二-甲磺酸盐和单-甲苯磺酸盐的水吸附/解吸等温线。

发明详述

定义和缩写

除非另有说明，本说明书中使用下面的定义。

术语“癌症”包括但不限于下述癌症：乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、睾丸癌、食道癌、胃癌、皮肤癌、肺癌、骨癌、结肠癌、胰腺癌、甲状腺癌、胆道癌、口腔前庭和咽癌(口部)、唇癌、舌癌、口腔癌、咽喉癌、小肠癌、结肠-直肠癌、大肠癌、直肠癌、脑和中枢神经系统癌症、恶性胶质瘤、成神经细胞瘤、角化棘皮瘤、表皮样癌、大细胞癌、腺癌、腺瘤、滤泡性腺癌、未分化癌、乳头状癌、精原细胞瘤、黑素瘤、肉瘤、膀胱癌、肝癌、肾癌、骨髓障碍、淋巴障碍、何杰金氏病、毛细胞癌和白血球过多症。

短语“可药用的”是指在合理的医学判断范围内适用于与患者的组织相接触而不显示出过度的毒性反应、刺激性、过敏反应等，同时具有合理的效益/风险比且对于预定应用是有效的物质。

术语“治疗(treating)”是指逆转、缓解、抑制该术语所针对的障碍或病症的进展或者防止所述障碍或病症，或者防止这类障碍或病症的一种或多种症状。

术语“治疗(treatment)”是指按照前面定义的“治疗(treating)”的行为。

表1中列举了本说明书中使用的缩写。

表1.缩写

单-羟乙基磺酸盐(式2)可以以一种或多种多晶型形式存在，包括形式A、形式B和形式D。如上所述，每种多晶型可以通过粉末X-射线衍射(PXRD)、或拉曼光谱、或差示扫描量热法(DSC)、或者这些表征方法的某些组合加以区分。单-羟乙基磺酸盐(式2)可以是无水的，也可以含有可变量的水或者一种或多种溶剂。另外，单-羟乙基磺酸盐(式2)可以是基本上纯的，即含有至少大约99重量％的特定多晶型物，或者也可以是两种或多种多晶型的混合物(例如形式B和形式D等)。

游离碱(式1)是二元碱化合物，它可以形成单-和二-酸加成盐。其共轭酸所具有的pK_a为7.3和4.1，因此为了生成二盐，需要相对较强的酸。尽管可以形成式1化合物的二-羟乙基磺酸盐，但是似乎单-羟乙基磺酸盐更适用，这是因为后者要求较少的抗衡离子。

图1和图2提供了6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮的单-羟乙基磺酸盐形式(式2)的PXRD衍射图。将这些形式定义为图1中的形式A和图2中的形式B和形式D。为了方便阅读，已经将图2中形式D的衍射图向上平移了700单位。下表2中列出了单-羟乙基磺酸盐多晶型A、B和D的显著性PXRD峰(也就是那些峰高与噪音比值大于3.5的峰)，其以下划线给出，这些特征峰的亚群可用于将一种多晶型与另一种多晶型区分开。表2所提供的特征峰列表并不是唯一可能的特征峰列表。多晶型鉴定领域的普通技术人员可以选择特征峰的其它组合，它们也能够将一种晶型与另一种晶型区分开。

为了进行对比，图3-图6中分别示出了6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮的单-甲磺酸盐、二-甲磺酸盐、单-HCl和二-HCl盐的PXRD衍射图。尽管这些盐可以以不止一种形式存在，但是目前仅仅鉴定了单-甲磺酸盐的截然不同的多晶型，将图3指定为形式A、形式B、形式C和形式D。为了突出各单-甲磺酸盐形式之间的差异，已经将图3中形式B、形式C和形式D的衍射图向上平移了不同的数量。

如图1-图6所示的各PXRD图样是在使用CuK_α辐射的RIGAKUD/Max2200粉末X-射线衍射计上获得的。衍射计装备有细焦点X-射线管。在每次操作时，将管电压和电流分别设定为40kV和40mA，偏斜和分散狭缝设定为0.5°，接受狭缝设定为0.3mm。衍射辐射使用NaI闪烁检测器检测。对于每次运行，按照大约1°/分钟(3s/0.040°步长)的速度由3.0至40.0°2θ进行θ-2θ连续扫描。通过将样本置于硅片支架上从而制备得到分析用样本。使用RIGAKU’s RIGMEAS软件收集数据，然后利用由JADE软件平台开发的商业软件包进行分析。

对于每次粉末X-射线衍射测量，将盐形式的样本放置在位于支架平面上的空腔中，用载玻片调节样本的表面。将含有样本的支架置于衍射计中，用X-射线电子束源最初以相对于支架表平面而言较小的角度辐射样本。然后沿着弧线逐渐移动X-射线束，使入射电子束和支架表平面之间的角度逐渐增大。在每次扫描时，使用闪烁计数器检测衍射辐射的量，将其记录为2θ的函数。仪器软件将扫描的衍射辐射结果以强度对2θ的形式表示(图1-图6)。

在分别测量同一多晶型所得到的结果之间可能由于多种原因导致PXRD图样存在差异。误差的来源包括样本制备的差异(例如样本高度)、仪器误差、标度误差和操作误差(包括在确定峰位置时的误差)。优先取向，也就是在PXRD样本的结晶中缺乏随机取向，可能导致相对峰高存在显著性差异。标度误差和样本高度误差通常导致衍射图中的所有峰沿着相同方向位移相同的数量。平面支架上样本高度所存在的细小差异可能导致PXRD峰位出现很大偏移。系统性研究显示，1mm的样本高度差异可能导致峰位移高达1°2θ，这可参见Chen等人，J.Pharmaceutical and Biomedical Analysis(2001)26：63。

在很多情形中，因系统误差引起的衍射图样之间的峰位移可以通过修正位移(例如给所有峰位值施加一校正因子)或者通过再校准衍射计而消除。通常，可以使用同一方法弥补衍射计之间存在的差异，从而使得由两种不同仪器获得的PXRD峰位具有一致性。另外，当这些方法被应用于来自相同或不同衍射计的PXRD测量结果时，某特定多晶型的峰位通常相差大约±0.2°2θ.

