FR3039168A1 - MICROBIOLOGICAL PROCESS FOR THE PRODUCTION OF FORMIATE FROM CO2 BY MEANS OF A CLASS II METHANOTROPIC STRAIN - Google Patents
MICROBIOLOGICAL PROCESS FOR THE PRODUCTION OF FORMIATE FROM CO2 BY MEANS OF A CLASS II METHANOTROPIC STRAIN Download PDFInfo
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Abstract
L'invention a trait à un procédé microbiologique de production de formiate à partir de CO2 catalysé par une bactérie méthanotrophe de classe II, et notamment par la bactérie Methylosinus trichosporium OB3b. L'invention a également trait à un procédé de valorisation du CO2 catalysé par une bactérie méthanotrophe de classe II, et notamment par la bactérie Methylosinus trichosporium OB3b.The invention relates to a microbiological process for producing formate from CO2 catalyzed by a class II methanotrophic bacterium, and in particular by the bacterium Methylosinus trichosporium OB3b. The invention also relates to a process for recovering CO2 catalyzed by a class II methanotrophic bacterium, and in particular by the bacterium Methylosinus trichosporium OB3b.
Description
Procédé microbiologique de production de formiate à partir de CO2 au moyen d’une souche méthanotrophe de classe Π L’invention a trait à un procédé microbiologique de production de formiate à partir de CO2 catalysé par une bactérie méthanotrophe de classe II, et notamment par la souche bactérienne Methylosinus trichosporium OB3b. L’invention a également pour objet un procédé de valorisation du CO2 au moyen d’une bactérie méthanotrophe de classe II, et notamment la souche bactérienne Methylosinus trichosporium OB3b.The invention relates to a microbiological process for the production of formate from CO2 catalyzed by a class II methanotrophic bacterium, and in particular by the method for the production of formate from CO2 using a class I methanotrophic strain. bacterial strain Methylosinus trichosporium OB3b. The subject of the invention is also a process for recovering CO2 using a class II methanotrophic bacterium, and in particular the bacterial strain Methylosinus trichosporium OB3b.
Arrière-plan technologique L’acide formique ou acide méthanoique est un acide carboxylique aliphatique d’origine naturelle dont la forme basique est l’ion formiate, qui se présente sous la forme d’un liquide incolore à odeur persistante. Cette molécule a été tout d’abord découverte dans des produits de distillation de corps de fourmis. Elle se retrouve plus généralement dans les glandes de plusieurs insectes hyménoptères, ainsi que dans certaines plantes urticantes telles que les orties. De nos jours elle est synthétisée, à des fins industrielles, principalement par voie chimique. En effet, l’acide formique trouve de nombreuses applications dans l’industrie du cuir et du textile, dans la composition des teintures et produits de traitement, les insecticides, les solvants, les fumigènes, les produits de traitement anti-moisissures, etc., mais également dans la parfumerie et l’industrie agro-alimentaire en tant que molécule aromatique. Récemment, il a été montré que l’acide formique peut être utilisé comme carburant dans des piles à combustibles (Yu et al., 2008, Journal of Power Sources, 182(1), 124-132) ou pour stocker de l’hydrogène qui peut ensuite être libéré par déshydrogénation de l’acide formique (Fellay et al. 2008, Angewandte Chemie, 120(21), 4030-4032). La possibilité d’utiliser l’acide formique en tant que vecteur énergétique laisse présager que les besoins en acide formique vont s’accroître dans les prochaines années.BACKGROUND ART Formic acid or methanolic acid is a naturally occurring aliphatic carboxylic acid whose basic form is the formate ion, which is in the form of a colorless liquid with a persistent odor. This molecule was first discovered in ant body distillation products. It is found more generally in the glands of several Hymenoptera insects, as well as in some stinging plants such as nettles. Nowadays it is synthesized, for industrial purposes, mainly by chemical means. Indeed, formic acid has many applications in the leather and textile industry, in the composition of dyes and treatment products, insecticides, solvents, fumigants, anti-mold treatment products, etc. but also in perfumery and the food industry as an aromatic molecule. Recently, it has been shown that formic acid can be used as fuel in fuel cells (Yu et al., 2008, Journal of Power Sources, 182 (1), 124-132) or to store hydrogen which can then be released by dehydrogenation of formic acid (Fellay et al., 2008, Angewandte Chemie, 120 (21), 4030-4032). The possibility of using formic acid as an energy carrier suggests that the need for formic acid will increase in the coming years.
Jusqu’à présent, l’acide formique est quasiment exclusivement produit par synthèse chimique, en conditions extrêmes (de pression, température et pH) par l’hydrolyse du formamide (HC(0)NH2) obtenu par réaction du formiate de méthyle (HCO2CH3) avec de l’ammoniac ; le formiate de méthyle étant quant à lui synthétisé à partir de méthanol et de monoxyde de carbone (John et al., 1985 Encyclopedia of Chemical Processing and Design : Volume 23).Up to now, formic acid is almost exclusively produced by chemical synthesis under extreme conditions (pressure, temperature and pH) by the hydrolysis of formamide (HC (O) NH2) obtained by reaction of methyl formate (HCO2CH3 ) with ammonia; methyl formate is synthesized from methanol and carbon monoxide (John et al., 1985 Encyclopedia of Chemical Processing and Design: Volume 23).
Des voies de synthèse biologique ont été étudiées. Néanmoins, les rendements sont encore trop faibles pour être industriellement intéressants. Ainsi, on connaît par le document W095/19425 un procédé microbiologique faisant intervenir une souche bactérienne phénotypiquement proche du genre Bacillus pour produire, en présence de facteurs de croissance, du lactate et de l’acide formique à partir de glucose. Mais, outre la consommation importante de glucose, ce procédé requiert Γutilisation d’une grande quantité de facteurs de croissance (extrait de levure/caséine trypsique). On connaît également, par le document FR2745297, un procédé de fabrication d’acide formique par une bactérie lactique homofermentaire présentant une déficience dans le transport ou le métabolisme du lactose et capable de transformer ledit lactose en acide formique. Là encore, la mise en œuvre du procédé nécessite une source de sucre fermentescible. En outre, la réaction ne peut avoir lieu qu’en présence d’une concentration élevée en substances azotées et notamment en extrait de levure. Il n’est donc pas économiquement intéressant de produire de l’acide formique à l’échelle industrielle par les procédés microbiologiques actuellement disponibles.Biological synthesis routes have been studied. Nevertheless, the yields are still too low to be industrially interesting. Thus, WO95 / 19425 discloses a microbiological process involving a bacterial strain phenotypically close to the genus Bacillus to produce, in the presence of growth factors, lactate and formic acid from glucose. In addition to high glucose consumption, however, this method requires the use of a large amount of growth factors (yeast extract / trypsin casein). Document FR2745297 also discloses a process for the production of formic acid by a homofermentative lactic acid bacterium having a deficiency in the transport or metabolism of lactose and capable of converting said lactose into formic acid. Here again, the implementation of the process requires a source of fermentable sugar. In addition, the reaction can take place only in the presence of a high concentration of nitrogenous substances and especially yeast extract. It is therefore not economically advantageous to produce formic acid on an industrial scale by the currently available microbiological processes.
