HK1079661B - 罗伊乳酸杆菌菌株用於制备改善哺乳动物免疫功能的组合物的用途 - Google Patents

Description

罗伊乳酸杆菌菌株用于制备改善哺乳动物免疫功能的组合物的用途

发明背景

发明领域

本发明涉及使用罗伊乳酸杆菌菌株作为免疫增强试剂、和为此目的选择最有利菌株的改进方法。

现有技术

含有广泛大量不同胃肠微生物的益生菌业已配制，主要因为耐抗生素病原体的增加。广泛大量的乳酸杆菌种包括罗伊乳酸杆菌的菌株，业已用于益生菌配制。罗伊乳酸杆菌是一种天然存在的动物胃肠道居民，它日常地发现在健康动物的肠内。已知它具有抗菌活性。例如，参见美国专利5,439,678、5,458,875、5,534,253、5,837,238和5,849,289。当罗伊乳酸杆菌细胞在甘油存在下于厌氧条件下生长时，它们会产生称作无蛋白菌质(reuterin)(β-羟基-丙醛)的抗菌物质。

免疫调制活性也与罗伊乳酸杆菌有关。例如，参见Wagner RD等人“益生菌对免疫缺陷老鼠的皮肤粘膜念珠菌病的生物疗法影响”，《感染免疫(Infect Immune)》1997 Oct 65：4165-72；但是，在菌株间存在着功效的差异，并且需要方法来选择最有效的菌株，例如，在本发明条件中提供了选择菌株补充CD4+细胞的方法。

而且，虽然已知罗伊乳酸杆菌可用作通常有利的益生菌，但是，先前工作仅在一定程度地认识到利用最好乳酸杆菌菌株的重要性，该菌株中和由这些已存在于胃肠道中病原体产生的毒素。例如，参见El-Nezami HS等“通过乳酸杆菌和丙酸杆菌去除在玻璃试管内的普通镰刀菌毒素”，《食品添加的污染(Food Addit Contam)》2002 Jul19：680-6。这类毒素中和作用包括粘合，按照此发明，据报导，不仅对于改善由这些产生病原体的毒素引起的直接影响是重要的，而且，对于降低免疫系统的通常负担也是重要的。

这里存在着许多不同的由病原微生物引起的胃肠问题原因。例如，幽门螺杆菌引起的胃溃疡和十二指肠溃疡、胃癌、和胃粘膜相关的淋巴组织淋巴瘤。某些病原性大肠杆菌菌株产生毒素，如由大肠杆菌O157:H7产生的vero毒素(VT)，抗生素对于防止它们是越来越少有效的。

因此，本发明一个目的是提供一种通过使用已被检测对于CD4+细胞补充和毒素中和都是有效的罗伊乳酸杆菌改善哺乳动物免疫功能的方法，和提供选择这类免疫改善罗伊乳酸杆菌菌株的方法，以及提供含这类菌株的产品。本发明的又一个目的是提供一种利用对于降低这些毒素的免疫负担是有效的罗伊乳酸杆菌菌株的培养物上清液的方法。

其它目的和优点将从下述说明和随后权利要求书变得更加清楚明了。

发明概述

本发明涉及作为免疫增强试剂的罗伊乳酸杆菌菌株的应用、和在含这类菌株细胞的产品中使用罗伊乳酸杆菌菌株改善哺乳动物免疫功能的方法、以及所指的产品。这些菌株经选择具有良好毒素粘合和中和作用；并具有良好的CD4+补充作用。本发明其它目的和特征将从下述说明和随后权利要求书变得更加清楚明了。

附图简要说明

图1.确认防止vero细胞毒素(VT)和Gb₃受体在罗伊乳酸杆菌的培养物上清液中通过竞争的ELISA的粘合抑制能力。每个按如下进行反应，在盘子涂敷有Gb₃，随后通过使用mAb对抗VT进行ELISA。

对照：VT+胰蛋白酶大豆汤(TSB)

