[go: up one dir, main page]

HK1086031B - 新霉素磷酸转移酶基因及选择高产重组细胞的方法 - Google Patents

新霉素磷酸转移酶基因及选择高产重组细胞的方法 Download PDF

Info

Publication number
HK1086031B
HK1086031B HK06105904.8A HK06105904A HK1086031B HK 1086031 B HK1086031 B HK 1086031B HK 06105904 A HK06105904 A HK 06105904A HK 1086031 B HK1086031 B HK 1086031B
Authority
HK
Hong Kong
Prior art keywords
gene
ala
cells
seq
neomycin phosphotransferase
Prior art date
Application number
HK06105904.8A
Other languages
English (en)
Other versions
HK1086031A1 (zh
Inventor
Barbara Enenkel
Kerstin Sautter
Ralf Otto
Jürgen FIEDER
Klaus Bergemann
Original Assignee
贝林格尔英格海姆法玛两合公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE10330686A external-priority patent/DE10330686A1/de
Application filed by 贝林格尔英格海姆法玛两合公司 filed Critical 贝林格尔英格海姆法玛两合公司
Priority claimed from PCT/EP2003/013203 external-priority patent/WO2004050884A2/de
Publication of HK1086031A1 publication Critical patent/HK1086031A1/zh
Publication of HK1086031B publication Critical patent/HK1086031B/zh

Links

Description

新霉素磷酸转移酶基因及选择高产重组细胞的方法
发明领域
本发明是关于新颖的经修饰新霉素磷酸转移酶基因及其在高产重组细胞选择方法中的用途。相应地，本发明也关于新的表达载体，其含有根据本发明的经修饰的新霉素磷酸转移酶基因，优选的是与功能上连接至异源启动子的目的基因组合。本发明进一步关于利用相应的高产重组细胞制备异源基因产物的方法。
背景技术
哺乳动物细胞是用来生产复杂的生物药学蛋白质的优选的宿主细胞，因为其在翻译后进行的修饰，不仅在功能上也在药物动力学上可与人类相容。在商业上相关的细胞类型是杂交瘤、骨髓瘤，CHO(中国仓鼠卵巢)细胞和BHK(幼仓鼠肾脏)细胞。越来越多地在无血清和不含蛋白质的生产条件下进行宿主细胞的培养。其理由是与此相关的成本降低、在纯化重组蛋白质上的干扰减少，并降低导入病原(例如朊蛋白、病毒)的可能。应用CHO细胞作为宿主细胞变得更广泛，是因为这一细胞适应在不含血清和蛋白质的培养基中悬浮生长，并亦为管理当局视为和接受作为安全的生产细胞。
为了生产表达异源目的基因(GOI)的稳定哺乳动物细胞系，通常通过转染，将异源基因连同可选择标记基因，例如新霉素磷酸转移酶一起，引入所需的细胞系内。异源基因和可选择的标记基因可与此同时或者由一个单一载体一起表达，或由共转染的各自分开的载体表达。在转染之后2至3天，将细胞移至含有选择试剂，例如在使用新霉素磷酸转移酶基因(NPT基因)时为G418的培养基中，并在这一选择条件下培养数周。然后可分离出现的具抗性的细胞，并研究所需的基因产物(GOI)的表达。
在建立具有高表达的所需蛋白质的细胞株中，一个大问题发生自重组载体随机及未受指导地整合入宿主细胞基因组的转录活性或非活性位置。结果得到具有完全不同异源基因表达速率的细胞群体，细胞的生产率通常遵循常态分布。所以为了鉴定具有非常高异源目的基因表达的细胞克隆，必须检查及测试大量克隆，导致时间、人力及成本花费。对转染所用的载体系统的优化因此目的在于通过适当的选择策略增加转染细胞群体中的高产部分，并借助降低克隆确认中的花费。此表达系统的发展为本发明的主题。
使用其基因于大肠杆菌中与转座子5-相关的氨基葡萄糖苷-3′-磷酸转移酶II酶(新霉素磷酸转移酶)(EC27195)的基因作为可选择标记在许多生物中(如细菌、酵母、植物及哺乳动物细胞)中被使用。此酶赋予对许多氨基葡萄糖苷抗生素的耐受性如新霉素、卡那霉素及G418，藉着把ATP末端磷酸根转移至氨基己糖环I的3′羟基而灭活抗生素。除了野生型新霉素磷酸转移酶(wt NPT)，已知有些突变体具有降低的磷酸转移酶活性及因而于细菌中(Blazquez等人，1991；Kocabiyik等人，1992；Yenofsky等人，1990)及于叶片中(Yenofsky等人，1990)降低对氨基葡萄糖苷抗生素的耐受性。
使用其中一种突变体(Glu1 82Asp)作为选择大鼠胚胎干细胞的标记，将新霉素磷酸转移酶基因藉由有针对性的同源重组(基因靶向)整合入c-myc基因(Hanson等人，1995)。作者将修饰酶的应用限制于基因靶向。
专利申请WO 99/53046描述与生产相关的哺乳细胞中表达修饰的新霉素磷酸转移酶基因(Asp261Asn)。作者描述一种非克隆方法以在哺乳类细胞中表达目的基因。藉由以编码启动子元件、目的基因及与内部核糖体进入位点(IRES，internal ribosomal entry site)元件耦联的可选择标记的三个个别DNA片段共转染细胞，能够培养于选择压力下被靶向的细胞，其中将所有三个DNA片段作为有功能的双顺反子转录单位(目的基因启动子-IRES-新霉素磷酸转移酶基因)加以组合。元件的排列仅发生于转染的细胞，所以仅少数细胞显示元件的正确排列。再者，基因扩增后，利用可扩增可选择标记，不可产生高产克隆。在反覆选择及基因扩增后产生的细胞呈现最高6pg蛋白质/细胞/天的产率。
无一文献公开特别适合于制备用于哺乳动物细胞的高表达载体系统的修饰的新霉素磷酸转移酶基因，该基因容许发展高产细胞以制备重组生物制药蛋白质，所述细胞含有一或多个目的基因及具有降低的抗生素抗性的修饰的新霉素磷酸转移基因两者的一或多个完整的功能性的转录单位。描述于WO 99/53046的DNA构建体仅含有功能上连接至二氢叶酸还原酶(DHFR)无启动子新霉素基因。
所以需要取得使适当的修饰的新霉素磷酸转移酶基因，特别是为了发展生物过程所用的相应高表达载体系统所用的该基因。所以本发明的任务为提供相应的新颖的修饰的新霉素磷酸转移酶基因，含有修饰的新霉素磷酸转移酶基因及功能上连接至异源启动子的目的基因的表达载体，选择高产重组细胞，优选是哺乳动物细胞的方法，及制造异源基因产物的方法。
意外地，于本发明的范围内，已能制备及鉴定新颖的经修饰的高选择性新霉素磷酸转移酶基因，其特征在于其特别适于选择高产细胞。
发明概述
本发明提供新颖的经修饰的新霉素磷酸转移酶基因。意外地已发现，藉由利用说明于下文中的经修饰新霉素磷酸转移酶基因作为可选择标记，可达成具有共同整合目的基因的高表达率的转染哺乳动物细胞富集。与利用野生型新霉素磷酸转移酶作为可选择标记比较，以根据本发明的新颖新霉素磷酸转移酶基因之一转染后，细胞呈现蛋白质(抗体)的生产率增加1.4至14.6倍。
根据本发明的修饰的新霉素磷酸转移酶基因优选为突变体，其编码在氨基酸位置91、182、198、227、240或261上与野生型基因不同的氨基酸。于优选具体实施例中，根据本发明的新霉素磷酸转移酶基因为突变体Glu182Gly、Glu182Asp、Trp91Ala、Val198Gly、Asp227Ala、Asp227Val、Asp227Gly、Asp261Asn、Asp261Gly或Phe240Ile。为了选择高产哺乳动物细胞，已证实特别适合于使用突变体Trp91Ala、Asp227Val、Asp261Asn、Asp261Gly及Phe240Ile，而突变体Asp227Val及Asp261Gly另一方面给予细胞克隆最高生产率且因而为特别优选。
藉由利用含有功能上连接至异源启动子的异源目的基因及根据本发明的修饰的新霉素磷酸转移酶基因的真核表达载体得到高产细胞。表达载体优选含有其他调控元件，如功能上连接至启动子的一或多个增强子。另外含有功能上连接至目的基因及异源启动子的萤光蛋白质基因，优选经由内部核糖体进入位点(IRES)的表达载体也为优选，其得以于异源启动子的控制下双顺反子表达编码萤光蛋白质的基因及编码目的蛋白质/产物的基因。特别优选的是异源目的基因于泛素(ubiquitin)/S27a启动子的控制下的表达载体。
本发明亦关于表达载体，其取代目的基因含有为掺入此基因的多克隆位置，即具有限制性核酸内切酶的多重识别序列的序列区域。
于另一方面中，本发明是关于重组哺乳动物细胞，其含有前述根据本发明的修饰的新霉素磷酸转移酶基因之一。此外，本发明是关于重组哺乳动物细胞，其已受根据本发明的表达载体之一转染。此等优选为重组啮齿类动物细胞，其中重组仓鼠细胞如CHO细胞或BHK细胞为特别优选。于另一优选具体实施例中，将该重组细胞另外以可扩增的可选择标记的基因转染，如以二氢叶酸还原酶(DHFR)的基因。
本发明亦关于富集表达修饰的新霉素磷酸转移酶基因的重组哺乳动物细胞的方法，其特征在于(i)将哺乳动物细胞集合体以修饰的新霉素磷酸转移酶基因转染，其与野生型新霉素磷酸转移酶相比仅具有1至80％，优选仅1至60％，更优选仅1.5至30％，还更优选仅1.5至26％的活性，和/或上述修饰之一；(ii)将哺乳动物细胞于允许表达修饰的新霉素磷酸转移酶基因的条件下培养；及(iii)将哺乳动物细胞于至少一种选择剂存在下培养，所述选择剂选择性作用于哺乳动物细胞的生长，并给予表达新霉素磷酸转移酶基因的细胞生长优势。
本发明亦关于于重组哺乳动物细胞中表达至少一种目的基因的方法，其特征在于(i)将哺乳动物细胞集合体以至少一种目的基因及一种修饰的新霉素磷酸转移酶基因转染，其与野生型新霉素磷酸转移酶相比仅具有1至80％，优选仅1至60％，更优选仅1.5至30％，还更优选仅1.5至26％的活性和/或上述修饰之一；(ii)将细胞于允许表达目的基因及修饰的新霉素磷酸转移酶基因的条件下培养；(iii)将哺乳动物细胞于至少一种选择剂存在下培养，所述选择剂选择性作用于哺乳动物细胞的生长，并给予表达新霉素磷酸转移酶基因的细胞生长优势；及(iv)自哺乳动物细胞或自培养上清液得到目的蛋白质。
本发明更关于得到及选择表达至少一种异源目的基因的重组哺乳动物细胞的方法，其特征在于(i)重组哺乳动物细胞以根据本发明的表达载体转染，其除了目的基因及修饰的新霉素磷酸转移酶基因之外还编码萤光蛋白质；(ii)将哺乳动物细胞于允许表达目的基因、编码萤光蛋白质的基因及修饰的新霉素磷酸转移酶基因的条件下培养；(iii)将哺乳动物细胞于至少一种选择剂存在下培养，所述选择剂选择性作用于哺乳动物细胞的生长，并给予表达新霉素磷酸转移酶基因的细胞生长优势；及(iv)藉流式细胞计分析将哺乳动物细胞挑选。
若已将哺乳动物细胞另外以可扩增可选择标记基因如DHFR基因转染，能够于也表达可扩增可选择的标记基因的条件下培养哺乳动物细胞，及向培养基中加入选择剂造成可扩增可选择标记基因的扩增。
优选的是，将根据本发明的方法实施于适应悬浮生长的哺乳动物细胞，即于悬浮培养中培养的哺乳动物细胞。其他具体实施例是关于将哺乳动物细胞(优选的是适应悬浮生长者)于无血清条件下培养的方法。
附图说明
图1显示于CHO-DG44细胞中用来表达重组蛋白质的基础载体的示意性制备。“P/E”为CMV增强子及仓鼠-泛素/S27a启动子的组合，只有“P”时代表启动子元件及“T”为转录的终止信号，其对已转录的mRNA的聚腺苷酸化为必需。于各转录单位内以箭头指明转录起始的位置及方向。为了克隆异源基因，将具有限制性核酸内切酶的多重切割位置的序列区域(多克隆位点-MCS)插入于启动子元件之后。将可扩增的可选择标记二氢叶酸还原酶缩写为“dhfr”及可选择标记新霉素磷酸转移酶缩写为“npt”(npt野生型或npt突变体)。来自脑心肌炎病毒的“IRES”元件于双顺反子转录单位内作为内部核糖体进入位点并使随后绿萤光蛋白质“GFP”得以翻译。
图2显示编码单链蛋白质(图2A)或单克隆抗体的亚单位(图2B)并用来转染CHO-DG44细胞的真核表达载体的示意性制备。“P/E”为CMV增强子及仓鼠-泛素/S27a启动子的组合，只有“P”时代表启动子元件及“T”为转录的终止信号，其对已转录的mRNA的聚腺苷酸化为必需。于各转录单位内以箭头指明转录起始的位置及方向。将可扩增的可选择标记二氢叶酸还原酶缩写为“dhfr”及可选择标记新霉素磷酸转移酶缩写为“npt”。NPT突变体E182G(SEQ ID NO：3)、E182D(SEQ ID NO：19)、W91A(SEQ ID NO：5)、D190G(SEQ ID NO：23)、V198G(SEQ ID NO：7)、D208G(SEQ ID NO：25)、D227A(SEQ ID NO：9)、D227V(SEQ ID NO：11)、D227G(SEQ ID NO：21)、D261G(SEQ ID NO：13)、D261N(SEQ ID NO：15)、及F240I(SEQ ID NO：17)包含点突变，在指示的位置造成改变的氨基酸(以1字母密码表示)。来自脑心肌炎病毒的“IRES”元件于双顺反子转录单位内作为内部核糖体进入位点并使随后绿萤光蛋白质“GFP”得以翻译。“MCP-1”编码单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1)，而“HC”及“LC”分别编码人源化单克隆IgG2抗体的重或轻链。
图3显示新霉素磷酸转移酶(npt)基因的部分序列，其中已藉致突变的引物进行PCR插入点突变。大写字母代表NTP编码区域的核苷酸序列而小写字母代表两侧非编码核苷酸序列。由核苷酸序列预测的氨基酸序列(3-字母密码)示于编码核苷酸序列之上。箭头代表使用的引物的方向、长度及位置，箭头具有实线代表致突变的正向引物，箭头具有虚线代表致突变反向引物，箭头具有点线代表分别位于npt基因或突变位置的上游的引物Neofor5(SEQ ID NO：27)或Neofor2(SEQ ID NO：29)，而箭头具有点划线代表分别位于npt基因或突变位置的下游的引物Neorev5(SEQ ID NO：28)或IC49(SEQ ID NO：30)。将相对于野生型序列替换的核苷酸强调于箭头上方或下方。
图4显示NPT氨基酸序列内保守性结构域及插入NPT突变的位置。基于不同氨基葡萄糖苷修饰的酶之间序列同源性，于NPT蛋白质序列内鉴定不同保守性结构域(以灰色表示)。酶C末端区域的三个基序(motif)明显具有特殊功用。基序1及2可能牵涉ATP催化或核苷酸结合中末端磷酸根的催化转移，而基序3被视为具有ATP水解和/或改变酶-氨基葡萄糖苷复合物的构型的功能。发生于至少70％氨基葡萄糖苷修饰的酶的氨基酸以粗体强调。基于其类似性将单下标线的氨基酸归于相同组，并发生于至少70％氨基葡萄糖苷修饰的酶。以星号标注的氨基酸代表突变处的位置。
图5显示NPT突变对稳定转染的MCP-1表达细胞的选择的影响。为此，将CHO-DG44细胞以载体pBIN-MCP1、pKS-N5-MCP1或pKS-N8-MCP1(图2A)转染，其含有NTP野生型(WT)或NPT突变体Glu182Asp或Asp227Gly作为可选择标记。为了选择稳定转染的细胞，将400微克/毫升或800微克/毫升G418加至培养基作为选择剂。细胞培养上清液中产生的重组蛋白质MCP-1的浓度藉ELISA决定并计算每细胞及每天的特异性生产率。长条代表特异性生产率的均值或来自6孔板中的四次培养的18个集合体的效价。
于图6中研究NTP突变对稳定转染的单克隆抗体表达细胞的选择的影响。为此，将CHO-DG44细胞以质粒组合pBIDG-HC/pBIN-LC(NPT野生型)、pBIDG-HC/pKS-N5-LC(NPT突变体Glu182Asp)或pBIDG-HC/pKS-N8-LC(NPT突变体Asp227Gly)(图6A)或以组合pBIDG-HC/pBIN-LC(NPT野生型)、pBIDG-HC/pBIN1-LC(NPT突变体Glu182Asp)、pBIDG-HC/pBIN2-LC(NPT突变体Trp91Ala)、pBIDG-HC/pBIN3-LC(NPT突变体Val198G)、pBIDG-HC/pBIN4-LC(NPT突变体Asp227Ala)、pBIDG-HC/pBIN 5-LC(NPT突变体Asp227Val)、pBIDG-HC/pBIN6-LC(NPT突变体Asp261Gly)、pBIDG-HC/pBIN7-LC(NPT突变体Asp261Asn)或pBIDG-HC/pBIN8-LC(NPT突变体Phe240Ile使用的)转染(图6B)，其彼此间不同仅在于作为可选择标记使用的NTP基因(野生型或突变体)。细胞培养上清液中产生的重组单克隆IgG2抗体的浓度藉ELISA决定并计算每细胞及每天的特异性生产率。总共，每一载体组合建立5-9个集合体。长条代表特异性生产率的均值或来自75平方厘米瓶中进行的6次培养的测试中所有集合体的效价。为了计算相对效价或相对特异性生产率，将以NPT野生型基因选择的集合体的平均值视为1。
图7显示藉由使用根据本发明的NPT突变体作为可选择标记于转染的细胞集合体中具有较高GFP表达的细胞的富集。为此，将CHO-DG44细胞以质粒组合pBIDG-HC/pBIN-LC(NTP野生型)、pBIDG-HC/pKS-N5-LC(NPT突变体Glu182Asp)、pBIDG-HC/pKS-N8-LC(NPT突变体Asp227Gly)、pBIDG-HC/pBIN1-LC(NPT突变体Glu182Gly)、pBIDG-HC/pBIN2-LC(NPT突变体Trp91Ala)、pBIDG-HC/pBIN3-LC(NPT突变体Vall98G)、pBIDG-HC/pBIN4-LC(NPT突变体Asp227Ala)、pBIDG-HC/pBIN5-LC(NPT突变体Asp227Val)、pBIDG-HC/pBIN6-LC(NPT突变体Asp261Gly)、pBIDG-HC/pBIN7-LC(NPT突变体Asp261Asn)或pBIDG-HC/pBIN8-LC(NPT突变体Phe240Ile)转染(于各情况中有5至9集合体)，其彼此间不同仅在于使用NTP基因(野生型或突变体)作为可选择标记。再者，pBIDG载体也含有GFP作为标记基因。转染的细胞集合体于加入G418的无HT培养液中选择2-3周后，藉FACS分析测量GFP萤光。每个图，除了以无转染的CHO-DG44细胞作为负对照之外，代表来自以相同质粒组合转染的每个集合体的GFP萤光的均值。
图8显示由经dhfr介导的基因扩增达成的单克隆抗体生产率增加，以由载体组合pBIDG-HC/pBIN-LC(NPT野生型)或pBIDG-HC/pBIN5-LC(NPT突变体D227V)转染的CHO-DG44所得到的细胞集合体作为实例。在G418存在中于无次黄嘌呤/胸苷CHO-S-SFMII培养基中的第一次选择后，藉由加入100nM及而后500nM MTX至培养基中进行经dhfr介导的基因扩增。集合体中细胞培养上清液中的单克隆抗体浓度藉ELISA决定并计算每细胞及每天的特异性生产率(pg/细胞*天)。各数据点代表于75平方厘米瓶中进行的6次培养的平均。
图9显示根据本发明的NPT突变体与NPT野生型于点分析中比较的酶活性。为此，将已以NPT野生型基因(SEQ ID NO：1)或以NPT突变体E182G(SEQ ID NO：3)、E182D(SEQ ID NO：19)、W91A(SEQ ID NO：5)、V198G(SEQ ID NO：7)、D227A(SEQ ID NO：9)、D227V(SEQ ID NO：11)、D227G(SEQ ID NO：21)、D261G(SEQ ID NO：13)、D261N(SEQ ID NO：15)及F240I(SEQ ID NO：17)转染及选择的两种不同表达单克隆抗体的细胞集合体(细胞集合体1及2)的细胞萃取物制备。使用未转染的CHO-DG44细胞作为负对照。使用G418作为磷酸化分析中的底物。将萃取物于96孔真空歧管中经P81磷酸纤维素及硝化纤维素膜的夹层过滤。由蛋白激酶磷酸化的蛋白质及未磷酸化的蛋白体结合至硝化纤维素，而磷酸化及未磷酸化的G418通过硝化纤维素并结合至磷酸纤维素(图9A)。利用磷影像分析仪(PhosphoImager)侦测放射线信号及定量。使用以5微克萃取物得到的信号来计算百分比酶活性。百分比酶活性表示来自2表达单克隆抗体的细胞集合体NTP突变体的平均值，其中将野生型NPT的酶活性视为100％(图9B)。
图10显示NPT表达的RNA印迹分析及于转染的细胞集合体中NPT基因拷贝数。为此，将已以NPT野生型基因(SEQ ID NO：1)或以NPT突变体E182G(SEQ ID NO：3)、E182D(SEQ ID NO：19)、W91A(SEQ ID NO：5)、V198G(SEQ ID NO：7)、D227A(SEQ ID NO：9)、D227V(SEQ ID NO：11)、D227G(SEQ ID NO：21)、D261G(SEQ ID NO：13)、D261N(SEQ ID NO：15)及F240I(SEQ ID NO：17)转染及选择的两种不同表达单克隆抗体的细胞集合体的总RNA加以制备。使用未转染的CHO-DG44细胞作为负对照。将30：μg各RNA与FITC-dUTP标记的PCR产物杂交，该产物包含有NPT基因的编码区域。于所有转染的细胞中，侦测到约1.3kb的特异性单一NPT转录物。为了决定npt基因的拷贝数，于斑点印迹分析中，将基因组DNA自前述表达单克隆抗体的细胞集合体中分离。将10微克、5微克、2.5微克、1.25微克、0.63微克或0.32微克基因组DNA与FITC-dUTP标记的PCR产物杂交，该产物包含有NPT基因的编码区域。使用未转染的CHO-DG44细胞作为负对照。使用质粒pBIN-LC作为标准(320pg、160pg、80pg、40pg、20pg、10pg、5pg、2.5pg)。利用对标定过的质粒DNA测量的信号强度决定的标准系列计算npt基因于细胞集合体中的拷贝数。
图11显示以二细胞集合体为例(细胞集合体5及8)利用FACS藉GFP为基础的选择分离高表达单克隆抗体细胞集合体。将此等得自以pBID-HC及pBING-LC共转染的细胞集合体经过连续以GFP为基础的FACS挑选。在每次挑选步骤后以ELISA决定集合体中细胞培养上清液中的IgG2抗体的浓度并计算每细胞及每天的特异性生产率(pg/细胞*天)。总共完成6次挑选，其中于各情况中，将具有最高GFP萤光的5％细胞选出。各数据点代表于75平方厘米瓶中进行的至少6个培养的平均值。
图12显示以细胞集合体5及8为例(比较图11)藉由合并以GFP为基础的选择与MTX扩增步骤达到单克隆抗体生产率的增加。在以载体pBID-HC及pBING-LC共转染CHO-DG44两周后，自细胞集合体5及8选出具有最高GFP萤光的5％细胞。而后藉由加入100nM氨甲蝶呤(MTX，Methotrexate)至培养基中进行经dhff介导的基因扩增。于集合体细胞培养上清液中的单克隆抗体浓度藉ELISA决定并计算每细胞及每天的特异性生产率(pg/细胞*天)。各数据点代表于75平方厘米瓶中进行的至少6次培养的平均。
图13显示以细胞集合体5及8为例(比较图11)抗体生产率及GFP萤光之间的关联性。此等细胞集合体是由以载体组合pBID-HC及pBING-LC转染CHO-DG44得到。将其经过连续以GFP为基础的FACS挑选，其中各自选出具有最高GFP萤光的5％细胞。在每次挑选步骤后以ELISA决定集合体细胞培养上清液中的IgG2抗体的浓度并计算每细胞及每天的特异性生产率(pg/细胞*天)。各数据点代表于75平方厘米瓶中进行的至少6个培养的平均。
发明和优选实施方式的详细描述
下列氨基酸位置的资讯于各情况中是关于由具有SEQ ID NO：1的野生型新霉素磷酸转移酶基因编码的氨基酸位置。“修饰的新霉素磷酸转移酶基因”意指编码具有新霉素磷酸转移酶活性的多肽的核酸，该多肽于至少一个于本说明书中更完全地说明的氨基酸位置，具有与野生型蛋白质不同的氨基酸，该氨基酸位置为与具有SEQ ID NO：2的野生型蛋白质同源。于本文中，用词“同源”意指可将携带突变的序列区域与参考序列相对照，参考序列于此情况中，根据SEQ ID NO：2的野生型新霉素磷酸转移酶的序列，对照利用所谓标准“比对”演算法，如例如“BLAST”(Altschul，S.F.，Gish，W，Miller，W.，Myers，E.W.& Lipman，D.J.(1990)“基本局部比对搜寻工具”J.Mol.Biol.215：403-410；Gish，W.& States，D.J.(1993)“藉数据库类似性搜寻鉴定蛋白质编码区域”Nature Genet.3：266-272；Madden，T.L.，Tatusov，R.L.& Zhang，J.(1996)“网路BLAST服务器的运用”Meth.Enzymol.266：131-141；Zhang，J.&Madden，T.L(1997)“PowerBLAST：一种新的网路BLAST运用于互动或自动序列分析及注解”Genome Res.7：649-656；Altschul，Stephen F.，Thomas L.Madden，Alejandro A.Schaffer，Jinghui Zhang，Zheng Zhang，Webb Miller，及David J.Lipman(1997)“Gapped BLAST及PSI-BLAST：新一代蛋白质数据库搜寻程式”Nucleic Acids Res.25：3389-3402)。当其符合其序列顺序及可利用标准“比对”演算法鉴定，序列为一致。
本发明提供新颖的经修饰新霉素磷酸转移酶基因及允许高表达异源基因产物(优选的是生物制药上相关的多肽或蛋白质)的哺乳动物细胞株的制备及选择方法。根据本发明的方法首先是基于选择除了目的基因也表达根据本发明的新霉素磷酸转移酶基因的细胞，其给予转染的细胞比未转染的细胞有选择性优势。意外地，已发现利用在此已说明的根据本发明的修饰新霉素磷酸转移酶基因(mNPT基因)具有显著选择优势超过野生型新霉素磷酸转移酶基因(wtNPT基因)。此尤有关于利用具有比wtNPT低酶活性的突变体。
根据本发明的修饰的新霉素磷酸转移酶基因
已证实特别适合使用编码仅具有1至80％，优选仅1至60％的wtNPT酶活性的NPT的修饰的NTP基因。优选的NTP突变体为仅具有1至30％的wtNPT酶活性者，而仅具有1.5至26％的wtNPT酶活性者为特别优选。NTP的酶活性可于例如如说明于实例4中及称为方法5的点分析中决定。
用词“野生型新霉素磷酸转移酶”意指编码氨基葡萄糖苷-3′-磷酸转移酶II酶(EC2.7.1.95)的新霉素磷酸转移酶基因，其基因于大肠杆菌中与天然的转座子5-相关，并含有例如示于SEQ ID NO：2中的氨基酸序列，或由示于SEQ ID NO：1中的核苷酸序列编码。此酶赋予对许多氨基葡萄糖苷抗生素的抗性如新霉素、卡那霉素及G418，藉由转移ATP末端磷酸根至氨基己糖环I的3′羟基而灭活抗生素。用词wtNPT也意指具有与由SEQ ID NO：1编码的NPT可相比较的酶活性的所有NPT。此特别包括彼等NPT其中催化自ATP转移末端磷酸根至底物的酶活性中心，以相同或几乎相同形态存在(Shaw等人，1993；Hon等人，1997；Burk等人，2001)因此具有与含有氨基酸序列SEQ ID NO：2的酶可比较的酶活性。wtNPT具有可比较的酶活性若其呈现约81至150％，优选90至120％的由SEQ ID NO：2定义的NPT展现的酶活性，而活性可于例如如说明于实例4中及称为方法5的点分析中决定。
基本上优选为突变体，其中与wtNPT相较降低的酶活性是基于氨基酸序列的修饰，如基于置换、插入或缺失至少一或多个氨基酸。缺失、插入及置换突变体可由“位置特异性突变发生”和/或“以PCR为基础的突变发生技术”产生。相应的方法是例如由Lottspeich及Zorbas(1998)(第36.1章与其他参考资料)说明。
意外地，已发现若使用新霉素磷酸转移酶突变体作为可选择标记，其中与wtNPT比较至少于氨基酸位置91氨基酸色氨酸、于氨基酸位置182氨基酸谷氨酸、于氨基酸位置198氨基酸缬氨酸、于氨基酸位置227氨基酸天冬氨酸、于氨基酸位置261氨基酸天冬氨酸或于氨基酸位置240氨基酸苯丙氨酸已被改变，可能达到特别有效富集具有高表达率的共同整合的目的基因的转染的哺乳动物细胞。于是，关于于位置91、182、198、227、261和/或240的氨基酸的突变体为优选。特别有利的为置换突变体，即突变体中发生于于野生型此位置的氨基酸已由另一氨基酸取代。再更优选的为相对应的置换突变体，其中改变相对应的氨基酸导致相较于wtNPT降低酶活性至1至80％，优选至1至60％，更优选至1.5至30％，还更优选至1.5至26％。特别优选的是修饰的NPT基因，其中氨基酸91、227、261和/或240已被修饰，所以造成与wtNPT比较酶活性仅为1至80％，优选的是仅1至60％，更优选的是仅1.5至30％，最优选的是仅1.5％至26％。更优选的是置换突变体其中氨基酸于氨基酸位置227已被修饰，使得修饰的NPT的酶活性与wtNPT比较为小于26％，优选的是于1及20％之间，更优选的是于1及16％之间。
根据本发明另一具体实施例，有利的突变体为与wtNPT比较，于氨基酸位置91、182或227编码甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸或酪氨酸者。再者，谷氨酸于氨基酸位置182可由天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或任何其他优选的带负电荷氨基酸取代。也为优选的是修饰的NPT基因其与wtNPT比较，于氨基酸位置198编码甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸者。也为优选的是修饰的NPT基因其与wt NPT比较，于氨基酸位置240编码甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、酪氨酸或色氨酸者。也为优选的是修饰的NPT基因其与wtNPT比较，于氨基酸位置261编码甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或天冬氨酸者。特别是，已发现以突变体Glu182Gly、Glu182Asp、Trp91Ala、Val198Gly、Asp227Ala、Asp227Val、Asp227Gly、Asp261Gly、Asp261Asn及Phe240Ile作为可选择标记可能达到富集具有高表达率的共同整合的目的基因的转染的哺乳动物细胞，结果是此等突变体为特别优选。再更优选的为突变体Asp227Val、Asp227Gly、Asp261Gly、Asp261Asn、Phe240Ile及Trp91Ala，因利用此等达到最佳富集率。突变体Asp227Val为特别优选。
相反地，已证实Asp190Gly及Asp208Gly突变体为于无血清培养条件下选择转染的CHO-DG44细胞的不适当标记。此等突变体(Asp190Gly、Asp208Gly)可能大幅降低的酶功能的结果，在选择时期后仅得到少数细胞，其严重地损害其生长及生命力。
基于野生型的于位置182及227的氨基酸为非保守的氨基酸，其位于氨基葡萄糖苷-3′-磷酸转移酶的C末端区域的三个保守的基序之外。氨基酸于位置91也属于非保守的氨基酸且位于氨基葡萄糖苷-3′-磷酸转移酶的N末端区域的保守的基序之一之外。相反地，氨基酸于位置198及240为于NPT的C端区域的保守的氨基酸，但然而于保守的基序之外。相反地，氨基酸于位置261为于C端区域的第三个基序中的保守的氨基酸(Shaw等人，1993，Hon等人，1997；Burk等人，2001)。
