FR2998799A1 - Composition, useful to e.g. eliminate trimethylamine in the intestine and liver, comprises a microorganism expressing a trimethylamine methyltransferase, capable of metabolizing trimethylamine in the presence of hydrogen in the intestine - Google Patents
Composition, useful to e.g. eliminate trimethylamine in the intestine and liver, comprises a microorganism expressing a trimethylamine methyltransferase, capable of metabolizing trimethylamine in the presence of hydrogen in the intestine Download PDFInfo
- Publication number
- FR2998799A1 FR2998799A1 FR1261507A FR1261507A FR2998799A1 FR 2998799 A1 FR2998799 A1 FR 2998799A1 FR 1261507 A FR1261507 A FR 1261507A FR 1261507 A FR1261507 A FR 1261507A FR 2998799 A1 FR2998799 A1 FR 2998799A1
- Authority
- FR
- France
- Prior art keywords
- tma
- composition
- microorganism
- trimethylamine
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims abstract description 68
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 60
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 title claims abstract description 14
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 11
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 title claims abstract description 11
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 title claims abstract description 11
- GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N trimethylamine Chemical compound CN(C)C GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 137
- 102000055027 Protein Methyltransferases Human genes 0.000 title claims description 12
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 title claims description 9
- 108020000850 Trimethylamine methyltransferase Proteins 0.000 title abstract 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 98
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 30
- 101710116896 Trimethylamine methyltransferase MttB Proteins 0.000 claims description 25
- UYPYRKYUKCHHIB-UHFFFAOYSA-N trimethylamine N-oxide Chemical compound C[N+](C)(C)[O-] UYPYRKYUKCHHIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 241000203069 Archaea Species 0.000 claims description 18
- 230000000696 methanogenic effect Effects 0.000 claims description 18
- 108010000231 Choloylglycine hydrolase Proteins 0.000 claims description 15
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 claims description 10
- 206010003210 Arteriosclerosis Diseases 0.000 claims description 9
- 208000037260 Atherosclerotic Plaque Diseases 0.000 claims description 9
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 claims description 7
- 239000003833 bile salt Substances 0.000 claims description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 4
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 7
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 abstract 1
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 39
- 238000000034 method Methods 0.000 description 16
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 12
- 241000909983 Candidatus Methanomethylophilus alvus Species 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 9
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 7
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 6
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 6
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Chemical compound C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 241001064129 Methanomassiliicoccus luminyensis Species 0.000 description 5
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 5
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 5
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 102000016397 Methyltransferase Human genes 0.000 description 4
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 4
- 229940093761 bile salts Drugs 0.000 description 4
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 239000001814 pectin Substances 0.000 description 4
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 description 4
- 235000010987 pectin Nutrition 0.000 description 4
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 3
- 241000203067 Methanobacteriales Species 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 3
- 230000007505 plaque formation Effects 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 108091092584 GDNA Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 241000202985 Methanobrevibacter smithii Species 0.000 description 2
- 241000204676 Methanosphaera stadtmanae Species 0.000 description 2
- 206010068233 Trimethylaminuria Diseases 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 229960001231 choline Drugs 0.000 description 2
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000002702 enteric coating Substances 0.000 description 2
- 238000009505 enteric coating Methods 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 108091005592 methylated proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 101150084750 1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150090724 3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150033839 4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150101112 7 gene Proteins 0.000 description 1
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150044182 8 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 208000037157 Azotemia Diseases 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 101100368896 Escherichia coli (strain K12) tatD gene Proteins 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 241000202987 Methanobrevibacter Species 0.000 description 1
- 101100024773 Methanosarcina barkeri mttC gene Proteins 0.000 description 1
- 102000008109 Mixed Function Oxygenases Human genes 0.000 description 1
- 108010074633 Mixed Function Oxygenases Proteins 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 241000282849 Ruminantia Species 0.000 description 1
- 208000028878 Severe primary trimethylaminuria Diseases 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 210000002249 digestive system Anatomy 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 244000005709 gut microbiome Species 0.000 description 1
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 239000006984 methanogenium medium Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 101150075417 mttB gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 239000006186 oral dosage form Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 description 1
- 238000013139 quantization Methods 0.000 description 1
- 150000003248 quinolines Chemical class 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N rifampicin Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O/C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C([O-])=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CC[NH+](C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N 0.000 description 1
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 210000004243 sweat Anatomy 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 101150075675 tatC gene Proteins 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 208000009852 uremia Diseases 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/45—Transferases (2)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Description
Utilisation de microorganismes pour diminuer le taux de triméthylamine dans l'intestin, traitement de la triméthylaminurémie et prévention de la formation des plaques d'athérome La présente invention a trait à l'utilisation de microorganismes permettant de métaboliser la triméthylamine (TMA) dans l'intestin et donc de diminuer le taux intestinal de cette TMA. L'invention a notamment pour objectif de permettre le traitement de la triméthylaminurémie et/ou de diminuer le taux de triméthylamine N-oxyde (TMAO), ce qui permet de prévenir la formation des plaques d'athérome et de fournir un moyen supplémentaire pour la prévention des maladies cardio-vasculaires. L'invention a également pour objet un nouveau microorganisme susceptible d'être utilisé dans ces applications. La triméthylaminurémie (ou TMAU, urémie à TMA, ou syndrome de l'odeur du poisson pourri ou encore fish-odor syndrome) est une maladie génétique dans laquelle la personne déficiente génétiquement en une enzyme (mono-oxygénase à flavine 3 FM03) ne peut pas efficacement transformer le TMA en TMAO au niveau du foie. Dans certains cas également, la déficience en cette capacité de transformation est sporadique et acquise. La triméthylamine s'accumule alors dans l'organisme et est finalement éliminée par la sueur, l'urine et l'expiration, avec une forte odeur de poisson. Si aucune étude réelle ne montre l'incidence générale de la maladie, le chiffre de 1 % de la population américaine a été cependant avancé. Dans ce qui suit, on désignera une telle personne comme un patient déficient en métabolisme de la TMA. La TMA a une origine alimentaire et résulte de la conversion de la choline apportée par l'alimentation (notamment oeuf, viande, foie, germe de blé, poisson, etc.).The present invention relates to the use of microorganisms for metabolizing trimethylamine (TMA) in the gastrointestinal tract, the treatment of trimethylaminuremia and the prevention of atheroma plaque formation. intestine and thus lower the intestinal level of this TMA. The object of the invention is in particular to allow the treatment of trimethylaminuremia and / or to reduce the level of trimethylamine N-oxide (TMAO), which makes it possible to prevent the formation of atheroma plaques and to provide an additional means for the prevention of cardiovascular diseases. The invention also relates to a new microorganism that can be used in these applications. Trimethylaminuremia (or TMAU, TMA uremia, or rotten fish odor syndrome or fish-odor syndrome) is a genetic disease in which the person genetically deficient in an enzyme (flavo 3 monooxygenase FM03) can not not effectively transform TMA into TMAO in the liver. In some cases also, the deficiency in this transformation capacity is sporadic and acquired. Trimethylamine then accumulates in the body and is eventually eliminated by sweat, urine and exhalation, with a strong fishy odor. If no real study shows the general incidence of the disease, the figure of 1% of the American population has been advanced. In what follows, we will designate such a person as a patient deficient in metabolism of TMA. TMA has a food origin and results from the conversion of choline brought by food (including egg, meat, liver, wheat germ, fish, etc.).
Cette choline est transformée au niveau de l'intestin par le microbiote intestinal. Par ailleurs chez les personnes possédant l'enzyme FM03 active, le TMA est transformée en TMAO dans le foie et ce métabolite se retrouve dans la circulation sanguine. Wang et al. (Nature 2011, 472(7341), 57-63; voir également K. Rak and D.J. Rader, Cardiovascular Disease, News and Views, Nature2011, 472, 40-41) enseignent que la TMAO circulante peut contribuer à un développement des plaques d'athérome dans les artères et donc aux maladies cardiaques. Les Archaea méthanogènes sont des microorganismes qui produisent du méthane dans des conditions anaérobies. On retrouve certaines Archaea dans le système digestif d'animaux tels que les ruminants, ainsi que chez certains individus humains, en particulier les individus âgés.This choline is transformed in the intestine by the gut microbiota. Moreover, in people with active FM03 enzyme, TMA is converted into TMAO in the liver and this metabolite is found in the bloodstream. Wang et al. (Nature 2011, 472 (7341), 57-63, see also K. Rak and DJ Rader, Cardiovascular Disease, News and Views, Nature2011, 472, 40-41) teach that circulating TMAO can contribute to plaque development. atheroma in the arteries and therefore to heart disease. Methanogenic Archaea are microorganisms that produce methane under anaerobic conditions. Some Archaea are found in the digestive system of animals such as ruminants, as well as in some human individuals, particularly older individuals.
Ainsi, l'équipe de B. Dridi (International Journal of Systematic Evolutionary Microbiology 2012, 62, 1902-1907) présente l'isolement d'un tel microorganisme dénommé Methanomassiiiicoccus luminyensis dont il est décrit que sous une atmosphère de N2/CO2, cette Archaea peut réduire le méthanol en méthane mais n'utilise pas la triméthylamine. Le génome complet de cette Archaea a été publié et mentionné dans A. Gorlas, Journal of Bacteriology, Septembre 2012, Vol. 194, 17, p. 4745, le génome étant accessible dans EMBL sous les références d'accès CAJE01000001 à CAJE01000026. A l'heure actuelle, il n'a pas été décrit, notamment chez l'homme, d'Archaea capable d'utiliser et de métaboliser la TMA in vivo.Thus, the team of B. Dridi (International Journal of Systematic Evolutionary Microbiology 2012, 62, 1902-1907) presents the isolation of such a microorganism called Methanomassiiiicoccus luminyensis which is described that under an atmosphere of N2 / CO2, this Archaea can reduce methanol to methane but does not use trimethylamine. The complete genome of this Archaea has been published and mentioned in A. Gorlas, Journal of Bacteriology, September 2012, Vol. 194, 17, p. 4745, the genome being accessible in EMBL under access references CAJE01000001 to CAJE01000026. At present, it has not been described, particularly in humans, Archaea capable of using and metabolizing TMA in vivo.
