FR3013847A1 - Nouveau biomarqueur du cancer de la prostate. - Google Patents

Abstract

L'invention concerne une méthode de détection in vitro d'un cancer de la prostate et/ou d'une métastase prostatique chez un sujet comprenant les étapes consistant à : (i) mesurer la concentration de α2δ2, ou un fragment de α2δ2, dans un échantillon biologique obtenu dudit sujet, (ii) comparer la concentration de α2δ2, ou un fragment de α2δ2, mesurée à l'étape (i) à une valeur prédéterminée de la concentration en α2δ2, ou un fragment de α2δ2, dans laquelle une concentration de α2δ2, ou d'un fragment de α2δ2, dans l'échantillon biologique supérieure à ladite valeur prédéterminée indique la présence d'un cancer de la prostate chez ledit sujet, et une concentration de α2δ2, ou d'un fragment de α2δ2, inférieure à ladite valeur prédéterminée indique l'absence d'un cancer de la prostate chez ledit sujet.

Description

L'invention concerne l'utilisation de la protéine a282 ou un fragment de celle-ci comme biomarqueur du cancer de la prostate d'un sujet. Le cancer de la prostate est un des types de cancer les plus fréquents chez les hommes, et est l'une des principales causes de morbidité et mortalité cancéreuse dans le monde. Le cancer de la prostate constitue un problème de santé publique de plus en plus important en partie du fait de l'augmentation de la durée de vie. Il se situe par exemple en France au premier rang des cancers avec environ 71 000 nouveaux cas en 2011 (1).

Actuellement, la technique la plus répandue pour diagnostiquer le cancer de la prostate est basée sur des critères anatomo-pathologiques habituellement obtenus à partir de biopsies de la prostate indiquées suite à une élévation du taux sanguin de PSA (Prostate Spécific Antigen) et/ou un toucher rectal. Cette protéine PSA est sécrétée par la prostate et son taux s'élève lorsqu'il existe une pathologie prostatique inflammatoire ou tumorale bénigne ou maligne (cancer). La mesure du taux de PSA dans le sang indique ainsi la probabilité de développer un cancer de la prostate, mais il peut y avoir des erreurs, notamment dans le screening de la PSA, ou encore à cause du fait que ce test n'est pas spécifique du cancer de la prostate. Le toucher rectal, quant à lui, aboutit à de grandes divergences selon le praticien, et est plus utilisé pour la détection de stades avancés du cancer de la prostate.

Il existe donc toujours un besoin pour de nouvelles méthodes, de préférence non- invasives, de détection du cancer de la prostate et de détermination du stade du cancer de la prostate. Les canaux calciques représentent une des principales voies d'entrée du calcium dans la cellule nerveuse, participant activement à l'excitabilité cellulaire et aux processus moléculaires de la transmission synaptique. Les canaux calciques sont des complexes glycoprotéiques dont le composant central est la sous-unité ai, formant le pore, associée à des sous-unités auxiliaires a28, f3 et y. La sous-unité a215 est formée de deux unités, a2 et Ô, codées par le même gêne. Ces deux parties sont reliées entre elles via deux ponts disulfures. La sous- unité a215 est essentiellement extracellulaire et est ancrée à la membrane plasmique par la partie Ô de la protéine au moyen d'un groupement GlycosylPhosphatidylInositol (GPI). Quatre sous-parties de a215 (a2151 à a284), chacune codée par un gène, ont ainsi été découvertes. Alors que l'implication des canaux calciques dans les maladies cardiovasculaires, neurologiques ou métaboliques est connue depuis longtemps, leur rôle dans d'autres pathologies comme le cancer n'a été admis que récemment. Des études in vivo ou in vitro ont ainsi démontré l'implication des canaux calciques dans le développement cancéreux de différents tissus ou organes, comme la prostate, le sein, ou le cerveau (2, 3). Les canaux calciques participeraient en effet à l'invasion cellulaire, la migration, la différenciation et/ou à la prolifération (4, 5, 6). Il a ainsi été mis en évidence que différents canaux calciques, et notamment les canaux calciques voltage-dépendant, pouvaient être impliqués, soit en étant surexprimés, soit en étant sous-exprimés, dans la tumorigénèse. Dans la plupart des cas, la surexpression des canaux calciques accélère la prolifération cellulaire tandis que l'inhibition et la régulation à la baisse des canaux calciques diminuent la croissance cellulaire.

Il a, par exemple, été précédemment démontré par les inventeurs que les canaux calciques de type T voltage-dépendants Cav3.2 sont surexprimés dans les lignées cellulaires du cancer de la prostate, aboutissant vers un phénotype plus agressif (5). Il a également précédemment été démontré par les inventeurs que ces canaux permettent la sécrétion de facteurs paracrines comme la sérotonine ou la phosphatase prostatique acide, pouvant jouer un rôle dans la progression cancéreuse. Par ailleurs, les sous-unités des canaux calciques voltage-dépendants ou leur gène sont souvent considérés comme des facteurs sérieux dans la croissance tumorale. La demande de brevet EP 2 062 591 décrit ainsi la possibilité d'utiliser le gène CACNA lE d'un canal calcique voltage-dépendant, codant pour la protéine am, en tant que marqueur pour le diagnostic de cancers, en ce qu'il serait surexprimé dans de nombreux cancers, comme le lymphome, le cancer du sein, du foie, du poumon, du colon, le cancer rectal, le cancer des ovaires, du pancréas, de la prostate, de la peau, de l'utérus. De la même façon, le gène CACNA1H, codant pour la sous-unité am, a été identifié 25 dans la demande de brevet US 2008/0160009 Al comme cible pour le traitement du cancer de la prostate et du sein. Le gène CACNA2D2 a, lui aussi, fait l'objet de plusieurs études. Ce gène code pour les deux sous-unités a2 et 152 30 Le gène CACNA2D2 a notamment été localisé sur le locus 3p21.3, identifié par de nombreuses recherches comme un locus de gènes suppresseurs de tumeurs (W00204511, US 2003/0044911). En effet, des mutations de la région 3p21 du chromosome 3 sont retrouvées dans les cancers du poumon, du rein, du sein, du pancréas et de l'utérus. Il a été montré que ce locus subit de nombreuses modifications génétiques. L'identification de mutations dans la 35 région 3p21 est ainsi la première anomalie génétique détectée actuellement dans les cancers du poumon, suggérant qu'un ou plusieurs gènes de cette région agiraient comme suppresseurs de tumeurs. Il a par ailleurs été découvert par ces chercheurs que l'expression de la sous-unité a28 est inhibée dans la majorité des cellules du cancer du poumon, indiquant ainsi que l'altération de l'homéostasie du calcium dans les cellules cancéreuses conduit à une tumeur maligne. La sous-unité a ainsi été considérée comme suppresseur de tumeur, induisant l'apoptose des cellules (7, 8) et l'origine du cancer, notamment le cancer du poumon et du sein. Les inventeurs ont à présent découvert, de manière très surprenante et après de nombreuses recherches, que la protéine a282 a un lien étroit avec la tumorigénèse et l'angiogénèse dans le cancer de la prostate. Cette action sur la croissance tumorale va à l'encontre des recherches démontrant que le gène CACNA2D2, codant pour cette protéine, est localisé dans la région 3p21.3 qui serait un cluster de gènes suppresseurs de tumeurs. Il a ainsi été découvert que la protéine a282 ou un fragment de celle-ci pouvait servir de biomarqueur au cancer de la prostate. DEFINITIONS Le terme «a282», tel qu'utilisé ici, se réfère à la protéine a282 de la famille des sous- unités a215 des canaux calciques voltages-dépendants et englobe tous les synonymes se référant à cette sous-unité. Le terme « fragment » tel qu'utilisé ici se réfère, sauf indication contraire, à un fragment de la protéine a282 et peut par exemple concerner la sous-partie a2 ou la sous-partie 82, de préférence la sous-partie a2. Le terme « CANA2D2 », tel qu'utilisé ici, se réfère au gène codant pour la sous-unité a282, et englobe tous les synonymes se référant à ce gène.

Le terme « cancer de la prostate », tel qu'utilisé ici, se réfère à une tumeur de la prostate, par exemple une tumeur maligne, chez un sujet donné, dans laquelle la tumeur est généralement d'origine épithéliale. Le terme « métastase » doit être entendu dans sa signification générale de l'état de la technique, et se réfère à l'étendue d'une tumeur de la prostate à un autre organe ou élément 35 non-adjacent.