VT+G：VT+250mM甘油溶液

VT+LRS：VT+在250mM甘油溶液中培养的罗伊乳酸杆菌培养物上清液。

发明详细说明及其优选实施例

本发明涉及罗伊乳酸杆菌菌株的应用，它们具有良好毒素粘合和中和效果；并且对于改善哺乳动物免疫功能的组合物产生具有良好的CD4+细胞补充作用。它还涉及含这类罗伊乳酸杆菌菌株的产品，和一种使用这类罗伊乳酸杆菌菌株改善哺乳动物免疫功能的方法。而且，它提供了选择这类改善免疫罗伊乳酸杆菌菌株的方法。

细胞分裂素(cytokine)是免疫系统蛋白质，它们是生物响应改性剂。它们能协调抗体和T细胞免疫系统的相互作用，并能放大免疫反应性(10)。细胞分裂素包括由巨噬细胞合成的单核因子和由活化T淋巴细胞和天然杀伤(NK)细胞产生的淋巴因子。人体和老鼠中的CD4+亚类是基于细胞分裂素产生和效应物作用。Th1细胞合成干扰素-γ(IFN-γ)、IL-2和肿瘤坏死因子(TNF)。它们主要负责防止细胞内微生物的细胞免疫和负责延期型超敏性反应。它们会影响免疫球蛋白G2a(IgG2a)合成和抗体依赖细胞中介的细胞毒性。它们产生的INF-γ能活化巨噬细胞并导致吞噬作用。Th-2细胞合成白细胞间介素-4(IL-4)、白细胞间介素-5(IL-5)、白细胞间介素-6(IL-6)、白细胞间介素-9(IL-9)、白细胞间介素-10(IL-10)、和白细胞间介素-13(IL-13)。它们诱发IgE和G1抗体响应，

包括在本发明中的是由多个实施例步骤证实的方法：罗伊乳酸菌菌株给药、分析该菌株和所用菌株在CD4+细胞补充和毒素中和的功效。数据表明，例如，含有罗伊乳酸杆菌菌株的片状制剂，给出与直接给药细胞培养物相似的胃肠移植水平。罗伊乳酸杆菌菌株移植与罗伊乳酸杆菌的摄取有关，清洗时间(罗伊乳酸杆菌下降到前摄取水平所需要的时间)为给药该药片后至少28天，表明本发明适合于罗伊乳酸杆菌细胞培养物以及配制含有这类罗伊乳酸杆菌培养物的产品。

本发明优选涉及含有罗伊乳酸杆菌菌株作为哺乳动物免疫功能的预防疾病改善的益生菌的产品用途。这类产品可以是多种食品，例如饮食补充剂、糖果或含有这种选择菌株细胞的药片。

本发明所述的罗伊乳酸杆菌还可用于治疗多种能够产生毒素诸如大肠杆菌的微生物药品的制备。出血性大肠杆菌和VT毒素可由此得到治疗。

根据本发明，罗伊乳酸杆菌菌株细胞和其培养物上清液都可用于制备预防性的、益生菌型和药物的组合物。

根据本发明，所有具有良好CD4+细胞补充性和/或良好毒素粘合性的罗伊乳酸杆菌都可使用。CD4+细胞的存在，可通过使用CD4的抗体而得到测试，例如，采用免疫组织化学法(诸如实施例5)或免疫萤光法。毒素粘合可通过使罗伊乳酸杆菌细胞或上清液与毒素接触和对于可用毒素差异的测试而得到证实，如实施例1所述。