表2.单-羟乙基磺酸盐形式A、B和D的显著性PXRD峰

图7-图11示出了6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮的单-羟乙基磺酸盐形式(式2)的拉曼光谱。图7示出了单-羟乙基磺酸盐形式A、形式B和形式D的拉曼光谱，其中拉曼位移为0cm^-1至1850cm^-1，图8-图11提供了单-羟乙基磺酸盐形式A、形式B和形式D的拉曼光谱，其中拉曼位移分别为1350cm^-1至1800cm^-1、1100cm^-1至1350cm^-1、500cm^-1至850cm^-1和340cm^-1至550cm^-1。在有些图中，为了突出各单-羟乙基磺酸盐形式之间存在的差异，对一个或多个拉曼光谱使用了不同的纵坐标缩放比例(例如图7、8、10、和11中的形式A)或不同的基线(例如图9中的形式A和形式B)或者不同的纵坐标缩放比例和基线(图10)。

下表3列出了用于将一种单-羟乙基磺酸盐与另一种单-羟乙基磺酸盐区分开的拉曼光谱特征峰。与PXRD数据一样，表3中提供的特征峰数值并不是唯一可能的特征峰列表，多晶型鉴定领域的普通技术人员可以选择其它也可以将一种多晶型与另一种多晶型区分开的特征峰组合。

图7-图11所示的拉曼光谱是使用KAISER OPTICAL SYSTEMSHOLOLAB拉曼显微镜和摄谱仪获得的。该拉曼摄谱仪(spectrograph)使用在785nm操作的固态二极管激光器，输出功率为大约90mW。通过显微镜物镜传递到样本的功率为大约27mW。使用热电冷却后的CCD检测器检测拉曼信号。分别使用与拉曼显微镜相连的纤维光学电缆和摄谱仪来引导到达和来自样本的激光激发光和拉曼散射光。

为了获得代表性的拉曼光谱，各多晶型形式的样本在多个位置或位点上进行检测。对于每个样本，在四个或五个点上获得拉曼光谱，每个点上具有四组重谱。对于正常情况下的固体样本，指定多晶型形式的数据在峰强度上具有最大差异，而在峰位上具有相对较小的差异。对于各种形式，尽管可以预期，但是拉曼位移值(峰位置是波数的函数)相差小于1cm^-1，不同形式之间的峰位相差超过1cm^-1。据信峰强度或峰位置上的至少某些差异是由于激光碰撞样本中不同结晶的方式所引起的。

表3.单-羟乙基磺酸盐形式A、B、和D的特征拉曼光谱峰

与前面所描述的差异一样，使用不同仪器获得的特定多晶型的拉曼光谱似乎在峰位置上也存在细微差异(即1cm^-1或更小)，在峰强度上存在相对更大的差异。假如拉曼散射与所用激发波长无关的话，那么峰位置应当同样位于使用不同激发源的仪器周围。至于其它，峰强度可能随检测器或光学的类型、激发激光的功率和样本位置变化而变化。

图12和图13示出了被指定为形式A(图12)和形式B以及D(图13)的6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮的单-羟乙基磺酸盐形式(式2)的DSC热谱图。另外，图14-图16分别示出了单-甲磺酸盐(形式A、B、C和D)、二-甲磺酸盐和二-HCl盐的DSC热谱图。DSC数据是使用TAINSTRUMENTS 2920 Modulated DSC V2.6获得的。单独的多晶型样本在通风、密闭的铝盘中使用5℃/分钟的加热速率加热至350℃以及50mL/分钟的氮清洗气流进行分析。

如图12-图15所示，该单-羟乙基磺酸盐(形式A、B和D)、单-甲磺酸盐(形式A、B、C和D)和二-甲磺酸盐具有截然不同的熔点，分别具有位于大约273℃、271℃、277℃、309℃、307℃、302℃、304℃和289℃的尖锐吸热峰。相反，该二-HCl盐(图16)具有相对复杂的DSC热谱图，包括位于大约40℃和110℃之间和大约160℃和200℃之间的宽吸热峰，它们可能分别表示失去湿气和晶格水。该二-HCl盐DSC示踪(trace)也具有始于大约207℃的相对较尖的放热峰和始于大约275℃的宽吸热峰，这可能分别表明形式转变并熔化或分解或者两者都有。

图17和图18示出了6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮的游离碱(式1)及其各种盐包括单-羟乙基磺酸盐(形式B和D)、单-和二-HCl、单-甲磺酸盐(形式A和C)、二-甲磺酸盐和单-甲苯磺酸盐的吸水和解吸等温线(25℃下)。这些吸水和解吸数据是使用VTI CORPORATION MODELSGA-100对称重量分析器获得的。为了获得水汽等温线，将多晶型样本置于密闭环境舱中的微量天平上，然后以5℃/分钟的速率加热直到舱内温度达到40℃。为了获得干燥样本重量，使多晶型物在40℃下平衡，直到样本在2分钟内的重量变化小于0.0270重量％。干燥之后，样本冷却至25℃，然后暴露于5或10％RH至90％RH以及90％RH至10或5％RH的不同湿度水平(以10％RH递增)下。在各湿度水平下，让多晶型物平衡直到样本在2分钟内的重量变化小于0.0270重量％。记录每个湿度水平下的平衡质量以及干燥样本重量，用来生成重量变化对相对湿度的曲线。

在图17和图18所示的化合物中，只有游离碱、单-羟乙基磺酸盐(形式B和D)和单-甲苯磺酸盐当暴露于25℃的10％RH至90％RH的湿度水平下时具有小于2％的质量变化。

表4列出了游离碱(根据浆化试验最稳定的结晶相)和羟乙基磺酸盐(形式B、根据浆化试验结果最稳定的形式)的水溶解度。由于形式B似乎是最稳定的羟乙基磺酸盐形式，因此在已观察的羟乙基磺酸盐形式中它应具有最低的水溶解度。没有评价其它羟乙基磺酸盐形式的亚稳态溶解度。羟乙基磺酸盐的水溶解度是这样得到的：将盐溶解于至多大约300mg/mL的水中，平衡大约48小时后观察到有固体，使用HPLC测量水相中盐的浓度。参见表5所列出的HPLC条件。游离碱的水溶解度是这样得到的：将该固体在水中平衡14小时，然后利用半自动化UV-vis方法(使用SPECTRMAX PLUS分光光度计板读数器)测量水相中游离碱的浓度。