Une voie de synthèse biochimique du formiate (forme basique de l’acide formique) à partir de dioxyde de carbone (CO2) a également été étudiée. Plus précisément, des enzymes de type formiate déshydrogénase (FDH) extraites de microorganismes, ont été purifiées et modifiées pour améliorer leur performances de catalyse, et utilisées pour réduire le CO2 en formiate (Alissandratos et al. 2013, Appl Environ Microbiol., 79(2), 741-4 ; Spinner et al., 2012 Catal. Sci. Technol., 2, 19-28). Néanmoins, l’addition d’un cofacteur onéreux (leNAD) est nécessaire pour réaliser la réaction de bioconversion, rendant cette alternative également incompatible avec une application industrielle. Résumé de l’inventionA biochemical synthesis route of formate (basic formic acid form) from carbon dioxide (CO2) was also studied. Specifically, formate dehydrogenase (FDH) enzymes extracted from microorganisms have been purified and modified to improve their catalysis performance, and used to reduce CO2 to formate (Alissandratos et al., 2013, Appl Environ Microbiol., 79 ( 2), 741-4, Spinner et al., 2012, Catal, Sci., Technol., 2, 19-28). Nevertheless, the addition of an expensive cofactor (leNAD) is necessary to carry out the bioconversion reaction, making this alternative also incompatible with an industrial application. Summary of the invention
En travaillant sur la valorisation du CO2, les inventeurs ont découvert que des bactéries méthanotrophes de classe II, connues pour utiliser le méthane comme seule source d’énergie et de carbone, sont également aptes à convertir directement et sélectivement le CO2 en formiate dans des conditions physiologiques douces. Notamment, les inventeurs ont montré que la bactérie Methylosinus trichosporium OB3b est apte à produire des quantités de formiate importantes (par comparaison aux autres voies de synthèse du formiate connues jusqu’à présent), en utilisant le CO2 comme seule source de carbone. L’utilisation de ces bactéries méthanotrophes de classe II, telle que la bactérie Methylosinus trichosporium OB3b, pour produire du formiate permet donc simultanément de transformer le CO2 et de limiter l’émission de ce gaz à effet de serre dans l’atmosphère. L’invention a donc pour objet un procédé de production de formiate à partir de CO2, caractérisé en ce qu’il comprend une étape selon laquelle on met une bactérie méthanotrophe de classe II en contact avec du CO2.By working on the recovery of CO2, the inventors have discovered that class II methanotrophic bacteria, known to use methane as sole source of energy and carbon, are also able to directly and selectively convert CO2 into formate under conditions soft physiological. In particular, the inventors have shown that the bacterium Methylosinus trichosporium OB3b is capable of producing significant amounts of formate (compared to the other forms of formate synthesis known hitherto), using CO2 as the only carbon source. The use of these class II methanotrophic bacteria, such as the Methylosinus trichosporium OB3b bacterium, to produce formate thus simultaneously makes it possible to transform CO2 and limit the emission of this greenhouse gas into the atmosphere. The invention therefore relates to a process for producing formate from CO2, characterized in that it comprises a step according to which a class II methanotrophic bacterium is contacted with CO2.
Dans un mode de réalisation particulier, la bactérie méthanotrophe de classe II est Methylosinus trichosporium OB3b.In a particular embodiment, the class II methanotrophic bacterium is Methylosinus trichosporium OB3b.
Le procédé selon l’invention peut comprendre une étape préliminaire selon laquelle la bactérie méthanotrophe de classe II est cultivée dans un milieu de culture en présence de méthane (CH4) et d’air. L’étape de réduction du CO2 en formiate peut être réalisée sous air atmosphérique ou sous mélange gazeux contenant du CO2 ou sous CO2 pur.The method according to the invention may comprise a preliminary step according to which the class II methanotrophic bacterium is cultured in a culture medium in the presence of methane (CH4) and air. The CO2 reduction stage in formate can be carried out in atmospheric air or in a gaseous mixture containing CO2 or in pure CO 2.
Avantageusement, le procédé comprend une étape additionnelle de récupération du formiate et/ou d’acide formique. L’invention a également pour objet un mélange réactionnel susceptible d’être obtenu par la mise en œuvre d’un tel procédé, ledit mélange comprenant au moins 150 mg de formiate/g de cellules sèches, préférentiellement au moins 250 mg de formiate/g de cellules sèches, de manière encore préférée au moins 350 mg de formiate/g de cellules sèches. L’invention a également pour objet un procédé de criblage d’une bactérie méthanotrophe de classe II capable de produire du formiate par réduction du CO2, comprenant les étapes consistant à : (a) Mettre une bactérie méthanotrophe de classe II en suspension dans un milieu de réaction en présence de CO2 ; (b) Vérifier la présence de formiate dans le mélange réactionnel; et si du formiate est détecté à l’étape (b) (c) Sélectionner la bactérie. L’invention a également pour objet une bactérie méthanotrophe de classe II, isolée d’un consortium bactérien ou non, obtenue ou pouvant être obtenue selon un tel procédé de criblage. L’invention concerne également l’utilisation d’une bactérie méthanotrophe de classe II, et notamment de la bactérie Methylosinus trichosporium OB3b ou d’une bactérie obtenue ou pouvant être obtenue par le procédé de criblage, pour la production de formiate par réduction de C02. L’invention a aussi pour objet un procédé de valorisation du CO2 comprenant la réduction du CO2 en formiate par une bactérie méthanotrophe de classe II, telle que la bactérie Methylosinus trichosporium OB3b ou une bactérie obtenue ou pouvant être obtenue par le procédé de criblage. Un tel procédé comprend avantageusement la mise en œuvre du procédé de production de formiate ci-dessus.Advantageously, the process comprises an additional step of recovering formate and / or formic acid. The subject of the invention is also a reaction mixture which can be obtained by the implementation of such a process, said mixture comprising at least 150 mg of formate / g of dry cells, preferably at least 250 mg of formate / g. dry cells, more preferably at least 350 mg formate / g dry cells. The invention also relates to a method for screening a class II methanotrophic bacterium capable of producing formate by reducing CO2, comprising the steps of: (a) placing a class II methanotrophic bacterium in suspension in a medium reaction in the presence of CO2; (b) Check the presence of formate in the reaction mixture; and if formate is detected in step (b) (c) Select the bacterium. The subject of the invention is also a class II methanotrophic bacterium, isolated from a bacterial or non-bacterial consortium, obtained or obtainable according to such a screening method. The invention also relates to the use of a class II methanotrophic bacterium, and in particular to the bacterium Methylosinus trichosporium OB3b or a bacterium obtained or obtainable by the screening method, for the production of formate by reduction of CO2. . The invention also relates to a CO2 recovery process comprising the reduction of CO2 formate by a class II methanotrophic bacterium, such as the bacterium Methylosinus trichosporium OB3b or a bacterium obtained or obtainable by the screening method. Such a process advantageously comprises the implementation of the above formate production process.
Brève description des figuresBrief description of the figures
Figure 1 : Voie métabolique de la réduction du CO2 (cas de la voie sérine) dans une bactérie méthanotrophe de classe II ;Figure 1: Metabolic pathway of CO2 reduction (case of the serine pathway) in a class II methanotrophic bacterium;
Figure 2. Suivi cinétique de la concentration en formiate total (Figure 2.a) et suivis cinétiques du pH et de la DOeoonm (Figure 2.b) en réacteur fermé ;Figure 2. Kinetic monitoring of total formate concentration (Figure 2.a) and kinetic monitoring of pH and DOeoonm (Figure 2.b) in a closed reactor;
Figure 3. Suivis cinétiques de la concentration en formiate total, du pH et de la DOôoonm en réacteur semi-continu ;Figure 3. Kinetic observations of the concentration of total formate, pH and ODonoon in a semi-continuous reactor;
Figure 4. Suivi cinétique de viabilité des bactéries par croissance cellulaire lors de l’expérience en réacteur semi-continu.Figure 4. Kinetic tracking of viability of bacteria by cell growth during the semi-continuous reactor experiment.