与利用wtNPT作为可选择标记比较，在Glu182Gly、Glu182Asp及Val198Gly突变体的情况中细胞显示生产率增加倍数为1.4-2.4倍，在Asp227Gly突变体的情况中生产率增加倍数为1.6-4.1倍，在Asp227Ala或Trp91Ala突变体的情况中生产率增加倍数为2.2或4倍，在Phe240Ile或Asp261Asn突变体的情况中生产率增加倍数为5.7或7.3倍及在Asp261Gly或Asp227Val突变体的情况中生产率甚至增加至9.3或14.6倍。为了表达多链蛋白质(抗体)，进行共转染。将两蛋白质链各自以其本身载体表达，一个载体另外编码NPT基因而另一载体编码可扩增可选择的二氢叶酸还原酶基因。
因此本发明是关于富集表达修饰的新霉素磷酸转移酶基因的重组哺乳动物细胞的方法，其特征在于(i)将哺乳动物细胞集合体以修饰的新霉素磷酸转移酶基因转染，其与野生型新霉素磷酸转移酶相比仅具有1至80％，优选仅1至60％，更优选仅1.5至30％，还更优选仅1.5至26％的活性和/或说明于本文中的修饰之一；(ii)将哺乳动物细胞于允许表达修饰的新霉素磷酸转移酶基因的条件下培养；及(iii)将哺乳动物细胞于至少一种选择剂存在下培养，其选择性作用于哺乳动物细胞的生长，并给予表达新霉素磷酸转移酶基因的细胞生长优势。
特别优选的为相对应的方法，其使用于本申请案中更详细说明的修饰NPT基因，特别是若使用的修饰NPT基因编码修饰的NPT，其与野生型基因比较，于氨基酸位置91编码丙氨酸，于氨基酸位置182编码甘氨酸或天冬氨酸，于氨基酸位置198编码甘氨酸，于氨基酸位置227编码丙氨酸、甘氨酸或缬氨酸，于氨基酸位置261编码甘氨酸或天冬酰胺或于氨基酸位置240编码异亮氨酸。再更优选的是NPT基因，其与野生型基因比较，于氨基酸位置227编码缬氨酸和/或于氨基酸位置261编码甘氨酸和/或天冬酰胺。特别优选的是彼等NPT基因，其与野生型基因比较，编码异亮氨酸于氨基酸位置240或编码缬氨酸于氨基酸位置227，而与野生型基因比较编码缬氨酸于氨基酸位置227的NPT基因为特别优选。自然地，本发明也包括修饰的NPT基因及利用根据本发明的修饰NPT基因，其包含相对应氨基酸交换的组合。
本发明进一步关于真核表达载体，其含有(i)一功能上连接至异源启动子的异源目的基因及(ii)根据本发明的修饰新霉素磷酸转移酶基因其编码具有比野生型新霉素磷酸转移酶较低的酶活性的新霉素磷酸转移酶。为本发明目的的“低”或“较低”酶活性意指酶活性其相当于最多80％，优选1至80％，更优选仅1至60％的wtNPT酶活性。根据本发明的一个具体实施例，“较低酶活性”代表与野生型新霉素磷酸转移酶相比的1至30％，优选1.5至26％的酶活性。
优选表达载体含有修饰的NPT基因，其编码具有仅1至80％，优选仅1至60％的wtNPT酶活性的修饰NPT。也为优选的是具有修饰NPT基因的表达载体，其编码具有仅1至30％的wtNPT酶活性的突变体。特别优选的是含有修饰NPT基因的表达载体，其编码具有仅1.5至26％的wtNPT酶活性的突变体，活性由于实施例4中并称为方法5的点分析决定说明。
于本发明的另一具体实施例中，表达载体含有修饰NPT的基因，与wtNPT比较，其于氨基酸位置Trp91、Glu182、Val198、Asp227、Phe240或于位置Asp261被修改。于本文中，NPT突变体优选修饰于位置Trp91、Glu182、Val198、Asp227、Phe240或Asp261且具有仅1至80％，优选仅1至60％，更优选仅1.5至30％，特别优选仅1.5％至26％的wtNPT酶活性。优选的是可将氨基酸Trp91、Glu182或Asp227各以甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸或酪氨酸于相对应的位置取代。优选的是也可将于位置182的谷氨酸以天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或另一优选带负电荷的氨基酸取代。也为优选的是修饰的NPT基因，其与wtNPT比较于氨基酸位置198编码甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸。此外，修饰的NPT基因优选与wtNPT比较于氨基酸位置240编码甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、酪氨酸或色氨酸。也为优选的是修饰的NPT基因，其与wtNPT比较于氨基酸261编码甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或天冬氨酸特别优选使用突变体，其中将于位置227的天冬氨酸以甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸取代，于位置261的天冬氨酸以丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或谷氨酰胺取代，特别是由甘氨酸或天冬酰胺取代。
特别优选的是含有修饰NPT基因的表达载体，其编码Glu182Gly、Glu182Asp、Trp91Ala、Val198Gly、Asp227Ala、Asp227Val、Asp227Gly、Asp261Gly、Asp261Asn或Phe240Ile突变体，其于Glu182Gly突变体的情况中含有氨基酸序列SEQ ID NO：4，于Glu182Asp突变体的情况中含有氨基酸序列SEQ ID NO：20，于Trp91Ala突变体的情况中含有氨基酸序列SEQ IDNO：6，于Val198Gly突变体的情况中含有氨基酸序列SEQ ID NO：8，于Asp227Ala突变体的情况中含有氨基酸序列SEQ ID NO：10，于Asp227Val突变体的情况中含有氨基酸序列SEQ ID NO：12，于Asp227Gly突变体的情况中含有氨基酸序列SEQ ID NO：22，于Asp261Gly突变体的情况中含有氨基酸序列SEQ ID NO：14，于Asp261Asn突变体的情况中含有氨基酸序列SEQ ID NO：16及于Phe240Ile突变体的情况中含有氨基酸序列SEQ IDNO：18。最优选的是利用Asp227Val、Asp227Gly、Asp261Gly、Asp261Asn、Phe240Ile或Trp91Ala突变体的表达载体，特别是若其含有示于SEQ IDNO：12、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：6的氨基酸序列或若其以示于SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：5的核酸序列编码或含有这些序列。
此外，本发明第一次提供修饰的新霉素磷酸转移酶基因及其基因产物，其与wtNPT比较于氨基酸位置Trp91、Val198或Phe240编码不同氨基酸。本发明特别第一次提供Trp91、Val198或Phe240突变体，其具有与wtNPT比较降低的酶活性。说明于此及于本发明范围内可制作获得的修饰NPT优选于氨基酸位置91编码丙氨酸，于位置198编码甘氨酸及于位置240编码异亮氨酸。再者，本发明第一次提供NPT突变体，其与wtNPT比较，于位置182编码甘氨酸，于位置227编码丙氨酸或缬氨酸及于位置261编码甘氨酸。基因及基因产物(酶)两者皆第一次于本发明范围内提供。于本文中，本发明第一次提供修饰的NPT具有氨基酸序列根据SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14及SEQID NO：18。再者，本发明提供修饰的NPT基因具有DNA序列根据SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：13及SEQ ID NO：17。
目的基因
在根据本发明的表达载体中所含有的目的基因，包括编码目的产物的任何长度的核苷酸序列。基因产物或“目的产物”通常是蛋白质、多肽、肽或其片段或衍生物。然而，它亦可以是RNA或反义RNA。目的基因可以其全长、缩短的形式，作为融合基因或被标示的基因存在。它可以是基因组DNA，或优选是cDNA或相应的片段或融合。目的基因可以是天然的基因序列，或可以是突变或以其它方式修饰的。这类修饰包括适应确定的宿主细胞的密码子最优化和人源化作用。目的基因，可编码分泌性、细胞质的、位在核中、与膜结合或与细胞表面结合的多肽。
“核苷酸序列”或“核酸序列”一词代表寡核苷酸、核苷酸、多核苷酸及其片段，以及基因组或合成来源的DNA或RNA，其以单或双链存在，并可代表基因的编码或非编码链。可使用标准技术，如位置特异的突变生成或PCR介导的突变生成作用(例如在Sambrook等人，1989或Ausubel等人，1994中描述的)，来修饰核酸序列。
“编码”意指在核酸中特定序列的核苷酸的特性或性能，例如在染色体或mRNA中的基因，在生物过程中作为基质，用来合成其他的聚合物和大分子，例如rRNA、tRNA、mRNA、其他的RNA分子、cDNA或多肽。因此，若藉着mRNA的转录和后续的翻译，在细胞或其他生物系统中生产所需的蛋白质，则基因编码蛋白质。可将其核苷酸序列与mRNA序列相同，且正常亦在序列数据库，例如EMBL或GenBank中提供的编码链，还有作为转录基质的基因非编码链或cDNA两者，称为用来编码产物或蛋白质。编码蛋白质的核酸，亦包括以简并遗传密码为基础，具有不同核苷酸序列顺序，但结果产生蛋白质的相同氨基酸序列的核酸。编码蛋白质的核酸序列亦可含有内含子。
“cDNA”一词代表脱氧核糖核酸，藉着逆转录，并由基因产生的mRNA或其他RNA合成第二DNA链来制备。若cDNA以双链DNA分子的形式出现，其含有编码和非编码链两者。
“内含子”一词代表任何长度的非编码核苷酸序列。它们天然出现在许多真核生物基因中，并藉着称为拼接的过程，从先前转录的mRNA前体中移除。这需要在5′和3′端精确地切掉内含子，并正确地连接所得的mRNA末端，而得以产生成熟加工的mRNA，具有可供成功地合成蛋白质的正确的阅读框架。许多涉及该拼接过程的拼接供体和拼接受体位置，即直接位在外显子-内含子或内含子-外显子邻接处的序列，已经被表征。关于总论，参见Ohshima等人，1987。
目的蛋白质
具有生物药学重要性的蛋白质/多肽，包括例如抗体、酶、细胞因子、淋巴因子、粘附分子、受体及其衍生物或片段，但不限于此。通常，所有作为激动剂或拮抗剂，并/或具有治疗或诊断用途的多肽均是有价值的。
“多肽”一词用于氨基酸序列或蛋白质，并意指任何长度的氨基酸的聚合物。该词亦包括在翻译后，藉着像糖基化作用、磷酸化作用、乙酰化作用或蛋白质加工的反应修饰的蛋白质。可藉着例如取代、缺失或插入氨基酸，以及与其他蛋白质融合，同时仍保留其生物活性，来修饰多肽的结构。用词“多肽”因此也包括，例如，由免疫球蛋白成分，如Fc部分，及生长因子，如白介素组成的融合蛋白质。
治疗性蛋白质的实例为胰岛素、胰岛素样生长因子、人生长激素(hGH)和其他生长因子、组织纤溶酶原激活物(tPA)、红细胞生成素(EPO)、细胞因子，例如介白素(IL)，如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18，干扰素(IFN)-α、-β、-γ、-ω或-τ、肿瘤坏死因子(TNF)，如TNF-α、β或-γ、TRAIL、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、MCP-1和VEGF。其他的实例为单克隆、多克隆、多特异性和单链抗体，及其片段，像是例如Fab、Fab′、F(ab′)2、Fc和Fc′片段、轻(L)和重(H)免疫球蛋白链，及其恒定、可变或高变区，以及Fv和Fd片段(Chamov等人，1999)。该抗体可以是人类或非人类来源的。人源化和嵌合型抗体亦是可能的。
Fab片段(抗原结合片段＝Fab)由两个链的可变区组成，其藉着相邻的恒定区维持在一起。它们例如可藉着以蛋白酶处理，如木瓜蛋白酶，从传统的抗体中或藉着DNA克隆产生。其他抗体片段为F(ab′)2片段，其可藉着利用胃蛋白酶的蛋白水解消化产生。
亦可能藉着基因克隆，制备截短的抗体片段，其仅由重(VH)和轻链(VL)的可变区组成。其被称为Fv片段(可变片段＝可变部分的片段)。因为在这些Fv片段中，不可能经由恒定链的半胱氨酸基团共价结合，通常藉着一些其他的方法使Fv片段稳定。为了该目的，通常藉着大约10至30个氨基酸，特别优选是15个氨基酸的短肽片段，将重和轻链的可变区连接在一起。这产生其中VH和VL藉着肽接头连接在一起的单多肽链。亦将这类抗体片段称为单链Fv片段(scFv)。scFv抗体的实例是已知并已被描述的，参照，例如Huston等人，1988。
近年来，已经发展出各种生产多聚体scFv衍生物的策略。意图是生产具有改良的药物动力学特性，并增加结合的抗体亲抗原性的重组抗体。为了达到scFv片段的多聚化作用(Multimerisierung)，可以带有多聚化结构域的融合蛋白质的形式生产它们。多聚作用结构域可以是例如IgG的CH3区或螺旋结构(“卷曲螺旋结构”)，如亮氨酸-拉链结构域。在另一策略中，使用在scFv片段的VH和VL区之间的交互作用来进行多聚化作用(例如微型双功能抗体(diabodies)、微型三功能抗体(tribodies)和微型五功能抗体(pentabodies))。
本领域技术人员使用“微型双功能抗体”一词，代表二价的同型二聚体scFv衍生物。在scFv分子中将肽接头缩短至5-10个氨基酸，结果藉着使VH/VL链重叠，形成同型二聚体。还可藉着插入二硫桥，使微型双功能抗体更稳定。可在例如Perisic等人，1994的文献中找到微型双功能抗体的实例。
本领域技术人员使用“微抗体”(minibody)，代表二价的同型二聚体scFv衍生物。它由融合蛋白质组成，其含有作为二聚化作用区的免疫球蛋白，优选的是IgG，特别优选是IgGl的CH3区。这藉着亦属于IgG的铰链区，和接头区与scFv片段连接。由Hu等人，1996描述了这类微抗体的实例。
本领域技术人员使用“微型三功能抗体”，代表三价的同型三聚体scFv衍生物(Kortt等人，1997)。VH-VL的直接融合不需使用接头序列，导致三聚体的形成。
本领域技术人员称为小抗体(mini antibody)的片段，其具有二-、三-或四价的结构，亦为scFv片段的衍生物。藉着二-、三-或四聚体的“卷曲螺旋”结构，达成多聚化作用(Pack等人，1993和1995；Lovejoy等人，1993)。
编码荧光蛋白质的基因
于另一具体实施例中，根据本发明的表达载体含有编码萤光蛋白质的基因，优选的是功能上连接至目的基因。优选的是，将二基因皆于单一异源启动子的控制下转录，使得目的蛋白质/产物及萤光蛋白质由双顺反子mRNA编码。此使得可以藉由萤光蛋白质的表达率鉴定产生大量目的蛋白质/产物的细胞。
荧光蛋白质可以是例如绿、蓝绿色、蓝色、黄色或其他颜色的荧光蛋白质。一个特定的实例为获自维多利亚水母或肾形水母(Renilla reniformis)的绿色荧光蛋白(GFP)，以及从其中发展出的突变体，参见例如Bennet等人，1998；Chalfie等人，1994；WO 0I/04306及其中提及的文献。
在WO 00/34318、WO 00/34326、WO 00/34526和WO 01/27150中描述了其他的荧光蛋白质和编码它们的基因，以引用的方式并入本文中。这些荧光蛋白质是物种珊瑚纲(Anthozoa)，例如马哈诺珊瑚(Anemonia majano)、羽珊瑚(Clavularia sp.)、钮扣珊瑚(Zoanthus sp.)I、钮扣珊瑚II、海葵(Discosomastriata)、香菇珊瑚(Discosoma sp.)“红色”、香菇珊瑚“绿色”、香菇珊瑚“紫红色”、皱摺海葵(Anemonia sulcata)的非生物发光生物体的荧光团。
除了野外型蛋白质之外，根据本发明使用的荧光蛋白质亦包含天然或以遗传技术制备的突变体和变体、其片段、衍生物或已经例如与其他的蛋白质或肽融合的变体。所使用的突变，例如可改变该蛋白质的激发或发射光谱、发色团的形成、消光系数或稳定性。此外，可藉着密码子最优化作用，改善在哺乳动物或其他物种中的表达。根据本发明，亦可使用与可选择标记融合的荧光蛋白质，优选的是可扩增的选择标记，如二氢叶酸还原酶(DHFR)。
荧光蛋白质放出的荧光使得以检测到该蛋白质，例如藉着具有荧光激活细胞分拣器(FACS)的流式细胞计或藉着荧光显微镜。
其他调节元件
表达载体含有至少一个异源启动子，其允许目的基因及优选萤光蛋白质的基因表达。
“启动子”一词代表多核苷酸序列，其容许并控制在功能上与其连接的基因或序列的转录。启动子含有为RNA聚合酶结合提供的识别序列，以及转录的起始位置(转录起始位置)。为了在某些细胞类型或宿主细胞中表达想要的序列，必须选择适当的功能性启动子。本领域技术人员熟悉得自各种来源的各种启动子，包括在组成型的、可诱导的和可阻抑的启动子。它们被保藏在数据库中，例如GenBank，并可以个别的元件，或克隆到得自商业或工业来源的多核苷酸序列内的元件的形式获得。在可诱导的启动子中，可对信号作出反应而降低或增加启动子的活性。一个可诱导的启动子的实例，是四环素(tet)启动子。该启动子含有四环素操纵子序列(tetO)，可藉着四环素-调节的反式激活蛋白质(tTA)诱导它。当出现四环素时，抑制了tTA与tetO的结合。其他可诱导的启动子的实例为jun、fos、金属硫蛋白和热休克启动子(亦参见Sambrook等人，1989；Gossen等人，1994)。特别适合在真核生物中高度表达的启动子，例如有SV40早期启动子、腺病毒主要晚期启动子、小鼠金属硫蛋白-I启动子、劳斯肉瘤病毒的长末端重复区和人类巨细胞病毒的早期启动子。其他异源哺乳动物启动子的实例，是肌动蛋白、免疫球蛋白或热休克子。
特别适合在真核生物中高度表达的启动子，例如有SV40早期启动子、腺病毒主要晚期启动子、小鼠金属硫蛋白-I启动子、劳斯肉瘤病毒的长末端重复区和人类巨细胞病毒的早期启动子。其他异源哺乳动物启动子的实例，是肌动蛋白、免疫球蛋白或热休克启动子。
可将相对应的异源启动子功能上连接至其他调控序列以便增加/调控表达盒中的转录活性。
例如，可在功能上将启动子与增强子序列连接，以便增加转录活性。为了这个，可使用一或多个增强子和/或增强子序列的数个拷贝，例如CMV或SV40增强子。于是，于另一具体实施例中，根据本发明的表达载体含有一或多个增强子/增强子序列，优选为CMV或SV40增强子。
“增强子”一词代表多核苷酸序列，其以顺式位置作用在启动子的活性上，并因此刺激在功能上与该启动子连结的基因的转录。不像启动子，增强子的影响与位置和方位无关，并因此可将它们放在转录单位之前或之后，在内含子内，或甚至是在编码区内。增强子可紧邻转录单位，并离启动子一段相当远的距离。亦可能与启动子有物理及功能上的重叠。本领域技术人员知晓得自各种来源的许多增强子(并保藏在数据库中，如GenBank，例如SV40增强子、CMV增强子、多瘤病毒增强子、腺病毒增强子)，可以独立元件或克隆到多核苷酸序列内的元件的形式获得(例如保藏在ATCC，获得自商业和工业来源)。许多启动子序列亦含有增强子序列，如经常使用的CMV启动子。人CMV增强子是迄今鉴定的最强的增强子之一。一个可诱导的增强子的实例为金属硫蛋白增强子，可藉着糖皮质激素或重金属刺激之。
其他可能的修饰是，例如多个Spl结合位置的导入。启动子序列亦可与调节序列联合，所述调节序列容许转录活性的控制/调节。因此，可将启动子制成可阻抑的/可诱导的。例如，可藉着将其与正-或负调节的转录因子的结合位置的序列连接，来进行的。上文提及的转录因子Spl，例如对转录活性具有正面的影响。另一个实例为激活蛋白AP-1的结合位置，其可正面和负面地作用在转录上。可藉着许多种类的因子来控制AP-1的活性，例如生长因子、细胞因子和血清(Faisst等人，1992及其中的参考文献)。亦可藉看经由一、二、三或更多个碱基的突变(取代、插入或缺失)，改变启动子序列，来增加转录效率，然后在报告基因测定中判定，这是否增加了启动子活性。
基本上，额外的调节元件包括仓鼠-泛素/S27a启动子以外的启动子、增强子、中止和聚腺苷酸化信号，以及其他的表达控制元件。对各种细胞类型来说已知可诱导和在组成型调节序列。
“转录调节元件”通常包括在待表达的基因序列上游的启动子、转录起始和中止位置，以及聚腺苷酸化信号。
“转录起始位置”一词意指在构建体中的核酸，其相当于与被掺入主要转录物，即mRNA前体的第一个核酸。转录起始位置可与启动子序列重叠。
“转录中止位置”一词意指正常在目的基因或待转录的基因段的3′端的核苷酸序列，且其引起RNA聚合酶的转录的中止。
“聚腺苷酸化信号”是一信号序列，在真核生物mRNA的3′端的特定位置，引起切开，并在转录后在被切开的3′端掺入大约100-200个腺嘌呤核苷酸(聚腺苷酸尾)。聚腺苷酸化信号包括在切开位置的大约10-30个核苷酸上游的序列AATAAA，以及位在下游的序列。已知各种聚腺苷酸化元件，如tk聚腺苷酸、SV40晚期和早期聚腺苷酸或BGH聚腺苷酸(在例如US5,122,458中描述)。
在本发明的一个优选具体实施例中，每个转录单位均具有启动子或启动子/增强子元件、目的基因和/或标记基因，以及转录中止元件。在另一个优选的具体实施例中，转录单位还含有翻译调节单位。
“翻译调节元件”对于每个待表达的多肽而言，包括翻译起始位置(AUG)、中止密码和聚腺苷酸信号。对于最佳表达，移除、添加或改变待表达的核酸序列的5′-和/或3′-非翻译区，可能是明智的，以便排除任何可能不适当的额外翻译起始密码，或其他可能影响转录或表达水平的表达的序列。为了促进表达，可将核糖体共有结合位置另行插入紧接在起始密码子的上游。为了产生分泌性多肽，通常目的基因含有信号序列，其编码信号前体肽，将已经合成的多肽运送至并通过ER膜。信号序列通常，但并非总是位在分泌性蛋白的氨基终端，并可在已经将该蛋白质插入ER膜之后，藉着信号肽酶切开。基因序列通常但不一定含有它自己的信号序列。若天然的信号序列并未出现，则可以已知的方式，导入异源的信号序列。本领域技术人员知道该种类的许多信号序列，并保藏在序列数据库中，如GenBank和EMBL。
根据本发明一个特别重要的调节元件，是内部核糖体进入位点(IRES)。IRES元件包括不依赖基因上游5′-末端甲基乌嘌呤核苷？(guanosinium)帽(CAP结构)的在功能上激活翻译起始的序列，并在动物细胞中容许从单一转录物中翻译两个顺反子(开放阅读框架)。该IRES元件为紧接在下游的开放阅读框架的翻译，提供了独立的核糖体进入位置。与细菌的mRNA相反，其可以是多顺反子的，即它可编码更多不同的多肽或产物，藉着mRNA一个接一个翻译，大多数得自动物细胞的mRNA是单顺反子的，并仅编码一个蛋白质或产物。在真核生物细胞中的多顺反子转录物的情况中，翻译将从上游最接近的翻译起始位置开始，并将由第一个中止密码子中止，随后将从核糖体中释放出转录物。因此，在翻译期间将仅产生由mRNA编码的第一个多肽或产物。相反的，具有IRES元件的多顺反子转录物，该IRES在功能上与在转录物中第二个或后续的开放阅读框架连接，容许位在其下游的开放阅读框架编阅架构的后续翻译，而得以在真核生物细胞中，产生二或多个由相同转录物编码的多肽或产物。
IRES元件可具有各种长度和各种来源，并可起源自例如脑心肌炎病毒(EMCV)或其他小核糖核酸病毒。在文献中描述了各种IRES序列及其在建构载体上的用途，参见例如Pelletier等人，1988；Jang等人，1989；Davies等人，1992；Adam等人，1991；Morgan等人，1992；Sugimoto等人，1994；Ramesh等人，1996；Mosser等人，1997。
位在下游的基因序列在功能上与IRES元件的3′端连接，即选择间隔距离，以致于不影响或仅稍微影响基因的表达，或为了想要的目的而有充分的表达。可藉着简单的实验，藉着改变间隔，并使用报告基因测定，作为间隔的函数判定表达速率，来判定在IRES元件和位在其下游的基因的起始密码子之间，可供充分表达的最佳许可距离。
藉着所述的测量，有可能获得最佳表达盒，其对于异源基因产物表达相当有价值。因此，藉着一或多个这类测量所获得的表达盒，同样是本发明更进一步的目标。
仓鼠-泛素/S27a启动子
于另一具体实施例中，根据本发明的表达载体含有仓鼠的泛素/S27a启动子，优选的是功能上连接至目的基因，更优选的是功能上连接至目的基因及编码萤光蛋白质的基因。
仓鼠的泛素/S27a启动子是强有力的同源启动子，在WO 97/15664中描述。这类启动子具有优选至少下列的特征之一：富含GC的序列区、Spl结合位置、聚嘧啶元件、缺乏TATA盒子。特别优选的是具有Spl结合位置但缺乏TATA盒子的启动子。此外优选的组成型激活的启动子，且特别是在含有血清、低血清和不含血清培养条件下同样地具有活性的启动子。在另一个具体实施例中，它是可诱导的启动子，特别是由移除血清而激活的启动子。
特别有利的实施方式是具有在WO 97/15664的图5中所含有的核苷酸序列的启动子。特别优选的在此是含有得自图5的位置-161至-45的序列的启动子。
在本发明说明书的实例中使用的启动子，分别含有具有从附录的序列表的SEQ ID NO：55的位置1923至2406的序列的DNA分子。该序列相当于得自WO 97/15664的图5的片段-372至+111，并代表优选的启动子，即优选启动子应包括这一序列区。另一适当的启动子片段含有位置2134至2406的序列(相当于WO 97/15664的图5中的-161至+111)。仅含有位置2251至2406的序列的启动子不再具有功能(相当于WO 97/15664的图5中位置-45至+111)。有可能在5′方向从位置2143开始延长启动子序列。
亦可能使用完整仓鼠泛素/S27a启动子序列的功能亚片段，以及完整序列或其亚片段的功能性突变体变体，其藉着例如取代、插入或删除而加以修饰。在后文中亦将相应的亚片段、突变体或变体称为“经过修饰的启动子”。
经过修饰的启动子，所述启动子优选与其他调节元件组合，优选具有转录活性，其相应于在SEQ ID NO：55中提供的核苷酸序列位置1923至2406的启动子片段WO 97/15664的图5的-372至+111)。经过修改的启动子被发现在本发明的意义上是有用的，若其在比较性报告基因测定中具有转录活性，该活性为1923至2406片段(-372至+111片段)的至少50％，优选的是至少80％，更佳的是至少90％，而更优选的是至少100％。特别优选的是经过修饰的启动子，其对仓鼠泛素/S27a启动子的野生型序列SEQ ID NO：1具有至少80％，优选的是至少85％，优选的是至少90％，再优选的是至少95％，而特别优选的是至少97％的最低序列同源性，并在比较性报告基因测定中具有相应的启动子活性。
在相对应的比较性报告基因测定中，欲测试的启动子片段包括克隆到各自位于无启动子的报告基因之前的参考序列，该报告基因编码例如虫荧光素酶、分泌性碱性磷酸酶或绿色荧光蛋白质(GFP)。随后藉着转染，将这一构建体(启动子序列+报告基因)导入受试细胞，例如CHO-DG44内，并藉着测量报告基因的蛋白质内含量，判定由各自的启动子片段诱导的报告基因表达。在例如Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，1994，更新版中示例性的也有相应的测试。
仓鼠泛素/S27a启动子的启动子序列和经过修饰的启动子，其亦可包括例如5′非翻译区或其从中选出的片段，以及泛素/S27a基因或其选出的片段的编码区，可由本领域技术人员从对WO 97/15664中描述的序列的认识中使用例如在Sambrook等人，1989；Ausubel等人，1994中描述的各种标准方法获得。例如，可从在WO 97/15664中描述的序列开始，选择适当的片段，并以化学方式合成含有该片段的序列的寡核苷酸探针。例如，可使用这类探针，例如藉着杂交作用从仓鼠基因组文库中克隆泛素/S27a基因或其5′非翻译区或其他片段。使用上述的报告基因测定，本领域技术人员不需费很大力气便可鉴定具有启动子活性的片段，并用于本发明的目的。可藉着PCR扩增利用得自基因组DNA或基因组文库的相应引物，轻易地获得5′非翻译区或其特异性片段。亦可藉着限制性核酸外切酶III消化，从较大的DNA片段中获得5′非翻译区的片段。亦可以化学方式合成这类DNA分子，或藉着连接从以化学方式合成的片段中生产。
可藉着“位置特异的突变生成作用”和/或“以PCR为基础的突变生成技术”，生产缺失、插入和取代突变体。在例如Lottspeich和Zorbas 1998第36.1章中以及进一步的参考文件中提及相当的方法。
藉着利用得自仓鼠泛素/S27a基因的5′非翻译区或得自仓鼠泛素/S27a基因的S27a部分或3’非翻译区域的探针的交又一杂交作用，亦可能从其他，优选是哺乳动物的相应的同源基因中，鉴定和分离适当的启动子序列。在例如Lottspeich和Zorbas 1998第23章中描述了相应的技术。为了本发明的目的，“同源性”为这样的基因，若基因的核苷酸序列对与该基因的核苷酸序列显露出至少70％，优选的是至少80％，优选的是至少90％，再优选的是至少95％，且特别优选的是至少97％的一致性，则该基因是“同源的”。
藉由说明的方法能得到最佳表达盒，其有表达异源基因产物的高度价值。所以藉由一或多种此方法得到的表达盒同样为本发明的主题。
根据本发明的表达载体的制备
原则上，可藉着本领域技术人员常用的传统方法，例如由Sambrook等人(1989)描述的，来制备根据本发明的表达载体。其中亦描述载体的功能性组分，例如适当的启动子(除了仓鼠泛素/S27a启动子之外)、增强子、中止和聚腺苷酸化信号、抗生素抗性基因、选择标记、复制起点和拼接信号。可使用传统的克隆载体来制备它们，例如质粒、噬菌体、噬菌粒、粘粒或病毒载体，如杆状病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒和单纯疱疹病毒，以及人造的染色体/小染色体。真核生物的表达载体，通常亦含有原核生物序列，例如复制起点和抗生素抗性基因，其容许载体在细菌中复制和选择。已知许多含有用来导入多核苷酸序列的多克隆位置的真核生物表达载体，且有些可购自各种公司，如Stratagene，La Jolla，CA，USA；Invitrogen，Carlsbad，CA，USA；Promega，Madison，WI，USA或BD Biosciences Clontech，Palo Alto，CA，USA。
以本领域技术人员熟悉的方式之一，将仓鼠-泛素/S27a启动子、目的基因、编码荧光蛋白质的基因，优选还有可扩增的选择标记基因，例如二氢叶酸还原酶，以及任选额外的调节元件，如内部核糖体进入位点(IRES)、增强子或聚腺苷酸化信号，导入表达载体内。根据本发明的表达载体至少含有异源启动子、目的基因及修饰的新霉素磷酸转移酶基因。优选的是，表达载体也含有编码萤光蛋白质的基因。根据本发明特别优选使用泛素/S27a启动子作为异源启动子。特别优选的表达载体为将异源启动子(优选为泛素/S27a启动子)、目的基因及编码萤光蛋白质的基因功能上连在一起或功能上连接且新霉素磷酸转移酶基因位于相同或分开的转录单位中。
在本说明的范围内，“功能性连接”或“在功能上连接”一词意指二或多个核酸序列或部分序列，安置它们使其得以执行其想要的功能。例如，若启动子/增强子能够以顺向的位置，控制或调节已连接的基因序列的转录，则其在功能上与编码基因序列连接。通常，但不一定，在功能上连接的DNA序列紧靠在一起，且若连接两个编码基因序列，或在分泌信号序列的情形中，是在相同的阅读框架中。虽然在功能上连接的启动子通常是位在编码基因序列的上游，但不一定必须与其靠近。增强子同样不必紧密靠近，只要其有利于基因序列的转录。为了该目的，它们可在基因序列的上游和下游，任选离它一段距离。聚腺苷酸化作用位置在功能上与基因序列连接，若将它安置在基因序列的3′端，使得经由编码序列至聚腺苷酸化信号进行转录。可根据传统的重组方法进行连接，例如藉着PCR技术、藉着在适当限制性切割位置处的连接，或藉着拼接。若没有可利用的适当切割位置，则可以已知的方式，使用合成的寡核苷酸接头或接合体。根据本发明，最好不经由内含子序列进行在功能上的连接。
