FR2807446A1 - LACTOCOCCUS LACTIS GENOMES, POLYPEPTIDES AND USES - Google Patents
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Abstract
Description
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La présente invention a pour objet la séquence génomique et des séquences nucléotidiques codant pour des polypeptides de Lactococcus lactis IL1403. Les polypeptides décrits dans la présente invention sont, de façon non limitative, des polypeptides d'enveloppe cellulaire, des polypeptides impliqués dans les différents cycles du métabolisme de Lactococcus lactis ou dans les processus de réplication et de sensibilité ou de résistance aux phages, ou sécrétés. The present invention relates to the genomic sequence and nucleotide sequences encoding polypeptides of Lactococcus lactis IL1403. The polypeptides described in the present invention are, without limitation, cell envelope polypeptides, polypeptides involved in the different cycles of Lactococcus lactis metabolism or in the processes of replication and sensitivity or resistance to phages, or secreted. .
L'invention concerne également l'utilisation de la séquence génomique et/ou des séquences nucléotidiques et/ou polypeptidiques décrites dans la présente invention pour l'analyse de l'expression de gènes, et l'identification de gènes homologues chez des espèces proches de Lactococcus lactis. The invention also relates to the use of the genomic sequence and / or of the nucleotide and / or polypeptide sequences described in the present invention for the analysis of the expression of genes, and the identification of homologous genes in species close to Lactococcus lactis.
L'invention concerne également différents outils qui permettent d'identifier la présence de Lactococcus lactis ou d'espèces avoisinantes dans des échantillons biologiques. The invention also relates to various tools which make it possible to identify the presence of Lactococcus lactis or neighboring species in biological samples.
Par ailleurs, l'invention concerne également des souches de Lactococcus lactis ou d'espèces proches de Lactococcus lactis, modifiées par mutagenèse et/ou introduction de gènes spécifiques de L. lactis, afin d'augmenter les propriétés industrielles desdites souches. Furthermore, the invention also relates to strains of Lactococcus lactis or of species close to Lactococcus lactis, modified by mutagenesis and / or introduction of specific genes of L. lactis, in order to increase the industrial properties of said strains.
Lactococcus lactis est une bactérie gram positive à bas GC%, catalase négative, asporogène et anaérobie facultative. Elle est membre du groupe des Streptococceae auquel appartient aussi entre autre les bactéries des genres Enterococcus, Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus. De nombreuses souches de ces genres sont utilisées dans l'industrie alimentaire, mais aussi dans des fabrications spécialisées. Lactococcus est l'une des bactéries les mieux caractérisées de ce groupe, tant au niveau métabolique que génétique. Ces bactéries produisent Lactococcus lactis is a low GC%, catalase negative, asporogenic and facultative anaerobic gram positive bacterium. It is a member of the Streptococceae group to which also belongs, among others, bacteria of the genera Enterococcus, Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus. Many strains of these genera are used in the food industry, but also in specialized manufacturing. Lactococcus is one of the best characterized bacteria of this group, both metabolically and genetically. These bacteria produce
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principalement du lactate à partir des sucres lors des fermentation alimentaires et sont donc couramment nommées "bactéries lactiques". Les bactéries lactiques sont en général non pathogènes et sont ajoutées comme ferments pour la production d'aliments fermentés. En particulier, L. lactis est utilisé comme ferment pour la production de fromages, de beurre et de nombreux autres produits laitiers. Les souches de L. lactis sont en général capables de pousser rapidement dans le lait. mainly lactate from sugars during food fermentation and are therefore commonly called "lactic acid bacteria". Lactic acid bacteria are generally non-pathogenic and are added as ferments for the production of fermented foods. In particular, L. lactis is used as a ferment for the production of cheese, butter and many other dairy products. Strains of L. lactis are generally able to grow rapidly in milk.
Cette propriété est conférée entre autre par leur capacité à utiliser le lactose comme source de sucre et les protéines du lait comme source d'acides aminés. Ces gènes sont portés par des plasmides dont la perte provoque un chute de la vitesse de croissance des souches dans le lait. This property is conferred among other things by their ability to use lactose as a source of sugar and milk proteins as a source of amino acids. These genes are carried by plasmids, the loss of which causes a drop in the growth rate of the strains in milk.
L'importance de L. lactis pour l'industrie a suscité de nombreuses études en particulier durant ces 15 dernières années. Cela a conduit à la construction de nombreux outils d'étude et de modification génétique pour cette bactérie. Ces études ont aussi permis d'accumuler de nombreuses connaissances sur sa génétique et sa physiologie. La plupart de ces études furent conduites sur deux groupes de souches dont les représentants de laboratoire les plus connus sont les souches IL1403 et MG1363. Ces deux souches sont génétiquement représentatives des deux principales sous espèces utilisées dans l'industrie, L. lactis subsp. lactis et subsp. cremoris. The importance of L. lactis for the industry has given rise to numerous studies, in particular during the last 15 years. This has led to the construction of numerous study and genetic modification tools for this bacterium. These studies have also made it possible to accumulate a great deal of knowledge on its genetics and physiology. Most of these studies were conducted on two groups of strains, the best known laboratory representatives of which are strains IL1403 and MG1363. These two strains are genetically representative of the two main subspecies used in industry, L. lactis subsp. lactis and subsp. cremoris.
Une étude décrivant la variabilité génétique au sein de l'espèce L. lactis a été publiée (Tailliez et al, System. Appl. Microbiol., 21 : 530-538,1998). Elle révèle que les souches industrielles peuvent être réparties en 3 groupes. La souche IL1403 (déposée à la CNCM sous le numéro 1-2438) dont la séquence est un objet de la présente invention appartient au groupe de souches le plus représenté. A study describing the genetic variability within the species L. lactis has been published (Tailliez et al, System. Appl. Microbiol., 21: 530-538,1998). It reveals that industrial strains can be divided into 3 groups. The IL1403 strain (deposited at the CNCM under number 1-2438), the sequence of which is an object of the present invention, belongs to the group of strains most represented.
De nombreuses études ont été réalisées pour comprendre le métabolisme et la physiologie des lactocoques dans le but d'améliorer leur utilisation dans l'industrie et de développer de nouvelles applications. Ces études ont permis, entre autre de développer des applications permettant l'accélération de l'affinage, la production Numerous studies have been carried out to understand the metabolism and physiology of lactococci with the aim of improving their use in industry and developing new applications. These studies have made it possible, among other things, to develop applications allowing the acceleration of refining, production
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d'arôme ou la résistance aux phages. Il a été aussi mis au point des procédés biotechnologiques permettant de produire avantageusement des produits tel la Lalanine. aroma or phage resistance. Biotechnological processes have also been developed making it possible to advantageously produce products such as Lalanine.
La recherche actuelle cherche donc à maîtriser et améliorer les performances des bactéries lactiques pour optimiser les transformations agroalimentaires, en particulier la fabrication des yaourts et des fromages. Current research therefore seeks to control and improve the performance of lactic acid bacteria in order to optimize food processing, in particular the manufacture of yogurts and cheeses.
A titre d'exemple, le goût de noisette du beurre, le goût frais des fromages blancs est apporté par le diacétyle, molécule produite par les bactéries lactiques. Or, l'addition de diacétyle est interdite en France. Il serait par conséquent intéressant d'utiliser des souches naturellement ou artificiellement surproductrices de diacétyle pour obtenir des produits ayant un goût plus typé. For example, the nutty taste of butter, the fresh taste of fromage blanc is provided by diacetyl, a molecule produced by lactic acid bacteria. However, the addition of diacetyl is prohibited in France. It would therefore be advantageous to use strains naturally or artificially overproducing diacetyl to obtain products having a more distinctive taste.
Les bactéries lactiques sécrètent des enzymes et autres protéines qui contribuent aux qualités organoleptiques (texture et arôme) des fromages. La connaissance des mécanismes facilitant la sécrétion devrait permettre d'accélérer l'affinage ou de faire produire par les bactéries des molécules intéressantes : enzymes digestives, antigènes pour la fabrication de vaccins... Lactic bacteria secrete enzymes and other proteins which contribute to the organoleptic qualities (texture and aroma) of cheeses. Knowledge of the mechanisms facilitating secretion should make it possible to accelerate the refining or cause bacteria to produce interesting molecules: digestive enzymes, antigens for the manufacture of vaccines, etc.
On estime que 10% de la fabrication fromagère est perdue ou fortement déclassée du fait de l'attaque par des phages. Si on comprenait les raisons de la résistance de certaines bactéries, on pourrait améliorer la survie des ferments utilisés par l'industrie. It is estimated that 10% of cheese production is lost or greatly downgraded due to attack by phages. If we understood the reasons for the resistance of certain bacteria, we could improve the survival of the ferments used by industry.
L'ensemble des études menées sur L. lactis a conduit à la publication de 420 séquences dans GenBank correspondant à 1317 peptides traduits. Ces séquences sont largement redondantes par le fait que de nombreux gènes ont été séquences plusieurs fois dans des souches différentes. De plus, de nombreuses séquences correspondent à une information plasmidique. Il en découle que ces séquences correspondent à environ 500 gènes chromosomiques chez L. lactis, ce qui représente entre un cinquième et un quart du génome. All the studies carried out on L. lactis led to the publication of 420 sequences in GenBank corresponding to 1317 translated peptides. These sequences are largely redundant in that many genes have been sequenced several times in different strains. In addition, many sequences correspond to plasmid information. It follows that these sequences correspond to approximately 500 chromosomal genes in L. lactis, which represents between a fifth and a quarter of the genome.
Un certain nombre d'approches a été utilisé pour identifier des gènes de L. lactis. Une première approche consiste à isoler dans un premier temps des mutants A number of approaches have been used to identify genes from L. lactis. A first approach consists in isolating first mutants
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affectés dans une fonction, et de rechercher par la suite des fragments d'ADN qui permettent de restaurer cette fonction (Renault, P et al. 1989. Product of the Lactococcus lactis gène required for malolactic fermentation is homologous to a family of positive regulators. J. Bacteriol. , no. 171 : 3108-14). Une deuxième approche est de complémenter des mutants d'autres bactéries comme E. coli ou B. subtilis pour un gène de fonction connue (Bardowski, J., S. D. Ehrlich, and A. affected in a function, and subsequently to search for DNA fragments that make it possible to restore this function (Renault, P et al. 1989. Product of the Lactococcus lactis gene required for malolactic fermentation is homologous to a family of positive regulators. J. Bacteriol., No. 171: 3108-14). A second approach is to complement mutants of other bacteria such as E. coli or B. subtilis for a gene of known function (Bardowski, J., S. D. Ehrlich, and A.
Chopin. 1992. Tryptophan biosynthesis gènes in Lactococcus lactis subsp. lactis. Chopin. 1992. Tryptophan biosynthesis genes in Lactococcus lactis subsp. lactis.
J. Bacteriol, 174 : 6563-70.). Une troisième approche est de rechercher des mutants obtenus par insertion de transposons ou de plasmides portant des courtes séquences homologues, ce qui permet ensuite de caractériser le ou les gènes inactivés en clonant des fragments adjacents (Rallu, F., A. Gruss, and E. Maguin. 1996. J. Bacteriol, 174: 6563-70.). A third approach is to search for mutants obtained by inserting transposons or plasmids carrying short homologous sequences, which then makes it possible to characterize the inactivated gene (s) by cloning adjacent fragments (Rallu, F., A. Gruss, and E . Maguin. 1996.
Lactococcus lactis and stress. Antonie Van Leeuwenhoek 70, no. 2-4 : 243-51). Des approches génomiques permettent aussi de définir des segments de gènes qui sont conservés dans différents organismes, et d'en déduire des amorces dont l'utilisation en PCR permet d'amplifier et d'isoler un fragment d'un gène connu par ailleurs (Duwat, P., S. D. Ehrlich, and A. Gruss. 1995. The recA gène of Lactococcus lactis: characterization and involvement in oxidative and thermal stress. Molecular Microbiology 17 : 1121-31). Différentes variantes de ces techniques existent et peuvent être utilisées avantageusement. Lactococcus lactis and stress. Antonie Van Leeuwenhoek 70, no. 2-4: 243-51). Genomic approaches also make it possible to define segments of genes which are conserved in different organisms, and to deduce therefrom primers whose use in PCR makes it possible to amplify and isolate a fragment of a gene known elsewhere (Duwat , P., SD Ehrlich, and A. Gruss. 1995. The recA gene of Lactococcus lactis: characterization and involvement in oxidative and thermal stress. Molecular Microbiology 17: 1121-31). Different variants of these techniques exist and can be used advantageously.
L'étude de Lactococcus lactis demande de nouvelles approches, en particulier génétiques, afin d'améliorer la compréhension des différentes voies métaboliques de cet organisme. The study of Lactococcus lactis requires new approaches, in particular genetic, in order to improve the understanding of the different metabolic pathways of this organism.
Ainsi, c'est un objet de la présente invention que de divulguer la séquence complète du génome de Lactococcus lactis IL1403 ainsi que de tous les gènes contenus dans cedit génome. Thus, it is an object of the present invention to disclose the complete sequence of the genome of Lactococcus lactis IL1403 as well as of all the genes contained in said genome.
En effet, la connaissance du génome de cet organisme permet de mieux définir les interactions entre les différents gènes, les différentes protéines, et par là-même, les différentes voies métaboliques. En effet, et contrairement à la divulgation de séquences isolées, la séquence génomique complète d'un organisme forme un tout, permettant d'obtenir immédiatement toutes les Indeed, knowledge of the genome of this organism makes it possible to better define the interactions between the various genes, the various proteins, and therefore the various metabolic pathways. Indeed, and unlike the disclosure of isolated sequences, the complete genomic sequence of an organism forms a whole, making it possible to immediately obtain all the
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informations nécessaires à cet organisme pour croître et fonctionner. information necessary for this organism to grow and function.
La présente invention concerne donc une séquence nucléotidique de Lactococcus lactis caractérisée en ce qu'elle correspond à SEQ ID N 1. The present invention therefore relates to a nucleotide sequence of Lactococcus lactis characterized in that it corresponds to SEQ ID N 1.
La présente invention concerne également une séquence nucléotidique de Lactococcus lactis caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi : a) une séquence nucléotidique comportant au moins 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou 98 % d'identité avec SEQ ID N 1 ; b) une séquence nucléotidique hybridant dans des conditions de forte stringence avec SEQ ID N 1 ; c) une séquence nucléotidique complémentaire de SEQ ID
N 1 ou complémentaire d'une séquence nucléotidique telle que définie en a), ou b), ou une séquence nucléotidique de l'ARN correspondant ; d) une séquence nucléotidique de fragment représentatif de SEQ ID N
1, ou de fragment représentatif d'une séquence nucléotidique telle que définie en a), b) ou c); e) une séquence nucléotidique comprenant une séquence telle que définie en a), b), c) ou d) ; etf) une séquence nucléotidique modifiée d'une séquence nucléotidique telle que définie en a), b), c), d) ou e). The present invention also relates to a nucleotide sequence of Lactococcus lactis characterized in that it is chosen from: a) a nucleotide sequence comprising at least 80%, 85%, 90%, 95% or 98% identity with SEQ ID N 1; b) a nucleotide sequence hybridizing under high stringency conditions with SEQ ID N 1; c) a nucleotide sequence complementary to SEQ ID
N 1 or complementary to a nucleotide sequence as defined in a), or b), or a nucleotide sequence of the corresponding RNA; d) a nucleotide sequence of fragment representative of SEQ ID N
1, or of a fragment representative of a nucleotide sequence as defined in a), b) or c); e) a nucleotide sequence comprising a sequence as defined in a), b), c) or d); andf) a nucleotide sequence modified from a nucleotide sequence as defined in a), b), c), d) or e).
De façon plus particulière, la présente invention a également pour objet les séquences nucléotidiques caractérisées en ce qu'elles sont issues de SEQ ID
N 1 et en ce qu'elles codent pour un polypeptide choisi parmi les séquences
SEQ ID N 2 à SEQ ID N 2323. More particularly, the present invention also relates to the nucleotide sequences characterized in that they are derived from SEQ ID
N 1 and in that they encode a polypeptide chosen from the sequences
SEQ ID N 2 to SEQ ID N 2323.