本发明所述益生菌、预防性的和药物的产品，可含有适合于营养或药物用途的添加剂和赋形剂。

本发明特征借助于下述实施例将变得更加清楚明了，但是，这些实施例不能理解为是对本发明的限制。

实施例1 Vero毒素研究

在此实验中采用三种乳酸菌菌株，罗伊乳酸杆菌ATCC 55730、保加利亚乳酸杆菌，菌株LB12，(CHR，Horsholm，Denmark)、和干酪乳酸杆菌，菌株01，(CHR，Horsholm，Denmark)。罗伊乳酸杆菌在MRS汤(加20mM葡萄糖)中培养后，在一个嗜气性固定条件中于37℃培养24-48小时。在某些情形中，这些初始培养之后，于2500rpm转速离心分离30分钟，采用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤两次以除去培养基成分，悬浮在250mM甘油溶液中，接着在嗜气性固定条件下于37℃培养6小时。保加利亚乳酸杆菌和干酪乳酸杆菌在MRS加20ml葡萄糖(没有甘油)在嗜气性固定条件下于37℃培养24-48小时。采用每个试验乳酸菌，随后，调节到2g/30ml(干重)，在培养后于2500rpm转速离心分离30分钟，取回该上清液，采用NaOH调节其pH到7.0，以接种vero细胞(参见下文)，并通过2.0μm过滤器过滤。甘油溶液和MRS汤被调节到pH7.0，充当参照物，随后通过2.0μm过滤器过滤。

Vero细胞(非洲绿猴肾细胞，ATCC-CCL81)在补充有10％胎牛血清(FBS，Sigma)的最小基本培养基(MEM，Sigma)中，以25g/ml庆大霉素(Sigma)在37℃于10％CO₂培养箱中培养48小时，在证实单层形成之后使用。

采用大肠杆菌O157:H7(ATCC 43894)，它分泌出VT1和VT2，之后，接种到胰蛋白酶大豆汤(TSB)，培养24小时，同时在37℃的摇动培养箱中搅动，以2500rpm转速离心分离30分钟，并过滤该培养物上清液。

500Vero细胞(2×10⁵细胞/ml)被接种到96孔培养板上，并于37℃在10％CO₂培养箱中接种48小时，以证实单层形成，之后，通过使用下述处理进行实验：A：仅有VT(正参照)；B：TSB(大肠杆菌O157:H7培养基)；C：MRS汤(试验乳酸菌)；D：甘油溶液(罗伊乳酸杆菌培养基)；E：VT+MRS汤；F：VT+甘油溶液；G：VT+罗伊乳酸杆菌的甘油溶液培养物上清液；H：VT+保加利亚乳酸杆菌的MRS汤培养物上清液；I：VT+保加利亚乳酸杆菌的培养物上清液；和J：VT+干酪乳酸杆菌的培养物上清液。处理B、C和D是用来确定是否每种培养液自身都能引起对Vero细胞的细胞毒性；以及E和F是用来确定是否试验乳酸菌的培养基其自身具有抗VT的中和能力。在G、H和J中每种试验乳酸菌的培养物上清液，都进行2x连续稀释，之后，每种稀释的试验乳酸菌的培养物上清液和VT分别按下述进行结合：400ml+100ml；300ml+200ml；200ml+300ml；和100ml+400ml，之后，于37℃在10％CO₂培养箱中培养48小时，以确定是否出现细胞病理效应(CPE)。

300mM中和盐酸氨基脲(Sigma)(它能抑制无蛋白菌质产生)，添加到250mM甘油溶液的罗伊乳酸杆菌的培养液，以抑制无蛋白菌质产生，如上所述，收集其上清液。100μl Vero细胞接种到96孔培养板上，并于37℃在10％CO₂培养箱中培养24小时，以检验是否有单层形成，之后，进行下述处理：A：仅有VT；B：VT+25mM甘油溶液；C：VT+罗伊乳酸杆菌的甘油溶液培养物上清液；和D：VT+在无蛋白菌质抑制剂处理之后(如上所述)培养的罗伊乳酸杆菌的甘油溶液培养物上清液。在B、C和D中，采用甘油溶液和无蛋白菌质抑制剂处理或没有处理的每种罗伊乳酸杆菌培养液，与VT分别按下述进行结合：20+80；30+70；40+60；50+50；60+40；70+30；和80+20μl，之后，于37℃在10％CO2培养箱中培养18小时，以检验是否出现细胞病理效应。在显微镜观察之后，培养液采用结晶紫进行染色，并在490nm读取它们的O.D(光学密度)数值。