Description détaillée de l’inventionDetailed description of the invention
Les inventeurs ont découvert que des bactéries méthanotrophes de classe II, et notamment la bactérie Methylosinus trichosporium OB3b, sont capables de produire du formiate en grandes quantités par réduction directe du CO2 dans des conditions opératoires douces. Cette découverte est très intéressante à plusieurs niveaux. Tout d’abord, contrairement à la bactérie Methylosinus trichosporium IMV 3011 (J.Y. Xin et al., 2007- Journal of Basic Microbiology, 47(5), 426-435) qui produit du méthanol, la bactérie Methylosinus trichosporium OB3b produit du formiate, avec des productions au moins 200 fois plus importantes que celle reportée pour le méthanol. Par ailleurs, Methylosinus trichosporium OB3b est apte à produire sélectivement du formiate en utilisant comme seule source de carbone le CO2, et cela sans apport de cofacteurs ou facteurs de croissance coûteux. De plus, les inventeurs ont pu obtenir des concentrations très élevées de formiate, jusqu’à environ 20 mM, ce qui est bien supérieur aux quantités obtenues jusqu’à présent par les procédés microbiologiques disponibles.The inventors have discovered that methanotrophic bacteria of class II, and in particular the bacterium Methylosinus trichosporium OB3b, are capable of producing formate in large quantities by direct reduction of CO2 under mild operating conditions. This discovery is very interesting on many levels. First, unlike Methylosinus trichosporium IMV 3011 (JY Xin et al., 2007- Journal of Basic Microbiology, 47 (5), 426-435), which produces methanol, the Methylosinus trichosporium OB3b bacterium produces formate, with productions at least 200 times larger than that reported for methanol. Furthermore, Methylosinus trichosporium OB3b is able to selectively produce formate using CO2 as the only carbon source, without the addition of costly cofactors or growth factors. In addition, the inventors have been able to obtain very high concentrations of formate, up to about 20 mM, which is much higher than the amounts obtained so far by the available microbiological processes.
Forts de cette découverte, les inventeurs ont mis au point un procédé de production microbiologique de formiate à partir de CO2, comprenant une étape de mise en contact d’une bactérie méthanotrophe de classe II, telle que la bactérie Methylosinus trichosporium OB3b, avec du CO2Based on this discovery, the inventors have developed a process for the microbiological production of formate from CO2, comprising a step of contacting a class II methanotrophic bacterium, such as the bacterium Methylosinus trichosporium OB3b, with CO2.
Dans le contexte de l’invention, on désigne par « bactéries méthanotrophes » les bactéries capables de se développer en utilisant le méthane comme seule source de carbone et d’énergie. On désigne par « bactéries méthanotrophes de classe II » les bactéries méthanotrophes appartenant au groupe des Protéobactéries a qui inclue les quatre genres suivant : Methylosinus, Methylocystis, Methylocapsa et Methylocella. Les bactéries méthanotrophes de classe II utilisent la voie sérine pour l’assimilation du carbone.In the context of the invention, the term "methanotrophic bacteria" means bacteria capable of developing using methane as sole source of carbon and energy. Methanotrophic class II bacteria are methanotrophic bacteria belonging to the group of Protobacteria which includes the following four genera: Methylosinus, Methylocystis, Methylocapsa and Methylocella. Methanotrophic class II bacteria use the serine pathway for carbon assimilation.
Avantageusement, le procédé selon l’invention est mis en œuvre en utilisant la bactérie Methylosinus trichosporium OB3b.Advantageously, the method according to the invention is implemented using the bacterium Methylosinus trichosporium OB3b.
Comme indiqué précédemment, la bactérie Methylosinus trichosporium OB3b est une bactérie méthanotrophe du groupe II (NCBI : Taxonomy ID : 595536 ; GenBank ADVE00000000 ; NCIMB : 11131). Elle fut initialement isolée en 1970 par Roger Whittenbury. Son génome a été séquencé en 2010 (L. Stein et al., 2010 - Journal of Bacteriology, p. 6497-6498). Dans le contexte de l’invention, on utilise indifféremment les termes « M. trichosporium OB3b » et « bactérie OB3b » pour désigner la bactérie Methylosinus trichosporium OB3b.As previously indicated, the bacterium Methylosinus trichosporium OB3b is a Group II methanotrophic bacterium (NCBI: Taxonomy ID: 595536; GenBank ADVE00000000; NCIMB: 11131). It was originally isolated in 1970 by Roger Whittenbury. His genome was sequenced in 2010 (L. Stein et al., 2010 - Journal of Bacteriology, 6497-6498). In the context of the invention, the terms "M. trichosporium OB3b" and "bacterium OB3b" are used interchangeably to designate the bacterium Methylosinus trichosporium OB3b.
Selon l’invention, la bactérie est mise en contact avec du CO2, avantageusement dissous dans un milieu de réaction dans lequel la bactérie est maintenue.According to the invention, the bacterium is brought into contact with CO2, advantageously dissolved in a reaction medium in which the bacterium is maintained.
Par « milieu de réaction », on entend le milieu dans lequel la bactérie est maintenue, pour produire spécifiquement du formiate, et dans lequel le CO2 apporté va être dissous, que ce milieu permette ou non la production de biomasse. Dans le contexte de l’invention, le milieu de réaction comprend au moins de l’eau, des sels minéraux et du CO2 dissous.By "reaction medium" is meant the medium in which the bacterium is maintained, to specifically produce formate, and in which the CO2 supplied will be dissolved, whether or not this medium allows the production of biomass. In the context of the invention, the reaction medium comprises at least water, mineral salts and dissolved CO2.
Le CO2 utilisé peut être le CO2 provenant de l’air atmosphérique, ou provenir en tout ou partie d’un apport spécifique en CO2. Notamment, le CO2 peut provenir de CO2 pur ou d’un mélange gazeux, tel qu’un mélange CO2-O2, CO2-CH4, ou CO2-H2. Dans un mode de réalisation particulier, le mélange gazeux comprend au moins 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% de CO2. Dans un mode de réalisation particulier, le mélange gazeux est un mélange équivolumique CO2-O2.The CO2 used may be CO2 from atmospheric air, or all or part of a specific CO2 input. In particular, the CO2 can come from pure CO2 or from a gas mixture, such as a mixture of CO2-O2, CO2-CH4, or CO2-H2. In a particular embodiment, the gaseous mixture comprises at least 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% of CO2. In a particular embodiment, the gaseous mixture is an equivolumic mixture CO2-O2.
Le formiate étant obtenu directement par réduction du CO2, le rendement en formiate du procédé selon l’invention dépend directement de l’apport en CO2. L’homme du métier saura adapter les concentrations en CO2 aux rendements souhaités. Dans un mode de réalisation particulier, la concentration en CO2 dissous dans le milieu de réaction est comprise entre environ 30 et environ 50 mM.Since the formate is obtained directly by reduction of CO2, the formate yield of the process according to the invention depends directly on the CO2 input. Those skilled in the art will be able to adapt the concentrations of CO2 to the desired yields. In a particular embodiment, the dissolved CO2 concentration in the reaction medium is between about 30 and about 50 mM.
