HK1085615B - 來源於真菌的脂肪酸脫氫酶 - Google Patents

Description

来源于真菌的脂肪酸脱氢酶

发明背景

本申请要求申请号为60/382,391、申请日为2002年5月22日，以及申请号为60/453,125、申请日为2003年3月7日的美国临时专利申请的优先权。特别将上述每个申请公开的全部内容都作为本申请的参考。

1.发明领域

本发明主要涉及调节长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA’s)中双键的数目和位置的脱氢酶、及其使用方法和组合物。特别的是，本发明涉及利用脱氢酶改善脂肪酸的特性和在真菌中已确定的编码这些脱氢酶的核酸。

2.相关技术的描述

在绝大多数有机体中，脂肪酸生物合成的主要产物是16-和18-碳的化合物。这些脂肪酸的链长度与不饱和程度的相对比率随物种不同而相差很大。例如哺乳动物主要产生饱和的和单饱和的脂肪酸，然而绝大多数高等植物产生含有一个、两个或三个双键的脂肪酸，后面两个就包括多不饱和脂肪酸(PUFA’s)。

PUFA’s的两种主要类别是Ω-3脂肪酸(也用“n-3”脂肪酸代表)，以二十碳五烯酸为例(EPA，20:4，n-3)；以及Ω-6脂肪酸(也用“n-6”脂肪酸代表)，以花生四烯酸为例(ARA，20:4，n-6)为例。PUFAs是细胞质膜和脂肪组织的重要成分，其中它们各自以磷脂和甘油三酯的形式存在。PUFAs对于哺乳动物的正常发育，特别是对婴儿大脑的发育以及组织的形成、修复来说是必需的。

脂肪酸能够治疗一些疾病。已经表明补充PUFAs可降低血管成形术后的再狭窄比率。也有文献详细报道了某些食用的Ω-3脂肪酸对心血管疾病和类风湿性关节炎的有益效果(Simopoulos，1997；James etal.，2000)。此外，PUFAs已被建议用来治疗哮喘和牛皮癣。有证据表明PUFAs可能参与了钙代谢，这提示PUFAs可以用于治疗或预防骨质疏松和肾或尿路结石。有益于健康的主要证据来自于长链Ω-3脂肪，鱼和鱼油中的EPA和DHA。基于这些证据，加拿大(ScientificReview Committee，1990，Nutrition Recommendations，Minister ofNational Health and Welfare，Canada，Ottowa)、欧洲(de Deckereret al.，1998)、英国(The British Nutrition Foundation，1992，Unsaturatedfatty-acids-nutritional and physiological significance：The report of theBritish Nutrition Foundation’s Task Force，Chapman and Hall，London)和美国(Simopoulos et al.，1999)的健康机构和营养学家已建议提高膳食中这些PUFAs的用量。

PUFAs也可用来治疗糖尿病(U.S.Pat.No.4,826,877；Horrobin etal.，1993)。已经证实在糖尿病动物中，脂肪酸代谢和组成发生了改变。这提示这些改变与一些糖尿病引起的长期并发症，包括视网膜病、神经病、肾病和生殖系统损伤有关。含有GLA的樱草油已显示出能够预防和治疗糖尿病神经损伤。

PUFAs，例如亚油酸(LA，18:2，Δ9，12)和α-亚油酸(ALA，18:3，Δ9，12，15)，被认为是饮食中必需的脂肪酸，因为哺乳动物缺少合成这些酸的能力。然而哺乳动物有能力将摄取的LA和ALA代谢成长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)中n-6和n-3的形式。这些LC-PUFA’s是重要的细胞成分，其作为调节正常生理功能的生物活性类二十烷的前体，如前列腺素、环前列腺素和白细胞三烯，赋予膜的流动性和功能性。

在哺乳动物中，LC-PUFA的形成的限速步骤是Δ6脱氢化，其中将LA转化为γ-亚油酸(GLA，18:3，Δ6，9，12)，将ALA转变为SDA(18:4，Δ6，9，12，15)。已经表明许多生理和病理状况能抑制该代谢步骤，最终抑制LC-PUFA的生成。然而，通过饮食补充EPA或DHA而避开Δ6脱氢化可以有效的缓解许多与PUFA低水平有关的病理性疾病。然而，如下面更详细的阐述，由于多种原因，目前可使用PUFA的来源是不令人满意的。对于一个可靠的和经济的PUFA’s的来源的需要已引发了对PUFA’s的可供选择的来源的兴趣。

重要的长链PUFAs主要包括主要在不同类型的鱼油中发现的二十二碳六烯酸(DHA，22:6，n-3)和EPA，以及在丝状真菌中发现的花生四烯酸(ARA，20:4，n-6)。对DHA而言，已有的多种用于商业化生产的来源包括多种的海洋有机体、冷水海洋鱼类的油和蛋黄部分。商业化生产SDA的来源包括Trichodesma和Echium属。然而，由天然来源进行商业化生产PUFAs有几个缺点。PUFAs的天然来源，例如动物和植物，往往具有很高的不同种类的油组成。例如，从Echinm种子中获得的油，除了SDA以外，几乎含有相当水平的Ω-6脂肪酸GLA。因此从这些来源中得到的油需要进一步纯化以分离得到一种或多种的目标PUFAs或生产富含一种或多种PUFA的油。

天然来源的PUFAs在可用性方面也遭遇了无法控制的波动。鱼群有可能经历自然的变动或可能由于捕捞过度而耗尽。此外，即使有大量证据表明它们的治疗效果，关于Ω-3脂肪酸饮食的推荐并没有引起注意。鱼油具有不可能从目标产物中经济地去除的令人不愉快的味道和气味，使这些产品不能作为食品添加剂被接受。动物油，特别是鱼油，能够造成环境污染物累积。食物可以添加鱼油，但是需再次指出的是，由于成本和世界范围的鱼群衰减，这种添加也是有问题的。问题还在于消耗和摄取全鱼是有困难的。虽然如此，如果增加鱼的食用量的健康信息被社会所接受，满足鱼的需求就很可能成为问题。此外，问题还在于这个产业持续发展能力严重依赖于用于水产饲养的野生鱼群(Naylor et al.，2000)。

其它的自然限制促使寻找一种新的生产Ω-3脂肪酸的方法。气候和疾病能够造成依靠鱼和植物资源的产量的波动。用于交替的产油农作物生长的农田正面临着竞争，竞争来自于人口持续扩增和相应的对在现存的可耕土地上生产食物的需求增加。农作物确实产生PUFAs，例如琉璃苣，但不适合进行商业化生产，不能很好的实施单一种植。与利润更大、更易于种植的农作物相比，种植这种农作物不具备经济上的竞争性。大规模发酵如Mortierella的生物体的费用也是昂贵的。天然的动物组织含有少量的ARA并且难以加工处理。微生物如Porphyidium和Mortierella很难进行商业规模的培养。

许多酶参与PUFA生物合成。通过Δ12-脱氢酶由油酸(OA，18:1，Δ9)生成LA(18:2，Δ9，12)，而通过Δ15去饱和酶由LA生成ALA(18:3)。通过Δ6去饱和酶由LA和ALA生成SDA(18:4，Δ6，9，12，15)和GLA(18:3，Δ6，9，12)。然而，如上所述，哺乳动物不能在比Δ9位更远的位置上脱氢化，因此不能将油酸转变成LA。同样的，哺乳动物不能合成ALA。其它真核生物，包括真菌和植物，含有在碳12和碳15的位置上脱氢的酶。因此动物中的大多数多不饱和脂肪酸来自于饮食并通过随后的脱氢化和饮食中的LA和ALA的延长获得的。

U.S.Pat.No.5,952,544描述了从Brassica napus中分离和克隆的编码脂肪酸脱氢酶的核酸片段。‘544专利的核酸片段的表达在植物中进行，结果积累ALA。然而，在表达植物Δ15-脱氢酶的转基因植物中，大量的LA仍然没有被脱氢酶转化。可以将更多的LA转变成ALA的活性更好的酶将是很有利的。增加从LA到ALA的转化可以产生更大量的ALA。当与编码Δ15-脱氢酶的核酸共表达时，升高的ALA的水平会促使Δ6-脱氢酶作用于ALA，从而产生更高水平的SDA。由于使用SDA的多种有益作用，需要大幅度提高SDA产量。已经在各种来源的核酸进行探索以提高SDA产量。然而仍只能很大程度寄期望于改善土地上的农作物的商业化生产的革新(见，e.g.，Reed et al.，2000)。此外，使用来源于Caenorhabditis elegans(Meesapyodsuk et al.，2000)的脱氢酶多核苷酸对于富集的植物种子油的商业化生产是不理想的。

编码Δ15-脱氢酶的核酸已从蓝藻目和植物的几个种中分离，包括拟南芥、大豆和欧芹。这些脱氢酶推断的氨基酸序列显示高度的相似性，最显著的是在被认为参与铁结合的3个富集组氨酸的基序区域，这不受任何一个理论限制。然而，从任何一种真菌中都没有分离到Δ15-脱氢酶。此外，即使将几种真菌的基因组测序，使用复杂的运算法则，利用已知的Δ15-脱氢酶cDNA和氨基酸序列在Aspergillus以及NeurosporaDNA数据库比对也没有发现Δ15-脱氢酶。

因此，获得参与PUFA生物合成的遗传物质和在植物体系，特别是在地面生长的陆地农作物体系中表达分离的物质是有利的，此体系能够提供商业化产量的一种或多种PUFA’s。由于需要增加人和动物Ω-3脂肪的摄取量，需要提供多种的富含Ω-3的食品和食品添加剂，从而使人们可以选择饲料、饲料成分、食品和食品配料来满足他们的日常饮食习惯。目前，只有一种Ω-3脂肪酸，ALA，可在植物油中获得。然而，摄取的ALA只有少量转变成如EPA和DHA的长链Ω-3脂肪酸。这一点在未结案的美国申请10/384,639“炎症紊乱的治疗和预防”中证实，通过使用亚麻子油将人均ALA摄取量从1克/每天提高到14克/每天，只是适度增加了胞质磷脂EPA的水平。ALA摄取量增加14倍只造成胞质磷脂EPA增加2倍(Manzioris et al.，1994)。

因此，最终还需要利用脂肪酸脱氢酶、编码它们的基因和产生它们的重组方法高效和商业化可实施的生产PUFAs。需要生产含有相对比例更高的和/或富含特定PUFA’s的油，含有它们的食品组合物和添加剂。也需要发现产生特定PUFA’s的可靠的经济的方法。

尽管如上所述低效率和低产量，通过陆生食物链生产Ω-3脂肪酸，特别是生产SDA还是一项对公共健康有益的事业。如上所述，只有少量ALA转变成EPA，因此SDA特别重要。这是因为在这三种酶促反应过程中(需要Δ6，Δ12，和Δ15)，起始酶Δ6-脱氢酶在人体中活性很低，限制了速度。Δ6-脱氢酶限制速度的证据来自于证明了在小鼠和大鼠中转化其底物ALA，要比转化其产物SDA到EPA的效率更低的研究(Yamazaki et al.，1992；Huang，1991)。

基于这些研究，表明在商业化含油种子农作物，例如双低油菜、大豆、玉米、向日葵、红花或亚麻中，将它们种子油中典型的单和多不饱和脂肪酸的某一部分转变成SDA，需要多种脱氢酶的种子特异性的表达，包括Δ6-和Δ12并且有Δ15-脱氢酶活性的酶。来自于Δ6、Δ12和Δ15-脱氢酶表达水平提高的植物的油中富含SDA和其它Ω-3脂肪酸。这些油可以用来生产富含Ω-3脂肪酸的食品和食品添加剂，并且消耗这样的食品可有效的提高组织中EPA和DHA的水平。完全用富含Ω-3的油制作和准备的食品和食品原料，如牛奶、人造黄油和香肠将产生治疗性的益处。已显示人们不改变饮食习惯，利用富含Ω-3脂肪酸的食品可摄取相当于每天至少1.8克EPA和DHA的Ω-3(Naylor，supra.)。因此，非常需要新的Δ15-脱氢酶的核酸用于转基因农作物中以制备富含PUFAs的油。需要富含PUFAs，特别是如十八碳四烯酸的Ω-3脂肪酸的新植物种子油。