采用Gb₃(红细胞四糖神经酰胺)(Sigma)对96孔培养板进行涂覆，该Gb₃被5％牛血清白蛋白(BSA)所阻断并与已经在VT或VT+250mM甘油溶液中培养的罗伊乳酸杆菌培养物上清液进行反应。之后，使用一种抗VT的单细胞抗体(mAb)作为主抗体，向其中，添加辣根过氧化物酶(HRP)-共轭的山羊抗老鼠IgG，之后，培养O-苯二胺，通过ELISA读出器在490nm观察其光学密度(O.D.)。这个实验证实了抑制罗伊乳酸杆菌与该Gb₃受体间相互作用的物质的存在。

从VT与250mM甘油溶液之间和VT与在涂覆Gb₃后甘油溶液培养的罗伊乳酸杆菌培养物上清液之间的相互作用的结果，可以确认，VT和罗伊乳酸杆菌的培养物上清液的结合，与仅有VT情形相比，以非常明显的水平产生低的O.D.数值，如图1所示。这表示在罗伊乳酸杆菌培养物上清液中能够抑制VT与该Gb3受体结合的物质的存在，能够被间接地检测到。

采用罗伊乳酸杆菌培养物上清液对96孔培养板进行涂覆，该上清液在VT/VT+250mM甘油溶液中培养、被3％(BSA)所阻断并与VT进行反应。之后，使用一种抗VT的单细胞抗体作为主抗体，向其中，添加辣根过氧化物酶(HRP)-共轭的山羊抗老鼠IgG(H+L)，之后，培养O-苯二胺，通过ELISA读出器在490nm观察其光学密度(O.D.)。这个实验证实了在罗伊乳酸杆菌上清液中存在着与VT相互作用的物质。

实施例2 乳酸菌对由大肠杆菌O157:H7分泌Vero细胞毒素(VT)I和II的中和作用的研究

当向Vero细胞中添加TSB、MRS汤和甘油溶液时，没有观察到细胞病理效应。另外，当向Vero细胞中添加VT和MRS汤/甘油溶液时，在Vero细胞中观察到有CPE，这表明该培养液自身缺乏抗VT的中和能力。

当每种试验乳酸菌的培养物上清液进行调节到pH7.0，过滤并与VT结合，得到如表1所示结果。对于保加利亚乳酸杆菌和干酪乳酸杆菌来说，在整个浓度范围内出现了CPE，但是，对于罗伊乳酸杆菌来说，在许多甘油上清液中没有出现CPE，只有试验乳酸菌与VT的比值为4∶1存在例外，在该情形中，存在着非常低的CPE。因此，在250mM甘油溶液中培养的培养物上清液，存在着可辨别的抗VT中和能力。对于在MRS汤(+20mM葡萄糖)的培养来说，所有浓度都出现CPE。

表1通过罗伊乳酸杆菌、保加利亚乳酸杆菌和干酪乳酸杆菌的培养物上清液中vero细胞毒素比较vero细胞抗细胞病理效应(CPE)的能力

乳酸菌	乳酸菌培养物上清液	VT(μl)	连续稀释(x2)乳酸菌培养物上清液
								0	1	2	3	4
				400	100	-	-						-
300	200	-						-		+	+
				200	300	-						+	+	+
100	400								+	+	+
					400	100						+	+	+	+
300	200	+	+					+	+	+
					200	300	+				+	+	+	+
100	400	+	+					+	+	+
					保加利亚乳酸杆菌	400	100				+	+	+	+	+
300	200	+	+	+				+	+
						200	300			+	+	+	+	+
100	400	+	+	+				+	+
						干酪乳酸杆菌	400			100	+	+	+	+	+
300	200	+	+	+	+			+
							200		300	+	+	+	+	+
100	400	+	+	+	+			+

^*：该培养物上清液是在250mM甘油溶液中培养罗伊乳酸杆菌后得到的

^**：该培养物上清液是在MRS汤(加20mM葡萄糖)中培养罗伊乳酸杆菌后得到的

-：没有CPE(细胞病理效应)