表4中的数据表明，单-羟乙基磺酸盐(pH5.4)的水溶解度比游离碱(pH7.9)高20,000倍。上述水溶解度的明显不同不能通过游离碱和单-羟乙基磺酸盐的饱和溶液的pH之间存在相对合理(modest)的差异来解释。实际上，通过亨-哈二氏方程式(Henderson-Hasselbalch)计算(利用游离碱在pH7.9和pK_as7.3和4.1下的溶解度0.0092mg/mL)，游离碱的理论水溶解度在pH5.4下仅仅为0.62mgA/mL。将在117mgA/mL、pH5.4(相对于游离碱而言呈过饱和)下制备得到的单-羟乙基磺酸盐的水溶液用游离碱的结晶种晶没有引起沉淀析出。相反，籽晶被溶解，这表明羟乙基磺酸盐离子具有一定的增加游离碱在水中的溶解度的能力。

表4.游离碱和羟乙基磺酸盐(形式B)的水溶解度

表5.用于水溶解度测量的常规HPLC条件

羟乙基磺酸盐在生理盐水中的溶解度为0.58mgA/mL，远远低于其水溶解度，非常接近于在该溶液的最终pH(pH5.56)下的理论值0.43mgA/mL(根据亨-哈方程式计算)。在生理盐水中，羟乙基磺酸盐离子所具有的令人吃惊的增溶能力几乎消失殆尽，该化合物的溶解行为更类似于普通碱性化合物。

羟乙基磺酸盐可以使用各种技术制备得到。例如，在一种方法中，将羟乙基磺酸和第一溶剂的溶液与6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮的水浆状物混合。混合物过滤除去任何固体，所得到的滤液冷冻干燥(冻干)得到无定形的羟乙基磺酸盐。通过将该无定形盐溶解于第二溶剂中(同时可以加热以促进完全溶解)而将其转化为结晶形式。所得到的溶液接下来冷却至RT或更低使盐的结晶沉淀析出，沉淀可以通过过滤分离，然后置于真空烤箱中干燥。

上述方法通常使用化学计量的(也就是摩尔比例为1∶1或2∶1)或者接近化学计量的羟乙基磺酸和6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮。第一和第二溶剂可以相同或不同，通常是水混溶性溶剂，包括醇类例如MeOH和EtOH。使无定形盐溶解于第二溶剂中所需的热量取决于所用溶剂，但是混合物的温度一般为大约30℃至大约60℃，通常为大约30℃至大约50℃。在某些情形中，混合物的温度为大约30℃至大约40℃或者大约35℃至大约40℃。

在另一方法中，将游离碱(式1)分散(浆化)在第一溶剂中，用结晶性的羟乙基磺酸盐形式种晶。所得到的混合物与羟乙基磺酸和第二溶剂混合。通常将羟乙基磺酸溶液分成多份在一定时间内加入。所得到的浆状物或分散液在室温或更高的温度下搅拌，通常是在高于大约35℃或40℃的温度下。为了提高收率，所得到的混合物可以冷却至低于大约0℃的温度下，这时沉淀析出另外的羟乙基磺酸盐结晶。羟乙基磺酸盐结晶可以通过过滤分离，然后置于真空烤箱中干燥。与前面描述的方法相似，这种技术也使用化学计量或接近化学计量的羟乙基磺酸和6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮。另外，第一和第二溶剂可以相同或不同，通常是水混溶性溶剂，包括醇类例如MeOH和EtOH。相比于前面描述的方法，该方法通常收率更高，同时获得更好的(例如更大、更均匀)结晶。

另一方法借助于游离碱(式1)，同时由被保护的步骤中间体直接生成羟乙基磺酸盐。该方法包括将N-BOC保护的式3化合物

与大约3.5当量(或更多)的羟乙基磺酸在第一溶剂和水中进行反应，由此除去BOC保护基团，从而暴露出乙酰基得到6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮的二-羟乙基磺酸盐。上述反应可以在室温或更高的温度下进行，通常是在大约30℃至大约60℃的温度下进行。向上述反应混合物中加入位阻碱(例如Et₃N)在第二溶剂中的溶液，从而形成可溶于反应混合物中的与羟乙基磺酸的盐。加入碱的用量足以维持一在二-羟乙基磺酸盐存在下一反应混合物中存在稍微过量的游离羟乙基磺酸。例如，如果将3.5当量的羟乙基磺酸与BOC-保护的式3化合物反应的话，那么可以使用大约1.45当量的位阻碱，使得有大约0.05当量的游离羟乙基磺酸过量。如果需要的话，该二-羟乙基磺酸盐可以通过过滤分离。

为了得到6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮的单-羟乙基磺酸盐，在延长的时间内(例如逐滴)加入另外的碱以保证形成必需的单-羟乙基磺酸盐形式(例如形式B)。加入位阻碱太快，可能导致形成其它的亚稳态多晶型物。为了提高收率，所得到的浆状物可以冷却至大约5℃或更低的温度下，然后过滤并干燥。与前面描述的方法相同，第一和第二溶剂可以相同或不同，通常是水混溶性溶剂，包括醇类例如MeOH和EtOH。

本发明公开的其它盐形式例如单-或二-HCl、甲磺酸或苯甲磺酸盐可以按照类似于前面描述的用于制备羟乙基磺酸盐(式2)的方法制备。

本发明公开的化合物(式1和盐)包括所有的可药用同位素变体。同位素变体是指其中至少一个原子被具有相同原子序数但原子质量不同于通常在自然界发现的原子质量的原子所替代的化合物。有用的同位素包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟和氯的同位素。它们的示例性同位素包括但不限于²H、³H、¹³C、¹⁴C、¹⁵N、¹⁷O、¹⁸O、³²P、³⁵S、¹⁸F、和³⁶Cl。