De plus, les séquences nucléotidiques caractérisées en ce qu'elles comprennent une séquence nucléotidique choisie parmi : a) une séquence nucléotidique codant pour un polypeptide choisi parmi les séquences SEQ ID N 2 à SEQ ID N 2323 ; b) une séquence nucléotidique comportant au moins 80 %, 85 %, 90 %, In addition, the nucleotide sequences characterized in that they comprise a nucleotide sequence chosen from: a) a nucleotide sequence encoding a polypeptide chosen from the sequences SEQ ID N 2 to SEQ ID N 2323; b) a nucleotide sequence comprising at least 80%, 85%, 90%,
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95 % ou 98 % d'identité avec une séquence nucléotidique codant pour un polypeptide choisi parmi les séquences SEQ ID N 2 à SEQ
ID N 2323 ; c) une séquence nucléotidique s'hybridant dans des conditions de forte stringence avec une séquence nucléotidique codant pour un polypetide choisi parmi les séquences SEQ ID N 2 à SEQ ID N
2323 ; d) une séquence nucléotidique complémentaire ou d'ARN correspondant à une séquence telle que définie en a), b) ou c) ; e) une séquence nucléotidique de fragment représentatif d'une séquence telle que définie en a), b), c) ou d) ; etf) une séquence nucléotidique modifiée d'une séquence telle que définie en a), b), c), d) ou e), sont également des objets de l'invention. 95% or 98% identity with a nucleotide sequence encoding a polypeptide chosen from the sequences SEQ ID N 2 to SEQ
ID N 2323; c) a nucleotide sequence hybridizing under high stringency conditions with a nucleotide sequence encoding a polypetide chosen from the sequences SEQ ID N 2 to SEQ ID N
2323; d) a complementary nucleotide or RNA sequence corresponding to a sequence as defined in a), b) or c); e) a nucleotide sequence of a fragment representative of a sequence as defined in a), b), c) or d); andf) a nucleotide sequence modified from a sequence as defined in a), b), c), d) or e), are also subjects of the invention.
Par acide nucléique, séquence nucléique ou d'acide nucléique, polynucléotide, oligonucléotide, séquence de polynucléotide, séquence nucléotidique, termes qui seront employés indifféremment dans la présente description, on entend désigner un enchaînement précis de nucléotides, modifiés ou non, permettant de définir un fragment ou une région d'un acide nucléique, comportant ou non des nucléotides non naturels, et pouvant correspondre aussi bien à un ADN double brin, un ADN simple brin que des produits de transcription desdits ADNs. Ainsi, les séquences nucléiques selon l'invention englobent également les PNA (Peptid Nucleic Acid), ou analogues. By nucleic acid, nucleic acid or nucleic acid sequence, polynucleotide, oligonucleotide, polynucleotide sequence, nucleotide sequence, terms which will be used interchangeably in the present description, is meant to denote a precise sequence of nucleotides, modified or not, making it possible to define a fragment or a region of a nucleic acid, comprising or not comprising unnatural nucleotides, and which may correspond equally well to a double-stranded DNA, a single-stranded DNA and to transcription products of said DNAs. Thus, the nucleic sequences according to the invention also encompass PNAs (Peptid Nucleic Acids), or the like.
II doit être compris que la présente invention ne concerne pas les séquences nucléotidiques dans leur environnement chromosomique naturel, c'est-à-dire à l'état naturel. Il s'agit de séquences qui ont été isolées et/ou purifiées, c'est-à-dire qu'elles ont été prélevées directement ou indirectement, par exemple par copie, leur environnement ayant été au moins partiellement modifié. On entend ainsi également désigner les acides nucléiques obtenus par synthèse chimique. It should be understood that the present invention does not relate to the nucleotide sequences in their natural chromosomal environment, that is to say in the natural state. These are sequences which have been isolated and / or purified, that is to say they have been removed directly or indirectly, for example by copying, their environment having been at least partially modified. It is thus also meant to denote the nucleic acids obtained by chemical synthesis.
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Par pourcentage d'identité entre deux séquences d'acides nucléiques ou d'acides aminés au sens de la présente invention, on entend désigner un pourcentage de nucléotides ou de résidus d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. On entend désigner par "meilleur alignement" ou "alignement optimal", l'alignement pour lequel le pourcentage d'identité déterminé comme ci- après est le plus élevé. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d'acides nucléiques ou d'acides aminés sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée par segment ou par fenêtre de comparaison pour identifier et comparer les régions locales de similarité de séquence. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé, outre manuellement, au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Smith et Waterman (1981, Ad. App. By percentage identity between two sequences of nucleic acids or amino acids within the meaning of the present invention, is meant a percentage of nucleotides or identical amino acid residues between the two sequences to be compared, obtained after the best alignment, this percentage being purely statistical and the differences between the two sequences being distributed at random and over their entire length. The term “best alignment” or “optimal alignment” is intended to denote the alignment for which the percentage identity determined as below is the highest. Sequence comparisons between two nucleic acid or amino acid sequences are traditionally carried out by comparing these sequences after having optimally aligned them, said comparison being carried out by segment or by comparison window to identify and compare the local regions of sequence similarity. Optimal alignment of sequences for comparison can be achieved, in addition to manually, using the local homology algorithm of Smith and Waterman (1981, Ad. App.
Math. 2 : au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Neddleman et Wunsch (1970, J. Mol. Biol. 48 : au moyen de la méthode de recherche de similarité de Pearson et Lipman (1988, Proc Natl. Acad. Sci. USA 85 : au moyen de logiciels informatiques utilisant ces algorithmes (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA et TFASTA dans le Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI). Afin d'obtenir l'alignement optimal, on utilise de préférence le programme BLAST, avec la matrice BLOSUM 62. On peut également utiliser les matrices PAM ou PAM250. Math. 2: using the local homology algorithm of Neddleman and Wunsch (1970, J. Mol. Biol. 48: using the similarity search method of Pearson and Lipman (1988, Proc Natl. Acad. Sci. USA 85: Using computer software using these algorithms (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI). optimal alignment, the BLAST program is preferably used, with the BLOSUM 62 matrix. The PAM or PAM250 matrices can also be used.
Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acides nucléiques ou d'acides aminés est déterminé en comparant ces deux séquences alignées de manière optimale dans laquelle la séquence d'acides nucléiques ou d'acides aminés à comparer peut comprendre des additions ou des délétions par rapport à la séquence de référence pour un alignement optimal entre ces deux séquences. Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le nucléotide ou le résidu d'acide aminé est identique entre les deux The percentage identity between two nucleic acid or amino acid sequences is determined by comparing these two optimally aligned sequences in which the nucleic acid or amino acid sequence to be compared may include additions or deletions relative to the reference sequence for optimal alignment between these two sequences. Percent identity is calculated by determining the number of identical positions for which the nucleotide or amino acid residue is identical between the two
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séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions comparées et en multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage d'identité entre ces deux séquences. sequences, by dividing this number of identical positions by the total number of positions compared and by multiplying the result obtained by 100 to obtain the percentage identity between these two sequences.
Par séquences nucléiques présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence 85 % ou 90 %, de façon plus préférée 95 % voire 98 %, après alignement optimal avec une séquence de référence, on entend désigner les séquences nucléiques présentant, par rapport à la séquence nucléique de référence, certaines modifications comme en particulier une délétion, une troncation, un allongement, une fusion chimérique et/ou une substitution, notamment ponctuelle, et dont la séquence nucléique présente au moins 80 %, de préférence 85 %, 90 %, 95 % ou 98 %, d'identité après alignement optimal avec la séquence nucléique de référence. Il s'agit de préférence de séquences dont les séquences complémentaires sont susceptibles de s'hybrider spécifiquement avec les séquences de référence. De préférence, les conditions d'hybridation spécifiques ou de forte stringence seront telles qu'elles assurent au moins 80 %, de préférence 85 %, 90 %, 95 % ou 98 % d'identité après alignement optimal entre l'une des deux séquences et la séquence complémentaire de l'autre. By nucleic acid sequences exhibiting a percentage identity of at least 80%, preferably 85% or 90%, more preferably 95% or even 98%, after optimal alignment with a reference sequence, is meant to denote the nucleic acid sequences exhibiting , relative to the reference nucleic acid sequence, certain modifications such as in particular a deletion, a truncation, an extension, a chimeric fusion and / or a substitution, in particular point, and of which the nucleic sequence presents at least 80%, preferably 85 %, 90%, 95% or 98%, identity after optimal alignment with the reference nucleic acid sequence. They are preferably sequences whose complementary sequences are capable of hybridizing specifically with the reference sequences. Preferably, the specific hybridization conditions or of high stringency will be such as to ensure at least 80%, preferably 85%, 90%, 95% or 98% identity after optimal alignment between one of the two sequences. and the sequence complementary to the other.
Une hybridation dans des conditions de forte stringence signifie que les conditions de température et de force ionique sont choisies de telle manière qu'elles permettent le maintien de l'hybridation entre deux fragments d'ADN complémentaires. A titre illustratif, des conditions de forte stringence de l'étape d'hybridation aux fins de définir les fragments polynucléotidiques décrits ci-dessus, sont avantageusement les suivantes. Hybridization under high stringency conditions means that the temperature and ionic strength conditions are chosen such that they allow hybridization to be maintained between two complementary DNA fragments. By way of illustration, the conditions of high stringency of the hybridization step for the purposes of defining the polynucleotide fragments described above are advantageously the following.
L'hybridation ADN-ADN ou ADN-ARN est réalisée en deux étapes : (1) préhybridation à 42 C pendant 3 heures en tampon phosphate (20 mM, pH 7,5) contenant 5 x SSC (1 x SSC correspond à une solution 0,15 M NaCl + 0,015 M citrate de sodium), 50 % de formamide, 7 % de sodium dodécyl sulfate (SDS), 10 x Denhardt's, 5 % de dextran sulfate et 1 % d'ADN de sperme de saumon ; (2) hybridation proprement dite pendant 20 heures à une température dépendant de la The DNA-DNA or DNA-RNA hybridization is carried out in two steps: (1) prehybridization at 42 C for 3 hours in phosphate buffer (20 mM, pH 7.5) containing 5 x SSC (1 x SSC corresponds to a solution 0.15 M NaCl + 0.015 M sodium citrate), 50% formamide, 7% sodium dodecyl sulfate (SDS), 10 x Denhardt's, 5% dextran sulfate and 1% salmon sperm DNA; (2) actual hybridization for 20 hours at a temperature depending on the
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taille de la sonde (i.e. : 42 C, pour une sonde de taille > 100 nucléotides) suivie de 2 lavages de 20 minutes à 20 C en 2 x SSC + 2 % SDS, 1 lavage de 20 minutes à 20 C en 0,1 x SSC + 0,1 % SDS. Le dernier lavage est pratiqué en 0,1 x SSC + 0,1% SDS pendant 30 minutes à 60 C pour une sonde de taille > 100 nucléotides. probe size (ie: 42 C, for a probe size> 100 nucleotides) followed by 2 washes of 20 minutes at 20 C in 2 x SSC + 2% SDS, 1 wash of 20 minutes at 20 C in 0.1 x SSC + 0.1% SDS. The last wash is carried out in 0.1 × SSC + 0.1% SDS for 30 minutes at 60 ° C. for a probe of size> 100 nucleotides.
Les conditions d'hybridation de forte stringence décrites ci-dessus pour un polynucléotide de taille définie, peuvent être adaptées par l'homme du métier pour des oligonucléotides de taille plus grande ou plus petite, selon l'enseignement de Sambrook et al., (1989, Molecular cloning : laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor). The high stringency hybridization conditions described above for a polynucleotide of defined size can be adapted by those skilled in the art for oligonucleotides of larger or smaller size, according to the teaching of Sambrook et al., ( 1989, Molecular cloning: laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor).
De plus, par fragment représentatif de séquences selon l'invention, on entend désigner tout fragment nucléotidique présentant au moins 15 nucléotides, de préférence au moins 30,75, 150,300 et 450 nucléotides consécutifs de la séquence dont il est issu. Moreover, by representative fragment of sequences according to the invention, is meant any nucleotide fragment having at least 15 nucleotides, preferably at least 30.75, 150,300 and 450 consecutive nucleotides of the sequence from which it is derived.
Par fragment représentatif, on entend en particulier une séquence nucléique codant pour un fragment biologiquement actif d'un polypeptide, tel que défini plus loin. By representative fragment is meant in particular a nucleic acid sequence encoding a biologically active fragment of a polypeptide, as defined below.
Par fragment représentatif, on entend également les séquences intergéniques, et en particulier les séquences nucléotidiques portant les signaux de régulation (promoteurs, terminateurs, voire enhancers...). By representative fragment is also meant the intergenic sequences, and in particular the nucleotide sequences carrying the regulatory signals (promoters, terminators, or even enhancers, etc.).
Parmi lesdits fragments représentatifs, on préfère ceux ayant des séquences nucléotidiques correspondant à des cadres ouverts de lecture, dénommés séquences ORFs (ORF pour Open Reading Frame ), compris en général entre un codon d'initiation et un codon stop, ou entre deux codons stop, et codant pour des polypeptides, de préférence d'au moins 100 acides aminés, tel que par exemple, sans s'y limiter, les séquences ORFs qui seront décrites par la suite. Among said representative fragments, preference is given to those having nucleotide sequences corresponding to open reading frames, called ORFs sequences (ORFs for Open Reading Frame), generally comprised between an initiation codon and a stop codon, or between two stop codons. , and encoding polypeptides, preferably of at least 100 amino acids, such as, for example, without being limited thereto, the ORFs sequences which will be described below.
La numérotation des séquences nucléotidiques ORFs qui sera utilisée par la suite dans la présente description correspond à la numérotation des séquences d'acides aminés des protéines codées par lesdites ORFs. The numbering of the ORFs nucleotide sequences which will be used subsequently in the present description corresponds to the numbering of the amino acid sequences of the proteins encoded by said ORFs.
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Ainsi, les séquences nucléotidiques ORF2, ORF3..., ORF2322 et ORF2323 codent respectivement pour les protéines de séquences d'acides aminés SEQ ID N 2, SEQ ID N 3..., SEQ ID N 2322 et SEQ ID N 2323 figurant dans la liste de séquences de la présente invention. Les séquences nucléotidiques détaillées des séquences ORF2, ORF3..., ORF2322 et ORF2323 sont déterminées par leur position respective sur la séquence génomique SEQ ID N 1. Le tableau I fournit les coordonnées des différentes ORFs par rapport à la séquence nucléotidique SEQ ID N 1, en donnant le nucléotide de départ, le nucléotide de fin d'ORF, ainsi que le nucléotide estimé pour lequel la protéine débute. Thus, the nucleotide sequences ORF2, ORF3 ..., ORF2322 and ORF2323 code respectively for the proteins of amino acid sequences SEQ ID N 2, SEQ ID N 3 ..., SEQ ID N 2322 and SEQ ID N 2323 appearing in the sequence listing of the present invention. The detailed nucleotide sequences of the ORF2, ORF3 ..., ORF2322 and ORF2323 sequences are determined by their respective position on the genomic sequence SEQ ID N 1. Table I provides the coordinates of the different ORFs relative to the nucleotide sequence SEQ ID N 1 , giving the starting nucleotide, the end nucleotide of ORF, as well as the estimated nucleotide for which the protein starts.
Ainsi, ORF N 2 s'étend du nucléotide 349 au nucléotide 1722, la protéine SEQ ID N 2 s'étendant quant à elle du nucléotide 358 au nucléotide 1722. De même, OFR N 6 s'étend du nucléotide 10283 au nucléotide 10846, la protéine débutant au nucléotide 10837, car elle est située sur le brin complémentaire. Ainsi, à la lecture du Tableau I, on voit bien que ORF N 6 est la séquence complémentaire s'étendant entre les nucléotides 10283 et 10846, extrémités comprises, de la séquence SEQ ID N 1. Thus, ORF N 2 extends from nucleotide 349 to nucleotide 1722, the protein SEQ ID N 2 for its part extending from nucleotide 358 to nucleotide 1722. Likewise, OFR N 6 extends from nucleotide 10283 to nucleotide 10846, the protein starting at nucleotide 10837, because it is located on the complementary strand. Thus, on reading Table I, it can be clearly seen that ORF N 6 is the complementary sequence extending between nucleotides 10283 and 10846, ends included, of the sequence SEQ ID N 1.
Les fragments représentatifs selon l'invention peuvent être obtenus par exemple par amplification spécifique telle que la PCR ou après digestion par des enzymes de restriction appropriés de séquences nucléotidiques selon l'invention, cette méthode étant décrite en particulier dans l'ouvrage de Sambrook et al.. The representative fragments according to the invention can be obtained for example by specific amplification such as PCR or after digestion with appropriate restriction enzymes of nucleotide sequences according to the invention, this method being described in particular in the work by Sambrook et al. ..
Lesdits fragments représentatifs peuvent également être obtenus par synthèse chimique lors que leur taille n'est pas trop importante, selon des méthodes bien connues de l'homme du métier. Said representative fragments can also be obtained by chemical synthesis when their size is not too large, according to methods well known to those skilled in the art.
Parmi les séquences contenant des séquences de l'invention, ou des fragments représentatifs, on entend également les séquences qui sont naturellement encadrées par des séquences qui présentent au moins 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou 98 % d'identité avec les séquences selon l'invention. Among the sequences containing sequences of the invention, or representative fragments, is also meant the sequences which are naturally flanked by sequences which exhibit at least 80%, 85%, 90%, 95% or 98% identity with the sequences according to the invention.
Par séquence nucléotidique modifiée, on entend toute séquence By modified nucleotide sequence is meant any sequence
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nucléotidique obtenue par mutagénèse selon des techniques bien connues de l'homme du métier, et comportant des modifications par rapport aux séquences normales, par exemple des mutations dans les séquences régulatrices et/ou promotrices de l'expression du polypeptide, notamment conduisant à une modification du taux d'expression ou de l'activité dudit polypeptide. nucleotide obtained by mutagenesis according to techniques well known to those skilled in the art, and comprising modifications compared to normal sequences, for example mutations in the regulatory and / or promoter sequences of the expression of the polypeptide, in particular leading to a modification the level of expression or the activity of said polypeptide.