+：CPE

a：轻的CPE

使用Microcal Origin 6.1(Microcal Software，Inc.，Boston，MA)程序，将VT与罗伊乳酸杆菌培养物上清液之间对比的ELISA和结合化验的结果，进行学生试验。

实施例3 对试验对象给药罗伊乳酸杆菌

在此实施例中，每天两次，给试验对象两个嚼片，每个嚼片含有1×10⁸CFU(菌落形成单位)的罗伊乳酸杆菌(SD2112：ATCC 55730)，使每天总剂量为4×10⁸CFU罗伊乳酸杆菌。所有其它用于该嚼片的赋形剂是已知的并遵循国际药典。该研究分两部分进行：研究上部胃肠的胃镜检查期间，和研究末梢小肠的回肠镜检查时间(下面将对其作详细说明)。排外标准是：在研究之前和之中服用二周抗生素；在研究之前和之中服用三周益生菌，正在进行的采用胃肠相关药物治疗，和需要常规治疗(如癌症)的严重器官病。对于病人治疗的方案，得到丹麦民族委员会的批准，并合乎赫尔辛基声明。该研究是在丹麦进行的。

使用Wilcoxon符号等级试验，用来比较在摄入罗伊乳酸杆菌之前和之后的症状、血液试验数值、粪便罗伊乳酸杆菌含量、和组织差异。P＜0.05被认为是明显的。

所有试验对象完成了研究。在胃镜检查期间，对10个健康自愿者进行了研究，它们都大于18岁，具有正常的饮食习惯。在摄入罗伊乳酸杆菌之前于0天过夜后，和在研究末尾的第28天，进行胃十二指肠镜检。从胃的本体和胃腔和从十二指肠的第三部分取出活组织检查，都是用于罗伊乳酸杆菌培养物和组织学检查。该活组织检查的平均大小为33mg。该活组织检查立即放入到PBS(2∶1vol/wt样品)中，贮存在冰上，并传送到瑞典Lund的大地生命女神有限公司实验室，对罗伊乳酸杆菌数进行分析。从组织分离到分析的时间在36小时内。

在回肠镜检查期间，对具有在因溃疡性结肠炎(3个对象)或克罗恩氏病(6个对象)的结肠切除术之后的回肠造口术的9个试验对象进行研究。在所有试验对象中，小肠都没有发炎迹象。在0天和第28天进行回肠镜检查。如上所述在小肠末梢20cm内取出活组织检查，用于罗伊乳酸杆菌培养物及其它乳酸杆菌和用于组织学检查。

实施例4 分析微生物

在摄入罗伊乳酸杆菌之前(0天)和在研究末尾(第28天)，从每个试验对象收取粪便样品。回肠镜检查对象的粪便(在下文进行解释)是取自人造口。在第42天(在停止摄入罗伊乳酸杆酸后第14天)，收集7个胃镜检查期间志愿者和4个回肠镜检查期间志愿者的粪便样品。样品(不少于5g)收集在无菌容器内，并立即放入冰箱中。在24小时内，添加20ml(1∶5，wt/vol)的0.1％蛋白胨水。将该样品进行均化，等分试样分散到低温小瓶中，之后立即在-70℃冷冻。样品(冷冻在干冰上)被运送到大地生命女神有限公司实验室，用于分析总的乳酸杆菌和罗伊乳酸杆菌。样品被解冻、稀释并涂到含有万古霉素(50mg/l)的MRS-3琼脂上用于罗伊乳酸杆菌，和LBS琼脂板(KEBOLABAB，Lund，Sweden)用于总的乳酸杆菌数。MRS-3是一种改性的MRS琼脂(KEBOLAB AB，Lund，Sweden)，含2％乙酸钠(wt/vol)。可推荐地，LBS琼脂是按照通过添加1.32ml冰乙酸/升的制备方法制得的。琼脂板是通过在厌氧罐中使用BBL气包(Gas packs)厌氧地于37℃培养48小时。来自该研究的选择分离物的DNA(参见下文)，由PCR通过使用一种细菌条形码repPROTM DNA指纹识别试剂盒(BacterialBarCodes，Inc.，Houston，TX)进行分析，指纹识别通过使用Bionumerics软件(Applied Maths BVBA，Sint-Martens-Latem，Belgium)进行分析。