本发明公开的化合物用同位素例如氘也就是²H取代可以因为具有更高的代谢稳定性而获得某些治疗上的优势，例如体内半衰期延长或剂量需要量降低，因而这在某些情形下是有用的。另外，某些同位素变体例如掺入放射性同位素的变体可用于药物和/或底物组织分布研究。放射性同位素氚也就是³H、和碳-14也就是¹⁴C是特别有用的，因为它们容易掺入且方便检测。

本发明公开的化合物的同位素变体通常可以通过本领域技术人员已知的常规方法或者通过类似于下文中使用适宜试剂的适宜同位素变体的实施例中描述的方法制备。本发明公开的化合物的可药用溶剂化物包括那些其中结晶溶剂可能被同位素取代的溶剂化物，例如D₂O、d₆-丙酮、d₆-DMSO。

本发明公开的化合物(式1和盐)可以以结晶或无定形产品的形式给药。它们可以通过例如沉淀、结晶、冷冻干燥、喷雾干燥或蒸发干燥的方法获得例如固体栓、粉末或薄膜的形式。微波或无线电频率干燥可用于实现上述目的。

本发明公开的化合物可以单独或者联合其它的药物给药，通常是以与一种或多种可药用赋形剂混合的制剂形式给药。术语“赋形剂”是指除式1所示化合物及其盐之外的其它任意成分。赋型剂的选择在很大程度上取决于具体的给药方式。

本发明公开的化合物可以口服给药。口服给药应当包括吞咽，从而使得化合物能够进入胃肠道，也可以通过颊或舌下给药使化合物直接由嘴进入血流。

适合口服给药的制剂包括固体制剂，例如片剂、含有微粒、液体或粉末的胶囊剂、锭剂(包括充满液体的锭剂)、咀嚼片剂(chew)、复微粒(multiparticulates)和纳米微粒、凝胶、固体溶液、脂质体、薄膜(包括粘膜粘着剂)、卵剂(ovule)、喷雾剂和液体制剂。液体制剂包括混悬剂、溶液剂、糖浆剂和酏剂。这类制剂可用作软胶囊剂或硬胶囊剂中的填充剂，并且通常含有载体例如水、EtOH、聚乙二醇、丙二醇、甲基纤维素、或者适宜的油，以及一种或多种乳化剂和/或助悬剂。液体制剂还可以通过使固体从例如囊剂中配制(reconstitution)而制备得到。

本发明公开的化合物还可用于快速溶解、快速崩解剂型中，例如那些由Liang和Chen描述在Expert Opinion in Therapeutic Patents(2001)11(6)：981-986中的剂型。

对于片剂剂型而言，药物的剂量可以占剂型的1重量％至80重量％，通常占剂型的5重量％至60重量％。除了药物之外，片剂通常还含有崩解剂。崩解剂的实例包括羟乙酸淀粉钠、羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钙、交联羧甲基纤维素钠、聚乙烯聚吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、微晶纤维素、低级烷基取代的羟丙基纤维素、淀粉、预凝胶淀粉和藻酸钠。通常，崩解剂可以占剂型的1重量％至25重量％，优选5重量％至20重量％。

粘合剂通常用于赋予片剂以粘合特性。适宜的粘合剂包括微晶纤维素、凝胶、糖类、聚乙二醇、天然和合成树胶、聚乙烯吡咯烷酮、预凝胶淀粉、羟丙基纤维素和羟丙基甲基纤维素。片剂还可以含有稀释剂，例如乳糖(单水合物、喷雾干燥的单水合物、无水等)、甘露醇、木糖醇、右旋糖、蔗糖、山梨醇、微晶纤维素、淀粉和磷酸氢钙二水合物。

片剂还任选含有表面活性剂例如十二烷基硫酸钠和聚山梨醇酯80、以及助流剂例如二氧化硅和滑石。如果存在的话，表面活性剂可以占片剂的0.2重量％至5重量％，助流剂可以占片剂的0.2重量％至1重量％。

片剂通常还含有润滑剂例如硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、硬脂酰富马酸钠、以及硬脂酸镁与十二烷基硫酸钠的混合物。润滑剂通常占片剂的0.25重量％至10重量％，优选为0.5重量％至3重量％。其它成分可以包括防腐剂、抗氧化剂、芳香剂和着色剂。

可以直接将片剂混合物压制形成片剂。片剂混合物或混合物部分在压片之前既可以是湿法、干法或熔化制粒的，也可以是熔化冷凝或挤压制粒的。最终的制剂可以含有一层或多层，可以包衣或不包衣。示例性的片剂含有至多大约80％药物、大约10重量％至大约90重量％粘合剂、大约0重量％至大约85重量％稀释剂、大约2重量％至大约10重量％崩解剂、以及大约0.25重量％至大约10重量％润滑剂。有关片剂的其它细节参见H.Lieberman和L.Lachman，Pharmaceutical DosageForms：Tablets，VoL 1(1980)。

可以将适合口服给药的固体制剂配制成立刻和/或修饰释出药物。缓释制剂包括延时释出、持续释出、脉冲式释出、控制释出、靶向释出以及按程序释出。有关适宜缓释制剂的综述参见美国专利号6,106,864。有关其它有用的释出技术例如高能量分散剂和渗透性和包衣颗粒的细节参见Verma等人，Pharmaceutical Technology On-line(2001)25(2)：1-14。有关利用口香糖获得控制释出的讨论参见WO00/35298。

本发明公开的化合物(式1和盐)还可以直接给药至血流、肌肉、或内脏器官中。非肠道给药的适宜方式包括静脉内、动脉内、腹膜内、鞘内、心室内、尿道内、胸骨内、颅内、肌内和皮下给药。用于非肠道给药的适宜装置包括针式(包括显微针)注射器、无针式注射器和输注手段。

非肠道给药制剂通常是含有赋型剂例如盐、碳水化合物和缓冲剂(优选pH为3-9)的水溶液剂，但是对于某些应用，更适合将其制剂成无菌的无水溶液剂或者用于与适宜的媒质例如无菌、无热原水联合使用的干燥形式。采用本领域技术人员熟知的常规制药技术可以方便地在无菌条件下通过冻干法完成非肠道给药制剂的制备。

可以使用适宜的制剂技术来提高在非肠道溶液剂制备中使用的本发明公开化合物的溶解性，例如合掺入增溶剂。可以将非肠道给药制剂配制成前述的立刻和/或缓和释出药物。因此，可以将本发明公开的化合物配制成更多的固体形式，用于以保证长时间释出活性化合物的植入药库的形式给药。

