HK1061656A - 硫藤黄菌素二氧化物及其衍生物在制备用於治疗cns疾病的药物中的用途及其制备方法 - Google Patents

Description

硫藤黄菌素二氧化物及其衍生物在制备用于治疗CNS疾病 的药物中的用途及其制备方法

本发明涉及硫藤黄菌素二氧化物及其衍生物在生产用于治疗CNS疾病的药物中的应用，涉及通过微生物拟诺卡氏菌(Nocardiopsis)种ST100692，DSM 13834的发酵制备它们的方法，还涉及微生物拟诺卡氏菌种ST 100692，DSM 13834。

硫藤黄菌素是已知的天然化合物，可通过商业途径得到(ApinChemical，UK；CMS Speciality Chemicals，UK；Ubichem plc，UK)。硫藤黄菌素二氧化物也是已知的化合物。制备硫藤黄菌素二氧化物的一个已知方法是用间氯过苯甲酸氧化硫藤黄菌素(产率为30％)，该方法在Schachtner等，J.Heterocycl.Chem.，1999，161-175中有描述。

以前已描述硫藤黄菌素二氧化物有药用性质。WO 99/12543描述了将硫藤黄菌素二氧化物用作抗瘤药物，WO 96/32396描述了将硫藤黄菌素二氧化物用作抗细菌和抗真菌的药物。

现在令人惊讶的发现硫藤黄菌素二氧化物是溶神经素的有效抑制剂。溶神经素属于含锌的金属蛋白酶家族。它可能扮演着使作为内源性抗精神病药的神经降压肽生理失活的角色。硫藤黄菌素二氧化物抑制溶神经素对神经降压肽的失活作用，因此可用于治疗神经变性疾病如帕金森症和阿尔茨海默氏病。硫藤黄菌素二氧化物还具有选择性，因为它不阻断别的含锌的金属蛋白酶如脑啡肽酶或血管紧张肽转化酶。

此外，现在已经发现微生物拟诺卡氏菌(Nocardiopsis)种ST 100692，DSM 13834能相对高产地形成硫藤黄菌素二氧化物。

因此本发明涉及式1化合物以及其生理上可耐受的盐在生产治疗CNS疾病的药物中的应用，

其中，R1，R2，R3独立地选自：H、烷基和酰基。

在优选的式1化合物以及其生理上可耐受的盐中R1为酰基，R2为H且/或R3为烷基。

式1化合物中的酰基基团可有2到10个碳原子，优选为2到6个碳原子，且可以是直链或支链，饱和的或有一个或两个不饱和键。

有两个碳原子的酰基基团意味着，例如乙酰基。

饱和直链酰基基团的例子有乙酸残基、丙酸残基、丁酸残基、戊酸残基、己酸残基、庚酸残基、辛酸残基、壬酸残基和癸酸残基。

有一个不饱和键的直链酰基基团的例子有丙烯酸残基和巴豆酸残基。

有两个不饱和键的直链酰基基团的一个例子是山梨酸残基。

式I化合物中的烷基可有1到6个碳原子，且可以是直链或支链的。此外，烷基基团包括饱和与不饱和基团，其中不饱和基团可含有一个或两个双键。含有1到6个碳原子的烷基基团的例子是甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、所有这些基团的正异构体(n-isomer)、异丙基、异丁基、1-甲基丁基、异戊基、新戊基、2，2-二甲基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基和异己基。

不饱和的烷基基团是，例如链烯基基团如乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基(＝烯丙基)、2-丁烯基、3-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基、3-甲基-2-丁烯基、5-己烯基或1，3-戊二烯基。

在一个实施方案中，本发明涉及式II化合物

或其生理上可耐受的盐在生产用于治疗CNS疾病的药物中的用途。

式I化合物可用于治疗由高出循环正常水平的溶神经素引起的疾病。可用式I化合物治疗的CNS疾病包括精神病如精神分裂症和神经变性疾病如阿尔茨海默氏病和帕金森症。

可通过在适当的条件下发酵微生物拟诺卡氏菌种ST 100692，DSM13834或其一种变种或突变株，分离至少一种化合物，并在适当时将其转化为生理上可耐受的盐、衍生物或此衍生物的生理上可耐受的盐而得到式I化合物。