Par séquence nucléotidique modifiée, on entend également toute séquence nucléotidique codant pour un polypeptide modifié tel que définit ciaprès. By modified nucleotide sequence is also meant any nucleotide sequence encoding a modified polypeptide as defined below.
Les fragments représentatifs selon l'invention peuvent également être des sondes ou amorces, qui peuvent être utilisées dans des procédés de détection, d'identification, de dosage ou d'amplification de séquences nucléiques. The representative fragments according to the invention can also be probes or primers, which can be used in methods for the detection, identification, assay or amplification of nucleic sequences.
Une sonde ou amorce se définit, au sens de l'invention, comme étant un fragment d'acides nucléiques simple brin ou un fragment double brin dénaturé comprenant par exemple de 12 bases à quelques kb, notamment de 15 à quelques centaines de bases, de préférence de 15 à 50 ou 100 bases, et possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour former un complexe d'hybridation avec un acide nucléique cible. A probe or primer is defined, within the meaning of the invention, as being a fragment of single-stranded nucleic acids or a denatured double-stranded fragment comprising, for example, from 12 bases to a few kb, in particular from 15 to a few hundred bases, of preferably 15 to 50 or 100 bases, and possessing hybridization specificity under conditions determined to form a hybridization complex with a target nucleic acid.
Les sondes et amorces selon l'invention peuvent être marquées directement ou indirectement par un composé radioactif ou non radioactif par des méthodes bien connues de l'homme du métier, afin d'obtenir un signal détectable et/ou quantifiable. The probes and primers according to the invention can be labeled directly or indirectly with a radioactive or non-radioactive compound by methods well known to those skilled in the art, in order to obtain a detectable and / or quantifiable signal.
Les séquences de polynucléotides selon l'invention non marquées peuvent être utilisées directement comme sonde ou amorce. The unlabeled polynucleotide sequences according to the invention can be used directly as a probe or a primer.
Les séquences sont généralement marquées pour obtenir des séquences utilisables pour de nombreuses applications. Le marquage des amorces ou des sondes selon l'invention est réalisé par des éléments radioactifs ou par des molécules non radioactives. The sequences are generally marked to obtain sequences which can be used for numerous applications. The labeling of the primers or probes according to the invention is carried out by radioactive elements or by non-radioactive molecules.
Parmi les isotopes radioactifs utilisés, on peut citer le 32P, le 33P, le 35S, le 3H ou le 125I. Les entités non radioactives sont sélectionnées parmi les ligands tels la Among the radioactive isotopes used, there may be mentioned 32P, 33P, 35S, 3H or 125I. Non-radioactive entities are selected from ligands such as
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biotine, l'avidine, la streptavidine, la dioxygénine, les haptènes, les colorants, les agents luminescents tels que les agents radioluminescents, chémoluminescents, bioluminescents, fluorescents, phosphorescents. biotin, avidin, streptavidin, dioxygenin, haptens, dyes, luminescent agents such as radioluminescent, chemoluminescent, bioluminescent, fluorescent, phosphorescent agents.
Les polynucléotides selon l'invention peuvent ainsi être utilisés comme amorce et/ou sonde dans des procédés mettant en oeuvre notamment la technique de PCR (amplification en chaîne par polymérase) (Rolfs et al., 1991, Berlin : Springer-Verlag). Cette technique nécessite le choix de paires d'amorces oligonucléotidiques encadrant le fragment qui doit être amplifié. On peut, par exemple, se référer à la technique décrite dans le brevet américain U.S. N 4,683,202. Les fragments amplifiés peuvent être identifiés, par exemple après une électrophorèse en gel d'agarose ou de polyacrylamide, ou après une technique chromatographique comme la filtration sur gel ou la chromatographie échangeuse d'ions, puis séquences. La spécificité de l'amplification peut être contrôlée en utilisant comme amorce les séquences nucléotidiques de polynucléotides de l'invention comme matrice, des plasmides contenant ces séquences ou encore les produits d'amplification dérivés. Les fragments nucléotidiques amplifiés peuvent être utilisés comme réactifs dans des réactions d'hybridation afin de mettre en évidence la présence, dans un échantillon biologique, d'un acide nucléique cible de séquence complémentaire à celle desdits fragments nucléotidiques amplifiés. The polynucleotides according to the invention can thus be used as a primer and / or probe in processes implementing in particular the PCR (polymerase chain reaction) technique (Rolfs et al., 1991, Berlin: Springer-Verlag). This technique requires the choice of pairs of oligonucleotide primers flanking the fragment which must be amplified. Reference may, for example, be made to the technique described in U.S. Patent No. 4,683,202. The amplified fragments can be identified, for example after agarose or polyacrylamide gel electrophoresis, or after a chromatographic technique such as gel filtration or ion exchange chromatography, then sequenced. The specificity of the amplification can be controlled by using as primer the nucleotide sequences of polynucleotides of the invention as a template, plasmids containing these sequences or else the derived amplification products. The amplified nucleotide fragments can be used as reagents in hybridization reactions in order to demonstrate the presence, in a biological sample, of a target nucleic acid of sequence complementary to that of said amplified nucleotide fragments.
L'invention vise également les acides nucléiques susceptibles d'être obtenus par amplification à l'aide d'amorces selon l'invention. The invention also relates to the nucleic acids capable of being obtained by amplification using primers according to the invention.
D'autres techniques d'amplification de l'acide nucléique cible peuvent être avantageusement employées comme alternative à la PCR (PCR-like) à l'aide de couple d'amorces de séquences nucléotidiques selon l'invention. Par PCR-like on entend désigner toutes les méthodes mettant en #uvre des reproductions directes ou indirectes des séquences d'acides nucléiques, ou bien dans lesquelles les systèmes de marquage ont été amplifiés, ces techniques sont bien entendu connues, en général il s'agit de l'amplification de l'ADN par une polymérase ; lorsque l'échantillon d'origine est un ARN il convient préalablement d'effectuer une transcription reverse. Other techniques for amplifying the target nucleic acid can be advantageously used as an alternative to PCR (PCR-like) using a pair of primers of nucleotide sequences according to the invention. By PCR-like is meant all the methods implementing direct or indirect reproductions of nucleic acid sequences, or in which the labeling systems have been amplified, these techniques are of course known, in general it is necessary to acts of amplification of DNA by a polymerase; when the original sample is an RNA, reverse transcription should first be carried out.
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Il existe actuellement de très nombreux procédés permettant cette amplification, comme par exemple la technique SDA (Strand Displacement Amplification) ou technique d'amplification à déplacement de brin (Walker et al., 1992, Nucleic Acids Res. 20 : la technique TAS (Transcription-based Amplification System) décrite par Kwoh et al. (1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86,1173), la technique 3SR (Self-Sustained Sequence Replication) décrite par Guatelli et al. (1990, Proc. There are currently a large number of methods allowing this amplification, such as for example the SDA technique (Strand Displacement Amplification) or the strand displacement amplification technique (Walker et al., 1992, Nucleic Acids Res. 20: the TAS technique (Transcription). -based Amplification System) described by Kwoh et al. (1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86,1173), the 3SR (Self-Sustained Sequence Replication) technique described by Guatelli et al. (1990, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 87 : 1874),la technique NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification) décrite par Kievitis et al. (1991, J. Virol. Methods, 35,273), la technique TMA (Transcription Mediated Amplification), la technique LCR (Ligase Chain Reaction) décrite par Landegren et al. (1988, Science 241,1077), la technique de RCR (Repair Chain Reaction) décrite par Segev (1992, Kessler C. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874), the NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification) technique described by Kievitis et al. (1991, J. Virol. Methods, 35,273), the TMA (Transcription Mediated Amplification) technique, the LCR (Ligase Chain Reaction) technique described by Landegren et al. (1988, Science 241, 1077), the RCR (Repair Chain Reaction) technique described by Segev (1992, Kessler C.
Springer Verlag, Berlin, New-York, 197-205), la technique CPR (Cycling Probe Reaction) décrite par Duck et al. (1990, Biotechniques, 9,142), la technique d'amplification à la Q-béta-réplicase décrite par Miele et al. (1983, J. Mol. Biol., 171,281). Certaines de ces techniques ont depuis été perfectionnées. Springer Verlag, Berlin, New York, 197-205), the CPR (Cycling Probe Reaction) technique described by Duck et al. (1990, Biotechniques, 9,142), the Q-beta-replicase amplification technique described by Miele et al. (1983, J. Mol. Biol., 171,281). Some of these techniques have since been perfected.
Dans le cas où le polynucléotide cible à détecter est un ARNm, on utilise avantageusement, préalablement à la mise en oeuvre d'une réaction d'amplification à l'aide des amorces selon l'invention ou à la mise en #uvre d'un procédé de détection à l'aide des sondes de l'invention, une enzyme de type transcriptase inverse afin d'obtenir un ADNc à partir de l'ARNm contenu dans l' échantillon biologique. L'ADNc obtenu servira alors de cible pour les amorces ou les sondes mises en oeuvre dans le procédé d'amplification ou de détection selon l'invention. In the case where the target polynucleotide to be detected is an mRNA, it is advantageously used, prior to the implementation of an amplification reaction using the primers according to the invention or to the implementation of a method of detecting using the probes of the invention, an enzyme of reverse transcriptase type in order to obtain a cDNA from the mRNA contained in the biological sample. The cDNA obtained will then serve as a target for the primers or the probes used in the amplification or detection method according to the invention.
La technique d'hybridation de sondes peut être réalisée de manières diverses (Matthews et al., 1988, Anal. Biochem., 169,1-25). La méthode la plus générale consiste à immobiliser l'acide nucléique extrait des cellules de différents tissus ou de cellules en culture sur un support (tels que la nitrocellulose, le nylon, le polystyrène) et à incuber, dans des conditions bien définies, l'acide nucléique cible immobilisé avec la sonde. Après l'hybridation, l'excès de sonde est éliminé et les molécules hybrides formées sont détectées par la méthode appropriée (mesure de la The technique of hybridization of probes can be carried out in various ways (Matthews et al., 1988, Anal. Biochem., 169,1-25). The most general method is to immobilize the nucleic acid extracted from cells of different tissues or cells in culture on a support (such as nitrocellulose, nylon, polystyrene) and incubate, under well-defined conditions, the target nucleic acid immobilized with the probe. After hybridization, the excess probe is removed and the hybrid molecules formed are detected by the appropriate method (measurement of the
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radioactivité, de la fluorescence ou de l'activité enzymatique liée à la sonde). radioactivity, fluorescence or enzyme activity linked to the probe).
Selon un autre mode de mise en #uvre des sondes nucléiques selon l'invention, ces dernières peuvent être utilisées comme sondes de capture. Dans ce cas, une sonde, dite sonde de capture , est immobilisée sur un support et sert à capturer par hybridation spécifique l'acide nucléique cible obtenu à partir de l'échantillon biologique à tester et l'acide nucléique cible est ensuite détecté grâce à une seconde sonde, dite sonde de détection , marquée par un élément facilement détectable. According to another embodiment of the nucleic acid probes according to the invention, the latter can be used as capture probes. In this case, a probe, called a capture probe, is immobilized on a support and is used to capture by specific hybridization the target nucleic acid obtained from the biological sample to be tested and the target nucleic acid is then detected using a second probe, called a detection probe, marked by an easily detectable element.
Parmi les fragments d'acides nucléiques intéressants, il faut ainsi citer en particulier les oligonucléotides anti-sens, c'est-à-dire dont la structure assure, par hybridation avec la séquence cible, une inhibition de l'expression du produit correspondant. Il faut également citer les oligonucléotides sens qui, par interaction avec des protéines impliquées dans la régulation de l'expression du produit correspondant, induiront soit une inhibition, soit une activation de cette expression. Among the nucleic acid fragments of interest, it is thus necessary to cite in particular the antisense oligonucleotides, that is to say the structure of which ensures, by hybridization with the target sequence, an inhibition of the expression of the corresponding product. Mention should also be made of sense oligonucleotides which, by interaction with proteins involved in the regulation of the expression of the corresponding product, will induce either an inhibition or an activation of this expression.
De façon préférée, les sondes ou amorces selon l'invention sont immobilisées sur un support, de manière covalente ou non covalente. En particulier, le support peut être une puce à ADN ou un filtre à haute densité, également objets de la présente invention. Preferably, the probes or primers according to the invention are immobilized on a support, covalently or non-covalently. In particular, the support can be a DNA chip or a high density filter, also subjects of the present invention.
On entend désigner par puce à ADN ou filtre haute densité, un support sur lequel sont fixées des séquences d'ADN, chacune d'entre elles pouvant être repérée par sa localisation géographique. Ces puces ou filtres diffèrent principalement par leur taille, le matériau du support, et éventuellement le nombre de séquences d'ADN qui y sont fixées. The term “DNA chip or high density filter” is intended to denote a support on which DNA sequences are attached, each of them being able to be identified by its geographical location. These chips or filters differ mainly in their size, the material of the support, and possibly the number of DNA sequences attached to them.
On peut fixer les sondes ou amorces selon la première invention sur des supports solides, en particulier les puces à ADN, par différents procédés de fabrication. En particulier, on peut effectuer une synthèse in situ par adressage photochimique ou par jet d'encre. D'autres techniques consistent à effectuer une synthèse ex situ et à fixer les sondes sur le support de la puce à ADN par adressage mécanique, électronique ou par jet d'encre. Ces différents procédés The probes or primers according to the first invention can be fixed on solid supports, in particular DNA chips, by various manufacturing methods. In particular, a synthesis can be carried out in situ by photochemical addressing or by inkjet. Other techniques consist in carrying out an ex situ synthesis and in fixing the probes on the support of the DNA chip by mechanical, electronic or inkjet addressing. These different processes
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sont bien connus de l'homme du métier. are well known to those skilled in the art.
Une séquence nucléotidique (sonde ou amorce) selon l'invention permet donc la détection et/ou l'amplification de séquences nucléiques spécifiques. En particulier, la détection de cesdites séquences est facilitée lorsque la sonde est fixée sur une puce à ADN, ou à un filtre haute densité. A nucleotide sequence (probe or primer) according to the invention therefore allows the detection and / or amplification of specific nucleic sequences. In particular, the detection of said sequences is facilitated when the probe is attached to a DNA chip, or to a high density filter.
L'utilisation de puces à ADN ou de filtres à haute densité permet en effet de déterminer l'expression de gènes dans un organisme présentant une séquence génomique proche de L. lactis IL1403. The use of DNA chips or high density filters makes it possible to determine the expression of genes in an organism exhibiting a genomic sequence close to L. lactis IL1403.
La séquence génomique de L. lactis IL1403, complétée par l'identification de tous les gènes de cet organisme, telle que présentée dans la présente invention, sert de base à la construction de ces puces à ADN ou filtre. The genomic sequence of L. lactis IL1403, completed by the identification of all the genes of this organism, as presented in the present invention, serves as a basis for the construction of these DNA chips or filters.
La préparation de ces filtres ou puces consiste à synthétiser des oligonucléotides, correspondant aux extrémités 5' et 3' des gènes. Ces oligonucléotides sont choisis en utilisant la séquence génomique et ses annotations divulguées par la présente invention. La température d'appariement des ces oligonucléotides aux places correspondantes sur l'ADN doit être approximativement la même pour chaque oligonucleotide. Ceci permet de préparer des fragments d'ADN correspondants à chaque gène par l'utilisation de condition de PCR appropriées dans un environnement hautement automatisée. Les fragments amplifiés sont ensuite immobilisés sur des filtres ou des supports en verre, silicium ou polymères synthétiques et ces milieux sont utilisés pour l'hybridation. The preparation of these filters or chips consists in synthesizing oligonucleotides, corresponding to the 5 'and 3' ends of the genes. These oligonucleotides are selected using the genomic sequence and its annotations disclosed by the present invention. The pairing temperature of these oligonucleotides at the corresponding places on the DNA should be approximately the same for each oligonucleotide. This allows DNA fragments corresponding to each gene to be prepared by the use of appropriate PCR conditions in a highly automated environment. The amplified fragments are then immobilized on filters or supports made of glass, silicon or synthetic polymers and these media are used for hybridization.
La disponibilité de tels filtres et/ou puces et de la séquence génomique correspondante annotée permet d'étudier l'expression de grands ensembles, voire de la totalité des gènes dans les micro-organismes associés à Lactococcus lactis, en préparant les ADN complémentaires, et en les hybridant à l'ADN ou aux oligonucléotides immobilisés sur les filtres ou les puces. Egalement, les filtres et/ou les puces permettent d'étudier la variabilité des souches ou des espèces, en préparant l'ADN de ces organismes et en les hybridant à l'ADN ou aux oligonucléotides immobilisés sur les filtres ou les puces. The availability of such filters and / or chips and of the corresponding annotated genomic sequence makes it possible to study the expression of large groups, or even all of the genes in the microorganisms associated with Lactococcus lactis, by preparing the complementary DNAs, and by hybridizing them to the DNA or to the oligonucleotides immobilized on the filters or the chips. Also, the filters and / or the chips make it possible to study the variability of the strains or the species, by preparing the DNA of these organisms and by hybridizing them to the DNA or to the oligonucleotides immobilized on the filters or the chips.