Les inventeurs ont réussi à identifier une nouvelle espèce d'Archaea méthanogène dans un échantillon de sels d'un individu humain, espèce comprenant un gène codant pour une TMA méthyltransférase et un gène codant pour protéine corrinoïde acceptrice de groupement méthyle de TMA, susceptibles, en présence d'hydrogène et en anaérobie, conditions rencontrées dans l'intestin ou le colon humain, de métaboliser la TMA, de sorte qu'il est proposé ici d'utiliser ces microorganismes pour métaboliser la TMA pour en diminuer le taux intestinal. Il a en outre été découvert que cette souche d'Archaea présente également un gène de résistance aux sels biliaires, notamment un gène codant pour une hydrolyse des sels biliaires, favorisant ainsi la survie et le maintien du microorganisme au niveau intestinal. Ce microorganisme est dénommé ci-après souche 1 ou Methanomethylophilus alvus. Les inventeurs ont également identifié que la souche d'Archaea Methanomassiiiicoccus luminyensis décrite par D. Didri et al. (supra), dénommée parfois ci-après souche 2, possède également les gènes codant pour une TMA méthyltransférase et pour une protéine corrinoïde acceptrice de groupement méthyle de TMA susceptibles de permettre le métabolisme du TMA en présence de l'hydrogène dans l'intestin. On pense que la TMA est métabolisée avec formation de protéines méthylées (protéines corrinoide méthylées) qui captent les méthyles de la TMA. Cette protéine méthylée est sans doute ensuite entraînée dans la voie de la méthanogénèse, aboutissant à la production de méthane. L'invention a donc pour objet une composition contenant un microorganisme exprimant une TMA méthyltransférase, capable de métaboliser la triméthylamine (TMA) en présence d'hydrogène dans l'intestin, pour utilisation comme médicament pour diminuer ou supprimer la TMA au niveau intestinal et dans le foie. Plus précisément, dans une premier mode de réalisation, l'utilisation vise à traiter la triméthylaminurémie. Le patient traité a un déficit en capacité à métaboliser la TMA.The inventors have succeeded in identifying a new species of methanogenic archaea in a sample of salts of a human individual, a species comprising a gene coding for a TMA methyltransferase and a gene coding for TMA methyl acceptor corrinoid protein, susceptible, in presence of hydrogen and anaerobic, conditions encountered in the intestine or the human colon, to metabolize TMA, so that it is proposed here to use these microorganisms to metabolize TMA to reduce the intestinal level. It has also been discovered that this strain of Archaea also has a bile salt resistance gene, in particular a gene coding for hydrolysis of bile salts, thus favoring the survival and maintenance of the microorganism at the intestinal level. This microorganism is hereinafter referred to as strain 1 or Methanomethylophilus alvus. The inventors have also identified that the strain of Archaea Methanomassiiiicoccus luminyensis described by D. Didri et al. (supra), sometimes referred to hereinafter as strain 2, also has the genes coding for a TMA methyltransferase and for a TMA methyl acceptor corrinoid protein likely to allow the metabolism of TMA in the presence of hydrogen in the intestine. TMA is thought to be metabolized with formation of methylated proteins (methylated corrinoid proteins) that capture TMA methyls. This methylated protein is probably then driven into the methanogenesis pathway, resulting in the production of methane. The subject of the invention is therefore a composition containing a microorganism expressing a TMA methyltransferase, capable of metabolizing trimethylamine (TMA) in the presence of hydrogen in the intestine, for use as a medicament for reducing or eliminating TMA at the intestinal level and in liver. More specifically, in a first embodiment, the purpose is to treat trimethylaminuremia. The treated patient has a deficit in ability to metabolize TMA.
Notamment, il est déficient en enzyme FM03 active.In particular, it is deficient in active FM03 enzyme.
Dans un deuxième mode de réalisation, l'utilisation vise la diminution du taux du métabolite hépatique de la TMA, le TMAO, notamment du TMAO plasmatique. Cette utilisation peut viser la prévention de la formation de plaques d'athérome et/ou la prévention des maladies cardiovasculaires. Le patient visé est soit un patient capable de métaboliser la TMA, soit un patient déficient en métabolisme de la TMA mais traité à l'aide d'un médicament permettant de rétablir un métabolisme de la TMA en TMAO, par exemple avec la composition selon l'invention. La métabolisation de la TMA, en amont, permet alors de limiter la production de TMAO par le foie. L'utilisation de la composition selon l'invention chez un patient déficient en métabolisme de la TMA permet de combiner les deux effets, métabolisme de la TMA ou traitement de la triméthylaminurémie et diminution de la TMAO plasmatique, prévention de la formation de plaques d'athérome et/ou prévention des maladies cardiovasculaires. L'invention a aussi pour objet une composition contenant un microorganisme exprimant une TMA méthyltransférase, capable de métaboliser la triméthylamine (TMA) en présence d'hydrogène dans l'intestin, pour traiter la triméthylaminurémie. L'invention a donc aussi pour objet une composition contenant un microorganisme exprimant une TMA méthyltransférase, capable de métaboliser la triméthylamine (TMA) en présence d'hydrogène dans l'intestin, pour utilisation comme médicament pour diminuer le taux de TMAO plasmatique, prévenir la formation de plaques d'athérome et/ou prévenir les maladies cardiovasculaires. La métabolisation de la TMA par les microorganismes selon l'invention suppose que les méthyles de la TMA soient transférés à une autre molécule. Dans un mode de réalisation, le microorganisme exprime également une protéine corrinoide susceptible de jouer ce rôle d'accepteur de méthyle. Cette protéine est en particulier une protéine corrinoïde acceptrice de groupement méthyle de TMA. Dans un mode de réalisation, la composition comprend un microorganisme comprenant le gène codant pour une TMA méthyltransférase ayant la séquence SEQ ID NO : 1 ou 2, ou une séquence équivalente (d'une méthyltransférase active sur la TMA) ayant plus de 90% d'identité, notamment ayant 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% d'identité, avec la SEQ ID NO: 1 ou 2. Dans un mode de réalisation, la composition comprend un microorganisme comprenant le gène codant pour une TMA méthyltransférase, ce gène ayant la séquence SEQ ID NO: 3 ou 4, ou une séquence équivalente (séquence codant pour une méthyltransférase active sur la TMA) ayant plus de 90% d'identité, notamment ayant 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% d'identité, avec la SEQ ID NO: 3 ou 4.In a second embodiment, the aim is to reduce the level of the hepatic metabolite of TMA, the TMAO, in particular plasma TMAO. This use may be aimed at preventing the formation of atheroma plaques and / or the prevention of cardiovascular diseases. The target patient is either a patient capable of metabolizing TMA, or a patient deficient in metabolism of TMA but treated with a drug to restore a metabolism of TMA to TMAO, for example with the composition according to the invention. 'invention. The metabolism of TMA, upstream, allows to limit the production of TMAO by the liver. The use of the composition according to the invention in a patient deficient in metabolism of TMA makes it possible to combine the two effects, metabolism of TMA or treatment of trimethylaminuremia and decrease of plasma TMAO, prevention of plaque formation. atheroma and / or prevention of cardiovascular diseases. The invention also relates to a composition containing a microorganism expressing a TMA methyltransferase, capable of metabolizing trimethylamine (TMA) in the presence of hydrogen in the intestine, to treat trimethylaminuremia. The subject of the invention is therefore also a composition containing a microorganism expressing a TMA methyltransferase, capable of metabolizing trimethylamine (TMA) in the presence of hydrogen in the intestine, for use as a medicament for reducing the level of plasma TMAO, preventing formation of atheroma plaques and / or prevention of cardiovascular diseases. The metabolism of TMA by the microorganisms according to the invention assumes that the methylated TMA is transferred to another molecule. In one embodiment, the microorganism also expresses a corrinoid protein capable of acting as a methyl acceptor. This protein is in particular a TMA methyl acceptor corrinoid protein. In one embodiment, the composition comprises a microorganism comprising the gene encoding a TMA methyltransferase having the sequence SEQ ID NO: 1 or 2, or an equivalent sequence (of a TMA-active methyltransferase) having greater than 90% d identity, especially having 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 or 99% identity, with SEQ ID NO: 1 or 2. In one embodiment, the composition comprises a microorganism comprising the gene coding for a TMA methyltransferase, this gene having the sequence SEQ ID NO: 3 or 4, or an equivalent sequence (sequence coding for a TMA-active methyltransferase) having more than 90% identity, in particular having 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 or 99% identity, with SEQ ID NO: 3 or 4.
Dans un mode de réalisation, la composition comprend un microorganisme comprenant le gène codant pour une protéine corrinoïde acceptrice de groupement méthyle de TMA, ayant la séquence SEQ ID NO: 5 ou 6, ou une séquence équivalente (d'une protéine corrinoïde acceptrice de groupement méthyle capable de capter les méthyles de la TMA en présence d'une méthyltransférase) ayant plus de 90% d'identité, notamment ayant 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% d'identité, avec la SEQ ID NO: 5 ou 6. Dans un mode de réalisation, la composition comprend un microorganisme comprenant le gène codant pour une protéine corrinoïde acceptrice de groupement méthyle de TMA, ce gène ayant la séquence SEQ ID NO: 7 ou 8, ou une séquence équivalente (séquence codant pour une protéine corrinoïde acceptrice de groupement méthyle capable de capter les méthyles de la TMA en présence d'une méthyltransférase) ayant plus de 90% d'identité, notamment ayant 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% d'identité, avec la SEQ ID NO: 7 ou 8.In one embodiment, the composition comprises a microorganism comprising the gene encoding a TMA methyl acceptor corrinoid protein, having the sequence SEQ ID NO: 5 or 6, or an equivalent sequence (of a group accepting corrinoid protein). methyl capable of capturing TMA methyls in the presence of a methyltransferase) having more than 90% identity, especially having 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 or 99% identity with the SEQ ID NO: 5 or 6. In one embodiment, the composition comprises a microorganism comprising the gene coding for a TMA methyl acceptor corrinoid protein, this gene having the sequence SEQ ID NO: 7 or 8, or an equivalent sequence (sequence coding for a methyl acceptor corrinoid protein capable of capturing TMA methyls in the presence of a methyltransferase) having more than 90% identity, in particular having 90, 91, 92, 93, 94 , 95, 9 6, 97, 98 or 99% identity, with SEQ ID NO: 7 or 8.