在研究开始时和在该研究产品给药之前，没有一个胃镜检查期间对象在该粪便中具有可检测的罗伊乳酸杆菌(表2)。在摄入罗伊乳酸杆菌28天之后，所有对象在粪便中都有罗伊乳酸杆菌，范围在1.0×10²-3.5×10⁵CFU/g(每克粪便物质的菌落形成单位数)，平均为4.0×10⁴CFU/g，表明由于该研究产品的给药，在粪便中活的罗伊乳酸杆菌有明显提高。5个对象选择要求在第42天和第56天(即在该研究产品用药后第28天)排出粪便样品。在这些对象中，该罗伊乳酸杆菌在摄入后四周仍存留在粪便之中(表2)。

表2回收粪便中的罗伊乳酸杆菌

胃镜检查对象

对象	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	平均	SD
													消耗的药片％一致性	10089	10493	10493	8677	9383	9282	8172	10493	10291	9888	9686	87
CFU罗伊乳酸杆菌/g粪便
													0天28天42天56天	nd5.0E+03**	Nd1.0E+031.4E+03*	nd3.8E+041.5E+031.3E+03	Nd3.5E+05**	nd1.0E+02**	nd1.0E+021.2E+032.2E+03	nd4.1E+031.6E+031.0E+03	nd2.0E+026.0E+026.0E+02	nd1.0E+023.0E+02*	nd1.9E+035.0E+021.0E+03	nd4.0E+041.0E+031.2E+03	1.1E+055.3E+026.0E+02

回肠镜检查对象

对象	11	12	13	14	15	16	17	18	19	平均	SD
												消耗的药片％一致性	9282	11098	112100	11098	9888	11098	112100	112100	112100	10896	77
CFU罗伊乳酸杆菌/g回肠造口术排泄物
												0天28天42天56天	ndnd**	NdNd1.0E+031.0E+03	ndnd**	Nd6,8E+036.0E+028.0E+02	nd1.0E+021.9E+03*	nd3.0E+026.0E+022.0E+02	nd5.0E+02**	5.00E+044.0E+04**	1.00E+021.0E+02**	nd8.0E+031.0E+036.7E+02	1.6E+046.1E+024.2E+02

nd＝没有检到(＜1.0×10²CFU/g粪便物质)；^*表示该对象没有给出样品粪便(回肠造口术排泄物)样品是在补充罗伊乳酸杆菌28天前补充时(0天)取出的。结果表示为菌落形成单位(CFU)/g湿重量粪便物质。

实施例5 组织学

为了评价所有局部免疫响应，测定B-淋巴细胞、T-淋巴细胞和巨噬细胞数量的变化。初始期间活组织检查和28天活组织检查用福尔马林固定并埋入在石蜡中。之后，切取4μm切片，并通过使用标准技术(苏木精，van gieson，PeriodicAcidSciff-淀粉酶制剂)组织化学地和免疫组织化学地被染色。自DAKO，Glostrup，Denmark获得的主抗体是：CD20(B-淋巴细胞)、CD3、CD4+、CD8(T-淋巴细胞)、CD68(组织细胞)、螺旋杆菌、和Ki-67(增殖标记物)。免疫组织化学染色是在DAKO TechMate^TM 500免疫着色剂上进行的，以得到均匀的染色。

由病理学家评价该活组织检查。根据化学染色，对组织损伤按照Madsen等(Gastroenterol.1999；116：1107-1114)进行分级(1-10)。这种分级表示数字总数为四个的标准：溃疡、上皮增生、单核细胞数量、和薄片自身的中性粒细胞。根据免疫组织化学染色，半定量地评价薄片自身中CD20、CD3、CD4+、CD8和CD68阳性细胞的数目。三个月后，将初始期间和28天活组织检查进行混合，并由同一病理学家进行评价。计算每个评价中初始期间和28天活组织检查的阳性染污细胞间的全部相关性，并进行比较。