于说明的一个具体实施例中，将异源启动子(优选为泛素/S27a启动子)、目的基因及编码萤光蛋白质的基因功能上连在一起。此意指例如将目的基因及编码萤光蛋白质的基因自相同异源启动子开始表达。在一个特别优选的具体实施例中，经由IRES元件进行该功能上的连接，而得以从两个基因合成双顺反子mRNA。根据本发明的表达载体，可额外地含有增强子元件，其在功能上对一或多个启动子发挥作用。特别优选的是其中将泛素/S27a启动子或其修饰形式与增强子元件，例如SV40增强子或CMV增强子元件连接的表达载体。
基本上，在表达载体内的基因的表达，可从一或多个转录单位开始进行。将转录单位定义为含有一或多个待转录的基因的区域。在转录单位内的基因，在功能上彼此连接，使得所有在这类单位中的基因，均在相同启动子或启动子/增强子的转录控制之下。该基因的转录连接的结果，是可从一个转录单位中转录一种以上的蛋白质或产物，并藉此表达之。每个转录单位在此可含有对其中所含有的基因序列的转录和翻译所必需的调节元件。每个转录单位可含有相同或不同的调节元件。可使用IRES元件或内含子进行在转录单位中的基因的功能连接。
表达载体可含有用来表达目的基因、修饰的NPT基因及任选的编码荧光蛋白质的基因的单一转录单位。或者，亦可将这些基因排列在二或多个转录单位中。在此，在转录单位中基因的各种组合均是可能的。在本发明的另一个具体实施例中，可藉着共转染，或在按照任何顺序的连续转染中，将一个以上，由一、二或多个转录单位组成的表达载体引入宿主细胞内。可选择在每个载体上调节元件和基因的任何组合，只要确保转录单位的充分表达。若需要，可将其他的调节元件和基因，例如额外的目的基因或选择标记，安置在表达载体上。
因此，根据本发明的表达载体可在一个或在两个分开的转录单位中，含有编码目的基因和编码修饰的新霉素磷酸转移酶的基因。每个转录单位可转录并表达一或多个基因产物。若在一个转录单位上含有两个基因，其在相同的启动子或启动子/增强子的控制之下，而优选是使用IRES来确保所有组份的功能连接。若编码荧光蛋白质的基因和可扩增的选择标记基因被包含在两个分开的转录单位中，则其可在相同或不同启动子/增强子的控制之下。然而，对于选择标记基因而言，优选是使用其天然或较弱的异源启动子，例如SV40早期启动子，且优选不使用增强子。在本发明的范围中，带有两个分开的转录单位的表达载体是优选的。一个(双顺反子)转录单位含有目的基因和编码荧光蛋白质的基因，而另一个转录单位则含有可扩增的选择标记基因。优选的是藉着编码聚腺苷酸信号，优选是tk聚腺苷酸、BGH聚腺苷酸或SV40聚腺苷酸的序列，在3′端对每个转录单位进行限制。
根据本发明，优选的还有那些用多克隆位置代替目的基因的载体，所述多克隆位置容许经由限制性核酸内切酶的识别序列，克隆目的基因。从现有技术中知道所有种类的限制性核酸内切酶的多种识别序列，以及所属的限制性核酸内切酶。最好是使用由至少六个核苷酸组成的作为识别序列的序列。可在例如Sambrook等人，1989中找到适当的识别序列的一览表。
宿主细胞
为了以根据本发明的表达载体转染，使用真核生物宿主细胞，优选是哺乳动物细胞，且更特定而言是啮齿动物细胞，如小鼠、大鼠和仓鼠细胞系。以根据本发明的表达载体转染相应的细胞，结果产生经过转化、在遗传上经过修饰、重组或转基因的细胞，其亦为本发明的目标。
在本发明的范围内优选的宿主细胞是仓鼠细胞，如BHK21、BHK TK-、CHO、CHO-K1、CHO-DUKX、CHO-DUKX B1和CHO-DG44细胞，或这些细胞系的衍生物/后代。特别优选的是CHO-DG44、CHO-DUKX、CHO-K1和BHK21细胞，特别是CHO-DG44和CHO-DUKX细胞。小鼠的骨髓瘤细胞也同样是适合的，优选的是NS0和Sp2/0细胞，以及这些细胞系的衍生物/后代。
在下列的表2中提供了可根据本发明来使用的仓鼠和小鼠细胞的实例。然而，亦可使用这些细胞的衍生物和后代、其他的哺乳动物细胞，包括但不限于人类、小鼠、大鼠、猿猴、啮齿动物的细胞株，或真核生物细胞，包括但不限于酵母、昆虫和植物细胞，作为生产生物药学蛋白质的宿主细胞。
表1：仓鼠和小鼠生产细胞系
  细胞系   保藏号
  NS0   ECASS第85110503号
  Sp2/0-Ag14   ATCC CRL-1581
  BHK21   ATCC CCL-10
  ECACC第85011423号
  HaK   ATCC CCL-15
  2254-62.2(BHK-21-衍生物)   ATCC CRL-8544
  CHO   ECACC第8505302号
  CHO-K1   ATCC CCL-61
  ATCC CRL-9096
  CHO-DUKX B1   ATCC CRL-9010
  CHO-DG44   Urlaub等人；Cell 33[2]，405-412，1983
  CHO Pro-5   ATCC CRL-1781
  V79   ATCC CCC-93
  B14AF28-G3   ATCC CCL-14
  CHL   ECACC第87111906号
藉着传统的方法(Sambrook等人，1989；Ausubel等人，1994)，进行以多核苷酸或根据本发明的表达载体之一转染真核生物宿主细胞的作用。转染的适当方法包括例如脂质粒介导的转染、磷酸钙共沉淀、电穿孔、聚阳离子(例如DEAE葡聚糖)介导的转染、原生质粒融合、显微注射和病毒感染。根据本发明，优选进行稳定的转染，其中将构建体整合到宿主细胞的基因组，或人造染色体/小染色体内，或以稳定的方式，以附加体的形式包含在宿主细胞内。提供最佳转染频率，并在各自的宿主细胞中的异源基因的表达的转染方法在此是优选的。按照定义，将被插入宿主细胞中的每个序列或每个基因称为相对于宿主细胞的“异源序列”或“异源基因”。即使欲导入的序列或欲导入的基因与该宿主细胞的内源序列或内源基因相同，亦适用。例如，被导入仓鼠宿主细胞中的仓鼠肌动蛋白基因，按照定义亦是异源的基因。
根据本发明，特别的是重组哺乳动物细胞，优选的是啮齿类动物细胞，特别优选的是仓鼠细胞如CHO或BHK细胞，以根据本发明说明于本文中的一种表达载体转染。
在异源二聚体蛋白质，例如单克隆抗体(单克隆抗体)的重组制备中，在原则上可藉着两种不同的方法，进行适当宿主细胞的转染。该种类的单克隆抗体′s由许多亚单位、重和轻链组成。可将编码这些亚单位的基因放置在在单一质粒上的独立的或多顺反子的转录单位中，然后用该质粒转染宿主细胞。这企图在整合至宿主细胞基因组内之后，确保基因的化学计算上的表达。然而，在独立转录单位的情况中，必须藉此确保编码不同蛋白质的mRNA展现出相同的稳定性，以及转录和翻译效率。在第二种情况中，藉着单一的启动子，进行多顺反子的转录单位中基因的表达，并仅形成一个转录物。藉着使用IRES元件，获得在第二和后续的顺反子中基因的正确有效内部翻译起始。然而，这些顺反子的表达速率比第一个顺反子的低，其藉着所谓的“帽”依赖的前起始复合物的翻译起始，实质上比IRES依赖的翻译起始更有效。为了达到顺反子真正等摩尔的表达，可例如导入额外的顺反子间元件，其与IRES元件一起导致均一的表达速率(WO 94/05785)。
其他并根据本发明优选的同时制备许多异源蛋白质的可能路径，是共转染，其中整合分别在不同的表达载体中的基因。这具有可互相调整基因和基因产物的某些比例的优点，藉此平衡在mRNA稳定性，以及在转录和翻译效率上的差异。此外，该表达载体因为它们的尺寸较小是较稳定的，且在克隆和转染上较容易操作。
因此，在本发明一个特殊的具体实施例中，额外地以一或多个具有编码一或多个其他目的蛋白质的基因的载体转染，优选是共转染宿主细胞。用来共转染的其他载体或多个载体，在相同的启动子/增强子组合的控制之下，编码例如其他目的蛋白质或多个蛋白质，以及至少一个其他的选择标记，例如二氢叶酸还原酶。
根据本发明，优选在不含血清的条件下建立适应和培养宿主细胞，任选在不含动物蛋白质/肽的培养基中培养。可购得的培养基的实例，包括Ham′s F12(Sigma，Deisenhofen，DE)、RPMI-1640(Sigma)、杜贝可氏(Dulbecco′s)经过改良的Eagle′s培养基(DMEM；Sigma)基本必需培养基(MEM；Sigma)、艾司可夫(Iscove′s)经过改良的杜贝可氏培养基(IMDM；Sigma)、CD-CHO(Invitrogen.Carlsbad，CA，USA)、CHO-S-SFMII(Invitrogen)、不含血清的CHO-培养基(Sigma)和不含蛋白质的CHO-培养基(Sigma)。任选以各种化合物补充这些培养基中的每一种，例如激素和/或其他的生长因子(例如胰岛素、铁传递蛋白、表皮生长因子、胰岛素样生长因子)、盐类(例如氯化钠、钙、镁、磷酸盐)、缓冲溶液(例如HEPES)、核苷(例如腺苷、胸苷)、谷氨酰胺、葡萄糖或其他等价的营养物、抗生素和/或微量元素。虽然根据本发明，不含血清的培养基是优选的，但亦可使用已经与适量血清混合的培养基来培养宿主细胞。为了选择表达一或多个选择标记基因的经过遗传修饰的细胞，将一或多个适当的选择剂加至该培养基中。
“选择剂”一词意指妨碍缺乏所讨论的选择标记基因的宿主细胞生长和存活的物质。于本发明范围内，优选使用geneticin(G418)作为培养基添加剂以选择携带修饰的新霉素磷酸转移酶基因的异源宿主细胞。优选的是，使用100及800微克/毫升的培养基之间的G418浓度，特别优选为300至400微克/毫升的培养基。若要将宿主细胞以许多表达载体转染，即若要分开地将几个目的基因导入宿主细胞中，其一般具有不同可选择标记基因。
“选择标记基因”是藉着在培养基中加入相应的选择剂，容许特异性地选择含有该基因的细胞的基因。更明白地说，抗生素抗性基因可作为正性的选择标记被使用。只有已经以该基因转化的细胞，才能够在相应的抗生素的存在下生长，并因此被选择。相反未经转化的细胞在这些选择条件下不能生长或存活。有正性、负性和双功能的选择标记。正性选择标记允许藉着相对于选择剂的抗性，或藉着补偿宿主细胞中的代谢或降解代谢缺陷，选择和富集经过转化的细胞。相反的，可藉着负性的选择标记，选择性地清除已经接受选择标记的基因的细胞。其实例为单纯疱疹病毒的胸苷激酶基因，其在细胞中的表达通过无环乌苷(acyclovir)和9-[1，3-二羟-2-丙氧甲基]乌嘌呤(gancyclovir)的同时加入，导致细胞的清除。在本发明中使用的可选择标记，包括可扩增的选择标记，包括以遗传方式修饰的突变体和变体、片段、功能等价物、衍生物、同系物，以及与其他蛋白质或肽的融合，只要该选择标记保留其选择特性。这类衍生物在氨基酸序列中，在视为有选择性的区域或结构域中展现出相当大的同源性。文献描述了许多选择标记基因，包括双功能的(正性/负性的)标记(参见，例如WO 92/08796和WO94/28143)。经常用在真核生物细胞中的选择标记的实例，包括氨基糖苷磷酸转移酶(APH)、潮霉素磷酸转移酶(HYG)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、胸苷激酶(TK)、谷氨酰胺合成酶、天冬酰胺合成酶的基因，以及介导对新霉素(G418)、嘌呤霉素、组氨醇D、博来霉素、腐草霉素和利欧辛(zeocin)的抗性的基因。
亦可能藉着荧光激活细胞分拣(FACS)来选择经过转化的细胞。关于此点，例如可使用细菌的β-半乳糖苷酶、细胞表面标记或荧光蛋白质(例如绿色荧光蛋白质(GFP)及其得自维多利亚水母和肾形水母或其他物种的变体、红荧光蛋白质和发其他颜色荧光的蛋白质，及其得自非生物发光生物(例如香菇珊瑚、皱摺海葵、羽珊瑚、钮扣珊瑚)的变体，来选择经过转化的细胞。
基因表达及选择高产宿主细胞
用词基因表达是关于宿主细胞中异源基因序列的转录和/或翻译。表达率一般可基于存在于宿主细胞中相对应mRNA量或基于由目的基因编码的基因产物的产生量而决定。由特定核苷酸序列转录而制备的mRNA量可由例如RNA印迹杂交法、核糖核酸酶-RNA保护法、细胞RNA的原位杂交或藉由PCR法决定(Sambrook等人，1989；Ausubel等人，1994)。由特定核苷酸序列编码的蛋白质也可由许多方法决定，如例如ELISA、蛋白质印迹法、放射线免疫分析法、免疫沉淀法、侦测蛋白质的生物活性或藉由免疫染色蛋白质随后进行FACS分析(Sambrook等人，1989；Ausubel等人，1994)。
用词“高表达水平(或率)”、“高表达”、“增加的表达”或“高生产率”意指导入宿主细胞中的异源序列(例如编码有疗效蛋白质的基因)的持久及充分高表达或合成。若将根据本发明的细胞藉根据本发明说明于此的方法之一培养，无基因扩增，且若此细胞产生至少多于每天大约0.5pg所需基因产物(0.5pg/细胞/天)，则呈现增加的或高表达或高表达水平(率)或高生产率。若根据本发明的细胞无先前基因扩增而产生至少多于每天大约1.0pg所需基因产物(1.0pg/细胞/天)，则也呈现增加的或高表达或高表达水平(率)或高生产率。特别是若根据本发明的细胞无先前基因扩增而产生至少多于每天大约1.5pg所需基因产物(1.5pg/细胞/天)，呈现增加的或高表达或高表达水平(率)或高生产率。特别是若根据本发明的细胞无先前基因扩增而产生至少多于每天大约2.0pg所需基因产物(2.0pg/细胞/天)，呈现增加的或高表达或高表达水平(率)或高生产率。若根据本发明的细胞无先前基因扩增而产生至少多于每天大约3.0pg所需基因产物(3.0pg/细胞/天)，则呈现特别增加的或高表达或特别高表达水平(率)或特别高生产率。藉由单一基因扩增步骤，如利用下文中所述的DHFR/MTX扩增系统，可将生产率增加至少2至10倍，所以使用用词“高表达”、“增加的表达”或“高生产率”提及已受到基因扩增步骤的细胞若此细胞产生至少多于每天大约5pg所需基因产物(5pg/细胞/天)，优选至少多于大约10pg/细胞/天，更优选至少多于大约15pg/细胞/天，再更优选至少多于大约20pg/细胞/天或至少多于大约30pg/细胞/天。
藉由利用根据本发明的表达载体之一及藉由利用根据本发明的方法之一两者可达到高或增加的表达、高生产率或高表达水平(率)。
例如，藉由共同表达目的基因及修饰的NPT基因，能够选择及鉴定表达异源基因至高程度的细胞。与wtNPT比较，修饰的NPT允许更有效的选择具有高表达异源目的基因的稳定转染的宿主细胞。
因此本发明亦关于表达至少一种目的基因于重组哺乳动物细胞中的方法，特征为(i)将一集合体哺乳动物细胞以至少一种目的基因及一种修饰的新霉素磷酸转移酶基因转染，其与野生型新霉素磷酸转移酶比较仅具有1至80％的活性，优选仅1至60％，更优选仅1.5至30％，特别优选仅1.5至26％；(ii)将细胞于允许表达目的基因及修饰的新霉素磷酸转移酶基因的条件下培养；(iii)将哺乳动物细胞于至少一种选择剂(优选为G418)存在下培养，其选择性作用于哺乳动物细胞的生长，并给予表达修饰的新霉素磷酸转移酶基因的细胞生长优势；及(iv)自哺乳动物细胞或自培养上清液得到目的蛋白质。优选的是使用曾经以根据本发明的表达载体转染的重组哺乳动物细胞。
本发明亦关于选择表达至少一种目的基因的重组哺乳动物细胞的方法，其中(i)将哺乳动物细胞集合体以至少一种目的基因及一种修饰的新霉素磷酸转移酶基因转染，其与野生型新霉素磷酸转移酶比较仅具有1至80％的活性，优选仅1至60％，更优选仅1.5至30％，特别优选仅1.5至26％；(ii)将哺乳动物细胞于允许表达目的基因及修饰的新霉素磷酸转移酶基因的条件下培养；(iii)将哺乳动物细胞于至少一种选择剂(优选为G418)存在下培养，其选择性作用于哺乳动物细胞的生长，并给予表达修饰的新霉素磷酸转移酶基因的细胞生长优势。
若使用本申请案中详述的修饰NPT基因，为特别优选的方法来表达至少一种目的基因及选择表达相对应目的基因的重组细胞，特别是若与野生型基因比较使用于氨基酸位置182编码甘氨酸或天冬氨酸，于氨基酸位置91编码丙氨酸，于氨基酸位置198编码甘氨酸，于氨基酸位置227编码丙氨酸、甘氨酸或缬氨酸，于氨基酸位置261编码甘氨酸或天冬酰胺或于氨基酸位置240编码异亮氨酸的修饰NPT基因。特别优选使用Asp227Val、Asp227Gly、Asp261Gly、Asp261Asn、Phe240Ile或Trp91Ala突变体。一般而言，根据本发明于本专利说明书中提到的所有修饰的新霉素磷酸转移酶基因皆适用于此方法中。对于优选的新霉素磷酸转移酶基因，见修饰的新霉素磷酸转移酶基因章节。
表达目的基因及修饰的NPT基因的细胞的选择是由例如加入G418作为选择剂而实施。然而，也能够利用其他氨基葡萄糖苷抗生素如新霉素或卡那霉素。优选将根据本发明的细胞于每毫升培养基有200至800微克G418中培养及选择。已证实特别优选每毫升培养基加入300至700微克G418。每毫升培养基加入大约400微克G418为最佳具体实施例。利用此方法能够选择具有特别高表达率的重组细胞。与利用wtNPT比较，在以每毫升培养基400微克G418选择作为可选择标记后，在Glu182Gly、Glu182Asp及Val198Gly突变体的情况中细胞显示生产率增加倍数为1.4-2.4倍，在Asp227Gly突变体的情况中倍数为1.6-4.1倍，在Asp227Ala或Trp91Ala突变体的情况中倍数为2.2或4倍，在Phe240Ile或Asp261Asn突变体的情况中倍数为5.7或7.3倍及甚至在Asp261Gly或Asp227Val突变体的情况中倍数为9.3或14.6倍。将不同修饰的NPT基因的特异性生产率示于图6中。
可将相对应的方法与FACS-辅助的选择重组宿主细胞结合，其含有一或多个萤光蛋白质(如GFP)或细胞表面标记作为另外的可选择标记。也可使用得到增加的表达的其他方法，及不同方法的组合，是基于例如利用(人造)转录因子、以天然或合成的药剂处理细胞以向上调节内源或异源基因表达、改善mRNA或蛋白质的稳定性(半衰期)、改善mRNA翻译的起始、藉由利用附加型质粒(基于利用病毒序列作为复制起点，如SV40、多瘤病毒、腺病毒、EBV或BPV)增加基因剂量、利用扩增促进序列(Hemann等人，1994)或基于DNA串联体的体外扩增系统(Monaco等人，1996)。
目的基因及编码萤光蛋白质的基因的耦合转录已证实特别有效于与利用修饰NPT基因作为可选择标记连结。形成的双顺反子mRNA表达目的蛋白质/产物及萤光蛋白质两者。基于表达目的基因及萤光蛋白质的此种耦合，藉由表达的萤光蛋白质，如藉由利用萤光激活的细胞分拣器(FACS)，挑选，可轻易地根据本发明鉴定及分离高产的重组宿主细胞。
呈现高生命力及所需基因产物的增加的表达水平的重组宿主细胞的选择为多重阶段的过程。例如，将已以根据本发明的表达载体转染或任选以其他载体共转染的宿主细胞于允许选择表达修饰的NPT的细胞的条件下培养，如藉由培养于如G418以浓度100、200、400、600、800微克或以上的G418/毫升培养基的选择剂存在下。而后将相对应的细胞研究至少编码萤光蛋白质且耦合至目的基因的基因的表达，以便鉴定及挑选展现萤光蛋白质最高表达率的细胞/细胞群体。优选的是，将属于萤光蛋白质最高表达率的10-20％细胞分出并进一步培养。实际上，此意指将萤光细胞最亮的10％分出并进一步培养。于是，也可将细胞混合物的萤光细胞最亮的5％，优选最亮的3％或甚至最亮的1％分出及复制。特佳具体实例中，仅分出最亮0.5％或最亮的0.1％萤光细胞并加以复制。
可将选择步骤实施于细胞集合体中或利用预先挑选的细胞集合体/细胞克隆。可实施一或多次，优选二或多次及特别是三或多次挑选步骤，而于单个挑选步骤之间可将细胞培养及复制一段特定时间，如在集合体的情况中大约二周。例如，图11及12显示突变体Asp227Gly有及无基因扩增步骤的以FACS为基础的挑选后的特异性生产率。
因此本发明是关于得到及选择表达至少一种异源目的基因的重组哺乳动物细胞的方法，特征为(i)将重组哺乳动物细胞以根据本发明的表达载体转染；(ii)将转染的细胞于允许表达目的基因、编码萤光蛋白质的基因及修饰的新霉素磷酸转移酶基因的条件下培养；(iii)将哺乳动物细胞于至少一种选择剂存在下培养，其选择性作用于哺乳动物细胞的生长，并给予表达修饰的新霉素磷酸转移酶基因的细胞生长优势；及(iv)将呈现特别高萤光基因表达的哺乳动物细胞藉流式细胞计分析挑选。视需要，可将步骤(iv)中得到的细胞以步骤(ii)至(iv)重复一次或数次。
一相对应方法为优选，其特征在于挑选的哺乳动物细胞具有平均特异性生产率(无额外基因扩增步骤)为大于每细胞每天0.5pg所需基因产物(0.5pg/细胞/天)，优选大于1Pg/细胞/天，特别优选选大于2pg/细胞/天，再优选大于3pg/细胞/天，再更优选大于4pg/细胞/天，例如大于5、6、7、8、9、10等、大于15、20、25pg/细胞/天等。如上述，此等细胞的生产率可由简单基因扩增步骤，如利用DHFR/MTX系统，而增加至少2至10倍。例如将此示于图12中以利用NTP突变体Asp227Gly选择。特异性生产率为20及25pg/细胞/天之间。
根据本发明也为优选的是一方法，其中将适当挑选的细胞复制及用来制备编码的目的基因产物。为此，优选将选定的高产细胞培养于无血清培养基中及优选于允许目的基因表达的条件下的悬浮培养中。优选目的蛋白质/产物是得自细胞培养基为分泌的基因产物。然而，若将蛋白质表达而无分泌信号，则也可将基因产物自细胞溶解物分离。为了得到大体上无其他重组蛋白质及宿主细胞蛋白质的纯的同质产物，实施传统纯化程序。首先，将细胞及细胞残骸自培养基或溶解物移除。而后可将所需基因产物去除污染的可溶蛋白质、多肽及核酸，如藉由在免疫亲和及离子交换柱、乙醇沉淀、反相HPLC或层析法于交联葡聚糖、硅胶或阳离子交换树脂如DEAE上分离。造成纯化由重组宿主细胞表达的异源蛋白质的方法为本领域技术人员已知且说明于文献中，如由Harr1s等人，1995及Scopes1998。
可扩增可选择的标记基因
此外，视情况也可将根据本发明的细胞经过一或多个基因扩增步骤，其中将其于导致可扩增可选择的标记基因扩增的选择剂存在下培养。可将此步骤于表达萤光蛋白质且优选曾以FACS预先挑选一次或数次(优选以说明于此的方式之一)的细胞及于未曾挑选的细胞两者中实施。
前提为将宿主细胞另外以编码可扩增可选择标记的基因转染。可以想见，编码可扩增可选择的标记的基因可存在于根据本发明的一个表达载体上或藉由其他载体而被导入宿主细胞。
可扩增的选择标记基因通常编码真核生物细胞在某些培养条件下生长所需的酶。例如，可扩增的选择标记基因可编码二氢叶酸还原酶(DHFR)。在该情况中，若在选择剂氨甲蝶呤(MTX)的存在下培养以其转染的宿主细胞，则扩增该基因。
下列的表2提供其他可根据本发明使用的可扩增的选择标记基因和相关选择剂的实例，并在Kaufman，“酶学方法”，185：537-566(1990)的综述中描述。
表2：可扩增的选择标记基因
可扩增的选择标记基因 保藏号码 选择剂
二氢叶酸还原酶 M19869(仓鼠)E00236(小鼠) 氨甲蝶呤(MTX)
金属硫蛋白 D10551(仓鼠)M13003(人类)M11794(大鼠) 镉
CAD(氨基甲酰磷酸合成酶：天冬氨酸转氨基甲酰酶：二氢乳清酸酶) M23652(仓鼠)D78586(人类) N-磷酸乙酰基-L-天冬氨酸
腺苷脱氨酶 K02567(人类)M10319(小鼠) Xyl-A-或腺苷，2′脱氧助间型霉素
AMP(腺苷酸)-脱氨酶 D12775(人类)J02811(大鼠) 腺嘌呤，重氮丝氨酸，助间型霉素
UMP-合成酶 J03626(人类) 6-氮尿苷，吡唑呋喃
IMP 5′-脱氢酶 J04209(仓鼠)J04208(人类)M33934(小鼠) 霉酚酸
黄嘌呤-乌嘌呤-磷酸核糖转移酶 X00221(大肠杆菌) 霉酚酸与有限的黄嘌呤
突变的HGPRT酶或突变的胸苷-激酶 J00060(仓鼠)M13542， 次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT)
K02581(人类)J00423，M68489(小鼠)M63983(大鼠)M36160(疱疹病毒)
胸苷酸-合成酶 D00596(人类)M13019(小鼠)L12138(大鼠) 5-氟脱氧尿苷
P-糖蛋白170(MDR1) AF016535(人类)J03398(小鼠) 数种药物，例如阿霉素、长春新碱、秋水仙素
核糖核苷酸还原酶 M124223，K02927(小鼠) 蚜栖菌素
谷氨酰胺-合成酶 AF150961(仓鼠)U09114，M60803(小鼠)M29579(大鼠) 甲硫氨酸亚砜胺(Methioninsulfoximin)(MSX)
天冬酰胺-合成酶 M27838(仓鼠)M27396(人类)U38940(小鼠)U07202(大鼠) β-天冬氨酰基异羟肟酸，合欢氨酸，5′氮胞苷
精氨基琥珀酸合成酶 X01630(人类)M31690(小鼠)M26198(牛) 刀豆氮酸
乌氨酸-脱羧酶 M34158(人类)J03733(小鼠)M16982(大鼠) α-二氟甲基乌氨酸
HMG-CoA-还原酶 L00183，M12705(仓鼠)M11058(人类) 密实菌素
N-乙酰基葡萄糖氨基-转移 M55621(人类) 衣霉素
酶
苏氨酰基-tRNA-合成酶 M63180(人类) 疏螺旋体素
J05096(人类)M14511(大鼠) 乌本苷
根据本发明，使用的可扩增可选择的标记基因优选为编码具有DHFR功能的多肽的基因，如编码DHFR或来自萤光蛋白质与DHFR的融合蛋白质。DHFR为嘌呤的生物合成所必需。缺少DHFR基因的细胞无法生长于缺少嘌呤的培养基中。所以DHFR基因为有用的可选择标记于无嘌呤培养基中培养的细胞中选择及扩增基因。与DHFR基因联结使用的选择培养基为氨甲蝶呤(MTX)。
所以本发明包括制备及选择重组哺乳动物细胞的方法，其含有下列步骤：(i)以至少编码一目的蛋白质、修饰的新霉素磷酸转移酶及DHFR的基因转染宿主细胞；(ii)将细胞于允许表达不同基因的条件下培养；及(iii)藉由培养细胞于允许至少可扩增可选择的标记基因扩增的选择剂如氨甲蝶呤存在下扩增共同整合的基因。优选的是，将转染的细胞培养于无次黄嘌呤/胸苷、缺乏血清及加入增加浓度的MTX的培养基中。优选的是，在第一次扩增步骤中MTX浓度为至少5nM。然而，MTX的浓度也可为至少20nM或100nM且可逐步增加至1μM。于独立情况中，可使用大于1μM的浓度，如2μM。
若相对应细胞另外以萤光蛋白质的基因转化，利用萤光激活细胞分拣器(FACS)可将此等细胞鉴定及挑选，而后在存在至少20，优选在存在50或100nM MTX中培养和于基因扩增步骤中扩增。以此方式，能够大量增加生产率至每细胞及每天多于20pg基因产物，优选至多于21、22、23、24、25等，30、35、40等。可将宿主细胞经过一或多次基因扩增步骤以便增加至少目的基因及可扩增可选择的标记基因的拷贝数目。根据本发明，藉由新霉素磷酸转移酶贝介导的对氨基葡萄糖苷抗生素如新霉素、卡那霉素及G418的抗性，将可达到的高生产率结合至有效的预先选择。所以能够降低基因扩增步骤所需数目及例如仅实行单一基因扩增。
因此于另一具体实施例中，本发明亦关于得到及选择表达至少一种异源目的基因的重组哺乳动物细胞的方法，其特征在于：(i)将重组哺乳动物细胞以根据本发明的表达载体及可扩增可选择的标记基因的基因转染；(ii)将哺乳动物细胞于允许表达目的基因、修饰的新霉素磷酸转移酶基因及编码萤光蛋白质的基因的条件下培养；(iii)将哺乳动物细胞于至少一种选择剂存在下培养，其选择性作用于哺乳动物细胞的生长，并给予表达修饰的新霉素磷酸转移酶基因的细胞生长优势；(iv)将呈现特别高萤光基因表达的哺乳动物细胞藉流式细胞计分析挑选；(v)将挑选的细胞于表达可扩增可选择的标记基因的条件下培养；及(vi)将选择剂加至培养基中其造成可扩增可选择的标记基因的扩增。
特别优选的为一相对应的方法，其中使用说明于本发明中的修饰的新霉素磷酸转移酶基因。也为优选的为一方法，其中仅实施一次扩增步骤。也为优选的为一相对应方法其导致重组哺乳动物细胞呈现平均特异性生产率大于每细胞每天20pg，优选大于21、22、23、24、25等、30、35、40等的所需基因产物。
哺乳动物细胞，优选是小鼠骨髓瘤和仓鼠细胞，是使用DHFR作为可扩增的选择标记的优选宿主细胞。细胞株CHO-DUKX(ATCC CRL-9096)和CHO-DG44(Urlaub等人，1983)是特别优选的，因为它们由于突变的结果，本身没有DHFR活性。为了能够在其他具有它们自己内源的DHFR活性的细胞类型中，使用DHFR依赖的扩增作用，可能在转染的过程中使用突变的DHFR基因，其编码具有降低对氨甲蝶呤的敏感性的蛋白质(Simonson等人，1983；Wigler等人，1980；Haber等人，1982)。
当利用DHFR负性基本细胞如CHO-GD44或CHO-DUKX时，DHFR标记特别适用于选择及随后扩增，因此等细胞不表达内源DHFR且所以不生长于无嘌呤培养基中。因此，可将DHFR基因于此使用为显性可扩增可选择的标记并将转化的细胞于无次黄嘌呤/胸苷培养基中选择。
在后文中，藉着非限制性的具体实施例，更详细解释本发明。
实例
缩写
Ala(＝A)    丙氨酸
AP：        碱性磷酸酶
Asn(＝N)    天冬酰胺
Asp(＝D)    天冬氨酸
bp：          碱基对
BSA：         牛血清白蛋白
CHO：         中国仓鼠卵巢
dhfr：        二氢叶酸还原酶
DMSO：        二甲基亚砜
ELISA：       酶联免疫吸附测定
FACS：        萤光激活的细胞分拣器
FITC：        异硫氰酸萤光素
GFP：         绿色萤光蛋白质
Glu(＝E)：    谷氨酸
Gly(＝G)：    甘氨酸
HBSS：        Hanks平衡盐溶液
HT：          次黄嘌呤/胸苷
Ile(＝I)：    异亮氨酸
IRES：        内部核糖体进入位点
kb：          千碱基
mAb：         单克隆抗体
MCP-1：       单核细胞趋化蛋白-1
MTX：         氨甲蝶呤
MW：          平均值
NPT：         新霉素磷酸转移酶
PCR：         聚合酶链式反应
PBS：         磷酸盐缓冲液
Phe(＝F)：    苯丙氨酸
Trp(＝W)：    色氨酸
Val(＝V)：    缬氨酸
WT：           野生型
方法
1.细胞培养及转染
将细胞CHO-DG44/dhfr-/-(Urlaub等人，1983)于无血清、补充次黄嘌呤及胸苷(InVitrogen GmbH，Karlsruhe，DE)的CHO-S-SFMII培养基中于细胞培养瓶及37℃潮湿环境及5％CO2中永久培养为悬浮细胞。以CASY1细胞计数器(Schaerfe System，DE)或藉锥虫蓝染色决定细胞数及生存力，而后将细胞以浓度1-3×105/毫升接种及每2-3天实施。
为转染CHO-DG44使用Lipofectamine Plus试剂(Invitrogen GmbH)。对各转染混合物，将总计1微克质粒DNA、4微升Lipofectamine及6微升Plus试剂根据制造商的说明混合在一起并以200微升的体积加至在补充0.8毫升HT的CHO-S-SFMII培养基中的6×105指数生长的CHO-DG44细胞。于细胞培养箱中37℃培养3小时后加入2毫升补充HT的CHO-S-SFMII培养基。对于以NPT为基础的选择中，转染后2天将细胞转移至具有G418(Invifrogen)的补充HT的CHO-S-SFMII培养基，其中每3至4天更换培养基。通常，将400微克/毫升G418加入以进行选择，于一些实验序列中也将浓度降低至200微克/毫升或提高至500、600或800微克/毫升。在共转染情况于DHFR-及NPT-为基础的选择中，其中一个表达载体含有DHFR而另一表达载体含有新霉素磷酸转移酶可选择标记，转染后2天将细胞转移至未加黄嘌呤及胸苷的CHO-S-SFMII培养基同时将G418(Invitrogen)以400微克/毫升的浓度加入培养基。