Dans un mode de réalisation, la composition comprend un microorganisme comprenant le gène codant pour une TMA méthyltransférase ayant la séquence SEQ ID NO : 1, ou séquence équivalente telles que définie supra, et le gène codant pour une protéine corrinoïde acceptrice de groupement méthyle de TMA, ayant la séquence SEQ ID NO : 5, ou séquence équivalente telles que définie supra .In one embodiment, the composition comprises a microorganism comprising the gene coding for a TMA methyltransferase having the sequence SEQ ID NO: 1, or equivalent sequence as defined above, and the gene coding for a TMA methyl acceptor corrinoid protein. , having the sequence SEQ ID NO: 5, or equivalent sequence as defined above.
Dans un mode de réalisation, la composition comprend un microorganisme comprenant le gène codant pour une TMA méthyltransférase ayant la séquence SEQ ID NO : 2, ou séquence équivalente telles que définie supra, et le gène codant pour une protéine corrinoïde acceptrice de groupement méthyle de TMA, ayant la séquence SEQ ID NO : 6, ou séquence équivalente telles que définie supra.In one embodiment, the composition comprises a microorganism comprising the gene encoding a TMA methyltransferase having the sequence SEQ ID NO: 2, or equivalent sequence as defined above, and the gene coding for a TMA methyl acceptor corrinoid protein. , having the sequence SEQ ID NO: 6, or equivalent sequence as defined above.
Dans un mode de réalisation, la composition comprend un microorganisme comprenant le gène codant pour une TMA méthyltransférase, ce gène ayant la séquence SEQ ID NO: 3, ou séquence équivalente telles que définie supra, et le gène codant pour une protéine corrinoïde acceptrice de groupement méthyle de TMA, ce gène ayant la séquence SEQ ID NO : 7, ou séquence équivalente telles que définie supra.In one embodiment, the composition comprises a microorganism comprising the gene coding for a TMA methyltransferase, this gene having the sequence SEQ ID NO: 3, or equivalent sequence as defined above, and the gene coding for a group accepting corrinoid protein. methyl of TMA, this gene having the sequence SEQ ID NO: 7, or equivalent sequence as defined above.
Dans un mode de réalisation, la composition comprend un microorganisme comprenant le gène codant pour une TMA méthyltransférase, ce gène ayant la séquence SEQ ID NO: 4, ou séquence équivalente telles que définie supra, et le gène codant pour une protéine corrinoïde acceptrice de groupement méthyle de TMA, ce gène ayant la séquence SEQ ID NO : 8, ou séquence équivalente telles que définie supra.In one embodiment, the composition comprises a microorganism comprising the gene coding for a TMA methyltransferase, this gene having the sequence SEQ ID NO: 4, or equivalent sequence as defined above, and the gene coding for a group accepting corrinoid protein. TMA methyl, this gene having the sequence SEQ ID NO: 8, or equivalent sequence as defined above.
Dans un mode de réalisation, le microorganisme comporte également un gène de résistance aux sels biliaires, de préférence un gène codant pour une hydrolase des sels biliaires, telle qu'une choloylglycine hydrolase. Dans un mode de réalisation, la choloylglycine hydrolase a la séquence SEQ ID NO: 9, ou une séquence équivalente (d'une hydrolase active sur les sels biliaires) ayant plus de 90% d'identité, notamment ayant 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% d'identité, avec la SEQ ID NO: 9. Dans un mode de réalisation, la choloylglycine hydrolase est codée par un gène ayant la séquence SEQ ID NO: 10, ou une séquence équivalente (séquence codant pour une hydrolase active sur les sels biliaires) ayant plus de 90% d'identité, notamment ayant 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% d'identité, avec la SEQ ID NO: 10. Dans un mode de réalisation, la composition comprend un microorganisme comprenant le gène codant pour une TMA méthyltransférase ayant la séquence SEQ ID NO : 1, ou séquence équivalente telles que définie supra, le gène codant pour une protéine corrinoïde acceptrice de groupement méthyle de TMA ayant la séquence SEQ ID NO : 5, ou séquence équivalente telles que définie supra, et le gène codant pour une choloylglycine hydrolase ayant la séquence SEQ ID NO: 9, ou séquence équivalente telles que définie supra. Dans un mode de réalisation, la composition comprend un microorganisme comprenant le gène codant pour une TMA méthyltransférase, ce gène ayant la séquence SEQ ID NO: 3, ou séquence équivalente telles que définie supra, le gène codant pour une protéine corrinoïde acceptrice de groupement méthyle de TMA, ce gène ayant la séquence SEQ ID NO: 7, ou séquence équivalente telles que définie supra, et le gène codant pour une choloylglycine hydrolase, ce gène ayant la séquence SEQ ID NO: 10, ou séquence équivalente telles que définie supra. Suivant un mode de réalisation préféré, dans ces compositions, le microorganisme est une Archaea méthanogène, notamment d'origine humaine ou animale, de préférence humaine. Dans un mode de réalisation, le microorganisme est une Archaea méthanogène dont l'ARN 16S est codé par la séquence ADN SEQ ID NO: 11 (souche 1 identifiée par les inventeurs) ou une séquence ayant plus de 85 %, notamment plus de 90% d'identité, notamment ayant 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% d'identité, avec la SEQ ID NO 11. Ce microorganisme comprend le gène codant pour une TMA méthyltransférase ayant la séquence SEQ ID NO: 1, ou séquence équivalente telles que définie supra, le gène codant pour une protéine corrinoïde acceptrice de groupement méthyle de TMA, ayant la séquence SEQ ID NO : 5, ou séquence équivalente telles que définie supra, et le gène codant pour une choloylglycine hydrolase, ayant la séquence SEQ ID NO : 9, ou séquence équivalente telles que définie supra. Ce microorganisme comprend le gène codant pour une TMA méthyltransférase, ce gène ayant la séquence SEQ ID NO: 3, ou séquence équivalente telles que définie supra, le gène codant pour une protéine corrinoïde acceptrice de groupement méthyle de TMA, ce gène ayant la séquence SEQ ID NO : 7, ou séquence équivalente telles que définie supra, et le gène codant pour une choloylglycine hydrolase, ce gène ayant la séquence SEQ ID NO: 10, ou séquence équivalente telles que définie supra. Le génome de cette souche, dénommée ici Methanomethylophilus alvus, est présenté dans la SEQ ID NO: 13.In one embodiment, the microorganism also comprises a bile salt resistance gene, preferably a gene encoding a bile salt hydrolase, such as a choloylglycine hydrolase. In one embodiment, the choloylglycine hydrolase has the sequence SEQ ID NO: 9, or an equivalent sequence (of a hydrolase active on bile salts) having more than 90% identity, in particular having 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 or 99% identity, with SEQ ID NO: 9. In one embodiment, the choloylglycine hydrolase is encoded by a gene having the sequence SEQ ID NO: 10, or an equivalent sequence (sequence coding for a hydrolase active on bile salts) having more than 90% identity, in particular having 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 or 99% identity, with the SEQ ID NO: 10. In one embodiment, the composition comprises a microorganism comprising the gene coding for a TMA methyltransferase having the sequence SEQ ID NO: 1, or equivalent sequence as defined above, the gene coding for a protein TMA acceptor methyl acceptor corrinoid having the sequence SEQ ID NO: 5, or equivalent sequence such as s as defined above, and the gene coding for a choloylglycine hydrolase having the sequence SEQ ID NO: 9, or equivalent sequence as defined above. In one embodiment, the composition comprises a microorganism comprising the gene coding for a TMA methyltransferase, this gene having the sequence SEQ ID NO: 3, or equivalent sequence as defined above, the gene coding for a methyl acceptor corrinoid protein of TMA, this gene having the sequence SEQ ID NO: 7, or equivalent sequence as defined above, and the gene coding for a choloylglycine hydrolase, this gene having the sequence SEQ ID NO: 10, or equivalent sequence as defined above. According to a preferred embodiment, in these compositions, the microorganism is a methanogenic Archaea, in particular of human or animal origin, preferably human. In one embodiment, the microorganism is a methanogenic archaea whose 16S RNA is encoded by the DNA sequence SEQ ID NO: 11 (strain 1 identified by the inventors) or a sequence having more than 85%, especially more than 90%. of identity, in particular having 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 or 99% identity, with SEQ ID No. 11. This microorganism comprises the gene coding for a TMA methyltransferase having the sequence SEQ ID NO: 1, or equivalent sequence as defined above, the gene coding for a TMA methyl acceptor corrinoid protein, having the sequence SEQ ID NO: 5, or equivalent sequence as defined above, and the gene coding for a choloylglycine hydrolase, having the sequence SEQ ID NO: 9, or equivalent sequence as defined above. This microorganism comprises the gene coding for a TMA methyltransferase, this gene having the sequence SEQ ID NO: 3, or equivalent sequence as defined above, the gene coding for a TMA methyl acceptor corrinoid protein, this gene having the sequence SEQ ID NO: 7, or equivalent sequence as defined above, and the gene coding for a choloylglycine hydrolase, this gene having the sequence SEQ ID NO: 10, or equivalent sequence as defined above. The genome of this strain, referred to herein as Methanomethylophilus alvus, is presented in SEQ ID NO: 13.