发明概述

一方面，本发明提供了编码能在脂肪酸分子碳15位脱氢的多肽(Δ15-脱氢酶)的分离的核酸。这些可用来转化细胞或改善植物或植物产生的油的脂肪酸组成。本发明的一个实施方案是从具有独特的脱氢酶活性的真菌种中分离的分离的多核苷酸序列。该分离的多核苷酸优选从属于选自由接合菌门(zygomycota)，担子菌门(basidiomycota)和子囊菌门(ascomycota)组成的组中的一个门中的真菌种中分离。在某些实例中，分离的多核苷酸是从选自由粗糙脉孢菌(粗糙链孢霉)，构巢曲霉(构巢曲霉)和灰霉(灰葡萄孢)构成的组中的真菌种中分离的。

另一方面，本发明提供选自下列的分离的多核苷酸：(a)编码SEQID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：34的多肽的多核苷酸；(b)含有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：33的核酸序列的多核苷酸；(c)与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：4或SEQ ID NO：33或其互补物中的一种或多种，在5×SSC、50％甲酰胺和42℃条件下杂交的多核苷酸；和(d)编码带有至少一个下列氨基酸基序的多肽的真菌多核苷酸：

TrpIleLeuAlaHisGluCysGlyHisGlyAlaSerPhe(WILAHECGHGASF)(SEQ IDNO：6)；LeuAlaHisGluCysGlyHis(LAHECGH)(SEQ ID NO：7)；HisSerPheLeuLeuValProTyrPheSerTrpLys(HSFLLVPYFSWK)(SEQ ID NO：8)；LeuLeuValProTyrPheSerTrpLys(LLVPYFSWK)(SEQ ID NO：9)；His(His/Ala)ArgHisHisArg(Phe/Tyr)ThrThr(H(H/A)RHHR(F/Y)TT)(SEQ ID NO：10，SEQ IDNO：19，SEQ ID NO：20，或SEQ ID NO：21)；TrpValHisHisTrpLeuValAlaIleThrTyrLeu(His/Gln)HisThrHis(WVHHWLVAITYL(H/Q)HTH)(SEQ ID NO：11)；AlaIleThrTyrLeu(His/Gln)HisThr(AITYL(H/Q)HT)(SEQ ID NO：12)；GlyAlaLeuAlaThrValAspArg(GALATVDR)(SEQ ID NO：13)或HisValValHisHisLeuPheXaaArgIleProPheTyr(HVVHHLFXRIPFY)(SEQ ID NO：14 or SEQID NO：22).

然而，在另一方面，本发明提供含有本发明所述的分离的多核苷酸的重组载体。在这里使用术语“重组载体”，包括任何一种希望将它引入到一个宿主细胞、组织和/或有机体中的DNA重组片段，特别包括从起始多核苷酸分离的表达盒。重组载体可以是线性的或环状的。在各种不同的方面，重组载体可以包含至少一个从下组中选择的额外的序列：与多核苷酸可操作性连接的调控序列；与多核苷酸可操作性连接的筛选标记；和多核苷酸可操作性连接的标记序列；和多核苷酸可操作性连接的纯化部分；和多核苷酸可操作性连接的靶序列。

在另一方面，本发明提供用本发明的多核苷酸转化的细胞，例如哺乳动物、植物、昆虫、酵母和细菌细胞。在进一步实施方案中，使用除本发明的多核苷酸之外还含有结构性和组织特异性启动子的重组载体转化细胞。在本发明某些特定实例中，这些细胞被进一步限定为被编码多肽的核酸序列转化，该多肽具有在脂肪酸碳6位上脱氢的脱氢酶活性。

在另一方面，本发明提供具有在脂肪酸分子碳15位脱氢的脱氢酶活性的多肽，包括片段和蛋白。在本发明的一个实例中，多肽含有至少一种下列氨基酸基序：

TrpIleLeuAlaHisGluCysGlyHisGlyAlaSerPhe(WILAHECGHGASF)(SEQ ID NO：6)；LeuAlaHisGluCysGlyHis(LAHECGH)(SEQ ID NO：7)；HisSerPheLeuLeuValProTyrPheSerTrpLys(HSFLLVPYFSWK)(SEQ ID NO：8)；LeuLeuValProTyrPheSerTrpLys(LLVPYFSWK)(SEQ ID NO：9)；His(His/Ala)ArgHisHisArg(Phe/Tyr)ThrThr(H(H/A)RHHR(F/Y)TT)(SEQ ID NO：10，SEQ IDNO：19，SEQ ID NO：20，或SEQ ID NO：21)；TrpValHisHisTrpLeuValAlaIleThrTyrLeu(His/Gln)HisThrHis(WVHHWLVAITYL(H/Q)HTH)(SEQ ID NO：11)；AlaIleThrTyrLeu(His/Gln)HisThr(AITYL(H/Q)HT)(SEQ ID NO：12)；GlyAlaLeuAlaThrValAspArg(GALATVDR)(SEQ ID NO：13)或HisValValHisHisLeuPheXaaArgIleProPheTyr(HVVHHLFXRIPFY)(SEQ ID NO：14 or SEQID NO：22).

在进一步的实施方案中，多肽进一步被限定为含有所有上述氨基酸基序。本发明也提供含有SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5，或SEQ IDNO：34的氨基酸序列的真菌多肽或其片段，其具有在脂肪酸分子碳15位脱氢的脱氢酶活性。

另一方面，本发明提供一种由植物种子中生产含Ω-3脂肪酸的种子油的方法，包括步骤(a)获得本发明所述植物的种子；和(b)从所述种子中提取油。这些植物种子包括双低油菜、大豆、黄豆、油菜籽、向日葵、棉花、可可豆、花生、红花、椰子、亚麻、油椰子、油籽油菜和玉米。优选的转化这些植物细胞的方法包括使用农杆菌的Ti和Ri质粒、电穿孔和高速弹道轰击。

另一方面，提供了包括向一种产油植物中引入本发明所述的重组载体，而生产含有改变了的Ω-3脂肪酸水平的种子油的植物的方法。在此方法中，导入重组载体可以包括植物的栽培以及步骤：(a)用重组载体转化植物细胞；和(b)由所述植物细胞再生植物，其中植物的Ω-3脂肪酸水平被改变。在此方法中，植物可以从包括例如拟南芥、油籽芸苔属、油菜籽、向日葵、红花、双低油菜、玉米、大豆、棉花、亚麻、加州希蒙得木、中国乌桕树、烟草、可可豆、花生、果树，柑桔类植物、产生坚果和浆果的植物组成的组中选择。该植物可以被进一步限定为用编码具有在脂肪酸分子碳6位脱氢的脱氢酶活性的多肽的核酸序列转化，并且植物中SDA的含量增加。此方法也可以进一步包括将重组载体引入到多种产油植物中，筛选遗传了具有预期的Ω-3脂肪酸特性的植物重组载体的植物或子代。

另一方面，本发明提供一种内源的双低油菜籽油，其SDA含量从大约8％到约27％，油酸的含量从大约40％到约70％。在某些实例中，双低油菜籽油可以进一步限定为含有小于10％的混合的ALA酸、LA和GLA。该油包含SDS含量还可以进一步限定为从大约10％到约20％，包括从约12％到约20％，大约15％到约20％，约10％到约17％，约12％到约17％。在本发明的进一步的实施方案中，双低油菜籽油的油酸含量可以进一步限定为从大约45％到约65％，包括从约50％到约65％，大约50％到约60％，约55％到约65％。在本发明更进一步的实施方案中，SDA的含量进一步限定为从大约12％到约17％，油酸含量进一步限定为从大约55％到约65％。在一个具体的实例中，该双低油菜籽油来自于欧洲油菜(Brassica napus)或芜菁(Brassica rapa)种子。在某些实例中，提供的油中Ω-6与Ω-3脂肪酸的比率是从约1∶1到约1∶4，包括从约1∶2到约1∶4。

另一方面，本发明提供一种提高人和动物消耗的可食用产品的营养价值的方法，包括将本发明提供的双低油菜籽油添加到可食用产品中。在具体实例中，产品是人和/或动物的食品。可食用产品也可以是动物饲料和/或食品添加剂。在该方法中，双低油菜籽油可以提高可食用产品的SDA含量和/或降低可食用产品中Ω-6与Ω-3脂肪酸的比率。可食用食品可以在添加双低油菜籽油之前缺少SDA。

另一方面，本发明提供生产食品或饲料的方法，包括将本发明提供的双低油菜籽油添加到原料食品或饲料成分中生产食品和饲料。在某些的实例中，本方法被进一步限定为生产食品和/或饲料的方法。本发明也提供由本方法制成的食品或饲料。

另一方面，本发明包括向人和动物提供SDA的方法，包括给予所述人或动物权利要求1所述的双低油菜籽油。在本方法中，双低油菜籽油可以以可食用的组合物的形式给予，其包括食品或饲料。食品的例子包括饮料、浸渍食品、沙司、调味品、色拉调料、果汁、糖浆、甜点、糖衣和饼馅、软冷冻品、甜食或中间食品。可食用组合物可以基本上是液体或固体。可食用组合物也可以是食品添加剂和/或保健品。在本方法中，可以给予人和/或动物双低油菜籽油。给予油的动物的例子可以包括家畜或家禽。

附图简述

下述附图构成了本说明书的一部分并且进一步证明本发明的某些方面。通过参考一个或多个这些图并结合在此记载的特定实例的详细描述可以更好的理解本发明。从下列图的描述中可以更充分的理解本发明：

图1显示在pCR2.1盒(pMON67004)中真菌Δ15-脱氢酶NcD15D的编码区域。

图2显示在酵母表达载体pYES2.1(pMON77208)中真菌Δ15-脱氢酶NcD15D的编码区域。

图3显示在200个半个种子中(种子被分成两半)ALA的水平，按ALA从最低到最高的次序。

图4显示得到质粒pMON77214和pMON77217的流程图或质粒图谱。

图5显示脱氢酶多肽包括N.crassaΔ15-脱氢酶的典型系统树图。

图6显示典型的脱氢酶多肽与N.crassaΔ15-脱氢酶的序列比对结果。

图7A-7H显示制备构建体的质粒图。

发明详述

本发明通过提供制备具有改善的PUFA含量的植物的方法和组合物，克服了现有技术的局限性。对例如植物的有机体中脂肪酸含量的调整产生有许多益处，包括对营养和健康有益的改善。调整脂肪酸含量可用来在植物、植物的部分和植物产品、包括植物种子油中获得预期的有益的PUFA’s的水平或状况。例如，当在植物的种子组织中产生预期的PUFA’s时，可以从特定的种子中分离出油，从而得到高含量的预期的PUFAs的油或具有预期的脂肪酸含量或状况的油，它们随后可以用来提供食品原料和其它产品有益的特性。本发明特别提供含有SDA和有益油酸含量的内源性双低油菜籽油。

本发明的不同方面包括调整细胞PUFA含量的方法和组合物，例如，调整植物细胞的PUFA含量。与本发明相关的组合物包括新分离的多核苷酸序列、多核苷酸构建体和用本发明的多核苷酸转化的植物和/或植物的部分。该分离的多核苷酸可以编码真菌脂肪酸脱氢酶和特别的是可以编码真菌Δ15-脱氢酶。可以使用宿主细胞来表述编码催化脂肪酸脱氢的脱氢酶多肽的多核苷酸。