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Les différences entre les séquences génomiques des différentes souches ou espèces peuvent grandement affecter l'intensité de l'hybridation et, par conséquent, perturber l'interprétation des résultats. Il peut donc être nécessaire d'avoir la séquence précise des gènes de la souche que l'on souhaite étudier. La méthode de détection des gènes décrite plus loin en détail, impliquant la détermination de la séquence de fragments aléatoires d'un génome, et les organisant d'après la séquence du génome complet de Lactococcus lactis IL 1403 divulgué dans la présente invention, peut être très utile. Differences between the genomic sequences of different strains or species can greatly affect the intensity of hybridization and, therefore, interfere with the interpretation of results. It may therefore be necessary to have the precise sequence of the genes of the strain that one wishes to study. The method of gene detection described later in detail, involving the determination of the sequence of random fragments of a genome, and organizing them according to the sequence of the complete genome of Lactococcus lactis IL 1403 disclosed in the present invention, can be very useful.
L'utilisation des filtres à haute densité et/ou des puces permet ainsi d'obtenir des connaissances nouvelles sur la régulation des gènes dans les organismes d'importance industrielle, et en particulier les bactéries lactiques propagées dans diverses conditions. Elle permet aussi une identification rapide des différences entre les génomes des souches utilisées dans de multiples applications industrielles. The use of high density filters and / or chips thus makes it possible to obtain new knowledge on the regulation of genes in organisms of industrial importance, and in particular lactic acid bacteria propagated under various conditions. It also allows rapid identification of differences between the genomes of strains used in multiple industrial applications.
En outre, une puce à ADN ou un filtre peut être un outil extrêmement intéressant pour la détermination, la détection et/ou l'identification d'un microorganisme. Ainsi, on préfère également les puces à ADN selon l'invention qui contiennent en outre au moins une séquence nucléotidique d'un microorganisme autre de Lactococcus lactis, immobilisée sur le support de ladite puce. De préférence, le microorganisme choisi l'est parmi les microorganismes associés à Lactococcus lactis, les bactéries du genre Lactococcus, ou les variants de Lactococcus lactis. Par bactérie associée à Lactococcus lactis, on entend, comme ceci a déjà été défini plus haut, les bactéries membres du groupe des Streptocoques. In addition, a DNA chip or filter can be an extremely valuable tool for the determination, detection and / or identification of a microorganism. Thus, the DNA chips according to the invention are also preferred, which additionally contain at least one nucleotide sequence of a microorganism other than Lactococcus lactis, immobilized on the support of said chip. Preferably, the microorganism chosen is from microorganisms associated with Lactococcus lactis, bacteria of the genus Lactococcus, or variants of Lactococcus lactis. By bacteria associated with Lactococcus lactis is meant, as has already been defined above, bacteria members of the Streptococcus group.
Une puce à ADN ou un filtre selon l'invention est un élément très utile de certains kits ou nécessaires pour la détection et/ou l'identification de microorganismes, en particulier les bactéries appartenant à l'espèce Lactococcus lactis ou les microorganismes associés, également objets de l'invention. A DNA chip or a filter according to the invention is a very useful element of certain kits or necessary for the detection and / or identification of microorganisms, in particular bacteria belonging to the species Lactococcus lactis or associated microorganisms, also objects of the invention.
Par ailleurs, les puces à ADN ou les filtres selon l'invention, contenant Furthermore, the DNA chips or the filters according to the invention, containing
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des sondes ou amorces spécifiques de Lactococcus lactis, sont des éléments très avantageux de kits ou nécessaires pour la détection et/ou la quantification de l'expression de gènes de Lactococcus lactis (ou de microorganismes associés). probes or primers specific for Lactococcus lactis are very advantageous elements of kits or necessary for the detection and / or quantification of the expression of genes of Lactococcus lactis (or associated microorganisms).
En effet, le contrôle de l'expression des gènes est un point critique pour optimiser la croissance et le rendement d'une souche, soit en permettant l'expression d'un ou plusieurs gènes nouveaux, soit en modifiant l'expression de gènes déjà présents dans la cellule. La présente invention fournit l'ensemble des séquences naturellement actives chez L. lactis permettant l'expression des gènes. Elle permet ainsi la détermination de l'ensemble des séquences exprimées chez L. lactis. Elle fournit également un outil permettant de repérer les gènes dont l'expression suit un schéma donné. Pour réaliser cela, l'ADN de tout ou partie des gènes de L. lactis peut être amplifié grâce à des amorces selon l'invention, puis fixé à un support comme par exemple le verre ou le nylon ou une puce à ADN, afin de construire un outil permettant de suivre le profil d'expression de ces gènes. Cet outil, constitué de ce support contenant les séquences codantes sert de matrice d'hybridation à un mélange de molécules marquées reflétant les ARN messagers exprimés dans la cellule (en particulier les sondes marquées selon l'invention). En répétant cette expérience à différents instants et en combinant l'ensemble de ces données par un traitement approprié, on obtient alors les profils d'expression de l'ensemble de ces gènes. La connaissance des séquences qui suivent un schéma de régulation donnée peut aussi être mise à profit pour rechercher de manière dirigée, par exemple par homologie, d'autres séquences suivant globalement, mais de manière légèrement différente le même schéma de régulation. En complément, il est possible d'isoler chaque séquence de contrôle présente en amont des segments servant de sondes et d'en suivre l'activité à l'aide de moyen approprié comme un gène raporteur (luciférase, ss-galactosidase, GFP). Ces séquences isolées peuvent ensuite être modifiées et assemblées par ingénierie métabolique avec des séquences d'intérêt en vue de leur expression optimale. Indeed, the control of gene expression is a critical point for optimizing the growth and yield of a strain, either by allowing the expression of one or more new genes, or by modifying the expression of genes already present in the cell. The present invention provides all of the sequences naturally active in L. lactis allowing the expression of genes. It thus makes it possible to determine all of the sequences expressed in L. lactis. It also provides a tool for identifying genes whose expression follows a given pattern. To achieve this, the DNA of all or part of the genes of L. lactis can be amplified using primers according to the invention, then fixed to a support such as for example glass or nylon or a DNA chip, in order to construct a tool to follow the expression profile of these genes. This tool, consisting of this support containing the coding sequences, serves as a hybridization matrix for a mixture of labeled molecules reflecting the messenger RNAs expressed in the cell (in particular the labeled probes according to the invention). By repeating this experiment at different times and by combining all of these data by appropriate processing, the expression profiles of all of these genes are then obtained. Knowledge of the sequences which follow a given regulatory scheme can also be used to seek in a directed manner, for example by homology, other sequences following overall, but in a slightly different manner, the same regulatory scheme. In addition, it is possible to isolate each control sequence present upstream from the segments serving as probes and to monitor its activity using appropriate means such as a reporter gene (luciferase, ss-galactosidase, GFP). These isolated sequences can then be modified and assembled by metabolic engineering with sequences of interest for their optimal expression.
La présente invention donne la liste de nombreux gènes codant pour des The present invention lists numerous genes encoding
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protéines régulant la transcription des gènes de L. lactis (Tableau Et). Modifier la structure ou l'intégrité de ces gènes pourra permettre de modifier l'expression des gènes cibles contrôlés par des promoteurs cibles de ces régulateurs. Les indications données par le Tableau II permettent de plus à l'homme du métier de choisir le ou les régulateurs pertinents pour l'application recherchée ainsi que leur cible, ce qui permet l'optimisation de l'expression de gènes d'intérêt. Par exemple l'inactivation du gène kdgR augmente la transcription des gènes de la voie d'Entner Dodouroff, codés par les gènes qui lui sont contigus, et transcrits dans le sens opposé (ORF 1674 et
1675). L'utilisation des outils précédemment décrits tels les puces à ADN, permet aussi de repérer l'ensemble des gènes dont la régulation est modifiée par cette inactivation. Il est ainsi possible de sélectionner un ensemble de séquence de contrôle répondant, à des nuances près, à un même type de régulation. Ces séquences peuvent être alors utilisées pour contrôler l'expression de gènes d'intérêt. proteins regulating the transcription of L. lactis genes (Table Et). Modifying the structure or integrity of these genes may make it possible to modify the expression of the target genes controlled by target promoters of these regulators. The indications given in Table II also allow those skilled in the art to choose the relevant regulator (s) for the desired application as well as their target, which allows optimization of the expression of genes of interest. For example, the inactivation of the kdgR gene increases the transcription of the genes of the Entner Dodouroff pathway, encoded by the genes which are contiguous to it, and transcribed in the opposite direction (ORF 1674 and
1675). The use of the tools described above, such as DNA chips, also makes it possible to identify all the genes whose regulation is modified by this inactivation. It is thus possible to select a set of control sequences responding, with some nuances, to the same type of regulation. These sequences can then be used to control the expression of genes of interest.
L'invention concerne également les polypeptides codés par une séquence nucléotidique selon l'invention, de préférence, par un fragment représentatif de la séquence SEQ ID N 1 et correspondant à une séquence ORF. En particulier, les polypeptides de Lactococcus lactis caractérisés en ce qu'ils sont choisis parmi les séquences SEQ ID N 2 à SEQ ID N 2323 sont objet de l'invention. The invention also relates to the polypeptides encoded by a nucleotide sequence according to the invention, preferably by a fragment representative of the sequence SEQ ID N 1 and corresponding to an ORF sequence. In particular, the Lactococcus lactis polypeptides characterized in that they are chosen from the sequences SEQ ID N 2 to SEQ ID N 2323 are subject of the invention.
L'invention comprend également les polypeptides caractérisés en ce qu'ils comprennent un polypeptide choisi parmi : a) un polypeptide selon l'invention ; b) un polypeptide présentant au moins 80 % de préférence 85 %, 90 %,
95 % et 98 % d'identité avec un polypeptide selon l'invention ; c) un fragment d'au moins 5 acides aminés d'un polypeptide selon l'invention, ou tel que défini en b) ; d) un fragment biologiquement actif d'un polypeptide selon l'invention, ou tel que défini en b) ou c) ; e) un polypeptide modifié d'un polypeptide selon l'invention, ou tel que défini en b), c) ou d). The invention also comprises the polypeptides characterized in that they comprise a polypeptide chosen from: a) a polypeptide according to the invention; b) a polypeptide exhibiting at least 80%, preferably 85%, 90%,
95% and 98% identity with a polypeptide according to the invention; c) a fragment of at least 5 amino acids of a polypeptide according to the invention, or as defined in b); d) a biologically active fragment of a polypeptide according to the invention, or as defined in b) or c); e) a modified polypeptide of a polypeptide according to the invention, or as defined in b), c) or d).
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Les séquences nucléotidiques codant pour les polypeptides décrits précédemment sont également objet de l'invention. The nucleotide sequences encoding the polypeptides described above are also the subject of the invention.
Dans la présente description, les termes polypeptides, séquences polypeptidiques, peptides et protéines sont interchangeables. In the present description, the terms polypeptides, polypeptide sequences, peptides and proteins are interchangeable.
Il doit être compris que l'invention ne concerne pas les polypeptides sous forme naturelle, c'est-à-dire qu'ils ne sont pas pris dans leur environnement naturel mais qu'ils ont pu être isolés ou obtenus par purification à partir de sources naturelles, ou bien obtenus par recombinaison génétique, ou par synthèse chimique, et qu'ils peuvent alors comporter des acides aminés non naturels comme cela sera décrit plus loin. It should be understood that the invention does not relate to the polypeptides in natural form, that is to say that they are not taken in their natural environment but that they could be isolated or obtained by purification from natural sources, or else obtained by genetic recombination, or by chemical synthesis, and that they can then contain non-natural amino acids as will be described below.
Par polypeptide présentant un certain pourcentage d'identité avec un autre, que l'on désignera également par polypeptide homologue, on entend désigner les polypeptides présentant par rapport aux polypeptides naturels, certaines modifications, en particulier une délétion, addition ou substitution d'au moins un acide aminé, une troncation, un allongement, une solution chimérique et/ou une mutation, ou les polypeptides présentant des modifications posttraductionnelles. Parmi les polypeptides homologues, on préfère ceux dont la séquence d'acides aminés présentent au moins 80 %, de préférence 85 %, 90 %, 95 % et 98 % d'homologie avec les séquences d'acides aminés des polypeptides selon l'invention. Dans le cas d'une substitution, un ou plusieurs acide(s) aminé (s) consécutifs) ou non consécutif(s) sont remplacés par des acides aminés équivalents . L'expression acides aminés équivalents vise ici à désigner tout acide aminé susceptible d'être substitué à l'un des acides aminés de la structure de base sans cependant modifier essentiellement les activités biologiques des peptides correspondant et telles qu'elles seront définies par la suite. By polypeptide exhibiting a certain percentage of identity with another, which will also be denoted by homologous polypeptide, is meant polypeptides exhibiting, with respect to natural polypeptides, certain modifications, in particular a deletion, addition or substitution of at least an amino acid, a truncation, an extension, a chimeric solution and / or a mutation, or the polypeptides exhibiting post-translational modifications. Among the homologous polypeptides, preference is given to those whose amino acid sequence exhibit at least 80%, preferably 85%, 90%, 95% and 98% homology with the amino acid sequences of the polypeptides according to the invention. . In the case of a substitution, one or more consecutive or non-consecutive amino acid (s) are replaced by equivalent amino acids. The expression equivalent amino acids is intended here to denote any amino acid capable of being substituted for one of the amino acids of the basic structure without, however, essentially modifying the biological activities of the corresponding peptides and as they will be defined below. .
Ces acides aminés équivalents peuvent être déterminés soit en s'appuyant sur leur homologie de structure avec les acides aminés auxquels ils se substituent, soit sur des résultats d'essais comparatifs d'activité biologique These equivalent amino acids can be determined either by relying on their structural homology with the amino acids for which they are substituted, or on the results of comparative tests of biological activity.
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entre les différents polypeptides susceptibles d'être effectués. between the different polypeptides likely to be made.
A titre d'exemple, on mentionne les possibilités de substitution susceptibles d'être effectuées sans qu'il résulte en une modification approfondie de l'activité biologique du polypeptide modifié correspondant. On peut remplacer ainsi la leucine par la valine ou l'isoleucine, l'acide aspartique par l'acide glutamine, la glutamine par l'asparagine, l'arginine par la lysine, etc... les substitutions inverses étant naturellement envisageables dans les mêmes conditions. By way of example, mention is made of the substitution possibilities capable of being carried out without resulting in a thorough modification of the biological activity of the corresponding modified polypeptide. Leucine can thus be replaced by valine or isoleucine, aspartic acid by glutamine acid, glutamine by asparagine, arginine by lysine, etc. same conditions.
Les polypeptides homologues correspondent également aux polypeptides codés par les séquences nucléotidiques homologues ou identiques, telles que définies précédemment et comprennent ainsi dans la présente définition des polypeptides mutés ou correspondant à des variations inter ou intra espèces, pouvant exister chez Lactococcus, et qui correspondent notamment à des troncatures, substitutions, délétions et/ou additions, d'au moins un résidu d'acides aminés. The homologous polypeptides also correspond to the polypeptides encoded by the homologous or identical nucleotide sequences, as defined above and thus include in the present definition polypeptides which are mutated or corresponding to inter or intra species variations, which may exist in Lactococcus, and which correspond in particular to truncations, substitutions, deletions and / or additions, of at least one amino acid residue.
Il est entendu que l'on calcule le pourcentage d'identité entre deux polypeptides de la même façon qu'entre deux séquences d'acides nucléiques. It is understood that the percentage identity between two polypeptides is calculated in the same way as between two nucleic acid sequences.
Ainsi, le pourcentage d'identité entre deux polypeptides est calculé après alignement optimal de ces deux séquences, sur une fenêtre d'homologie maximale. Pour définir ladite fenêtre d'homologie maximale, on peut utiliser les mêmes algorithmes que pour les séquences d'acide nucléique. Thus, the percentage identity between two polypeptides is calculated after optimal alignment of these two sequences, over a window of maximum homology. To define said maximum homology window, the same algorithms can be used as for the nucleic acid sequences.
Par fragment biologiquement actif d'un polypeptide selon l'invention, on entend désigner en particulier un fragment de polypeptide, tel que défini ciaprès, présentant au moins une des caractéristiques biologiques des polypeptides selon l'invention, notamment en ce qu'il est capable d'exercer de manière générale une activité même partielle, tel que par exemple : une activité enzymatique (métabolique) ou une activité pouvant être impliquée dans la biosynthèse ou la biodégradation de composés organiques ou inorganiques ; The term “biologically active fragment of a polypeptide according to the invention” is intended to denote in particular a fragment of a polypeptide, as defined below, exhibiting at least one of the biological characteristics of the polypeptides according to the invention, in particular in that it is capable of to exercise in general an activity, even partial, such as for example: an enzymatic (metabolic) activity or an activity which can be involved in the biosynthesis or biodegradation of organic or inorganic compounds;
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- une activité structurelle (enveloppe cellulaire, molécule chaperonne, ribosome) ; - une activité de transport (d'énergie, d'ion) ; dans la sécrétion de protéine ; - une activité dans le processus de réplication, amplification, préparation, transcription, traduction ou maturation, notamment de l' ADN, de l'ARN ou des protéines. - structural activity (cell envelope, chaperone molecule, ribosome); - a transport activity (energy, ion); in protein secretion; - an activity in the process of replication, amplification, preparation, transcription, translation or maturation, in particular of DNA, RNA or proteins.