Dans un mode de réalisation, le microorganisme est une Archaea méthanogène dont l'ARN 16S est codé par la séquence ADN SEQ ID NO: 12 (souche 2 décrite par Dridi supra, souche DSM No. 25720; ou CSUR P135), ou une séquence ayant plus de 85%, de préférence plus de 90% d'identité, notamment ayant 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% d'identité, avec la SEQ ID NO 12. Ce microorganisme comprend le gène codant pour une TMA méthyltransférase ayant la séquence SEQ ID NO: 2, ou séquence équivalente telles que définie supra, et le gène codant pour une protéine corrinoïde acceptrice de groupement méthyle de TMA, ayant la séquence SEQ ID NO: 6, ou séquence équivalente telles que définie supra. Ce microorganisme comprend le gène codant pour une TMA méthyltransférase, ce gène ayant la séquence SEQ ID NO: 4, ou séquence équivalente telles que définie supra, et le gène codant pour une protéine corrinoïde acceptrice de groupement méthyle de TMA, ce gène ayant la séquence SEQ ID NO : 8, ou séquence équivalente telles que définie supra. Dans un mode de réalisation, la composition comprend la souche Methanomassiliicoccus luminyensis DSM No. 25720, disponible auprès de la collection DSMZ (Inhoffenstrafle 7B, 38124 Braunschweig, Allemagne). Dans un mode de réalisation les microorganismes sont vivants. Dans d'autres modes de réalisation, ils peuvent être tués ou inactivés. Les compositions selon l'invention peuvent comprendre en outre un véhicule ou excipient pharmaceutiquement acceptable.In one embodiment, the microorganism is a methanogenic archaea whose 16S RNA is encoded by the DNA sequence SEQ ID NO: 12 (strain 2 described by Dridi supra, strain DSM No. 25720 or CSUR P135), or a sequence having more than 85%, preferably more than 90% identity, especially having 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 or 99% identity, with SEQ ID NO. 12. microorganism comprises the gene coding for a TMA methyltransferase having the sequence SEQ ID NO: 2, or equivalent sequence as defined above, and the gene coding for a TMA methyl acceptor corrinoid protein, having the sequence SEQ ID NO: 6, or equivalent sequence as defined above. This microorganism comprises the gene coding for a TMA methyltransferase, this gene having the sequence SEQ ID NO: 4, or equivalent sequence as defined above, and the gene coding for a TMA methyl acceptor corrinoid protein, this gene having the sequence SEQ ID NO: 8, or equivalent sequence as defined above. In one embodiment, the composition comprises the strain Methanomassiliicoccus luminyensis DSM No. 25720, available from the DSMZ collection (Inhoffenstrafle 7B, 38124 Braunschweig, Germany). In one embodiment, the microorganisms are alive. In other embodiments, they may be killed or inactivated. The compositions according to the invention may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier or excipient.
Dans un mode de réalisation, la composition est un extrait de culture, de préférence un extrait concentré. Notamment, un extrait concentré de microorganisme vivant est employé. Dans un mode de réalisation, la composition ou un extrait servant de principe actif dans la composition comprend une population de microorganismes consistant essentiellement ou consistant exclusivement en microorganismes méthanogènes conformes à l'invention. La composition peut en comprendre une espèce ou une souche unique, ou bien en comprendre au moins deux espèces ou souches différentes. Dans un autre mode de réalisation, la composition ou un extrait servant de principe actif dans la composition comprend une population de microorganismes comprenant au moins une espèce ou une souche de microorganisme méthanogène conforme à l'invention, et un ou plusieurs autres microorganismes, notamment venant de culture. La composition peut comprendre une espèce ou une souche unique de microorganisme méthanogène conforme à l'invention, ou bien en comprendre au moins deux espèces ou souches différentes.In one embodiment, the composition is a culture extract, preferably a concentrated extract. In particular, a concentrated extract of live microorganism is used. In one embodiment, the composition or an extract serving as an active ingredient in the composition comprises a population of microorganisms consisting essentially or exclusively of methanogenic microorganisms according to the invention. The composition may comprise a single species or strain, or comprise at least two different species or strains. In another embodiment, the composition or an extract serving as active principle in the composition comprises a population of microorganisms comprising at least one species or a strain of methanogenic microorganism according to the invention, and one or more other microorganisms, in particular from of culture. The composition may comprise a species or a single strain of methanogenic microorganism according to the invention, or comprise at least two different species or strains.
Dans un mode de réalisation, les microorganismes sont lyophilisés. La lyophilisation est réalisée par une technique standard. La composition peut alors comprendre un excipient et/ou un stabilisant de lyophilisation standard, et tout autre additif utile. La composition se présente de préférence sous une forme d'administration par voie orale. Cette forme peut avantageusement comprendre une forme d'administration entérique, notamment une capsule entérique, une gélule entérique, un comprimé comportant un coating entérique, une encapsulation, e.g. microencapsulation, avec un matériau procurant une protection entérique, la combinaison d'au moins deux de ces moyens dont l'un au moins procure une protection entérique, etc. Le terme entérique signifie que la forme d'administration protège la composition jusqu'à ce qu'elle atteigne l'intestin. Par exemple, la composition, notamment le lyophilisat de microorganismes, peut être revêtu par coating à l'aide d'agents protecteurs, notamment choisis de manière usuelle parmi les protéines, polysaccharides, gommes, et autres agents de coating entériques. Dans un mode de réalisation, un double coating est réalisé suivant l'enseignement de EP 1 514 553. La forme d'administration peut aussi être adaptée à une administration dans une cavité du corps.In one embodiment, the microorganisms are lyophilized. Lyophilization is carried out by a standard technique. The composition may then comprise a standard excipient and / or lyophilization stabilizer, and any other useful additive. The composition is preferably in an oral dosage form. This form may advantageously comprise an enteric form of administration, in particular an enteric capsule, an enteric capsule, a tablet comprising an enteric coating, encapsulation, eg microencapsulation, with a material providing enteric protection, the combination of at least two of these means of which at least one provides enteric protection, etc. The term enteric means that the form of administration protects the composition until it reaches the intestine. For example, the composition, in particular the lyophilizate of microorganisms, may be coated by means of protective agents, especially chosen in the usual manner from proteins, polysaccharides, gums, and other enteric coating agents. In one embodiment, a double coating is performed according to the teaching of EP 151453. The administration form may also be adapted for administration into a body cavity.
La forme d'administration peut aussi être adaptée à une administration par la voie rectale, par exemple suppositoire ou analogue. Dans ce mode de réalisation, les compositions selon l'invention contiennent de 10 à 1013 microorganismes. La présente invention a aussi pour objet une méthode de traitement destinée à diminuer la teneur en TMA chez un patient qui en a besoin.The form of administration may also be adapted for rectal administration, for example suppository or the like. In this embodiment, the compositions according to the invention contain from 10 to 1013 microorganisms. The present invention also relates to a method of treatment for decreasing the TMA content in a patient who needs it.
L'invention a donc pour objet une méthode pour diminuer ou supprimer la TMA au niveau intestinal et/ou dans le foie, comprenant l'administration à un patient qui en a besoin, d'une quantité suffisante d'une composition contenant un microorganisme exprimant une TMA méthyltransférase. Ce microorganisme est capable de métaboliser la triméthylamine (TMA) en présence d'hydrogène dans l'intestin. De préférence, le microorganisme exprime également une protéine corrinoïde acceptrice de groupement méthyle de TMA. De préférence encore, le microorganisme exprime également une hydrolase des sels biliaires, notamment une choloylglycine hydrolase. Dans un mode de réalisation, la composition comprend une Archaea méthanogène, notamment Methanomethylophilus alvus ou Methanomassiliicoccus luminyensis. Dans une premier mode de réalisation, l'invention concerne une méthode de traitement de la triméthylaminurémie. Le patient traité a un déficit en capacité à métaboliser la TMA. Notamment, il est déficient en enzyme FM03 active. Dans un deuxième mode de réalisation, l'invention concerne une méthode permettant de diminuer le taux du métabolite hépatique de la TMA, le TMAO, notamment le TMAO plasmatique. Cette méthode peut viser la prévention de la formation de plaques d'athérome et/ou la prévention des maladies cardiovasculaires. Le patient visé est soit un patient capable de métaboliser la TMA, soit un patient déficient en métabolisme de la TMA mais traité à l'aide d'un médicament permettant de rétablir un métabolisme de la TMA en TMAO, par exemple avec la composition selon l'invention. La métabolisation de la TMA, en amont, permet alors de limiter la production de TMAO par le foie. La méthode appliquée chez un patient déficient en métabolisme de la TMA permet de combiner les deux effets, métabolisme de la TMA ou traitement de la triméthylaminurémie, et diminution de la TMAO plasmatique, prévention de la formation de plaques d'athérome et/ou prévention des maladies cardiovasculaires. Dans un mode de réalisation préféré les microorganismes sont vivants. Dans un mode de réalisation, on administre au patient au moins une dose contenant une quantité suffisante de microorganismes pour obtenir l'effet recherché entre diminution du taux de TMA, diminution du taux de TMAO, ou encore combinaison des deux. Des doses supplémentaires peuvent être administrées de manière étalée dans le temps, notamment à intervalles de temps régulier, par exemple à chaque repas, pour maintenir l'effet recherché. Dans un autre mode de réalisation dans lequel le microorganisme est forcément vivant, on administre au patient soit au moins une dose immédiatement efficace pour obtenir l'effet recherché entre diminution du taux de TMA, diminution du taux de TMAO, ou encore combinaison des deux, soit une dose d'ensemencement, le développement intra-intestinal du microorganisme permettant ensuite d'obtenir l'effet recherché. Dans un mode de réalisation, le microorganisme s'implante dans l'intestin sur le long terme. On peut alors envisager une ou plusieurs (e.g. de 1 à 5) doses initiales, par exemple prises au moment des repas, puis des compléments à intervalles de temps régulier, ou après des épisodes de dérangement intestinal (diarrhées ou autres). Les compositions utilisées dans ces méthodes de traitement peuvent avoir les différentes caractéristiques développées supra. La présente invention a aussi pour objet une culture contenant une Archaea méthanogène dont l'ARN 16S est codé par la séquence ADN SEQ ID NO: 11 (souche 1 identifiée par les inventeurs) ou une séquence ayant plus de 90% d'identité, notamment ayant 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% d'identité, avec la SEQ ID NO 11. Ce microorganisme comprend le gène codant pour une TMA méthyltransférase ayant la séquence SEQ ID NO: 1, ou séquence équivalente telles que définie supra, le gène codant pour une protéine corrinoïde acceptrice de groupement méthyle de TMA, ayant la séquence SEQ ID NO: 5, ou séquence équivalente telles que définie supra, et le gène codant pour une choloylglycine hydrolase, ayant la séquence SEQ ID NO : 9, ou séquence