本发明的一些方面包括各种各样的脱氢酶多肽和其编码多核苷酸。本发明的不同实施方式为可以将脱氢酶多核苷酸及其编码的特异性依赖宿主细胞的多肽、底物的可用性，以及目标终产物联合起来应用。“脱氢酶”是指一种多肽，它能使一个或多个脂肪酸的连续碳原子之间脱氢或催化双键形成，而产生单或多-不饱和脂肪酸或其前体。特别值得注意的是能够催化硬脂酸转变成油酸，油酸转变成LA，LA转变成ALA，或ALA转变成SDA的多肽，其中包括了在12，15或6位脱氢的酶。术语“多肽”是指任何氨基酸链，不考虑其长度或翻译后的修饰(例如，糖基化或磷酸化)。选择一种具有脱氢酶活性的特定的多肽要考虑但不局限于多肽的最适pH，是否多肽是限速酶或其成分，是否使用的脱氢酶是预期的PUFA的合成所必需的，和/或多肽所需要的辅助因子。表达的多肽优选具有与其在宿主细胞的位置上的生化环境相容的特性。例如，多肽或许不得不竞争底物。

对多肽的Km和特异性活性的分析可以用来决定一种指定的多肽是否适合在指定宿主细胞中调整PUFAs的生产、水平或状况。在特定情况下使用的多肽是一种可以在预期的宿主细胞中已有条件下发挥特异性作用的多肽，然而在其他方面，在此还可以探讨任何具有预期的特性或能够修饰预期的PUFA(s)相应生产、水平或性质或任何其它预期性状的脱氢酶多肽。表达的酶的底物可以由宿主细胞产生或由外源提供。为了实现表达，本发明的多肽通过下述的多核苷酸编码。

本发明者已分离和制备了真菌来源的显示Δ15-脱氢酶活性的酶。真菌来源包括但不局限于曲霉属(Aspergillus)，例如构巢曲霉；葡萄孢属(Botrytis)，例如灰葡萄孢；链孢酶属(Neurospora)，例如粗糙链孢菌；以及其它的显示Δ15-脱氢酶活性的真菌。

特别值得感兴趣的是粗糙脉孢菌和/或构巢曲霉Δ15-脱氢酶。N.crassaΔ15-脱氢酶的氨基酸序列由SEQ ID NO：3列出，由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的核酸序列编码，测定其分子量大约为49,123.37道尔顿。序列由429个氨基酸组成；其中32个是强碱性氨基酸(赖氨酸，精氨酸)；其中35个是强酸性氨基酸(天冬氨酸，谷氨酸)；170个疏水性氨基酸(丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸)；和100个极性氨基酸(天冬酰氨、半胱氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)。SEQ ID NO：3的等电点是7.187；在pH7.0时电荷为1.634；Davis，Botsein，Roth熔解温度为89.65℃，Wallace温度为5098.00.

A.nidulansΔ15-脱氢酶的氨基酸序列由SEQ ID NO：5列出，编码它的核酸序列由SEQ ID NO：4列出，经测定分子量大约为46,300道尔顿。该序列由401个氨基酸组成；其中有31个是强碱性的(赖氨酸，精氨酸)；34个是强酸性的(天冬氨酸，谷氨酸)；161个疏水氨基酸(丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸)；和100个极性氨基酸(天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)。SEQ ID NO：5的等电点是6.83。

编码粗糙脉孢菌和/或构巢曲霉Δ15-脱氢酶的序列可在转基因植物、微生物或动物中表达，而使LA到ALA的合成增加，SDA也同样如此。也可以使用其它的多核苷酸，只要其基本上与N.crassa和/或A.nidulansΔ15-脱氢酶多核苷酸一样，或其编码的多肽基本上与N.crassa和/或A.nidulansΔ15-脱氢酶多肽一样。“基本上一样”是指氨基酸序列或核酸序列表现出与N.crassa和/或A.nidulansΔ15-脱氢酶氨基酸序列或编码氨基酸序列的核酸序列按优选地递增顺序具有至少80％、90％或95％的一致性。可以运用序列分析软件来比较多肽或多核苷酸，例如，序列分析软件包GCG Wisconsin包(Accelrys，San Diego，CA)、MEGAlign(DNAStar，Inc.，1228S，Park St.，Madison，Wis.56-3715)，和Mac载体(Oxford Molecular Group，2105 S.BascomAvenue，Suite 200，Campbell，Calif，95008)。这些软件通过确定相似或一致的程度匹配相似的序列。

本发明包含来自于相同或其它相关的有机体的相关的脱氢酶。这些相关的脱氢酶包括在相同或不同的真菌种中自然生成的已知的Δ15-脱氢酶的变体。相应的脱氢酶可以通过其发挥与已知的脱氢酶基本相同作用的能力而鉴定；即能够有效的将LA转变为ALA，将GLA转变为SDA。相应的脱氢酶还可以通过以下方法鉴定，通过筛选序列数据库寻找与已知脱氢酶同源的序列，通过基于已知脱氢酶的探针与原有机体构建的文库杂交，或通过利用有机体来源的mRNA与基于已知脱氢酶的引物进行RT-PCR。

本发明的某一方面包括真菌Δ15-脱氢酶多肽的片段和变种，以及编码那些具有脱氢酶活性的多肽的核苷酸。本发明的另一个方面是含有核酸或其片段的载体，其中含有启动子、Δ15-脱氢酶编码序列和终止区域，该载体能转移至启动子和终止子发挥功能的有机体中。本发明相应的提供产生重组Δ15-脱氢酶的有机体。本发明的另一方面提供分离的Δ15-脱氢酶，它可以通过标准的蛋白纯化的方法从重组有机体中纯化(例如，见Ausubel et al.，1987)。

本发明的不同方面包括所述编码脱氢酶的核酸序列。核酸可以从真菌包括，但不局限于粗糙链孢霉、构巢曲霉、灰葡萄孢等中分离。这些真菌的染色体都已经过测序，已知每一种都富含ALA.基于用于扩增作为潜在的脂肪酸脱氢酶的序列的寡核苷酸引物以及N.crassa基因组DNA数据库的BLAST搜索的克隆策略可以被用来测定单个克隆的序列。这些克隆然后就可以得到功能表征。

核酸构建体可以通过被整合到宿主细胞的基因组中或在宿主细胞中自主复制(例如附加复制)提供。为了生产ALA和/或SDA，通常使用的表达盒(即编码蛋白的多核苷酸，其可操作地与核酸序列连接，指导多核苷酸表达)包括给编码Δ15-脱氢酶的多核苷酸提供表达的表达盒。在某些实例中，宿主细胞可以具有野生型油酸的含量。

当考虑到本发明提供的教导，构建表达载体的方法和组合物来表达真菌脱氢酶是本领域普通技术人员显而易见的。所述表达载体是被设计成用来可控表达目的多核苷酸的DNA或RNA分子，例如编码Δ15-脱氢酶的多核苷酸。载体的例子包括质粒、噬菌体、粘粒或病毒。根据本发明也考虑穿梭质粒例如(Wolk et al.，1984；Bustos et al.，1991)。载体的综述和制备使用载体的方法可以在Sambrook et al.(1989)、Goeddel(1990)和Perbal(1988)中找到。能有效表达多核苷酸的序列元件包括启动子、增强子、上游激活序列、转录终止信号和多酰苷化位点。

编码脱氢酶的多核苷酸可以置于强启动子的转录控制之下。在一些情况下，这会导致表达的脱氢酶的量的增加，并且伴随酶催化反应生成的脂肪酸的产量也增加。有多种植物启动子序列可用来促使转基因植物中编码脱氢酶的多核苷酸的组织特异性表达。例如，napin启动子和乙酰载体蛋白启动子先前通过表达脱氢酶的反义形式被用来调整种子油的组成(Knutzon et al.，1999)。类似的，大豆β-伴球蛋白的β-亚基的启动子已显示出高的活性并且形成在除了大豆以外的种的转基因植物中的组织特异性表达(Bray et al.，1987)。Arondel et al.(1992)通过将内质网定位的fad3基因置于强组成型花椰菜镶嵌病毒35S启动子的转录控制下，在转基因植物拟南介的组织中提高亚麻酸的含量(18:3)。

普通技术人员可以确定适合在特定宿主细胞中表达的载体和调控元件(包括可操作连接的启动子和编码区域)。本文中“可操作连接”是指启动子和终止子序列有效发挥调节转录功能。进一步的例子是，在转基因植物中适于表达Δ15-脱氢酶的载体可以包括种子特异性的启动子序列，其来源于可操作连接到Δ15-脱氢酶编码区域，以及进一步可操作连接到种子贮藏蛋白终止信号或胭脂碱合成酶终止信号的向日葵甲基橙素、napin或大豆球蛋白。进一步的例子为，用来在植物中表达Δ15-脱氢酶的载体可包含与Δ15-脱氢酶编码区域可操作连接的，以及进一步与组成型或组织特异性终止子或胭脂碱合成酶终止信号可操作连接的组成型的启动子或组织特异性启动子。

具有本发明所述的功能的核苷酸序列或在此披露的调节因素的修饰都在本发明的范围之内。这样的修饰包括插入、替换和删除，以及反应出遗传密码简并性的特定替换。

构建此类重组载体的标准技术是本领域技术人员所熟知的，可以参考如Sambrook et al.(1989)，或任何一种广范使用的关于重组DNA技术的实验操作手册。各种用于连接DNA片段的策略应根据DNA片段末端的特性来选择。根据本发明需要进一步考虑的是将用于克隆、表达或加工的核苷酸序列元件，例如编码信号肽的序列、编码用于蛋白滞留在内质网中的KDEL的序列或编码指导Δ15-脱氢酶转运到叶绿体中的转运肽的序列，引入核酸载体中。这些序列是本领域普通技术人员所知道的。例如Van den Broeck等人(1985)描述了一种优选的转运蛋白。如Michaelis等人(1982)披露了原核和真核信号序列。

在某些实施方案中，表达盒可以包括用于特别是分别在产生或摄取LA或ALA宿主细胞中提供Δ6-和/或Δ15-脱氢酶活性的盒。不能产生ALA的宿主有机体对Ω-6型不饱和脂肪酸如LA的生成是有利的。通过抑制Δ15-脱氢酶活性宿主ALA的产生是可以被除去，降低和/或抑制的。这可以利用提供Δ15-脱氢酶反义表达盒，通过插入、缺失、替换部分或全部靶基因而破坏靶Δ15-脱氢酶基因，或通过添加Δ15-脱氢酶抑制剂的标准筛选方法完成。相似地，利用Δ6反义转录的表达盒，通过破坏Δ6-脱氢酶基因，或通过使用Δ6-脱氢酶抑制剂，使具有Δ6-脱氢酶活性的微生物或动物更有利于产生LA或ALA。

编码目的脱氢酶的多核苷酸可以通过多种方法鉴定。例如，目的脱氢酶的来源，例如用可检测的酶促反应或化学合成的探针筛选Neurospora来源的基因组或cDNA文库，该探针可以由DNA、RNA或非天然出现的核苷酸或其混合物制备。探针可以从已知的脱氢酶多核苷酸酶促合成，用于在标准的或降低严谨性的杂交方法中使用。寡核苷酸探针也可以用来筛选来源，该探针是基于已知的脱氢酶序列，包括已知脱氢酶中的保守序列，或基于纯化的目的蛋白获得的肽序列。基于氨基酸序列的寡核苷酸探针可以退化至包含遗传密码的简并，或可以偏好成有机体的优选密码子。寡核苷酸也可以用作从已知或疑似来源的逆转录mRNA的PCR引物；PCR产物可以是全长的cDNA或可用来制备得到全长的目的cDNA的探针。可选择的是，目的蛋白可以被全部测序以及全合成编码此多肽的DNA。