Selon l’invention, l’apport en CO2 peut être réalisé par tout moyen connu et notamment par des contacteurs membranaires (Pen et al. 2014, Bioresource Technology, 174, 42-52), un fritté poreux de distribution de gaz (Kim et al. 2010, Biotechnology and Bioprocess Engineering, 15(3), 476-480 ; Duan et al. Bioresource Technology, 102(15), 7349-7353) ou un simple contact gaz-liquide (milieu de réaction) dans un réacteur fermé (Pen et al. 2014, Bioresource Technology, 174, 42-52).According to the invention, the CO2 contribution can be achieved by any known means and in particular by membrane contactors (Pen et al., 2014, Bioresource Technology, 174, 42-52), a porous gas distribution sinter (Kim et al. al., 2010, Biotechnology and Bioprocess Engineering, 15 (3), 476-480, Duan et al., Bioresource Technology, 102 (15), 7349-7353) or a simple gas-liquid contact (reaction medium) in a closed reactor (Pen et al., 2014, Bioresource Technology, 174, 42-52).
Dans un exemple de réalisation, il est également possible d’ajouter du molybdène à l’état de trace dans le milieu de réaction, de manière à promouvoir le fonctionnement de l’enzyme FDH de la bactérie (figure 1) et ainsi la production de CO2.In an exemplary embodiment, it is also possible to add trace molybdenum in the reaction medium, so as to promote the operation of the bacterial FDH enzyme (FIG. 1) and thus the production of CO2.
Dans un exemple de réalisation, le pH dans le milieu de réaction est maintenu entre 6 et 8, préférentiellement à pH 6,5, +/- 0,5. De même la température dans le milieu réaction est préférentiellement maintenue entre 20°C et 50°C, de manière préférée entre 25°C et 35°C, et de manière encore préférée à 30°C, +/- 1.In an exemplary embodiment, the pH in the reaction medium is maintained between 6 and 8, preferably at pH 6.5, +/- 0.5. Similarly, the temperature in the reaction medium is preferably maintained between 20 ° C and 50 ° C, preferably between 25 ° C and 35 ° C, and more preferably at 30 ° C, +/- 1.
Selon l’invention, il est possible préalablement à l’étape de réaction, c’est-à-dire préalablement à la mise en contact de la bactérie avec le CO2 pour produire le formiate, de placer la bactérie dans un milieu de culture dans des conditions de température et de pH favorables à sa croissance.According to the invention, it is possible before the reaction step, that is to say before contacting the bacterium with the CO2 to produce the formate, to place the bacterium in a culture medium in which conditions of temperature and pH favorable to its growth.
Par « milieu de culture », on entend le milieu dans lequel les bactéries sont mises à croître, pour produire de la biomasse bactérienne. Le milieu de culture comprend de manière classique les éléments chimiques strictement nécessaires à la croissance bactérienne sous une forme utilisable par les bactéries, à savoir une source de carbone (et notamment du méthane), des sels minéraux et de l’eau. Des milieux standards sont disponibles dans le commerce, décrits dans la littérature scientifique ou dans les catalogues des fournisseurs de souches bactériennes. L’homme du métier sait quels sont les composants minimums requis en l’absence desquels les bactéries méthanotrophes de classe II ne peuvent se développer, et peut sans difficultés cultiver une telle bactérie, et notamment Methylosinus trichosporium OB3b. De manière avantageuse, le milieu de culture comprend comme seule source de carbone du méthane. Les conditions générales de culture (température, composition du milieu, agitation, etc.) permettant la croissance ou le maintien des bactéries, sont aisément définies par l’homme du métier selon la souche bactérienne utilisée.By "culture medium" is meant the medium in which the bacteria are grown, to produce bacterial biomass. The culture medium conventionally comprises the chemical elements strictly necessary for bacterial growth in a form usable by bacteria, namely a source of carbon (and especially methane), mineral salts and water. Standard media are available commercially, described in the scientific literature or in the catalogs of suppliers of bacterial strains. Those skilled in the art know what are the minimum components required in the absence of which class II methanotrophic bacteria can not develop, and can without difficulty cultivate such a bacterium, including Methylosinus trichosporium OB3b. Advantageously, the culture medium comprises as sole source of carbon methane. The general conditions of culture (temperature, composition of the medium, agitation, etc.) allowing the growth or maintenance of the bacteria are easily defined by those skilled in the art according to the bacterial strain used.
Sans être liés par une quelconque théorie, les inventeurs pensent que Methylosinus trichosporium OB3b est capable de réduire le CO2 en formiate en utilisant le poly-β-hydroxybutyrate (PHB), polymère intracellulaire de stockage de l’énergie qu’elle produit en grande quantité, comme donneur d’électrons pour la régénération du cofacteur NAD (figure 1). Aussi, dans un mode de réalisation particulier, le procédé comprend une étape préalable selon laquelle la bactérie est mise à croître dans des conditions lui permettant de produire de plus grandes quantités de PHB, et notamment en la maintenant préférentiellement en présence de CH4 et d’air, dans des conditions limitantes en azote, phosphore et/ou oxygène.Without being bound by any theory, the inventors believe that Methylosinus trichosporium OB3b is capable of reducing CO2 to formate by using poly-β-hydroxybutyrate (PHB), an intracellular polymer for storing the energy it produces in large quantities. , as an electron donor for the regeneration of the NAD cofactor (FIG. 1). Also, in a particular embodiment, the method comprises a prior step according to which the bacterium is grown under conditions enabling it to produce greater quantities of PHB, and in particular by maintaining it preferentially in the presence of CH4 and air, under conditions limiting nitrogen, phosphorus and / or oxygen.
Après l’étape de culture, la bactérie est avantageusement lavée de son milieu de culture et mise en suspension dans du milieu de réaction avant la mise en contact avec du CO2.After the culturing step, the bacterium is advantageously washed from its culture medium and suspended in reaction medium before contacting with CO2.
Tout ou partie du procédé selon l’invention peut être mis en œuvre à l’échelle du laboratoire ou à l’échelle industrielle, c’est-à-dire sur des fermenteurs de moyenne (d’environ 1 à 100 m3) ou de grande capacité (de plus de 100 m3).All or part of the process according to the invention can be implemented on a laboratory scale or on an industrial scale, that is to say on fermenters of average (from about 1 to 100 m 3) or large capacity (over 100 m3).
Dans un mode de réalisation particulier du procédé de l’invention, l’étape de réduction du CO2 par la bactérie méthanotrophe de classe II est conduite dans un bioréacteur, ou fermenteur. Selon l’invention, il est possible d’utiliser un réacteur fermé, semi-continu ou continu, de manière à conduire une réaction en « batch », en « fed batch » ou en continu.In a particular embodiment of the process of the invention, the step of reducing CO2 by class II methanotrophic bacteria is conducted in a bioreactor, or fermenter. According to the invention, it is possible to use a closed, semi-continuous or continuous reactor, so as to conduct a reaction in "batch", "fed batch" or continuously.
Ainsi, à titre d’exemple, dans un réacteur fermé, sous air atmosphérique, la concentration en formiate peut atteindre 400 mg/L ± 50 mg/L, au bout de 15 jours de réaction à 30°C ; tandis que sous mélange 50% air et 50% CO2, la concentration en formiate est supérieure à 700 mg/L ± 50 mg/L, au bout de 15 jours de réaction à 30°C. En réacteur semi-continu, sous air atmosphérique, on obtient 400 mg/L ± 50 mg/L de formiate au bout de 15 jours de réaction à 30°C.Thus, for example, in a closed reactor, in atmospheric air, the formate concentration can reach 400 mg / L ± 50 mg / L, after 15 days of reaction at 30 ° C; while under a mixture of 50% air and 50% CO2, the formate concentration is greater than 700 mg / L ± 50 mg / L, after 15 days of reaction at 30 ° C. In a semi-continuous reactor, under atmospheric air, 400 mg / L ± 50 mg / L of formate are obtained after 15 days of reaction at 30 ° C.
