GR1010885B - Μεθοδος παρασκευης πολυδυναμου εμβολιου για χρηση σε μικρα και μεγαλα μηρυκαστικα ζωα εκτροφης με μαστιτιδα - Google Patents

Abstract

Η παρούσα εφεύρεση αφορά μέθοδο αντιμετώπισης της μαστίτιδας μηρυκαστικών ζώων εκτροφής. Τα βήματα της μεθόδου είναι τα εξής: Α) απομόνωση παθογόνων οργανισμών, Β) ταυτοποίηση/χαρακτηρισμός παθογόνων βακτηριακών στελεχών, Γ) επιδημιολογία S. aureus, Δ) καλλιέργεια μικροοργανισμών/παραγωγή βιομάζας, Ε) νέκρωση βακτηριακών κυττάρων/παραγωγή βακτερίνης, Στ) παρασκευή τελικού προϊόντος/συντήρηση. Η παρασκευή του αυτεμβολίου πραγματοποιείται με τη χρήση νεκρών βακτηριακών κυττάρων των παθογόνων μικροοργανισμών που προκαλούν την ασθένεια σε μία συγκεκριμένη εκτροφή ή σε μία γεωγραφικά προσδιορισμένη περιοχή εκτροφής παραγωγικών ζώων, σε συνδυασμό με την παρουσία ανοσοενισχυτικού.

Description

[0001] ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ

[0003] Μέθοδος παρασκευής πολυδύναμου εμβολίου για χρήση σε μικρά και μεγάλα μηρυκαστικά ζώα εκτροφής με μαστίτιδα

[0005] Τεχνικό πεδίο στο οποίο αναφέρεται η εφεύρεση

[0007] Η παρούσα εφεύρεση σχετίζεται με τη μεθοδολογία παραγωγής πολυδύναμου αυτεμβολίου για την αντιμετώπιση της μαστίτιδας μικρών και μεγάλων μηρυκαστικών ζώων εκτροφής. Η παρασκευή του αυτεμβολίου πραγματοποιείται με τη χρήση νεκρών βακτηριακών κυττάρων των παθογόνων μικροοργανισμών που προκαλούν την ασθένεια σε μία συγκεκριμένη εκτροφή ή σε μία γεωγραφικά προσδιορισμένη περιοχή εκτροφής παραγωγικών ζώων, σε συνδυασμό με την παρουσία ανοσοενισχυτικού.

[0009] Η εφεύρεση αντιμετωπίζει προληπτικά, μέσω εμβολιασμού, την κλινική και υποκλινική μαστίτιδα των παραγωγικών ζώων, η οποία μπορεί να προκληθεί από ένα μεγάλο αριθμό βακτηριακών στελεχών του είδους Staphylococcus aureus, στα οποία συμπεριλαμβάνονται και στελέχη αρνητικά στην πηκτάση (Colagulase Negative S. aureus-CNS), και εκδηλώνεται ως φλεγμονή του μαστικού αδένα, η οποία συνοδεύεται από κλινικά συμπτώματα και/ή μείωση της ποσότητας και ποιότητας του γάλακτος

[0011] Στάθμη προηγούμενης τεχνικής και αξιολόγηση αυτής

[0013] Τα αυτεμβόλια δρουν παρόμοια με τα εμπορικά σκευάσματα των εμβολίων προκαλώντας την απόκριση του ανοσοποιητικού συστήματος σε έναν ιό ή ένα βακτήριο. Περιέχουν νεκρό νοσογόνο παράγοντα, ο οποίος διεγείρει το ανοσοποιητικό σύστημα του οργανισμού, ώστε να αποκτήσει ανοσία, δημιουργώντας τη «μνήμη» του ανοσοποιητικού συστήματος.