On entend ainsi par « cancer de la prostate » aussi bien l'adénocarcinome (95% des tumeurs malignes de la prostate) que les variantes morphologiques plus rares, comme le précurseur du cancer de la prostate, connu comme la néoplasie intraépithéliale prostatique, ou encore les tumeurs neuroendocrines (par exemple, carcinome à petites cellules, tumeurs carcinoïdes, adénocarcinome avec différenciation neuroendocrine). On peut ainsi se référer à Chang et al. (9) pour les différentes formes de cancer. L' « agressivité » du cancer de la prostate, qui peut permettre de déterminer le stade d'avancement du cancer, peut être quantifiée selon la classification de Gleason fondée sur le degré de différenciation, c'est-à-dire l'écart existant entre un tissu tumoral et un tissu prostatique sain, et le nombre de mitoses. La classification de Gleason est notée selon une agressivité croissante du grade 1 au grade 5, plus le grade étant élevé, plus le cancer étant agressif et plus le pronostic étant pessimiste. Le grade, indiqué dans la demande avant la parenthèse, correspond au grade de Gleason de la coupe étudiée. L'addition des deux grades les plus fréquemment observés sur les différentes biopsies provenant d'un patient permet de déterminer le Score de Gleason pour chaque patient (entre 0 et 10) et est indiqué entre parenthèses (par exemple « 2+3 »). Pour éviter toute confusion, les phases de cycles cellulaires habituellement connues et définies par « GO », « G1 », « G2 » sont ici identifiées par « Go », « Gi », « G2 », sauf indication contraire. Les termes « anticorps anti-a282 » se rapportent à un anticorps ou un fragment de celui-ci qui reconnaît spécifiquement a282 ou un fragment de a282, par exemple un épitope de (12 ou 82. Les termes « valeur prédéterminée » se rapportent ici à la quantité de a2,52 ou d'un fragment de a282 dans les échantillons biologiques obtenus de la population en général ou d'une population sélectionnée de sujets.

Selon un exemple, la population sélectionnée peut être comprise de sujets apparemment sains, par exemple des sujets n'ayant jamais présenté auparavant de signes ou de symptômes indiquant la présence d'un cancer de la prostate. Selon un autre exemple, la valeur prédéterminée peut être la quantité de a282 ou d'un fragment chez des sujets ayant un cancer de la prostate dont le stade est établi.

La valeur prédéterminée peut être un seuil ou une fourchette.

La valeur prédéterminée peut être établie sur la base de mesures comparatives entre des sujets sains et des sujets ayant un cancer de la prostate établi. Les termes « sujet » ou « patient », tels qu'entendus ici, désignent un singe, un chimpanzé ou un humain. De préférence, il s'agit d'un humain. Les termes « normal » ou « sain » peuvent être utilisés ici pour désigner un sujet, patient, échantillon, tissu, organe ou autre ne présentant pas de cancer. Les termes « échantillon biologique » désignent tout échantillon biologique issu du 10 patient, par exemple mais de façon non limitative, des fluides biologiques. De manière préférentielle, il s'agit de fluides biologiques comme le sang, le sérum, le plasma, l'urine ou le sperme. De préférence encore, il s'agit d'un échantillon d'urine ou de sperme. Le terme « biomarqueur » désigne en général une molécule, i.e. un gène (ou un acide 15 nucléique codant pour ce gène), protéine, dont l'expression peut être déterminée dans un échantillon biologique d'un sujet par des méthodes connues de l'état de la technique (aussi bien que celles décrites ici) et qui permet de prédire ou déduire l'état du sujet duquel elle a été obtenue. 20 On entend ici par « siRNA » un petit ARN interférent bicaténaire non codant qui interfère avec la traduction de l'ARN messager en protéine et le détruit, inhibant ainsi l'expression génique au stade post-transcriptionnel. Ainsi, on entend par « si-a282» l'ARN interférant contre la séquence codant a282. 25 « LNCaP » désigne une lignée cellulaire humaine de cancer de la prostate provenant d'un ganglion sus-claviculaire d'un patient atteint d'un cancer de prostate androgénorésistant. Les lignées LNCaP surexprimant la protéine a282 par rapport aux lignées LNCaP normales sont désignées par « LNCaP-OE2152 ». La lignée cellulaire « PC3 », lignée cellulaire du cancer de la prostate, est obtenue à 30 partir d'une métastase osseuse d'un patient atteint de cancer androgénorésistant. La lignée cellulaire « DU145 » est obtenue à partir d'une métastase cérébrale chez un patient atteint d'un cancer de la prostate.

DESCRIPTION DE L'INVENTION La présente invention concerne une méthode de détection in vitro d'un cancer de la prostate et/ou d'une métastase prostatique chez un sujet comprenant les étapes consistant à : (i) mesurer la concentration de a2,52, ou un fragment de a2,52, dans un échantillon biologique obtenu dudit sujet, (ii) comparer la concentration de a2,52, ou un fragment de a2,52, mesurée à l'étape (i) à une valeur prédéterminée de la concentration en a282, ou un fragment de a282, dans laquelle une concentration de a2,52, ou d'un fragment de a2,52, dans l'échantillon biologique supérieure à ladite valeur prédéterminée indique la présence d'un cancer de la prostate chez ledit sujet, et une concentration de a2,52, ou d'un fragment de a282, inférieure à ladite valeur prédéterminée indique l'absence d'un cancer de la prostate chez ledit sujet.

De manière avantageuse, la valeur prédéterminée se rapporte à la quantité de a282 ou d'un fragment de a2,52 dans les échantillons biologiques obtenus de sujets apparemment sains, par exemple des sujets n'ayant jamais présenté auparavant de signes ou de symptômes indiquant la présence d'un cancer de la prostate.

Une méthode de détection in vitro d'un cancer de la prostate et/ou d'une métastase prostatique chez un sujet peut ainsi consister à effectuer les étapes consistant à : (i) mesurer la concentration de a2,52, ou d'un fragment, dans un échantillon biologique obtenu dudit sujet, (ii) comparer la concentration de a2,52, ou d'un fragment de a2,52, mesurée à l'étape (i) à une valeur prédéterminée dérivée de la concentration en a282, ou d'un fragment de a282, dans un échantillon biologique d'un sujet sain ne souffrant pas de cancer de la prostate, un niveau élevé de a2,52, ou d'un fragment de a2,52, dans l'échantillon biologique par rapport à ladite valeur prédéterminée indiquant que le sujet souffre d'un cancer de la prostate.

Les inventeurs ont montré que la protéine a282 est exprimée de façon plus forte dans les stades avancés du cancer (voir figure 5, G2 et G3) que dans les stades normaux et précoces du cancer (voir figure 5, stades normaux, BPH et métastase). La présente invention concerne donc également une méthode pour déterminer in vitro le stade d'un cancer de la prostate chez un sujet comprenant les étapes consistant à : (i) mesurer la concentration de a2152, ou un fragment de a2152, dans un échantillon biologique obtenu dudit sujet, (ii) comparer la concentration de a2152, ou un fragment de a2152, mesurée à l'étape (i) à une valeur prédéterminée de la concentration en a282, ou un fragment de a282, dans laquelle, lorsque la concentration de a282, ou d'un fragment de a282, dans l'échantillon biologique est supérieure à ladite valeur prédéterminée de la concentration en a2152, ou un fragment de a2152, l'écart entre ladite concentration de a2152, ou d'un fragment de a282, dans l'échantillon biologique obtenu dudit sujet et ladite valeur prédéterminée indique le stade du cancer de la prostate chez ledit sujet.

Selon un mode de réalisation, la valeur prédéterminée se rapporte ici à la quantité de a282 ou d'un fragment de a282 dans les échantillons biologiques obtenus de sujets apparemment sains, par exemple des sujets n'ayant jamais présenté auparavant de signes ou de symptômes indiquant la présence d'un cancer de la prostate.

Selon un autre mode de réalisation, la valeur prédéterminée est ici la quantité de a282 ou d'un fragment de a282 chez des sujets ayant un cancer de la prostate dont le stade est établi. La concentration de la protéine a2152, ou d'un fragment, dans un échantillon biologique obtenu du sujet, selon les méthodes de l'invention, permet ainsi de déterminer le niveau d'expression du gène CACNA2D2. L'échantillon biologique est avantageusement un fluide biologique, de préférence un échantillon de sang, un échantillon de sérum, un échantillon de plasma, un échantillon d'urine ou un échantillon de sperme, de préférence encore un échantillon d'urine ou de sperme. Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, il s'agit d'un échantillon d'urine éventuellement recueilli après massage de la prostate du sujet à tester. Une fois que l'échantillon biologique est préparé, la concentration en protéines est 30 mesurée au moyen de toute technique connue de l'homme du métier. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, une telle méthode comprend l'étape de mise en contact de l'échantillon avec une molécule de liaison capable de se lier spécifiquement avec la protéine a282 présente dans l'échantillon biologique. La molécule de 35 liaison peut être spécifique de la forme mature de la protéine a282. La molécule de liaison peut également reconnaître les deux parties a2 et 82 de la sous-unité a282. De manière également avantageuse, la molécule de liaison peut être capable de se lier spécifiquement avec un fragment de la protéine a282, par exemple avec la partie a2 ou avec la partie 82 de la sous-unité a282. La molécule de liaison peut être un anticorps polyclonal ou monoclonal, de préférence monoclonal. La molécule de liaison peut également être un aptamère. Des anticorps polyclonaux de l'invention, ou des fragments de ceux-ci, peuvent être déterminés au moyen de méthodes connues de l'homme du métier, en administrant par exemple un antigène ou un épitope approprié à un animal, par exemple un cochon, une vache, un cheval, un lapin, une chèvre, un mouton, une souris ou autre. Des adjuvants connus de l'état de la technique peuvent être utilisés pour améliorer la production d'anticorps. Des anticorps polyclonaux, permettant de reconnaître a2,52, et pouvant être utilisés dans la présente invention sont, par exemple mais de manière non limitative, H210 (Santa Cruz) ou A01 (Abnova). Bien que les anticorps polyclonaux soient pratiques à la réalisation de l'invention, les anticorps monoclonaux sont préférés. Des anticorps monoclonaux de l'invention, ou des fragments de ceux-ci, peuvent être préparés et isolés au moyen de méthodes connues de l'homme du métier.