Le procédé selon l’invention permet notamment d’obtenir au moins 150 mg de formiate/g de cellules sèches, préférentiellement au moins 250 mg de formiate/g de cellules sèches, de manière encore préférée au moins 350 mg de formiate/g de cellules sèches après un temps de réaction compris entre 10 et 15 jours.The process according to the invention makes it possible in particular to obtain at least 150 mg of formate / g of dry cells, preferably at least 250 mg of formate / g of dry cells, more preferably at least 350 mg of formate / g of cells. dry after a reaction time between 10 and 15 days.
Dans un mode de mise en œuvre particulier, le procédé de production de formiate selon l’invention comprend les étapes consistant à :In a particular embodiment, the process for producing formate according to the invention comprises the steps of:
Introduire une bactérie méthanotrophe de classe II dans un bioréacteur contenant un milieu de réaction ;Introduce class II methanotrophic bacteria into a bioreactor containing a reaction medium;
Approvisionner le milieu de réaction en un gaz contenant du CO2 ; et optionnellement Récupérer le formiate produit dans le bioréacteur par réduction du CO2, sous forme de formiate et/ou d’acide formique.Supply the reaction medium with a gas containing CO2; and optionally recovering the formate produced in the bioreactor by reduction of CO2, in the form of formate and / or formic acid.
Dans un mode de mise en œuvre du procédé selon l’invention, le formiate produit est récupéré sous forme d’acide formique à partir du milieu de réaction.In one embodiment of the process according to the invention, the product formate is recovered in the form of formic acid from the reaction medium.
Dans un mode de réalisation particulier, l’étape de récupération de l’acide formique à partir du milieu de réaction est réalisée par électrodialyse ou par extraction-liquide avec un co-solvant. Ces dispositifs de récupération permettent de récupérer en continu l’acide formique et éviter ainsi l’éventuelle inhibition des bactéries par un excédent de produit, tout en obtenant un acide formique exempt d’impuretés (comme les sels du milieu de réaction). Dans le cas d’une récupération en continu du produit, un apport continu en CO2 peut être réalisé dans le bioréacteur. Dans le cas d’un procédé de récupération par électrodialyse, un module d’électrodialyse bipolaire est avantageusement couplé avec un module de microfiltration pour séparer et récupérer en continu le formiate produit sous sa forme acide (acide formique). En particulier, l’électrodialyse bipolaire peut être réalisée sur un milieu de réaction sans biocatalyseurs, obtenu en continu après avoir séparé les bactéries du milieu par un module de microfiltration tangentielle. L’électrodialyse bipolaire consiste à combiner une membrane bipolaire pour acidifier le formiate en acide formique et des membranes monopolaires pour extraire les sels du milieu de réaction.In a particular embodiment, the step of recovering formic acid from the reaction medium is carried out by electrodialysis or by extraction-liquid with a co-solvent. These recovery devices make it possible to continuously recover the formic acid and thus avoid the possible inhibition of the bacteria by an excess of product, while obtaining a formic acid free of impurities (such as the salts of the reaction medium). In the case of a continuous recovery of the product, a continuous supply of CO2 can be realized in the bioreactor. In the case of an electrodialysis recovery process, a bipolar electrodialysis module is advantageously coupled with a microfiltration module for continuously separating and recovering the formate produced in its acid form (formic acid). In particular, bipolar electrodialysis can be performed on a reaction medium without biocatalysts, obtained continuously after separating the bacteria from the medium by a tangential microfiltration module. Bipolar electrodialysis involves combining a bipolar membrane to acidify formate into formic acid and monopolar membranes to extract salts from the reaction medium.
Le formiate et/ou l’acide formique obtenu à partir d’un tel procédé microbiologique peut être avantageusement utilisé dans toute industrie susceptible d’en avoir besoin, et notamment dans l’industrie du cuir et du textile, dans la parfumerie, dans l’industrie agro-alimentaire, etc. Par exemple, le formiate et/ou l’acide formique issu du procédé selon l’invention peut être utilisé dans la composition de teintures, d’insecticides, de solvants, de fumigènes, de produits de traitement anti-moisissures ou en tant que molécule aromatique, etc. Par ailleurs, le formiate et/ou l’acide formique issu du procédé selon l’invention peut s’avérer particulièrement utile en tant que carburant dans des piles à combustibles ou pour stocker de l’hydrogène. L’invention a également pour objet le mélange réactionnel susceptible d’être obtenu par la mise en œuvre du procédé décrit ci-dessus. Avantageusement, ledit mélange comprend au moins 150 mg de formiate/g de cellules sèches, préférentiellement au moins 250 mg de formiate/g de cellules sèches, de manière encore préférée au moins 350 mg de formiate/g de cellules sèches.The formate and / or formic acid obtained from such a microbiological process can be advantageously used in any industry that may need it, and in particular in the leather and textile industry, in perfumery, in the food industry. food industry, etc. For example, the formate and / or formic acid derived from the process according to the invention can be used in the composition of dyes, insecticides, solvents, fumigants, anti-mold treatment products or as a molecule. aromatic, etc. Furthermore, the formate and / or formic acid from the process according to the invention can be particularly useful as fuel in fuel cells or for storing hydrogen. The subject of the invention is also the reaction mixture that can be obtained by carrying out the process described above. Advantageously, said mixture comprises at least 150 mg of formate / g of dry cells, preferably at least 250 mg of formate / g of dry cells, more preferably at least 350 mg of formate / g of dry cells.
