HK1081195B - 来自牛樟芝菌丝体的化合物和混合物或组合物及其用途 - Google Patents

Description

来自牛樟芝菌丝体的化合物和混合物或组合物及其用途

技术领域

本发明涉及来自牛樟芝(Antrodia Camphorata)菌丝体的新混合物与化合物及其用途。本发明涉及包含本发明的化合物的组合物或菌丝体。

背景技术

在台湾，牛樟芝(Polyporaceae，Aphyllophorales)的子实体作为中药是众所周知的。它仅生长在台湾地方性常绿Cinnamomun kanehirai(Hay)(Lauraceae)心材壁内层。它很罕见且未被栽培出来。该子实体已经被用来治疗食物与药物中毒、腹泻、腹痛、高血压、皮肤疥癣和肝癌。至今几乎没有报导生物活性研究。

在台湾，牛樟芝又叫作牛樟菇，最近报导其为特征如下的新真菌种：出现于子实体中的其担孢子的圆柱型，虚软的淀粉体骨架菌丝，苦味和亮黄棕色倒生至帽型(pileate)担子果，以及纯培养物中的厚垣孢子与anthroconidia。该新真菌种的生长极为缓慢，并局限于以地方性树木品种Cinnamomum kanehirai Hay(Lauraceae)为唯一宿主。牛樟芝的详细描述与分类学位置见述于Wu，S.-H.等人，Antrodiacinnamomea(牛樟芝)，New combination of a medicinal fungus inTaiwan，Bot.Bull.Acad.Sin.38：273-275。

在台湾民间医药中，认为牛樟芝的子实体具有某些医疗效果。依照传统方法将子实体磨制成干燥粉末或与其它草药炖煮后口服，用来治疗因中毒、腹泻、腹痛、高血压、皮肤疥癣和肝癌所引起的症状。然而至今几乎没有药理学或临床研究出现在文献中。因为具有严格的宿主特异性并且在自然中稀少，以及人工栽培失败之故，“牛樟芝”在台湾的价格十分昂贵。近年来，具高品质的该真菌子实体已被贩售至极高的价钱，约是每千克15000美元。

发明内容

因此，本发明的目的是提供来自牛樟芝菌丝体的新混合物。

本发明的另一目的是提供来自牛樟芝菌丝体的新化合物。

本发明的再一目的是提供包含本发明的化合物的新组合物。

本发明的再一目的是提供包含本发明的化合物的新的牛樟芝菌丝体。

附图说明

图1显示化合物2的HMBC相关。

图2显示本发明的化合物。

图3显示本发明的化合物4及5的NOE(核欧沃豪斯效应)相关。

图4a-d显示本发明的化合物3的试验结果。

图5a-c显示ACM(牛樟芝菌丝体粉末)水萃取物的试验结果。

图6a-f显示ACM乙醇萃取物的试验结果。

图7a-e显示本发明的化合物1的试验结果。

具体实施方式

本发明提供下式的化合物

其中

X为N或O；

R₁为C_1-10烷氧基、C_2-10链烯氧基或C_2-10炔氧基；

R₂为H、C_1-10烷基、C_2-10链烯基或C_2-10炔基；且

R₃不存在，或为H或羟基；

条件是如果X为O，则R₃不存在。

在本发明的化合物中，优选R₁为C_2-6链烯氧基或C_2-6炔氧基；更优选R₁为经C_1-6烷基取代的C_2-6链烯氧基，而最优选R₁为经甲基取代的丁烯氧基。在本发明的化合物中，优选R₂为C_1-6烷基，最优选R₂为异丁基。

因此，本发明的优选化合物为3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]呋喃-2，5-二酮、3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-2，5-二酮、3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-1-醇-2，5-二酮、3R^*，4S^*-1-羟基-3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2，5-二酮，或3R^*，4R^*-1-羟基-3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2，5-二酮。

本发明的更优选的化合物为3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-2，5-二酮或3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-1-醇-2，5-二酮。

本发明的进一步优选的化合物为3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-1-醇-2，5-二酮。

本发明亦提供来自牛樟芝菌丝体的混合物，其包含本发明的化合物。本发明的混合物制备自牛樟芝菌丝体的水或有机溶剂萃取物。该有机溶剂包括但不限于醇(如CH₃OH、C₂H₅OH或C₃H₇OH)、酯(如乙酸乙酯)、烷(如己烷)及卤代烷(如CH₃Cl、C₂H₂Cl₂)。优选的有机溶剂为乙醇或不引起人的任何副作用的含乙醇的溶剂。本发明的混合物可减低收缩压或增加高密度脂蛋白。此外，相同的混合物具有中枢胆碱能激动、保肝、抗炎或抗肿瘤活性。详言之，本发明的混合物可抑制选自肝、肠、骨、血、淋巴及乳房的细胞或组织的肿瘤。接受本发明的混合物的受试者包括但不限于人、哺乳动物、小鼠、大鼠、马、猪、鸡、鸭、狗与猫。

本发明亦提供包含本发明的化合物的组合物。本发明的组合物可减低收缩压或增加高密度脂蛋白。此外，本发明的组合物具有中枢胆碱能激动、保肝、抗炎或抗肿瘤活性。详言之，本发明的组合物可抑制选自肝、肠、骨、血、淋巴及乳房的细胞或组织的肿瘤。接受本发明的组合物的受试者包括但不限于人、哺乳动物、小鼠、大鼠、马、猪、鸡、鸭、狗与猫。