Les molécules de liaison de l'invention, comme les anticorps ou aptamères, peuvent être marquées au moyen d'une molécule ou substance, par exemple une molécule fluorescente, une enzyme capable de produire un produit coloré, une molécule radioactive ou d'autres marqueurs connus de l'état de l'art.

Ainsi, selon un mode de réalisation particulier de l'invention, la concentration de la protéine a282, ou d'un fragment de a282, est mesurée en utilisant un anticorps ou un fragment de celui-ci, spécifique de ladite protéine a2152, ou d'un fragment de a282- La concentration en protéines peut être mesurée au moyen de techniques standards connues de l'homme du métier, généralement des techniques d'immunodiagnostic comprenant des immunoessais comme la compétition, la réaction directe ou les tests de type sandwich. De tels tests incluent, sans y être limité, les tests d'agglutination, les immunoessais médiés et marqués par enzyme comme les tests ELISA, les tests de type biotine/avidine, les immunoessais par radio, l'immunoélectrophorèse, l'immunoprécipitation.35 La mesure de la concentration en protéines peut aussi comprendre une étape de séparation des composés comme par HPLC (basé sur l'hydrophobie), par chromatographie avec exclusion par taille (basée sur la taille), et/ou par affinité de phase solide (basé sur l'affinité du composé pour la phase solide utilisée). Une fois séparée, la protéine a282 peut être identifiée au moyen de profils de séparation connus pour la protéine, par exemple le temps de rétention, et mesurée selon des techniques standards. Selon un autre mode de réalisation, il peut s'agir d'une identification et d'une mesure d'un fragment, par exemple a2 ou 82. De manière alternative, les composés séparés peuvent être détectés et mesurés par exemple par spectrométrie de masse. Selon un mode de réalisation de l'invention, une valeur témoin ou une normalisation 15 peut être utilisée. Par exemple, selon un mode de réalisation particulier de l'invention dans lequel l'échantillon biologique est un échantillon d'urine, la quantité de créatinine peut être utilisée pour normaliser le résultat obtenu. En effet, la créatinine étant un bon indicateur de la fonction rénale, elle est par exemple utilisée comme standard en matière de dosage de stupéfiant ou de produits dopants pour évaluer si l'échantillon d'urine est dilué, ou encore 20 comme standard pour les intoxications aux métaux lourds. Sa valeur peut donc être utilisée dans les méthodes de détection de la présente invention. Une fois les urines récoltées (par exemple sur une durée de 24h) et précipitées, la concentration en protéine a2,52, ou un fragment, est mesurée. La valeur de l'augmentation du ratio de a282/créatinine (ou d'un fragment de a282/créatinine) par rapport au ratio de a282/créatinine (ou d'un fragment de 25 a282/créatinine) d'un sujet sain indique la présence d'un cancer de la prostate. Une augmentation de 50% peut par exemple indiquer que le sujet souffre d'un cancer de la prostate. Les méthodes de détection selon l'invention peuvent également être utilisées en 30 complément d'une autre méthode de détection connue de l'homme du métier, par exemple, mais de façon non limitative, l'analyse du dosage de PSA. La présente invention se rapporte également à un agent anticancéreux pour son utilisation dans le traitement du cancer de la prostate chez un sujet, caractérisé en ce qu'on 35 détecte ledit cancer de la prostate au moyen d'une méthode comme précédemment décrite. 10 Une méthode de traitement du cancer de la prostate chez un sujet peut ainsi comprendre les étapes consistant à : détecter la présence d'un cancer dudit sujet au moyen d'une méthode de détection selon la présente invention, administrer audit sujet un traitement apte à traiter le cancer de la prostate. « Traiter le cancer de la prostate » peut être entendu comme tout traitement capable, par exemple, de supprimer la tumeur ou les métastases, réduire le risque de récidive, ralentir le développement de la tumeur ou des métastases, et/ou traiter les symptômes de la maladie. Tout agent anticancéreux connu de l'homme du métier peut ainsi être utilisé. Le traitement peut, par exemple mais sans s'y limiter, consister en un traitement hormonal, par exemple des agonistes de l'hormone de libération des gonadotrophines (LHRH) (comme leuprolide, goserelin ou buserelin), un traitement par antiandrogènes (comme flutamide, ou nilutamide), un traitement par des médicaments empêchant les glandes surrénales de produire des androgènes (comme ketoconazole ou aminoglutethimide), ou encore par des oestrogènes. La présente invention concerne également une méthode pour surveiller un traitement d'un sujet atteint d'un cancer de la prostate et/ou d'une métastase prostatique comprenant la détermination de la concentration de a282, ou d'un fragment, dans un échantillon biologique obtenu dudit sujet, et éventuellement la comparaison de ladite concentration de a2152, ou d'un fragment, à une valeur prédéterminée représentant un stade prédéterminé du cancer de la prostate, la concentration de a2,52, ou d'un fragment, par rapport à ladite valeur prédéterminée indiquant l'évolution du cancer de la prostate, et ainsi l'efficacité du traitement. La présente invention concerne enfin l'utilisation de la protéine a2,52, ou d'un fragment, comme biomarqueur du cancer de la prostate d'un sujet. De préférence, ledit fragment est a2.

FIGURES Figure 1 : A : Analyse de l'expression de a2151, a282 et a283 dans les lignées cellulaires LNCaP et DU145 par criblage par RT-PCR. La Pactine et un échantillon contrôle positif (« cerveau ») sont utilisés comme témoin.

B : Analyse de l'expression de a282 dans les lignées cellulaires LNCaP, PC3 et DU145 par criblage par RT-PCR. La Pactine est utilisée comme témoin. Figure 2 : Analyse de l'expression de a282 dans 10 tissus cancéreux (numérotés de C1 à C10) et 10 tissus non-cancéreux (numérotés de N1 à N10) de la prostate par RT-PCR. La pactine est utilisée comme témoin. Figure 3 : Analyse par western-blot montrant que si-a282 (50 nM, 4 jours) inhibe bien l'expression de a282 dans les cellules LNCaP. La calnexine est utilisée comme témoin.

Figure 4 : Analyse de l'expression de a282 dans les tissus cancéreux (« non cancer », n=18) et non cancéreux (« cancer », n=20) de prostate humaine par criblage. Figure 5 : Analyse de l'expression de a282 à différentes stades du cancer de la prostate 15 par analyse immunohistochimique. A et B : aperçu de tissus de la prostate provenant de tissus normaux, hyperplasiques et cancéreux (A : objectif *5, B : objectif *40). Les grades indiqués avant la parenthèse correspondent aux grades de Gleason le plus fréquent de la coupe montrée. Entre-parenthèses sont indiqués les scores de Gleason du patient correspondant. M : métastase rectale, BPH : 20 hyperplasie, N : tissu prostatique normal. La coloration immunohistochimique contre a282 a été révélée par réaction DAB-peroxydase. C : a) aperçu de tissus de la prostate provenant de tissus normaux (« normal »), de métastase (« métastase »), tissu hyperplasique (« BHP ») ou tissus cancéreux (« cancer »). Les images colorées ont été déconvolutionnées et l'intensité de coloration de la cellule a été 25 analysée et convertie en densité optique. La densité optique est augmentée dans les acini entourant les cellules des tissus cancéreux ; b) histogramme montrant la densité optique moyenne (ODDAB) pour différents stades de cancer. Le nombre de cellules analysées est représenté sur chaque barre. 30 Figure 6 : Analyse de l'effet de la protéine a282 sur la prolifération cellulaire. A : a) Effet d'un traitement de 4 jours utilisant si-a282 (50 nM) sur la croissance cellulaire (méthode MTS) par rapport à un témoin, si-ctl, qui, à la même concentration, n'a aucune influence sur la prolifération cellulaire ; b) Effet d'un traitement de 4 jours utilisant si-a282 (50 nM) sur le nombre de 35 cellules (comptage manuel des cellules extrudées par Tryptan Blue) ; B : Effet de si-1/282 sur la prolifération cellulaire de deux autres lignées cellulaires du cancer de la prostate (PC3 et DU145). C : Expériences cinétiques sur l'inhibition en fonction du temps par si-a282 de la croissance cellulaire de LNCaP par rapport à un témoin (si-ctl).