Par « mélange réactionnel », on désigne un milieu de réaction comprenant au moins un microorganisme ainsi que les produits de la réaction catalysée par ledit microorganisme. Ainsi, selon l’invention, le mélange réactionnel désigne un milieu de réaction comprenant une bactérie méthanotrophe de groupe II capable de produire du formiate à partir de CO2, ainsi que du formiate. Par exemple, le mélange réactionnel comprend du milieu de réaction, la bactérie Methylosinus trichosporium OB3b et du formiate. L’invention a également pour objet un bioréacteur comprenant une suspension bactérienne de Methylosinus trichosporium OB3b dans un milieu de réaction, un système d’alimentation de gaz dans ladite suspension, et optionnellement des moyens pour alimenter la suspension en inoculum et/ou sels minéraux et/ou des moyens pour récupérer les produits de réaction. L’invention a également pour objet l’utilisation d’une bactérie méthanotrophe de classe II capable de produire du formiate, telle que la bactérie Methylosinus trichosporium OB3b pour la production de formiate par réduction de CO2. L’utilisation d’une bactérie méthanotrophe de classe II telle que la bactérie Methylosinus trichosporium OB3b pour produire du formiate permet de consommer de grandes quantités de CO2. Ainsi, l’invention fournit un procédé de valorisation du CO2 comprenant une étape de réduction du CO2 en formiate par une bactérie méthanotrophe de classe II, et notamment par la bactérie Methylosinus trichosporium OB3b, mettant avantageusement en œuvre le procédé de production de formiate ci-dessus. L’invention a également pour objet un procédé de criblage d’une bactérie méthanotrophe de classe II capable de produire du formiate par réduction du CO2, comprenant les étapes consistant à : (a) Mettre une bactérie méthanotrophe de classe II en suspension dans un milieu de réaction en présence de CO2 ; (b) Vérifier la présence de formiate dans le mélange réactionnel; et en cas de présence de formiate dans le milieu de réaction ; (c) Sélectionner la bactérie.By "reaction mixture" means a reaction medium comprising at least one microorganism and the products of the reaction catalysed by said microorganism. Thus, according to the invention, the reaction mixture designates a reaction medium comprising a group II methanotrophic bacterium capable of producing formate from CO2, as well as formate. For example, the reaction mixture comprises reaction medium Methylosinus trichosporium OB3b and formate. The invention also relates to a bioreactor comprising a bacterial suspension of Methylosinus trichosporium OB3b in a reaction medium, a gas supply system in said suspension, and optionally means for supplying the suspension with inoculum and / or mineral salts and / or means for recovering the reaction products. The invention also relates to the use of a class II methanotrophic bacterium capable of producing formate, such as the bacterium Methylosinus trichosporium OB3b for the production of formate by reducing CO2. The use of a class II methanotrophic bacterium such as the Methylosinus trichosporium OB3b bacterium to produce formate makes it possible to consume large amounts of CO2. Thus, the invention provides a process for recovering CO2 comprising a step of reducing CO2 to formate by a class II methanotrophic bacterium, and in particular by the bacterium Methylosinus trichosporium OB3b, advantageously implementing the formate production process described in FIG. above. The invention also relates to a method for screening a class II methanotrophic bacterium capable of producing formate by reducing CO2, comprising the steps of: (a) placing a class II methanotrophic bacterium in suspension in a medium reaction in the presence of CO2; (b) Check the presence of formate in the reaction mixture; and in case of presence of formate in the reaction medium; (c) Select the bacterium.
Avantageusement, l’étape (b) de vérification de la présence de formiate se fait par comparaison avec un ou deux témoins négatifs. Un premier témoin peut consister en du milieu de réaction sous CO2 mais dépourvu de bactéries. Un second témoin peut consister en du milieu de réaction comprenant des bactéries mais dépourvu de CO2. La présence d’une bactérie méthanotrophe de classe II capable de produire du formiate par réduction du CO2 dans le milieu de réaction est confirmée si du formiate est détecté dans le mélange réactionnel et que dans le ou les témoins, il n’y a pas de formiate détecté.Advantageously, the step (b) of checking the presence of formate is by comparison with one or two negative controls. A first control may consist of reaction medium under CO2 but free of bacteria. A second control may consist of reaction medium comprising bacteria but devoid of CO2. The presence of a class II methanotrophic bacterium capable of producing formate by reduction of CO2 in the reaction medium is confirmed if formate is detected in the reaction mixture and in the control (s) there is no formate detected.
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé de criblage comprend une étape préliminaire selon laquelle la bactérie est cultivée dans un milieu de culture en présence de méthane et d’air avant l’étape (a) de réaction. L’invention a également pour objet une bactérie méthanotrophe de classe II, isolée d’un consortium bactérien ou non, obtenue ou pouvant être obtenue par un tel procédé de criblage. D’autres aspects et avantages de la présente invention apparaîtront dans la partie expérimentale suivante, qui doit être regardée à titre illustratif, ne limitant en aucune façon l’étendue de la protection recherchée.In a particular embodiment, the screening method comprises a preliminary step wherein the bacterium is cultured in a culture medium in the presence of methane and air prior to step (a) of reaction. The subject of the invention is also a Class II methanotrophic bacterium, isolated from a bacterial or non-bacterial consortium, obtained or obtainable by such a screening method. Other aspects and advantages of the present invention will appear in the following experimental part, which must be regarded as an illustration, in no way limiting the extent of the protection sought.
ExemplesExamples
Matériel et méthodes 1) Souche bactérienne et culture cellulaireMaterials and methods 1) Bacterial strain and cell culture
La souche Mélhylosinus trichosporium OB3b (NCIMB, 11131, Angleterre) est cultivée dans un milieu NMS (Nitrate Minerai Salts) modifié comme décrit dans Pen et al., 2014 (Bioresource Technology, 174, 42-52 « An innovative membrane biorecator for methane biohydroxylation »). La souche est maintenue par voie liquide avec des repiquages réguliers dans du milieu NMS frais (Pen et al., 2014). La culture cellulaire est réalisée dans un réacteur de culture cellulaire de 3 L (Biostat A plus, Sartorius, France) mis en œuvre à 30°C avec des débits gazeux fixés à 100 ± 5 mL.min"1, respectivement pour le méthane et l’air. Une corrélation entre la densité optique (DO) de la suspension à 600 nm (DOôoonm) et la concentration en cellules sèches a été préalablement établie ([concentration en cellules sèches] (g/L) = 0,322 x DOeoomn (-), Pen et al., 2014). i Milieu de réaction et préparation de la suspension bactérienneThe strain Melhylosinus trichosporium OB3b (NCIMB, 11131, England) is grown in NMS medium (Nitrate Minerals Salts) modified as described in Pen et al., 2014 (Bioresource Technology, 174, 42-52). An innovative membrane biorecator for methane biohydroxylation "). The strain is maintained liquid with regular subcultures in fresh NMS medium (Pen et al., 2014). The cell culture is carried out in a 3 L cell culture reactor (Biostat A plus, Sartorius, France) operated at 30 ° C. with gas flow rates set at 100 ± 5 mL.min-1, respectively for methane and A correlation between the optical density (OD) of the 600 nm suspension (DOôoonm) and the dry cell concentration was previously established ([dry cell concentration] (g / L) = 0.322 x DOeoomn (- ), Pen et al., 2014) i Reaction medium and preparation of the bacterial suspension
Les expériences sont conduites dans un milieu de réaction autoclavé (pH = 7,0 ±0,1), composé de sels minéraux de 20 mM de phosphate et 5 mM de MgCh (Xin et al., 2007) dans de l’eau ultrapure. A la fin de l’étape de culture cellulaire, la culture bactérienne est centrifugée de manière stérile pendant 20 min à 4500 rpm et à 4°C. Le surnageant est ôté et les culots bactériens sont ensuite resuspendus dans le milieu de réaction, de telle sorte que la DOeoonm de la suspension bactérienne soit de l’ordre de 20 (déterminée d’après une dilution). La suspension mère ainsi obtenue est alors utilisée pour les expériences. i BioréacteursThe experiments are carried out in an autoclaved reaction medium (pH = 7.0 ± 0.1), composed of 20 mM phosphate mineral salts and 5 mM MgCh (Xin et al., 2007) in ultrapure water. . At the end of the cell culture step, the bacterial culture is sterile centrifuged for 20 minutes at 4500 rpm and 4 ° C. The supernatant is removed and the bacterial pellets are then resuspended in the reaction medium, such that the DOeoonm of the bacterial suspension is of the order of 20 (determined from a dilution). The mother suspension thus obtained is then used for the experiments. i Bioreactors
Deux types de bioréacteurs ont été mis en œuvre : un bioréacteur fermé et un réacteur semi-continu. Réacteur ferméTwo types of bioreactors have been implemented: a closed bioreactor and a semi-continuous reactor. Reactor closed
Le réacteur fermé est un flacon étanche de 50 ml contenant 5 ml de liquide. Deux conditions ont été testées. L’espace de tête du flacon (45 ml) est rempli dans un cas, d’un mélange stérile et équivolumique d’air atmosphérique et de dioxyde de carbone (99,999 %) et dans l’autre cas, le mélange gazeux est seulement constitué d’air atmosphérique stérile ; les gaz de l’espace de tête sont tous à la pression atmosphérique. Il est à noter que l’air utilisé contient 0,039% volumique de CO2. Les gaz sont stérilisés au moyen de filtres hydrophobes en Téflon (0,2-pm, Sartorius). Le réacteur est agité sur un plateau agitant (Unimax 1010, Heidolph) dans un incubateur. Le milieu des réacteurs est échantillonné stérilement avec une seringue.The closed reactor is a 50 ml sealed flask containing 5 ml of liquid. Two conditions were tested. The head space of the flask (45 ml) is filled in one case with a sterile and equivolumic mixture of atmospheric air and carbon dioxide (99.999%) and in the other case, the gaseous mixture is only constituted sterile atmospheric air; headspace gases are all at atmospheric pressure. It should be noted that the air used contains 0.039% by volume of CO2. The gases are sterilized using hydrophobic Teflon filters (0.2-pm, Sartorius). The reactor is stirred on a stirring tray (Unimax 1010, Heidolph) in an incubator. The reactor medium is sampled sterilely with a syringe.