本发明亦提供包含本发明的化合物的牛樟芝(Antrodia)菌丝体。优选的菌丝体其至少1％原菌丝体的重量为本发明的化合物1-5的总重。最优选的菌丝体其至少3％原菌丝体的重量为本发明的化合物1-5的总重。依先前深层液体发酵(submerged liquid fermentation)制备牛樟芝菌丝体，深层液体发酵如T.L.M.Stamford等人，Food Science“Protein enrichment of cashew wastes for animal feeds”，来自http://www.unu.edu/unupress/food/8F10le/8F10lE0b.htm。

实施例

下列实施例是非限制性的，且仅代表本发明的各种态样及特征。

一般实验程序

以Yanagimoto小型热台熔点测定器测量熔点，且未校正。以JascoDIP-360自动旋光仪测量旋光性。以Shimadzu UV-2200自记分光光度计测量紫外光谱。以Jasco FT/IR-230红外分光计测量红外光谱。以Varian Unity Plus 500光谱仪测量¹H-和¹³C-NMR谱。以JeolJMS-AX 505 HAD质谱仪在70eV的电离电压下测量EIMS和HR-EIMS。采用BW-820MH(正相)和Chromatorex-ODS DM1020T(反相)(Fuji Silysia)的硅胶进行柱色谱。

萃取与分离

在回流下，将来自台湾善笙生物科技股份有限公司，2001年10月的牛樟芝菌丝体粉末(60克)用氯仿萃取3小时，萃取三次。对氯仿萃取物(5.3克)进行硅胶色谱，以正己烷-丙酮(19∶1-14∶6)和氯仿-甲醇(1∶1)洗脱，得到九个部分(Fr.1-9)。对第二部分进行硅胶色谱，得到化合物1(8.7毫克)。对第四部分进行正相与反相硅胶色谱，得到化合物2(13.6毫克)。对第五部分进行硅胶色谱，以正己烷-丙酮(8∶2)洗提，得到麦角甾醇过氧化物(35.8毫克)。对第六部分进行组合的正相及反相硅胶柱色谱，得到化合物3(14.6毫克)。对第七部分进行柱色谱，得到化合物4和5(4∶1)的混合物，随后对4和5的混合物进行制备HPLC分离[柱：Tosoh TSK-gel ODS-80T_M(21.5×300毫米)，流动相：含有0.1％TFA的甲醇-水(70∶30)]。

3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-呋喃-2，5-二酮(化合物1)：黄色油；UV(MeOH)λ_max(logε)227(4.1)，258(3.9)，275(3.8)，355(3.4)nm；IR(CHCl₃)v_max 1763cm^-1，¹H-NMR表1；¹³C-NMR表2；EIMS m/z 314[M]⁺(100)，246(100)，131(100)；HR-EIMSm/z314.1523(C₁₉H₂₂O₄的计算值：314.1518)。

3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-2，5-二酮(2)：黄色针状结晶(正己烷-乙酸乙酯)；mp 110-111℃；UV(甲醇)λ_max(logε)230(4.3)，272(3.5)，355(3.7)nm；IR(CHCl₃)v_max 1724cm^-1；¹H-NMR表1；¹³C-NMR表2；EIMS m/z 313[M]⁺(8)，245(100)，203(77)，131(28)；HR-EIMS m/z 313.1681(C₁₉H₂₃NO₃的计算值：313.1678)。

化合物2的X-射线晶体学：

由正己烷-乙酸乙酯结晶而获得黄色针状结晶，经选出后供数据收集。晶体数据：C₁₉H₂₃NO₃；Mr＝313.40；大小0.15×0.02×0.02毫米；三斜晶空间群P1(#2)，a＝6.3505(5)b＝12.205(1)c＝12.560(2)α＝64.623(7)°，β＝75.358(4)°，γ＝84.681(5)°，V＝850.9(2)Z＝2，D_calc＝1.223g/cm³，μ(MoKα)＝0.82cm^-1，F000＝336.00。于93K下放射，以具有石墨单色的Mo-Kα(λ＝0.71069)的Rigaku RAXIS-RAPID影象板衍射计进行测量。在采集的8950个反射中，4745个为独特的(R_int＝0.108)；合并相等反射。以直接法(SHELXS86)解析晶体结构并以全矩阵最小二承方精算。非均质地(anisotropically)精算非氢原子。氢原子被包括在内但不精算。最终指数R＝0.074，R_w＝0.099，而GOF(Guest Observer Facility，客体观察设施)＝1.06。最终差值傅立叶图的最大与最小峰分别对应于0.83及-0.89e^-/

3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-1-醇-2，5-二酮(化合物3)：黄色油；UV(MeOH)λ_max(logε)：232.5(4.3)，296(3.7)，374(3.7)nm；IR(CHCl₃)v_max 1717cm^-1；¹H-NMR表1；¹³C-NMR表2；EIMS m/z 329[M]⁺(12)，261(100)，131(50)；HR-EIMS m/z：329.1637(C₁₉H₂₃NO₄的计算值：329.1627)。

3R^*，4S^*-1-羟基-3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2，5-二酮(4)：无色油；[α]_D ²³+2.5°(c0.2，甲醇)；UV(甲醇)λ_max(logε)：225(4.3)，275(3.3)，283(3.2)nm；IR(CHCl₃)v_max 1715cm^-1；¹H-NMR表1；¹³C-NMR表2；EIMS m/z 331[M]⁺(2)，263(67)，207(66)，191(30)，179(40)，133(64)，69(100)；HR-EIMS m/z：331.1747(C₁₉H₂₅NO₄的计算值：331.1783)。