一旦目的基因组或cDNA被分离，就可以通过已知的方法测序。本领域公认这些方法会出错，所以对相同区域的多重测序是必须的，而且预计在得到的推测序列中仍然存在一定比例的错误，特别是在有重复区域、大量的二级结构，或不同寻常的碱基组成，例如高GC碱基含量的区域中。当出现差异时，可以再次测序并且可以使用特殊的方法。特殊的方法包括改变使用的测序条件：不同的温度、不同的酶、改变寡核苷酸形成更高有序结构能力的蛋白；改变的核苷酸例如ITP或甲基化的dGTP、不同的凝胶组成例如加入甲酰胺、不同的引物或与问题区域距离不同的引物或不同的模板，例如单链DNAs。也可以对mRNA进行测序。

编码有脱氢酶活性的多肽的一些或全部序列可以从天然来源获得。然而在一些情况下，希望修饰全部或部分密码子，例如通过使用宿主偏好密码子来增强表达。根据在特定的目标宿主种类中大量表达蛋白时出现最高频率的密码子来确定宿主偏好密码子。这样，编码有脱氢酶活性的多肽的序列可以被全合成或部分合成。也可以合成全部DNA或其部分DNA来除去在转录mRNA中出现的任何不稳定序列或二级结构区域。也可以合成全部或部分DNA来改变碱基组成以使其在目的宿主细胞中更偏好。合成序列和将序列合在一起的方法在文献中已有充分记载。可以使用体外突变和筛选，定点突变，或其它手段来获得天然存在的脱氢酶基因的突变基因，用来制备在宿主细胞体内有更好的物理和动力学功能参数的脱氢酶活性的多肽，例如目的具有更长的半衰期或更高的产率的多不饱和脂肪酸。

一旦得到编码脱氢酶多肽的多核苷酸，可将它放入能在宿主细胞中复制的载体中，或在体外通过PCR或长PCR技术扩增。复制载体可以包括质粒、噬菌体、病毒、粘粒等。希望的载体包括那些有利于对目的基因进行突变或目的基因在宿主细胞中表达的载体。长PCR技术已使在体外扩增大的构建体成为可能，这样，对目的基因进行修饰，例如突变或添加表达信号和扩增产生的构建可以完全在体外进行而不使用复制载体或宿主细胞。

为了表达脱氢酶多肽，将有功能的转录和翻译起始和终止区域可操作地与编码脱氢酶多肽的多核苷酸连接。多肽编码区域的表达可以在体外发生或在宿主细胞中发生。转录和翻译起始和终止区域从多种的非单一的来源获得，包括要表达的多核苷酸、已知基固或在预期体系中预期能表达的基因、表达载体、化学合成或来自于宿主细胞中内源位点。

在宿主细胞中的表达可以是瞬时的或稳定的完成。引入的含有在宿主中有功能的表达信号的构建体，在构建体不能复制也几乎不整合到宿主细胞中，或宿主细胞不能增值时，发生瞬时表达。也可以通过诱导可调控的与目的基因可操作地连接的启动子的活性来完成瞬时表达，尽管这样的可诱导的体系时常显示低水平的本底表达。通过引入能够整合到宿主基因组或可以在宿主细胞中自主复制构建体来完成稳定表达。目的基因的稳定表达可以通过利用定位的可筛选标记或用表达构建体转染，接着筛选表达标记物的细胞来筛选。当通过整合产生稳定表达时，在宿主基因组可随机发生构建体的整合，或通过使用含有有效的与宿主位点进行靶向重组并与宿主基因组同源的区域的构建体而实现定位。在构建体靶向定位到内源位点时，全部或部分转录和翻译调节区域可以由内源位点提供。

当希望有机体中的脱氢酶多肽的表达增加时，可以使用几种方法。可以在宿主有机体中引入额外的编码脱氢酶多肽的基因。可以通过同源重组增加源自原有的脱氢酶位点的表达，例如通过在宿主基因组中插入一个更强的启动子来造成表达的增加，通过删去宿主基因组的信息除去mRNA或编码的蛋白的不稳定序列，或通过给mRNA添加稳定序列(U.S.Pat.No.4,910,141)。

可以考虑在宿主细胞中通过使用附加体或整合的表达载体引入和扩增多个编码一种脱氢酶的多核苷酸或编码多种脱氢酶的多核苷酸。当两个或更多的基因由各自独立的复制载体表达时，理想地是每一个载体都有不同的复制手段。每一个引入的构建体，无论整合与否，都应有不同的筛选方法并且都与其它构建体缺少同源性以保持稳定的表达以及防止构建体中的元件重新分配。引入的构建体的调节区域、筛选手段和扩增方法的明智选择可以通过实验来确定，这样所有引入的多核苷酸在必需的水平上表达来满足目的产物的合成。

当需要转化时，本发明的Δ15-脱氢酶编码序列可以插入到植物转化载体，例如Bevan(1984)所描述的二元载体。植物转化载体可以通过修饰天然的基因转移系统根癌农杆菌而获得。天然系统包括含有一个大片段的大Ti(肿瘤-诱导)-质粒，即已知的T-DNA，其可以被转移到转化的植物中。另一个Ti质粒片段，vir区域，用于T-DNA的转移。T-DNA区域与末端重复毗连。在修饰的二元载体中，肿瘤诱导的基因已被删去，利用vir区域的功能来转移由T-DNA边界序列毗连的外来DNA。T-区域也包含耐受抗生素的筛选标记，和用来插入转移序列的多克隆位点。这些工程化的菌株被命名为“卸甲(disarmed)”A.tumefaciens菌株，能够将由T-区域界定的序列有效的转入植物的核基因组中。

本发明发现许多应用。发现基于本发明多核苷酸的探针可以在分离相关分子的方法中或检测表达脱氢酶的有机体的方法中使用。当作为探针使用时，多核苷酸或寡核苷酸必须是可检测的。这通常是通过在内部位点或在5’端或3’端连上标记来实现，例如通过掺入修饰的残基。这样的标记可以直接检测到，可以结合到可检测的标记的二级分子上，或可以结合到无标记的二级分子上和可检测的标记的三级分子上；只要操作中不出现无法接受的背景信号，而且获得满意的可检测的信号，这个过程就可以持续进行。二级、三级或桥系统可以包括使用直接抗任何其它分子的抗体，包括标记或其它抗体；或可以包含任何可相互结合的分子，例如生物素-链亲和素/抗生物素蛋白系统。典型的可检测的标记包括放射性同位素，化学合成的或酶法产生的或改变发光的分子，产生可检测反应产物的酶、磁性分子、荧光分子或根据结合改变荧光或发射光特性的分子。标记方法的例子可以参考U.S.Pat.No.5,011,770。或者通过等温滴定热量测定探针结合到目标上时溶液热量的变化，或通过将探针或目标涂在表面上并检测目标或探针结合时产生的表面光散射的变化，这些可以各自通过BIAcore系统完成。

包含目标基因的构建体可以通过常规技术引入到宿主细胞中。为了方便，在此将通过任何方法处理的含有DNA序列或构建体的宿主细胞命名为“转化的”或“重组的”。例如根据基因是否整合到基因组，扩增或出现在带有多拷贝数的附加染色体元件，目标宿主会含有至少一份表达构建体的拷贝，也可以含有两个或更多的拷贝。

转化的宿主细胞可以通过引入的构建体上含有的筛选标记来鉴定。可供选择的，单独的标记构建体可以和目的构建体一起被引入，正如许多转化技术引入许多DNA分子到宿主细胞中一样。具有代表性的是可以根据转化的宿主在选择培养基上的生长能力而筛选转化的宿主。选择培养基中可以掺入抗生素或缺乏未转化宿主生长必需的因子，例如营养因子或生长因子。因此引入的标记基因可以赋予抗生素耐性，或编码必需的生长因子或酶，并在转化的宿主表达时能在选择培养基上生长。当检测到表达的标记蛋白时，可直接或间接进行转化宿主的筛选。标记蛋白可以单独表达或和其它蛋白融合表达。可以根据酶活性检测标记蛋白；例如，β-半乳糖苷酶可以将底物X-gal转变成有颜色的产物，而且荧光素酶可以将荧光素转变成光发射产物。标记蛋白可以通过它的产光或修饰特性来检测；例如，Aequorea Victoria绿色荧光蛋白用蓝光照射时发荧光。可以使用抗体来检测目的蛋白上的标记蛋白或分子标签。可以筛选表达标记蛋白或标签的细胞，例如通过目测，或通过如FACS或利用抗体的淘选技术。值得注意的是对卡那霉素和氨基糖苷G418的耐受，以及在缺少尿嘧啶、亮氨酸、赖氨酸或色氨酸的培养基中的生长能力。

特别感兴趣的是在真核宿主细胞中Δ15-脱氢酶-介导的PUFA’s的产生。真核细胞包括植物细胞，例如来自于产油的农作物的植物细胞，和其它包括真菌细胞的可基因操作的细胞。细胞可以培养成为或形成部分或全部包括植物在内的有机体宿主。在一个优选的实例中，宿主是产生和/或可以吸收外源供给的Δ15-脱氢酶底物，并优选产生大量的一种或多种的底物的植物细胞。

转化的宿主细胞在适当的适于目的终产物的条件下生长。为了使宿主细胞在培养基中生长，优化条件以得到最大量或最经济的PUFA’s产量，这与筛选的脱氢酶活性相关。可被优化的培养基条件包括：碳源、氮源、添加底物、添加的底物终浓度、添加的底物形式、需氧或厌氧生长、生长温度、诱导剂、诱导温度、诱导时的生长期、收获时的生长期、pH、密度和筛选的保持。

本发明的另一方面提供含有分离的本发明的DNA的转基因植物或植物后代。单子叶植物和双子叶植物都可以考虑。使用上述的任何一种植物转化方法将植物细胞用分离的编码Δ15-脱氢酶的DNA转化。转化的植物细胞通常在一个愈合组织培养基中或叶盘上，它通过本领域普通技术人员已知的方法可再生成完全的转基因植物(例如，Horsch etal.，1985)。在一个实例中，转基因植物选自由拟南芥、双低油菜、大豆、黄豆、油菜籽、向日葵、棉花、可可豆、花生、红花、椰子、亚麻、油椰、油籽蔓茎、玉米、加州希蒙得木、中国乌桕树、烟草、果树、柑桔类的植物或产坚果和浆果的植物的组。由于转化的植物的后代遗传了编码Δ15-脱氢酶的多核苷酸，转化植物的种子或插条都可以用来保持转基因植物系。

本发明进一步提供使转基因带有升高的ALA和/或SDA含量的方法。该方法包括，例如将编码Δ15-脱氢酶的DNA引入到缺少或具有低水平的ALA或SDA但含有LA的植物细胞中，从转基因的细胞可再生ALA和/或SDA含量增加的的植物。在本发明的某些实施方案中，编码Δ6-和/或Δ12-脱氢酶的DNA可以被引入到植物细胞中。这些植物也可以包含或不包含内源的Δ6-和/或Δ12-脱氢酶活性。在某些实施方案中，考虑将改造的商业化的种植农作物作为转基因有机体，包括但不局限于拟南芥、双低油菜、大豆、黄豆、油菜籽、向日葵、棉花、可可豆、花生、红花、椰子、亚麻、油椰、油籽芸苔和玉米、加州希蒙得木、是中乌桕树、烟草、果树、柑桔类的植物或产坚果和浆果的植物。