Par fragment de polypeptides selon l'invention, on entend désigner un polypeptide comportant au minimum 5 acides aminés, de préférence 10,15, 25, 50,100 et 150 acides aminés. The term “polypeptide fragment according to the invention” is intended to denote a polypeptide comprising at least 5 amino acids, preferably 10,15, 25, 50,100 and 150 amino acids.
Les fragments de polypeptides peuvent correspondre à des fragments isolés ou purifiés naturellement présents dans les souches de Lactococcus, ou à des fragments qui peuvent être obtenus par clivage dudit polypeptide par une enzyme protéolitique telle que la trypsine ou la chymotrypsine ou la collagénase, par un réactif chimique (bromure de cyanogène, CNBr) ou en plaçant ledit polypeptide dans un environnement très acide (par exemple à pH = 2,5). Des fragments polypeptidiques peuvent également être préparés par synthèse chimique, à partir d'hôtes transformés par un vecteur d'expression selon l'invention qui contiennent un acide nucléique permettant l'expression dudit fragment, et placé sous le contrôle des éléments de régulation et/ou d'expression appropriés. The polypeptide fragments can correspond to isolated or purified fragments naturally present in the strains of Lactococcus, or to fragments which can be obtained by cleavage of said polypeptide by a proteolytic enzyme such as trypsin or chymotrypsin or collagenase, by a reagent. chemical (cyanogen bromide, CNBr) or by placing said polypeptide in a very acidic environment (for example at pH = 2.5). Polypeptide fragments can also be prepared by chemical synthesis, from hosts transformed by an expression vector according to the invention which contain a nucleic acid allowing the expression of said fragment, and placed under the control of regulatory elements and / or appropriate expression.
Par polypeptide modifié d'un polypeptide selon l'invention, on entend désigner un polypeptide obtenu par recombinaison génétique ou par synthèse chimique comme décrit plus loin, qui présente au moins une modification par rapport à la séquence normale. Ces modifications peuvent être notamment portées sur des acides aminés nécessaires pour la spécificité ou l'efficacité de l'activité, ou à l'origine de la conformation structurale, de la charge, ou de l'hydrophobicité du polypeptide selon l'invention. On peut ainsi créer des polypeptides d'activité équivalente, augmentée ou diminuée, ou de The term “modified polypeptide of a polypeptide according to the invention” is intended to denote a polypeptide obtained by genetic recombination or by chemical synthesis as described below, which exhibits at least one modification with respect to the normal sequence. These modifications can in particular be carried out on amino acids necessary for the specificity or the effectiveness of the activity, or at the origin of the structural conformation, the charge, or the hydrophobicity of the polypeptide according to the invention. It is thus possible to create polypeptides of equivalent, increased or decreased activity, or of
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spécificité équivalente, plus étroite ou plus large. Parmi les polypeptides modifiés, il faut citer les polypeptides dans lesquels jusqu'à cinq acides aminés peuvent être modifiés, tronqués à l'extrémité N ou C-terminale, ou bien délétés, ou ajoutés. equivalent, narrower or wider specificity. Among the modified polypeptides, mention should be made of polypeptides in which up to five amino acids can be modified, truncated at the N or C-terminus, or else deleted, or added.
Comme cela est indiqué, les modifications d'un polypeptide ont pour objectifnotamment : - de permettre sa mise en #uvre dans des procédés de biosynthèse ou de biodégradation de composés organiques ou inorganiques, - de permettre sa mise en oeuvre dans des procédés de réplication, d'amplification, de réparation et règle de transcription, de traduction, ou de maturation notamment de l'ADN, l'ARN, ou de protéines, - de permettre sa sécrétion améliorée, - de modifier sa solubilité, l'efficacité ou la spécificité de son activité, ou encore de faciliter sa purification. As indicated, the objective of the modifications of a polypeptide is in particular: - to allow its use in processes of biosynthesis or biodegradation of organic or inorganic compounds, - to allow its use in processes of replication, amplification, repair and rule of transcription, translation, or maturation in particular of DNA, RNA, or proteins, - to allow its improved secretion, - to modify its solubility, efficiency or specificity of its activity, or to facilitate its purification.
La synthèse chimique présente également l'avantage de pouvoir utiliser des acides aminés non naturels ou des liaisons non peptidiques. Ainsi, il peut être intéressant d'utiliser des acides aminés non naturels, par exemple sous forme D, ou des analogues d'acides aminés, notamment des formes soutirées. Chemical synthesis also has the advantage of being able to use unnatural amino acids or non-peptide bonds. Thus, it may be advantageous to use unnatural amino acids, for example in D form, or amino acid analogs, in particular withdrawn forms.
La présente invention fournit toutes les séquences nucléotidiques et polypeptidiques du génome de Lactococcus lactis IL 1403. Par ailleurs, il est un objet de la présente invention que de divulguer les fonctions de ces gènes et protéines (Tableau II). The present invention provides all the nucleotide and polypeptide sequences of the genome of Lactococcus lactis IL 1403. Furthermore, it is an object of the present invention to disclose the functions of these genes and proteins (Table II).
Ainsi, à chaque cadre ouvert de lecture présenté dans le Tableau 1 est assigné un descriptif sur son rôle (Tableau II). Les gènes ont ensuite été classés en catégories selon une classification adaptée des gènes de E coli (Riley, Functions of the gene products of Escherichia coli, Microbiology Reviews 57: 862,1993). Cela permet à l'homme du métier de repérer les gènes utilisés dans une fonction métabolique donnée, puis d'isoler ce ou ces gènes dans des buts d'application en relation avec sa problématique, en y incluant des applications Thus, each open reading frame presented in Table 1 is assigned a description of its role (Table II). The genes were then classified into categories according to an adapted classification of the genes of E. coli (Riley, Functions of the gene products of Escherichia coli, Microbiology Reviews 57: 862,1993). This allows a person skilled in the art to identify the genes used in a given metabolic function, then to isolate this or these genes for application purposes in relation to his problem, by including applications therein.
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industrielles directes (modification des souches) ou indirectes (outil de diagnostique et ses applications). Les gènes décrits dans l'invention ont été isolés sur des fragment d'ADN grâce à des amorces déduites de la séquence de L. lactis IL 1403. Le Tableau III donne les noms des gènes correspondants aux ORF, ainsi que les protéines correspondantes d'autres organismes après comparaison avec la banque de données Swiss prot. direct industrial (modification of strains) or indirect (diagnostic tool and its applications). The genes described in the invention were isolated from DNA fragments using primers deduced from the sequence of L. lactis IL 1403. Table III gives the names of the genes corresponding to the ORFs, as well as the corresponding proteins of other organizations after comparison with the Swiss prot database.
Les enzymes de biosynthèses d'acides aminés
Dans cette partie sont groupés les cadres ouverts de lecture correspondant aux protéines impliquées dans les réactions catalytiques des voies du métabolisme primaire, intermédiaire, secondaire, la fabrication de molécules complexes ou plus simples. Les voies identifiées ont été déterminées d'après les connaissances relatives aux besoins nutritionnels de ces bactéries et leurs possibilités métaboliques. L'ensemble des gènes impliqués dans les voies de biosynthèse des acides aminés est divulgué. Certaines de ces voies ont été identifiées auparavant tel que les voies de biosynthèse de l'histidine, du tryptophane, des acides aminés branchés ainsi que quelques gènes impliqués dans différentes autrés voies. Amino acid biosynthesis enzymes
In this part are grouped the open reading frames corresponding to the proteins involved in the catalytic reactions of the pathways of primary, intermediate and secondary metabolism, the manufacture of complex or simpler molecules. The pathways identified were determined based on knowledge of the nutritional needs of these bacteria and their metabolic possibilities. All the genes involved in the biosynthetic pathways of amino acids are disclosed. Some of these pathways have been identified previously such as the pathways for the biosynthesis of histidine, tryptophan, branched amino acids as well as some genes involved in different other pathways.
La synthèse de vitamines
La synthèse de vitamines peut avoir un intérêt certain pour une bactérie alimentaire comme L. lactis. Cette bactérie est capable de synthétiser naturellement un certain nombre de vitamines, et la connaissance des gènes menant à leur synthèse permet à l'homme du métier d'optimiser l'expression de ces gènes ou de les modifier en vue d'augmenter la production de ces vitamines. Les bactéries ainsi modifiées peuvent être utilisées soit dans des procédés de fabrication de concentré de vitamines, soit directement dans l'alimentation afin d'obtenir un produit enrichi en vitamine. Comme il est indiqué au Tableau II, les gènes nécessaires à la synthèse de quatre cofacteurs, l'acide folique, la ménaquinone, la riboflavine et la thiorédoxine ont été identifiés. Synthesis of vitamins
The synthesis of vitamins can have a certain interest for a food bacterium like L. lactis. This bacterium is capable of naturally synthesizing a certain number of vitamins, and knowledge of the genes leading to their synthesis enables those skilled in the art to optimize the expression of these genes or to modify them in order to increase the production of these vitamins. The bacteria thus modified can be used either in manufacturing processes for vitamin concentrate, or directly in the diet in order to obtain a product enriched in vitamin. As indicated in Table II, the genes necessary for the synthesis of four cofactors, folic acid, menaquinone, riboflavin and thioredoxin have been identified.
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Les gènes à activité peptidolytique
Les gènes codant pour des enzymes protéolytiques ont été systématiquement recherchés. Un certains nombre d'entre eux avaient déjà été caractérisés et leur fonction décrite tel pepN, pepC, pepF, pepO, pepA, pepP, pep V, pepX clpP and clpY et d'autres étaient encore inconnus du public tels pepQ, pepM, pepDAI, pepDA2, ycjE, htrA. Ces enzymes ont un rôle crucial dans la nutrition azotée des bactéries lactiques et participent à la dégradation des peptides dans les produits fermentés, en particulier les fromages. Cet enzyme participe aussi à d'autres processus cellulaires comme la dégradation de protéines permettant le renouvellement des protéines ou même de protéines héterologues limitant ainsi leur production. D'autres protéines participent à la formation de la paroi comme vanY ou à des processus plus généraux comme la dégradation de protéines entrant dans divers processus cellulaires pour pi136, yudC, yudDyujB and yufD. Genes with peptidolytic activity
The genes encoding proteolytic enzymes have been systematically sought. A number of them had already been characterized and their function described such as pepN, pepC, pepF, pepO, pepA, pepP, pep V, pepX clpP and clpY and others were still unknown to the public such as pepQ, pepM, pepDAI , pepDA2, ycjE, htrA. These enzymes play a crucial role in the nitrogen nutrition of lactic acid bacteria and participate in the degradation of peptides in fermented products, in particular cheeses. This enzyme also participates in other cellular processes such as the degradation of proteins allowing the renewal of proteins or even heterologous proteins thus limiting their production. Other proteins participate in the formation of the wall like vanY or in more general processes like the degradation of proteins entering in various cellular processes for pi136, yudC, yudDyujB and yufD.
Les gènes de laglycolyse
Les enzymes impliqués dans la glycolyse ont été plus particulièrement étudiés. Les gènes impliqués dans la glycolyse ont été détectés dans différentes parties du chromosome de la souche IL1403. Ce sont enoA (633 kb) et enoB (274 kb) codant pour l'énolase, pgk (242 kb) codant pour la phosphoglycérate kinase, pgm (332 kb) codant pour la phosphoglycérate mutase, pgmB (442 kb) codant pour la betta-phosphoglycomutase, gapA (554 kb) et gapB (2315 kb) codant pour la glycéraldéhyde 3-phosphate déhydrogénase, tpiA (1148 kb) codant pour la trioséphosphate isomérase, pyk (1370 kb) codant pour la pyruvate kinase, fbaA (1963 kb) codant pour la fructose-bisphosphate aldolase, pgiA (2228 kb) codant pour la glucose-6-phosphate isomérase. En synthétisant des oligonucléotides homologues aux séquences de contigs proches des zones où ces gènes ont été détectés dans IL1403, et en effectuant des amplifications de type LR PCR sur l'ADN chromosomique de MG1363, des produits The genes of glycolysis
The enzymes involved in glycolysis have been more particularly studied. The genes involved in glycolysis have been detected in different parts of the chromosome of strain IL1403. These are enoA (633 kb) and enoB (274 kb) encoding the enolase, pgk (242 kb) encoding the phosphoglycerate kinase, pgm (332 kb) encoding the phosphoglycerate mutase, pgmB (442 kb) encoding the betta -phosphoglycomutase, gapA (554 kb) and gapB (2315 kb) encoding glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, tpiA (1148 kb) encoding triosephosphate isomerase, pyk (1370 kb) encoding pyruvate kinase, fbaA (1963 kb) encoding fructose-bisphosphate aldolase, pgiA (2228 kb) encoding glucose-6-phosphate isomerase. By synthesizing oligonucleotides homologous to the sequences of contigs close to the areas where these genes have been detected in IL1403, and by carrying out LR PCR-type amplifications on the chromosomal DNA of MG1363, products
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d'amplification contenant les gènes de la glycolyse ont été obtenus. Ces gènes représentent l'ensemble complet des gènes de la glycolyse ayant pu être trouvés chez L. lactis. Cette méthode peut être appliquées aux autres souches de L. amplification containing the genes for glycolysis were obtained. These genes represent the complete set of genes for glycolysis that could be found in L. lactis. This method can be applied to other strains of L.
Lactis pour la détection des gènes de la glycolyse dans l'environnement génétique le plus adéquat pour l'industrie. La modification des ces gènes par mutagénèse a permis la construction de nouvelles souches dites food-grade , qui ont de nombreuses applications dans l'industrie alimentaire et l'agriculture. Lactis for the detection of glycolysis genes in the most suitable genetic environment for industry. The modification of these genes by mutagenesis has allowed the construction of new so-called food-grade strains, which have numerous applications in the food industry and agriculture.
En particulier, il a montré qu'il existait 2 copies des gènes gap codant pour la glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogénase et eno codant pour l'énolase. Il a été aussi montré que le gène gap précédemment isolé n'était pas exprimé de manière significative lors de croissances dans différents milieux, et ne codait donc pas pour le gène réellement impliqué dans la glycolyse. Une analyse détaillée de la séquence montre que le second gène gap identifié possède des propriétés qui suggèrent fortement qu'il s'agit du gène réellement actif lors de la glycolyse. Premièrement, son biais de codon est très fort et semblable aux autres gènes de la glycolyse tels ceux de l'opéron las, pgi, fdp et tpi. Deuxièmement, il possède une séquence de régulation (boîte CRE) en amont de la boîte -35 de son promoteur, permettant son activation lors de l'assimilation du sucre rapide. Enfin, il a été démontré expérimentalement que ce gène était fortement exprimé lors de croissance exponentielle, et qu'il était indispensable à la croissance cellulaire (son inactivation est létale). Le gène gap de la glycolyse a été isolé sur un plasmide de E. coli (pGEM) et son expression dans E. coli restaure la croissance de mutants gap dans les milieux appropriés. Ce gène pourrait donc être utilisé pour augmenter l'activité GAPDH dans des souches où cette activité est limitante pour la vitesse d'acidification. Une telle construction mènera à l'obtention d'une souche acidifiant plus vite le lait, une propriété recherchée dans certains procédés industriels. Un travail comparable peut être réalisé sur les autres enzymes de cette voie. In particular, it has shown that there are 2 copies of the gap genes encoding glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase and eno encoding enolase. It was also shown that the previously isolated gap gene was not significantly expressed during growth in different media, and therefore did not code for the gene actually involved in glycolysis. A detailed analysis of the sequence shows that the second gap gene identified has properties which strongly suggest that it is the gene actually active during glycolysis. First, its codon bias is very strong and similar to other glycolysis genes such as those of the las, pgi, fdp and tpi operon. Second, it has a regulatory sequence (CRE box) upstream of the -35 box of its promoter, allowing its activation during rapid sugar uptake. Finally, it has been demonstrated experimentally that this gene was strongly expressed during exponential growth, and that it was essential for cell growth (its inactivation is lethal). The glycolysis gap gene was isolated on an E. coli plasmid (pGEM) and its expression in E. coli restores the growth of gap mutants in the appropriate media. This gene could therefore be used to increase GAPDH activity in strains where this activity is limiting for the rate of acidification. Such a construction will lead to obtaining a strain which acidifies the milk more quickly, a property which is sought after in certain industrial processes. Comparable work can be done on the other enzymes in this pathway.