整合了异源基因的以DHFR为基础的基因扩增可由以浓度5-2000nM选择剂MTX(Sigma，Deisenhofen，DE)加入至无HT CHO-S-SFMII培养基而得到。
2.表达载体
为了分析表述，使用基于pAD-CMV载体(Werner等人，1998)及藉CMV增强子/仓鼠泛素/S27a启动子的组合介导的异源基因的组成型表达(WO97/15664)的真核表达载体。虽然基本载体pBID含有作用为可扩增可选择标记的dhfr小基因(参见如EP-0-393-438)，于载体pBIN中dhfr小基因已由新霉素磷酸转移酶抗性基因取代(图1)。为此目的，将可选择标记新霉素磷酸转移酶(包括SV40早期启动子及TK-聚腺苷酸化信号)自市售质柱pBK-CMV(Stratagene，La Jolla，CA，USA)分离为1640 bp Bsu36I片段。在以Klenow-DNA聚合酶填上片段末段的反应后，将片段与同样以Klenow-DNA聚合酶处理的载体pBID的3750 bp Bsu36I/StuI片段接合。
在双顺反子基本载体pBIDG(图1)中，自载体pIRES2-EGFP(Clontech，Palo Alto，CA，USA)分离IRES-GFP基因区域并使其以在CMV增强子/启动子的控制下的方式引入载体pBID中以保留启动子区域及IRES-元件之间的多克隆位点。使用下列程序。于PCR突变发生中，其中质粒pIRES2-EGFP作用为模板，一方面藉由利用致突变的引物将IRES序列内的HindIII切割位置AAGCTT转变成序列ATGCTT而因而消除。另一方面，藉由具有对IRES序列的5′端互补的引物将XbaI切割位置插入或藉由具有对GFP序列的3′端互补的引物将SpeI切割位置导入。将形成的PCR片段(其含有完整IRES及GFP序列)以XbaI及SpeI消化并克隆入载体pBID的多克隆位置的3′端的单独XbaI切割位置。以相同方式，使来自载体pIRES2-EGFP的IRES-GFP基因区域位于载体pBIN中CMV增强子/仓鼠泛素/S27a启动子的控制下。此产生双顺反子基本载体pBING(图1)。
将人类MCP-1cDNA(Yoshimura等人，1989)作为0.3kb HindIII/EcoRI片段克隆入载体pBIN的相对应切割位置，造成载体pBIN-MCP1(图2A)。
为了表达单克隆人源IgG2抗体，将重链以1.5kb BamHI/HindIII片段克隆入以BamHI及HindIII消化的载体pBID或pBIDG，以得到载体pBID-HC或pBIDG-HC(图2B)。另一方面，将轻链以0.7kb BamHI/HindIII片段克隆载体pBIN或pBING的相对应切割位置，产生载体pBIN-LC或pBING-LC(图2B)。
3.FACS
以Coulter Epics Altra装置进行流式细胞计分析及挑选。将FACS安装具有激发波长488 nm的氦-氩激光。于适合萤光蛋白质的波长将萤光强度吸收及藉由随附的软件Coulter Expo32处理。通常以速率8000-10000个事件/秒实施挑选。可将悬浮的细胞离心(于180×g 5分钟)并于HBSS中调整细胞浓度至1-1.5×107/毫升。而后可将细胞根据其萤光蛋白质信号挑选。将细胞收集于已含培养基的试管中，而后离心及视挑选的细胞数目而定，接种入适当培养容器或直接置于微量滴定盘中。
4.ELISA
利用OptEIA人类MCP-1套装试剂盒根据制造商的说明书(BDBiosciences Pharmingen，Heidelberg，DE)藉ELISA定量稳定转染的CHO-DG44细胞上清液中MCP-1效价。
一方面利用羊抗人IgG Fc片段(Dianova，Hamburg，DE)另一方面利用AP-共轭的羊抗人K轻链抗体(Sigma)藉ELISA根据标准程序(CurrentProtocols in Molecular Biology，Ausubel等人，1994，更新版)定量来自稳定转染的CHO-DG44上清液中的IgG2单克隆抗体。使用纯化的IgG2抗体作为标准。
由公式pg/((Ct-Co)t/ln(Ct-Co))计算生产率(pg/细胞/天)，其中Co及Ct分别为植入及收成时的细胞数，而t为培养时间。
5.点分析以决定NPT酶活性
为了制备细胞萃取物，根据Duch等人，1990的方法，将6×106个细胞以PBS清洗二次，而后重新悬浮于600微升萃取缓冲液(0.135 M Tris-HCl pH6.8，20％甘油，4 mM二硫苏糖醇)。于干冰或水浴中四次冷冻及解冻循环后，藉离心将细胞残骸移除，使用上清液进行随后的酶分析。利用BIO-RAD蛋白质分析(Bio-Rad Laboratories GmbH，Munich，DE)，以BSA作为标准蛋白质，藉(Bradford)分析法决定细胞萃取物中的蛋白质浓度(Current Protocols inMolecular Biology，Ausubel等人，1994，更新版)。为了决定NPT酶活性，(基于Platt等人，1987的方法)实施点分析法(DotAssay)。为此，将5微克、2.5微克及1.25微克蛋白质以萃取缓冲液调整至最终体积20微升，以来自非转染的CHO-DG44细胞的细胞萃取物增加总蛋白质量至5微克。在加入200微升分析缓冲液(67mM Tiis-HCl pH7.1，42mM MgCl2，400mM NH4Cl)加/减40微克/毫升G418及加/减5微居里[γ-33p]-ATP/ml(NEN)后，将萃取物培养于27℃135分钟。而后将萃取物于96孔真空歧管(Schleicher & Schull，Dassel，DE)通过一层Whatman 3MM滤纸，P81磷酸纤维素膜(Whatman LaboratoryDivision，Maidstone，Great Britain)及硝化纤维素膜(Schleicher & Schull)的夹层过滤。由蛋白质激酶磷酸化的蛋白质及非磷酸化的蛋白质结合至硝化纤维素，而磷酸化的G418通过硝化纤维素并结合至磷酸纤维素。以去离子水清洗三次后将膜自装置移出，再以水清洗而后风干。利用磷影像分析仪(Phospho Imager)(Molecular Dynamics，Krefeld，DE)定量放射线信号。
6.RNA印迹分析
以TRIZOL试剂根据制造商说明书(Invitrogen GmbH，Karlsruhe，DE)自细胞分离总RNA并根据乙二醛/DMSO-变性RNA的标准程序(CurrentProtocols in Molecular Biology，Ausubel等人，1994，更新版)实施由凝胶电泳分离30微克RNA及转移至Hybond N+尼龙膜(Amersham Biosciences，Freiburg，DE)。用于随后用GennImages CDP-Star检测试剂盒(AmershamBiosciences)的无放射性杂交的探针为包含NPT基因的编码区域的PCR产物，根据制造商的说明书以GeneImages随机引物标记试剂盒(AmershamBiosciences，Freiburg，DE)FITC-dUTP-标记。
7.斑点印迹分析
利用DNA分离试剂盒根据制造商的说明书(细胞及组织的DNA分离试剂盒；Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，DE)自细胞分离基因组DNA。利用96孔真空歧管(Schleicher & Schull，Dassel，DE)藉标准方法(Ausubel等人，1994)于碱性缓冲液中将不同量DNA(10微克、5微克、2.5微克、1.25微克、0.63微克及0.32微克)过滤至Hybond N+尼龙膜(Amersham Biosciences，Freiburg，DE)上。使用未转染的CHO-DG44细胞作为负对照。使用质粒pBIN-LC作为标准(320pg、160pg、80pg、40pg、20pg、10pg、5pg、2.5pg)。用于随后用GnenImages CDP-Star检测试剂盒(Amersham Biosciences)的无放射性杂交的探针为包含NPT基因的编码区域的PCR产物，根据制造商的说明书以GeneImages随机引物标记试剂盒(Amersham Biosciences，Freiburg，DE)FITC-dUTP-标记。利用ImageMaster VDS-CL(Amersham Biosciences)定量化学发光信号。随后细胞中npt基因的拷贝数利用标定过的质粒DNA所得的信号强度的标准系列决定。利用阿弗加德罗常数及将CHO细胞的DNA含量设定为约5pg，计算质粒分子数。
实施例1：新霉素磷酸转移酶的突变发生
藉由PCR利用致突变引物(图3)进行制备NPT突变体Glu182Gly(SEQID NO：3)、Trp91Ala(SEQ ID NO：5)、Val198Gly(SEQ ID NO：7)、Asp227Ala(SEQ ID NO：9)、Asp227Val(SEQ ID NO：11)、Asp261Gly(SEQ IDNO：13)、Asp261Asn(SEQ ID NO：15)、Phe240Ile(SEQ ID NO：17)、Glu182Asp(SEQ ID NO：19)、Asp227Gly(SEQ ID NO：21)、Asp190Gly(SEQ IDNO：23)及Asp208Gly(SEQ ID NO：25)所需的野生型NPT基因的碱基置换。使用载体pBIN(图1)或pBK-CMV(Stratagene，La Jolla，USA)作为PCR突变发生的模板。首先、将突变体的5′或3′部分于不同PCR混合物中制备。为了制备突变体Glu182Gly、Glu182Asp、Trp91Ala、Asp190Gly、Val198Gly、Asp208Gly及Asp227Gly，使用引物组合来扩增，其由Neofor5(SEQ ID NO：27)及相关致突变反向(reverse)引物或Neorev5(SEQ ID NO：28)及相关致突变前向(forward)引物组成：
-在NPT突变体Glu182Gly(SEQ ID NO：3)的情况中的Neofor5(SEQ IDNO：27)及E 182Grev(SEQ ID NO：32)或Neorev5(SEQ ID NO：28)及E182Gfor(SEQ ID NO：31)；
-在NPT突变体Glu182Asp(SEQ ID NO：19)的情况中的Neofor5(SEQ IDNO：27)及E182Drev(SEQ ID NO：48)或Neorev5(SEQ ID NO：28)及E182Dfor(SEQ ID NO：47)；
-在NPT突变体Trp91Ala(SEQ ID NO：5)的情况中的Neofor5(SEQ ID NO：27)及W91Arev(SEQ ID NO：34)或Neorev5(SEQ ID NO：28)及W91Afor(SEQID NO：33)；
-在NPT突变体Val198Gly(SEQ ID NO：7)的情况中的Neofor5(SEQ IDNO：27)及V198Grev(SEQ ID NO：36)或Neorev5(SEQ ID NO：28)及V198Gfor(SEQ ID NO：35)；
-在NPT突变体Asp190Gly(SEQ ID NO：23)的情况中的Neofor5(SEQ IDNO：27)及D190Grev(SEQ ID NO：50)或Neorev5(SEQ ID NO：28)及D190Gfor(SEQ ID NO：49)；
-在NPT突变体Asp208Gly(SEQ ID NO：25)的情况中的Neofor5(SEQ IDNO：27)及D208Grev(SEQ ID NO：52)或Neorev5(SEQ ID NO：28)及D208Gfor(SEQ ID NO：51)；
-在NPT突变体Asp227Gly(SEQ ID NO：21)的情况中的Neofor5(SEQ IDNO：27)及D227Grev(SEQ ID NO：54)或Neorev5(SEQ ID NO：28)及D227Gfor(SEQ ID NO：52)；
为了制备突变体Asp227Ala、Asp227Val、Asp261Gly、Asp261Asn及Phe240Ile，使用引物组合来扩增，其由Neofor2(SEQ ID NO：29)及相关致突变反向(rev)引物或IC49(SEQ ID NO：30)及相关致突变前向(for)引物组成：
-在NPT突变体Asp227Ala(SEQ ID NO：9)的情况中的Neofor2(SEQ IDNO：29)及D227Arev(SEQ ID NO：38)或IC49(SEQ ID NO：30)及D227Afor(SEQ ID NO：37)；
-在NPT突变体Asp227Val(SEQ ID NO：11)的情况中的Neofor2(SEQ IDNO：29)及D227Vrev(SEQ ID NO：40)或IC49(SEQ ID NO：30)及D227Vfor(SEQ ID NO：39)；
-在NPT突变体Asp261Gly(SEQ ID NO：13)的情况中的Neofor2(SEQ IDNO：29)及D261Grev(SEQ ID NO：42)或IC49(SEQ ID NO：30)及D261Gfor(SEQ ID NO：41)；
-在NPT突变体Asp261Asn(SEQ ID NO：15)的情况中的Neofor2(SEQ IDNO：29)及D261Nrev(SEQ ID NO：44)或IC49(SEQ ID NO：30)及D261Nfor(SEQ ID NO：43)；
-在NPT突变体Phe240Ile(SEQ ID NO：17)的情况中的Neofor2(SEQ IDNO：29)及F240Irev(SEQ ID NO：46)或IC49(SEQ ID NO：30)及F240Ifor(SEQ ID NO：45)；
而后将研究的突变体的5′部分的编码链与3′部分的互补链由杂交结合于由致突变引物序列形成的重叠区域，将单链区域填满并于以引物Neofor5(SEQ ID NO：27)及Neorev5(SEQ ID NO：28)或Neofor2(SEQ ID NO：29)及IC49(SEQ ID NO：30)的PCR中再度将总产物扩增。将PCR产物以StuI/RsrII(突变体Glu182Gly、Trp91Ala及Val198Gly的Neofor5/Neorev5PCR产物)、StuI/BstBI(突变体Glu182Asp、Asp190Gly、Asp208Gly及Asp227Gly的Neofor5/Neorev5PCR产物)或DraIII/RsrII(突变体Asp227Ala、Asp227Val、Asp26lGly、Asp261Asn及Phe240Ile的Neofor2/IC49PCR产物)消化。而后于载体pBIN-LC(图2B)或pBK-CMV(Stratagene，La Jolla，USA)中，由StuI/RsrII消化、DraIII/RsrII消化或StuI/BstBI消化将部分野生型NPT序列去除并以PCR产物的相对应片段取代。藉由序列分析互补及编码链二者，核对不同突变体中所需碱基置换以确保剩余DNA序列相对应于野生型NPT序列。以此方式，产生表达载体pBIN1-LC、pBIN2-LC、pBIN3-LC、pBIN4-LC、pBIN5-LC、pBIN6-LC、pBIN7-LC及pBIN8-LC，其含有NPT突变体Glu182Gly、Trp91Ala、Val198Gly、Asp227Ala、Asp227Val、Asp26lGly、Asp261Asn或Phe240Ile(图2B)。
将剩余NTP突变体自修饰的pBK-CMV分离为1640bp Bsu36I片段，将片段末端以Klenow-DNA聚合酶填满并与同样以Klenow-DNA聚合酶处理的载体pBID的3750bp Bsu36I/StuI片段接合。以此方式，产生表达载体pKS-N5、pKS-N6、pKS-N7及pKS-N8，其分别含有NPT突变体Glu182As p、Asp190Gly、Asp208Gly或Asp227Gly。而后将人类MCP-1cDNA作为0.3kbHindIII/EocRI片段(图2A)克隆入此等表达载体或将人化IgG2抗体的轻链作为0.7kb HindIII/BamHI片段(图2B)克隆入此等表达载体。
插入新霉素磷酸转移酶的突变一方面为较多(Val198Gly、Phe240Ile)或较少(Trp9lAla、Glul82Gly、Glul82Asp、Asp227Ala、Asp227Val、Asp227Gly)两侧包围保守性结构域，如基序1、2及3(Shaw等人，1993)的保守的氨基酸(图4)。另一方面，突变位于保守的基序1(Asp190Gly)、2(Asp208Gly)或3(Asp261Gly、Asp261Asn)内并关于保守的氨基酸。
实施例2：NPT突变对稳定转染的MCP-1表达细胞选择的影响
使用MCP-1作为CHO细胞中单链蛋白质表达的实例。为此，将CHO-DG44细胞以pKS-N5-MCP1、pKS-N6-MCP1、pKS-N7-MCP1、pKS-N8-MCP1或pBIN-MCP1(图2A)转染。进行一式两份制备。转染后两天，将细胞植入96孔盘(2000个细胞/孔)并以400微克/毫升G418于HT-补充的CHO-S-SFMII培养基选择。在以pBIN-MCP1转染的细胞的情况中，同时以800微克/毫升G418进行选择。将得到的细胞群体连续经24孔盘转移至6孔盘中。即使于选择阶段期间不同转染混合物之间可侦测到差异。与以NPT野生型基因(SEQ ID NO：1)进行选择的细胞群体相反，已以突变的NPT转染的细胞群体中，较少细胞能耐受以G418的起始选择。所以直到约四天后才可将此等细胞群体转移入24孔盘内。在已以pKS-N6-MCP1及pKS-N7-MPCI转染的混合物中，无稳定转染的细胞于400微克/毫升G418的浓度被选出。推测，具有突变Asp190Gly或Asp208Gly的NPT突变体中酶功能严重受损以致于无足够G418分子可被灭活以使稳定的转染细胞生长。虽然当将G418浓度降低至200微克/毫升，一些细胞存活于第一选择阶段，但除了突变体Asp208Gly的情况中的少数例外其皆严重地妨碍于其生长及存活而无法扩张。
由以突变体Glu182Asp及Asp227Gly或以NPT野生型转染的细胞，培养18集合体(混合物1及2各9集合体)经过四代于6孔盘中，藉ELISA判定细胞培养上清液中产生的MCP-1浓度。已使用NPT突变体作为可选择标记的细胞集合体显示比以NPT野生型于400或甚至800微克/毫升G418的浓度实施选择的细胞集合体平均50-57％(Glu182Asp突变体)或57-65％(Asp227Gly突变体)的更高生产率(图5)。因此，藉由利用NPT突变体作为可选择标记，可将转染的细胞群体中高产者的比例确实地增加。
实施例3：NPT突变对稳定转染的单克隆抗体表达细胞选择的影响
于共转染中，将CHO-DG44细胞首先以质粒组合pBIDG-HC/pBIN-LC(NTP野生型)、pBIDG-HC/pKS-N5-LC(Glu182Asp NPT突变体)或pBIDG-HC/pKS-N8-LC(Asp227Gly NPT突变体)(图2B)转染。于使用的载体构型中，将人源化IgG2抗体的两蛋白质链各以其本身载体表达，其另外编码DHFR或新霉素可选择标记于不同转录单位中。产物基因的表达是由CMV-增强子/仓鼠泛素/S27a启动子组合介导。然而，例如，利用CMV增强子/启动子、SV40增强子/仓鼠泛素/S27a启动子或其他启动子组合也可得到可比较的资料。
总计，实施四个转染系列，于各情况中每质粒组合使用6个集合体。与以NPT野生型基因进行选择的细胞群体相反，已以突变NPT转染的细胞群体中，较少细胞耐受以G418的起始选择。于加入400微克/毫升G418的无-HT CHO-S-SFMII培养基中选择转染的细胞集合体2-3周后，进行数次(6-8次)由ELISA决定细胞培养上清液中抗体效价。与利用NTP野生型基因作为可选择标记比较，以Glu182Asp突变体选择的细胞显示分别平均生产率及效价86％或77％增加，以Asp227Gly突变体选择的细胞显示分别平均生产率及效价126％及107％增加。因此，藉由利用具有降低的酶活性的NPT突变体，能够选择性富集具有基本生产率高达两倍的细胞。
于另-转染系列，测试不同浓度G418对选择的影响。使用400、500或600微克/毫升G418来选择转染的细胞集合体，各情况3个集合体。在较高浓度，显著较少细胞在以NPT野生型基因进行的选择的细胞群体中存活于初始选择，以Asp227Gly突变体效果最大。然而，得到的稳定转染的细胞群体显示对生长及活力无妨碍。然而，于用于转染的质粒组合内达到的生产率及效价之间侦测不到显著差异。但是，即使于此，由NPT突变体选择的细胞再次平均具有最高生产率，由Asp227Gly突变体领先，其生产率比NPT野生型高四倍，之后为Glu182Asp突变体，生产率高2.4倍(图6A)。
而后于共转染中，将CHO-DG44细胞以质粒组合pBIDG-HC/pBIN-LC(NTP野生型)、pBIDG-HC/pBIN1-LC(Glu182Gly NPT突变体)、pBIDG-HC/pBIN2-LC(Trp91Ala NPT 突变体)、pBIDG-HC/pBIN3-LC(Val198Gly NPT突变体)、pBIDG-HC/pBIN4-LC(Asp227Ala)、pBIDG-HC/pBIN5-LC(Asp227Val NPT突变体)、pBIDG-HC/pBIN6-LC(Asp261Gly NPT突变体)、pBIDG-HC/pBIN7-LC(Asp261Asn NPT突变体)或pBIDG-HC/pBIN8-LC(Phe240Ile NPT突变体)(图2B)转染。于使用的载体构型中，再度将单克隆人源化IgG2抗体的两蛋白质链各以其本身载体表达，其也另外编码DHFR或新霉素可选择标记于不同转录单位中。
对各质粒组合，转染5集合体。与以NPT野生型基因进行选择的细胞群体相反，已以突变NPT转染的细胞群体中，较少细胞耐受以G418的起始选择。于加入400微克/毫升G418的无-HT CHO-S-SFMII培养基中选择转染的细胞集合体二至三周后，进行六次由ELISA决定细胞培养上清液中抗体效价。图6B总结由测试中的集合体中决定的平均效价及生产率。与利用NPT野生型基因作为可选择标记比较，所有已以NPT突变体选择的细胞集合体显示平均增加生产率及效价分别为1.4-14.6倍或1.4-10.8倍(图6B)。因此以NPT突变体Asp227Val或Asp261Gly得到具有较高基本生产率细胞的最佳选择性增加，其增加平均生产率分别为14.6或9.3倍。
载体pBIDG-HC含有另一可选择标记-GFP。GFP转录上经IRES元件连接至重链。目标蛋白质及可选择标记GFP的表达之间形成的关连也使得能够快速地基于FACS分析中决定的GFP萤光评估转染细胞群体中表达水平的高低及分布。二至三周于G418的无-HT CHO-S-SFMII培养基选择转染的细胞集合体后，于FACS分析中测量GBP萤光(图7)。事实上GFP萤光信号与单克隆抗体IgG2抗体所得到的效价资料关联。以NPT突变体Asp227Val、Asp261Gly、Asp161Asn及Phe240Ile选择的集合体也具有较高比例的具有高GFP萤光的细胞，之后为以NPT突变体Trp91Ala、Asp227Gly、Gly182Asp、Asp227Ala、Glu182Gly及Val198Gly选择的细胞。
藉由加入选择剂氨甲蝶呤(MTX，Methotrexate)至培养基中能够藉由诱导经dhfr介导的基因扩增更进一步增加细胞的生产率。因此，例如，以100nMMTX的单一基因扩增步骤后，由以质粒组合pBIDG-HC/pBIN5-LC(NPT突变体Asp227Val)、pBIDG-HC/pBIN6-LC(NPT突变体Asp261Gly)、pBIDG-HC/pBIN7-LC(NPT突变体Asp261Asn)及pBIDG-HC/pBIN8-LC(NPT突变体Phe240Ile)共转染所得的细胞集合体中单位生产率可增加2至4倍，视集合体而定，可达到4到14pg/细胞/天的生产率。图8显示，经由实例，由共转染pBIDG-HC/pBIN5-LC(NPT突变体Asp227Val)所得的细胞集合体，藉由加入MTX(100nM MTX接着500nM MTX)达到生产率增加至27pg/细胞/天。
实施例4：决定及比较NPT酶活性
为了比较NPT突变体的酶活性与NPT野生型的酶活性，实施点分析法以决定细胞萃取物中的NPT活性，基于Platt等人1987的程序并于图9A中藉由实例显示NPT突变体Glu182Asp及Asp227Gly。由不同单克隆抗体-表达细胞集合体制备细胞萃取物，其已以NPT野生型基因(SEQ ID NO：1)或以NPT突变体Glu182Gly(SEQ ID NO：3)、Glu182Asp(SEQ ID NO：19)、Tr91Ala(SEQ ID NO：5)、Asp190Gly(SEQ ID NO：23)、Val198Gly(SEQ IDNO：7)、Asp208Gly(SEQ ID NO：25)、Asp227Ala(SEQ ID NO：9)、Asp227Val(SEQ ID NO：11)、Asp227Gly(SEQ ID NO：21)、Asp261Gly(SEQ IDNO：13)、Asp261Asn(SEQ ID NO：15)或Phe240Ile(SEQ ID NO：17)转染及选择。使用来自未转染的CHO-DG44细胞的细胞萃取物作为负对照。
与NPT野生型比较，NPT突变体的酶活性显著降低。平均NPT突变体仅具野生型酶活性的1.5％到62％，而NPT突变体Asp261Gly及Asp261Asn以3.1％或1.5％有最低残余活性而NPT突变体Val198Gly及Trp91Ala以61.9％或53.2％有最高残余活性(图9B)。于磷酸纤维素上得到的信号是针对由NPT酶活性造成的G418磷酸化。未加入NPT底物G418至分析缓冲液中，于磷酸纤维素上无活性可侦测。于硝化纤维素膜上得到的信号，其由细胞萃取物内的蛋白质激酶磷酸化的蛋白质形成，作为运用的样品等量的内对照。
无法将NPT突变体与NPT野生型比较降低的酶活性归因于降低的基因表达。相反地，RNA印迹分析总RNA显示以NPT野生型转染及呈现高NPT酶活性的细胞集合体比以NPT突变体转染的细胞集合体表达较少RNA(图10)。唯一的例外为以NPT突变体Glu182Gly转染并表达可比较量的NPT-mRNA的细胞。于实施于来自此等转染细胞群体的基因组DNA上的斑点印迹分析中，显示NPT突变体的较高表达是由基因剂量效果和/或由整合外源DNA进入转录活跃的基因组区域而得(图10)。例如，于以NPT突变体Trp91Ala选择的细胞中，于第1集合体中基因剂量效果显著而第2集合体中整合效果显著。以此方式，具有降低酶活性的标记用于选择转染的细胞于相同选择压力下能够合成足够标记蛋白质以补偿对选择剂降低的耐受性。
实施例5：藉由以GFP为基础的FACS挑选，分离具有单克隆抗体高表达的细胞
于共转染中，将CHO-DG44细胞以编码单克隆人源化IgG2抗体的质粒组合pBID-HC及pBING-LC转染(图2B)。于使用的载体构型中，将抗体的两蛋白质链各以其自己的载体表达，其也于不同转录单位中另外编码DHFR或修饰的新霉素磷酸转移酶可选择标记(Asp227Gly突变体；SEQ IDNO：21)。此外，载体pBING-LC含有另一可选择标记——GFP。藉由IRES元件转录连接GFP及轻链的表达的结果，以载体pBID-HC/pBING-LC共转染CHO-DG44，能够于短时间仅以藉由连续FACS挑选选择具有高GFP含量的细胞。分离具有单克隆抗体高表达的细胞。总计，将8个不同细胞集合体转染，由此在前二至三周于加入400微克/毫升G418的无-HTCHO-S-SFMII培养基选择后，得到稳定转染的细胞群体。由ELISA经由数次(7-8次)决定所有8集合体细胞的效价及生产率。平均效价约为1.4毫克/升，生产率约为1.3pg/细胞/天。为了随后连续以FACS为基础的挑选，选择第5集合体及第8集合体，第5集合体具有最高生产率而第8集合体具有相当于所有集合体的平均生产率。各步骤中，藉FACS将具有最高GFP萤光的5％细胞筛出并于集合体中进一步培养。将此挑选实施高达总计六次，每次挑选之间约二周培养期。令人惊讶地，发现单克隆抗体生产率与GFP萤光之间良好关联性(图13)，虽然两蛋白质链各自由其本身载体表达及于以GFP为基础的FACS挑选期间，仅能够选择轻链的表达，因其共转录耦合至GFP。仅由以FACS为基础的挑选能够将生产率增加至9.5pg/细胞/天(图11)。当将仓鼠启动子功能上连接至SV40增强子代替CMV增强子，也可得到可比较的资料。藉由单一随后MTX扩增步骤，始自第一个挑选步骤的第5集合体及第8集合体，藉由加入100nM MTX至选择培养基，能够增加集合体的生产率至平均多于20pg/细胞/天(图12)。萤光蛋白质的高表达量对细胞生长及生命力皆无负面影响。于基因扩增期间，细胞生长性质也严重地受MTX加入的负面影响，特别是当将其以更高浓度加入。然而，预先挑选的细胞集合体显示对相当高起始剂量的100nM MTX反应出显著更加强健的特性。其更加禁得起选择阶段，即仅2周后得到具有高生命力及良好生长速率的细胞群体。
此外，选择高产细胞的发展时间与传统逐步基因扩增策略比较，降低至约6周，后者通常包含4个扩增阶段及增加MTX加入。藉由组合使用增加具有增加表达目的基因的转染细胞，其由利用具有降低酶活性的修饰的NPT可选择标记达到，之后以GFP为基础的FACS挑选与随后基因扩增步骤可将此达成。
文献：
Adam，M.A.et al.，J Virol 1991，65，4985-4990
Altschul，S.F.et al.，Nucleic Acids Res.1997，25，3389-3402
Altschul，S.F.et al.，J Mol Biol 1990，215，403-410
Ausubel，F.M.et al.，Current Protocols in molecular biology.New York：
Greene Publishing Associates and Wiley-lnterscience.1994(updated)
Blazques，J.et al.，Molecular Microbilolgy 1991，5(6)，1511-1518
Bennett，R.P.et al.，Bio Techniques 1998，24，478-482
Burk，D.L.et al.，Biochemistry 2001，40(30)，8756-8764
Chalfie，M.et al.，Science 1994，263，802-805
Chamov，S.M.et al.，Antibody Fusion Proteins，Wiley-Liss lnc.，1999
Davies，M.V.et al.，J Virol 1992，66，1924-1932
Faisst，S.et al.，Nucleic Acids Research 1992，20，3-26
Gish，W.& States，D.J.，Nature Genet.1993，3，266-272
Gossen，M.et al.，Curr Opi Biotech 1994，5，516-520
Duch，M.et al.，Gene 1990，95，285-288
Hanson，K.D.et al.，Mol Cell Biol 1995，15(1)，45-51
Haber，D.A.et al.，Somatic Cell Genetics 1982，8，499-508