在两个0天的对象和两个28天的对象的胃中(本体和腔)发现了占优势的单一B-淋巴细胞。一个对象在28天的胃(腔)中有分散的细胞。4个对象在0天的十二指肠中有单细胞，8个对象在28天的十二指肠中有占优势的单细胞。8个对象在0天的胃中(本体和腔)有占优势的CD3、CD4+和CD8(T-淋巴细胞)单细胞，9个对象在28天的心室(本体和腔)中有占优势的单细胞(表3)。在0天的8个对象的十二指肠中发现了分散的细胞，在28天的7个对象的十二指肠中发现了占优势的分散T-淋巴细胞。

在0天的9个对象和28天的5个对象的胃中(本体和腔)发现了占优势的单一组织细胞。在0天和28天的6个对象(不是相同的六个对象)的十二指肠中发现了占优势的分散细胞。

在试验对象接受罗伊乳酸杆菌之后，在活组织检查中，组织细胞(CD68)的数目存在着统计上明显的下降，从本体(p＝0.025)和腔(p＝0.046)，并且在十二指肠中存在明显提高数目的B-细胞(CD20)(p＝0.046；表3)。没有发现T淋巴细胞数量由于摄入罗伊乳酸杆菌而有明显变化。两种研究之间的一致性(第一，不是盲目的，且第二，组织样品的盲目分析)为76％(表3)。对于本体和腔的组织细胞(CD68)来说，一致性分别仅为40％和65％。十二指肠B-细胞的一致性(CD20)为60％。因此，在这些发现中存在着某些不确定性。CD3、CD4+、和CD8分析的一致性是很高的(多达90％；表3)。

在回肠镜期间，所有活组织检查都是组织学正常的且螺旋杆菌阴性。Ki-阳性细胞在所有活组织检查中是正常的。在6个对象中发现了占优势的单一B-淋巴细胞，在0天的2个对象中发现了分散细胞。在28天的所有对象中都观察到单细胞。在0天和28天的7个对象中都发现了占优势的分散CD3细胞(B-淋巴细胞)。在0天的7个对象中发现了占优势的分散CD4+细胞，在28天的7个对象中发现了占优势的细胞邻接群。在0天的7个对象和28天的9个对象中发现了占优势的分散CD8细胞(表3)。在0天和28天的7个对象都发现了占优势分散的组织细胞。

在补充罗伊乳酸杆菌28天后，存在着明显更高数目的CD4+淋巴细胞(p＝0.046；表3)。没有发现B-淋巴细胞或组织细胞数量由于罗伊乳酸杆菌给药而有明显变化。这两种研究间的一致性，对于所有检测的细胞类型一般都是很高的，对于CD4+结果，它为78％，表明这些数据具有良好的可靠性(表3)。所有螺旋杆菌染污都是阴性的。

表3来自回肠镜检查期间的回肠活组织检查的组织学评价

对象	0天组织学分数	B-细胞	T-细胞			组织细胞	28天组织学分数	B-细胞				组织细胞
													CD20	CD3	CD4	CD8	CD68	CD20	CD3	CD4	CD8	CD68
		11	0	X	XX	XX		XX	XX	0	X	X											XXX	XX	XX
12	0						XX						XXX	XXX	XX	XX	0	X	XX	XXX	XX	XX
		13	0	-	XX	XX		XX	XX	0	X	XX											XXX	XX	X
14	0						X						XX	XX	XX	XX	0	X	X	XXX	XX	XX
		15	0	XX	XXX	XX		XX	XX	0	X	XX											XXX	XX	X
16	0						X						XX	XX	XX	XX	0	X	XX	XXX	XX	XX
		17	0	X	XX	XX		X	XX	0	X	XX											XX	XX	XX
18	0						X						XX	XX	X	X	0	X	XX	XX	XX	XX
		19	0	X	XX	XXX		XX	X	0	X	XX											XXX	XX	XX