[0015] Τα αυτεμβόλια χρησιμοποιούνται προληπτικά για τον έλεγχο των ασθενειών και τη διατήρηση της υγείας των ζώων και καλύπτονται επί του παρόντος από την εθνική νομοθεσία των κρατών μελών της Ευρωπαϊκής Ένωσης. Η μεθοδολογία της παρασκευής τους βασίζεται σε ευρέως χρησιμοποιημένες μικροβιολογικές τεχνικές. Ωστόσο, η αποτελεσματικότητα των αυτεμβολίων για μια συγκεκριμένη ασθένεια εμπλέκει ως απαραίτητη προϋπόθεση την επιλογή των κατάλληλων μικροβιακών παθογόνων που προκαλούν την ασθένεια σε μία συγκεκριμένη εκτροφή ή σε εκτροφές που ανήκουν σε συγκεκριμένη, γεωγραφικά καθορισμένη, περιοχή. Με τη σειρά της, η επιλογή αυτή προϋποθέτει την απομόνωση και τον χαρακτηρισμό των μικροβιακών στελεχών που εμφανίζουν κλωνική διασπορά σε μία περιοχή.

[0016] Σύντομη παρουσίαση της εφεύρεσης

[0018] Η εφεύρεση αφορά μια καινοτόμα μέθοδο/διάταξη για τον εμβολιασμό των μικρών και μεγάλων μυρηκαστικών ζώων παραγωγής ενάντια στην κλινική και υποκλινική μαστίτιδα. Ειδικότερα, η παρούσα εφεύρεση χαρακτηρίζεται από τη μελέτη της γενοτυπικής ποικιλότητας των στελεχών (διερεύνηση της κλωνικής διασποράς) του παθογόνου αιτίου ( Staphylococcus aureus ) σε μια εκτροφή ή σε εκτροφές ζώων μιας περιοχής με τη χρήση μοριακών τεχνικών (Ηλεκτροφόρηση γέλης σε παλλόμενο ηλεκτρικό πεδίο-Pulsed Field Gel Electrophoresis, PFGE). Η διαδικασία της ανάπτυξης της εφεύρεσης ξεκινάει με την απομόνωση και την ταυτοποίηση των μικροβιακών στελεχών/παθογόνου αιτίου και εξελίσσεται με τη μελέτη της επιδημιολογίας του S. aureus, την παραγωγή βιομάζας των μικροβιακών στελεχών, την παραγωγή βακτερίνης και τέλος την παρασκευή του εμβολιακού παρασκευάσματος με τη χρήση ανοσοενισχυτικού. Το κύριο χαρακτηριστικό του του τελικού παρασκευάσματος είναι ότι περιέχει νεκρά βακτηριακά κύτταρα διαφορετικών στελεχών του είδους Staphylococcus aureus που έχουν απομονωθεί ως το παθογόνο αίτιο της μαστίτιδας και εμφανίζουν κλωνική διασπορά σε μία εκτροφή/περιοχή.

[0020] Τα βασικά χαρακτηριστικά της εφεύρεσης είναι τα εξής.

[0022] Πρόκειται για μέθοδο αντιμετώπισης της μαστίτιδας μηρυκαστικών ζώων εκτροφής που αποτελείται από τα εξής βήματα:

[0024] Α) Απομόνωση παθογόνων οργανισμών,

[0026] Β) Ταυτοποίηση/χαρακτηρισμός παθογόνων βακτηριακών στελεχών,

[0028] Γ) Επιδημιολογία S. aureus,

[0030] Δ) Καλλιέργεια μικροοργανισμών/Παραγωγή βιομάζας,

[0032] Ε) Νέκρωση βακτηριακών κυττάρων/παραγωγή βακτερίνης,

[0034] Στ) Παρασκευή τελικού προϊόντος/συντήρηση.

[0036] Η απομόνωση των παθογόνων οργανισμών γίνεται με λήψη δείγματος γάλακτος και χρήση θρεπτικών μέσων.