3R^*，4R^*-1-羟基-3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2，5-二酮(5)：无色油；[α]_D ²³+3.0°(c0.2，MeOH)；UV(MeOH)λ_max(logε)：227(4.3)，275(3.4)、283(3.3)nm；IR(CHCl₃)v_max 1715cm^-1；¹H-NMR表1；¹³C-NMR表2；EIMS m/z 331[M]⁺(1)，263(45)，207(50)，191(75)，179(30)，133(100)，69(92)；HR-EIMS m/z：331.1766(C₁₉H₂₅NO₄的计算值：331.1783)。

麦角固醇过氧化物：无色针状结晶(正己烷-丙酮)；mp 165-169℃(lit²mp 171-174℃)。

细胞毒性测定：采用sulforhodamin B(SRB)进行法体外LLC肿瘤细胞测定。以Probit法计算50％生长抑制(ED₅₀)。

结果与讨论

对牛樟芝菌丝体的氯仿萃取物重复进行正相及反相硅胶色谱，以获得五种新的马来酸和琥珀酸衍生物(化合物1-5)与麦角固醇过氧化物。

表1

化合物1-5的¹H-NMR谱数据(δppm，J＝Hz)(500MHz，CDCl₃)

表2

化合物1-5的¹³C-NMR谱数据(δppm)(125MHz，CDCl₃)

a)归属是可互换的。

新化合物的结构如下确定：

化合物2为黄色针状结晶，mp 110-111℃，由HR-EIMS分析其分子式为C₁₉H₂₃NO₃。红外光谱在1724cm^-1显示二酰亚胺羰基吸收。¹³C-NMR谱显示在脂肪族区有四个甲基碳、两个亚甲基碳与一个次甲基碳信号，以及一个苯环、一个烯基和两个羰基碳。¹H-NMR谱显示在δ0.90、2.06和2.51有异丁基部分，在δ1.76、1.81、4.56和5.50有3-甲基2-丁烯氧基部分，并且在6.95和7.50有对位取代的苯部分，该对位取代的苯部分由¹H-¹H COSY(冷却同步加速器)和HMQC(异核多量子相关)实验进一步支持。通过HMBC观察到长范围相关，如图1所示。基于分子式与¹³C-NMR谱，推断此化合物含有另外的CHNO原子，包括多于一个羰基碳。因此，推测该不清楚的部分为马来酰亚胺基。然后通过X-射线分析确定此结构为3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-2，5-二酮。

化合物1的分子式由HR-EIMS分析为C₁₉H₂₂O₄。红外光谱显示在1763cm^-1处有酸酐的羰基吸收。化合物1的¹H-NMR谱与化合物2的类似，显示有异丁基部分、3-甲基2-丁烯氧基部分、对位取代的苯环的存在。HMBC谱表明化合物1具有与化合物2部分相同的结构(图1)，其中根据分子式推断马来酸酐的存在。因此，确定化合物1为3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]呋喃-2，5-二酮。

化合物3的分子式由HR-EIMS分析为C₁₉H₂₃NO₄。红外光谱显示在1717cm^-1处有羰基吸收，可归属为羟基二酰亚胺。¹H-和¹³C-NMR谱也与化合物1和2的类似，显示有异丁基部分、3-甲基2-丁烯氧基部分、对位取代的苯环的存在。在HMBC实验中，证明化合物3具有部分结构与化合物2相同(图1)。化合物3比化合物2多含有一个氧原子，因此，确定此化合物为3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-1-醇-2，5-二酮。

由HR-EIMS分析出化合物4和5有相同的R_f值与相同的分子式(C₁₉H₂₅NO₄，实测值分别为331.1747和331.1766)，然而它们可以通过制备HPLC分离。二化合物的红外光谱显示在1715cm^-1处有羟基二酰亚胺羰基吸收。在¹H-和¹³C-NMR谱中，二化合物均显示有异丁基部分、3-甲基2-丁烯氧基部分、对位取代的苯环的存在，但异丁基亚甲基质子显示多重峰而非如化合物1-3是二重峰。¹H-¹H COSY谱显示该亚甲基连接于-CH-CH-单元上。化合物4和5的¹³C-NMR谱显示两个额外的sp³碳信号，代替在化合物1-3中发现的sp²碳信号。因此，化合物4和5不是N-羟基马来酰亚胺，而是N-羟基琥珀酰亚，于琥珀酰亚胺环的C-3和C-4位具有立体中心。化合物4和5由H-3和H-4之间的偶合常数(化合物4和5分别为4.0与8.0Hz)确定分别为反式与顺式异构体。在化合物4的NOESY(核欧沃豪斯效应)谱中没有观察到H-3和H-4之间的NOE，而在化合物5的NOESY谱中则观察到明显的NOE。化合物4和5的旋光性分别为+2.5°和+3.0°，而它们的CD谱显示在任何波长均无卡滕效应，表明化合物4和5均为外消旋混合物。使用手性柱，用几种溶剂系统通过HPLC拆分这些外消旋混合物并未成功。目前，我们无法明确推断这些化合物是光学活性化合物还是消旋混合物。因此，它们的相对结构分别确定为3R^*，4S^*-和3R^*，4R^*-1-羟基-3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2，5-二酮。