Harris et al.，Protein Purification：A Practical Approach，Pickwood and Hames，eds.，IRL Press，1995
Hemann，C.et al.，DNA Cell Biol 1994，13(4)，437-445
Hon，W.et al.，Cell 1997，89，887-895
Hu，S.et al.，Cancer Res.1996，56(13)，3055-3061
Huston，C.et al.，Proc Natl Acad Sci USA 1998，85(16)，5879-5883
Jang，S.K.et al.，J Virol1989，63，1651-1660
Kaufman，R.J.，Methods in Enzymology 1990，185，537-566
Kocabiyik，S.et al.，Biochem Biophys Res Commun 1992，185(3)，925-931
Kortt，A.A.et al.，Protein Engineering 1997，10(4)，423-433
Lottspeich F.and Zorbas H.eds.，Bioanalytic，Spektrum Akad.Verl.，1998
Lovejoy，B.et al.，Science 1993，259，1288-1293
Madden，T.L.et al.，Meth.Enzymol.1996，266，131-141；
Monaco，L.et al.，Gene 1996，180145-15
Morgan，R.A.et al.，Nucleic Acids Research 1992，20，1293-1299
Mosser，D.D.et al.，Bio Techniques 1997，22，150-161
Ohshima，Y.et al.，J Mol Biol 1987，195，247-259
Pack，P.et al.，Biotechnology 1993，11，1271-1277
Pack，P.et al.，J Mol Biol1995，246(1)，28-34
Pelletier，J.et al.，Nature 1988，334，320-325
Perisic，O.et al.，Structure 1994，2，1217-1226
Platt，S.G.et al.，Analyt Biochem 1987，162，529-535
Ramesh，N.et al.，Nucleic Acids Research 1996，24，2697-2700
Sambrook，J.，Fritsch，E.F.& Maniatis，T.，Molecular Cloning：A Laboratory
Manual Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，1989
Scopes，R.，Protein Purification，Springer Verlag，1988
Shaw，K.J.et al.，Microbiological Reviews 1993，57(1)，138-163
Simonson，C.C.et al.，Proc Natl Acad Sci USA 1983，80，2495-2499
Sugimoto et al.，Biotechnology 1994，12，694-698
Yenofsky，R.L.et al.，Proc Natl Acad Sci USA 1990，87，3435-3439
Yoshimura，T.et al.，FEBS LETTERS 1989，244(2)，487-493
Urlaub，G.et al.，Cell 1983，33，405-412
Werner，R.G.et al.，Arzneim.-Forsch./Drug.Res.1998，48，870-880
Wigler，M.et al.，Proc Natl Acad Sci USA 1980，77，3567-3570
Zhang，J.& Madden，T.L.Genome Res.1997，7，649-656；
序列表
<110>贝林格尔英格海姆法玛两合公司(BOEHRINGER INGELHEIM PHARMA GMBH & CO KG)
<120>新的新霉素磷酸转移酶基因及选择高产重组细胞的方法
<130>Case 1-1411
<140>
<141>
<160>55
<170>PatentIn Ver.3.1
<210>1
<211>795
<212>DNA
<213>大肠杆菌(Escherichia coli)
<400>1
atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc 60
ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca 120
gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg 180
caagacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg 240
ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag 300
gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg 360
cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc 420
atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa 480
gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgag catgcccgac 540
ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat 600
ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac 660
atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc 720
ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt 780
gacgagttct tctga                                                  795
<210>2
<211>264
<212>PRT
<213>大肠杆菌(Escherichia coli)
<400>2
Met Ile Glu Gln Asp Gly Leu His Ala Gly Ser Pro Ala Ala Trp Val
  1               5                  10                  15
Glu Arg Leu Phe Gly Tyr Asp Trp Ala Gln Gln Thr Ile Gly Cys Ser
             20                  25                  30
Asp Ala Ala Val Phe Arg Leu Ser Ala Gln Gly Arg Pro Val Leu Phe
         35                  40                  45
Val Lys Thr Asp Leu Ser Gly Ala Leu Asn Glu Leu Gln Asp Glu Ala
     50                  55                  60
Ala Arg Leu Ser Trp Leu Ala Thr Thr Gly Val Pro Cys Ala Ala Val
 65                  70                  75                  80
Leu Asp Val Val Thr Glu Ala Gly Arg Asp Trp Leu Leu Leu Gly Glu
                 85                  90                  95
Val Pro Gly Gln Asp Leu Leu Ser Ser His Leu Ala Pro Ala Glu Lys
            100                 105                 110
Val Ser Ile Met Ala Asp Ala Met Arg Arg Leu His Thr Leu Asp Pro
        115                 120                 125
Ala Thr Cys Pro Phe Asp His Gln Ala Lys His Arg Ile Glu Arg Ala
    130                 135                 140
Arg Thr Arg Met Glu Ala Gly Leu Val Asp Gln Asp Asp Leu Asp Glu
145                 150                 155                 160
Glu His Gln Gly Leu Ala Pro Ala Glu Leu Phe Ala Arg Leu Lys Ala
                165                 170                 175
Ser Met Pro Asp Gly Glu Asp Leu Val Val Thr His Gly Asp Ala Cys
            180                 185                 190
Leu Pro Asn Ile Met Val Glu Asn Gly Arg Phe Ser Gly Phe Ile Asp
        195                 200                 205
Cys Gly Arg Leu Gly Val Ala Asp Arg Tyr Gln Asp Ile Ala Leu Ala
    210                 215                 220
Thr Arg Asp Ile Ala Glu Glu Leu Gly Gly Glu Trp Ala Asp Arg Phe
225                 230                 235                 240
Leu Val Leu Tyr Gly Ile Ala Ala Pro Asp Ser Gln Arg Ile Ala Phe
                245                 250                 255
Tyr Arg Leu Leu Asp Glu Phe Phe
            260
<210>3
<211>795
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：
     新霉素突变体E182G
<400>3
atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc 60
ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca 120
gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg 180
caagacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg 240
ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag 300
gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg 360
cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc 420
atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa 480
gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgag catgcccgac 540
ggcggggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat 600
ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac 660
atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc 720
ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt 780
gacgagttct tctga                                                  795
<210>4
<211>264
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：
    新霉素突变体E182G
<400>4
Met Ile Glu Gln Asp Gly Leu His Ala Gly Ser Pro Ala Ala Trp Val
  1               5                  10                  15
Glu Arg Leu Phe Gly Tyr Asp Trp Ala Gln Gln Thr Ile Gly Cys Ser
             20                  25                  30
Asp Ala Ala Val Phe Arg Leu Ser Ala Gln Gly Arg Pro Val Leu Phe
         35                  40                  45
Val Lys Thr Asp Leu Ser Gly Ala Leu Asn Glu Leu Gln Asp Glu Ala
     50                  55                  60
Ala Arg Leu Ser Trp Leu Ala Thr Thr Gly Val Pro Cys Ala Ala Val
 65                  70                  75                  80
Leu Asp Val Val Thr Glu Ala Gly Arg Asp Trp Leu Leu Leu Gly Glu
                 85                  90                  95
Val Pro Gly Gln Asp Leu Leu Ser Ser His Leu Ala Pro Ala Glu Lys
            100                 105                 110
Val Ser Ile Met Ala Asp Ala Met Arg Arg Leu His Thr Leu Asp Pro
        115                 120                 125
Ala Thr Cys Pro Phe Asp His Gln Ala Lys His Arg Ile Glu Arg Ala
    130                 135                 140
Arg Thr Arg Met Glu Ala Gly Leu ValAsp Gln Asp Asp Leu Asp Glu
145                 150                 155                 160
Glu His Gln Gly Leu Ala Pro Ala Glu Leu Phe Ala Arg Leu Lys Ala
                165                 170                 175
Ser Met Pro Asp Gly Gly Asp Leu Val Val Thr His Gly Asp Ala Cys
            180                 185                 190
Leu Pro Asn Ile Met Val Glu Asn Gly Arg Phe Ser Gly Phe Ile Asp
        195                 200                 205
Cys Gly Arg Leu Gly Val Ala Asp Arg Tyr Gln Asp Ile Ala Leu Ala
    210                 215                 220
Thr Arg Asp Ile Ala Glu Glu Leu Gly Gly Glu Trp Ala Asp Arg Phe
225                 230                 235                 240
Leu Val Leu Tyr Gly Ile Ala Ala Pro Asp Ser Gln Arg Ile Ala Phe
                245                 250                 255
Tyr Arg Leu Leu Asp Glu Phe Phe
            260
<210>5
<211>795
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：
    新霉素突变体W91A
<400>5
atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc 60
ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca 120
gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg 180
caagacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg 240
ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac gcgctgctat tgggcgaagt gccggggcag 300
gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg 360
cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc 420
atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa 480
gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgag catgcccgac 540
ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat 600
ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac 660
atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc 720
ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt 780
gacgagttct tctga                                                  795
<210>6
<211>264
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：
    新霉素突变体W91A
<400>6
Met Ile Glu Gln Asp Gly Leu His Ala Gly Ser Pro Ala Ala Trp Val
  1               5                  10                  15
Glu Arg Leu Phe Gly Tyr Asp Trp Ala Gln Gln Thr Ile Gly Cys Ser
             20                  25                  30
Asp Ala Ala Val Phe Arg Leu Ser Ala Gln Gly Arg Pro Val Leu Phe
         35                  40                  45
Val Lys Thr Asp Leu Ser Gly Ala Leu Asn Glu Leu Gln Asp Glu Ala
     50                  55                  60
Ala Arg Leu Ser Trp Leu Ala Thr Thr Gly Val Pro Cys Ala Ala Val
 65                  70                  75                  80
Leu Asp Val Val Thr Glu Ala Gly Arg Asp Ala Leu Leu Leu Gly Glu
                 85                  90                  95
Val Pro Gly Gln Asp Leu Leu Ser Ser His Leu Ala Pro Ala Glu Lys
            100                 105                 110
Val Ser Ile Met Ala Asp Ala Met Arg Arg Leu His Thr Leu Asp Pro
        115                 120                 125
Ala Thr Cys Pro Phe Asp His Gln Ala Lys His Arg Ile Glu Arg Ala
    130                 135                 140
Arg Thr Arg Met Glu Ala Gly Leu Val Asp Gln Asp Asp Leu Asp Glu
145                 150                 155                 160
Glu His Gln Gly Leu Ala Pro Ala Glu Leu Phe Ala Arg Leu Lys Ala
                165                 170                 175
Ser Met Pro Asp Gly Glu Asp Leu Val Val Thr His Gly Asp Ala Cys
            180                 185                 190
Leu Pro Asn Ile Met Val Glu Asn Gly Arg Phe Ser Gly Phe Ile Asp
        195                 200                 205
Cys Gly Arg Leu Gly Val Ala Asp Arg Tyr Gln Asp Ile Ala Leu Ala
    210                 215                 220
Thr Arg Asp Ile Ala Glu Glu Leu Gly Gly Glu Trp Ala Asp Arg Phe
225                 230                 235                 240
Leu Val Leu Tyr Gly Ile Ala Ala Pro Asp Ser Gln Arg Ile Ala Phe
                245                 250                 255
Tyr Arg Leu Leu Asp Glu Phe Phe
            260
<210>7
<211>795
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：
    新霉素突变体V198G
<400>7
atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc 60
ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca 120
gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg 180
caagacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg 240
ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag 300
gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg 360
cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc 420
atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa 480
gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgag catgcccgac 540
ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat gggggaaaat 600
ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac 660
atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc 720
ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt 780
gacgagttct tctga                                                  795
<210>8
<211>264
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：
    新霉素突变体V198G
<400>8
Met Ile Glu Gln Asp Gly Leu His Ala Gly Ser Pro Ala Ala Trp Val
  1               5                  10                  15
Glu Arg Leu Phe Gly Tyr Asp Trp Ala Gln Gln Thr Ile Gly Cys Ser
             20                  25                  30
Asp Ala Ala Val Phe Arg Leu Ser Ala Gln Gly Arg Pro Val Leu Phe
         35                  40                  45
Val Lys Thr Asp Leu Ser Gly Ala Leu Asn Glu Leu Gln Asp Glu Ala
     50                  55                  60
Ala Arg Leu Ser Trp Leu Ala Thr Thr Gly Val Pro Cys Ala Ala Val
 65                  70                  75                  80
Leu Asp Val Val Thr Glu Ala Gly Arg Asp Trp Leu Leu Leu Gly Glu
                 85                  90                  95
Val Pro Gly Gln Asp Leu Leu Ser Ser His Leu Ala Pro Ala Glu Lys
            100                 105                 110
Val Ser Ile Met Ala Asp Ala Met Arg Arg Leu His Thr Leu Asp Pro
        115                 120                 125
Ala Thr Cys Pro Phe Asp His Gln Ala Lys His Arg Ile Glu Arg Ala
    130                 135                 140
Arg Thr Arg Met Glu Ala Gly Leu Val Asp Gln Asp Asp Leu Asp Glu
145                 150                 155                 160
Glu His Gln Gly Leu Ala Pro Ala Glu Leu Phe Ala Arg Leu Lys Ala
                165                 170                 175
Ser Met Pro Asp Gly Glu Asp Leu Val Val Thr His Gly Asp Ala Cys
            180                 185                 190
Leu Pro Asn Ile Met Gly Glu Asn Gly Arg Phe Ser Gly Phe Ile Asp
        195                 200                 205
Cys Gly Arg Leu Gly Val Ala Asp Arg Tyr Gln Asp Ile Ala Leu Ala