D : Analyse FACS de l'effet de si-1/282 sur le nombre de cellules LNCaP en phase Go/Gi (représenté « GO/G1 sur la figure), G2/M et S par rapport à un témoin, si-ctl. B : Effet de la gabapentine (100 1..1M) sur la prolifération cellulaire par méthode MTS. F : a) Cinétique de la prolifération cellulaire chez deux clones différents de LNCaP-1/2152 (C9 et C11). b) Analyse FACS de l'effet de LNCaP-1/2152 (clone C11) sur le nombre de cellules en phase Go/G1, G2/M et S par rapport à une lignée cellulaire LNCaP ne surexprimant Pas 1/2152 Figure 7 : Analyse in vivo de la croissance cellulaire induite par la protéine 1/282. A : Poids en gramme des tumeurs LNCaP (témoin) et LNCap-1/282 (clone C11) au sacrifice ; B : Cinétique de croissance des tumeurs LNCaP (témoin) et LNCap-1/2152 (clone C11) ; C : Temps moyen de multiplication par 2 des tumeurs LNCaP (témoin) et LNCap-1/282 (clone C11). Figure 8 : Analyse histologique des tumeurs LNCaP et LNCaP-1/2152 A : Différentes vues à grossissement *20 de : a : la tumeur LNCaP témoin ; c : la tumeur LNCaP-1/282. Les images b (LNCaP témoin) et d (tumeur LNCaP-1/282) montrent au moyen des flèches les foyers de nécroses et d'inflammation. B : Quantification du pourcentage des noyaux positifs à l'analyse par immunofluorescence par PCNA (noyaux des cellules en division), normalisé par rapport au nombre total de noyaux (DAPI).

Figure 9 : Analyse de l'effet de 1/282 sur la formation de vaisseaux sanguins dans les tumeurs LNCaP xénogreffées A : Coloration immunohistochimique (peroxydase/DAB) de CD31 (a : tumeur LNCaP, b : tumeur LNCaP-1/282) ; B : Pourcentage de tissus positifs au CD31 dans les tumeurs LNCaP et LNCaP-1/282.35 Figure 10 : Analyse de l'effet de a282 sur l'angiogénèse par la sécrétion de VEGF. A : a. Western blots de CD31 et VEGF dans 8 tumeurs différentes provenant de 4 souris différentes (M1 à M4) (Tumeurs LNCaP : « T-LNCaP », Tumeurs LNCaP-a282: «T-a2152 »). La Pactine est utilisée comme témoin. b. Densité relative des bandes CD31 observées par Western blot (fig 10A.a.) normalisées par rapport à Pactine (10 échantillons pour chaque tumeur). c. Densité relative des bandes VEGF observées par Western blot (fig 10A.a.) normalisées par rapport à Pactine (10 échantillons pour chaque tumeur). B : Sécrétion de VEGF mesurée au moyen du test ELISA dans les cellules LNCaP et LNCaP-a2152 (clones C9 et C11). Figure 11 : Analyse de la sécrétion de a2 dans les cellules LNCaP-OE2152 A : Western blot de a2 dans le milieu de culture des cellules LNCaP, de deux clones surexprimant a282 (clone C11 et C16) et dans le milieu de culture seul (« RPMI »), sans DTT (6 jours d'incubation) ou avec DTT, i.e. en conditions réductrices (15 min d'incubation). B : Western blot pour deux autres milieux de culture contenant soit 2% de SVF (sérum de veau foetal), soit 10% de SVF (conditions courantes de culture). EXEMPLES Matériels et méthodes Cultures cellulaires Les lignées cellulaires LNCaP, DU145 et P3 proviennent de la « American Type Culture Collection » et ont été cultivées, selon les recommandations du fournisseur, dans du RPMI 1640 (GIBCO, Life Technologies, France) additionné de 10% de sérum foetal bovin (FBS, Sigma, L'Isle d'Abeau, France) et de 2 mM de L-glutamine (Sigma, L'Isle d'Abeau, France). Les cellules ont été systématiquement cultivées dans des récipients de 75 cm2 (Nunc, Poly-Labo, France) en atmosphère humidifiée à 37°C (95% d'air - 5% de CO2). Le milieu de culture a ensuite été changé tous les trois jours. Des lignées cellulaires LNCaP stables exprimant la protéine a282 (ci-après désignées sous le terme « LNCaP-a2152 ») ont été conçues comme précédemment reporté dans la publication de Florian Gackière et al (10).

Production de si-RNAs et préparation cellulaire Les petits ARN interférents proviennent de Eurogentech (France). Les si-a282 ont été validés dans les cellules LNCaP. Pour cela, il a été montré par western-blot que si-a282 diminue l'expression de la protéine a282 dans les cellules LNCaP (figure 3).

Les siRNAs utilisés ici comprennent un siRNA témoin non-spécifique contre la luciférase (ci-après désigné sous le terme « si-ctl » ou « siCTL »). Les siRNAs sont présentées dans le tableau 1. siRNA Position siCTL Luciferase 153-171 si-112152 1868-1850 Tableau 1 Les cellules ont été transfectées avec 20 ou 50 nM de siRNA en utilisant HiPerFect Transfection Reagent (Qiagen) comme précédemment reporté dans la publication de Florian Gackière et al (10).

Analyse de l'expression du gène de la sous-unité a2152 par RT-PCR ou RT-PCR quantitative L'extraction de l' ARN a été effectuée avec du Trizol® au moyen d'une méthode décrite à l'origine par Chomczynski et Sacchi (11). La méthode de RT-PCR est équivalente à celle décrite dans la publication de Florian Gackière et al (10).

Pour chaque réaction de PCR, 1 1.1.g d'ARNm total a été traité avec du DNAse II, incubé à 70°C et a subi une transcription inverse avec la polymérase MULV RNA (Applied Biosystems, 50U/µL) en présence de 0,5 1.1.M de dNTP et d'un inhibiteur de la ribonucléase (Applied B io s y stems). L'ADNc obtenu a été utilisé pour l'amplification par PCR au moyen d'un kit Taq Gold (Applied Biosystems). Les conditions opératoires de la PCR sont présentées dans le tableau 2. 1 cycle 34 à 40 cycles 1 cycle 95 °C 95°C 58°C 72°C 72°C 5 min 30 sec 30 sec 1 min/1000pb 7 min Tableau 2 Les amorces sens et antisens (Invitrogen) utilisées pendant l'amplification sont présentées dans le tableau 3.

Protéine Gène Taille (bp) 1/281 CACNA2D1 400 1/2152 CACNA2D2 505 500 112153 CACNA2D3 439 Pactine 220 Tableau 3 Les produits de la PCR ont été analysés sur un gel d'agarose (1,5% ou 2%) comprenant du bromure d'éthidium (0,5 µg/ml) puis visualisés sous UV. Les images ont ensuite été capturées au moyen d'un logiciel Gelcapture (Bio-imaging System). Western blotting Après un lavage dans une solution saline tamponnée au phosphate, les cellules ont été collectées par grattage dans du tampon de lyse (Triton X-100 1%, Na déoxycholate, 1%, NaC1 150 mM, PO4NaK 10 mM, pH 7,2) avec un mélange d'anti-protéases, puis ont été incubées dans de la glace pendant 45 min. Les lysats ont été centrifugés à 12000G pendant 10 min à 4°C. La concentration en protéines du supernageant a été déterminée par test BCA (Pierce Chemical Compagny). Les analyses par Western-blot de l'expression des protéines a été effectuée comme décrit dans la publication de Florian Gackière et al (10).