根据Aquveque等人的报告第二次分离这些类型的来自天然的马来酸和琥珀酸衍生物。

使用LLC(Lewis肺癌)细胞系研究氯仿萃取物与分离的化合物的细胞毒活性(表3)。氯仿萃取物显示中等细胞毒作用，其ED₅₀值为26.7微克/毫升。马来酸化合物1和4不具细胞毒活性，而发现化合物2和3对于LLC细胞系具细胞毒性，其ED₅₀值低于氯仿萃取物的。表3来自牛樟芝菌丝体的氯仿萃取物与化合物1-4对LLC细胞系的50％生长抑制(ED₅₀)值

a)阳性对照

ACM(牛樟芝菌丝体粉末)的肿瘤测定

A.细胞系

粘附细胞：

MCF-7：人乳腺癌

HT-29：人结肠腺癌

KATO III：人胃腺癌

SW480：人结肠腺癌

SW620：人结肠腺癌

HepG2：人肝腺肿瘤

悬浮细胞：

EL4：小鼠淋巴瘤

B.样品

化合物1、化合物3、ACM乙醇萃取物、ACM水萃取物

C.测定方法

计算ED₅₀(有效剂量的50％抑制)

粘附细胞：MTT(甲基噻唑基四唑鎓)法：对于MCF-7、HT-29、KATO III、SW480、HepG2，3天确定细胞。SW6204天。

悬浮细胞：细胞计数法；EL4细胞计数5天。

D.结果

计算：y＝m Ln(x)+b

实例

X	Y
		0	0.97
10ppm	0.941
		30ppm	0.6
100ppm	0.331

使用X(10、30、50ppm)与Y值得到相关曲线

y＝-0.2643Ln(x)+1.5321

ED₅₀＝exp【(0.97/2-1.5321)/(-0.2643)】

样品制备与样品描述

A.ACM(牛樟芝菌丝体粉末)的水萃取物

1.将1克ACM加入装有40毫升RO H₂O的250毫升烧杯中，室温下将烧杯置于超声水浴中，持续20分钟。

2.在45℃下搅拌水浴45分钟。

3.将烧杯置于超声水浴中再持续20分钟。

4.于3000rpm下将样品离心15分钟。

5.收集上清液，并用培养基进行连续稀释。

B.测定样品浓度

1.蒸发盘秤重(W1)。

2.将10毫升水萃取物加入蒸发盘内

3.将蒸发盘置入烘箱内以除去水分(W2)

样品重/毫升＝(W2-W1)/10

C.ACM(牛樟芝菌丝体粉末)乙醇萃取物

1.将100毫升95％乙醇加入装有20克ACM的500毫升烧杯中，并在室温下搅拌10分钟。

2.以Advantec 1号滤纸过滤悬浮液，并收集滤液。

3.以旋转式真空蒸发仪浓缩滤液，除去乙醇。

D.化合物1：来自ACM的纯化合物

E.化合物3：来自ACM的纯化合物

MTT测定法

1.细胞增殖后弃去旧培养基，然后以磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗细胞一次。

2.以胰蛋白酶-EDTA冲洗细胞。

3.于1200rpm下离心5分钟，然后弃去上清液。

4.以10毫升培养基悬浮团粒。

5.将100微升细胞悬浮液与100微升台盼蓝混合，以计算存活细胞。

6.在96孔盘的每孔中加入1×10⁴个细胞/100微升培养基，将盘于37℃下在二氧化碳培养箱中培养24小时。

7.弃去旧培养基，以PBS清洗细胞一次。

8.在每孔中加入100微升样品，将盘于37℃下在二氧化碳培养箱中培养。

9.在第3、4和5天以PBS清洗细胞一次。

10.在每孔中加入57微升MTT(0.88毫克/毫升)。

11.4小时后弃去MTT，并以PBS清洗细胞一次。

12.每孔加入50微升DMSO。

13.以ELISA仪在OD545下读取结果。

细胞计数法(EL4细胞系)

1.细胞增殖后通过离心弃去旧培养基。

2.以新鲜培养基将团粒再悬浮。

3.将100微升细胞悬浮液与100微升台盼蓝混合，以计算存活细胞。

4.制备含有1×10⁵个细胞/毫升样品的不同浓度的样品。

5.于96孔盘的每孔中放入100微升样品，将盘于37℃下在二氧化碳培养箱中培养。

6.在第3、4和5天计算存活细胞。

PBS

NaCl      8克

KCl       0.2克

Na₂HPO₄   1.4克

KH₂PO₄    0.2克

体积调为1升PH 7.4

结果与讨论

ACM于细胞系的ED₅₀

细胞系	HepG2	HT-29	KATO III	EL4	SW480	SW620	MCF-7
								化合物1	21ppm	52ppm	38ppm	3.5ppm		15ppm	6ppm
化合物3	35ppm	42ppm	69ppm	2.6ppm	20ppm	27ppm	0.02ppm
								ACM乙醇萃取物	32ppm	52ppm	156ppm	2.6ppm	71ppm	4ppm
ACM水萃取物	295ppm	707ppm		20ppm	207ppm	132ppm	318ppm