équivalente telles que définie supra. Ce microorganisme comprend le gène codant pour une TMA méthyltransférase, ce gène ayant la séquence SEQ ID NO: 3, ou séquence équivalente telles que définie supra, le gène codant pour une protéine corrinoïde acceptrice de groupement méthyle de TMA, ce gène ayant la séquence SEQ ID NO : 7, ou séquence équivalente telles que définie supra, et le gène codant pour une choloylglycine hydrolase, ce gène ayant la séquence SEQ ID NO: 10, ou séquence équivalente telles que définie supra. Le génome de cette souche, dénommée ici Methanomethylophilus alvus, est présenté dans la SEQ ID NO: 13. La culture peut correspondre à un consortium de microorganismes, issu par exemple d'une mise en culture de selles de patient humain ou d'un animal, contenant entre autres Methanomethylophilus alvus, et de préférence, ce microorganisme représente plus de 10 %, de préférence plus de 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 % des microorganismes dans le consortium. Notamment, ce microorganisme représente dans le consortium, plus de 10 %, de préférence plus de 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 % des souches méthanogènes les plus fréquemment rencontrées chez l'homme (Methanobacteriales de type Methanobrevibacter smithii et Methanosphaera stadtmanae). La culture peut aussi être une culture pure de Methanomethylophilus alvus.The subject of the invention is therefore a method for reducing or eliminating TMA at the intestinal and / or liver level, comprising administering to a patient in need thereof, a sufficient quantity of a composition containing a microorganism expressing TMA methyltransferase. This microorganism is able to metabolize trimethylamine (TMA) in the presence of hydrogen in the intestine. Preferably, the microorganism also expresses a methyl acceptor corrinoid protein of TMA. More preferably, the microorganism also expresses a hydrolase of bile salts, especially a choloylglycine hydrolase. In one embodiment, the composition comprises a methanogenic Archaea, especially Methanomethylophilus alvus or Methanomassiliicoccus luminyensis. In a first embodiment, the invention relates to a method for treating trimethylaminuremia. The treated patient has a deficit in ability to metabolize TMA. In particular, it is deficient in active FM03 enzyme. In a second embodiment, the invention relates to a method for reducing the level of the hepatic metabolite of TMA, TMAO, including plasma TMAO. This method may be aimed at preventing the formation of atheroma plaques and / or the prevention of cardiovascular diseases. The target patient is either a patient capable of metabolizing TMA, or a patient deficient in metabolism of TMA but treated with a drug to restore a metabolism of TMA to TMAO, for example with the composition according to the invention. 'invention. The metabolism of TMA, upstream, allows to limit the production of TMAO by the liver. The method applied in a patient with a metabolic deficiency of TMA makes it possible to combine the two effects, metabolism of TMA or treatment of trimethylaminuremia, and decrease of plasma TMAO, prevention of atheroma plaque formation and / or prevention of cardiovascular illnesses. In a preferred embodiment the microorganisms are alive. In one embodiment, the patient is administered at least one dose containing a sufficient amount of microorganisms to achieve the desired effect between decreasing the TMA level, decreasing the TMAO level, or a combination of both. Additional doses may be administered over time, particularly at regular time intervals, for example at each meal, to maintain the desired effect. In another embodiment in which the microorganism is necessarily alive, the patient is administered at least one immediately effective dose to achieve the desired effect between decreasing the level of TMA, decreasing the level of TMAO, or a combination of both, or a seeding dose, the intra-intestinal development of the microorganism then making it possible to obtain the desired effect. In one embodiment, the microorganism implants in the intestine in the long term. One or more (e.g. from 1 to 5) initial doses may be considered, for example taken at mealtimes, then supplements at regular time intervals, or after episodes of intestinal disturbance (diarrhea or other). The compositions used in these methods of treatment may have the different characteristics developed supra. The subject of the present invention is also a culture containing a methanogenic archaea whose 16S RNA is encoded by the DNA sequence SEQ ID NO: 11 (strain 1 identified by the inventors) or a sequence having more than 90% identity, especially having 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 or 99% identity, with SEQ ID NO 11. This microorganism comprises the gene encoding a TMA methyltransferase having the sequence SEQ ID NO: 1 , or equivalent sequence as defined above, the gene coding for a TMA methyl acceptor corrinoid protein, having the sequence SEQ ID NO: 5, or equivalent sequence as defined above, and the gene coding for a choloylglycine hydrolase, having the sequence SEQ ID NO: 9, or equivalent sequence as defined above. This microorganism comprises the gene coding for a TMA methyltransferase, this gene having the sequence SEQ ID NO: 3, or equivalent sequence as defined above, the gene coding for a TMA methyl acceptor corrinoid protein, this gene having the sequence SEQ ID NO: 7, or equivalent sequence as defined above, and the gene coding for a choloylglycine hydrolase, this gene having the sequence SEQ ID NO: 10, or equivalent sequence as defined above. The genome of this strain, referred to herein as Methanomethylophilus alvus, is presented in SEQ ID NO: 13. The culture may correspond to a consortium of microorganisms, resulting for example from stool culture of a human patient or an animal. , containing among others Methanomethylophilus alvus, and preferably, this microorganism represents more than 10%, preferably more than 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90% of the microorganisms in the consortium. In particular, this microorganism represents, in the consortium, more than 10%, preferably more than 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90% of the methanogenic strains most frequently encountered in humans (methanobacteriales of the Methanobrevibacter type). smithii and Methanosphaera stadtmanae). The culture can also be a pure culture of Methanomethylophilus alvus.
La culture comprend un véhicule adapté. La culture est maintenue en conditions d'anaérobie.The culture includes a suitable vehicle. The culture is maintained under anaerobic conditions.
Liste des séquences : SEQ ID Acides aminés Nucléotides NO: 1 TMA méthyltransférase souche 1 2 TMA méthyltransférase souche 2 3 Gène codant pour la TMA méthyltransférase souche 1 4 Gène codant pour la TMA méthyltransférase souche 2 protéine corrinoïde acceptrice de groupement méthyle de TMA souche 1 6 protéine corrinoïde acceptrice de groupement méthyle de TMA souche 2 7 Gène codant pour la protéine corrinoïde acceptrice de groupement méthyle de TMA souche 1 8 Gène codant pour la protéine corrinoïde acceptrice de groupement méthyle de TMA souche 2 9 Hydrolase de sels biliaires souche 1 Gène codant pour hydrolase de sels biliaires souche 1 11 ADN codant pour l'ARN 16S souche 1 12 ADN codant pour l'ARN 16S souche 2 13 Génome souche 1 14 Amorce mttb Fw Amorce mttb Rv 16-21 Amorces L'invention va être maintenant décrite plus en détail à l'aide d'exemples de mise en oeuvre non limitatifs. Exemple 1 : Méthode d'isolement et de culture d'une Archaea méthanogène consommatrice de TMA : 1.1. méthode de détection moléculaire : Les méthodes de biologie moléculaire permettent de mettre en évidence et distinguer les Archaea méthanogènes consommatrices de TMA (appelées ici Methanomethylophilales) entre eux. Une première phase peut consister à mettre en évidence des Archaea méthanogènes à l'aide de l'ARN 16S en prenant les ARN 16S des souches 1 et 2 décrites supra, ou des ADN codant pour ces ARN16S, à l'aide des amorces appropriées. Une deuxième phase (ou première phase si la classification a déjà été réalisée) consiste à détecter la présence d'un gène mttb (ou mttB), et éventuellement, en plus, un gène mttc (ou mttC). Des amorces utilisables pour la détection du gène mttb sont les suivantes : Fw: SEQ ID NO: 14: GCACTTCCACCACATCG Rv: SEQ ID NO: 15: AGCTGRGACAGRACGAT Où R correspond à une base purique, A ou G Amplicon: 270-300 pb. 1.2. méthode de culture, d'enrichissement et d'isolement La culture / l'isolement est initialement réalisé à partir de selles fraiches, provenant d'un humain : cet humain peut être une personne chez laquelle préalablement la présence de méthanogènes en général, et de Methanomethylophilales en particulier aura été mise en évidence avec les techniques de détection moléculaire citées ci-dessus (à partir d'ADN extraits de ces selles, selon les méthodologies standards= par le kit QIAGen DNA Stool Kit). Alternativement, la mise en évidence de la présence de Methanomethylophilales pourra être réalisée en parallèle de la mise en culture, selon cette même méthodologie. Toutes les manipulations sont effectuées en conditions stériles et anaérobie stricte (flux de N2). Les selles, une fois récupérées sont traitées immédiatement. Sinon, alternativement, leur conservation peut être réalisée avant emploi, plusieurs heures à 4°C, en pot fermé, dans lequel une anaérobie a été instaurée, sans modification dramatique apparente sur les résultats et la survie des méthanogènes dans l'échantillon.List of sequences: SEQ ID Amino acids Nucleotides NO: 1 TMA methyltransferase strain 1 2 TMA methyltransferase strain 2 3 Gene coding for TMA methyltransferase strain 1 4 Gene coding for TMA methyltransferase strain 2 tMA methyl acceptor corrinoid protein strain 1 6 TMA methyl acceptor corrinoid protein strain 2 7 Gene encoding TMA methyl moiety acceptor corrinoid protein strain 1 8 Gene encoding tMA methyl acceptor corrinoid protein strain 2 9 Bile salt hydrolase strain 1 Gene encoding TMA bile salt hydrolase strain 1 11 DNA encoding 16S RNA strain 1 12 DNA encoding 16S RNA strain 2 13 Genome strain 1 14 Mttb primer Fw Mttb primer Rv 16-21 Primers The invention will now be described further in detail using non-limiting examples of implementation. EXAMPLE 1 Method of Isolation and Culture of a Methanogenic Archaea Consuming TMA 1.1. Molecular detection method: The methods of molecular biology make it possible to highlight and distinguish methanogenic archaea consuming TMA (here called Methanomethylophilales) between them. A first phase may consist in demonstrating methanogenic archaea using 16S RNA by taking the 16S RNAs of the strains 1 and 2 described above, or the DNAs coding for these 16S RNAs, using the appropriate primers. A second phase (or first phase if the classification has already been performed) consists in detecting the presence of an mttb (or mttB) gene, and optionally, in addition, an mttc (or mttC) gene. Primers usable for the detection of the mttb gene are as follows: Fw: SEQ ID NO: 14: GCACTTCCACCACATCG Rv: SEQ ID NO: 15: AGCTGRGACAGRACGAT Where R corresponds to a purine base, A or G Amplicon: 270-300 bp. 1.2. method of culture, enrichment and isolation The culture / isolation is initially made from fresh stool, from a human: this human can be a person in which beforehand the presence of methanogens in general, and of Methanomethylophilales in particular will have been demonstrated with the molecular detection techniques mentioned above (from DNA extracted from these stools, according to the standard methodologies = by the kit QIAGen DNA Stool Kit). Alternatively, the detection of the presence of Methanomethylophilales may be performed in parallel with the culturing, according to this same methodology. All manipulations are performed under sterile conditions and strict anaerobic (N2 flow). Stool, once recovered are treated immediately. Alternatively, alternatively, their preservation can be carried out before use, several hours at 4 ° C, in closed pot, in which an anaerobic was instituted, without apparent dramatic change in the results and survival of the methanogens in the sample.