本发明的化合物还可以局部给药至皮肤或粘膜，既可以皮肤给药也可以透皮给药。用于该目的的典型制剂包括凝胶剂、水凝胶、洗剂、溶液剂、乳剂、软膏剂、扑粉、调味品(dressing)、泡沫、薄膜、皮肤贴剂、糯米纸囊剂(wafers)、植入剂、棉球(sponge)、纤维、绷带和微乳剂。还可以使用脂质体。典型的载体包括醇、水、矿物油、液体石蜡、白凡士林、甘油和丙二醇。典型的制剂还可以含有穿透促进剂。参见例如Finnin和Morgan的J Pharm Sci(1999)88(10)：955-958。

局部给药的其它方式包括通过离子透入、电穿孔、超声透入、超声促渗和无针式(例如POWDERJECT)或显微针注射递送方法。可以将局部给药制剂配制成前述的立刻和/或缓和释出药物。

本发明公开的化合物还可以鼻内给药或通过吸入给药，通常为来自干粉吸入器中的干粉形式(既可以是单独的混合物形式，例如与乳糖的干燥混合物，也可以是混合组分颗粒形式，例如与磷脂混合)或者来自加压容器、泵、喷雾机(spray)、喷雾器(atomizer)(优选使用电子流体力学产生细薄雾的喷雾器)、或雾化器(nebuliser)中的喷雾形式，可以使用也可以不使用适当的推进剂例如二氯氟甲烷。加压容器、泵、喷雾机、喷雾器、或雾化器中含有溶液或悬浮液，该溶液或悬浮液包括活性化合物、用于使活性化合物分散、溶解或延时释出的物质(例如EtOH或EtOH水溶液)、作为推进剂的一种或多种溶剂、以及任选的表面活性剂，例如脱水山梨糖醇三油酸酯或低聚乳酸(oligolactic acid)。

在使用干粉或混悬剂之前，将该药物产品微粒化至适合吸入给药的尺寸(通常是小于5微米)。这可以通过任何一种适合的粉碎方法而得以实现，例如旋转气流粉碎、流化床气流粉碎、超临界流化加工形成纳米颗粒、高压匀化、或者喷雾干燥。

可以将用于吸入器或吹入器中的胶囊、泡罩(blister)和药筒(例如由凝胶或羟丙基甲基纤维素制成)配制成含有活性化合物、适宜的粉末基质例如乳糖或淀粉、以及性能改良剂例如L-亮氨酸、甘露醇或硬脂酸镁的粉末混合物。乳糖可以是无水的，优选单水合的。其它适宜的赋形剂包括右旋糖苷、葡萄糖、麦芽糖、山梨醇、木糖醇、果糖、蔗糖和海藻糖。

用于喷雾器(利用电子流体动力学产生细薄雾)中的适宜溶液配方中可以含有1μg至20mg本发明化合物/喷，喷雾体积可以为1μl至100μl。典型的制剂中可以含有式1或式2化合物、丙二醇、无菌水、EtOH和NaCl。可替代丙二醇使用的溶剂包括甘油和聚乙二醇。

可以使用例如聚(DL-乳-共羟乙酸)(PGLA)将吸入/鼻内给药制剂配制成立刻和/或修饰释出药物。可以向用于吸入/鼻内给药的制剂中加入芳香剂例如薄荷醇和左薄荷脑、或甜味剂例如糖精或糖精钠。

在干粉吸入剂和气雾剂的情形中，剂量单位通过递送计算用量的阀门确定。通常将本发明的剂量单位设置成每个计算剂量或“一喷”中含有100μg至1000μg活性药物成分。总的日剂量通常为100μg至10mg，其可以以单次剂量给药，或者更通常是在全天中以多剂量给药。

活性化合物可以以例如栓剂、阴道栓剂或灌肠剂的形式直肠或阴道给药。可可脂是传统的栓剂基质，但是如果适合的话也可以使用其它的替代品。可以将直肠/阴道内给药制剂配制成上述的立刻和/或修饰释出药物。

本发明公开的化合物还可以直接给药至眼睛或耳朵，通常是以在等渗且调节好pH的无菌盐水中的微粒化混悬剂或溶液剂的滴剂形式。其它适合眼部和耳部给药的制剂包括软膏剂、可生物降解的(例如可吸收的凝胶海绵、胶原)和不可生物降解的(例如硅酮)植入剂、糯米纸囊剂(wafers)、镜片(lenses)和微粒或囊状系统，例如niosomes或脂质体。可以将聚合物例如交联聚丙烯酸、聚乙烯醇、透明质酸，纤维质聚合物(例如羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素或甲基纤维素)，或杂多糖聚合物(例如琼脂糖胶)与防腐剂例如苯扎氯铵一起混入。这类制剂还可以通过离子透入递送。可以将眼部/耳部给药制剂配制成上述的立刻和/或修饰释出药物。

本发明公开的化合物可以与可溶性大分子实体例如含有环糊精或聚乙二醇的聚合物结合以改善其溶解性、溶出速率、味觉掩盖程度、生物利用度和/或稳定性。已发现，例如药物-环糊精配合物通常适用于大多数的剂型和给药途径。可以使用包合和非包合配合物。作为与药物直接络合的替代品，环糊精可用作辅助添加剂，即作为载体、稀释剂或增溶剂。用于实现上述目的最常用的是α-、β-和γ-环糊精。参见例如国际专利申请号WO 91/11172、WO 94/02518和WO 98/55148。

式1、式2化合物或者其它盐的治疗有效剂量可以为大约0.01mg/kg至大约100mg/kg体重/天。典型的成人剂量可以是大约0.1至大约3000mg每天。根据特定应用和活性成分的药效，活性成分在单位剂量制剂中的含量可以在大约0.1mg至大约500mg、优选为0.6mg至100mg的范围内变化或进行调整。如果需要的话，组合物中还可以含有其它的可配伍的治疗剂。需要接受治疗的患者可以服用大约0.6至大约500mg每天的剂量，既可以一次服用，也可以在24小时内分成多次服用。如果需要长时间治疗，可以按照连续的时间间隔重复上述治疗。