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Les voies d'assimilation secondaire des sucres
L. lactis est capable d'utiliser un grand nombre de carbohydrates (de manière non limitative: L-arabinose, ribose, D-xylose, galactose, glucose, fiuctose, mannose, mannitol, N-acetyl glucoseamine, amygdaline, arbutine, esculine, salicine, cellobiose, maltose, lactose, melibiose, saccharose, trehalose, raffinose, amidon, gentiobiose, gluconate). Les gènes impliqués dans l'entrée de ces sucres et leur transformation pour rejoindre une des étapes de la glycolyse sont présentés au Tableau II. Pour illustrer, deux gènes impliqués dans la voie des pentoses phosphates ont été identifiés : la transkétolase (YqgF) et la phosphokétolase (YpdE). Un fragment interne a été utilisé pour inactiver l'un ou l'autre de ces gènes dans la souche de L. lactis NCD02118. Les mutants ainsi obtenus sont affectés dans le métabolisme des sucres et accusent des retards de croissance, en particulier en présence de xylose pour la souche ypdE. L'activité de ces gènes peut également être amplifiée en plaçant l'un ou l'autre de ces gènes sous contrôle d'un promoteur régulé différemment. Un travail similaire avec les autres gènes de ces voies permettra de construire des souches de L. lactis avec des capacités fermentaires nouvelles. En particulier, la modification additionnelle de l'expression des gènes codant (i) pour la glucose 6-phosphate déhydrogénase (zwf), la gluconate déshydrogénase (gnd), la ribulose phosphate isomérase (rpiA) ou pour (ii) des gènes de la voie d'Entner- Dodouroff (kdg, uxu et yqhA présent en amont de la transkétolase) et la gluconate phosphate déshydrogénase devrait permettre de produire des souches de L. lactis hétérofermentaires vraies à partir de sucre métabolisé en glucose 6-phosphate. Secondary sugars assimilation routes
L. lactis is able to use a large number of carbohydrates (without limitation: L-arabinose, ribose, D-xylose, galactose, glucose, fiuctose, mannose, mannitol, N-acetyl glucoseamine, amygdalin, arbutin, esculin, salicin, cellobiose, maltose, lactose, melibiose, sucrose, trehalose, raffinose, starch, gentiobiose, gluconate). The genes involved in the entry of these sugars and their transformation to join one of the steps of glycolysis are presented in Table II. To illustrate, two genes involved in the pentose phosphate pathway have been identified: transketolase (YqgF) and phosphoketolase (YpdE). An internal fragment was used to inactivate one or the other of these genes in the strain of L. lactis NCD02118. The mutants thus obtained are affected in the metabolism of sugars and show growth delays, in particular in the presence of xylose for the ypdE strain. The activity of these genes can also be amplified by placing one or the other of these genes under the control of a promoter regulated differently. Similar work with the other genes of these pathways will allow the construction of strains of L. lactis with new fermentation capacities. In particular, the additional modification of the expression of the genes encoding (i) for glucose 6-phosphate dehydrogenase (zwf), gluconate dehydrogenase (gnd), ribulose phosphate isomerase (rpiA) or for (ii) genes of Entner-Dodouroff pathway (kdg, uxu and yqhA present upstream of transketolase) and gluconate phosphate dehydrogenase should make it possible to produce true heterofermentative strains of L. lactis from sugar metabolized to glucose 6-phosphate.
Les gènes impliqués dans la formation et la régulation de l 'ensemble des produits defermentation
Les produits de fermentation sont ce qu'il y a de plus important pour la formation de l'arôme du fromage par Lactococcus lactis. Dans les conditions habituellement appliquées pour la production fromagère, 95 % du sucre utilisé est converti en acide lactique. D'autres produits importants pour la fermentation sont The genes involved in the formation and regulation of all of the fermentation products
Fermentation products are most important for the formation of cheese aroma by Lactococcus lactis. Under the conditions usually applied for cheese production, 95% of the sugar used is converted into lactic acid. Other important products for fermentation are
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l'éthanol, le fumarate et l'acétate. Une petite partie, habituellement moins de 1 %, du pyruvate produit durant la glycolyse est convertie en alpha-acétolactate, qui est distribué entre les acides aminés branchés et les produits de la branche de formation des acétoïnes : diacétyl, acétoïne ou 2,3-butanediol. L'interaction de ces gènes et leur régulation sont importantes pour la formation de l'ensemble des produits de fermentation. La présente invention fournie les outils pour détecter tous les gènes chromosomiques des bactéries du genre lactococci, impliquées dans la formation de produits de fermentation. Ces produits sont importants pour l'arôme du produit fromager final. Plusieurs gènes ont déjà été détectés auparavant. Ceux-ci incluent la lactate déhydrogénase, la pyruvate formate lyase, a-acétolactate synthase, aacétolactate décarboxylase. De nouveaux gènes potentiels impliqués dans cette voie, sont fournis par cette invention, détectés durant l'annotation. Ce sont d'autres putatives alpha-acétolactate décarboxylase (aldC gene), diacétyl réductase (butB), acétoïne réductase (butA), pyruvate déhydrogénase (pdhABCD), acétate kinase (acdAl, acdA2), alcool déhydrogénase (adhA, adhE). En manipulant ces gènes par des méthodes de génie génétique ou de génétique, l'homme du métier peut influencer l'arôme du produit final fromager de la façon désirée. D'autres enzymes, qui peuvent être utilisées pour changer l'emsemble des produits de fermentation, sont les NADH oxidases. Ces gènes sont codés par ndhA, yieA, yieB, yphA, ydjE, yhjd, yrfB, nox. La présente invention fournit les outils pour détecter ces gènes dans les différentes souches de L. lactis et pour créer des bactéries food-grade capables de produire ces métabolites importants pour les arômes comme le diacétyl. ethanol, fumarate and acetate. A small part, usually less than 1%, of the pyruvate produced during glycolysis is converted into alpha-acetolactate, which is distributed between branched amino acids and the products of the acetoin formation branch: diacetyl, acetoin or 2,3- butanediol. The interaction of these genes and their regulation are important for the formation of all fermentation products. The present invention provides the tools for detecting all the chromosomal genes of bacteria of the lactococci genus, involved in the formation of fermentation products. These products are important for the flavor of the final cheese product. Several genes have already been detected before. These include lactate dehydrogenase, pyruvate formate lyase, α-acetolactate synthase, aacetolactate decarboxylase. New potential genes involved in this pathway are provided by this invention, detected during annotation. These are other putative alpha-acetolactate decarboxylase (aldC gene), diacetyl reductase (butB), acetoin reductase (butA), pyruvate dehydrogenase (pdhABCD), acetate kinase (acdAl, acdA2), alcohol dehydrogenase (adhA, adhE). By manipulating these genes by genetic engineering or genetic methods, one skilled in the art can influence the flavor of the final cheese product as desired. Other enzymes, which can be used to change all of the fermentation products, are NADH oxidases. These genes are encoded by ndhA, yieA, yieB, yphA, ydjE, yhjd, yrfB, nox. The present invention provides the tools for detecting these genes in the different strains of L. lactis and for creating food-grade bacteria capable of producing these important metabolites for flavors, such as diacetyl.
Les gènes liés à l'activité des bactériophages
Les bactériophages constituent l'un des problèmes majeurs de l'industrie laitière. Ils sont à l'origine de perturbations importantes de les fermentations et par ce biais, de pertes économiques. De nombreux efforts ont été consacrés au développement de méthodes permettant de contrôler leur développement au cours des procédés de fabrication fromagère. On peut Genes linked to the activity of bacteriophages
Bacteriophages are one of the major problems in the dairy industry. They are the source of major disturbances in fermentations and, through this, of economic losses. Much effort has been devoted to the development of methods to control their development during cheese manufacturing processes. We can
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envisager en particulier de cloner sur un plasmide ou dans le chromosome de souches à utilisation industrielle, des gènes bactériens et/ou de bactériophages dont les produits limitent le développement de phages infectants On peut également développer des systèmes artificiels de résistance mimant les mécanismes naturels dits d'infection abortive, dans lesquels les cellules infectées meurent sans multiplier les phages. Dans ce but, un gène toxique pour la bactérie, placé sous le contrôle d'un promoteur de phage dont l'expression est induite après infection par un phage similaire est cloné sur un plasmide (Djordjevic, G. M., and Klaenhammer, T. R. (1997) Bacteriophage-triggered defense systems : phage adaptation and design improvements. Appl Environ Microbiol 63 :4370-4376 ; Walker, S. A., and Klaenhammer, T. R. (1998) Molecular characterization of a phage-inducible middle promoter and its transcriptional activator from the lactococcal bacteriophage #31. J Bacteriol
180 : 921-931) ou sur le chromosome bactérien. La présente invention, décrit les gènes de la souche IL 1403 et de six prophages identifiés sur son chromosome. Cinq de ces prophages ont été identifiés expérimentalement par induction de leur cycle de croissance lytique après exposition à un agent endommageant l'ADN (Ultra-Violets ou Mitomycine C). La présente invention apporte donc la possibilité d'identifier des gènes de bactérie ou de phage répondant à l'une ou l'autre des propriétés citées ci-dessus. A savoir : des gènes qui perturbent le développement d'un phage infectant, des gènes toxiques pour la bactérie, des circuits de régulation induits après infection par un phage. consider in particular to clone on a plasmid or in the chromosome of strains for industrial use, bacterial genes and / or bacteriophages whose products limit the development of infecting phages.Artificial resistance systems can also be developed mimicking the natural mechanisms called d abortive infection, in which infected cells die without multiplying phages. For this purpose, a toxic gene for the bacterium, placed under the control of a phage promoter whose expression is induced after infection by a similar phage is cloned on a plasmid (Djordjevic, GM, and Klaenhammer, TR (1997) Bacteriophage-triggered defense systems: phage adaptation and design improvements. Appl Environ Microbiol 63: 4370-4376; Walker, SA, and Klaenhammer, TR (1998) Molecular characterization of a phage-inducible middle promoter and its transcriptional activator from the lactococcal bacteriophage # 31. J Bacteriol
180: 921-931) or on the bacterial chromosome. The present invention describes the genes of the IL 1403 strain and of six prophages identified on its chromosome. Five of these prophages were identified experimentally by induction of their lytic growth cycle after exposure to a DNA damaging agent (Ultra-Violet or Mitomycin C). The present invention therefore provides the possibility of identifying bacterial or phage genes corresponding to one or other of the properties mentioned above. Namely: genes which disrupt the development of an infecting phage, genes toxic to the bacterium, regulatory circuits induced after infection by a phage.
Il est à noter que les signaux de transcription et traduction des phages ainsi que leurs circuits de régulation peuvent aussi être utilisés pour développer des systèmes d'expression conditionnelle (W095/31563) ou de surexpression (O'Sullivan, D. J., Walker, S. A., West, G., and Klaenhammer, T. R. (1996)
Development of an expression strategy using a lytic phage to trigger explosive plasmid amplification and gene expression. Biotechnology 14: 82-87) de protéines d'intérêt. La présente invention peut donc aussi être utilisée dans ce It should be noted that the phage transcription and translation signals as well as their regulatory circuits can also be used to develop conditional expression systems (WO95 / 31563) or overexpression systems (O'Sullivan, DJ, Walker, SA, West, G., and Klaenhammer, TR (1996)
Development of an expression strategy using a lytic phage to trigger explosive plasmid amplification and gene expression. Biotechnology 14: 82-87) of proteins of interest. The present invention can therefore also be used in this
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but. goal.
Les gènes impliqués dans les systèmes de régulation correspondent aux ORF 38,41, 448,452, 518,1461 et 1472. The genes involved in the regulatory systems correspond to ORFs 38,41, 448,452, 518,1461 and 1472.
Les gènes de réponse au stress
Les lactocoques sont soumis à de nombreux changements environnementaux dans les procédés industriels on peut citer parmi d'autres, des changements de température (chaleur, froid), d'osmolarité (salinité, activité en eau), de pH, d'oxygénation, de conditions redox etc. Une survie optimale de L. lactis à ces changements environnementaux, parfois brusques, est recherchée afin d'améliorer la reproductibilité et le rendement des procédés de fabrication et d'utilisation de ces ferments lactiques. Les lactocoques possèdent des réponses inductibles aux stress notamment aux UV, à la chaleur, au froid, au NaCl, à la présence d'H202, à la carence en sucre, à la bile, à l'acidité. Il faut noter que certains résultats (Kim et al., 1999, FEMS Microbiol Lett., 171,57) soulignent des différences dans les capacités de résistance et d'adaptation aux stress de 2 sous-espèces de lactocoques : L. lactis ssp. lactis et L. lactis ssp. cremoris. Des études protéomiques montrent qu'un certain nombre de protéines sont induites dans plusieurs conditions de stress. Cependant, les protéines impliquées dans la résistance à un ou plusieurs stress ont été, à ce jour rarement identifiées en particulier du fait de l'absence de l'invention qui limitait les possibilités d'identification des spots protéiques. Il est important de souligner néanmoins, que certaines conditions de stress semblent modifier l'expression d'enzymes métaboliques notamment impliqués dans la glycolyse. D'autres études biochimiques, moins globales, corrèlent l'augmentation de certaines activités enzymatiques à une meilleure survie et/ou à l'adaptation des lactocoques à certains stress. Ainsi, la H±ATPase, la désimination de l'arginine, le transport du citrate dans la sous espèce diacetylactis, le transport de solutés compatibles, les NADH-peroxidase et NADH-oxidase sont probablement Stress response genes
Lactococci are subject to many environmental changes in industrial processes, among others, changes in temperature (heat, cold), osmolarity (salinity, water activity), pH, oxygenation, redox conditions etc. Optimal survival of L. lactis to these environmental changes, sometimes abrupt, is sought in order to improve the reproducibility and the yield of the processes for the manufacture and use of these lactic ferments. Lactococci have inducible responses to stress including UV, heat, cold, NaCl, the presence of H2O2, sugar deficiency, bile, acidity. It should be noted that certain results (Kim et al., 1999, FEMS Microbiol Lett., 171,57) highlight differences in the capacities of resistance and adaptation to stress of 2 subspecies of lactococci: L. lactis ssp. lactis and L. lactis ssp. cremoris. Proteomic studies show that a number of proteins are induced under several stress conditions. However, the proteins involved in resistance to one or more stresses have so far been rarely identified, in particular due to the absence of the invention, which limited the possibilities of identifying protein spots. It is important to stress, however, that certain stress conditions seem to modify the expression of metabolic enzymes involved in particular in glycolysis. Other less comprehensive biochemical studies correlate the increase in certain enzymatic activities with better survival and / or the adaptation of lactococci to certain stresses. Thus, the H ± ATPase, the de-elimination of arginine, the transport of citrate in the subspecies diacetylactis, the transport of compatible solutes, the NADH-peroxidase and NADH-oxidase are probably
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impliquées dans des mécanismes d'adaptation aux stress et pour certains, dans la survie en fin de fermentation. involved in mechanisms of adaptation to stress and for some, in survival at the end of fermentation.
Des études génétiques (recherche de gènes conservés ou mutagenèse) ont permis la caractérisation de certains gènes impliqués dans les résistances aux stress. Genetic studies (search for conserved genes or mutagenesis) have enabled the characterization of certain genes involved in resistance to stress.
Ceux-ci restent néanmoins peu nombreux et le lien avec les études biochimiques a rarement été établi. Parmi les gènes identifiés on peut notamment citer : - stress oxydatif : recA,fpg, sodA, nox, pox (NADH peroxidase),flpA et flpB, - stress mutagène : recA, polA, hexB, deoB, gerC, dltD, arcD, bglA, gidA, hgrP, metB, proA et sept orf non identifiées par recherche d'homologie avec les banques de données, - stress thermique, dénaturation protéique : recA, groES, groEL, dnaK, dnaJ, ftsH, grpE, hrcA, ctsR, clpP, clpB, clpE, htrA, - stress froid : cspABCDE, - stress osmotique : busA, gadBCR, - stress acide : gadBCR, clpP, groES, groEL, dnaK. However, these remain few in number and the link with biochemical studies has rarely been established. Among the genes identified, we can in particular cite: - oxidative stress: recA, fpg, sodA, nox, pox (NADH peroxidase), flpA and flpB, - mutagenic stress: recA, polA, hexB, deoB, gerC, dltD, arcD, bglA , gidA, hgrP, metB, proA and seven orfs not identified by homology search with the databases, - heat stress, protein denaturation: recA, groES, groEL, dnaK, dnaJ, ftsH, grpE, hrcA, ctsR, clpP , clpB, clpE, htrA, - cold stress: cspABCDE, - osmotic stress: busA, gadBCR, - acid stress: gadBCR, clpP, groES, groEL, dnaK.
De plus, deux études génétiques (Duwat et al., 1999, Mol Microbiol.,
31,845 ; Rallu et al., 2000, Mol Microbiol., 35, 517; FR27 53201) ont permis d'isoler des mutants plus résistants que la souche initiale (MG1363) à une ou plusieurs conditions de stress et suggèrent fortement que des pools intracellulaires notamment de composés puriques et de phosphate constituent des détecteurs intracellulaires de stress. In addition, two genetic studies (Duwat et al., 1999, Mol Microbiol.,
31.845; Rallu et al., 2000, Mol Microbiol., 35, 517; FR27 53201) made it possible to isolate mutants that are more resistant than the initial strain (MG1363) to one or more stress conditions and strongly suggest that intracellular pools, in particular of purine compounds and of phosphate, constitute intracellular stress detectors.