[0038] Όταν η ασθένεια που θέλουμε να καταπολεμήσουμε είναι σταφυλόκοκκος, για την απομόνωση του ακολουθούνται τα εξής βήματα:

[0040] Α) το δείγμα του γάλακτος ενοφθαλμίζεται σε άγαρ Baird-Parker συμπληρωμένο με τελλουρίτη και κρόκο αυγού (egg-yolk tellurite)

[0042] Β) ακολουθεί αερόβια επώαση για 24-48 ώρες στους 35°C

[0044] Γ) για κάθε δείγμα επιλέγονται έως και τέσσερις απομονωμένες αποικίες που παρουσιάζουν την τυπική μορφολογία του S. aureus (μαύρες με ή χωρίς αδιαφανές άλω)

[0046] Δ) για τον καθαρισμό και την ταυτοποίηση των μικροβιακών στελεχών πραγματοποιείται η ανακαλλιέργεια τους σε μη εκλεκτικό θρεπτικό μέσο.

[0047] Η ταυτοποίηση των μικροβιακών στελεχών γίνεται με μικροσκοπική παρατήρηση όσο και με βιοχημικές δοκιμές.

[0049] Τα απομονωμένα στελέχη S. aureus αποθηκεύονται σε συνθήκες βαθιάς κατάψυξης, σε ειδικά φιαλίδια με την μορφή εναιωρήματος των μικροβιακών κυττάρων σε διάλυμα γλυκερόλης.

[0051] Η καλλιέργεια μικροοργανισμών γίνεται με παραγωγή της βιομάζας των μικροοργανισμών σε θρεπτικό υπόστρωμα Tryptone Soya Broth (TSB), σε καλλιέργειες κλιμακούμενου όγκου, σε συστήματα ασυνεχούς ζύμωσης σε κωνικές φιάλες των 500 ml, στους 37 °C, 150 rpm για 24 ώρες.

[0053] Η νέκρωση των μικροβιακών κυττάρων και η επακόλουθη παραγωγή των θραυσμάτων τους (βακτερίνη-bacterin) γίνεται με

[0055] Α) προσθήκη διαλύματος φορμαλδεύδης (1%w/w) στις κωνικές φιάλες καλλιέργειας των μικροοργανισμών οι οποίες παραμένουν στους 4°C για 16h,

[0056] Β) φυγοκέντρηση των καλλιεργειών σε αποστειρωμένες φιάλες στα 4000 rpm για 10 min και συλλογή της βιομάζας,

[0058] Γ) επαναιώρηση των νεκρών βακτηριακών κυττάρων σε φυσιολογικό ορό,

[0059] Δ) προσθήκη ανοσοενισχυτικού,

[0061] Ε) ανάμιξη των καλλιεργειών των διαφορετικών στελεχών.

[0063] Με την ανωτέρω μέθοδο παράγεται αυτεμβόλιο που χαρακτηρίζεται από την εξής σύνθεση:

[0065] Α) Μίγμα νεκρωμένων βακτηριακών κυττάρων (θραύσματα κυττάρων/βακτερίνη) των διαφορετικών στελεχών (10<8>κύτταρα/ml από κάθε στέλεχος)

[0067] Β) Υδροξείδιο του αργιλίου ως ανοσοενισχυτικό (1% w/w).

[0069] Πλεονεκτήματα της εφεύρεσης

[0071] Το πολυδύναμο αυτεμβόλιο συνδυάζει νεκρά κύτταρα στελεχών του είδους Staphylococcus aureus και των CNS που αναγνωρίζονται ως τα κύρια παθογόνα αίτια της μαστίτιδας και εμφανίζουν κλωνική διαπορά σε μία συγκεκριμένη εκτροφή ή σε μια συγκεκριμένη περιοχή εκτροφής μικρών και μεγάλων μυρηκαστικών ζώων παραγωγής.

[0073] Α. Ο συνδυασμός των κατάλληλα επιλεγμένων μικροβιακών στελεχών του παθογόνου αιτίου της ασθένειας επιτυγχάνει κατάλληλη ανοσολογική απόκριση του ξενιστή, καθιστώντας τον εμβολιασμό των ζώων ως αποτελεσματικό μέτρο πρόληψης της εμφάνισης της ασθένειας της μαστίτιδας.