活组织检查是在小肠末梢20cm内取出的，并被固定和切片用于通过使用免疫组织化学染污特定细胞类型的组织学检测(参见说明书)。

“-”＝没有细胞检到；“X”＝单细胞；“XX”＝分散细胞或细胞聚集；“XXX”＝多个邻接细胞群。组织学分数(1-10)划分组织损伤程度。

统计分析：Wilcoxon Signed Rank Test。样品给出名义分数：-、X、XX和XXX，它们分别被设定为1、2、3和4。

实施例6 血液的生物化学

在0天和28天取出血液样品，并分析其血红蛋白、血球容量、血小板、luecocytes、C-反应蛋白、钾、钠、肌酸酐、b-脲、p-葡萄糖、胆固醇、HDL(高密度脂蛋白)、LDL(低密度脂蛋白)、VLDL(极低密度脂蛋白)、tricgycerides、总胆红素、尿酸盐、ALAT、碱性磷酸酶和乳酸盐。

在摄入罗伊乳酸杆菌这前和之后，许多血液试验都是正常的。在血液变量中存在着一些非正常值，但是，没有发现临床明显的异常，在治疗之后也没有观察到系统变化。

实施例7 DNA指纹识别

DNA指纹识别分析是对来自该研究选用的罗伊乳酸杆菌分离物进行的。因而，从3个对象(它们已经消耗28天罗伊乳酸杆菌)取出的粪便分离物，以及一个分离物源自十二指肠活组织检查，和一个分离物源自回肠活组织检查，它们两个都是在罗伊乳酸杆菌给药之前0天取出的。发现所有分离物相互都具有98％的基团相似性。所有这些分离表现出与被结合到该药片中的菌株SD2112有97％的相似性。

实施例8 配制产品以改善人体免疫功能

在此实施例中，为了添加到标准酸奶中，通过使用上述对于毒素中和及CD4+补充的方法，选用罗伊乳酸杆菌SD2112，ATCC 55730。使用在乳品加工业用于培育乳酸杆菌的标准方法，该罗伊乳酸杆菌菌株培育并冻干。使用传统酸奶培养物，以10E+7CFU/克酸奶，接着将这种培养物添加到前述的发酵牛奶中，该酸奶被人们用作一种改善他们免疫功能的方法。

尽管本发明业已经借助于具体实施方式进行了说明，但是，能够理解众多的变化、改进、实施方式是可能的，因此，所有这些变化、改进和实施方式都可以认为是在本发明的精神和范围之内。

Claims (9)

1、罗伊乳酸杆菌菌株的用途，其

a.具有良好的毒素粘合与中和作用；其通过使罗伊乳酸杆菌细胞或上清液与毒素接触和对于可用毒素差异的测试，通过抗体测试而得到证实；以及

b.具有良好的CD4+补充，其通过使用CD4的抗体而得到测试，采用免疫组织化学法或免疫荧光法，该方法用于制备以改善哺乳动物免疫功能的组合物。

2、一种包括至少具有权利要求1所述特征的菌株的产品。

3、权利要求2所述产品，其中，所述产品配制成一种含有所选菌株细胞的食品。

4、权利要求2所述产品，其中，所述产品配制成一种含有所选菌株细胞的药片。

5、权利要求2所述产品，其中，所述产品配制成一种含有所选菌株细胞的添加剂。

6、权利要求2所述产品，其中，所述产品配制成一种含有所选菌株细胞的糖果。

7、权利要求2所述产品，其中，所述产品配制成一种含有所选菌株细胞的药物。

8、罗伊乳酸杆菌ATCC 55730培养物上清液在制备用于中和细菌毒素的如权利要求2所述的产品中的应用。

9、罗伊乳酸杆菌菌株在制备用于改善哺乳动物免疫功能的如权利要求2所述的产品中的应用，包括：使用这类菌株，它们

a.具有良好的毒素粘合与中和作用；其通过使罗伊乳酸杆菌细胞或上清液与毒素接触和对于可用毒素差异的测试，通过抗体测试而得到证实；以及

b.具有良好的CD4+补充，其通过使用CD4的抗体而得到测试，采用免疫组织化学法或免疫荧光法。