La séquence annotée de L. lactis IL1403 apporte une base moléculaire pour l'étude systématique des réponses aux stress des lactocoques. Les gènes détectés pendant l'annotation du génome de 111403 sont fournis dans les
Tableaux II et III de la présente demande. La méthode de détection des gènes équivalents dans d'autres bactéries proches de L. lactis IL 1403 est fournie dans la présente invention et permet d'exploiter les résultats obtenus durant l'étude The annotated sequence of L. lactis IL1403 provides a molecular basis for the systematic study of lactococcal stress responses. The genes detected during the annotation of the genome of 111403 are provided in the
Tables II and III of the present application. The method of detecting equivalent genes in other bacteria close to L. lactis IL 1403 is provided in the present invention and makes it possible to exploit the results obtained during the study.
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des réponses aux stress d'autres souches de L. lactis. En effet, les réponses aux stress ont préférentiellement été étudiées avec L. lactis MG1363 qui contrairement à IL 1403 ne contient pas de prophage inductible en condition de stress. responses to stress from other strains of L. lactis. Indeed, the responses to stress have preferably been studied with L. lactis MG1363 which, unlike IL 1403, does not contain inducible prophage under stress conditions.
Les gènes desprotéines sécrétés ou dont l'activité est liée à la sécrétion des protéines
L. lactis est capable de sécréter un certain nombre de protéines dans le milieu extérieur et à la surface de la cellule. Cette capacité peut être mise à profit pour sécréter des molécules d'intérêt comme des enzymes d'intérêt technologique ou des molécules d 'intérêt médical ou pharmaceutique. L'invention présente permet d'isoler rapidement différents signaux d'exportation de L. lactis afin de tester celui ou ceux qui donnent les meilleurs résultats avec le gène d'intérêt à exporter. La liste des protéines et des gènes susceptibles de fournir de tels signaux est fournie Tableau II. Ces protéines ont été extraites par une méthode informatique avec le logiciel PSORT (Nakai & Horton, PSORT : aprogram for detecting sorting signais in proteins and predicting their subcellular localization, Trends Biochem Sci, 24 : 34-6,
1999). D'autres méthodes pourraient être employées pour compléter ce tableau en utilisant une partie des données de l'invention, comme la liste des protéines potentiellement traduites chez L. lactis ou directement la séquence nucléotidique traduite dans toutes les phases. Genes for proteins that are secreted or whose activity is linked to the secretion of proteins
L. lactis is able to secrete a number of proteins in the external environment and on the surface of the cell. This capacity can be used to secrete molecules of interest such as enzymes of technological interest or molecules of medical or pharmaceutical interest. The present invention makes it possible to rapidly isolate various export signals of L. lactis in order to test the one or those which give the best results with the gene of interest to be exported. The list of proteins and genes capable of providing such signals is given in Table II. These proteins were extracted by a computer method with the PSORT software (Nakai & Horton, PSORT: aprogram for detecting sorting signais in proteins and predicting their subcellular localization, Trends Biochem Sci, 24: 34-6,
1999). Other methods could be used to complete this table by using part of the data of the invention, such as the list of proteins potentially translated in L. lactis or directly the nucleotide sequence translated in all the phases.
De plus, l'outil fourni dans l'invention donne toutes les informations de base sur les gènes qui peuvent limiter certaines étapes de la sécrétion. Une liste de ces gènes est présentée Tableau IV. Par exemple, l'intégralité du gène codant pour une lipoprotéine qui permet d'accélérer le repliement correct des protéines sécrétées a été isolé grâce aux enseignements de l'invention. Des homologues de cette protéine ont été caractérisés précédemment chez d'autre organismes comme B. subtilis. In addition, the tool provided in the invention gives all the basic information on the genes which can limit certain stages of secretion. A list of these genes is presented in Table IV. For example, the entire gene encoding a lipoprotein which makes it possible to accelerate the correct folding of the secreted proteins has been isolated thanks to the teachings of the invention. Homologues of this protein have been characterized previously in other organisms such as B. subtilis.
Cependant, il peut exister plusieurs gènes de ce type dans un organisme, ce qui complique la tache de l'expérimentateur confronté soit à une recherche exhaustive However, there can be several genes of this type in an organism, which complicates the task of the experimenter confronted either with an exhaustive research.
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de toutes les protéines homologues afin de réaliser le choix le plus judicieux, soit à développer une expérimentation lourde afin d'isoler le facteur pertinent dans son procédé. La présente invention permet donc à l'homme du métier de choisir en fonction de son expertise le ou les gènes nécessaires à l'accomplissement de son travail. Dans le cas de L. lactis, il a été possible d'isoler le gène codant pour l'homologue vrai de prsA de B. subtilis et de l'exprimer plus fortement dans des cellules surproduisant un enzyme d'intérêt industriel à partir du gène lip de Staphylococcus hyicus. En condition normale, une grande partie de la lipase est dégradée par limitation de la protéine type prsA. Sa surproduction préserve la lipase de toute dégradation de cet enzyme lors ou après son exportation. of all the homologous proteins in order to make the most judicious choice, ie to develop a heavy experiment in order to isolate the relevant factor in his process. The present invention therefore allows a person skilled in the art to choose, according to his expertise, the gene or genes necessary for the accomplishment of his work. In the case of L. lactis, it was possible to isolate the gene encoding the true prsA homolog of B. subtilis and express it more strongly in cells overproducing an enzyme of industrial interest from the gene. lip from Staphylococcus hyicus. Under normal conditions, a large part of the lipase is degraded by limiting the type protein prsA. Its overproduction preserves the lipase from any degradation of this enzyme during or after its export.
Les gènes impliqués dans la compétence des transformations génétiques
La compétence génétique naturelle est la capacité des bactéries à transporter de l'ADN étranger dans la cellule, le processer et à l'intégrer dans le chromosome ou à établire des éléments à réplication autonome. Les gènes, qui permettent à la bactérie de développer cette capacité, sont divisés en ce qu'on appelle des gènes précoces, qui sont des gènes de régulation, et en gènes tardifs, représentant le système de compétence lui-même. L'étude des séquences des gènes tardifs de compétence montre qu'ils sont fortement similaires dans les différentes bactéries AT- riches gram positifs, comme B.subtilis ou Streptococci. Une grande différence existe dans les méchanismes moléculaires qui régulent le développement de ce processus dans Streptococci et Bacilli. The genes involved in the competence of genetic transformations
Natural genetic competence is the ability of bacteria to transport foreign DNA into the cell, process it and integrate it into the chromosome or establish autonomously replicating elements. The genes, which allow the bacteria to develop this ability, are divided into what are called early genes, which are regulatory genes, and late genes, representing the skill system itself. The study of the sequences of the late competence genes shows that they are strongly similar in the different gram-positive AT-rich bacteria, such as B. subtilis or Streptococci. A big difference exists in the molecular mechanisms that regulate the development of this process in Streptococci and Bacilli.
Dans B. subtilis, le régulateur ComK existe, qui assemble les signaux des étapes précoces du développement de compétence. Un pendant fonctionnel de ce régulateur a été trouvé chez Streptococci. Il code pour le facteur sigma de l'ARN polymérase. Les conditions de compétence naturelle ne sont pas connues pour l'espèce L. lactis. Cependant, des recherches d'homologies dans le génome de L. lactis révellent 4 opérons (comE, comF, comC et comG) contenant 8 gènes ayant une forte similarité avec les gènes tardifs de In B. subtilis, the ComK regulator exists, which assembles the signals of the early stages of skill development. A functional counterpart of this regulator has been found in Streptococci. It encodes the sigma factor of RNA polymerase. The conditions of natural competence are not known for the species L. lactis. However, homology searches in the genome of L. lactis revealed 4 operons (comE, comF, comC and comG) containing 8 genes having a strong similarity with the late genes of
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compétence de B. subtilis en S. pneumoniae. Comme L. lactis semble pouvoir posséder un ensemble complet des gènes tardifs de compétence, il peut acquérir une compétence naturelle. Une manière de découvrir les conditions pour acquérir la compétence peut être l'étude de la régulation des gènes tardifs. Le gène, correspondant au régulateur de la compétence, ywcA, existe aussi dans L.lactis IL 1403. La surproduction de cette protéine dans L. lactis permettra l'induction des gènes tardifs de compétence dans ces cellules. La présente invention fournit la manière de détecter le système complet des gènes de compétence dans les plusieurs souches de L. lactis différentes de d'IL1403. La connaissance des structures des régions de régulation dans ces bactéries et des régulateurs correspondants donnera la possibilité d'induire la compétence dans ces souches. Cette méthode peut être utilisée pour les souches ne pouvant pas être manipulées par les autres méthodes de génie génétique. competence of B. subtilis in S. pneumoniae. As L. lactis appears to be able to possess a full set of late competence genes, it may acquire competence naturally. One way to discover the conditions for acquiring the skill may be to study the regulation of late genes. The gene, corresponding to the competence regulator, ywcA, also exists in L.lactis IL 1403. The overproduction of this protein in L. lactis will allow the induction of late competence genes in these cells. The present invention provides the manner of detecting the complete system of competence genes in the several strains of L. lactis other than of IL1403. Knowledge of the structures of the regulatory regions in these bacteria and of the corresponding regulators will give the possibility of inducing competence in these strains. This method can be used for strains that cannot be manipulated by other genetic engineering methods.
D'une manière préférée, l'invention est relative à une séquence nucléotidique selon l'invention, caractérisées en ce qu'elle pour un polypeptide de Lactococcus lactis ou un de ses fragments impliqué dans la biosynthèse des acides aminés et en ce qu'elle comprend une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences suivantes: ORF 1507 1508 1511 1512 1513 1514 1515 796 1178 1179 1275 1881 1251 1252 1254 1255 1257 1258 1259 1260 1261 683 1238 1240 1241 1243 1245 1246 1247 1248 1249 860 797, de préférence 500 120 1291 1690 1793 1794 1795 1796 1803 1807 1808 166 361 755 1292 1293 1323 1609 1668 1670 1972 1973 2159 2285 128 129 575 812 813 814 815 1324 1325 1656 1657 1935 2257 75 551 613 615 616 617 1904 et un de leurs fragments représentatifs. Preferably, the invention relates to a nucleotide sequence according to the invention, characterized in that it for a polypeptide of Lactococcus lactis or one of its fragments involved in the biosynthesis of amino acids and in that it comprises a nucleotide sequence chosen from the following sequences: ORF 1507 1508 1511 1512 1513 1514 1515 796 1178 1179 1275 1881 1251 1252 1254 1255 1257 1258 1259 1260 1261 683 1238 1240 1241 1243 1245 1246 1247 1248 1249 860 797, preferably 500 120 1291 1690 1793 1794 1795 1796 1803 1807 1808 166 361 755 1292 1293 1323 1609 1668 1670 1972 1973 2159 2285 128 129 575 812 813 814 815 1324 1325 1656 1657 1935 2257 75 551 613 615 616 617 1904 and one of their representative fragments.
De manière préférée, l'invention est relative à une séquence nucléotidique selon l'invention caractérisées en ce qu'elle code pour un polypeptide de Lactococcus lactis ou un de ses fragments impliqué dans la biosynthèse des cofacteurs, groupes prosthétiques et transporteurs et en ce qu'elle est choisie parmi les séquences suivantes : ORF 1169 1383 398 1405, de Preferably, the invention relates to a nucleotide sequence according to the invention characterized in that it codes for a polypeptide of Lactococcus lactis or one of its fragments involved in the biosynthesis of cofactors, prosthetic groups and transporters and in that 'it is chosen from the following sequences: ORF 1169 1383 398 1405, from
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préférence 871 953 1172 1173 1174 1176 1353 1354 610 1157 1615 187 743 744 745 746 747 875 584 585 1362 1487 1011 1012 1013 1014 1123 1145 1871 862 958 1692 1695 497 1130 1300 1301 1302 1526 1120 et un de leurs fragments représentatifs. preference 871 953 1172 1173 1174 1176 1353 1354 610 1157 1615 187 743 744 745 746 747 875 584 585 1362 1487 1011 1012 1013 1014 1123 1145 1871 862 958 1692 1695 497 1130 1300 1301 1302 1526 1120 and one of their representative fragments.
De manière préférée, l'invention est relative à une séquence nucléotidique selon l'invention caractérisées en ce qu'elle code pour un polypeptide d'enveloppe cellulaire de Lactococcus lactis ou un de ses fragments, et en ce qu'elle comprend une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences suivantes : ORF 328 329 2288 2320 1296, de préférence 326 327 631 978 1105 1193 1481 2025 2185 280 320 348 350 351 395 552 554 560 885 886 968 1181 1321 1406 1637 1638 1857 1934 1960 2096 2164 2283 2287 153 206 207 212 213 217 218 219 220 221 222 223 224 693 695 697 754 894 930 936 937 939 940 942 944 945 973 1297 1298 1299 1304 1380 1499 1500 1618 1845 2218 2279 2280 et un de leurs fragments représentatifs. Preferably, the invention relates to a nucleotide sequence according to the invention characterized in that it codes for a polypeptide of the cell envelope of Lactococcus lactis or one of its fragments, and in that it comprises a nucleotide sequence chosen from the following sequences: ORF 328 329 2288 2320 1296, preferably 326 327 631 978 1105 1193 1481 2025 2185 280 320 348 350 351 395 552 554 560 885 886 968 1181 1321 1406 1637 1638 1857 1934 1960 2096 2164 2283 2287 153 206 207 212 213 217 218 219 220 221 222 223 224 693 695 697 754 894 930 936 937 939 940 942 944 945 973 1297 1298 1299 1304 1380 1499 1500 1618 1845 2218 2279 2280 and one of their representative fragments.
De manière préférée, l'invention est relative à une séquence nucléotidique selon l'invention caractérisées en ce qu'elle code pour un polypeptide de Lactococcus lactis ou un de ses fragments impliqué dans la machinerie cellulaire, et en ce qu'elle comprend une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences suivantes : ORF 20 22 681 1898 1920 1921 402 403 972 417 1015 2134 1779 2206, de préférence 100 818 828 902 914 990 991 1267 1384 1636 1704 2207 508 126 119 562 959 1664 2161 2315 1107 1108 1265 1823 1824 1859 2084 2120 2176 2177 2178 2179 et un de leurs fragments représentatifs. Preferably, the invention relates to a nucleotide sequence according to the invention characterized in that it codes for a Lactococcus lactis polypeptide or one of its fragments involved in the cellular machinery, and in that it comprises a sequence nucleotide chosen from the following sequences: ORF 20 22 681 1898 1920 1921 402 403 972 417 1015 2134 1779 2206, preferably 100 818 828 902 914 990 991 1267 1384 1636 1704 2207 508 126 119 562 959 1664 2161 2315 1107 1108 1265 1823 1824 1859 2084 2120 2176 2177 2178 2179 and a representative fragment thereof.
De manière préférée, l'invention est relative à une séquence nucléotidique selon l'invention caractérisées en ce qu'elle code pour un polypeptide de Lactococcus lactis ou un de ses fragments impliqué dans le métabolisme intermédiaire central, et en ce qu'elle comprend une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences suivantes: ORF 728 155, de préférence 434 1024 1162 1376 1537 1621 291 716 1289 1538 1539 1728 Preferably, the invention relates to a nucleotide sequence according to the invention characterized in that it codes for a polypeptide of Lactococcus lactis or one of its fragments involved in the central intermediate metabolism, and in that it comprises a nucleotide sequence chosen from the following sequences: ORF 728 155, preferably 434 1024 1162 1376 1537 1621 291 716 1289 1538 1539 1728
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1729 1732 2005 1663 215 586 712 713 714 715 et un de leurs fragments représentatifs. 1729 1732 2005 1663 215 586 712 713 714 715 and one of their representative fragments.