详细实验结果如下：

本发明的化合物3：HepG2(图4a)，EL4(图4b)，HT-29(图4c)和Kato III(图4d)。

ACM水萃取物：HepG2(图5a)，SW620(图5b)和EL4(图5c)。

ACM乙醇萃取物：HT-29(图6a)，SW480(图6b)，SW620(图6c)，EL4(图6d)，HepG2(图6e)和Kato III(图6f)。

本发明的化合物1：MCF-7(图7a)，EL4(图7b)，HT-29(图7c)，SW620(图7d)和HepG2(图7e)。

以上结果证明，本发明的化合物与ACM萃取物对各种类型的肿瘤细胞具有抑制作用。

通过高效液相色谱法分析来自ACM乙醇萃取物的所有新化合物(1、2和3)

目的：为了测量来自ACM乙醇萃取物的所有新化合物(1、2和3)的量，采用高效液相色谱法作为我们的常规质量控制程序。

制备ACM乙醇萃取物样品：

1)、以电子天平精确秤重样品粉末20.000(克)，置入含有100毫升95％乙醇的刻度实验瓶中，其瓶盖勿旋紧。

2)、将上述步骤的样品瓶置于超声水浴中10分钟。

3)、将液体样品倒入离心管中，随后将那些样品在6500rpm条件下离心5分钟，以除去粗颗粒。

4)、以advantec 1号滤纸过滤液体层。

5)、以旋转式真空蒸发仪浓缩过滤液，直至出现粘稠、不含乙醇的淡黄色液体。

6)、重复步骤1至5三次，并收集所有萃取产物(总ACM乙醇萃取物＝4.60克)，计算收率。

2690型Water HPLC的应用：

1)、柱：反相C18

2)、流动相：甲醇、水、乙腈

3)、注射体积：20微升

4)、检测：光电二极管阵列检测仪996于波长254nm下测量

5)、准备于10毫升乙醇中的1.000(克)ACM乙醇萃取物样品，以进行HPLC分析^*：

结果：根据HPLC分析，含有纯化合物1、2和3的萃取产物显示于下表4中。

表4：

因此，化合物1、2和3的总重为ACM样品重量的5.92％。

ACM乙醇萃取物的试验

材料与设备

1.试验物质和给模式

所有体内试验皆以口服于2％Tween 80载体中1000毫克/千克的初始剂量试验物质给予。每个试验的观察时间描述于方法中。

2.动物

使用由台湾泛球药理研究所提供的雄性或雌性ICR小鼠、Wistar-Okamoto衍生系雄性自发性低血压大鼠(SHR)、Wistar与Long Evans衍生系大鼠。动物饲养空间如下：29×18×13厘米空间饲养10只小鼠，45×23×21厘米空间饲养6只大鼠，45×23×21厘米空间饲养3只豚鼠。小鼠和大鼠饲养在APEC^R笼子内。由国立台湾大学动物中心提供的重21±2克，6-8周大的C57BL/6J免疫活性雄性小鼠亦在本研究中使用。将实验动物饲养在独立通风的笼架(IVC架，36小型隔离系统)。每个笼子予以高压灭菌，并含有5只小鼠(在26.7×20.7×14厘米的空间内)。在使用前所有动物均于控温(21°-23℃)及控湿(60％-70％)环境中，在实验室中，于12小时光照周期下保持至少一周。提供标准实验饲料(LabDiet Rodent Diet与Guinea Pig Diet，PMI Nutrition International，美国)与自来水自由进食。

3.细胞系与培养基

鼠黑素瘤细胞，B16-F0(ATCC CRL-6322)购自American TypeCulture Collection，并以Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (GIBCO，美国)作为细胞培养基。将肿瘤细胞培养于37℃并含有5％CO₂的空气中。

4.化学药品

一般：

蒸馏水(自制)，二甲基亚砜(DMSO，Merck，德国)，等张氯化钠溶液(信东化学工业股份有限公司，台湾)，硫酸镁(MgSO₄·7H₂O，Wako，日本)，甲氯灭酸钠(Sigma，美国)，甲基纤维素(Signa，美国)，氢氧化钠(NaOH，Wako，日本)，磷酸盐缓冲盐水(Sigma，美国)和Tween 80(Wako，日本)。

试剂

Glicose-HA测定试剂盒(Wako，日本)，丙氨酸氨基转移酶(ALT)测定试剂盒(Wako，日本)，天门冬氨酸氨基转移酶(AST)测定试剂盒(Wako，日本)，T-胆固醇-HA与HDL测定试剂盒(Wako，日本)，Hemolynac 3Hemolys(Nihon Koden，日本)，Isotonic 3 Diluent(NihonKoden，日本)。

5.设备

一般使用：

动物箱(信德，台湾)，250毫升与1000毫升烧杯(Kinmax，美国)，一次性注射器(1毫升，Top Corporation，日本)，不锈钢镊子(klappencker，德国)，鼠秤(mouse scale)#Z-40(Taconic，美国)，口服喂食注射筒(Natsune，日本)，皮下注射针23G x 1”(Top Corporation，日本)，pH计(Suntex，美国)，鼠秤500克±2克(Chien-chun，台湾)，玻璃注射器1毫升、2毫升和5毫升(Mitsuba，日本)，以及不锈钢剪刀(Klappencker，德国)。

方法与结果：

1.胆碱能激动，中枢/外周(Lippmann W和Pugsley TA，Arch IntPharmacodyn.227：324，1977)。

将测试物质口服给予3只重150±20克的Wistar衍生系雄性或雌性大鼠组。在随后的30-60分钟内，记录累积测量的出现超过10秒咀嚼行为(口和/或舌运动)的动物数目，以及出现唾液分泌的动物数目。观察到3只大鼠中的2只或更多(≥2)的阳性反应表示可能有中枢胆碱能活性和外周胆碱能活性。