    210                 215                 220
Thr Arg Asp Ile Ala Glu Glu Leu Gly Gly Glu Trp Ala Asp Arg Phe
225                 230                 235                 240
Leu Val Leu Tyr Gly Ile Ala Ala Pro Asp Ser Gln Arg Ile Ala Phe
                245                 250                 255
Tyr Arg Leu Leu Asp Glu Phe Phe
            260
<210>9
<211>795
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：
    新霉素突变体D227A
<400>9
atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc 60
ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca 120
gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg 180
caagacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg 240
ctcgacgttg teactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag 300
gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg 360
cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc 420
atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa 480
gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgag catgcccgac 540
ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat 600
ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac 660
atagcgttgg ctacccgtgc tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc 720
ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt 780
gacgagttct tctga                                                  795
<210>10
<211>264
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：
    新霉素突变体D227A
<400>10
Met Ile Glu Gln Asp Gly Leu His Ala Gly Ser Pro Ala Ala Trp Val
  1               5                  10                  15
Glu Arg Leu Phe Gly Tyr Asp Trp Ala Gln Gln Thr Ile Gly Cys Ser
             20                  25                  30
Asp Ala Ala Val Phe Arg Leu Ser Ala Gln Gly Arg Pro Val Leu Phe
         35                  40                  45
Val Lys Thr Asp Leu Ser Gly Ala Leu Asn Glu Leu Gln Asp Glu Ala
     50                  55                  60
Ala Arg Leu Ser Trp Leu Ala Thr Thr Gly Val Pro Cys Ala Ala Val
 65                  70                  75                  80
Leu Asp Val Val Thr Glu Ala Gly Arg Asp Trp Leu Leu Leu Gly Glu
                 85                  90                  95
Val Pro Gly Gln Asp Leu Leu Ser Ser His Leu Ala Pro Ala Glu Lys
            100                 105                 110
Val Ser Ile Met Ala Asp Ala Met Arg Arg Leu His Thr Leu Asp Pro
        115                 120                 125
Ala Thr Cys Pro Phe Asp His Gln Ala Lys His Arg Ile Glu Arg Ala
    130                 135                 140
Arg Thr Arg Met Glu Ala Gly Leu Val Asp Gln Asp Asp Leu Asp Glu
145                 150                 155                 160
Glu His Gln Gly Leu Ala Pro Ala Glu Leu Phe Ala Arg Leu Lys Ala
                165                 170                 175
Ser Met Pro Asp Gly Glu Asp Leu Val Val Thr His Gly Asp Ala Cys
            180                 185                 190
Leu Pro Asn Ile Met Val Glu Asn Gly Arg Phe Ser Gly Phe Ile Asp
        195                 200                 205
Cys Gly Arg Leu Gly Val Ala Asp Arg Tyr Gln Asp Ile Ala Leu Ala
    210                 215                 220
Thr Arg Ala Ile Ala Glu Glu Leu Gly Gly Glu Trp Ala Asp Arg Phe
225                 230                 235                 240
Leu Val Leu Tyr Gly Ile Ala Ala Pro Asp Ser Gln Arg Ile Ala Phe
                245                 250                 255
Tyr Arg Leu Leu Asp Glu Phe Phe
            260
<210>11
<211>795
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：
    新霉素突变体D227V
<400>11
atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc 60
ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca 120
gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg 180
caagacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg 240
ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag 300
gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg 360
cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc 420
atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa 480
gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgag catgcccgac 540
ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat 600
ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac 660
atagcgttgg ctacccgtgt tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc 720
ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt 780
gacgagttct tctga                                                  795
<210>12
<211>264
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：
    新霉素突变体D227V
<400>12
Met Ile Glu Gln Asp Gly Leu His Ala Gly Ser Pro Ala Ala Trp Val
  1               5                  10                  15
Glu Arg Leu Phe Gly Tyr Asp Trp Ala Gln Gln Thr Ile Gly Cys Ser
             20                  25                  30
Asp Ala Ala Val Phe Arg Leu Ser Ala Gln Gly Arg Pro Val Leu Phe
         35                  40                  45
Val Lys Thr Asp Leu Ser Gly Ala Leu Asn Glu Leu Gln Asp Glu Ala
     50                  55                  60
Ala Arg Leu Ser Trp Leu Ala Thr Thr Gly Val Pro Cys Ala Ala Val
 65                  70                  75                  80
Leu Asp Val Val Thr Glu Ala Gly Arg Asp Trp Leu Leu Leu Gly Glu
                 85                  90                  95
Val Pro Gly Gln Asp Leu Leu Ser Ser His Leu Ala Pro Ala Glu Lys
            100                 105                 110
Val Ser Ile Met Ala Asp Ala Met Arg Arg Leu His Thr Leu Asp Pro
        115                 120                 125
Ala Thr Cys Pro Phe Asp His Gln Ala Lys His Arg Ile Glu Arg Ala
    130                 135                 140
Arg Thr Arg Met Glu Ala Gly Leu Val Asp Gln Asp Asp Leu Asp Glu
145                 150                 155                 160
Glu His Gln Gly Leu Ala Pro Ala Glu Leu Phe Ala Arg Leu Lys Ala
                165                 170                 175
Ser Met Pro Asp Gly Glu Asp Leu Val Val Thr His Gly Asp Ala Cys
            180                 185                 190
Leu Pro Asn Ile Met Val Glu Asn Gly Arg Phe Ser Gly Phe Ile Asp
        195                 200                 205
Cys Gly Arg Leu Gly Val Ala Asp Arg Tyr Gln Asp Ile Ala Leu Ala
    210                 215                 220
Thr Arg Val Ile Ala Glu Glu Leu Gly Gly Glu Trp Ala Asp Arg Phe
225                 230                 235                 240
Leu Val Leu Tyr Gly Ile Ala Ala Pro Asp Ser Gln Arg Ile Ala Phe
                245                 250                 255
Tyr Arg Leu Leu Asp Glu Phe Phe
            260
<210>13
<211>795
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：
    新霉素突变体D261G
<400>13
atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc 60
ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca 120
gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg 180
caagacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg 240
ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag 300
gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg 360
cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc 420
atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa 480
gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgag catgcccgac 540
ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat 600
ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac 660
atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc 720
ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt 780
ggcgagttct tctga                                                  795
<210>14
<211>264
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：
    新霉素突变体D261G
<400>14
Met Ile Glu Gln Asp Gly Leu His Ala Gly Ser Pro Ala Ala Trp Val
  1               5                  10                  15
Glu Arg Leu Phe Gly Tyr Asp Trp Ala Gln Gln Thr Ile Gly Cys Ser
             20                  25                  30
Asp Ala Ala Val Phe Arg Leu Ser Ala Gln Gly Arg Pro Val Leu Phe
         35                  40                  45
Val Lys Thr Asp Leu Ser Gly Ala Leu Asn Glu Leu Gln Asp Glu Ala
     50                  55                  60
Ala Arg Leu Ser Trp Leu Ala Thr Thr Gly Val Pro Cys Ala Ala Val
 65                  70                  75                  80
Leu Asp Val Val Thr Glu Ala Gly Arg Asp Trp Leu Leu Leu Gly Glu
                 85                  90                  95
Val Pro Gly Gln Asp Leu Leu Ser Ser His Leu Ala Pro Ala Glu Lys
            100                 105                 110
Val Ser Ile Met Ala Asp Ala Met Arg Arg Leu His Thr Leu Asp Pro
        115                 120                 125
Ala Thr Cys Pro Phe Asp His Gln Ala Lys His Arg Ile Glu Arg Ala
    130                 135                 140
Arg Thr Arg Met Glu Ala Gly Leu Val Asp Gln Asp Asp Leu Asp Glu
145                 150                 155                 160
Glu His Gln Gly Leu Ala Pro Ala Glu Leu Phe Ala Arg Leu Lys Ala
                165                 170                 175
Ser Met Pro Asp Gly Glu Asp Leu Val Val Thr His Gly Asp Ala Cys
            180                 185                 190
Leu Pro Asn Ile Met Val Glu Asn Gly Arg Phe Ser Gly Phe Ile Asp
        195                 200                 205
Cys Gly Arg Leu Gly Val Ala Asp Arg Tyr Gln Asp Ile Ala Leu Ala
    210                 215                 220
Thr Arg Asp Ile Ala Glu Glu Leu Gly Gly Glu Trp Ala Asp Arg Phe
225                 230                 235                 240
Leu Val Leu Tyr Gly Ile Ala Ala Pro Asp Ser Gln Arg Ile Ala Phe
                245                 250                 255
Tyr Arg Leu Leu Gly Glu Phe Phe
            260
<210>15
<211>795
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：
    新霉素突变体D261N
<400>15
atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc 60
ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca 120
gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg 180
caagacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg 240
ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag 300
gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg 360
cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc 420
atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa 480
gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgag catgcccgac 540
ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat 600
ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac 660
atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc 720
ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt 780
aacgagttct tctga                                                  795
<210>16
<211>264
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：
    新霉素突变体D261N
<400>16
Met Ile Glu Gln Asp Gly Leu His Ala Gly Ser Pro Ala Ala Trp Val
  1               5                  10                  15
Glu Arg Leu Phe Gly Tyr Asp Trp Ala Gln Gln Thr Ile Gly Cys Ser
             20                  25                  30
Asp Ala Ala Val Phe Arg Leu Ser Ala Gln Gly Arg Pro Val Leu Phe
         35                  40                  45
Val Lys Thr Asp Leu Ser Gly Ala Leu Asn Glu Leu Gln Asp Glu Ala
     50                  55                  60
Ala Arg Leu Ser Trp Leu Ala Thr Thr Gly Val Pro Cys Ala Ala Val
 65                  70                  75                  80
Leu Asp Val Val Thr Glu Ala Gly Arg Asp Trp Leu Leu Leu Gly Glu
                 85                  90                  95
Val Pro Gly Gln Asp Leu Leu Ser Ser His Leu Ala Pro Ala Glu Lys
            100                 105                 110
Val Ser Ile Met Ala Asp Ala Met Arg Arg Leu His Thr Leu Asp Pro
        115                 120                 125
Ala Thr Cys Pro Phe Asp His Gln Ala Lys His Arg Ile Glu Arg Ala
    130                 135                 140
Arg Thr Arg Met Glu Ala Gly Leu Val Asp Gln Asp Asp Leu Asp Glu
145                 150                 155                 160
Glu His Gln Gly Leu Ala Pro Ala Glu Leu Phe Ala Arg Leu Lys Ala
                165                 170                 175
Ser Met Pro Asp Gly Glu Asp Leu Val Val Thr His Gly Asp Ala Cys
            180                 185                 190
Leu Pro Asn Ile Met Val Glu Asn Gly Arg Phe Ser Gly Phe Ile Asp
        195                 200                 205
Cys Gly Arg Leu Gly Val Ala Asp Arg Tyr Gln Asp Ile Ala Leu Ala
    210                 215                 220
Thr Arg Asp Ile Ala Glu Glu Leu Gly Gly Glu Trp Ala Asp Arg Phe
225                 230                 235                 240
Leu Val Leu Tyr Gly Ile Ala Ala Pro Asp Ser Gln Arg Ile Ala Phe
                245                 250                 255
Tyr Arg Leu Leu Asn Glu Phe Phe
            260
<210>17
<211>795
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：
    新霉素突变体F240I
<400>17
atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc 60
ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca 120
gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg 180
caagacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg 240
ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag 300
gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg 360
cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc 420
atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa 480
gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgag catgcccgac 540
ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat 600
ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac 660
atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcatc 720
ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt 780
gacgagttct tctga                                                  795
<210>18
<211>264
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：
    新霉素突变体F240I
<400>18
Met Ile Glu Gln Asp Gly Leu His Ala Gly Ser Pro Ala Ala Trp Val
  1               5                  10                  15