实施例

下面的实施例是本发明的示例性和非限制性、以及代表性的具体实施方案。

实施例1

4-[6-(6-溴-8-环戊基-5-甲基-7-氧代-7，8-二氢-吡啶并[2，3-d] 嘧啶-2-基氨基)-吡啶-3-基]-哌嗪-1-羧酸叔丁酯的制备

将6-溴-8-环戊基-2-甲亚磺酰基-5-甲基-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮(10.00g，0.027mol，按照WO 01/707041中的实施例6制备，在此将其引入作为参考)和10.37g(0.0373mol)4-(6-氨基-吡啶-3-基)-哌嗪-1-甲酸叔丁酯在甲苯(100mL)中的悬浮液在氮气下的油浴中加热7小时。薄层色谱法(SiO₂，10％MeOH/DCM)显示两种起始原料均存在。将悬浮液继续加热回流18小时。所得到的悬浮液冷却至室温后过滤得到4-[6-(6-溴-8-环戊基-5-甲基-7-氧代-7，8-二氢-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基)-吡啶-3-基]-哌嗪-1-甲酸叔丁酯(5.93g，38％)。熔点＞250℃。MS(APCI)M⁺+1：计算值584.2，实测值584.2。

实施例2

4-{6-[8-环戊基-6-(1-乙氧基-乙烯基)-5-甲基-7-氧代-7，8-二 氢-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基]-吡啶-3-基}-哌嗪-1-羧酸叔丁酯 的制备

将4-[6-(6-溴-8-环戊基-5-甲基-7-氧代-7，8-二氢-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基)-吡啶-3-基]-哌嗪-]-甲酸叔丁酯(5.93g，0.010mol，如实施例1中制备)、四(三苯基膦)钯(0)(1.40g，0.00121mol)、和三丁基(1-乙氧乙烯基)锡(5.32mL，0.0157mol)在甲苯(30mL)中的悬浮液加热回流3.5小时。混合物冷却后过滤得到固体。该固体通过硅胶色谱法纯化15分钟，使用5％-66％乙酸乙酯/己烷梯度洗脱，得到为黄色泡沫的4-{6-[8-环戊基-6-(1-乙氧基-乙烯基)-5-甲基-7-氧代-7，8-二氢-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基]-吡啶-3-基}-哌嗪-1-甲酸叔丁酯(4.50g，78％)。MS(APCI)M⁺+1：计算值576.2，实测值576.3。

实施例3

6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨 基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮盐酸盐的制备

将氯化氢气体鼓泡通入至冰浴冷却的4-{6-[8-环戊基-6-(1-乙氧基-乙烯基)-5-甲基-7-氧代-7，8-二氢-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基]-吡啶-3-基}-哌嗪-1-甲酸叔丁酯(4.50g，0.00783mol，如实施例2中制备)的DCM(100mL)溶液中。所得到的悬浮液塞住后在室温下搅拌过夜，然后用乙醚(200mL)稀释。过滤收集固体，用乙醚洗涤，然后干燥得到为黄色固体的6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮盐酸盐(4.01g，92％)。熔点200℃。HPLC，C18反相，10％-95％梯度的0.1％TFA/CH₃CN的0.1％TFA/H₂O溶液，持续22分钟：在第11.04分钟为99.0％。MS(APCI)M⁺+1：计算值448.2，实测值448.3。对C₂₄H₂₉N₇O₂·2.4H₂O·1.85HCl的元素分析计算值：C，51.64；H，6.44；N，17.56，Cl(全部)，11.75。实测值：C，51.31；H，6.41；N，17.20；Cl(全部)，12.11。

实施例4

6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨 基)-8H-吡啶并[2.3-d]嘧啶-7-酮的单-羟乙基磺酸盐(形式B)的制备

向6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮(7.0g，15.64mmol，如实施例3中制备，然后与NaOH接触)分散在250mL水中的浆状物中逐滴加入30mL 0.52M羟乙基磺酸的MeOH(15.64mmol)溶液至pH为5.2。溶液通过玻璃滤器(细)过滤后，透明溶液冷冻干燥得到9.4g无定形盐。将该无定形盐(3.16g)与25mL MeOH混合，几乎完全融解后，形成新的沉淀。加入另外的25mL MeOH，混合物在46℃至49℃下搅拌4小时。混合物缓慢冷却至32℃，然后置于冷室(+4℃)中过夜。将样本进行PXRD分析，表明形成了形式B。混合物过滤后，沉淀在50℃的真空烤箱中干燥。从而制得2.92g式1化合物的单-羟乙基磺酸盐，收率92％。HPLC-99.25％，PXRD-形式B，CHNS，H-NMR与结构相符。

实施例5

6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨 基)-8H-吡啶并[2.3-d]嘧啶-7-酮的单-羟乙基磺酸盐(形式B)的制备

将MeOH(100mL)置于装备有机械搅拌器、热电偶/控制器、冷凝器和加热罩的250mL烧瓶中，预热至35℃。缓慢加入三等份无定形羟乙基磺酸盐(2g，如实施例4中制备)，每次加料间隔为25分钟至30分钟。反应混合物在35℃下搅拌过夜，然后冷却。样本过滤后通过PXRD检测。产物为纯的形式B。在更大规模的放大试验中，该整个反应混合物随后被用作形式B种晶。

实施例6

6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨 基)-8H-吡啶并[2.3-d]嘧啶-7-酮的单-羟乙基磺酸盐(形式B)的制备

将MeOH(50mL)置于装备有机械搅拌器、冷凝器、热电偶/控制器和加热罩的250mL烧瓶中，预热至40℃。缓慢加入三等份无定形羟乙基磺酸盐(1g，如实施例4中制备)，每次加料间隔30分钟，然后在40℃下搅拌过夜。反应就地通过拉曼光谱法监测。样本取出后，过滤并通过PXRD分析。PXRD和拉曼光谱显示其为纯的形式B。混合物冷却至25℃，速率为3℃/小时，再冷却至-10℃，过滤，真空干燥得到0.85g形式B的结晶产物。

实施例7

6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨 基)-8H-吡啶并[2.3-d]嘧啶-7-酮的单-羟乙基磺酸盐(形式B)的制备