本发明进一步提供可以使转基因植物含有提高水平的ALA和/或SDA的方法，其中所说的提高水平是比未转化的植物中存在的水平高。本方法可以包括将一种或多种编码Δ15-脱氢酶的多核苷酸引入到缺少或低水平ALA，但含有LA的植物中。含编码Δ15-脱氢酶或Δ15-脱氢酶和Δ6-脱氢酶的DNA的表达载体可通过本领域普通技术技术人员已知的重组技术的方法构建(Sambrook et al.，1989)。特别的是，商业化的种植农作物被考虑作为转基因有机体，包括但不限定于，拟南芥、双低油菜、大豆、黄豆、油菜籽、向日葵、棉花、可可豆、花生、红花、椰子、亚麻、油椰、油籽芸苔和玉米。

对于食物添加剂而言，纯化的PUFAs、转化的植物或植物部分，或其衍生物，可以被掺入烹饪油、脂肪或合成的人造黄油中，以便食用者在正常使用中就能得到希望的量。PUFAs也可以掺入到婴儿制剂、营养添加剂或其它食品产品中，还可以用作抗炎或降低胆固醇剂。

在此使用的“可食用组合物”被定义为可被哺乳动物摄取的组合物，如食品原料、营养物质和药用组合物。在此使用的“食品原料”是指能够被用于或准备哺乳动物的食品的物质，包括可以用于制备食品(例如油炸油)或食品添加剂的物质。例如，食品原料包括用于人食用的动物或由其来源的产品，例如鸡蛋。典型的食品原料包括但不限定于饮料(例如不含酒精的饮料、汽水、用于混合的饮料)、腌渍食品(例如水果和蔬菜)、沙司、调味品、色拉调料、果汁、糖浆、甜食(例如布丁、明胶、糖衣和饼馅、烘烤食物和例如冰激凌和冰冻果子露的冷冻甜点)、软冷冻产品(例如软冷冻奶油、软冷冻冰激凌和酸奶酪、软冷冻浇头食物上面的调料，例如奶制品或非奶制品搅拌的浇头食物上面的调料)、油和乳化制品(例如使面点酥松的油脂、人造黄油、蛋黄酱、黄油、烹饪油和色拉调料)和中间的潮湿食品(例如大米和狗粮)。

此外，在此描述的可食用组合物也可以作为在食品和饮料中含有的添加剂或增补剂而被摄取。这些可以和营养物质如各种不同的维生素和矿物质一起配制，并掺入到基本上为液体的组合物中，例如营养饮料、豆奶和汤；基本上为固体的组合物中；以及明胶或以粉状形式掺入到不同的食品中应用。在这样的功能或健康的食品中有效成分的含量可以与典型的药剂中含有的剂量相似。

纯化的PUFAs、转化的植物或植物部分也可能掺入到动物，特别是家畜的饲料中。这样，动物本身可以从富含PUFA的饮食中受益，同时消费从这些家畜制成的食品的人类消费者同样也能从中受益。预期在一些例子中，动物中的SDA将转变成EPA，这样动物可以通过从消耗SDA而增加的EPA中受益。

对于药物用途(人或兽用)而言，组合物通常是口服给药，但也可以通过任何可以成功吸收的途径给药，例如非肠道给药(即皮下、肌肉或静脉注射)、直肠给药、阴道给药或局部给药，例如作为皮肤药膏或洗液。本发明PUFAs转化的植物或植物部分可以单独给药或与药用可接受的载体或赋形剂一起给药。明胶胶囊是可应用的口服给药的优选剂型。上面所提到的饮食添加剂也可以采用口服给药。本发明的不饱和酸可以以结合的形式给药，或以脂肪酸的盐、酯、酰胺或前药。本发明包括任何药用可接受的盐；特别优选钠、钾或锂盐。也包括N-烷基多羟基醇胺盐，例如N-甲基谷氨酰胺，参见PCT公开WO96/33155。优选的酯是乙基酯。作为固体盐，PUFAs也可以以片剂的形式给药。对于静脉给药，PUFAs或其衍生物也可以掺入如Intralipids的商业化制剂中。

通过常规的突变，接着表达产生的突变多肽并测定它们的活性可以确定对脱氢酶活性很重要的脱氢酶多肽区域。突变可以包括替换、缺失、插入和位点突变，或它们的联合使用。替换可以根据保守的疏水性或亲水性(Kyte and Doolittle，1982)，或根据形成相似的多肽二级结构的能力(Chou and Fasman，1978)完成。一个典型的功能分析始于缺失突变来确定功能必需蛋白的N-和C-末端限制，然后进行内部缺失，插入或位点突变来进一步确定功能必须区。也可以使用其它的技术例如盒式突变或全合成。例如通过使用核酸外切酶来依次除去5’或3’编码区域完成缺失突变。这样的技术可以用试剂盒来进行。缺失后，通过将含有起始或终止密码的寡核苷酸连接到5’或3’缺失后的缺失编码区域来使编码区域完整。可供选择的是，通过各种各样的方法包括定位突变，诱变PCR或通过与在存在的限制性位点上消化的DNA连接，将编码起始或终止密码子的寡核苷酸插入到编码区域。

相似地，内部缺失可以通过各种各样的方法，包括使用DNA中存在的限制性位点，使用诱变引物经定位突变或诱变PCR来完成。插入是通过如连接-扫描诱变，定位突变或诱变PCR的方法来完成的。点突变是通过如位点决定的突变或诱变PCR的方法来完成。化学突变也可以用来确定对活性至关重要的脱氢酶多肽区域。这些结构功能分析可以确定哪一区域可以被删去，哪一区域可以耐受插入，哪一位点突变使突变蛋白基本上象天然脱氢酶一样发挥作用。所有这些突变蛋白和编码它们的核苷酸序列都包括在本发明的范围内。

如上所述，本发明某些具体的例子与植物转化构建体有关。例如，本发明的一个方面是包含一种或多种脱氢酶基因或cDNA地植物转化载体。本发明使用的代表性的编码序列包括粗糙链孢霉基因Δ15-脱氢酶NcD 15D(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)和构巢曲霉Δ15-脱氢酶AnD 15D(SEQ ID NO：4)。在某些例子中，本发明也可以使用反义脱氢酶序列。也可以使用典型的脱氢酶编码核酸，包括至少20、40、80、120、300和直到SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQID NO：33的核酸序列全长。在某些特定方面，核酸可以编码1、2、3、4或更多种脱氢酶。特定的例子是，核酸可以编码Δ6和Δ15-脱氢酶。

在本发明的某些例子中，提供了在有义或在反义方位与异源启动子有效连接的编码序列。还提供了包含这些序列的表达构建体，应用本发明的这些或其它序列进行的构建体的构建(可与植物转化联用)是本领域普通技术人员按照本发明的公开可以知晓的(见例如Sambrook etal.，1989，Gelvin et al.，1990)。因此，本发明的技术不限定于任何特定的核酸序列。

本发明提供的序列的一种用途是通过用脱氢酶基因遗传转化改变植物的的表型，例如油的组成，特定的例子是真菌Δ15-脱氢酶。其它序列也可以与脱氢酶基因联用。当可表达的编码区域(不必是标记编码区域)与标记编码区域联合使用，可以在相同或不同的DNA片段上使用单独的编码区域来转化。在后一种情况下，不同的载体同时递送到受体细胞以实现最大化的共转化。

经常要根据转化的目的来选择与脱氢酶编码序列一起使用的额外的元件。转化农作物的一个主要目的是增加植物的商业上预期的和对农业经济重要的特性。已知PUFAs赋予许多有益的健康效果，伴随的SDA产量的增加也是有益的，这可通过真菌Δ15-脱氢酶的表达而获得。在本发明的某些例子中，这样SDA的增加可以包含Δ6和/或Δ12脱氢酶的表达，包括真菌或植物Δ6和/或Δ12脱氢酶。

用来植物转化的载体可以包括，例如质粒、粘粒、YACs(酵母人工染色体)、BACs(细菌人工染色体)或任何其它适合的克隆体系，以及从它们得来的DNA片段。这样，当使用术语“载体”或“表达载体”时，其中包括了所有前述的载体类型和从它们分离得到的核苷酸序列。考虑到使用强插入能力的克隆体系能引入含有超过一个特定基因的大DNA序列。根据本发明，这可以用来引入各种脱氢酶编码核酸。可以通过使用细菌或酵母人工染色体(分别是BACs或YACs)，或甚至是植物人工染色体引入这些序列。例如，Hamilton等人(1996)披露了将BACs用于农杆菌-介导的转化。

从这些载体中分离的表达盒对于转化是特别有用的。当然用于转化植物细胞的DNA片段通常会包含cDNA、基因或希望引入的并在宿主细胞中已表达的基因。这些DNA片段会进一步包括例如启动子、增强子、多连接头，或调控基因等目的结构。被选择用于细胞引入的DNA片段或基因将经常编码在得到的重组细胞中表达从而形成可筛选或可选择的特性的蛋白，和/或赋予产生的转基因植物改善的表型的蛋白。然而，并不总是这样，本发明也包含插入有不表达的转基因的转基因植物。优选的可能包括于本发明所用载体的组分如下所述。

本发明的一个实施方案中使用特定的启动子。本发明中使用的启动子的例子包括但并不限定于35SCaMV(花椰菜花叶病毒)、34SFMV(玄参花叶病毒)(见例如U.S.专利号5,378,619，其内容在此全部作为参考)、Napin(来自于芸苔属)，7S(来自于黄豆)、Glob和Lec(来自于玉米)。35SCaMV启动子和在植物种子成熟期间受调节的启动子是在本发明的应用中所特别感兴趣的。考虑在可复制表达载体中单独或联合使用所有这些启动子和转录调节元件是本领域普通技术人员已知的。

例如Restrepo等人(1990)描述了CaMV 35S启动子。遗传转化的和突变的调节序列导致种子特异性表达，也可以被用来生产改善的种子油组合物。本发明所述的这些修饰是本领域普通技术人员显而易见的。

转录起始位点和编码序列的起始点之间的DNA序列，例如不翻译的引导序列，也可以影响基因表达。因此可将特定的引导序列用于本发明的转化构建体。优选考虑的引导序列是包括那些含有预知指导所附着的基因的最适表达的序列，例如包括优选的一致的引导序列，它可以增加或保持mRNA的稳定性和防止翻译的不恰当起始。根据本发明的公开，这类序列的选择是本领域普通技术人员已知的。优选由植物中典型高表达基因获得的序列。

典型的根据本发明制备的转化构建体包括3’末端DNA序列，该序列用作终止转录信号，能通过与脱氢酶基因(例如cDNA)有效连接的序列使产生的mRNA的多聚腺苷化。在本发明的一个实施方案中，使用天然的脱氢酶基因的终止子。可供选择的是，异源的3’端可以增强脱氢酶编码区域的表达。认为是有用的终止子的来源的例子包括根癌农杆菌(nos3’端)(Bevan等人，1983)的胭脂碱合成酶基因，根癌农杆菌的章鱼碱合酶基因的T7转录终止子，马铃薯或西红柿的蛋白酶抑制子I或II基因的3’端和CaMV 35S终止子(tml3’)。如果需要，调节元件例如一个Adh内含子(Callis等人，1987)，蔗糖合酶内含子(Vasil等人，1989)或TMV Ω元件(Gallie等人，1989)，也进一步被包括进去。

通过使用可选择的或可筛选的标记蛋白，可以提供或增强鉴别转化子的能力。“标记基因”是赋予表达标记蛋白的细胞独特表型的基因，这样能使转化的细胞与没有标记的细胞区别开来。根据标记是否能赋予能通过化学方法，例如通过使用一种选择性试剂(例如除草剂，抗生素等)就能够筛选的特性，或是否它是仅仅是可以通过观察或测试，例如通过“筛选”(例如绿色荧光蛋白)就可以鉴定的特性，该基因就可以编码可选择的或可筛选的标记。当然，许多适合的标记蛋白的例子是本领域已知的并可以在本发明中实际应用。