Glu Arg Leu Phe Gly Tyr Asp Trp Ala Gln Gln Thr Ile Gly Cys Ser
             20                  25                  30
Asp Ala Ala Val Phe Arg Leu Ser Ala Gln Gly Arg Pro Val Leu Phe
         35                  40                  45
Val Lys Thr Asp Leu Ser Gly Ala Leu Asn Glu Leu Gln Asp Glu Ala
     50                  55                  60
Ala Arg Leu Ser Trp Leu Ala Thr Thr Gly Val Pro Cys Ala Ala Val
 65                  70                  75                  80
Leu Asp Val Val Thr Glu Ala Gly Arg Asp Trp Leu Leu Leu Gly Glu
                 85                  90                  95
Val Pro Gly Gln Asp Leu Leu Ser Ser His Leu Ala Pro Ala Glu Lys
            100                 105                 110
Val Ser Ile Met Ala Asp Ala Met Arg Arg Leu His Thr Leu Asp Pro
        115                 120                 125
Ala Thr Cys Pro Phe Asp His Gln Ala Lys His Arg Ile Glu Arg Ala
    130                 135                 140
Arg Thr Arg Met Glu Ala Gly Leu Val Asp Gln Asp Asp Leu Asp Glu
145                 150                 155                 160
Glu His Gln Gly Leu Ala Pro Ala Glu Leu Phe Ala Arg Leu Lys Ala
                165                 170                 175
Ser Met Pro Asp Gly Glu Asp Leu Val Val Thr His Gly Asp Ala Cys
            180                 185                 190
Leu Pro Asn Ile Met Val Glu Asn Gly Arg Phe Ser Gly Phe Ile Asp
        195                 200                 205
Cys Gly Arg Leu Gly Val Ala Asp Arg Tyr Gln Asp Ile Ala Leu Ala
    210                 215                 220
Thr Arg Asp Ile Ala Glu Glu Leu Gly Gly Glu Trp Ala Asp Arg Ile
225                 230                 235                 240
Leu Val Leu Tyr Gly Ile Ala Ala Pro Asp Ser Gln Arg Ile Ala Phe
                245                 250                 255
Tyr Arg Leu Leu Asp Glu Phe Phe
            260
<210>19
<211>795
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：
    新霉素突变体E182D
<400>19
atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc 60
ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca 120
gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg 180
caagacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg 240
ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag 300
gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg 360
cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc 420
atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa 480
gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgag catgcccgac 540
ggcgatgatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat 600
ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac 660
atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc 720
ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt 780
gacgagttct tctga                                                  795
<210>20
<211>264
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：
    新霉素突变体E182D
<400>20
Met Ile Glu Gln Asp Gly Leu His Ala Gly Ser Pro Ala Ala Trp Val
  1               5                  10                  15
Glu Arg Leu Phe Gly Tyr Asp Trp Ala Gln Gln Thr Ile Gly Cys Ser
             20                  25                  30
Asp Ala Ala Val Phe Arg Leu Ser Ala Gln Gly Arg Pro Val Leu Phe
         35                  40                  45
Val Lys Thr Asp Leu Ser Gly Ala Leu Asn Glu Leu Gln Asp Glu Ala
     50                  55                  60
Ala Arg Leu Ser Trp Leu Ala Thr Thr Gly Val Pro Cys Ala Ala Val
 65                  70                  75                  80
Leu Asp Val Val Thr Glu Ala Gly Arg Asp Trp Leu Leu Leu Gly Glu
                 85                  90                  95
Val Pro Gly Gln Asp Leu Leu Ser Ser His Leu Ala Pro Ala Glu Lys
            100                 105                 110
Val Ser Ile Met Ala Asp Ala Met Arg Arg Leu His Thr Leu Asp Pro
        115                 120                 125
Ala Thr Cys Pro Phe Asp His Gln Ala Lys His Arg Ile Glu Arg Ala
    130                 135                 140
Arg Thr Arg Met Glu Ala Gly Leu Val Asp Gln Asp Asp Leu Asp Glu
145                 150                 155                 160
Glu His Gln Gly Leu Ala Pro Ala Glu Leu Phe Ala Arg Leu Lys Ala
                165                 170                 175
Ser Met Pro Asp Gly Asp Asp Leu Val Val Thr His Gly Asp Ala Cys
            180                 185                 190
Leu Pro Asn Ile Met Val Glu Asn Gly Arg Phe Ser Gly Phe Ile Asp
        195                 200                 205
Cys Gly Arg Leu Gly Val Ala Asp Arg Tyr Gln Asp Ile Ala Leu Ala
    210                 215                 220
Thr Arg Asp Ile Ala Glu Glu Leu Gly Gly Glu Trp Ala Asp Arg Phe
225                 230                 235                 240
Leu Val Leu Tyr Gly Ile Ala Ala Pro Asp Ser Gln Arg Ile Ala Phe
                245                 250                 255
Tyr Arg Leu Leu Asp Glu Phe Phe
            260
<210>21
<211>795
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：
    新霉素突变体D227G
<400>21
atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc 60
ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca 120
gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg 180
caagacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg 240
ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag 300
gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg 360
cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc 420
atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa 480
gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgag catgcccgac 540
ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat 600
ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac 660
atagcgttgg ctacccgtgg tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc 720
ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt 780
gacgagttct tctga                                                  795
<210>22
<211>264
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：
    新霉素突变体D227G
<400>22
Met Ile Glu Gln Asp Gly Leu His Ala Gly Ser Pro Ala Ala Trp Val
  1               5                  10                  15
Glu Arg Leu Phe Gly Tyr Asp Trp Ala Gln Gln Thr Ile Gly Cys Ser
             20                  25                  30
Asp Ala Ala Val Phe Arg Leu Ser Ala Gln Gly Arg Pro Val Leu Phe
         35                  40                  45
Val Lys Thr Asp Leu Ser Gly Ala Leu Asn Glu Leu Gln Asp Glu Ala
     50                  55                  60
Ala Arg Leu Ser Trp Leu Ala Thr Thr Gly Val Pro Cys Ala Ala Val
 65                  70                  75                  80
Leu Asp Val Val Thr Glu Ala Gly Arg Asp Trp Leu Leu Leu Gly Glu
                 85                  90                  95
Val Pro Gly Gln Asp Leu Leu Ser Ser His Leu Ala Pro Ala Glu Lys
            100                 105                 110
Val Ser Ile Met Ala Asp Ala Met Arg Arg Leu His Thr Leu Asp Pro
        115                 120                 125
Ala Thr Cys Pro Phe Asp His Gln Ala Lys His Arg Ile Glu Arg Ala
    130                 135                 140
Arg Thr Arg Met Glu Ala Gly Leu Val Asp Gln Asp Asp Leu Asp Glu
145                 150                 155                 160
Glu His Gln Gly Leu Ala Pro Ala Glu Leu Phe Ala Arg Leu Lys Ala
                165                 170                 175
Ser Met Pro Asp Gly Glu Asp Leu Val Val Thr His Gly Asp Ala Cys
            180                 185                 190
Leu Pro Asn Ile Met Val Glu Asn Gly Arg Phe Ser Gly Phe Ile Asp
        195                 200                 205
Cys Gly Arg Leu Gly Val Ala Asp Arg Tyr Gln Asp Ile Ala Leu Ala
    210                 215                 220
Thr Arg Gly Ile Ala Glu Glu Leu Gly Gly Glu Trp Ala Asp Arg Phe
225                 230                 235                 240
Leu Val Leu Tyr Gly Ile Ala Ala Pro Asp Ser Gln Arg Ile Ala Phe
                245                 250                 255
Tyr Arg Leu Leu Asp Glu Phe Phe
            260
<0210>23
<211>795
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：
    新霉素突变体D190G
<400>23
atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc 60
ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca 120
gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg 180
caagacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg 240
ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag 300
gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg 360
cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc 420
atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa 480
gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgag catgcccgac 540
ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcggt gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat 600
ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac 660
atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc 720
ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt 780
gacgagttct tctga                                                  795
<210>24
<211>264
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：
    新霉素突变体D190G
<400>24
Met Ile Glu Gln Asp Gly Leu His Ala Gly Ser Pro Ala Ala Trp Val
  1               5                  10                  15
Glu Arg Leu Phe Gly Tyr Asp Trp Ala Gln Gln Thr Ile Gly Cys Ser
             20                  25                  30
Asp Ala Ala Val Phe Arg Leu Ser Ala Gln Gly Arg Pro Val Leu Phe
         35                  40                  45
Val Lys Thr Asp Leu Ser Gly Ala Leu Asn Glu Leu Gln Asp Glu Ala
    50                  55                  60
Ala Arg Leu Ser Trp Leu Ala Thr Thr Gly Val Pro Cys Ala Ala Val
 65                  70                  75                  80
Leu Asp Val Val Thr Glu Ala Gly Arg Asp Trp Leu Leu Leu Gly Glu
                 85                  90                  95
Val Pro Gly Gln Asp Leu Leu Ser Ser His Leu Ala Pro Ala Glu Lys
            100                 105                 110
Val Ser Ile Met Ala Asp Ala Met Arg Arg Leu His Thr Leu Asp Pro
        115                 120                 125
Ala Thr Cys Pro Phe Asp His Gln Ala Lys His Arg Ile Glu Arg Ala
    130                 135                 140
Arg Thr Arg Met Glu Ala Gly Leu Val Asp Gln Asp Asp Leu Asp Glu
145                 150                 155                 160
Glu His Gln Gly Leu Ala Pro Ala Glu Leu Phe Ala Arg Leu Lys Ala
                165                 170                 175
Ser Met Pro Asp Gly Glu Asp Leu Val Val Thr His Gly Gly Ala Cys
            180                 185                 190
Leu Pro Asn Ile Met Val Glu Asn Gly Arg Phe Ser Gly Phe Ile Asp
        195                 200                 205
Cys Gly Arg Leu Gly Val Ala Asp Arg Tyr Gln Asp Ile Ala Leu Ala
    210                 215                 220
Thr Arg Asp Ile Ala Glu Glu Leu Gly Gly Glu Trp Ala Asp Arg Phe
225                 230                 235                 240
Leu Val Leu Tyr Gly Ile Ala Ala Pro Asp Ser Gln Arg Ile Ala Phe
                245                 250                 255
Tyr Arg Leu Leu Asp Glu Phe Phe
            260
<210>25
<211>795
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：
    新霉素突变体D208G
<400>25
atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc 60
ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca 120
gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg 180
caagacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg 240
ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag 300
gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg 360
cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc 420
atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa 480
gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgag catgcccgac 540
ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat 600
ggccgctttt ctggattcat cggctgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac 660
atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc 720
ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt 780
gacgagttct tctga                                                  795
<210>26
<211>264
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明
    新霉素突变体D208G
<400>26
Met Ile Glu Gln Asp Gly Leu His Ala Gly Ser Pro Ala Ala Trp Val
  1               5                  10                  15
Glu Arg Leu Phe Gly Tyr Asp Trp Ala Gln Gln Thr Ile Gly Cys Ser
             20                  25                  30
Asp Ala Ala Val Phe Arg Leu Ser Ala Gln Gly Arg Pro Val Leu Phe
         35                  40                  45
Val Lys Thr Asp Leu Ser Gly Ala Leu Asn Glu Leu Gln Asp Glu Ala
 50                  55                  60
Ala Arg Leu Ser Trp Leu Ala Thr Thr Gly Val Pro Cys Ala Ala Val
 65                  70                  75                  80
Leu Asp Val Val Thr Glu Ala Gly Arg Asp Trp Leu Leu Leu Gly Glu
                 85                  90                  95
Val Pro Gly Gln Asp Leu Leu Ser Ser His Leu Ala Pro Ala Glu Lys
            100                 105                 110
Val Ser Ile Met Ala Asp Ala Met Arg Arg Leu His Thr Leu Asp Pro
        115                 120                 125
Ala Thr Cys Pro Phe Asp His Gln Ala Lys His Arg Ile Glu Arg Ala
    130                 135                 140
Arg Thr Arg Met Glu Ala Gly Leu Val Asp Gln Asp Asp Leu Asp Glu
145                 150                 155                 160
Glu His Gln Gly Leu Ala Pro Ala Glu Leu Phe Ala Arg Leu Lys Ala
                165                 170                 175
Ser Met Pro Asp Gly Glu Asp Leu Val Val Thr His Gly Asp Ala Cys
            180                 185                 190
Leu Pro Asn Ile Met Val Glu Asn Gly Arg Phe Ser Gly Phe Ile Gly
        195                 200                 205