La réaction est conduite à 30 ± 1°C, sous une agitation de 160 rpm. Pour chaque cinétique, une série de flacons identiques est remplie avec la même suspension bactérienne et incubée. La réaction est arrêtée à différents temps de réaction.The reaction is conducted at 30 ± 1 ° C, with stirring of 160 rpm. For each kinetics, a series of identical vials is filled with the same bacterial suspension and incubated. The reaction is stopped at different reaction times.
Deux types de témoins sont réalisés : dans un cas, le mélange bactérien dans le milieu de réaction est mis en contact d’azote stérile (99,999 %) et dans l’autre cas, le milieu de réaction seul est mis en contact d’un mélange stérile CCh/air (1 :1 v/v).Two types of control are carried out: in one case, the bacterial mixture in the reaction medium is brought into contact with sterile nitrogen (99.999%) and in the other case, the reaction medium alone is brought into contact with one another. sterile CCh / air mixture (1: 1 v / v).
Chaque expérience est reproduite 3 fois. La concentration initiale moyenne de la suspension dans les réacteurs est 2,5 ± 0,3 g cellules sèches/L. b. Réacteur semi-continuEach experiment is reproduced 3 times. The initial average concentration of the suspension in the reactors is 2.5 ± 0.3 g dry cells / L. b. Semi-continuous reactor
Le réacteur utilisé est un réacteur de culture cellulaire d’un volume total de 3L (Biostat A plus, Sartorius, France). Le volume utile est 1,6 L et la concentration initiale de la suspension bactérienne est 2,1 ± 0,2 g cellules sèches/L. Le réacteur est maintenu à 30°C avec des débits gazeux de 100 ± 5 ml.min"1 pour l’air et le CO2 (cas d’un mélange CCh/air 1 :1 v/v). Les gaz sont stérilisés au moyen de filtres hydrophobes en Téflon (0,2-pm, Sartorius).The reactor used is a cell culture reactor with a total volume of 3L (Biostat A plus, Sartorius, France). The useful volume is 1.6 L and the initial concentration of the bacterial suspension is 2.1 ± 0.2 g dry cells / L. The reactor is maintained at 30 ° C. with gas flow rates of 100 ± 5 ml.min -1 for air and CO2 (in the case of a CCh / air 1: 1 v / v mixture). medium of hydrophobic Teflon filters (0.2-pm, Sartorius).
Pour chaque expérience (en réacteurs fermés ou semi-continus), des échantillons sont prélevés régulièrement de manière à mesurer la DOeoonm et la concentration en formiate total. Dans le cas du réacteur fermé, l’échantillonnage effectué permet aussi de mesurer le pH au cours du temps. 4) Tests de croissance des bactériesFor each experiment (in closed or semi-continuous reactors), samples are taken regularly to measure DOeoonm and total formate concentration. In the case of the closed reactor, the sampling performed also makes it possible to measure the pH over time. 4) Bacteria growth tests
Afin de déterminer si tout ou partie des bactéries présentes au sein du réacteur semi-continu sont toujours vivantes, des prélèvements de la suspension du réacteur sont effectués au cours du temps et ensemencés dans du milieu de culture frais (3% v/v) puis mis en culture dans des flacons de culture étanches (de volume total 100 ml dont 35 ml de liquide). Le ciel gazeux est composé d’un mélange méthane/air (1 :1 v/v) et le mélange gazeux est renouvelé chaque jour. La durée de la culture est fixée à 7 jours. La suspension mise en culture dans les flacons est prélevée (1 ml) initialement et au bout de 7 jours pour mesurer les DOeoonm initiale et finale. 5) Analyse du formiate total produitIn order to determine whether all or part of the bacteria present in the semi-continuous reactor are still alive, samples of the suspension of the reactor are made over time and seeded in fresh culture medium (3% v / v) and then cultured in sealed culture flasks (total volume 100 ml including 35 ml of liquid). The gaseous sky is composed of a methane / air mixture (1: 1 v / v) and the gaseous mixture is renewed every day. The duration of the cultivation is fixed at 7 days. The suspension placed in culture in the flasks is removed (1 ml) initially and after 7 days to measure the initial and final ODeoonm. 5) Analysis of the total formate product
Immédiatement après collecte, une fraction des échantillons est transférée dans un Eppendorf de 2 mL et centrifugée pendant 3 min à 4500 rpm et 4°C pour stopper la réaction dans l’échantillon. Le surnageant est alors conservé à -20°C pour un dosage du formiate total par chromatographie ionique (Dionex ICS-1000). La colonne utilisée est une Dionex IonPac AS 19 et l’élution est réalisée avec la rampe de concentration en hydroxyde de potassium (KOH) suivante : 10 mM pendant 10 min, puis 1,75 mM.min"1 jusqu’à 45 mM et enfin 10 mM pendant 10 min. Résultats L) Résultats en réacteur ferméImmediately after collection, a fraction of the samples are transferred to a 2 mL Eppendorf and centrifuged for 3 min at 4500 rpm and 4 ° C to stop the reaction in the sample. The supernatant is then stored at -20 ° C. for a total formate assay by ion chromatography (Dionex ICS-1000). The column used is a Dionex IonPac AS 19 and the elution is carried out with the following potassium hydroxide (KOH) concentration ramp: 10 mM for 10 min, then 1.75 mM.min-1 up to 45 mM and and finally 10 mM for 10 min Results L) Closed reactor results
Les résultats obtenus en réacteur fermé sous mélange équivolumique d’air et de CO2 et sous air seul sont présentés en Figure 2. Les témoins y sont également reportés.The results obtained in a closed reactor with an equivolumic mixture of air and CO2 and air alone are shown in FIG. 2. The controls are also reported there.