Environ 500 à 600 mg de selles sont récupérés à l'aide d'une seringue 1 ml insuline, dont l'extrémité est coupée (soit environ 0.4 ml). Ils sont placés dans 10 ml de milieu 141 DSMZ (Methanogenium medium) spécifique pour les microorganismes méthanogènes, en atmosphère H2/CO2 (80/20, pression de 2 atm.) en fiole antibiotique de 60 ml.Approximately 500 to 600 mg of stool is recovered using a 1 ml insulin syringe, the end of which is cut off (approximately 0.4 ml). They are placed in 10 ml of medium 141 DSMZ (Methanogenium medium) specific for methanogenic microorganisms, in H2 / CO2 atmosphere (80/20, pressure of 2 atm.) In a 60 ml antibiotic vial.
Pour favoriser le développement des Methanomethylophilales, et ainsi enrichir la culture en consortium, on dispose en plus dans le tube : - d'un substrat spécifique de ce groupe = méthanol (à 80 mM final), - ou, alternativement, d'une de ses « sources » naturelles dans le colon humain, à savoir la pectine qui sera hydrolysée par d'autres microbes du consortium (et potentiellement les Methanomethylophilales) de manière à donner entre autres du méthanol. - Divers antibiotiques tels que l'ampicilline (100 mg/L), et/ou la rifampicine (100 mg/L) ; Dridi et al (supra) ont proposé divers antibiotiques pour lesquels Methanomassiiiicoccus luminyensis est résistant.To promote the development of Methanomethylophilales, and thus enrich the culture in consortium, is additionally available in the tube: - a specific substrate of this group = methanol (at 80 mM final), - or, alternatively, one of its natural "sources" in the human colon, namely pectin which will be hydrolysed by other microbes of the consortium (and potentially Methanomethylophilales) so as to give among others methanol. - Various antibiotics such as ampicillin (100 mg / L), and / or rifampicin (100 mg / L); Dridi et al (supra) have proposed various antibiotics for which Methanomassiiiicoccus luminyensis is resistant.
Cette culture est ensuite réalisée à 37°C, sous agitation légère ; le suivi de la culture est assuré continuellement, par PCR quantitative, de préférence quotidiennement. Selon les types de souches de Methanomethylophilales, divers temps de doublement sont observés, et peuvent varier du simple au triple, voire davantage. A titre d'exemple, le cas de figure rencontré avec des selles d'un patient porteur de Methanomethylophilus alvus est illustré, depuis l'inoculation d'un échantillon de selles. Il s'agit d'un patient présentant 106 nombre de copies de gènes 16S rRNA /ml de culture de Methanobrevibacter smithii (Mbs), 10 fois plus de M. alvus (Mx), et encore 10 fois plus de bactéries (selles au moment de la mise en culture, temps 0). Dans les premiers jours d'une culture en milieu standard, sans apport de pectine ou de méthanol, les Mbs et certaines bactéries se développent beaucoup plus vite et supplantent Mx, avant une stabilisation et un développement retardé de Mx, à des taux se rapprochant de la quantité initiale dans l'échantillon. Ce taux peut être amélioré en ajoutant du méthanol, ou même de la pectine, substrat générateur de méthanol, comme dans ce cas au jour 20: on observe alors une nette amélioration de la proportion de Mx au cours du temps par rapport aux bactéries et à Mbs. Cette méthode peut être répétée : lors du suivi (de préférence quotidien), il est alors possible de déterminer le meilleur moment pour repiquer le consortium ou simplement re-supplémenter la culture en méthanol / pectine (par exemple sur une phase de plateau observée à partir du jour 20). Après un certain nombre de cycle d'enrichissement, on est en mesure de réaliser des isolements d'une souche de Mx à partir de ce mélange, par cultures individualisées d'un clone de ce milieu liquide en consortium. Ceci est effectué par la méthode des Roll-Tubes, méthode qui permet, en anaérobie, d'obtenir des colonies isolées en milieu solide DSMZ 141 + agar, en présence de méthanol (atmosphère anaérobie, contenant au moins de l'H2). Dans cette culture en milieu solide, les premières colonies qui apparaissent (Ière semaine) ne sont pas les Mx recherchés. Les colonies, petites, qui apparaissent par la suite (notamment après 2 ou 3 semaines de culture), sont récupérées et servent à inoculer individuellement, colonie par colonie, des tubes de milieu DSMZ-141. En parallèle, on détermine, par PCR quantitative, si la colonie repiquée est ou non un Mx. Dans le cas positif, l'isolement est alors réalisé, la culture repiquée selon la vitesse de croissance de Mx en milieu liquide 141 supplémenté avec du méthanol, sous atmosphère H2/CO2. La pureté de la souche isolée peut alors être vérifiée, soit en re-isolant, selon la méthode décrite ci-dessus (colonies isolées en milieu solide selon la technique des Roll-Tube), soit en analysant les courbes de dissociation obtenues sur les amplicons des -PCR quantitatives. 1.3. Protocole de quantification rapide de liqnées procaryotiques en culture Ce protocole sert au suivi en parallèle des Methanomethylophilales ou Mmp (Mx=M. alvus, M. luminyensis, autres), des Methanobacteriales (Mbac, telles que Methanobrevibacter smithii ou Methanosphaera stadtmanae) et des bactéries totales (Bac) dans les cultures d'enrichissement afin de définir les meilleures conditions pour la croissance de M. alvus et Mx/. - Principe : Lyse d'un petit aliquote (0,1 à 0,2 ml) de culture à haute température + choc osmotique Réduction de la concentration des inhibiteurs de PCR par centrifugation et dilution du surnageant Quantification des groupes d'intérêts en PCRq Les gammes étalons de quantification sont préparées à l'avance, et consistent en des amplicons PCR, réalisés avec les amorces décrites, purifiées et quantifiées selon les méthodes classiques. - Matériel : Centrifugeuse (mettre à 4°C) Thermomixeur (mettre à 99°C) Thermocycleur - Amorces Mmp, Mbac et Bac: MxF (AS-05_Fw ; 77) : ggg gTA ggg gTA AAA TCC TG (SEQ ID NO: 16) MxR (AS-06_Rv; 78) : Cgg ggT ATC TAA TCC CgT TT (SEQ ID NO: 17) MbacF (MbS-01_Fw; 75) : gCg AAC Cgg ATT AgA TAC CC (SEQ ID NO: 18) MbacR (MbS-02_Rv; 76) : AgT CTT gCg ACC gTA CTT CC (SEQ ID NO: 19) BacF (ES-06_Fw; 71) : ACT CCT ACg ggA ggC Ag (SEQ ID NO : 20) BacR (ES-07_Rv; 72) : gTA TTA CCg Cgg CTg CTg (SEQ ID NO : 21) Note : Les amorces MxF et MxR ciblent à la fois les Methanomethylophilales proches de M. alvus et celles proches de M. luminyensis. Il est possible de déterminer laquelle de ces lignées domine sur l'autre (ou s'il y a codominance), de manière qualitative, par l'observation des courbe de dissociations : les amplicons de M. alvus se dissocient autour de 84°C alors que ceux de M. luminyensis se dissocient autour de 85,5°C. Cette différence de température de dissociation n'a pas été clairement définie pour les Methanobacteriales. - Composition du Mix : Utilisation du kit Eurogentec MESA GREEN qPCR Master Mix Mix Volume (pl) Volume final 18 Master Mix 9 Amorce F 0,8 Amorce R 0,8 H20 5,4 ADNg 2 - Condition de la PCRq avec les amorces ci-dessus : Premier segment : 95 °C pendant 10 min Second segment : 95 °C pendant 30 sec 59 °C pendant 20 sec 72 °C pendant 30 sec 80 °C pendant 20 sec lecture de la fluo Troisième segment (courbe de dissociation, défini par l'appareil): 95 °C pendant 1 min 59 °C pendant 30 sec 95 °C pendant 30 sec Note : la lecture se fait à 80°C afin que l'ADN double brin aspécifique soit dénaturé (autour de 76 °C) avant la lecture. - Extraction à la chaleur et préparation de la quantification par PCRq - Annoter tous les tubes avant de sortir les cultures de l'étuve - Transférer un peu plus de 100 pl de culture (avec une seringue 1m1 et une aiguille bleue, traversant le septum du tube de culture anaérobie) dans un tube Eppendorf - Re-transférer 100 pl de ce prélèvement (avec une P100) dans un autre tube - Centrifuger à 16000g; 4°C ; 10 min ; ceci permet de culoter les cellules, et de se débarrasser d'inhibiteurs présents dans le milieu de culture - Pendant la centrifugation, mettre 90 pl d'eau milliQ dans des Eppendorf de 1,5 ml - Remplacer le surnageant par 100 pl d'H20 distillée ; permet d'enlever les ADN libres des cellules mortes, les inhibiteurs de PCR, de créer un choc osmotique qui facilite la lyse car les cellules culotées se retrouvent dans un milieu très peu concentré - Ajouter une pointe de spatule de billes de verre de 0,2 pm, et vortexer 5 s - Placer dans le Thermomixeur ; 99°C sans agitation pendant 3min, avec agitation 1400 tr/min pendant 7 min, sans agitation pendant 10 min ; les cellules sont lysées par la chaleur - Préparer le mix PCR en mélangeant l'eau et les amorces. - Centrifuger à 16000g; 4°C ; 10 min ; les débris cellulaires sont culotés et le contenu dissous des cellules, dont l'ADN, reste dans le surnageant. - Ajouter le master mix dans le mix PCR, et commencer à le répartir sur la plaque. - Reprendre 10 pl de surnageant dans un tube propre et l'ajouter aux 90 pl d'eau milliQ ; - Placer les tubes dans la glace jusqu'à la quantification. - A partir de l'appareil de PCRq, sur l'ordinateur, lancer le logiciel MxPro et choisir « Sybr assay with dissociation curve » pour permettre le préchauffage de la lampe pendant la répartition des ADNg sur la plaque PCR. - Répartir les échantillons d'ADNg sur la plaque. - Vérifier que tous les puits sont bien fermés. - Centrifuger la plaque à 500g max. pendant 5 s pour faire descendre les mix au fond des puits. - Rentrer le programme PCR et le plan de