本发明因此涉及式I化合物的生产方法，包括将微生物拟诺卡氏菌种ST 100692，DSM 13834或其突变株或变种在水性营养培养基中培养、分离并纯化至少一种目标化合物并任选地将其转化成生理上可耐受的盐、衍生物或该衍生物的生理上可耐受的盐。

除了产生硫藤黄菌素二氧化物，拟诺卡氏菌种ST 100692，DSM 13834还在所述发酵条件下产生硫藤黄菌素。得到的硫藤黄菌素可用本领域技术人员已知的方法分离并转化成硫藤黄菌素二氧化物。

因此，一个备选的生产本发明式I化合物的方法包括将微生物拟诺卡氏菌种ST 100692，DSM 13834或其突变株或变种在水性营养培养基中培养、分离并纯化硫藤黄菌素、将硫藤黄菌素转化成至少一种目标化合物并任选地进一步转化成生理上可耐受的盐、衍生物或此衍生物的生理上可耐受的盐。

根据布达佩斯条约将微生物拟诺卡氏菌种ST 100692于2000年11月13日保藏在德意志微生物保藏中心(Dertsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen，Mascheroder weg 1b，D-38124Braunschweig)，保藏号是DSM 13834。

用气相色谱分析脂肪酸对微生物拟诺卡氏菌种ST 100692，DSM 13834进行分类鉴定，发现其特征性酸为：14：0异(iso)，15：0反异(anteiso)，15：0异，16：0，16：0异，17：0，17：0异，17：0反异和18：0。菌落颜色是铬黄色，形成白色气生菌丝体，尤其是在ISP 2(酵母-麦芽)和ISP 3(燕麦粉)培养基上的时候。

代替菌株DSM 13834也可以用其突变株和变种，只要它们能合成本发明的化合物。这些突变株可通过本身已知的物理方法如辐射，例如，甲磺酸乙酯(EMS)；2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮(MOB)或N-甲基-N’-硝基-N-硝基胍(MNNG)产生。

可以通过测定培养液中积累的活性物质的生物活性，例如用下述方法检测对溶神经素的抑制效果来筛选生产本发明化合物的突变株和变种。

适宜的且优选的需氧发酵的碳源为可同化的糖类和糖醇如葡萄糖、乳糖或D-甘露醇以及含糖的天然产物如麦芽汁。适宜的含氮营养物为：氨基酸、肽和蛋白质以及它们的降解产物如蛋白胨或胰蛋白胨和肉膏，碾磨过的种子，如谷类、小麦、大豆或棉花植物的种子，来自制酒的蒸馏残渣、肉粉或酵母抽提物，以及铵盐和硝酸盐。营养液中可含有的无机盐为，例如，碱金属或碱土金属、铁、锌、钴和锰的氯化物、碳酸盐、硫酸盐或磷酸盐。

例如在一种营养培养基中可特别好的形成硫藤黄菌素二氧化物，该培养基含有约0.5％到5％的葡萄糖(优选1％到2％)，0.5％到5％的大豆粉(优选1％到2％)，0.1％到1.5％的玉米浆(液体)(优选0.3％到0.8％)，0.05％到1.0％碳酸钙(优选0.1％到0.5％)和0.05％到1％的氯化钠(优选0.3％到0.8％)，在每种情况下都基于完整营养液的重量计。

培养在有氧条件下进行，也就是说，例如，在摇瓶或发酵罐中振荡或搅拌进行浸没培养，适当时通入空气或氧气。发酵可在，例如各种体积的广口瓶或圆底烧瓶，玻璃发酵罐或不锈钢发酵罐中进行。发酵温度范围可以为约20到35℃，优选约25到30℃。pH应该在4到10之间，有利的是在6到8之间。该微生物在这些条件下一般发酵20到200小时，优选24到150小时。