Les témoins ne révèlent aucune présence de formiate (Fig. 2.a). En particulier, le témoin sous azote montre que les bactéries ne relarguent pas de formiate (en tant que produit microbien soluble) en cours d’expérience et le témoin sans bactéries sous mélange CCL/air montre que la réduction spontanée du CO2 en formiate ne se produit pas. L’apparition de formiate n’a lieu qu’en présence de CO2 et de bactéries (Fig. 2.a). L’évolution de la concentration en formiate au cours du temps a la même allure dans les deux cas testés (sous air et sous mélange air/CCh). En effet, la concentration croît, après une phase de latence de 10 jours, pour atteindre un maximum à 15 jours (environ 350 mg/L sous air et 750 mg/L sous mélange) puis diminue de 27 ± 1 % en moyenne dans les 2 cas à t = 20 jours.The controls do not reveal any presence of formate (Fig. 2.a). In particular, the control under nitrogen shows that the bacteria do not release formate (as a soluble microbial product) during the experiment and the control without bacteria under CCL / air mixture shows that the spontaneous reduction of CO2 into formate does not occur. product not. The appearance of formate takes place only in the presence of CO2 and bacteria (Fig. 2.a). The evolution of the formate concentration over time has the same pace in the two cases tested (under air and under air / CCh mixture). Indeed, the concentration increases, after a lag phase of 10 days, to reach a maximum at 15 days (about 350 mg / L in air and 750 mg / L under mixing) then decreases of 27 ± 1% on average in the 2 cases at t = 20 days.
Les concentrations en formiate atteintes sont d’autant plus grandes qu’il y a de CO2 dans l’espace de tête (Fig. 2.a). De plus, la quantité théorique de CO2 disponible dans l’espace de tête sous mélange CCh/air (8,9 10'1 mmol) est près de 10 fois supérieure à la quantité maximale en formiate produit (8,3 10'2 mmol), ce qui signifie qu’il n’y a pas de limitation par le CO2 dans ce cas. L’ensemble de ces éléments démontre que le CO2 est utilisé par la bactérie pour fabriquer du formiate et que, dans les conditions testées, les bactéries ont une capacité limitée d’assimilation du CO2 qui peut possiblement être liée à une inhibition des bactéries par le formiate.The concentrations of formate reached are all the greater as there is CO2 in the headspace (Fig. 2.a). In addition, the theoretical amount of CO2 available in the headspace under CCh / air mixture (8.9 ± 10 mmol) is nearly 10 times greater than the maximum amount of formate produced (8.3 × 10 -2 mmol). ), which means that there is no CO2 limitation in this case. All of these elements demonstrate that CO2 is used by the bacterium to make formate and that, under the conditions tested, the bacteria have a limited ability to assimilate CO2 which may possibly be related to an inhibition of bacteria by the bacteria. formate.
Dans les deux cas (mélange CCh-air et air seul), les suivis de DO et de pH (Fig. 2.b) montrent une forte diminution de la DO en début d’expérience puis ce paramètre tend à se stabiliser à partir de 5 jours autour d’une valeur moyenne de 5,8 ± 0,2 sous mélange et de 4,7 ± 0,2 sous air seul (l’écart observé pouvant être attribué à l’écart de concentration initiale représentant près d’une unité DO, soit près de 0,3 g de cellules sèches /L seulement). Le pH diminue sur les 5 premiers jours (de 7,0 à 6,1 en mélange et de 7,0 à 6,7 sous air) puis reste constant tout le long de l’expérience (Fig. 2.b). Il est à noter que le pH moyen tend dans les deux cas vers le pka du couple CO2/HCO3' = 6,37. A ce pH, l’espèce majoritaire est la forme basique (ion formiate) car le pKa de l’acide formique est de 3,75.In both cases (CCh-air mixture and air alone), the OD and pH follow-ups (Fig. 2.b) show a sharp decrease in OD at the beginning of the experiment and this parameter tends to stabilize from 5 days around an average value of 5.8 ± 0.2 under mixing and 4.7 ± 0.2 under air alone (the difference observed that can be attributed to the initial concentration difference representing almost one unit OD, ie almost 0.3 g of dry cells / L only). The pH decreases over the first 5 days (from 7.0 to 6.1 mixed and from 7.0 to 6.7 under air) and remains constant throughout the experiment (Fig. 2.b). It should be noted that the average pH tends in both cases towards the pka of the couple CO2 / HCO3 '= 6.37. At this pH, the majority species is the basic formate (ion formate) because the pKa of formic acid is 3.75.
La DO à 20 jours reste constante aux alentours de 5-6, ce qui montre que les bactéries sont toujours viables dans ces conditions. £) Résultats en réacteur semi-continuThe OD at 20 days remains constant around 5-6, which shows that the bacteria are still viable under these conditions. £) Semi-continuous reactor results
Dans cette configuration, les apports en CO2 et en air sont continus. Les résultats obtenus en réacteur semi-continu sous mélange équivolumique d’air et de CO2 sont présentés en Figure 3.In this configuration, the CO2 and air inputs are continuous. The results obtained in semi-continuous reactor with equivolumic mixture of air and CO2 are shown in FIG.
Comme en réacteur fermé, il y a une production de formiate et la concentration commence à augmenter entre 5 et 10 jours. La production maximale de formiate obtenue est de 215 ± 5 mg/g cellules sèches. A partir de 30 jours, la concentration se stabilise jusqu’à 60 jours autour d’une valeur moyenne de 400 mg/L. La DOeoonm et le pH demeurent constants tout le long de l’expérience (6,5 ± 0,2 pour la DO et 6,3 ±0,1 pour le pH dès 3 jours).As in closed reactor, there is a production of formate and the concentration begins to increase between 5 and 10 days. The maximum production of formate obtained is 215 ± 5 mg / g dry cells. From 30 days, the concentration stabilizes up to 60 days around an average value of 400 mg / L. DOeoonm and pH remained constant throughout the experiment (6.5 ± 0.2 for OD and 6.3 ± 0.1 for pH from 3 days).
La Figure 4 donne les résultats des tests de viabilité par croissance conduits tout au long de l’expérience avec le réacteur semi-continu. La DO initiale représente la DOeoonm de la suspension ensemencée dans du milieu frais (t = 0 j) ; la DO finale est la DOeoonm de la même suspension au bout de 7 jours de culture. La DO initiale est globalement constante au cours du temps (Fig. 4) et ceci s’explique par le fait que la DO dans le réacteur est quasi-constante (Fig. 3). Dans tous les cas, la DO finale reste significativement plus importante que la DO initiale. Ces résultats prouvent donc que tout ou grande partie des bactéries sont encore viables au bout de 60 jours de fonctionnement du réacteur.Figure 4 gives the results of the viability tests by growth conducted throughout the experiment with the semi-continuous reactor. The initial OD represents the DOeoonm of the suspension seeded in fresh medium (t = 0 days); the final OD is the DOeoonm of the same suspension after 7 days of culture. The initial OD is globally constant over time (Fig. 4) and this is explained by the fact that the OD in the reactor is almost constant (Fig. 3). In all cases, the final OD remains significantly larger than the initial OD. These results thus prove that all or most of the bacteria are still viable after 60 days of operation of the reactor.
Les expérimentations ci-dessus permettent de confirmer qu’il est possible de produire de grandes quantités de formiate à partir du CO2 au moyen de la bactérie Méthylosinus trichosporium OB3b en présence de CO2 Le rendement en formiate est directement fonction des apports en CO2. Dans tous les cas, il est montré que la bactérie résiste à de fortes concentrations en formiate, permettant d’envisager une production du formiate à l’échelle industrielle.The above experiments make it possible to confirm that it is possible to produce large quantities of formate from CO2 using the bacterium Methylosinus trichosporium OB3b in the presence of CO2. The formate yield is directly a function of the CO2 inputs. In all cases, it is shown that the bacterium is resistant to high concentrations of formate, making it possible to envisage production of formate on an industrial scale.
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Also Published As
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|---|---|
| WO2017017355A1 (en) | 2017-02-02 |
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