[0075] Β. Περιέχει ανοσοενισχυτικό για την επαγωγή ισχυρότερης ανοσοαπόκρισης του ξενιστή

[0076] Γ. θεωρείται ασφαλές γιατί περιέχει νεκρούς νοσογόνους παράγοντες

[0077] Αποκάλυψη της εφεύρεσης

[0079] Α) Απομόνωση παθογόνων μικροοργανισμών

[0081] Η διαδικασία της ανάπτυξης του εμβολίου ξεκινάει με την απομόνωση των μικροοργανισμών /παθογόνου αιτίου με συμβατικές μικροβιολογικές μεθόδους. Συγκεκριμένα, λαμβάνονται δείγματα γάλακτος από ζώα που εμφανίζουν κλινικά ή/και υποκλινικά συμπτώματα της μαστίτιδας και οι μικροοργανισμοί/παθογόνα αίτια απομονώνονται με τη χρήση κατάλληλων θρεπτικών μέσων, σε κατάλληλες συνθήκες θερμοκρασίας.

[0083] Για την απομόνωση των σταφυλόκοκκων το δείγμα του γάλακτος (100 μι) ενοφθαλμίζεται σε άγαρ Baird-Parker συμπληρωμένο με τελλουρίτη και κρόκο αυγού (egg-yolk tellurite) και ακολουθεί αερόβια επώαση για 24-48 ώρες στους 35°C. Για κάθε δείγμα επιλέγονται έως και τέσσερις απομονωμένες αποικίες που παρουσιάζουν την τυπική μορφολογία του S. aureus (μαύρες με ή χωρίς αδιαφανές άλω). Για τον καθαρισμό και την ταυτοποίηση των μικροβιακών στελεχών πραγματοποιείται η ανα καλλιέργεια τους σε μη εκλεκτικό θρεπτικό μέσο (εκχύλισμα μαγιάς σε σόγια, Tryptone Soya Yeast Extract Agar-TSYEA).

[0085] B) Ταυτοποίηση/χαρακτηρισμός παθογόνων βακτηριακών στελεχών

[0086] Η ταυτοποίηση των μικροβιακών στελεχών στελεχών βασίζεται τόσο στην μικροσκοπική τους παρατήρηση όσο και σε βιοχημικές δοκιμές (χρώση κατά Gram, αντίδραση καταλάσης, δοκιμή ζύμωσης μαννιτόλης, δοκιμή κοαγκουλάσης).

[0088] Γ) Αποθήκευση των στελεχών S. aureus

[0090] Τα απομονωμένα στελέχη S. aureus αποθηκεύονται σε συνθήκες βαθιάς κατάψυξης (-80°C), σε ειδικά φιαλίδια (cryovials) με την μορφή εναιωρήματος των μικροβιακών κυττάρων σε διάλυμα γλυκερόλης (20% ν/ν).

[0092] Δ) Επιδημιολογία S. aureus.

[0094] Διερευνάται η γενοτυπική ποικιλότητα των απομονωμένων μικροβιακών στελεχών από εκτροφές συγκεκριμένων περιοχών, με ηλεκτροφόρηση γέλης σε παλλόμενο ηλεκτρικό πεδίο-Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) (Εικόνα 1) με στόχο την εκτίμηση της κλωνικής διαποράς των παθογόνων μικροοργανισμών. Στη συνέχεια, επιλέγονται αντιπροσωπευτικά στελέχη S. aureus, των γενοτυπικών κλώνων που ανιχνεύονται μέσω της PFGE, για την καλλιέργειά τους και την παρασκευή του πολυδύμανου εμβολίου.

[0096] Ε) Καλλιέργεια μικροοργανισμών/Παραγωγή βιομάζας

[0098] Σε αυτό το στάδιο της διαδικασίας πραγματοποιείται η παραγωγή της βιομάζας των μικροοργανισμών σε 200 ml θρεπτικό υπόστρωμα Tryptone Soya Broth (TSB), σε καλλιέργειες κλιμακούμενου όγκου, σε συστήματα ασυνεχούς ζύμωσης σε κωνικές φιάλες των 500 ml, στους 37 °C, 150 rpm για 24 ώρες. Στις συνθήκες αυτές έχει προσδιοριστεί με βάση τη καμπύλη ανάπτυξης του μικροοργανισμού ότι ο μικροβιακός πληθυσμός βρίσκεται στην εκθετική φάση της ανάπτυξής του με 10<8>βιώσιμα κύτταρα/ml (CFU).