培养有利地分为几个阶段，即最初在液体营养培养基中产生一个或多个预培养物，然后将其转到真正的生产培养基——主要培养基中，例如以1∶10的体积比。通过例如将已形成孢子的菌丝体转到营养溶液中生长约20到120小时，优选24到90小时后得到预培养物。已形成孢子的菌丝体可通过例如将菌株在固体或液体营养培养基如酵母-麦芽琼脂或马铃薯-葡萄糖琼脂上生长约1到40天，优选5到12天得到。

可根据本领域技术人员已知的方法，例如通过生物学鉴定法检测生物活性或通过层析方法如薄层层析(TLC)或高效液相层析(HPLC)跟踪发酵的进展和本发明化合物的形成。

式I化合物可在菌丝体和培养物滤液中存在，但主要的量通常在生物量(菌丝体)中出现。因此有利的是通过过滤或离心将菌丝体与培养物滤液分离。将滤液用不和水混溶的溶剂如1-丁醇，乙酸乙酯、氯仿等萃取。有利的是将菌丝体用甲醇或丙酮提取，但也可以用上面提到的不和水混溶的溶剂。

提取可在很宽的pH范围中进行，但有利的是在中性介质中，优选pH在4到8之间进行。有机萃取物可例如真空浓缩并干燥。

一种纯化的方法是在吸附树脂如Diaion^HP-20(Mitsubishi Casei.，Tokyo)，Amberlite^XAD7(Rohm and Haas，USA)和Amberchrom^CG(Toso Haas，Philadelphia，USA)上进行层析。合适的还有各种反相载体，例如熟知的用在如高压液相层析(HPLC)系统中的RP18。

式I化合物可用类似上述的方法或本领域技术人员已知的其他方法分离和纯化。

上面式I也包括硫藤黄菌素二氧化物的衍生物。这些衍生物有和硫藤黄菌素二氧化物相同的功效或者可以在温和条件下转化成和硫藤黄菌素二氧化物有相同功效的化合物。这些衍生物可通过本领域技术人员熟知的方法制备。下面给出式I所覆盖的硫藤黄菌素二氧化物衍生物中的一些的制备方法的实例：

1)通过酸或碱可将硫藤黄菌素二氧化物的乙酰基(外向环)切开，方法见文献例如‘Protective Groups in Organic Synthesis’，第三版，T.Greene&P.Wuts，John Wiley&Sons，1999，pp 553-555中的描述。

2)可通过例如还原性烷基化将硫藤黄菌素二氧化物的游离氨基烷基化，方法在‘Advanced Organic Chemistry’，第四版，J.March，John Wiley&Sons，1992，PP 898-900中有描述。

3)可通过本领域技术人员熟知的标准步骤用例如酰氯或酸酐将硫藤黄菌素二氧化物的氨基酰化。

式I化合物的其他衍生物包括通过例如P.N.Rylander在文献‘Hydrogenation Methods’，Academic Press，New York(1985)，第2章中所给的方法将式I化合物如硫藤黄菌素二氧化物中至少一个双键还原或通过H.O.House在‘Modern Synthetic Reactions’，W.A.Benjymin，Inc.，NewYork(1972)，PP 446-452中所给的方法脱卤化氢所得到的化合物。

本发明的化合物可转化成药学上可接受的盐。这些盐可用本领域技术人员已知的标准方法制备。

式I化合物的生理上可耐受的盐是指在Remington’s PharmaceuticalSciences(第17版，1418页(1985))中描述的其有机和无机盐。盐比如钠盐和钾盐可通过例如将本发明化合物用适宜的钠或钾的械处理而制备。

本发明的另外一个方面是式I化合物的前体药物的应用。这种前体药物可在体内被代谢成式I化合物，如硫藤黄菌素二氧化物。这些前体药物本身可有活性或没有活性。

式I化合物可以以各种多形性(polymorphous)的形态如无定型的和结晶多形性的形态存在。式I化合物的所有多形性形态都落在本发明范围内且是本发明的另外一个方面。