适合用于本发明的转化植物或其它细胞的方法实际上包括将DNA引入到细胞的任何方法，例如通过PEG介导的原生质体转化法直接传送DNA(Omirulleh等人，1993)，通过干燥/抑制介导的DNA摄取(Potrykus等人，1985)，通过电穿孔(U.S.专利5,384,253，在此特别引用全文作为参考)，通过用碳化硅纤维搅拌(Kaeppler等人，1990；U.S.专利5,302,523，在此特别引用全文作为参考；U.S.专利号5,464,765，在此特别引用全文作为参考)，通过Agrobacterium介导的转化(U.S.专利号5,591,616和U.S.专利号5,563,055；在此都特别引用全文作为参考)和通过DNA包被的颗粒的加速(U.S.专利号5,550,318；U.S.专利号5,538,877；和U.S.专利号5,538,880；在此每一个都特别引用全文作为参考)等等。通过应用这些技术，实际上任何植物的细胞都可以稳定转化，并且这些细胞会发育成转基因植物。

在有效的将外源的DNA递送到受体细胞之后，下一步通常是关于鉴定用于进一步培养和植物再生的转化细胞。为了改善鉴定转化子的能力，应该使用根据本发明制备的转化载体带有的可选择的或可筛选的标记基因。在这种情况下，通常接下来要通过将细胞暴露于选择性试剂中来分析潜在的转化的细胞群，或要筛选带有预期的标记基因特性的细胞。

在暴露于选择性试剂后存活的细胞或在筛选分析中呈阳性的细胞，应在维持植物再生的培养基中培养。在一个典型例子中，通过另外加入如生长调节子的物质而改良MS和N6培养基。这些使用的生长调节子是麦草畏或2，4-D。然而也可以使用其它生长调节子，包括NAA、NAA+2，4-D或毒莠定。已发现以这种方式或类似的方式改良的培养基有助于细胞特定发育阶段的细胞生长。组织可以在含有生长调节因子的基本培养基中继续生长，直到形成能够开始植物再生的足量的组织，或接着重复进行人工筛选，直到组织形态学适合再生，通常要至少2周，然后将其转移至有益于胚胎成熟的培养基中。每两周将培养物转移至该培养基上。长出新芽意味着可以转移至缺少生长调节子的培养基中。

为了证实在再生植物中存在外源DNA或“转基因”，可以进行各种不同的测定。这样的测定包括，例如“分子生物学”鉴定，例如Southern和Northern印记和PCR^TM；“生化”鉴定，例如检测蛋白产物的存在，例如通过免疫手段(ELISAs和Western印记法)或通过酶的功能；植物部分的鉴定，例如叶或根鉴定；也可以通过分析整个再生植物的表型。

除了用根据本发明制备的构建体直接转化特定的植物基因型以外，也可以通过将带有本发明的选择的DNA的植物与缺失此DNA的另外的植株杂交而制成转基因植物。植物培育技术也可以用来引入多重脱氢酶，例如将Δ6，Δ12，和/或Δ15-脱氢酶引入单独的植物中。通过这种方式，Δ15-脱氢酶可以被有效地上调。通过制备具有Δ15-脱氢酶活性和/或其它脱氢酶活性(例如Δ6-和/或Δ12-脱氢酶活性)的植物纯合子，可以增加植物中有益的代谢产物。

如上所述，通过杂交可以将选择的脱氢酶基因引入到一个特定的植物种中，而不需要直接转化给定植物种。因此，本发明不仅包含直接转化的植物或根据本发明转化的细胞而再生的植物，还包括这些植物的后代。在此使用的术语“后代”是指根据本发明制备的亲代植物的任何一代的后代，其中的后代包括根据本发明制备的选择的DNA构建体。植物的“杂交”可以提供相对于起始细胞系具有一个或多个额外的转基因或等位基因的植物系，正如本发明所述，其被定义为是通过起始系与含有本发明的转基因或等位基因的供体植物系杂交，实现将特定序列引入到植物系中。为此，应进行例如如下步骤：(a)种植第一(起始系)和第二(含有期望的转基因或等位基因的供体植物系)亲代植物的种子；(b)将第一和第二亲代植物的种子培育成开花的植物；(c)用来自于第二亲代的植物的花粉给第一亲代植物的花授粉；和(d)收获在含有已受精的花的亲代植物上产生的种子。

在此将回交定义为包括下列步骤的过程：(a)将含有目的基因、DNA序列或元件的第一基因型的植物与缺少所述目的基因、DNA序列或元件的第二基因型植物杂交；(b)选择一个或多个含有目的基因、DNA序列或元件的后代植物；(c)将后代植物与第二基因型植物杂交；和(d)重复步骤(b)和(c)，其目的是将第一基因型植物中的目的DNA序列转移到第二基因型植物中。

将DNA元件基因掺入到植物的基因型中被定义回交转变过程的结果。掺入DNA序列的植物基因型可以被认为是回交转变基因型、系、近交或杂交体。类似的，缺少目的DNA序列的植物基因型可以被认为是一个没有转变的基因型，系，近交或杂交体。

实施例

下面的实施例用来说明本发明的实施方案。本领域技术人员应该承认在实施例中揭示的技术遵循了由本发明者发现的代表性技术，在本发明的实际应用中发挥了很好的作用。然而，根据现有技术，本领域普通技术人员应该知道在披露的特定的情形中可以产生许多变化，但仍然得到不背离本发明的概念、精神和范围的相同或相似的结果。更特殊的是，很明显某些在化学和生理学方面均相关试剂可以替代在此所述的试剂，同时将会得到相同或相似的结果。对于本领域技术人员，所有这些相似的替代和修改是显而易见的，被认为是在如所附的权利要求定义的本发明的精神、范围和概念之内。

实施例1

菌株和生长条件

粗糙链孢霉杂交A型和构巢曲霉格拉斯哥野生型来自于真菌遗传贮存中心。培养物在Vogel’s培养基N中生长(Case等人，NeurosporaNewsletter，8：25-26，1965)。液体培养用囊孢子接种，并在15℃下100RPM摇床培养3天。在布氏漏斗中经Whatman1号滤纸过滤收集菌丝体并在80℃贮藏用于分离RNA或直接冷冻干燥通过气相色谱进行脂肪酸组成分析。使用的酿酒酵母菌株是INVSc1，是组氨酸、亮氨酸、色氨酸和尿嘧啶(Invitrogen)营养缺陷型的二倍体菌株。将细胞在30℃，YPD培养基中保存。

实施例2

真菌RNA的分离

使用Chomczynski和Sacchi(1987，Tri-Reagent，SIGMA)的盐酸胍-酚-氯仿方法，从实施例1中所述的3种菌株的真菌菌丝体中分离总RNA。此方法将500毫克菌丝体在液氮中碾碎，然后加到7毫升Tri-Reagent中。加入氯仿，从有机相中分离水相。将RNA用异丙醇沉淀然后在重悬于去离子水中之前用70％乙醇漂洗

实施例3

N.crassaΔ12和Δ15-脱氢酶序列的克隆

根据与N.crassa基因组序列的序列对比，设计基因的特定引物来扩增全长的推断的Δ12-脱氢酶(Nc111F2和Nc111R3)和Δ15-脱氢酶(Nc94F6和Nc94R8)编码区。正向引物设计为在起始蛋氨酸5’端有3个核苷酸

Nc111F2：5’-AAGATGGCGTCCGTCTCCTCTGCCCTTCCC-3’(SEQ ID NO：15)

Nc111R3：5’-TTAGTTGGTTTTGGGGAGCTTGGCAGGCTTG-3’(SEQ ID NO：16)

Nc94F6：5’-AACATGACGGTCACCACCCGCAGCCA-3’(SEQ ID NO：17)。加在寡核苷酸的5’末端的NotI位点用斜体字表示。

Nc94R8：5’-TTACTGGGTGCTCTGAACGGTGTGCG-3’(SEQ ID NO：18)。加在寡核苷酸的5’末端的Sse8387I位点用斜体字表示。

N.crassa的cDNA用Marathon cDNA扩增试剂盒(ClontechLaboratories)制备。通过基因扩增PCR体系9700(PE AppliedBiosystems)，在推荐的循环条件下使用这些引物与3’-RACE readycDNA扩增推断的脱氢酶。将用寡核苷酸Nc94F6和Nc94R8产生的PCR产物连接到pCR2.1-TOPO(Invitrogen)，并命名为pMON67004(图1)。将cDNA测序，在氨基酸124-128，160-164和359-363位置上发现3个“组氨酸-盒”，这是膜结合脱氢酶的一种保守特性。

与其它的膜结合Δ12和Δ15-脱氢酶相比，发现最终的“HXXHH”组氨酸盒基序也是完整无缺的。相应的Δ15-脱氢酶(NcD15D)核苷酸和多肽序列分别在SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3中列出，基因组克隆在SEQ ID NO：1中列出。将pMON67004用EcoRI消化并连接到酵母表达载体pYES2/CT的EcoR1位点上形成pMON77208(图2)。对于植物转化载体，将pMON67004用EcoR1消化，接着进行补平反应，然后用Sse8387I酶切。将基因片段连接到二元载体pMON73270上，该载体已用NotI消化，接着进行补平反应，然后用Sse8387I酶切。在这样产生的载体pMON77214(图4)中，Δ15-脱氢酶基因NcD15D处在种子特异性Napin启动子的调节之下。EcoRI/Sse8387I-消化的DNA片段也连接到二元载体pMON73273上，由此产生pMON77217(图4)，在产生的pMON77217中NcD15D处在组成型的35S启动子的调节之下。

用寡核苷酸Nc111R3和Nc111F2产生的PCR产物直接连接到pYES2.1/V5-His-TOPO(Invitrogen)形成pMON67005(图7A)。将cDNA测序，并且在氨基酸的158-162，194-198和394-398位置上发现3个“组氨酸-盒”。与其它的膜结合的Δ12和Δ15-脱氢酶相比，发现最终的“HXXHH”组氨酸盒基序也是完整无缺的。推测的Δ12-脱氢酶(NcD12D)的核苷酸和多肽序列分别在SEQ ID NO：39和SEQ IDNO：40中列出。

实施例4

酵母转化和表达

使用Invitrogen关于pYES2.1/V5-His-TOPO的手册中记载的PEG/Li Ac实验方案将pMON67005和pMON77208的构建体引入到宿主菌S.cerevisiae INVSc1(尿嘧啶营养缺陷型)中。在不含尿嘧啶，含2％葡萄糖的SC最小限度培养基制成的平板上挑选转化子。将转化子克隆接种到5毫升不含尿嘧啶，含2％葡萄糖的SC最小限度培养基中，30℃下培养过夜。为了诱导，将稳定期的酵母细胞离心沉淀，在不含尿嘧啶，补入2％的半乳糖的SC最小限度培养基中重悬，在15℃下培养3天。向培养基中加入外源脂肪酸时，加入0.01％的LA(Δ9，12-18:2)和0.1％的乳化剂Tergitol。培养物在15℃条件下生长3天，接着离心收集培养物。用无菌的pH7.5的TE缓冲液清洗细胞团一次，除去培养基，并冻干24小时。用含有LacZ基因的载体转化的宿主菌，将其作为所有实验中的阴性对照。