Cys Gly Arg Leu Gly Val Ala Asp Arg Tyr Gln Asp Ile Ala Leu Ala
    210                 215                 220
Thr Arg Asp Ile Ala Glu Glu Leu Gly Gly Glu Trp Ala Asp Arg Phe
225                 230                 235                 240
Leu Val Leu Tyr Gly Ile Ala Ala Pro Asp Ser Gln Arg Ile Ala Phe
                245                 250                 255
Tyr Arg Leu Leu Asp Glu Phe Phe
            260
<210>27
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明
    寡核苷酸Neofor5
<400>27
ttccagaagt agtgaggagg c                                        21
<210>28
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：
    寡核苷酸Neorev5
<400>28
atggcaggtt gggcgtcgc                                           19
<210>29
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：
    寡核苷酸Neofor2
<400>29
gaactgttcg ccaggctcaa g                                        21
<210>30
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：
    寡核苷酸IC49
<400>30
cggcaaaatc ccttataaat ca                                       22
<210>31
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：
    寡核苷酸E182Gfor
<400>31
gacggcgggg atctcgtcgt                                          20
<210>32
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：
    寡核苷酸E182Grev
<400>32
acgacgagat ccccgccgtc                                            20
<210>33
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：
    寡核苷酸W91Afor
<400>33
gggaagggac gcgctgctat tgg                                        23
<210>34
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：
    寡核苷酸W91Arev
<400>34
ccaatagcag cgcgtccctt ccc                                        23
<210>35
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：
    寡核苷酸V198Gfor
<400>35
ccgaatatca tgggggaaaa tggc                                       24
<210>36
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：
    寡核苷酸V198Grev
<400>36
gccattttcc cccatgatat tcgg                                       24
<210>37
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明
    寡核苷酸D227Afor
<400>37
ctacccgtgc tattgctgaa g                                        21
<210>38
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：
    寡核苷酸D227Arev
<400>38
cttcagcaat agcacgggta g                                        21
<210>39
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：
    寡核苷酸D227Vfor
<400>39
ctacccgtgt tattgctgaa g                                        21
<210>40
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：
    寡核苷酸D227Vrev
<400>40
cttcagcaat aacacgggta g                                        21
<210>41
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明
    寡核苷酸D261Gfor
<400>41
gccttcttgg cgagttcttc tgag                                        24
<210>42
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：
    寡核苷酸D261Grev
<400>42
ctcagaagaa ctcgccaaga aggc                                        24
<210>43
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：
    寡核苷酸D261Nfor
<400>43
gccttcttaa cgagttcttc tgag                                        24
<210>44
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：
    寡核苷酸D261Nrev
<400>44
ctcagaagaa ctcgttaaga aggc                                        24
<210>45
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：
    寡核苷酸F240Ifor
<400>45
ggctgaccgc atcctcgtgc tt                                          22
<210>46
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：
    寡核苷酸F240Irev
<400>46
aagcacgagg atgcggtcag cc                                    22
<210>47
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：
    寡核苷酸E182Dfor
<400>47
gacggcgatg atctcgtcgt                                        20
<210>48
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：
    寡核苷酸E182Drev
<400>48
acgacgagat catcgccgtc                                        20
<210>49
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：
    寡核苷酸D190Gfor
<400>49
catggcggtg cctgct tgc                                        19
<210>50
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明
    寡核苷酸D190Grev
<400>50
gcaagcaggc accgccatg                                        19
<210>51
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：
    寡核苷酸D208Gfor
<400>51
gattcatcgg ctgtggccg                                    19
<210>52
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：
    寡核苷酸D208Grev
<400>52
cggccacagc cgatgaatc                                    19
<210>53
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：
    寡核苷酸D227Gfor
<400>53
ctacccgtgg tattgctgaa g                                 21
<210>54
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：
    寡核苷酸D227Grev
<400>54
cttcagcaat accacgggta g                                 21
<210>55
<211>2406
<212>DNA
<213>中国仓鼠(Cricetulus griseus)
<300>
<310>PCT/EP/96/04631
<311>1996-10-24
<312>1997-05-01
<400>55
gatctccagg acagccatgg ctattacaca gagaaaccct gtctggaaaa acaaaaaatt 60
agtgtccatg tgtaaatgtg tggagtatgc ttgtcatgcc acatacagag gtagagggca 120
gtttatggga gtcagttcct attcttcctt tatgggggac ctggggactg aactcaggtc 180
atcaggcttg gcagaaagtg cattagctca cggagcctta tcattggcga aagctctctc 240
aagtagaaaa tcaatgtgtt tgctcatagt gcaatcatta tgtttcgaga ggggaagggt 300
acaatcgttg gggcatgtgt ggtcacatct gaatagcagt agctccctag gagaattcca 360
agttctttgg tggtgtatca atgcccttaa aggggtcaac aacttttttt ccctctgaca 420
aaactatctt cttatgtcct tgtccctcat atttgaagta ttttattctt tgcagtgttg 480
aatatcaatt ctagcacctc agacatgtta ggtaagtacc ctacaactca ggttaactaa 540
tttaatttaa ctaatttaac cccaacactt tttctttgtt tatccacatt tgtggagtgt 600
gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgc 660
gcgcgcgcgc gcgctcggat cattctacct tttgtttaaa aaatgttagt ccaggggtgg 720
ggtgcactgt gaaagtctga gggtaacttg ctggggtcag ttctttccac tataggacag 780
aactccaggt gtcaactctt tactgacaga accatccaaa tagccctatc taattttagt 840
tttttattta tttatttttt gtttttcgag acagggtttc tctgtggctt tggaggctgt 900
cctggaacta gctcttgtag accaggctgg tctcgaactc agagatccac ctgcctctgc 960
ctcctgagtg ctgggattaa aggcatgcgc caccaacgct tggctctacc taattttaaa 1020
agagattgtg tgtcacaagg gtgtcatgtc gccctgcaac cacccccccc ccaaaaaaaa 1080
aaaaaaaaaa acttcactga agctgaagca cgatgatttg gttactctgg ctggccaatg 1140
agctctaggg agtctcctgt caaacagaat ctcaacaggc gcagcagtct tttttaaagt 1200
ggggttacaa cacaggtttt tgcatatcag gcattttatc taagctattt cccagccaaa 1260
aatgtgtatt ttggaggcag cagagctaat agattaaaat gagggaagag cccacacagg 1320
ttattaggaa gataagcatc ttctttatat aaaacaaaac caaaccaaac tggaggaggt 1380
ctacctttag ggatggaaga aaagacattt agagggtgca atagaaaggg cactgagttt 1440
gtgaggtgga ggactgggag agggcgcaac cgctttaact gtcctgtttt gcctattttt 1500
tggggacagc acatgttcct atttttccca ggatgggcaa tctccacgtc caaacttgcg 1560
gtcgaggact acagtcattt tgcaggtttc cttactgtat ggcttttaaa acgtgcaaag 1620
gtgaccatta accgtttcac gctgggaggg cacgtgcggc tcagatgctt cctctgactg 1680
agggccagga gggggctaca cggaagaggc cacacccgca cttgggaaga ctcgatttgg 1740
gcttcagctg gctgagacgc cccagcaggc tcctcggcta caccttcagc cccgaatgcc 1800
ttccggccca taacccttcc cttctaggca tttccggcga ggacccaccc tcgcgccaaa 1860
cattcggccc catcccccgg tcctcacctg aatctctaac tctgactcca gagtttagag 1920
actataacca gatagcccgg atgtgtggaa ctgcatcttg ggacgagtag ttttagcaaa 1980
aagaaagcga cgaaaaacta caattcccag acagacttgt gttacctctc ttctcatgct 2040
aaacaagccc cctttaaagg aaagcccctc ttagtcgcat cgactgtgta agaaaggcgt 2100
ttgaaacatt ttaatgttgg gcacaccgtt tcgaggaccg aaatgagaaa gagcataggg 2160
aaacggagcg cccgagctag tctggcactg cgttagacag ccgcggtcgt tgcagcgggc 2220
aggcacttgc gtggacgcct aaggggcggg tctttcggcc gggaagcccc gttggtccgc 2280
gcggctcttc ctttccgatc cgccatccgt ggtgagtgtg tgctgcgggc tgccgctccg 2340
gcttggggct tcccgcgtcg ctctcaccct ggtcggcggc tctaatccgt ctcttttcga 2400
atgtag                                                            2406

Claims (47)

1. 经修饰的新霉素磷酸转移酶基因，其特征在于该经修饰的新霉素磷酸转移酶基因在相对于野生型基因的氨基酸位置91、198和/或240处编码与野生型新霉素磷酸转移酶不同的氨基酸，且所述基因用于产生并选择高产重组细胞。
2. 根据权利要求1的经修饰的新霉素磷酸转移酶基因，其特征在于由该新霉素磷酸转移酶基因编码的经修饰的新霉素磷酸转移酶具有比野生型新霉素磷酸转移酶低的酶活性。
3. 根据权利要求1或2的经修饰的新霉素磷酸转移酶基因，其特征在于与野生型基因比较，该经修饰的新霉素磷酸转移酶基因在相对于野生型基因的氨基酸位置91处编码丙氨酸，在氨基酸位置198处编码甘氨酸，和/或在氨基酸位置240处编码异亮氨酸。
4. 根据权利要求1-3中任一项的经修饰的新霉素磷酸转移酶基因，其特征在于该经修饰的新霉素磷酸转移酶基因编码具有SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：8或SEQ ID NO：18的氨基酸序列的多肽。
5. 根据权利要求1-4中任一项的经修饰的新霉素磷酸转移酶基因，其包含SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：17的序列或由这些序列组成。
6. 经修饰的新霉素磷酸转移酶基因，其特征在于与野生型基因比较，该经修饰的新霉素磷酸转移酶基因在相对于野生型基因的氨基酸位置182处编码甘氨酸，在氨基酸位置227处编码丙氨酸或缬氨酸和/或在氨基酸位置261处编码甘氨酸，且所述基因用于产生并选择高产重组细胞。
7. 根据权利要求6的经修饰的新霉素磷酸转移酶基因，其特征在于该经修饰的新霉素磷酸转移酶基因编码具有SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14的氨基酸序列的多肽。
8. 根据权利要求6或7任一项中的经修饰的新霉素磷酸转移酶基因，其包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：13的序列或由这些序列组成。
9. 一种经修饰的新霉素磷酸转移酶，由根据权利要求1-8中任一项的经修饰的新霉素磷酸转移酶基因所编码。
10. 一种真核表达载体，包含根据权利要求1-8中任一项的经修饰的新霉素磷酸转移酶基因。
11. 一种真核表达载体，所述表达载体包含功能上连接至异源启动子的异源目的基因及根据权利要求1-8任一项的经修饰的新霉素磷酸转移酶基因，所述经修饰的新霉素磷酸转移酶基因编码与野生型新霉素磷酸转移酶比较具有较低酶活性的新霉素磷酸转移酶。
12. 根据权利要求10或11的表达载体，其特征在于该经修饰的新霉素磷酸转移酶基因编码具有SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、或SEQ ID NO：18的氨基酸序列的蛋白质。
13. 根据权利要求10-12中任一项的表达载体，其特征在于所述表达载体包含功能上连接至一个或多个启动子的一个或多个增强子。
14. 根据权利要求13的表达载体，其特征在于该增强子为CMV或SV40增强子。
15. 根据权利要求10-14中任一项的表达载体，其特征在于所述表达载体包含仓鼠泛素/S27a启动子。
16. 根据权利要求15的表达载体，其特征在于该异源目的基因是在泛素/S27a启动子的控制下。
17. 根据权利要求10-16中任一项的表达载体，其特征在于所述表达载体另外包含萤光蛋白质的基因。
18. 根据权利要求17的表达载体，其特征在于萤光蛋白质的基因功能上连接至或将连接至目的基因及异源启动子。
19. 根据权利要求17或18的表达载体，其特征在于所述表达载体另外包含内部核糖体进入位点(IRES)，该位点使得编码萤光蛋白质的基因及编码目的蛋白质/产物的基因于异源启动子的控制下双顺反子表达。
20. 根据权利要求17-19中任一项的表达载体，其特征在于编码萤光蛋白质的基因及经修饰的新霉素磷酸转移酶基因位于一个或两个分开的转录单位中。
21. 一种哺乳动物细胞，其包含根据权利要求1-8中任一项的经修饰的新霉素磷酸转移酶基因。
22. 一种哺乳动物细胞，其已用根据权利要求10-16中任一项的表达载体转染。
23. 一种哺乳动物细胞，其已用根据权利要求17-20中任一项的表达载体转染。
24. 根据权利要求21-23中任一项的哺乳动物细胞，其特征在于所述哺乳动物细胞还经过可扩增的可选择标记基因转染。
25. 根据权利要求24的哺乳动物细胞，其特征在于该可扩增可选择标记的基因为二氢叶酸还原酶(DHFR)基因。
26. 根据权利要求21-25中任一项的哺乳动物细胞，其特征在于该哺乳动物细胞为啮齿类动物细胞。
27. 根据权利要求26的哺乳动物细胞，其特征在于该啮齿类动物细胞为CHO或BHK细胞。
28. 一种富集哺乳动物细胞的方法，其特征在于：
(i)将哺乳动物细胞集合体以根据权利要求1-8中任一项的经修饰的新霉素磷酸转移酶基因转染；
(ii)将哺乳动物细胞于允许表达该经修饰的新霉素磷酸转移酶基因的条件下培养；及
(iii)将哺乳动物细胞于至少一种选择剂存在下培养，所述选择剂选择性作用于哺乳动物细胞的生长，并给予该表达经修饰的新霉素磷酸转移酶基因的细胞生长优势。
29. 一种得到及选择表达至少一种异源目的基因的哺乳动物细胞的方法，其特征在于：
(i)将哺乳动物细胞集合体以至少一种目的基因及根据权利要求1-8中任一项的经修饰的新霉素磷酸转移酶基因转染；
(ii)将哺乳动物细胞于允许表达一个或多个目的基因及该经修饰的新霉素磷酸转移酶基因的条件下培养；及
(iii)将哺乳动物细胞于至少一种选择剂存在下培养，所述选择剂选择性作用于哺乳动物细胞的生长，并给予表达该经修饰的新霉素磷酸转移酶基因的细胞生长优势。
30. 根据权利要求29的方法，其特征在于将该哺乳动物细胞另外以可扩增可选择标记的基因转染。
31. 根据权利要求30的方法，其特征在于将选择的哺乳动物细胞经过至少一次基因扩增步骤。
32. 根据权利要求30或31的方法，其特征在于其中可扩增可选择标记的基因为DHFR。
33. 根据权利要求30-32中任一项的方法，其特征在于基因扩增步骤藉加入氨甲蝶呤而实施。
34. 一种得到及选择表达至少一种异源目的基因的哺乳动物细胞的方法，其特征在于
(i)将重组哺乳动物细胞以根据权利要求17-20中任一项的表达载体转化；
(ii)将细胞于允许表达一个或多个目的基因、编码萤光蛋白质的基因、及经修饰的新霉素磷酸转移酶基因的条件下培养；
(iii)将哺乳动物细胞于至少一种选择剂存在下培养，所述选择剂选择性作用于哺乳动物细胞的生长，并给予表达经该修饰的新霉素磷酸转移酶基因的细胞生长优势；及
(iv)藉流式细胞计分析将哺乳动物细胞挑选。
35. 根据权利要求34的方法，其特征在于将哺乳动物细胞另外以可扩增可选择标记的基因转染并使由流式细胞计分析拣选的细胞经历至少一次基因扩增步骤。
36. 根据权利要求35的方法，其特征在于其中可扩增可选择标记的基因为DHFR。
37. 根据权利要求35的方法，其特征在于基因扩增藉加入氨甲蝶呤而实施。
38. 一种于重组哺乳动物细胞中制备至少一种目的蛋白质的方法，其特征在于：
(i)将哺乳动物细胞集合体以至少一种目的基因及根据权利要求1-8中任一项的经修饰的新霉素磷酸转移酶基因转染；
(ii)将细胞于允许表达一个或多个目的基因及该经修饰的新霉素磷酸转移酶基因的条件下培养；
(iii)将哺乳动物细胞于至少一种选择剂存在下培养，所述选择剂选择性作用于哺乳动物细胞的生长，并给予表达该经修饰的新霉素磷酸转移酶基因的细胞生长优势；及
(iv)自哺乳动物细胞或自培养上清液得到一个或多个目的蛋白质。
39. 一种于重组哺乳动物细胞中制备至少一种目的蛋白质的方法，其特征在于
(i)将重组哺乳动物细胞以根据权利要求17-20中任一项的表达载体转染；
(ii)将细胞于允许表达一个或多个目的基因、编码萤光蛋白质的基因及经修饰的新霉素磷酸转移酶基因的条件下培养；
(iii)将哺乳动物细胞于至少一种选择剂存在下培养，所述选择剂选择性作用于哺乳动物细胞的生长，并给予表达经该修饰的新霉素磷酸转移酶基因的细胞生长优势；及
(iv)藉流式细胞计分析将哺乳动物细胞拣选；
(v)自哺乳动物细胞或自培养上清液得到一个或多个目的蛋白质。
40. 一种制备至少一种目的蛋白质的方法，其特征在于：
(i)将根据权利要求24或25中任一项的哺乳动物细胞于允许表达目的基因、经修饰的新霉素磷酸转移酶基因及可扩增可选择标记的基因的条件下培养；
(ii)将哺乳动物细胞于至少一种选择剂存在下培养和选择，所述选择剂选择性作用于哺乳动物细胞的生长，并给予表达该经修饰的新霉素磷酸转移酶基因的细胞生长优势；
(iii)将选择的哺乳动物细胞经历至少一个基因扩增步骤；及
(iv)随后自哺乳动物细胞或自培养上清液得到一个或多个目的蛋白质。
41. 根据权利要求38-40中任一项的方法，其特征在于将哺乳动物细胞以编码异聚体形式的蛋白质/产物的至少两种目的基因转染，及
(i)将细胞于允许表达所述异聚体形式的蛋白质/产物的亚单位的条件下培养；及
(ii)自培养物或培养基分离所述异聚体形式的蛋白质/产物。
42. 根据权利要求38-41中任一项的方法，其特征在于拣选出的哺乳动物细胞呈现平均特异性生产率多于5pg一个或多个所需基因产物/每天每个细胞。
43. 根据权利要求40或41的方法，其特征在于拣选出的宿主细胞呈现平均特异性生产率多于20pg一个或多个所需基因产物/每天每个细胞。
44. 根据权利要求28至43中任一项的方法，其特征在于该哺乳动物细胞为啮齿类动物细胞。
45. 根据权利要求44的方法，其特征在于该啮齿类动物细胞为CHO或BHK细胞。
46. 根据权利要求28-45中任一项的方法，其特征在于将哺乳动物细胞于悬浮培养中培养。
47. 根据权利要求28-46中任一项的方法，其特征在于将哺乳动物细胞无血清培养。
HK06105904.8A 2002-11-29 2003-11-25 新霉素磷酸转移酶基因及选择高产重组细胞的方法 HK1086031B (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10256081.1 2002-11-29
DE10256081 2002-11-29
DE10330686.2 2003-07-08
DE10330686A DE10330686A1 (de) 2002-11-29 2003-07-08 Neue Neomycin-Phosphotransferase-Gene und Verfahren zur Selektion von Hochproduzierenden rekombinanten Zellen
PCT/EP2003/013203 WO2004050884A2 (de) 2002-11-29 2003-11-25 Neue neomycin-phosphotransferase-gene und verfahren zur selektion von hochproduzierenden rekombinanten zellen

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HK1086031A1 HK1086031A1 (zh) 2006-09-08
HK1086031B true HK1086031B (zh) 2008-12-24

Family

ID=

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101149777B1 (ko) 신규한 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자 및 고생산성 재조합 세포의 선별 방법
US7732181B2 (en) Neomycin-phosphotransferase-genes and methods for the selection of recombinant cells producing high levels of a desired gene product
US20090162900A1 (en) Expression vector, methods for the production of heterologous gene products and for the selection of recombinant cells producing high levels of such of such products
US9708626B2 (en) Regulatory nucleic acid elements
CA2507714A1 (en) Expression vector, methods for the production of heterologous gene products and for the selection of recombinant cells producing high levels of such products
HK1086031B (zh) 新霉素磷酸转移酶基因及选择高产重组细胞的方法
HK1086031A1 (zh) 新霉素磷酸转移酶基因及选择高产重组细胞的方法
NZ540851A (en) Novel neomycin phosphotransferase genes and method for the selection of high-producing recombinant cells
NZ540950A (en) Expression vector, methods for the production of heterologous gene products, and selection method for high-producing recombinant cells
HK1086030A (zh) 表达载体、异源基因产物的制备方法以及高产重组细胞的选择方法
HK1134107B (zh) 调控性核酸元件