Les anticorps, utilisés pour le western blotting ainsi que pour les identifications immunohistochimiques et par immunofluorescence, sont présentés dans le tableau 4. Anticorps Nom Entreprise Dilution Dilution Anticorps MW dans WB dans IF/IH secondaire (kDa) 112152 H210 Santa Cruz 1/200e 1/100e ou Rabbit 130 1/50e 1/2152 A01 Abnova / 1/50e Mouse 130 PCNA Sc-56 Santa Cruz 1/200e / Mouse 36 f3-actin A-5441 Sigma 1/4000e / Mouse 43 Calnexine mab 3126 Millipore 1/2000e / Mouse 95 Ki-67 Sc-101861 Santa Cruz / 1/100e Rabbit CD31 Ab28364 Abcam 1/200e 1/50e Rabbit 130 VEGF Ab46154 Abcam 1/200e 1/50e Rabbit 43 Tableau 4 Prolifération cellulaire et tests de viabilité La viabilité des cellules a été testée par méthode colorimétrique (CellTiter 96 Aqueous 5 Non-Radioactive Cell Proliferation Assay, Promega, USA) selon les recommandations du fournisseur. La prolifération cellulaire a également été testée par comptage manuel des cellules extrudées par Tryptan Blue. La coloration des anticorps Ki-67 ou PCNA (« Proliferating Cell Nuclear Antigen ») a 10 également été utilisée pour discriminer les cellules en quiescence (phase Go) et les cellules cycliques. Analyse du cycle cellulaire Les cellules ont été cultivées dans trois puits de 60mm par état, et les traitements ou 15 siRNA ont été appliqués comme précédemment décrit. Après traitement, les cellules ont été trypsinisées, récoltées et remises en suspension dans 0,2 ml de PBS stérile. 1 ml d'éthanol froid 70% a été ajouté sur les cellules en suspension pendant l'étape dans le vortex. Les échantillons ont été centrifugés, lavés dans du PBS stérile puis incubés avec de la ribonucléase (2 µg/ml) pendant 15 min à température ambiante. Du iodure de propidium (25 20 µg/ml final dans du PBS-triton X-100 0,1%) a été ajouté et mis à incuber pour 30 min supplémentaires à température ambiante. Le contenu en ADN a été mesuré par excitation d'iodure de propidium à 488 nm et mesure de l'émission à 520 nm au moyen d'un cytomètre en flux (Beckman coulter Epics XL4-MCL avec acquisition Expo32). L'interprétation des données a été effectuée avec Multicycle pour Windows (Phoenix Flow system). 25 Immunocoloration et analyse confocale L'analyse de l'expression de protéine dans les cellules et les tissus du cancer de la prostate (PCA) a été effectuée au moyen d'analyse d'immunofluorescence indirecte sur des cellules fixées à l'acétone et des tissus fixés dans du formol et enrobés de paraffine. Des puces à ADN (« microarrays ») de tissus et des tissus tumoraux de souris ont été 5 étudiées au moyen de méthodes immunohistochimiques. Les lames de puces à ADN de tissus multi-tumoraux proviennent de Biomax (USA). 30 tumeurs ont été analysées, ainsi que les tissus normaux correspondants. Le fournisseur (Biomax) fournit les informations cliniques (âge des patients, grades des cancers et grades de Gleason des coupes) correspondant aux différents tissus. Toutes les tumeurs ont été fixées 10 dans du formol et enrobées de paraffine. L'activité peroxydase endogène a été inhibée au moyen d'un traitement avec 0,3% de H202. Les lames de tissus ont été passées au micro-onde pendant 20 min, et lavées trois fois dans 10 mM de tampon au citrate (pH 6,0). Afin d'inhiber les liaisons non-spécifiques des anticorps et de perméabiliser les cellules, les lames ont été incubées avec du PBS contenant 0,2% de BSA, 0,1% de Triton X-100 et 5% de sérum d'âne 15 pendant 30 min à température d'ambiante. Ils ont ensuite été incubés toute la nuit à 4°C avec PBS/5 % de sérum non-immunisé contenant les anticorps pertinents. Les dilutions sont présentées dans le tableau 4. Les cellules ont ensuite été lavées avec du PBS. Pour les analyses d'immunofluorescence, les cellules ont été incubées avec le IgG secondaire Alexa fluor labellisé-488 anti-lapin (A-21206 ; Tests moléculaires ; dilution 20 1 :2000) dilué dans du PBS pendant lh à température ambiante. Après trois rinçages dans du PBS, les lames ont été montées avec du Mowiol®. La technique de détection DAB-peroxydase de raifort a été utilisée dans les analyses immunohistochimiques. De l'azure B a été utilisé pour contre-colorer les lames de tissus. Les observations confocales et d'immunocoloration ont été réalisées comme 25 précédemment décrit au moyen d'un microscope confocal Zeiss LSM 510 (Carl Zeiss, Le Pecq, France) relié à un microscope inversé pour diascopie et épifluorescence Zeiss Axiovert 200 M avec une lentille d'objectif à immersion en huile x63 (ouverture numérique 1.4). L'anticorps anti-Ki67 a été utilisé pour évaluer le pourcentage de cellules proliférantes. Au moins 500 cellules par lame et trois lames par état ont été comptées. 30 L'anticorps anti-PCNA a été utilisé pour évaluer le pourcentage de cellules en phase S dans les échantillons de tumeurs. Une immunofluorescence de l'anti-CD31 a été utilisée pour évaluer le nombre de vaisseaux sanguins dans les tumeurs xénogreffées. Les anticorps polyclonaux anti-a282 ont été utilisés pour étudier l'expression de a282 dans les tissus et les cellules de la prostate. 35 Analyse de la sécrétion de VEGF La sécrétion de VEGF a été mesurée in vitro au moyen d'une technique ELISA comme décrit par le fournisseur (Abcam). Après mise en culture, les cellules ont été cultivées dans plaques à 12 puits pendant 3 jours avant changement du milieu de culture. VEGF a ensuite été analysé dans le milieu de culture après 24 heures d'incubation (3 puits par état, et l'expérience a été répétée au moins trois fois). Analyse de la sécrétion de a2S2 Afin de déterminer si a282 est sécrétée dans le milieu de culture, les cellules ont été incubées pendant 6 jours sans changement du milieu de culture. A la fin de cette période, le milieu de culture a été retiré et centrifugé (milieu de culture cellulaire). Les cellules ont ensuite été incubées pendant 15 min avec 10 mM de DTT afin de cliver les ponts disulfure et le milieu a encore une fois été retiré et centrifugé. Les protéines des deux supernageants (avec et sans DTT) ont été précipitées avec de l'acétone. Le concentré a été remis en suspension dans RIPA. Le contenu en protéines a été mesuré et a282 a été analysée après une électrophorèse SDS-page (6 ou 8% d'acrylamide) et un western-blot. L'expression de a282 dans le milieu de culture cellulaire a été comparé au milieu de culture seul (sans cellules).

Essais in vivo Des souris Swiss nude mâles âgées de 6 semaines (Laboratoires Charles River, France) ont reçues une injection sur chaque flanc de cellules LNCaP ou de cellules LNCaP surexprimant a282. Six millions de cellules ont été injectées sur les deux flancs de chaque souris. Les cellules ont été préparées dans un mélange composé de 50% de PBS et de 50% de BD-Matrigel®. Les tumeurs ont été mesurées deux fois par semaine et les animaux ont été sacrifiés quand la taille de la tumeur a atteint 10% du poids de l'animal. Le jour du sacrifice, les tumeurs ont été pesées et divisées pour des analyses immunohistochimiques, par western blot et par PCR-RT supplémentaires. Au moins 10 animaux par état ont été utilisés.

Analyses statistiques Des graphiques ont été reproduits au moyen de Origin 7.0 (Microcal Software, Inc., Northampton, MA). Les résultats ont été exprimés en moyenne ± écart-type moyen. Des analyses statistiques ont été effectuées au moyen de tests t non appariés (pour comparer deux groupes) ou des tests ANOVA suivis de Dunnett (pour contrôle multiple vs tests de comparaisons) ou de post-tests de Student-Newman-Keuls (pour les comparaisons multiples) ou de tests du Chi2 (pour comparer des proportions). Les différences ont été considérées comme significatives avec p<0,05 : *, p<0,01 : **, p<0,001 : ***. Résultats Expression de a2152 dans les tissus et les lignées cellulaires du cancer de la prostate Il a été démontré dans des études précédentes que les canaux calciques voltage-dépendants Cav3.2 sont exprimés dans les lignées cellulaires du cancer de la prostate et dans les tumeurs de la prostate humaine (5). Il a ici été recherché si les sous-unités régulatrices supposées peuvent aussi être exprimées dans ces cellules. L'attention a été portée sur les sous- unités a215 étant donné que deux d'entre elles (a282 et a283) sont suspectées d'agir comme suppresseurs de tumeurs dans différents organes. Comme montré à la figure 1, il a été mis en évidence par RT-PCR que les lignées cellulaires du cancer de la prostate étudiées (cellules LNCaP, DU145, PC3) expriment un produit de la transcription de a282. Les autres sous-unités a215 recherchées (a2151 et a283) ne sont pas exprimées dans les lignées cellulaires de la prostate étudiées. De la même façon, et comme montré à la figure 2, les analyses par RT-PCR ont démontré que a282 est présente dans les tissus normaux et cancéreux de la prostate. Des tests d'immunodétection ont également été effectués pour mettre en évidence l'expression des protéines a282 dans les lignées cellulaires du cancer de la prostate et dans les coupes de tissus de la prostate. Les analyses par immunofluorescence ont montré que les lignées cellulaires du cancer de la prostate LNCaP, DU145 et PC3 sont fortement colorées par les anticorps anti-a282. Il est en outre observé que la coloration a282 est évidente sur la cellule mais elle est particulièrement prononcée sur la périphérie, c'est-à-dire près de la membrane plasmique, lieu d'ancrage des protéines a282 (non représenté).