本发明的化合物及其药学上可接受的盐和衍生物可本身或以相互混合物的形式作为药物施用于动物，优选哺乳动物，特别是人类。

因此适宜的药物组合物包含一种或多种式I或II化合物或者其药学上可接受的盐的有效量以及药学上可接受的载体。

根据本发明的化合物可口服、肌内、静脉内或用其他方式给药。含有这些化合物或其药学上可接受的盐或衍生物以及任选地还含有其他具有药物活性的物质的药物组合物可通过将这些活性化合物和一种或多种药学上可耐受的助剂和/或赋形剂混合进行制备。然后，该混合物可转化成适宜的药物形式，如片剂、包衣的片剂、胶囊、粒剂、粉剂、乳剂、混悬液或溶液。

可以提到的助剂和/或赋形剂的实例为填充剂、乳化剂、润滑剂、掩蔽调味剂、着色剂和缓冲物质黄蓍胶、乳糖、滑石、琼脂、聚乙二醇、乙醇和水。合适的且优选的胃肠外用药形式为水悬浮液或水溶液。还可以不加赋形剂或稀释剂将这些活性物质就此以合适的形式如以胶囊的形式给药。

生产合适的药物的一种方法包括将至少一种根据本发明的化合物与药学上合适的且生理上可耐受的载体以及适当时其他合适的活性物质、添加剂或赋形剂转化成合适的剂型。

通常，适用于特定病例的盖伦(galenic)制剂和给药方法以及剂量范围取决于要治疗的物种和各自病症或疾病的状况，且可用本领域已知的方法进行优化。使用固体剂型如片剂或胶囊，每日给药可以最多500mg，优选0.1到250mg。对于胃肠外给药，日剂量可以最多300mg，优选0.5到150mg。

下面是本发明的举例说明性实例，但不是对本发明范围的限制。

实施例1：生产菌株拟诺卡氏菌种DSM 13834的孢子悬浮液的制备

取100ml营养溶液(4g/l酵母抽提物，15g/l可溶性淀粉，1g/l K₂HPO₄，0.5g/l MgSO₄×7H₂O溶于1000ml水中，灭菌前pH为7.0)置于300ml无菌锥形瓶中，接种菌株拟诺卡氏菌种DSM 13834并在旋转摇床上以180rpm于28℃孵育5天。然后，1.5ml该培养物用1.5ml 99％的甘油稀释并保存在-20℃。

实施例2：在锥形瓶中制备生产菌株的培养物或预培养物

在含有100ml营养溶液(15g/l大豆粉，15g/l葡萄糖、5g/l玉米浆液，5g/l NaCl和2g/l CaCO₃)的灭菌锥形瓶中接种在斜面管(同样的营养溶液但加入2％琼脂)上生长的培养物或1ml甘油培养物(见实施例1)，在摇床上以180rpm于25℃孵育。约96小时后达到最大的硫藤黄菌素二氧化物产量。以约5％进行接种，72小时的浸没培养物(根据摇瓶培养的方法产生但使用了下面的培养基：15g/l葡萄糖，15g/l大豆粉，5g/l玉米浆，2g/l CaCO₃和5g/l NaCl，pH7.5)足够接种10到100l的发酵罐。

实施例3：硫藤黄菌素二氧化物的生产

将一个200l的发酵罐按照下面的条件操作：

营养培养基：    大豆粉    15g/l

                葡萄糖    15g/l

                玉米浆    5g/l

                NaCl      5g/l

                CaCO₃    2g/l

                          pH7.2(灭菌前)