plaque dans le logiciel. Exemple 2: Préparation d'une composition : La culture finale obtenue à l'exemple 1.1, contenant le microorganisme méthanogène de l'invention, est utilisée pour préparer une composition administrable. Elle est cependant de préférence utilisable comme stock, pour effectuer des cultures en anaérobie et en présence d'hydrogène et d'un substrat contenant du méthanol, propager le microorganisme et préparer des lots pour la fabrication de la composition selon l'invention. Le milieu et les conditions de culture sont alors celles décrites précédemment (milieu DSM 141, supplémenté en méthanol, sous atmosphère anaérobie contenant du H2). Les cultures obtenues, sont éventuellement concentrées, et sont lyophilisées, avant d'être incorporées à des gélules entériques. Exemple 3: Préparation d'une composition : On réalise une culture de la souche DSM No. 25720, et les cultures sont utilisées pour préparer des lots pour la fabrication de la composition selon l'invention. Les cultures sont effectuées en anaérobie et en présence d'hydrogène et d'un substrat contenant du méthanol (par exemple, milieu DSM 141, supplémenté en méthanol, sous atmosphère anaérobie contenant du H2). Les cultures obtenues, sont éventuellement concentrées, et sont lyophilisées, avant d'être incorporées à des gélules entériques.This culture is then carried out at 37 ° C., with gentle stirring; the monitoring of the culture is ensured continuously, by quantitative PCR, preferably daily. Depending on the types of strains of Methanomethylophilales, various doubling times are observed, and may vary from one to three times, or more. For example, the case encountered with stool of a patient carrying Methanomethylophilus alvus is illustrated, since the inoculation of a stool sample. This is a patient with 106 copies of 16S rRNA genes / ml of Methanobrevibacter smithii (Mbs) culture, 10 times more M. alvus (Mx), and 10 times more bacteria (stool at the time of cultivation, time 0). In the early days of standard culture, without the addition of pectin or methanol, Mbs and some bacteria grow much faster and supersede Mx, before stabilization and delayed development of Mx, at rates approaching the initial amount in the sample. This level can be improved by adding methanol, or even pectin, methanol generating substrate, as in this case on day 20: there is then a clear improvement in the proportion of Mx over time relative to the bacteria and Mbs. This method can be repeated: during monitoring (preferably daily), it is then possible to determine the best time to transplant the consortium or simply re-supplement the methanol / pectin culture (for example on a plateau phase observed from of day 20). After a number of enrichment cycles, it is possible to carry out isolations of a strain of Mx from this mixture, by individualized cultures of a clone of this liquid medium consortium. This is done by the Roll-Tubes method, which allows, anaerobically, to obtain isolated colonies in solid medium DSMZ 141 + agar, in the presence of methanol (anaerobic atmosphere, containing at least H2). In this culture in solid medium, the first colonies that appear (first week) are not the desired Mx. The small colonies, which appear later (especially after 2 or 3 weeks of culture), are recovered and used to inoculate colony colony individually tubes of DSMZ-141 medium. In parallel, it is determined, by quantitative PCR, whether or not the transplanted colony is an Mx. In the positive case, the isolation is then carried out, the culture subcultured according to the growth rate of Mx in a liquid medium 141 supplemented with methanol, under an H2 / CO2 atmosphere. The purity of the isolated strain can then be verified, either by re-isolating, according to the method described above (colonies isolated in solid medium according to the Roll-Tube technique), or by analyzing the dissociation curves obtained on the amplicons. quantitative -PCRs. 1.3. Rapid Quantification Protocol for Prokaryotic Proteins in Culture This protocol is used for the parallel monitoring of Methanomethylophilales or Mmp (Mx = M, alvus, M. luminyensis, others), Methanobacteriales (Mbac, such as Methanobrevibacter smithii or Methanosphaera stadtmanae) and bacteria. total (Bac) in enrichment cultures to define the best conditions for the growth of M. alvus and Mx /. - Principle: Lysis of a small aliquot (0.1 to 0.2 ml) of culture at high temperature + osmotic shock Reduction of the concentration of PCR inhibitors by centrifugation and dilution of the supernatant Quantification of interest groups in PCRq quantization standard ranges are prepared in advance, and consist of PCR amplicons, made with the primers described, purified and quantified according to conventional methods. - Material: Centrifuge (set to 4 ° C) Thermomixer (set to 99 ° C) Thermocycler - Primers Mmp, Mbac and Bac: MxF (AS-05_Fw; 77): ggg gTA ggg gTA AAA TCC TG (SEQ ID NO: 16 MxR (AS-06_Rv; 78): Cgg ATC GGT TAA TCC CgT TT (SEQ ID NO: 17) MbacF (MbS-01_Fw; 75): gCg AAC Cgg ATT AgA CC TAC (SEQ ID NO: 18) MbacR (MbS -02_Rv; 76): AgT CTT gCg ACC gTA CTT CC (SEQ ID NO: 19) BacF (ES-06_Fw; 71): ACT CCT ACg ggA ggC Ag (SEQ ID NO: 20) BacR (ES-07_Rv; 72) Note: The MxF and MxR primers target both Methanomethylophilales close to M. alvus and those close to M. luminyensis. It is possible to determine which of these lines dominates the other (or if there is codominance), qualitatively, by observing the dissociation curve: the amplicons of M. alvus dissociate around 84 ° C while those of M. luminyensis dissociate around 85.5 ° C. This difference in dissociation temperature has not been clearly defined for Methanobacteriales. - Composition of the Mix: Use of the Eurogentec Kit MESA GREEN qPCR Master Mix Mix Volume (pl) Final Volume 18 Master Mix 9 Primer F 0.8 Primer R 0.8 H20 5.4 ADNg 2 - Condition of the PCRq with the primers ci above: First segment: 95 ° C for 10 min Second segment: 95 ° C for 30 sec 59 ° C for 20 sec 72 ° C for 30 sec 80 ° C for 20 sec reading the fluo Third segment (dissociation curve, defined by the device): 95 ° C for 1 min 59 ° C for 30 sec 95 ° C for 30 sec Note: the reading is at 80 ° C so that the aspecific double-stranded DNA is denatured (around 76 °) C) before reading. - Extraction with heat and preparation of the quantification by PCRq - Annotate all the tubes before exiting the cultures of the oven - Transfer a little more than 100 μl of culture (with a 1m1 syringe and a blue needle, crossing the septum of the anaerobic culture tube) in an Eppendorf tube - Re-transfer 100 μl of this specimen (with one P100) into another tube - Centrifuge at 16000g; 4 ° C; 10 minutes ; this allows to pellet the cells, and to get rid of inhibitors present in the culture medium - During centrifugation, put 90 μl of milliQ water in 1.5 ml Eppendorf - Replace the supernatant with 100 μl of H20 distilled; allows free DNAs to be removed from dead cells, PCR inhibitors, to create an osmotic shock that facilitates lysis as the pelleted cells end up in a very low concentration medium - Add a spatula tip of 0 glass beads, 2 pm, and vortex 5 s - Place in the Thermomixer; 99 ° C without stirring for 3 min, with stirring 1400 rpm for 7 min, without stirring for 10 min; cells are lysed by heat - Prepare PCR mix by mixing water and primers. - Centrifuge at 16000g; 4 ° C; 10 minutes ; the cell debris is pelleted and the dissolved contents of the cells, including the DNA, remain in the supernatant. - Add the master mix in the PCR mix, and start spreading it on the plate. - Take up 10 μl of supernatant in a clean tube and add it to 90 μl of milliQ water; - Place the tubes in ice until quantification. - From the PCRq device, on the computer, launch the MxPro software and choose "Sybr assay with dissociation curve" to allow preheating of the lamp during the distribution of the gDNAs on the PCR plate. - Distribute the gDNA samples on the plate. - Check that all wells are closed. - Centrifuge the plate at 500g max. for 5 seconds to bring the mix down to the bottom of the wells. - Enter the PCR program and the plate plan in the software. Example 2 Preparation of a Composition: The final culture obtained in Example 1.1, containing the methanogenic microorganism of the invention, is used to prepare a manageable composition. However, it is preferably used as a stock, to carry out anaerobic cultures and in the presence of hydrogen and of a substrate containing methanol, to propagate the microorganism and to prepare batches for the manufacture of the composition according to the invention. The medium and the culture conditions are then those described previously (DSM 141 medium, supplemented with methanol, under an anaerobic atmosphere containing H2). The cultures obtained are optionally concentrated and lyophilized before being incorporated into enteric capsules. Example 3 Preparation of a Composition: A culture of strain DSM No. 25720 is carried out, and the cultures are used to prepare batches for the manufacture of the composition according to the invention. The cultures are performed anaerobically and in the presence of hydrogen and a substrate containing methanol (for example, DSM 141 medium, supplemented with methanol, under an anaerobic atmosphere containing H2). The cultures obtained are optionally concentrated and lyophilized before being incorporated into enteric capsules.