De plus, par western blot, il a été observé, au moyen d'anticorps anti-a282, l'expression de deux bandes autour de 160 kD (cf. figure 3). L'expression de ces bandes est fortement réduite lorsque les cellules LNCaP sont mises en présence de si-a282. Ces bandes de 160 kD observées par western blot correspondent à la taille attendue de a282, ce qui démontre que les anticorps utilisés ici détectent bien la protéine a2b2-35 Des colorations par immunofluorescence (IF) et immunohistochimiques (IH) de coupes du cancer de la prostate obtenus des sujets ont été effectuées sur des coupes de tissus de la prostate congelées (IF) ou des coupes en paraffine (réaction peroxydase IH). Il a été montré qu'il y a une forte coloration des structures glandulaires épithéliales. Les acini sont fréquemment colorés avec les anticorps anti-a282 (non représenté). De plus, les membranes apicales de l'épithélium sont plus fortement colorées que des membranes basolatérales (non représenté). L'immunocoloration des cellules épithéliales du cancer de la prostate dans le milieu de culture primaire a donc mis en évidence une forte coloration de a282 sur la périphérie des 10 cellules. L'expression de a2S2 augmente avec le développement du cancer de la prostate Afin d'évaluer les éventuelles différences d'expression de a282 entre les tissus normaux et les tissus tumoraux, une comparaison de l'expression de a282 au moyen de la 15 technique RT-PCR a été effectuée dans 18 tissus du cancer de la prostate et dans 20 tissus non-cancéreux de la prostate. Comme montré aux figures 2 et 4, a282 est plus fréquemment exprimée dans les tissus cancéreux (95% des tissus cancéreux expriment a282) que dans les tissus non-cancéreux (40% des tissus non-cancéreux expriment a282) (différence significative, p<0,001, test du Chi2). 20 De la même façon, l'expression de a282 a été comparée sur des macroarrays de 24 tissus différents dont 16 tissus cancéreux et 8 tissus non cancéreux. Comme montré à la figure 5, les cellules épithéliales recouvrant les acini sont colorées par les anticorps anti-a282 dans les échantillons normaux, hyperplasiques et cancéreux. Dans les stades avancés de cancer, un 25 certain nombre de cellules colorées quittent les acini (cf. figure 5B, G3, Métastase). Plusieurs grades de différenciation ont été analysés. La surface colorée ainsi que l'intensité de coloration augmentent dans les stades avancés du cancer de la prostate en comparaison à la prostate normale ou hyperplasique. 30 Comme montré à la figure 5, la localisation dans la cellule est différente entre les stades normaux, BPH et précoces (G1) du cancer et les stades avancés du cancer (G2, G3). Dans les stades BPH et précoces du cancer (G1), la coloration est majoritairement apicale et intracellulaire, alors que dans les stades avancés du cancer (G2 et G3), la coloration augmente 35 dans tous les compartiments de la cellule, et plus particulièrement dans le noyau des cellules.

La densité de coloration a également été analysée au moyen de la déconvolution de couleur pour extraire la coloration DAB de contre-coloration (Bleu azure) et il a été montré que la densité DAB est plus importante dans les stades avancés du cancer, mettant ainsi en évidence que l'expression de 112152 est augmentée dans les cancers avancés de la prostate (figure 5C).

L'inhibition de a2152 réduit la prolifération cellulaire alors que sa surexpression induit la prolifération cellulaire Etant donné que 11282 est exprimée dans les cellules épithéliales du cancer de la prostate, il a été recherché si la protéine peut participer à la croissance cellulaire.

Différentes approches ont été utilisées pour évaluer la prolifération cellulaire. L'utilisation de ligands ou de si-a252 réduit la tumorigénèse Premièrement, il a été démontré par une méthode MTS que la prolifération cellulaire est réduite de 20% au bout de 4 jours d'incubation dans 50 nM de si-11282 en comparaison avec si-ctl (cf. figure 6A a). De la même façon, la prolifération cellulaire est diminuée en présence de si-11282 dans les lignées DU145 et PC3 (cf. figure 6B). Des résultats similaires ont été obtenus avec un comptage manuel de cellules, ce qui montre qu'une incubation de 4 jours dans si-11282 diminue de 30% le nombre de cellules 20 LNCaP (cf. figure 6A b). Des expériences cinétiques (figure 6C) illustrent le fait que si-11282 est un inhibiteur significatif de la prolifération cellulaire après seulement trois jours d'incubation et qu'un effet maximal est atteint après 5 jours à 6 jours (40% de réduction de la prolifération cellulaire). 25 Des analyses FACS du cycle cellulaire montrent que cette action inhibitrice de si-11282 sur la prolifération cellulaire est corrélée à une augmentation du nombre de cellules en phase G1, ainsi qu'à une diminution du nombre de cellules en phase G2/M et en phase S (figure 6D). La gabapentine a été testée sur la prolifération cellulaire, celle-ci étant connue pour 30 inhiber différents canaux calciques voltage-dépendants par son action sur la sous-unité régulatrice an En effet, la gabapentine a été démontrée comme étant un ligand des deux sous-unités 112151 et 112152 (12). Dans les présents essais, la gabapentine, qui a été ajoutée au milieu de culture cellulaire à 100 1..1M, réduit de 35% la prolifération cellulaire d'incubation (figure 6E). L'inhibition induite par la gabapentine diminue ensuite légèrement jusqu'à 20% après 4 jours, ce qui peut être dû soit à une désensibilisation de la gabapentine, soit à une dégradation de la gabapentine. Les lignées LNCaP-a252 induisent la prolifération cellulaire Des clones de LNCaP surexprimant de manière stable a282 ont été utilisés de manière similaire dans les essais de prolifération cellulaire. Il a été montré que deux clones différents surexprimant a282 (clone 9 « C9 », et clone 11 « C 11 ») produisent des taux de prolifération plus rapides que les cellules témoins LNCaP, avec un temps de multiplication par 2 de 47,5h pour LNCaP contre 40,5h pour le clone 9 et 36h pour le clone 11 (cf. figure 6F a).

Des essais d'immunofluorescence colorant Ki-67 sur des lignées cellulaires LNCaP et LNCaP surexprimant a282 (clone 11) ont été effectués (cf. figure 6F b). Ki-67 est un marqueur de cellules proliférantes. Il est seulement exprimé pendant les phases G1, S, G2 et M. Les cellules en phase Go n'expriment pas Ki-67 de façon significative. Il peut y avoir soit une présence ponctuelle dans le noyau pendant les phases G1 et S, soit une localisation plus homogène dans le noyau pendant les phases G2 et M. Il a ici été démontré que a282 est associée à une diminution du nombre de cellules pendant la phase Go du cycle cellulaire. Dans ces essais, les cellules non proliférantes représentent 35,6 ± 1,6% de la population cellulaire LNCaP totale, alors qu'elles ne représentent que 21,6% ± 3,5% de la population cellulaire LNCaP-a2152 totale. Ce résultat est corrélé avec une augmentation du nombre de cellules pendant les phases Gi/S et G2/M du cycle cellulaire des cellules LNCaP-OE282. Au vu de tous ces résultats, il est donc démontré que a282 augmente la prolifération des cellules LNCaP.

La surexpression de a252 induit le développement tumoral in vivo Des essais in vivo ont été effectués sur des souris nude immunodéficientes. Les souris ont subi une injection sur chaque flanc de cellules LNCaP ou de cellules LNCaP surexprimant a282 (figure 4). Les tumeurs obtenues sont respectivement nommées ci-après « tumeur de LNCaP » et « tumeur de LNCaP-a282». La taille des tumeurs, qui a été mesurée deux fois par semaine, a commencé à augmenter habituellement après 4-6 semaines. Une fois que la tumeur était détectable, elles ont grandi avec un temps de multiplication par 2 de 12,2 ± 1,9 jours (cf. figure 7a) pour les tumeurs des LNCaP, pour atteindre une taille moyenne de 940 ± 146 mm3 (1,26 ± 0,22 g) (cf. figures 7b et c). Les tumeurs des LNCaP-a2152 ont grandi avec un temps de multiplication par 2 de 6,6 ± 0,8 jours (cf. figure 7a), pour atteindre une taille moyenne de 1760 ± 154 mm3 (2,3 ± 0,21 g) (cf. figures 7b et c). Pour les deux types de tumeurs, la taille maximale de la tumeur a été atteinte habituellement 4 semaines après le début de croissance de la tumeur pour chaque souris.