为了进行脂肪酸分析，在前述操作之后进行酵母脂质的提取。简单的说，将冻干的酵母细胞团用15毫升甲醇和30毫升含有100微克tridecanoin的氯仿提取。提取后，首先将酵母脂质皂化，将游离的脂肪酸甲基化。然后使用配备发光电离检测仪和熔硅毛细管柱(Supelcomega；50米×0.25毫米，内径，Supelco，Bellefonte，PA)的Hewlett-Packard5890H Plus气相色谱仪(Hewlett-Packard，Palo Alto，CA)对脂肪酸甲酯的分布进行气相色谱(GC)分析。

在作为对照的用含有LacZ的表达载体转化的酵母中，在不添加LA生长的细胞系中没有检测到LA或ALA(18:3)。在含有NcD15D或BnD15D的表达载体转化的酵母中，不添加LA，就没有ALA累积。在含有NcD12D表达载体转化的酵母中，不添加LA，LA累积到占脂肪酸的22％，显示D12D活性。当LA加入到表达NcD15D的酵母系中，ALA降至脂肪酸的1％。在表达Brassica napus Δ15-脱氢酶(BnD15D)的酵母系中，加入LA后，ALA降至脂肪酸的0.2％。在LacZ对照中，添加LA后没有检测到ALA。

表1酵母表达数据

实施例5

用NcD15D转化Arabidopsis

本实施例描述了表达异源Δ15-脱氢酶编码序列的转基因拟南芥植株的转化和再生。将种子播种在4英寸的含有反渗透水(ROW)和饱和MetroMix 200(SCOTTS有限公司，哥伦比亚，OH)的罐中培养Arabidopsis植物。通过将罐子放置在覆盖潮湿顶的单元中，在4-7℃的培养室中，每天光照8小时，长达4-7天的人工方法促进植物发育。将此单元转移至22℃、相对湿度为55％、每天光照16小时，平均亮度为约160-200Mol/秒＊平方米的培养室中。在发芽后，举起顶向后移1”以保证适度的不干燥空气的流通。当真正的叶子形成时移去湿顶。如需要，用ROW浇灌植物根部，直到发芽后2-3周。然后，如需要，用PLANTEX 18-18-5溶液(Plantex有限公司渥太华，加拿大)在50ppm氮气的条件下，浇灌植物根部。罐子很细以使在发芽后2-3周保持每罐有1株植物。一旦植物开始抽薹，应修剪初级花序以促进叶腋薹的生长。

使用现有技术已知的方法将转化载体pMON77214和pMON77217引入到根癌农杆菌菌株ABI中。如Bent等(1994)或Bechtold等(1993)所述获得转基因A.thaliana植物。简而言之，含有二元载体pMON77214或pMON77217的农杆菌的培养物在LB(10％细菌-胰化蛋白胨，5％酵母提取物和含卡那霉素(75毫克/升)、氯霉素(25毫克/升)和壮观霉素(100毫克/升)的10％氯化钠)生长过夜。将菌液离心并在5％蔗糖+.05％ Silwet-77中重悬。整个A.thaliana植物(约5-7周的年龄)的气生部分浸于得到的溶液中2-3秒钟。用纸巾吸去多余的溶液。将浸过的植物侧放在有盖的单元上并转移到19℃的培养室中。16到24小时后，移去顶使植物直立。当植物发育成熟时，停水2到7天收获种子。收获的种子经过不锈钢网孔筛选。

为了挑选转化子，将种子涂布在含有50mg/L的草甘膦的琼脂培养基上。挑选绿色的幼苗并移植至4”罐中并在上述条件下生长。当叶丛处在4-叶状态时收集叶子进行脂肪酸分析。冷冻干燥后，按上述方法分析叶子脂肪酸。

实施例6

N.crassa克隆的功能性表达

为了评价N.crassa D15D克隆的功能特异性，将pMON67004的编码区克隆到植物表达载体中，其中组成型的35S启动子驱动转基因的表达。得到的构建体pMON77217被转化到A.thaliana中并且对转化的T2植物的叶子进行了脂肪酸组成的分析。在非转化系中约20％的脂肪酸是LA，约48％的脂肪酸是ALA。在两个独立的A.thaliana转化实验中，LA的水平降至约3％和5％，而且ALA的水平分别增至65％和63％，显示了植物中Δ15-脱氢酶活性。这些数据在表2中进行了总结。指定CONT为对照。

表2拟南芥叶的脂肪酸含量

为了评价N.crassa D15D克隆在种子中促进ALA产生的功能特异性，将pMON67004的编码区克隆到种子特异性表达载体中，其中Napin启动子驱动转基因的表达。得到的构建体pMON77214被转化到A.thaliana中，对转化的T2植物的种子进行脂肪酸组成分析。在非转化系中，约26％的种子脂质是以LA出现，约18％是以ALA出现的。在两个独立的A.thaliana转化实验中，LA的水平降至约14％和13％，而且ALA的水平分别增至26％和30％，显示在种子中Δ15-脱氢酶活性。这些数据在表3显示。

表3拟南芥种子的脂肪酸含量

这些结果表明链孢霉NcD15D cDNA编码的蛋白是植物中功能性的Δ15-脱氢酶并在叶和种子中能指导ALA的合成。

实施例7

双低油菜中粗糙链孢霉Δ15-脱氢酶活性

用含有Napin启动子驱动的NeurosporaΔ15-脱氢酶的构建体pMON77214转化细胞系。Quantum和Ebony油菜种都被转化，包括二者的对照。表4中显示的数据是来自R₀植株的20个种子的混合物中18:2(LA)和18:3(ALA)的百分比。

表4来自R₀植物的20个种子的混合物中PUFAs的百分比

在这些系中产生的ALA水平高于种子脂肪酸的12％表明具有外源的Δ15-脱氢酶活性。从该转化中观察的最高的ALA水平存在于BN-G1395系，其中含30.17％的ALA。

对于几个表达pMON77214的系而言，测定了单个种子中的脂肪酸，品系向下一代进展。与预期的一样，相对于混合物，在单个种子中ALA水平增加到近2倍，显示了在每个长角果中单个的分离子的转基因的纯合性。在BN-1296系中，R1种子混合物含有25.04％的ALA。在这个系(BN-G1296-14)的单个种子中发现了最高达48.2％的ALA。在图3中显示了200个半种子中的ALA水平，按最低到最高ALA次序排列。

实施例8

A.nidulans的Δ15-脱氢酶序列和B.cinerea的Δ12-和Δ15-脱氢酶序列的克隆

根据与A.nidulans基因组序列进行序列对比，设计基因特异性引物来扩增推测的Δ15-脱氢酶(AnD15-F1和AnD15-R1)的全长编码区域。设计的正向引物在起始甲硫氨酸的5’端含有3个核苷酸

AnD15-F1：5’-AATATGGCTGCAACTGCAACAACCC-3’(SEQ IDNO：23)

AnD15-R1：5’-TTCCGCTTTGGCACCCTTCTTC-3’(SEQ IDNO：24)

根据部分基因组序列(用BLASTALL发现的Monsanto拥有的部分gDNA克隆)设计的寡核苷酸引物BcD12F1和BcD12R1来扩增B.cinereaΔ12-脱氢酶的全长编码区域。设计简并引物D15D-R9来在5’-RACE反应中扩增任何推测的B.cinereaΔ15-脱氢酶。设计寡核苷酸BCD15-F1用于进行由寡核苷酸D15D-R9产生的PCR产物的3’RACE反应。设计寡核苷酸BcD15F3和BcD15R1F来扩增推测的B.cinereaΔ15-脱氢酶的全长的编码区。

BcD12F1：5’-GTCGACACCATGGCCTCTACCACTGCTCTC-3’，5’端含有SalI(SEQ ID NO：25)

BcD12R1：5’-CTGCAGTGCCTTGAGCTTCATTGGTGGTGTA-3’，5’端含有PstI(SEQ ID NO：26)

D15D-R9：5’-GCCRTGNCCRCAYTCRTGNGCANGDAT-3’(SEQID NO：27)

BcD15-F1：5’-ACGATGACTCTCGATTACACAAGTCACCCG-3’(SEQ ID NO：28)

BcD15-F3：5’-GTCGACACGATGACTCTCGATTACACAAGTCACC-3’，5’端含有SalI(SEQ ID NO：29)

BcD15R1：5’-CTGCAGAATGCTTGAGCTATCAGCAGATCCCAA-3’，5’端含有PstI(SEQ ID NO：30)

使用GeneRacer试剂盒(Invitrogen)制备A.nidulans和B.cinereacDNA。使用基因AmpPCR体系9700(PE APPLIED BIOSYSTEMS)，在推荐的循环条件下，将这些引物和3’-RACE ready cDNA一起用来扩增推测的脱氢酶。用寡核苷酸AnD15-F1和AnD15-R1扩增编码A.nidulansΔ15-脱氢酶的PCR产物，将其连接入pYES2.1-TOPO(Invitrogen)并命名为pMON67010(图7B)。将cDNA测序，并且发现在氨基酸的93-97、129-133和327-331位置上出现3个“组氨酸-盒”，这是膜结合的脱氢酶中一个保守特性。相应的Δ15-脱氢酶(AnD15D)核苷酸和多肽序列分别在SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5中列出。

用寡核苷酸BcD12F1和BcD12R1进行PCR扩增B.cinerea中编码Δ12-脱氢酶的cDNA，接着将其直接连接到pYES2.1/V5-His-TOPO(Invitrogen)形成pMON67022(图7D)。将cDNA测序，并且发现在氨基酸的155-159，191-195和390-394位置上出现3个“组氨酸-盒”，这是膜结合脱氢酶中的一个保守特性。推测的Δ12-脱氢酶(BcD12D)核苷酸和多肽序列分别在SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32中列出。

为了从B.cinerea克隆Δ15-脱氢酶，根据N.crassa和Aspergillus sp.Δ12和Δ15-脱氢酶的氨基酸序列的比对产生简并的寡核苷酸。按照制造商推荐的条件，使用GeneRacer试剂盒(Invitrogen，Carlsbad CA)进行5’-RACE反应.合成cDNA后，利用简并的寡核苷酸D15D-R9对推测Δ15-脱氢酶的5’末端进行PCR扩增，并连接到pCR2.1-TOPO。将得到的742bp的片段测序，并通过推断与其它真菌的Δ15-脱氢酶的氨基酸序列的相似性来确定。使用3’-RACE反应从推测的B.cinereaΔ15-脱氢酶3’端以寡核苷酸BcD15-F1来扩增664bp的片段，并连接到pCR2.1-TOPO。根据5’-和3’-RACE产物的复合序列设计寡核苷酸BcD15F3和BcD15R1，通过3’-RACE反应来扩增全长的推测的B.cinereaΔ15-脱氢酶cDNA，并连接到pYes2.1-TOPO。将得到的质粒命名为pMON67021(图7C)。推测的Δ15-脱氢酶(BcD15D)相应核苷酸和多肽序列分别在SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34中列出。

为了评价在酵母表达试验中推测的AnD15D的Δ15-脱氢酶活性，向表达推测的Δ15-脱氢酶的酵母中提供该酶的底物，即LA，然后定量产生的ALA。将通过N.crassaΔ15-脱氢酶pMON67023产生ALA的数据与A.nidulansΔ15-脱氢酶的数据相比，如表5所示。pMON67023(图7E)构建如下：

Nc94F2：5’-AACATGACGGTCACCACCCGCAGCCACAAG-3’(SEQ ID NO：35)

Nc94R2：5’-CTGGGTGCTCTGAACGGTGTGCGCCCAAAT-3’(SEQ ID NO：36)

用引物Nc94F2和Nc94R2扩增没有终止密码子的NcD15D编码区域。得到的片段连接到pYES2.1-TOPO，在pYES2.1表达载体中含有的NcD15D编码区域和V5抗原决定部位和6-组氨酸区域之间产生读码框融合。