将游离碱(式1，0.895mg，2mmol)与10mL MeOH混合，然后用33mg式1化合物的单-羟乙基磺酸盐(形式B)种晶。然后在75分钟内加入10等份的5.6mL 0.375M羟乙基磺酸的MeOH(2.1mmol)溶液。混合物继续搅拌1小时，样本取出后进行PXRD分析。证实已经形成结晶形式B。混合物在室温下搅拌过夜，再次进行PXRD。发现结晶形式无变化。混合物置于-8℃冰箱中冷却，过滤，并在50℃真空炉中干燥，得到1.053g(理论值91.8％)标题化合物(形式B)。HPLC-99.8％，CHNS，H-HMR，RI与形式B的结构、PXRD相符。

实施例8

6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨 基)-8H-吡啶并[2.3-d]嘧啶-7-酮的单-羟乙基磺酸盐(形式A)的制备

将无定形羟乙基磺酸盐(47mg，如实施例4中制备)与4mL EtOH混合在装备有磁性搅拌器、热电偶和冷凝器的15mL烧瓶中。混合物加热回流，从而形成接近透明溶液。回流10-15分钟后，混合物变得浑浊。缓慢冷却至50℃，然后在69℃下用形式A种晶。混合物保持在50℃下，持续5小时，然后冷却至室温过夜。混合物随后用冰浴冷却至1℃，保持1.5小时，过滤后用0.5mL冷EtOH洗涤，风干，然后在70℃真空烤箱中干燥过夜，得到38.2mg细结晶物质。通过PXRD发现该结晶物质为单-羟乙基磺酸盐形式A。H-NMR符合单-羟乙基磺酸盐，并且显示存在残余EtOH，约为5.9mol％或0.6重量％。

实施例9

6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨 基)-8H-吡啶并[2.3-d]嘧啶-7-酮的单-羟乙基磺酸盐(形式D)的制备

将无定形羟乙基磺酸盐(9.0g，如实施例4中制备)与300mL MeOH混合，搅拌并加热至63.8℃(回流)。向该轻微浑浊的混合物中加入两份50mL每份的MeOH。该热混合物过滤在装备有机械搅拌器的2-L烧瓶中。混合物简单加热至回流，然后冷却至60℃。向混合物中加入IPA(100mL)。混合物再次加热至60℃，然后加入另外的110mL IPA。在59.7℃开始析出沉淀。混合物再次加热至67.5℃，冷却至50℃，然后保持过夜。第二日早晨取出样本进行PXRD分析。混合物以3℃/小时的速率冷却至25℃，取出另外的PXRD样本，混合物达到28℃。混合物冷却至室温过夜。收集沉淀，在65℃和30托的真空烤箱中干燥。上述步骤制备得到7.45g(82.8％收率)结晶化合物(通过PXRD分析为形式D)。先前分析过的样本也是形式D。HPLC显示纯度为98.82％，CHNS微量分析在+/-0.4％范围。由羟乙基磺酸盐形式A、B和D在MeOH中的浆状物在不到三天内得到基本上纯的形式B。

实施例10

羟乙基磺酸(2-羟基-乙磺酸)的制备

在装备有机械搅拌器、热电偶、气体喷雾器、以及穿过水阱的排气口的5-L四颈圆底烧瓶中加料入748g(5.05mol)羟乙基磺酸钠(ALDRICH)、和4L IPA。浆状物在室温下搅拌。使用冰浴保持内部温度低于50℃，同时向体系中鼓泡通入925g(25.4mol)氯化氢气体(ALDRICH)，控制速度使得加入后即溶解(此时可注意到无泡沫通过水阱)。加入足够的HCl气体直到体系呈饱和(此时可注意到开始有泡沫通过脱水器)。在加入HCl的过程中，温度升至45℃。然后将浆状物冷却至室温，通过粗玻璃过滤器过滤。滤饼用100mL IPA洗涤，得到的浑浊滤液通过10-20μ过滤器过滤。所得到的透明、无色滤液在旋转蒸发仪上减压浓缩，同时保持浴温低于50℃。所得到的1.07kg透明、浅黄色油状物用50mL自来水和400mL甲苯洗涤，在旋转蒸发仪上减压浓缩三天，同时保持浴温低于50℃。所得到的800g透明、浅黄色油状物用500mL甲苯和250mL IPA洗涤，在旋转蒸发仪上减压浓缩11天，同时保持浴温低于50℃。对所得到的713g透明、浅黄色油状物进行滴定于81重量％(580g，91.1％收率)，其中含有7.9重量％水和7.5重量％IPA。

实施例11

4-{6-[6-(1-丁氧基-乙烯基)-8-环戊基-5-甲基-7-氧代-7，8-二 氢-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基]-吡啶-3-基}-哌嗪-1-甲酸叔丁酯 的制备

将装备有机械搅拌器、热电偶、和氮气进口/通过硅油起泡器排气的出口的5-L三颈圆底烧瓶置于氮气氛下，向其中加入4-[6-(6-溴-8-环戊基-5-甲基-7-氧代-7，8-二氢-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基)-吡啶-3-基]-哌嗪-1-甲酸叔丁酯(300g，0.51mol，如实施例2中制备)、丁基乙烯醚(154g，1.54mol，ALDRICH)、正丁醇(1.5L，ALDRICH)、和二异丙基乙基胺(107mL，0.62mol，ALDRICH)。浆状物置于大约50托的真空下，然后用氮气充气三次。向其中加入8.3g(0.01mol)双-(二苯基膦二茂铁)二氯化钯二氯甲烷(JOHNSONMATTHEY，产品号077598001)，所得到的浆状物按照上述方法净化三次。混合物然后加热至95℃，同时搅拌20小时。所得到的微红色浆状物用2L庚烷稀释，然后冷却至大约5℃。在温度下，加入400mL饱和碳酸钾水溶液，混合物过滤后用250mL庚烷清洗。在45℃烤箱中干燥16小时后，得到为黄色固体的231.7g(75％收率)标题化合物。

实施例12

6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨 基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮的单-羟乙基磺酸盐(形式B)的制备