Par conséquent, il est mis en évidence in vivo que les tumeurs de LNCaP-OE2152 augmentent plus vite et sont plus grosses que les tumeurs de LNCaP. La surexpression de a2S2 induit la formation de vaisseaux sanguins et la sécrétion de VEGF.

Les deux tumeurs de LNCaP et LNCaP-a2152 obtenues lors des essais in vivo décrits précédemment sont fortement irriguées et sont caractérisées par d'abondants vaisseaux sanguins mais aussi par des signes d'hémorragies avec des fuites de globules rouges dans les tissus voisins et de nombreux foyers d'inflammations et de nécroses (cf. figure 8A).

Aucune différence significative de surface nécrotique n'a été détectée entre les tumeurs de LNCaP et les tumeurs de LNCaP-a282. Pourtant, les études d'immunofluorescence par PCNA, permettant l'identification des cellules en phase S du cycle cellulaire, montrent au contraire qu'in vivo, il y a plus de cellules proliférantes dans les tumeurs de LNCaP-a2152 que dans les tumeurs de LNCaP (figure 8B). De plus, les lames histologiques montrent qu'il y a plus de vaisseaux sanguins dans les tumeurs de LNCaP-a2152 que dans les tumeurs de LNCaP (figures 8 A et B). Les vaisseaux sanguins ont donc été colorés avec du CD31 (figure 9A) qui est un marqueur couramment utilisé pour colorer les cellules endothéliales et pour détecter l'angiogénèse dans les tumeurs. Il a été montré que la surface colorée dans les tumeurs de LNCaP-a2152 est deux fois plus importante en comparaison avec celle des tumeurs de LNCaP (figure 9B). Ceci a été confirmé par des analyses par western blot qui ont montré une augmentation de 50% dans l'expression de CD31 (figure 10A). Puisque a282 est associée à la formation de vaisseaux sanguins, l'expression et la sécrétion de VEGF dans les tumeurs et les cellules de la prostate ont été mesurées. Comme montré à la figure 10A, les analyses par western blot montrent que l'expression de VEGF est légèrement, mais significativement, augmentée dans les tumeurs surexprimant a282. Des analyses ELISA de VEGF ont donc été effectuées pour déterminer si la sécrétion in vitro est altérée dans les cellules LNCaP surexprimant a282. Comme montré à la figure 10B, les tests ELISA montrent que la surexpression de a282 augmente significativement la sécrétion de VEGF chez deux différents clones de LNCaP-a282. Ceci n'est pas dû à une stimulation générale non-spécifique de la sécrétion par les cellules LNCaP puisque la sécrétion de la phosphatase d'acide prostatique (PAP) n'est pas affectée par la surexpression de a282, bien que la PAP soit stimulée par une augmentation en calcium intracellulaire. a2S2 peut être clivée dans les cellules LNCaP surexprimant a2S2. En conditions non-réductrices, a282 correspond à une bande simple de 175 kDa alors qu'en conditions réductrices, deux bandes de 150 et 22 kDa sont observées par western blots (13). 11 a ainsi été montré que a2 et 82, dérivés du même gêne CACNA2D2, sont liés par des ponts disulfure. a2 est une sous-unité large extracellulaire (150kDa ou plus, dépendant de la glycosylation) reliée à 82, une plus petite protéine transmembranaire (environ 20kDa). Afin d'évaluer si a282 peut être utilisée comme marqueur tumoral, il a été recherché si ces ponts disulfure peuvent être clivées dans les cellules LNCaP pour permettre à la protéine d'être libérée dans le milieu de culture. Pour cela, la présence de a282, soit a2 en cas de clivage, a été recherchée dans le milieu de culture par western blot. La figure 11 montre que a2 est bien présente dans le milieu de culture dans lequel les cellules LNCaP-a282 ont été incubées pendant 6 jours, tandis que cette sous-unité est à peine détectable dans le milieu de culture des cellules témoins LNCaP.

Discussion La protéine a282 avait été détectée comme régulant l'activité des canaux calciques voltage-dépendants. Bien que de nombreuses recherches aient montré que le gène CACNA2D2, codant pour cette protéine, est localisé dans le locus 3p21, connu comme étant un cluster de gènes suppresseurs de tumeurs, il a ici été démontré que a282 est capable d'influer elle-même sur la prolifération cellulaire in vitro et sur la tumorigénèse in vivo. Cette protéine a282, ou un fragment de celle-ci, représente un nouveau biomarqueur du cancer, et notamment du cancer de la prostate. Ceci est basé sur les observations suivantes : (1) La sous-unité de canaux calciques a282, codée par le gène CACNA2D2, est exprimée dans les cellules de la prostate ; (2) Cette protéine, ou son gène, est plus fréquemment exprimée dans les tissus cancéreux que dans les tissus non-cancéreux de la prostate ; (3) Cibler cette protéine avec des ligands ou si-RNA peut réduire la tumorigénèse in vitro ; (4) L'expression de a282 est associée à une sécrétion de VEGF et une formation de vaisseaux sanguins ; (5) Sa surexpression induit le développement tumoral chez la souris nude ; (6) a282 est surexprimée dans d'autres formes de cancers ; (7) La protéine a282 peut être clivée et la sous-partie a2 de la protéine a282 libérée dans le milieu extracellulaire de cellules LNCaP-a282. Elle est détectable avec des anticorps disponibles sur le marché.

Ainsi, la protéine a282 a été détectée dans les cellules de la prostate à la fois cancéreuses et non-cancéreuses par PCR et immunodétection, en particulier sur les membranes apicales de l'épithélium (observation (1)). Des analyses PCR et immunohistochimiques ont ensuite montré que la protéine a282 est plus exprimée dans les tissus cancéreux de la prostate que dans les tissus non-cancéreux (observation (2)). En partant du constat, établi par des techniques de MTS, comptage manuel ou des expériences cinétiques, que le ciblage de la protéine avec si-a282 ou des ligands comme la gabapentine réduit la prolifération cellulaire (observation (3)), il a été montré in vitro et in vivo que cette surexpression de a282 induit le développement tumoral chez la souris nude (observation (5)).

Des analyses histologiques, d'immunodétection, par western blot et des tests ELISA ont également montré que cette surexpression de a282 provoque la sécrétion de VEGF et l'angiogénèse (observation (4)). Il a enfin été mis en évidence que la protéine a282 peut être clivée, libérant ainsi la sous-partie a2 de la protéine a282 dans le milieu extracellulaire de cellules LNCaP-a282. La protéine a282 ou les fragments de cette protéine, et plus particulièrement la sous-partie a2, sont détectables avec des anticorps disponibles sur le marché (observation (7)). Il est par ailleurs raisonnable d'affirmer que la protéine a282, ou les fragments de cette protéine, puisse, de la même façon, être détectée dans les urines.35 Il est ainsi connu qu'in vivo, les protéines ancrées par des groupements GPI à la membrane peuvent être clivées par différentes enzymes, dont certaines phospholipases C ou D, hydrolysant ces groupements GPI et libérant ainsi les protéines dans le milieu extracellulaire.

Plus particulièrement le clivage in vivo de la sous-partie a2 de la protéine, libérant la sous-partie a2 dans le milieu extracellulaire, est fortement présumé. Il est en effet connu que, dans le milieu extracellulaire, les ponts disulfures peuvent être clivés par de nombreuses enzymes comme la disulfure isomérase ou la phosphoglycérate kinase (14), libérant ainsi a2 dans le milieu extracellulaire des cellules épithéliales de la prostate. Or, il a déjà été montré que ces deux enzymes sont détectées dans la prostate et que leur expression est accrue lors du développement cancéreux (15, 16).

Ainsi, de façon similaire au présent cas, la protéine CD90 (Cluster of Differentiation 90) est une protéine de surface N-glycosylatée, ancrée à la membrane par un groupement GlycosylPhosphatidyllnositol (GPI), comme la protéine a282. Elle a été découverte initialement comme antigène de thymocytes (17), et a été décrite comme étant exprimée dans le tissu nerveux (18), les cellules progénitrices hématopoïétiques (19), et dans les fibroblastes de nombreux tissus tels que les poumons ou le myomètre lung (20). Des niveaux élevés de CD90 ont été détectés dans des gliomes malins et l'hépatocarcinome (21). La protéine CD90 est multipliée par un facteur 5 dans les tissus de cancers de la prostate par rapport aux tissus non cancéreux (22). Les mêmes auteurs ont étudié la présence de CD90 dans les urines afin de déterminer si cette protéine était sécrétée. Un peptide issu de CD90 a ainsi été identifié dans les urines de patients atteints de cancer de la prostate par spectrométrie de masse, confirmant que CD90 est sécrétée par le tissu cancéreux prostatique et peut donc servir de biomarqueur pour des tests non invasifs (22). Il est connu que la libération de protéines par les cellules prostatiques dans le liquide séminal s'effectue d'une part par la sécrétion de protéines solubles par exocytose et d'autre part par la production de prostasomes, ou exosomes, libérés par exocytose à partir des corps multivésiculaires des cellules épithéliales. Ces exosomes, retrouvées dans l'urine ou le liquide séminal, contiennent un grand nombre de protéines, par exemple des protéines membranaires, comme GLUT5 (Glucose Transporter 5), VAT-1 (synaptic vesicle membrane protein homologue) ou SCA2 (synaptic carrier associated membrane protein). D'autre part, ces prostasomes, qui sont normalement libérés dans le liquide séminal peuvent se retrouver dans le plasma sanguin au cours du développement de cancers prostatiques (23). Ainsi, il est très probable que la protéine a282 soit libérée dans le liquide séminal ou le plasma sanguin par ces prostasomes et puisse être dosée dans d'autres liquides organiques que l'urine. Enfin, il peut être appuyé le fait que, de la même façon que la PSA, l'architecture des tissus, et notamment la plus grande fragilité des vaisseaux sanguins, entraîne une fuite de PSA et d' a282 dans le sang, permettant ainsi de retrouver cette protéine dans le plasma en plus grand quantité lors de développement tumoral. Il a donc été ici mis en évidence que la protéine a2152, ou un fragment de celle-ci, peut être utilisée comme biomarqueur du cancer de la prostate, ainsi que pour détecter le stade d'avancement du cancer.