表5：胆碱能激动结果，中枢/外周，在大鼠中

载体与测试物质以口服(PO)给予，而阳性对照化合物腹膜内注射(IP)给予。在随后的30-60分钟的时间内，记录累积测量的出现超过10秒钟咀嚼行为(口和/或舌运动)的动物数目，以及出现唾液分泌的动物数目。观察到3只大鼠中的2只或更多(≥2)的阳性反应表示可能有胆碱能活性或外周胆碱能活性。

2.心血管、血压和心率(SHR 0、1、2、4小时)(Yen TT等人，Lite Sci.22：359，1978)

使用3只重250±20克的Wistar-Okamoto衍生系自发性高血压雄性鼠(SHR)组；平均收缩压为200±20mmHg，心率为400±30次/分钟。血压与心率通过tail cuff法在控温环境(32±1℃)下，于口服给予测试物质或载体之前(0时)和之后1、2、4小时间接纪录。当每次于间隔时间测量后与0时相比，收缩压下降10％或更多(≥10％)，或心率下降20％或更多(≥20％)，则认为是显著的。

表6：大鼠中心血管、血压结果(SHR 0、1、2、4小时)

表7：心血管、心率结果(SHR 0、1、2、4小时)

使用收缩压为200±20mmHg与心率为400±50mmHg次/分钟的SHR。血压是经由vial tail cuff法于口服给予测试物质或载体后0时和1、2、4小时作间接纪录。当每次测量时间点与在括号中给出的0时的相比，血压下降10％或更多(≥10％)，或心率下降20％或更多(≥20％)，则视为是显著的。

载体                 10ml/kg 0时229mmHg与403mmHg次/

                     分钟当作100％。

ACM-乙醇萃取物       1000mg/kg 0时223mmHg与452mmHg次/

                     分钟当作100％。

可乐定               0.1mg/kg 0时228mmHg与379mmHg次/

                     分钟当作100％。

表8：在大鼠中的心血管、血压结果(SHR 0、1、2、4小时)

表9：心血管、心率结果(SHR 0、1、2、4小时)

使用收缩压为200±20mmHg与心率为400±50mmHg次/分钟的SHR。血压是经由vial tail cuff法于口服给予测试物质或载体(之前)0时和之后1、2、4小时作间接纪录。每个测量时间点与在括号中给出的0时相比，血压下降10％或更多(≥10％)，或心率下降20％或更多(≥20％)，则视为是显著的。

载体                  10ml/kg 0时220mmHg与410mmHg次/

                      分钟当作100％。

ACM-乙醇萃取物        300mg/kg 0时205mmHg与446mmHg次/

                      分钟当作100％。

可乐定                0.1mg/kg 0时235mmHg与417mmHg次/

                      分钟当作100％。

3.胆固醇、血清(总HDL、总量/HDL比)，饮食诱发的(Schurr PE等人，Atherosclerosis Drug Discovery.Plenum，New York，pp.215-229，1976)。

给重量为22±2克的5只ICR衍生系雄性小鼠组喂食高脂食物(g/100g：椰子油，8；胆固醇，1.0；胆酸，0.3；猪油，2；标准食物88.7)7天以引发高胆固醇血症。在第5、6、7天口服给予测试物质。经整夜禁食后，从每只小鼠获得血清用来测定总胆固醇(总量)、高密度脂蛋白(HDL)和总量/HDL的改变百分比。与以载体治疗的对照动物相比，血清总量下降20％或更多(≥20％)，或血清HDL上升20％或更多(≥20％)，或总量/HDL下降40％或更多(≥40％)，视为是显著的。

表10：在小鼠中由饮食引起的胆固醇(总量/HDL，总量/HDL比)结果

在喂食高胆固醇食物后的第5、6、7天口服(PO)给予载体、测试物质或对照阳性化合物。在第三次给药后二十四小时，将整夜禁食的实验动物处死，以评估血清总胆固醇(总量)和高密度脂蛋白(HDL)。血清总量下降20％或更多(≥20％)，或血清HDL上升20％或更多(≥20％)，或总量/HDL比下降40％或更多(≥40％)，则认为是显著的。

4.肝损伤，D-半乳糖胺(Wrobel J等人，J.Med Chem 41：1084，1998)。

使用重量为200±20克的5只Wistar衍生系雄性大鼠组。每只动物以单一注射D-半乳糖胺(500mg/kg，IP)治疗。在D-半乳糖胺给药之前0.5小时与之后4小时和8小时口服给予测试物质，在24小时后处死动物。血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)水平以HITACHI自动分析仪(7050型)测量，通过最优化的UV法来测量。与以载体治疗的对照动物相比，ALT或AST活性下降30％或更多(≥30％)，则表明显著的保护。

表11：肝损伤的结果，半乳糖胺，在大鼠中

在半乳糖胺一次给药(500mg/kg，IP)之前0.5小时与之后4小时和8小时口服给予测试物和载体，在半乳糖胺注射24小时后处死大鼠，并测定ALT和AST值。与载体组相比，ALT和AST下降≥30％视为是显著的。

5.炎症，角叉菜聚糖(Winter CA等人，Proc Soc Exp Biol Med.111：544，1962)