[0100] Στ) Νέκρωση βακτηριακών κυττάρων/παραγωγή βακτερίνης

[0102] Η νέκρωση των μικροβιακών κυττάρων και η επακόλουθη παραγωγή των θραυσμάτων τους (βακτερίνη-bacterin) γίνεται με την προσθήκη διαλύματος φορμαλδεύδης (1%w/w) στις κωνικές φιάλες καλλιέργειας των μικροοργανισμών οι οποίες παραμένουν στους 4°C για 16h. Ακολουθεί η φυγοκέντρηση των καλλιεργειών σε αποστειρωμένες φιάλες στα 4000 rpm για 10 min και η συλλογή της βιομάζας, η επαναιώρηση των νεκρών βακτηριακών κυττάρων σε φυσιολογικό ορό, η προσθήκη ανοσοενισχυτικού (1% υδροξείδιο του αργιλίου)και η ανάμιξη των καλλιεργειών των διαφορετικών στελεχών.

[0104] Ζ) Παρασκευή τελικού προϊόντος/συντήρηση

[0106] Η αποθήκευσή του εμβολίου γίνεται σε αποστειρωμένες πλαστικές φιάλες των 500ml που διατηρούνται σε συνθήκες ψύξης (4°C). Για κάθε περιέκτη πραγματοποιείται έλεγχος στειρότητας με επίστρωση 100 μΙ σε αιματούχο άγαρ και επώαση των τριβλίων στους 37 °C, για 24 ώρες. Η τελική σύνθεση του αυτεμβολίου προσδιορίζεται ως εξής:

[0108] • Μίγμα νεκρωμένων βακτηριακών κυττάρων (θραύσματα κυττάρων/βακτερίνη) των διαφορετικών στελεχών (10<8>κύτταρα/ml από κάθε στέλεχος)

[0110] • Υδροξείδιο του αργιλίου ως ανοσοενισχυτικό (1% w/w)

[0112] Περιγραφή των σχεδίων

[0114] Το σχήμα 1 δείχνει την αρχή λειτουργίας της συσκευής PFGE και συγκεκριμένα δείχνει την διάταξη των ηλεκτροδίων (Α), την πολικότητα της διάταξης της συσκευής (Β), το μοτίβο της κίνησης των θραυσμάτων DNA και (Δ) την κατεύθυνση της μετακίνησης των θραυσμάτων DNA

[0116] Το σχήμα 2 δείχνει το δενδρόγραμμα γενοτυπικής συσχέτισης διαφορετικών βακτηριακών στελεχών.

Claims (1)

1. ΑΞΙΩΣΕΙΣ

Αξίωση 1<η>: Μέθοδος παρασκευής πολυδύναμου αυτεμβολίου που αποτελείται από τα εξής βήματα:

Α) Απομόνωση παθογόνων οργανισμών,

Β) Ταυτοποίηση/χαρακτηρισμός παθογόνων βακτηριακών στελεχών,

Γ) Επιδημιολογία S. aureus,

Δ) Καλλιέργεια μικροοργανισμών/Παραγωγή βιομάζας,

Ε) Νέκρωση βακτηριακών κυττάρων/παραγωγή βακτερίνης,

Στ) Παρασκευή τελικού προϊόντος/συντήρηση.

Αξίωση 2<η>: Μέθοδος παρασκευής πολυδύναμου αυτεμβολίου, όπως περιγράφεται στην αξίωση 1, που χαρακτηρίζονται από το ότι η απομόνωση των παθογόνων οργανισμών γίνεται με λήψη δείγματος γάλακτος και χρήση θρεπτικών μέσων.