15 REFERENCES 1. « Guide - Affection de Longue Durée (Tumeur maligne, affection maligne du tissu lymphatique ou hématopoïétique, Cancer de la prostate) », HAS et Institut National du Cancer, janvier 2012. 20 2. Fiske JL, Fomin VP, Brown ML, Duncan RL, Sikes RA (2006) Voltage-sensitive ion channels and cancer. Cancer Metastasis Rev 25: 493-500. 3. Kunzelmann K (2005) Ion channels and cancer. J Membr Biol 205: 159-173. 4. Bennett ES, Smith BA, Harper JM (2004) Voltage-gated Na+ channels confer invasive properties on human prostate cancer cells. Pflugers Arch 447: 908-914. 25 5. Mariot P, Vanoverberghe K, Lalevee N, Rossier MF, Prevarskaya N (2002) Overexpression of an alpha 1H (Cav3.2) T-type calcium channel during neuroendocrine differentiation of human prostate cancer cells. J Biol Chem 277: 10824-10833. 6. Spitzner M, Ousingsawat J, Scheidt K, Kunzelmann K, Schreiber R (2007) 30 Voltage-gated K+ channels support proliferation of colonic carcinoma cells. Faseb J 21: 35-44. 7. Carboni GL, Gao B, Nishizaki M, Xu K, Minna JD, et al. (2003) CACNA2D2- mediated apoptosis in NSCLC cells is associated with alterations of the intracellular calcium signaling and disruption of mitochondria membrane integrity.

35 Oncogene 22: 615-626 10 8. Lerman MI, Minna JD (2000) The 630-kb lung cancer homozygous deletion region on human chromosome 3p21.3: identification and evaluation of the resident candidate tumor suppressor genes. The International Lung Cancer Chromosome 3p21.3 Tumor Suppressor Gene Consortium. Cancer Res 60: 6116-6133. 9. Chang JM, Lee HJ, Lee SE, Byun S-S, Choe G Y, Kim SH, Seong CK, Kim SH. Unusual tumours involving the prostate: radiological-pathological findings. The British Journal of Radiology, 81 (2008), 907-915. 10. Gackiere F, Bidaux G, Delcourt P, Van Coppenolle F, Katsogiannou M, et al. (2008) CaV3.2 T-type Calcium Channels Are Involved in Calcium-dependent Secretion of Neuroendocrine Prostate Cancer Cells. J Biol Chem 283: 10162- 10173 11. Chomczynski P, Sacchi N (1987) Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem 162: 156159. 12. Dooley DJ, Taylor CP, Donevan S, Feltner D (2007) Ca2+ channel alpha2delta ligands: novel modulators of neurotransmission. Trends Pharmacol Sci 28: 75-82. 13. Davies A, Hendrich J, Van Minh AT, Wratten J, Douglas L, et al. (2007) Functional biology of the alpha(2)delta subunits of voltage-gated calcium channels. Trends Pharmacol Sci 28: 220-228. 14. Hogg PJ (2003) Disulfide bonds as switches for protein function. Trends Biochem Sci 28: 210-214. 15. Lexander H, Palmberg C, Auer G, Hellstrom M, Franzen B, et al. (2005) Proteomic analysis of protein expression in prostate cancer. Anal Quant Cytol Histol 27: 263-272. 16. Wang J, Ying G, Jung Y, Lu J, Zhu J, et al. (2010) Characterization of phosphoglycerate kinase-1 expression of stromal cells derived from tumor microenvironment in prostate cancer progression. Cancer Res 70: 471-480. 17. Ades EW, Zwerner RK, Acton RT, Balch CM. Isolation and partial characterization of the human homologue of Thy-1. J Exp Med 1980;151:400-6 18. Morris R. Thy-1 in developing nervous tissue. Dev Neurosci 1985;7:133-60. 19. Craig W, Kay R, Cutler RL, Lansdorp PM. Expression of Thy-1 on human hematopoietic progenitor cells. J Exp Med 1993;177:1331-42. 20. Koumas L, King AE, Critchley HO, Kelly RW, Phipps RP. Fibroblast heterogeneity: existence of functionally distinct Thy 1(+) and Thy 1(-) human female reproductive tract fibroblasts. Am J Pathol 2001;159:925-35. 21. He J, Liu Y, Zhu T, Zhu J, et al. CD90 is identified as a candidate marker for cancer stem cells in primary high-grade gliomas using tissue microarrays. Mol Cell Proteomics 2012;11. 22. Truc LD, Zhang H, Ye M, Huang CY, et al. CD90/THY1 is overexpressed in prostate cancer associated fibroblasts and could serve as a cancer biomarker. Mod Pathol 2010;23:1346-56. 23. Tavoosidana, G., Ronquist, G., Darmanis, S., Yan, J., Carlsson, L., Wu, D., Conze, T., Ek, P., Semjonow, A., Eltze, E. et al. (2011). Multiple recognition assay reveals prostasomes as promising plasma biomarkers for prostate cancer. Proc Natl Acad Sci U S A 108, 8809-14.

Claims (7)

1. REVENDICATIONS1. Méthode de détection in vitro d'un cancer de la prostate et/ou d'une métastase prostatique chez un sujet comprenant les étapes consistant à : (i) mesurer la concentration de a2152, ou un fragment de a2152, dans un échantillon biologique obtenu dudit sujet, (ii) comparer la concentration de a2152, ou un fragment de a2152, mesurée à l'étape (i) à une valeur prédéterminée de la concentration en a282, ou un fragment de a282, dans laquelle une concentration de a282, ou d'un fragment de a282, dans l'échantillon biologique supérieure à ladite valeur prédéterminée indique la présence d'un cancer de la prostate chez ledit sujet, et une concentration de a2152, ou d'un fragment de a2152, inférieure à ladite valeur prédéterminée indique l'absence d'un cancer de la prostate chez ledit sujet.
2. 2. Méthode pour déterminer in vitro le stade d'un cancer de la prostate chez un sujet comprenant les étapes consistant à : (i) mesurer la concentration de a2152, ou un fragment de a2152, dans un échantillon biologique obtenu dudit sujet, (ii) comparer la concentration de a2152, ou un fragment de a2152, mesurée à l'étape (i) à une valeur prédéterminée de la concentration en a282, ou un fragment de a282, dans laquelle, lorsque la concentration de a282, ou d'un fragment de a282, dans l'échantillon biologique est supérieure à ladite valeur prédéterminée de la concentration en a2152, ou un fragment de a2152, l'écart entre ladite concentration de a2152, ou d'un fragment de a282, dans l'échantillon biologique obtenu dudit sujet et ladite valeur prédéterminée indique le stade du cancer de la prostate chez ledit sujet.
3. 3. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, dans laquelle ledit fragment de (12152 est (12.
4. 4. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle l'échantillon biologique est un fluide biologique, de préférence un échantillon de sang, un échantillon de sérum, un échantillon de plasma, un échantillon d'urine ou un échantillon de sperme, de préférence encore un échantillon d'urine ou de sperme.
5. 5. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans laquelle la concentration de la protéine a282, ou d'un fragment de a2152, est mesurée en utilisant un anticorps ou un fragment de celui-ci, spécifique de ladite protéine a282, ou d'un fragment de a2b2-
6. 6. Agent anticancéreux pour son utilisation dans le traitement du cancer de la prostate chez un sujet, caractérisé en ce qu'on détecte ledit cancer de la prostate au moyen d'une méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 5.
7. 7. Utilisation de la protéine a2152, ou d'un fragment, comme biomarqueur du cancer de la prostate d'un sujet.