重量为150±20克的3只Long Evans衍生系雄性或雌性组，在研究前先禁食整晚。在右后爪接受注射角叉菜聚糖(0.1毫升1％内置(intraplantar)悬浮液)1小时前口服给予测试物质。后爪水肿作为炎症的量度，在给予角叉菜聚糖3小时后使用带有水槽(直径25毫米)的器官充满度测量器纪录。后爪水肿下降30％或更多(≥30％)表明显著的抗炎活性。

表12：炎症结果，角叉菜聚糖，在大鼠中

表13：炎症结果，角叉菜聚糖，在大鼠中

在右后爪(R.P.)注射角叉菜聚糖(0.1毫升1％内置(intraplantar)悬浮液)前1小时给予整夜禁食大鼠测试物质和载体；左后爪(L.P.)则不注射。括号中所示的后爪水肿下降30％或更多(≥30％)表明显著的急性抗炎活性。

6.肿瘤，同源黑素瘤B 16-F0细胞(Farrugia CA和Groves MJ.，Anticancer Research 19：1027-1032，1999)

使用5只无特殊病原体的(SPF)、免疫活性(6-8周大)的C57BL/6J雄性小鼠组，其饲养于无特殊病原体的(SPF)环境下的动物隔离间(IVC架)内。将与C57BL/6J小鼠同源的B16-F0鼠黑素瘤活细胞(ATCC CRL-6322，0.2毫升内有1.0×10⁵个细胞)皮下注射入实验小鼠的背侧。肿瘤接种后24小时开始治疗，每日以口服管饲方式给予测试化合物21天，或者当出现明显毒性症状时减少天数。自第1天至第22天监测小鼠的体重、肿瘤大小与存活。此外监控实验小鼠的存活，直至研究后第45天结束。

根据长椭球公式来评估肿瘤重量(毫克)：长(毫米)×[宽(毫米)]²×0.5，假设比重为1，π为3。化合物治疗的动物中的肿瘤生长以T/C(治疗/对照)×100％来计算；T/C值≤42％，则表明显著的抗肿瘤活性。T/C(治疗/对照)的平均存活时间≥125％亦视为具有显著的抗肿瘤活性。

表14：肿瘤，同源黑素瘤B16-F0细胞结果

表15：肿瘤，同源黑素瘤B16-F0细胞结果

肿瘤细胞植入24小时后，每天给予实验动物载体与测试物质，总共21次给药。同时，对照化合物，丝裂霉素以IP方式每周给予两次，总共6次给药。肿瘤大小每周测量与纪录两次，为期22天。以T/C(重量/对照)×100计算肿瘤生长抑制。T/C值≤42％视为具有显著的抗肿瘤活性。

表16：肿瘤，同源黑素瘤B16-F0细胞的结果

肿瘤细胞植入24小时后，每天给予实验动物载体与测试物质，总共21次给药。同时，对照化合物，丝裂霉素以IP方式每周给予两次，总共6次给药。肿瘤大小每周测量与纪录两次，为期22天。使用斯氏t检验确定测试化合物与载体对照组之间的体重变化的显著性差异。

表17：肿瘤，同源黑素瘤B16-F0细胞结果

a：若动物于45天后并未死亡，则其存活期当作45天。

监测治疗小鼠的存活至45天研究期，或至实验动物死亡为止。T/C(治疗/对照)的平均存活时间≥125％亦视为具有显著的抗肿瘤活性。

讨论：

依照自定标准，口服(PO)给予ACM-乙醇萃取物，在以下小鼠与大鼠测定中导致显著活性：

在大鼠中1000毫克/千克的中枢胆碱能激动；最小和不显著的激动在300毫克/千克下可见；在1000毫克/千克下对外周胆碱性神经没有显著的激动或拮抗(表5)。

在自发性高血压(SH)大鼠中，于1000毫克/千克下，收缩压减少(于1、2和4小时的时间点观察，与0时的100％相比，分别为16％、12％和20％)，且伴有心率中度但不显著的下降(表6和7)；300毫克/千克的剂量并未导致收缩压和心率的显著变化(表8和9)。

在1000毫克/千克下，在饮食诱发的小鼠中增加高密度脂蛋白(HDL，比载体对照多39％)(表10)；相关的总胆固醇(总量)未显著改变，而HDL/总量比显著下降至接近31％；300毫克/千克的剂量并未造成总量、HDL和HDL/总量比显著改变。

对半乳糖胺诱发的大鼠肝损伤，在1000毫克/千克×3下可见保肝作用(与载体对照相比，ALT下降44％而AST下降57％)；在300毫克/千克×3下可见ALT 20％的中度下降而AST下降28％(表11)。

在1000毫克/千克下对角叉菜聚糖诱发的大鼠爪水肿的抗炎作用(与载体对照相比45％抑制)(表12)；更低的300毫克/千克水平没有显著活性(与载体相比3％抑制，表13)。

在1000毫克/千克下，于第8、11和15天在C57BL/6J小鼠同源黑素瘤B16-F0细胞中的抗肿瘤活性(表14和15)，以及动物存活时间的延长(表17)；动物体重未显著改变(表16)。