Αξίωση 3<η>: Μέθοδος παρασκευής πολυδύναμου αυτεμβολίου, όπως περιγράφεται στην αξίωση 1, που χαρακτηρίζονται από το ότι για την απομόνωση του σταφυλόκοκκου ακολουθούνται τα εξής βήματα:

Α) το δείγμα του γάλακτος ενοφθαλμίζεται σε άγαρ Baird-Parker συμπληρωμένο με τελλουρίτη και κρόκο αυγού (egg-yolk tellurite)

Β) ακολουθεί αερόβια επώαση για 24-48 ώρες στους 35°C

Γ) για κάθε δείγμα επιλέγονται έως και τέσσερις απομονωμένες αποικίες που παρουσιάζουν την τυπική μορφολογία του S. aureus (μαύρες με ή χωρίς αδιαφανές άλω)

Δ) για τον καθαρισμό και την ταυτοποίηση των μικροβιακών στελεχών πραγματοποιείται η ανακαλλιέργεια τους σε μη εκλεκτικό θρεπτικό μέσο.

Αξίωση 4<η>: Μέθοδος παρασκευής πολυδύναμου αυτεμβολίου, όπως περιγράφονται στις προηγούμενες αξιώσεις, που χαρακτηρίζεται από το ότι η ταυτοποίηση των μικροβιακών στελεχών γίνεται με μικροσκοπική παρατήρηση όσο και με βιοχημικές δοκιμές.

Αξίωση 5<η>: Μέθοδος παρασκευής πολυδύναμου αυτεμβολίου, όπως περιγράφονται στις προηγούμενες αξιώσεις, που χαρακτηρίζεται από το ότι τα απομονωμένα στελέχη S. aureus αποθηκεύονται σε συνθήκες βαθιάς κατάψυξης, σε ειδικά φιαλίδια με την μορφή εναιωρήματος των μικροβιακών κυττάρων σε διάλυμα γλυ κερόλης.

Αξίωση 6<η>Μέθοδος παρασκευής πολυδύναμου αυτεμβολίου, όπως περιγράφονται στις προηγούμενες αξιώσεις, που χαρακτηρίζεται από το ότι η καλλιέργεια μικροοργανισμών γίνεται με παραγωγή της βιομάζας των μικροοργανισμών σε θρεπτικό υπόστρωμα Tryptone Soya Broth (TSB), σε καλλιέργειες κλιμακούμενου όγκου, σε συστήματα ασυνεχούς ζύμωσης σε κωνικές φιάλες των 500 ml, στους 37 °C, 150 rpm για 24 ώρες.

Αξίωση 7<η>: Μέθοδος παρασκευής πολυδύναμου αυτεμβολίου, όπως περιγράφεται στις προηγούμενες αξιώσεις, που χαρακτηρίζεται από το ότι η νέκρωση των μικροβιακών κυττάρων και η επακόλουθη παραγωγή των θραυσμάτων τους (βακτερίνη-bacterin) γίνεται με

Α) προσθήκη διαλύματος φορμαλδεύδης (1%w/w) στις κωνικές φιάλες καλλιέργειας των μικροοργανισμών οι οποίες παραμένουν στους 4°C για 16h,

Β) φυγοκέντρηση των καλλιεργειών σε αποστειρωμένες φιάλες στα 4000 rpm για 10 min και συλλογή της βιομάζας,

Γ) επαναιώρηση των νεκρών βακτηριακών κυττάρων σε φυσιολογικό ορό,

Δ) προσθήκη ανοσοενισχυτικού,

Ε) ανάμιξη των καλλιεργειών των διαφορετικών στελεχών.

Αξίωση 8<η>: Αυτεμβόλιο για χρήση σε μικρά και μεγάλα μηρυκαστικά ζώα εκτροφήςπου χαρακτηρίζεται από την εξής σύνθεση:

Α) Μίγμα νεκρωμένων βακτηριακών κυττάρων (θραύσματα κυττάρων/βακτερίνη) των διαφορετικών στελεχών (10<8>κύτταρα/ml από κάθε στέλεχος)

Β) Υδροξείδιο του αργιλίου ως ανοσοενισχυτικό (1% w/w).