Claims (9)
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR1261507A FR2998799B1 (en) | 2012-11-30 | 2012-11-30 | USE OF MICROORGANISMS TO DECREASE TRIMETHYLAMINE RATE IN INTESTINES, TREATMENT OF TRIMETHYLAMINUREMIA AND PREVENTION OF ATHEROMIC PLATE FORMATION |
| PCT/EP2013/070249 WO2014082773A1 (en) | 2012-11-30 | 2013-09-27 | Use of microorganisms for reducing the level of trimethylamine in a human body cavity, in particular for the treatment of trimethylaminuria or of bacterial vaginosis and the prevention of cardiovascular diseases |
| US14/648,186 US10238695B2 (en) | 2012-11-30 | 2013-09-27 | Use of microorganisms for reducing the level of trimethylamine in a human body cavity, in particular for the treatment of trimethylaminuria or of bacterial vaginosis and the prevention of cardiovascular diseases |
| CA2893265A CA2893265A1 (en) | 2012-11-30 | 2013-09-27 | Use of microorganisms for reducing the level of trimethylamine in a human body cavity in particular for the treatment of trimethylaminuria or of bacterial vaginosis and the prevention of cardiovascular diseases |
| CN201380069004.9A CN104918633A (en) | 2012-11-30 | 2013-09-27 | Use of microorganisms for reducing the level of trimethylamine in a human body cavity, in particular for the treatment of trimethylaminuria or of bacterial vaginosis and the prevention of cardiovascular diseases |
| EP13766995.8A EP2925346A1 (en) | 2012-11-30 | 2013-09-27 | Use of microorganisms for reducing the level of trimethylamine in a human body cavity, in particular for the treatment of trimethylaminuria or of bacterial vaginosis and the prevention of cardiovascular diseases |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR1261507A FR2998799B1 (en) | 2012-11-30 | 2012-11-30 | USE OF MICROORGANISMS TO DECREASE TRIMETHYLAMINE RATE IN INTESTINES, TREATMENT OF TRIMETHYLAMINUREMIA AND PREVENTION OF ATHEROMIC PLATE FORMATION |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2998799A1 true FR2998799A1 (en) | 2014-06-06 |
| FR2998799B1 FR2998799B1 (en) | 2015-09-04 |
Family
ID=47741094
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR1261507A Expired - Fee Related FR2998799B1 (en) | 2012-11-30 | 2012-11-30 | USE OF MICROORGANISMS TO DECREASE TRIMETHYLAMINE RATE IN INTESTINES, TREATMENT OF TRIMETHYLAMINUREMIA AND PREVENTION OF ATHEROMIC PLATE FORMATION |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| FR (1) | FR2998799B1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111693687A (en) * | 2020-05-28 | 2020-09-22 | 长沙都正生物科技有限责任公司 | Preparation method of biological negative sample and biological standard substance and TMAO detection method |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1992020789A1 (en) * | 1991-05-10 | 1992-11-26 | Forschungszentrum Jülich GmbH | Process for obtaining dimethyl amine or trimethyl amine dehydrogenases, dehydrogenases obtained thereby and their use |
| WO2010138899A2 (en) * | 2009-05-28 | 2010-12-02 | The Cleveland Clinic Foundation | Trimethylamine-containing compounds for diagnosis and prediction of disease |
-
2012
- 2012-11-30 FR FR1261507A patent/FR2998799B1/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1992020789A1 (en) * | 1991-05-10 | 1992-11-26 | Forschungszentrum Jülich GmbH | Process for obtaining dimethyl amine or trimethyl amine dehydrogenases, dehydrogenases obtained thereby and their use |
| WO2010138899A2 (en) * | 2009-05-28 | 2010-12-02 | The Cleveland Clinic Foundation | Trimethylamine-containing compounds for diagnosis and prediction of disease |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| BÉDIS DRIDI ET AL: "Age-related prevalence of Methanomassiliicoccus luminyensis in the human gut microbiome", APMIS, 1 March 2012 (2012-03-01), pages n/a - n/a, XP055036242, ISSN: 0903-4641, DOI: 10.1111/j.1600-0463.2012.02899.x * |
| CHALMERS R A ET AL: "Diagnosis and management of trimethylaminuria (FMO3 deficiency) in children", JOURNAL OF INHERITED METABOLIC DISEASE, KLUWER ACADEMIC PUBLISHERS, DO, vol. 29, no. 1, 1 February 2006 (2006-02-01), pages 162 - 172, XP019232735, ISSN: 1573-2665, DOI: 10.1007/S10545-006-0158-6 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111693687A (en) * | 2020-05-28 | 2020-09-22 | 长沙都正生物科技有限责任公司 | Preparation method of biological negative sample and biological standard substance and TMAO detection method |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2998799B1 (en) | 2015-09-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| WO2014082773A1 (en) | Use of microorganisms for reducing the level of trimethylamine in a human body cavity, in particular for the treatment of trimethylaminuria or of bacterial vaginosis and the prevention of cardiovascular diseases | |
| EP3609514B1 (en) | Consortia of living bacteria and its use in the treatment of microbiome dysbiosis | |
| FR3063647B1 (en) | SPECIFIC BACTERIA FOR THEIR USE AS A MEDICAMENT ESPECIALLY FOR COMBATING OVERWEIGHT, OBESITY, CARDIOMETABOLIC DISEASES AND INFLAMMATORY BOWEL DISEASES | |
| AU2016344770A1 (en) | Faecalibacterium prausnitzii and Desulfovibrio piger for use in the treatment or prevention of diabetes and bowel diseases | |
| EP3164144B1 (en) | Lactobacillus composition allowing the stimulation of human and animal juvenile growth in cases of malnutrition | |
| CN116904376A (en) | A highly salt-tolerant Bacillus cereus strain, microbial agents and their applications | |
| Song et al. | Acute effects of the environmental probiotics Rhodobacter sphaeroides on intestinal bacteria and transcriptome in shrimp Penaeus vannamei | |
| TW202120683A (en) | Methods and compositions for culturing hemoglobin-dependent bacteria | |
| Younes et al. | Metagenomic analysis of gut microbiome from tilapia species across several regions in Japan | |
| FR3008317A1 (en) | USE OF MICROORGANISMS TO DECREASE THE TRIMETHYLAMINE RATE IN A HUMAN BODY CAVITY, IN PARTICULAR FOR THE TREATMENT OF TRIMETHYLAMINURIA OR BACTERIAL VAGINOSIS AND THE PREVENTION OF CARDIOVASCULAR DISEASES | |
| FR2998799A1 (en) | Composition, useful to e.g. eliminate trimethylamine in the intestine and liver, comprises a microorganism expressing a trimethylamine methyltransferase, capable of metabolizing trimethylamine in the presence of hydrogen in the intestine | |
| CA2235709C (en) | Absorbable dietary composition for improving the biological balance of intestinal tract flora | |
| WO2020188181A1 (en) | Novel lactic acid bacteria strains that promote the absorption of calcium - peptides and associated products | |
| JP2025523691A (en) | Solid or semi-solid composition for administration to ruminants comprising a virus capable of suppressing in vivo methane production in ruminants - Patent Application 20070123333 | |
| FR3003169A1 (en) | USE OF MICROORGANISMS TO DECREASE THE TRIMETHYLAMINE RATE IN A HUMAN BODY CAVITY, IN PARTICULAR FOR THE TREATMENT OF TRIMETHYLAMINURIA OR BACTERIAL VAGINOSIS AND THE PREVENTION OF CARDIOVASCULAR DISEASES | |
| WO2022090279A1 (en) | Saccharomyces cerevisiae yeast for the prevention and/or treatment of parasitic diseases | |
| FR3047640A1 (en) | PROBIOTIC COMPOSITION FOR PROMOTING JUVENILE GROWTH IN ANIMAL BREEDING ANIMALS | |
| Zou et al. | Exploring the Roles of Tuna‐Associated Acinetobacter sp. YFT067: Implications for Host Health and Metabolism | |
| FR2741509A1 (en) | Improving intestinal tract flora | |
| Ezzedine | Focus on Bdellovibrio and like organisms in lake and marine environments: diversity, abundance and role of the only obligate bacterial predators | |
| Sun et al. | Identification of the gut commensal Candida parapsilosis as a causative fungus for the development of high fat-diet induced obesity in mice | |
| FR3059678A1 (en) | LACTIC ACID BACTERIA USEFUL IN TREATING METABOLIC DISEASES, IN PARTICULAR TYPE 2 DIABETES | |
| RU2797466C2 (en) | Faecalibacterium prausnitzii and desulfovibrio piger for use in the treatment or prevention of diabetes and intestinal diseases | |
| CN121022621A (en) | A different type of Corynebacterium and its application in improving obesity or its metabolic-related diseases | |
| De Decker | Résistance de la crevette Litopenaeus stylirostris à la bactérie pathogène Vibrio penaeicida: Physiologie, immunologie et pathologie comparées d’une population sélectionnée sur un critère de survie aux épisodes de mortalité et d’une population témoin non sélectionnée. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 4 |
|
| PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 5 |
|
| PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 6 |
|
| PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 7 |
|
| PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 8 |
|
| PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 9 |
|
| PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 10 |
|
| ST | Notification of lapse |
Effective date: 20230705 |