将装备有机械搅拌器、热电偶、和氮气进口/通过硅油起泡器排气的出口的22-L三颈圆底烧瓶置于氮气氛下，向其中加入4-{6-[6-(1-丁氧基-乙烯基)-8-环戊基-5-甲基-7-氧代-7，8-二氢-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基]-吡啶-3-基}-哌嗪-1-甲酸叔丁酯(725g，1.20mol，如实施例11中制备)和MeOH(14L)。浆状物在室温下搅拌，同时加料入羟乙基磺酸(530g，4.20mol，如实施例10中制备)、MeOH(1.5L)、和水(70mL，3.89mol)溶液。所得到的浆状物在30分钟内加热至55℃，然后在55℃下搅拌30分钟。向浆状物中加入175g(1.73mol)Et₃N(ALDRICH)在200mL MeOH中的溶液，同时冷却至30℃。浆状物保持在30℃下，同时在6小时内逐滴加入128g(1.26mol)Et₃N在2L MeOH中的溶液。采集所得到的浆状物中的样本，确定为结晶形式(形式B)。浆状物冷却后保持在5℃下持续15分钟，然后通过粗玻璃过滤器过滤。所得到的滤饼用200mL冷MeOH多次洗涤。固体产物在55℃下真空干燥得到710g(91％收率)为黄色结晶的标题化合物。

应该理解的是，本说明书仅为示例性而非限制性描述。在阅读本说明书之后，各种实施方案对于本领域技术人员而言均是显而易见的。因此，本发明的范围不应当根据本说明书来确定，而是应当参照后面的权利要求书、以及与这些有效权利要求等价的全部范围来加以确定。在此将所有论文和参考文献包括专利、专利申请、和专利公开文献的全部内容引入作为参考，并且适用于各种目的。

Claims (17)

1.6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮的单-羟乙基磺酸盐。

2.权利要求1的单-羟乙基磺酸盐，它是单-羟乙基磺酸盐的形式A，其特征在于：具有位于大约为8.7，12.6，13.5，17.6，18.8，19.6，19.8，23.0和24.2的2θ值位置的峰的粉末X射线衍射图样；具有位于大约为1600cm^-1、1290cm^-1、675cm^-1、470cm^-1、450cm^-1和425cm^-1的拉曼位移值位置的峰的拉曼光谱；以及具有位于273℃的尖吸热峰的DSC热谱图。

3.权利要求1的单-羟乙基磺酸盐，它是单-羟乙基磺酸盐的形式B，其特征在于：具有位于大约为5.1，10.2，11.8，12.1，12.8，13.1，14.7，15.2，16.0，16.6，17.9，19.2，19.7，21.3，21.9，22.6，23.2，24.6，25.6，26.1，28.9，30.0，30.9，32.5，33.0，32.5，33.0，34.2，35.3和36.0的2θ值位置的峰的粉末X射线衍射图样；具有位于大约为1600cm^-1、1290cm^-1、470cm^-1、450cm^-1和425cm^-1的拉曼位移值位置的峰、但在675cm^-1位置基本上无峰的拉曼光谱；以及具有位于271℃的尖吸热峰的DSC热谱图。

4.权利要求1的单-羟乙基磺酸盐，它是单-羟乙基磺酸盐的形式D，其特征在于：具有位于大约为8.4，8.9，10.8，12.6，14.2，16.8，17.9，18.4，19.1，20.0，20.4，21.0，21.9，22.6，23.0，23.6，24.6，26.2，27.2，28.7，29.8，30.3，38.4的2θ值位置的峰的粉末X射线衍射图样；具有位于大约为463cm^-1的拉曼位移值位置的峰的拉曼光谱；以及具有位于277℃的尖吸热峰的DSC热谱图。

5.药物剂型，它含有6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮的单-羟乙基磺酸盐和一种或多种可药用赋形剂。

6.制备结晶性6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮的单-羟乙基磺酸盐的方法，所述方法包括：

将羟乙基磺酸和第一溶剂的溶液与6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮和水的分散液混合得到第一混合物；

冷冻干燥第一混合物得到无定形盐；

将该无定形盐与第二溶剂混合得到第二混合物，第二混合物包括结晶性6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮的单-羟乙基磺酸盐，第二溶剂与第一溶剂相同或不同；并且

任选加热第二混合物、冷却第二混合物、或者加热并冷却第二混合物，

其中所述的第一溶剂和第二溶剂相同或不同，为水混溶性溶剂。

7.权利要求6的方法，其中的水混溶性溶剂是醇类。

8.权利要求7的方法，其中的醇类是MeOH或EtOH。

9.权利要求6的方法，其中第一混合物或第二混合物分别通过将等摩尔用量的羟乙基磺酸与6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮混合而制备得到。

10.制备6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮的单-羟乙基磺酸盐的方法，所述方法包括：

将4-{6-[6-(1-丁氧基-乙烯基)-8-环戊基-5-甲基-7-氧代-7，8-二氢-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基]-吡啶-3-基}-哌嗪-1-甲酸叔丁酯与羟乙基磺酸在第一溶剂和水中反应，得到包括6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮的二-羟乙基磺酸盐的混合物，所述的第一溶剂同权利要求6所定义；以及

向反应混合物中加入位阻碱得到6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮的单-羟乙基磺酸盐。

11.6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮的单-羟乙基磺酸盐用于制备治疗哺乳动物中由异常细胞增殖引起的疾病或病症的药物的用途。

12.权利要求11的用途，其中所述疾病或病症是与动脉粥样硬化、术后血管狭窄和再狭窄或子宫内膜异位相关的血管平滑肌增殖。

13.权利要求11的用途，其中所述异常细胞增殖是癌症。

14.6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮的单-羟乙基磺酸盐用于制备治疗哺乳动物中由病毒或真菌感染引起的疾病或病症的药物的用途。

15.6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮的单-羟乙基磺酸盐用于制备治疗哺乳动物中自身免疫疾病的药物的用途。

16.权利要求15的用途，其中所述自身免疫疾病是牛皮癣、炎症样类风湿性关节炎、狼疮、1型糖尿病、糖尿病性肾病、多发性硬化症、肾小球肾炎或器官移植排斥。

17.权利要求11、14或15的用途，其中所述的哺乳动物是人。