本发明的ACM、ACM-乙醇萃取物和化合物3的测试

使用九组，每组5只ICR衍生系雄性小鼠(重22±2克)。每只动物以单一剂量的四氯化碳(CCl₄，于50％橄榄油中，0.1毫升/千克，PO)激发免疫反应。在四氯化碳激发之前30分钟与之后4和8小时口服给予测试物质，剂量为300和1000毫克/千克的ACM，或剂量为30、100和300毫克/千克的本发明的化合物3；而在四氯化碳之前1天(每天两次)和30分钟以及之后4和8小时对口服给予的300和1000毫克/千克ACM乙醇萃取物进行预处理。于四氯化碳后24小时处死动物。使用HITACHI自动分析仪(7050型)以最优化的UV法测量丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)水平。与载体相比，ALT或AST水平下降30％或更多(≥30％)，表明对肝损伤有显著的保护作用。

结果

表18：测定肝损伤，四氯化碳，在小鼠中

讨论：

评价了本发明的ACM、ACM-乙醇萃取物和化合物3对由四氯化碳诱发的ICR小鼠的肝损伤的可能保护活性。在四氯化碳激发之前0.5小时和之后4和8小时，将测试物质，剂量为300和1000毫克/千克的ACM-乙醇，和剂量为30、100和300毫克/千克的本发明的化合物3口服给予试验动物。对于300和1000毫克/千克的ACM乙醇萃取物，在四氯化碳之前1天进行两次治疗(9:00AM和16:00PM)(b.i.d.)，并接着在四氯化碳激发之前0.5小时与之后4小时和8小时进行治疗(总计5次给药)。通过相对于载体治疗的动物而言的血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)的增加来确定肝损伤的程度。剂量为1000毫克/千克×3的ACM与剂量为300毫克/千克×3的本发明的化合物3导致，相对于载体治疗的动物而言，ALT(46％和41％)和AST(36％和33％)的显著减少。同时剂量为300和1000毫克/千克×5的ACM-乙醇萃取物也导致ALT(36％和34％)以及AST(25％和20％)的显著减少。

同时测试水飞蓟素(100毫克/千克×3，IP)显示相对于载体治疗组，ALT(31％)和AST(31％)的显著减少。

得出结论，本发明的ACM、ACM-乙醇萃取物和化合物3，在小鼠四氯化碳模型中具有显著的保肝活性。

尽管已对本发明进行的描述及例示详细至足以使本领域技术人员制造并使用之，但是在不背离本发明的实质与范围的前提下，各种替代、改变与改进应是明显的。

本领域技术人员容易理解，本发明适于达到目的，并得到本文所述及其固有的结果及优点。细胞系、胚胎、动物及其制造过程和方法代表优选的实施方案，是示例性的，并非欲限制发明的范围。本领域技术人员将会想到对其的修改及其它用途。这些修改均涵盖在本发明的实质内并由权利要求的范围定义。

本领域技术人员将容易地知道，在不背离本发明的范围与实质的前提下对本发明进行变更与修改。

说明书中提到的所有专利及著作均表示本发明所属技术领域的普通技术人员的水平。就像每件单个著作被具体和单个地指明引入作为参考一样，所有专利及著作均引入作为参考。

本文示例性地描述的本发明可在没有具体公开在本文中的一个或多个元素、一个或多个限制下得到施行。所采用的术语及表达仅为说明性而非限制性术语，且非欲用这些术语及表达来排除任何所示及所述或其部分特征的等价物，而是认为在要求保护的发明范围内各种改变是可能的。因此，应理解，虽然已通过优选实施方案及任选的特征具体描述了本发明，但本领域技术人员可能采用本文所公开的构思的改变和变体，认为这些修改与变体在由所附权利要求定义的发明范围内。

其它实施方案在所附权利要求中说明。

Claims (10)

1.以下化合物：

3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]呋喃-2，5-二酮，

3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-2，5-二酮，

3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-1-醇-2，5-二酮，

3R^*，4S^*-1-羟基-3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2，5-二酮，或

3R^*，4R^*-1-羟基-3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2，5-二酮

2.来自牛樟芝菌丝体的混合物，其制备自牛樟芝菌丝体的水或有机溶剂萃取物；所述混合物含有3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]呋喃-2，5-二酮、3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-2，5-二酮、3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-1-醇-2，5-二酮、3R^*，4S^*-1-羟基-3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2，5-二酮或3R^*，4R^*-1-羟基-3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2，5-二酮。

3.权利要求2的混合物，其中该有机溶剂为醇、酯、烷或卤代烷。

4.权利要求3的混合物，其中该醇为乙醇。

5.权利要求2的混合物在制备用于减低收缩压、增加高密度脂蛋白或用于中枢胆碱能激动、保肝、抗炎或抗肿瘤的药物中的用途。

6.权利要求5的用途，其中肿瘤来自选自肝、肠、骨、血、淋巴及乳房的细胞或组织。

7.一种组合物，其包含化合物3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]呋喃-2，5-二酮、3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-2，5-二酮、3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-1-醇-2，5-二酮、3R^*，4S^*-1-羟基-3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2，5-二酮或3R^*，4R^*-1-羟基-3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2，5-二酮。

8.权利要求7的组合物在制备用于减低收缩压、增加高密度脂蛋白或用于中枢胆碱能激动、保肝、抗炎或抗肿瘤的药物中的用途。

9.权利要求8的用途，其中肿瘤来自选自肝、肠、骨、血、淋巴及乳房的细胞或组织。

10.一种牛樟芝菌丝体，其包含化合物3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]呋喃-2，5-二酮、3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-2，5-二酮、3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-1-醇-2，5-二酮、3R^*，4S^*-1-羟基-3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2，5-二酮或3R^*，4R^*-1-羟基-3-异丁基4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2，5-二酮。