表5通过粗糙链孢霉Δ15-脱氢酶和构巢曲霉Δ15-脱氢酶制备ALA

这些结果表明在该表达体系中A.nidulans脱氢酶的活性比NcD15D高约2倍。

表6酵母中AnD15D底物利用的分析

这些结果表明在该表达体系中，A.nidulansD15D能够使LA和GLA脱氢。

实施例9

用于大豆的来自A.nidulans和N.crassa.Δ15-脱氢酶的密码子优化

由来自于大豆的8个高表达的种子特异性蛋白(伴大豆球蛋白、大豆球蛋白、球蛋白)和来源于双低油菜的17个高表达的种子特异性蛋白(cuciferin、napin、油质蛋白)构建密码子使用表。NcD15D和AnD15D核苷酸序列，和上述的密码子使用表一起，被送到Blue HeronBiotechnology有限公司(Bothell，Wa)，然后该公司利用所有的运算法则得到最终的优化密码子序列，该序列具有最低形成RNA二级结构的自由能。NcD15D的优化密码子序列由Blue Heron Biotechnology有限公司合成并命名为NcD15Dnno(SEQ ID NO：37)。AnD15D的优化密码子序列由Midland(Midland，TX)合成并命名为AnD15Dnno(SEQID NO：38)。

实施例10

NeurosporaΔ15-脱氢酶和Mortierella alpinaΔ6和Δ12-脱氢酶联合的活性

NeurosporaΔ15-脱氢酶和Mortierella alpinaΔ6和Δ12-脱氢酶联合的活性通过用构建体pMON77216(图7G)转化双低油菜来评价，该构建体含有由Napin启动子控制的3个脱氢酶。然而在获得的许多系中，发现Δ12-脱氢酶被部分删去。测定了来自单独的R0植物的10粒种子混合物的脂肪酸含量。下述表6显示了硬脂酸(18:0)(SA)、油酸(18:1)(OA)、LA、ALA、SDA和GLA的水平。对照系是Ebony。从多个转基因实验得到的种子混合物含有可测量的SDA，在8个实验中SDA累积到超过脂肪酸的10％。

表6R1种子混合物中相对的面积百分比结果(近似重量百分比)

来自实验BN-G1824的单种子的脂肪酸数据，包括纯合体和杂合体，在下述表7中显示。在一个例子中，观察到18.6％的SDA、17.8％的ALA、11.2％的LA、24％的油酸和18.8％的GLA。该例子被认为是高SDA/高GLA的例子。该例子中的另一种种子中观察到16.8％的SDA、7％的ALA、2％的LA、62.1％的油酸和3.1％GLA，该例子被认为是高SDA/低GLA系。分子数据显示，在高SDA/低GLA系中，Δ12编码序列是没有功能的。还特别显示，高SDA/低GLA系包含了一个单独的部分T-DNA插入的单拷贝，该插入丢失了MortierellaalpinaΔ12-脱氢酶编码区的左边界和末端51个碱基对之间的所有插入DNA(例如SEQ ID NO：41的最后51个碱基)。值得注意的是，在高SDA/低GLA系中油酸水平和野生型的水平接近，而在高SDA/高GLA系中，与野生型相比，油酸水平约降低2.5倍。展示高SDA/高油酸表型的系用灰色突出。

表7BN_G1190的R1单种子的相对面积百分比结果(近似重量百分比)

为了进一步评价粗糙链孢霉。Δ15-脱氢酶和M.alpinaΔ6-和Δ12-脱氢酶联合的活性，用含有NcD15D的构建体pMON77214再次转化构建体pCGN5544(含有M.alpinaΔ6-和Δ12-脱氢酶)纯合子的系，其种子油中含有高达35％的GLA。分析了来自11种R₀植物的20个种子的混合物。这些系中LA、ALA、SDA和GLA的水平在表8中显示。

表8R1种子混合物的相对面积百分比结果(近似重量百分比)分析

实施例11

粗糙链孢霉。Δ15-脱氢酶和Mortierella.alpinaΔ6-脱氢酶联合的活性

通过用含有Napin启动子控制的两个脱氢酶的构建体pMON77215(图7F)转化双低油菜，来评价粗糙链孢霉。Δ15-脱氢酶和Mortierella.alpinaΔ6-脱氢酶联合的活性。此载体通过NotI消化的、其中具有Napin启动子驱动的M..alpinaΔ6-脱氢酶(MaD6D)表达的pCGN5536(U.S.专利号.6,459,018 B1)来构建，然后将表达盒片段连接到二元载体pMON70660的NotI位点上形成pMON77212。pMON77215质粒的构建是通过用PmeI和AscI消化pMON77214，然后将得到的Napin-NcD15D表达盒片段连接到pMON77212的SwaI和AscI位点，形成同时含有MaD6D和NcD15D的构建体。

测定了来自单个R0双低油菜转化株中10个种子的混合物中脂肪酸的含量。在下表9中显示了SA、OA、LA、ALA、SDA和GLA的水平。对照系是Ebony(SP30052)。从多个转基因实验产生的种子的混合物含有可测量的SDA，25％的实验中(40中的10个)的SDA累积到超过脂肪酸的10％。

表9pMON77215的R1种子混合物中相对的面积百分比结果(近似重量百分比)

来自实验BN-G1860的单种子的脂肪酸数据，包括纯合体和杂合体，如下表10中显示。在一个例子中，观察到高达19％的SDA、10％的ALA、7％的LA、48％的油酸和5％的GLA。

表10BN_G1860的pMON77215单个R1种子相对的面积百分比结果(近似重量百分比)

实施例12

来自N.crassa.的Δ15-脱氢酶序列对玉米的密码子优化

由玉米(6个玉米蛋白和3个油质蛋白)的9个高表达的种子特异性基因构建密码子使用表。利用此表，用QuikChange定点突变试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA)将NcD15D的两个密码子进行突变，并且将产生的序列命名为NcFAD3m(SEQ ID NO：42)。改变密码子操作如下：1)得到一个更优选的翻译起始位点，通过改变第二个密码子的第一个碱基(SEQ ID NO：42中的第4位)将ACG变为GCG，而使SEQ ID NO：2中的一个丙氨酸被替换成苏氨酸；和2)为了移去一个稀有密码子，一个缬氨酸的密码子在882位置(SEQ ID NO：42)上从GTA换成GTG。

实施例13

EPA等同值

衡量种子油对于健康质量的标准是EPA等同值。该值反映了代谢作用转化成EPA的比率。由ALA的百分比除以14和SDA的百分比除以4相加来得出该值。本发明者获得的双低油菜油组合物具有高EPA等同值，显示在人和动物中具有与EPA水平提高相关的健康益处的特性。通过将传统的双低油菜油与典型的含有10％ALA和15％SDA的高SDA油组成的实施例进行对比，得到下面的分析结果。传统种类的双低油菜油约含有12％的ALA和0％SDA，其EPA的等同值为12/14+0/4＝0.8。相反的，高SDA油组成的实施例的EPA等同值为10/14+15/4＝4.4。相应的值显示如下。该值是基于重量％，而不是基于应用。巨大的差别表明在双低油菜油中产生的SDA的重要性。

表11EPA等同值比较

蔬菜油	总Ω-3(％脂肪酸)	n-6∶n-3比率(％脂肪酸)	相应的EPA等值(重量％ALA+SDA)
				双低油菜	12	2.6∶1	0.8
SDA双低油菜	50	1∶5	4.4

参考文献

在本发明中引用下面列出的参考文献作为参考，以它们作为补充、解释、提供背景技术或教导方法学、技术和/或在此使用的组合物。

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Claims (28)

1.一种分离的多核苷酸，其核酸序列编码一种多肽，所述多肽具有在脂肪酸分子的碳15位上脱氢的脱氢酶活性，其中该分离的多核苷酸选自：

(a)编码SEQ ID NO：3的多肽的多核苷酸；

(b)核酸序列为SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的多核苷酸。

2.权利要求1所述分离的多核苷酸，其中所述的多核苷酸来自于选自下组的门：选自接合菌门、担子菌门和子囊菌门。

3.权利要求1所述分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸来自于选自下组的种：粗糙链孢霉、构巢曲霉和灰葡萄孢。

4.权利要求1所述分离的多核苷酸，其中多核苷酸编码SEQID NO：3的多肽。

5.权利要求1所述分离的多核苷酸，其中多核苷酸包含SEQID NO：1、SEQ ID NO：2的核酸序列。

6.一种含有权利要求1所述分离的多核苷酸的重组载体。

7.权利要求6所述的重组载体，其进一步包含至少一种选自以下的附加序列：

(a)与多核苷酸可操作性连接的调控序列；

(b)与多核苷酸可操作性连接的选择标记；

(c)与多核苷酸可操作性连接的标记序列；

(d)与多核苷酸可操作性连接的纯化部分；和

(e)与多核苷酸可操作性连接的靶序列。

8.权利要求6所述的重组载体，其被进一步限定为含有与所述分离的多核苷酸可操作性连接的启动子。

9.权利要求8所述的重组载体，其中启动子是发育调控的、细胞器特异性的、组织特异性的、组成型的或细胞特异性的启动子。

10.权利要求8所述的重组载体，其中所述启动子选自35SCaMV、34S FMV、Napin、7S、Glob和Lec。

11.权利要求6所述的重组载体，其被限定为一种分离的表达盒。

12.权利要求6所述的重组载体，其被进一步限定为含有编码具有在脂肪酸分子碳6位脱氢的脱氢酶活性的多肽的核酸序列，和/或编码具有在脂肪酸分子碳12位脱氢的脱氢酶活性的多肽的核酸序列。

13.真菌多肽，其含有SEQ ID NO：3的氨基酸序列。

14.权利要求6所述的重组载体在制备转基因植物中的用途。

15.权利要求14所述的用途，其中所述植物含有一种编码具有在脂肪酸分子碳6位脱氢的脱氢酶活性的多肽的核酸序列。

16.用权利要求6所述的重组载体转化的宿主细胞。

17.权利要求16所述的宿主细胞，其中所述的宿主细胞表达由所述载体编码的蛋白。

18.权利要求16所述的宿主细胞，其中细胞从细胞的祖先遗传了重组载体。

19.权利要求16所述的宿主细胞，其中细胞已被所述重组载体转化。

20.权利要求16所述的宿主细胞，其中所述的宿主细胞是植物细胞。

21.一种制备含有来自于植物种子的Ω-3脂肪酸的种子油的方法，其包括如下步骤：

(a)根据权利要求14获得植物种子；和

(b)从所述种子中提取油。

22.一种产生植物的方法，所述植物包含的种子油中Ω-3脂肪酸水平提高，所述方法包括将权利要求6所述的重组载体导入到产油植物中。

23.权利要求22所述的方法，其中导入重组载体包括植物的培育。

24.权利要求22所述的方法，其中导入重组载体包括下列步骤：

(a)用权利要求6所述的重组载体转化植物细胞；和

(b)从植物细胞再生所述植物，其中植物的Ω-3脂肪酸的水平提高。

25.权利要求22所述的方法，其中植物选自拟南芥、油籽芸苔属、油菜籽、向日葵、红花、双低油菜、玉米、大豆、棉花、亚麻、加州希蒙得木，中国乌桕树、烟草、可可豆、花生、果树、柑桔属植物、产生坚果和浆果的植物。

26.权利要求22所述的方法，其中植物被进一步限定为用一种编码具有在脂肪酸分子碳6位脱氢的脱氢酶活性的多肽的核酸序列所转化。

27.权利要求26所述的方法，其中十八碳四烯酸是增加的。

28.权利要求22所述的方法，其被进一步限定为包括将权利要求6所述的重组载体导入到多种产油植物中，并且从所述植物或其遗传了重组载体的后代中，筛选具有预期的Ω-3脂肪酸状况的植物。