孵育时间：                60-80小时

孵育温度：                28℃

搅拌速度：                50rpm

通气：                    150l/min

通过反复加入几滴1到2ml的多元醇的乙醇溶液抑制泡沫的产生。69小时后达到最大的产量。

实施例4：硫藤黄菌素二氧化物的分离

将实施例3所得的3l培养物溶液冻干，然后将冻干物用甲醇(2-3l)提取。甲醇提取物真空减缩并用含10％甲醇的水稀释。稀释后的提取物加到装有吸附树脂CHP-20P的容积为1l的柱子上。用从水到乙腈的溶剂梯度洗脱。以每部分30ml进行过柱流动(30ml/min)，并收集含有所需化合物的部分，真空浓缩并冻干得到约30mg黄褐色粉末。所得粉末加到填有LUNA^10 uC18(2)的柱子(宽×高＝21mm×250mm)上并用溶于0.1％醋酸铵/水的10％到60％的乙腈梯度洗脱。洗脱介质的流速为25ml/min且柱子的流出液以每部分25ml收集。发现硫藤黄菌素二氧化物位于第15和16部分中。将所述部分冻干得到1.8mg纯度＞95％的硫藤黄菌素二氧化物。

硫藤黄菌素二氧化物的理化和光谱性质可概述于下：

分子式：C₈H₈N₂O₄S₂

分子量：260.3

UV-Maxima：230，302，388nm

1H-和13-C NMR：见表1

表1：

1H-和13-C NMR：300K时DMSO中硫藤黄菌素二氧化物的化学位移

	1H	13C
			1	2.10	22.51
2	-	170.46
			3	10.65	-
4	-	123.01
			5	-	164.27
6	3.10	27.85
			7	-	145.48
8	-	114.05
			9	7.55	109.58

实施例5：硫藤黄菌素二氧化物用作溶神经素抑制剂

在384孔平板格式的CyBio移液系统上进行试验，最终试验体积为16μl。

简单的说，将4μl适当稀释的微生物提取物(在50mM pH7.5的Tris缓冲液中稀释)分配到测试板中(Greiner，白色的384小体积孔的板)。之后向每个孔中加入4μl溶神经素(预稀释1∶5，360ng蛋白)。在室温下对样品和酶进行10分钟预孵育后，通过加入8μl溶于Tris缓冲液的底物(Mcc-Pro-Leu-Gly-D-Lys(Dnp)-OH，CALBIOCHEM)起始反应。底物的最终试验浓度为4μM。

移液后，将板立即置于荧光计(SpectraFluorplus，SLT)中并读出最初荧光量(λex：360nm/λem 405nm)。然后将反应继续在30℃进行30 min，记下最终的荧光读数。

读数最先用空白校正，然后从每个30min后的值中减去时间为0时的值，样品抑制活力表示为

100-(化合物的净强度/对照的净强度)×100(％)

每一个试验板含有合理数量的阳性对照和空白(用缓冲液代替酶)。

发现硫藤黄菌素二氧化物的IC50为0.6μM。

Claims (7)

1.式I化合物及其生理上可耐受的盐和衍生物在生产治疗CNS疾病的药物中的用途，

其中，R1、R2和R3独立地选自：H、烷基和酰基。

2.权利要求1的式I化合物的用途，其中R1为酰基，R2为H，R3为烷基。

3.权利要求1的用途，其中所述化合物为式II所示硫藤黄菌素二氧化物

4.生产式I化合物的方法，包括将微生物拟诺卡氏菌种ST100692，DSM 13834或其突变株或变种在有氧条件下于含有碳源和氮源的营养培养基中培养直到在营养培养基中出现至少一种式I化合物，以及分离和纯化该化合物。

5.生产式I化合物的方法，包括将微生物拟诺卡氏菌种ST100692，DSM 13834或其突变株或变种在有氧条件下于含有碳源和氮源的营养培养基中培养直到在营养培养基中出现硫藤黄菌素，分离硫藤黄菌素，并将其转化成至少一种式I化合物。

6.根据权利要求4或5的方法，其还包括将所述式I化合物转化成生理上可耐受的盐、衍生物或此衍生物的生理上可耐受的盐。

7.拟诺卡氏菌种ST 100692(DSM 13834)。