De manière préférée, l'invention est relative à une séquence nucléotidique selon l'invention caractérisées en ce qu'elle code pour un polypeptide de Lactococcus lactis ou un de ses fragments impliqué dans le métabolisme énergétique, et en ce qu'elle comprend une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences suivantes: ORF 1785 2042 59 1329 1814 1815 1816 1817 1818 1819 1820 994 995 677 918 1205 1262 2211 284 345 439 570 656 682 1152 1372 1373 1374 634 1552 1553 1554 2034 2035 2036 2037 2038 2039 684, de préférence 76 136 151 186 242 273 276 342 347 400 643 768 801 843 844 1281 1348 1572 1574 1583 1596 1601 1604 1746 1784 1925 2100 2182 2307 290 502 548 742 751 816 845 846 974 1327 1343 1747 1751 1971 1985 2088 2089 2090 2092 2093 254 256 257 1127 1283 1379 431 609 620 719 720 732 1756 2167 1674 1675 915 916 1125 1142 1207 1290 1707 1858 1864 2068 2069 265 253 385 967 1146 1792 1962 2224 2303 1673 1723 1979 2277 2290 61 62 63 64 26 181 426 440 711 784 834 976 1326 1504 1532 1533 1534 1543 1546 1549 1550 1676 1679 1680 1687 1721 1730 1731 2079 2241 2242 685 1212 1213 1214 1215 1216 et un de leurs fragments représentatifs. Preferably, the invention relates to a nucleotide sequence according to the invention characterized in that it codes for a Lactococcus lactis polypeptide or one of its fragments involved in energy metabolism, and in that it comprises a sequence nucleotide chosen from the following sequences: ORF 1785 2042 59 1329 1814 1815 1816 1817 1818 1819 1820 994 995 677 918 1205 1262 2211 284 345 439 570 656 682 1152 1372 1373 1374 634 1552 1553 1554 2034 2035 2036 2037 2038 2039 684, preferably 76 136 151 186 242 273 276 342 347 400 643 768 801 843 844 1281 1348 1572 1574 1583 1596 1601 1604 1746 1784 1925 2100 2182 2307 290 502 548 742 751 816 845 846 974 1327 1343 1747 1751 1971 1985 2088 2089 2090 2092 2093 254 256 257 1127 1283 1379 431 609 620 719 720 732 1756 2167 1674 1675 915 916 1125 1142 1207 1290 1707 1858 1864 2068 2069 265 253 385 967 1146 1792 1962 2224 2303 1673 1723 1979 2277 2290 61 62 63 64 26 181 426 440 711 784 834 976 1326 1504 1532 1533 15 34 1543 1546 1549 1550 1676 1679 1680 1687 1721 1730 1731 2079 2241 2242 685 1212 1213 1214 1215 1216 and one of their representative fragments.
De manière préférée, l'invention est relative à une séquence nucléotidique selon l'invention caractérisées en ce qu'elle code pour un polypeptide de Lactococcus lactis ou un de ses fragments impliqué dans le métabolisme des acides gras et des phospholipides et en ce qu'elle comprend une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences suivantes : ORF 65 72 118 390 413 414 415 576 577 675 786 787 788 789 790 791 792 793 794 795 859 1284 1834 1837 1955 et un de leurs fragments représentatifs. Preferably, the invention relates to a nucleotide sequence according to the invention characterized in that it codes for a polypeptide of Lactococcus lactis or one of its fragments involved in the metabolism of fatty acids and phospholipids and in that it comprises a nucleotide sequence chosen from the following sequences: ORF 65 72 118 390 413 414 415 576 577 675 786 787 788 789 790 791 792 793 794 795 859 1284 1834 1837 1955 and one of their representative fragments.
De manière préférée, l'invention est relative à une séquence nucléotidique selon l'invention caractérisées en ce qu'elle code pour un polypeptide de Lactococcus lactis ou un de ses fragments impliqué dans le Preferably, the invention relates to a nucleotide sequence according to the invention characterized in that it codes for a polypeptide of Lactococcus lactis or one of its fragments involved in the
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métabolisme des nucléotides, des purines, des pyrimidines ou nucléosides et en ce qu'elle comprend une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences suivantes : ORF 2066 1531 1556 1557 1558 1569 1573 1575 1576 1578 501 1386 1387 1404 1586 1599 21 281 282 947 949 1969 2133 200, de préférence 182 506 992 993 1159 1177 311 1112 1754 226 1164 1563 1564 1568 1689 2007 407 1086 1087 1388 1649 1650 295 605 645 829 854 1165 1482 1483 1485 1708 1908 1950 202 204 205 et un de leurs fragments représentatifs. metabolism of nucleotides, purines, pyrimidines or nucleosides and in that it comprises a nucleotide sequence chosen from the following sequences: ORF 2066 1531 1556 1557 1558 1569 1573 1575 1576 1578 501 1386 1387 1404 1586 1599 21 281 282 947 949 1969 2133 200, preferably 182 506 992 993 1159 1177 311 1112 1754 226 1164 1563 1564 1568 1689 2007 407 1086 1087 1388 1649 1650 295 605 645 829 854 1165 1482 1483 1485 1708 1908 1950 202 204 205 and one of their representative fragments.
De manière préférée, l'invention est relative à une séquence nucléotidique selon l'invention caractérisées en ce qu'elle code pour un polypeptide de Lactococcus lactis ou un de ses fragments impliqué dans les fonctions de régulation, et en ce qu'elle comprend une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences suivantes : ORF 1263 1331 1559 2041 2316 405 406 908 909 1022 1478 1641 1725 1696 1726 890 1555 1506 7, de préférence 6 8 110 131 137 154 167 243 245 261 324 335 421 424 429 445 541 565 622 674 771 832 847 877 905 929 946 982 1084 1151 1186 1197 1233 1294 1310 1349 1490 1494 1521 1524 1566 1624 1639 1652 1654 1717 1745 1753 1766 1830 1831 1846 1852 1853 1928 1956 2001 2032 2043 2059 2095 2216 2243 2258 2262 2270 2291 2296 2306 1020 1477 1642 1724 1752 1797 1798 740 1545 1688 2200 2205 24 340 383 386 1274 1345 1603 1927 543 435 1480 1498 1681 804 975 1211 1336 117 603 723 757 785 926 1344 1517 1527 1585 2172 227 229 360 770 1171 1333 1635 2071 2299 et un de leurs fragments représentatifs. Preferably, the invention relates to a nucleotide sequence according to the invention characterized in that it codes for a polypeptide of Lactococcus lactis or one of its fragments involved in the regulatory functions, and in that it comprises a nucleotide sequence chosen from the following sequences: ORF 1263 1331 1559 2041 2316 405 406 908 909 1022 1478 1641 1725 1696 1726 890 1555 1506 7, preferably 6 8 110 131 137 154 167 243 245 261 324 335 421 424 429 445 541 565 622 674 771 832 847 877 905 929 946 982 1084 1151 1186 1197 1233 1294 1310 1349 1490 1494 1521 1524 1566 1624 1639 1652 1654 1717 1745 1753 1766 1830 1831 1846 1852 1853 1928 1956 2001 2032 2043 2059 2095 2216 2243 2258 2262 2270 2291 2296 2296 1020 1477 1642 1724 1752 1797 1798 740 1545 1688 2200 2205 24 340 383 386 1274 1345 1603 1927 543 435 1480 1498 1681 804 975 1211 1336 117 603 723 757 785 926 1344 1517 1527 1585 2172 227 229 360 770 1171 1333 1635 2071 2299 and one of their fragments repr informative.
De manière préférée, l'invention est relative à une séquence nucléotidique selon l'invention caractérisées en ce qu'elle code pour un polypeptide de Lactococcus lactis ou un de ses fragments impliqué dans le processus de réplication, et en ce qu'elle comprend une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences suivantes : ORF 4 5 2 3 362 363 563 600 663 664 665 2030 2180 2198 2265 2281, de préférence 573 644 806 856 872 873 1089
1360 1361 1869 101 102 240 349 401 408 428 507 513 542 572 657 761 766 Preferably, the invention relates to a nucleotide sequence according to the invention characterized in that it codes for a polypeptide of Lactococcus lactis or one of its fragments involved in the replication process, and in that it comprises a nucleotide sequence chosen from the following sequences: ORF 4 5 2 3 362 363 563 600 663 664 665 2030 2180 2198 2265 2281, preferably 573 644 806 856 872 873 1089
1360 1361 1869 101 102 240 349 401 408 428 507 513 542 572 657 761 766
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767 857 878 898 923 997 1000 1002 1025 1088 1129 1138 1139 1140 1266 1270 1693 1791 1883 1948 2098 2247 2251 2263 2264 2267 2301 et un de leurs fragments représentatifs. 767 857 878 898 923 997 1000 1002 1025 1088 1129 1138 1139 1140 1266 1270 1693 1791 1883 1948 2098 2247 2251 2263 2264 2267 2301 and one of their representative fragments.
De manière préférée, l'invention est relative à une séquence nucléotidique selon l'invention caractérisées en ce qu'elle code pour un polypeptide de Lactococcus lactis ou un de ses fragments impliqué dans le processus de transcription, et en ce qu'elle comprend une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences suivantes : ORF 1237 1332 564, de préférence 817 960 1906 2314 14 619 646 648 709 779 1314 1367 1368 1607 1612 1623 1850 1851 2124 2160 2222 2297 359 419 1613 et un de leurs fragments représentatifs. Preferably, the invention relates to a nucleotide sequence according to the invention characterized in that it codes for a Lactococcus lactis polypeptide or one of its fragments involved in the transcription process, and in that it comprises a nucleotide sequence chosen from the following sequences: ORF 1237 1332 564, preferably 817 960 1906 2314 14 619 646 648 709 779 1314 1367 1368 1607 1612 1623 1850 1851 2124 2160 2222 2297 359 419 1613 and one of their representative fragments.
De manière préférée, l'invention est relative à une séquence nucléotidique selon l'invention caractérisées en ce qu'elle code pour un polypeptide de Lactococcus lactis ou un de ses fragments impliqué dans le processus de traduction, et en ce qu'elle comprend une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences suivantes : ORF 1239 313 396 706 858 1778 1854 1861 1929 2105 571 1776 97 98 680 2127 782 783 2128, de préférence 68 382 394 807 831 1113 1114 1763 1775 1879 1902 1914 1964 1983 1984 2020 2022 2094 2109 2183 2229 260 303 624 1606 1697 2027 2028 2045 2047 2192 374 911 1600 2062 107 135 198 246 292 301 302 748 760 781 805 853 892 906 1097 1099 1307 1308 1617 1644 1790 1893 1894 1937 2056 2057 2123 2125 2126 2135 2136 2137 2138 2139 2140 2142 2143 2144 2145 2146 2147 2148 2149 2150 2151 2152 2153 2154 2155 2156 2162 2209 2246 2248 2310 2311 2318 2319 13 132 158 168 169 171 496 638 705 852 1144 1923 1944 358 607 707 989 1126 1895 1912 2065 2208 2317 et un de leurs fragments représentatifs. Preferably, the invention relates to a nucleotide sequence according to the invention characterized in that it codes for a Lactococcus lactis polypeptide or one of its fragments involved in the translation process, and in that it comprises a nucleotide sequence chosen from the following sequences: ORF 1239 313 396 706 858 1778 1854 1861 1929 2105 571 1776 97 98 680 2127 782 783 2128, preferably 68 382 394 807 831 1113 1114 1763 1775 1879 1902 1914 1964 1983 1984 2020 2022 2094 2109 2183 2229 260 303 624 1606 1697 2027 2028 2045 2047 2192 374 911 1600 2062 107 135 198 246 292 301 302 748 760 781 805 853 892 906 1097 1099 1307 1308 1617 1644 1790 1893 1894 1937 2056 2057 2123 2125 2126 2135 2136 2137 2138 2139 2140 2142 2143 2144 2145 2146 2147 2148 2149 2150 2151 2152 2153 2154 2155 2156 2162 2209 2246 2248 2310 2311 2318 2319 13 132 158 168 169 171 496 638 705 852 1144 1923 1944 358 607 707 989 1126 1895 1912 2065 2208 2317 and one their fragments represent native.
De manière préférée, l'invention est relative à une séquence nucléotidique selon l'invention caractérisées en ce qu'elle code pour un polypeptide de Lactococcus lactis ou un de ses fragments impliqué dans le Preferably, the invention relates to a nucleotide sequence according to the invention characterized in that it codes for a polypeptide of Lactococcus lactis or one of its fragments involved in the
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processus de transport et de liaison des protéines, et en ce qu'elle comprend une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences suivantes : ORF 1256 1787 330 550 699 717 1330 1496 1497 1810 1888 1889 1890 1891 1892 2091 1771 566 919 1551 2040 2104 635 676 1970 121 122 437 81 82 726 927 2221, de préférence 11 74 104 262 263 269 270 271 285 286 287 318 319 333 334 544 545 579 580 672 673 729 855 881 888 889 917 983 984 1080 1121 1122 1203 1311 1312 1366 1567 1602 1667 1800 1801 1825 1826 1844 1926 2051 2052 2074 2157 2260 2261 2313 2321 70 115 331 352 353 354 355 356 357 364 365 375 574 698 824 863 864 955 956 957 1128 1182 1183 1184 1185 1750 1811 1847 1848 1873 2087 2107 2250 52 308 309 310 1767 1768 1769 1770 1772 208 209 259 430 933 934 1282 1369 1370 1371 1530 1540 1541 1542 1548 1671 1678 1683 1684 1685 1686 1733 1734 1735 2239 99 193 194 316 336 337 338 339 341 392 587 636 691 848 849 869 932 1194 1195 1295 1341 1355 1356 1357 1407 1528 1640 1655 2058 2169 2170 2171 2305 896 1166 1651 23 25 180 422 423 425 630 833 977 1149 1150 1505 1757 1758 1759 127 130 160 244 314 389 621 679 721 722 1389 1561 1584 1682 2220 2292 et un de leurs fragments représentatifs. protein transport and binding process, and in that it comprises a nucleotide sequence chosen from the following sequences: ORF 1256 1787 330 550 699 717 1330 1496 1497 1810 1888 1889 1890 1891 1892 2091 1771 566 919 1551 2040 2104 635 676 1970 121 122 437 81 82 726 927 2221, preferably 11 74 104 262 263 269 270 271 285 286 287 318 319 333 334 544 545 579 580 672 673 729 855 881 888 889 917 983 984 1080 1121 1122 1203 1311 1312 1366 1567 1602 1667 1800 1801 1825 1826 1844 1926 2051 2052 2074 2157 2260 2261 2313 2321 70 115 331 352 353 354 355 356 357 364 365 375 574 698 824 863 864 955 956 957 1128 1182 1183 1184 1185 1750 1811 1847 1848 1873 2087 2107 2250 52 308 309 310 1767 1768 1769 1770 1772 208 209 259 430 933 934 1282 1369 1370 1371 1530 1540 1541 1542 1548 1671 1678 1683 1684 1685 1686 1733 1734 1735 2239 99 193 194 316 336 337 338 339 341 392 587 636 691 848 849 869 932 1194 1195 1295 1341 1355 1356 1357 1407 1528 1640 1655 2058 2169 2170 2171 2305 896 1166 1651 23 25 180 422 423 425 630 833 977 1149 1150 1505 1757 1758 1759 127 130 160 244 314 389 621 679 721 722 1389 1561 1584 1682 2220 2292 and one of their representative fragments.
De manière préférée, l'invention est relative à une séquence nucléotidique selon l'invention caractérisées en ce qu'elle code pour un polypeptide de Lactococcus lactis ou un de ses fragments impliqué dans l'adaptation aux conditions atypiques, et en ce qu'elle comprend une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences suivantes : ORF 174 540 568 654 686 970 1570, de préférence 69 173 195 312 346 418 653 912 971 1102 1170 1414 2085 et un de leurs fragments représentatifs. Preferably, the invention relates to a nucleotide sequence according to the invention characterized in that it codes for a polypeptide of Lactococcus lactis or one of its fragments involved in the adaptation to atypical conditions, and in that it comprises a nucleotide sequence chosen from the following sequences: ORF 174 540 568 654 686 970 1570, preferably 69 173 195 312 346 418 653 912 971 1102 1170 1414 2085 and one of their representative fragments.
De manière préférée, l'invention est relative à une séquence nucléotidique selon l'invention caractérisées en ce qu'elle code pour un polypeptide de Lactococcus lactis ou un de ses fragments dans la sensibilité aux médicaments et analogues, et en ce qu'elle comprend une séquence Preferably, the invention relates to a nucleotide sequence according to the invention characterized in that it codes for a polypeptide of Lactococcus lactis or one of its fragments in the sensitivity to drugs and analogues, and in that it comprises a sequence
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nucléotidique choisie parmi les séquences suivantes : ORF 1244, de préférence 1860 2249 et un de leurs fragments représentatifs. nucleotide chosen from the following sequences: ORF 1244, preferably 1860 2249 and one of their representative fragments.
De manière préférée, l'invention est relative à une séquence nucléotidique selon l'invention caractérisées en ce qu'elle code pour un polypeptide de Lactococcus lactis ou un de ses fragments impliqué dans les fonctions relatives aux phages et prophages, et en ce qu'elle comprend une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences suivantes : ORF 448 449 452 455 465 471 493 494 1026 1027 1028 1029 1030 1031 1032 1033 1034 1035 1036 1037 1038 1039 1040 1041 1046 1051 1075 1076 1077 1420 1422 1423 1424 1425 1426 1448 1450 1455 1456 1458 1465 1466 1467 1468 1470 1720, de préférence 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 446 447 450 451 453 454 456 457 458 459 460 461 462 463 464 466 467 468 469 470 472 473 474 475 476 477 478 479 480 481 482 483 484 485 486 487 488 489 490 491 492 514 515 516 517 518 519 520 521 522 523 524 525 526 527 528 529 531 532 533 534 1042 1043 1044 1045 1047 1048 1049 1050 1052 1053 1054 1055 1056 1057 1058 1059 1060 1061 1062 1063 1064 1065 1066 1067 1068 1069 1070 1071 1072 1073 1074 1200 1217 1416 1417 1418 1419 1421 1427 1428 1429 1430 1431 1432 1433 1434 1435 1436 1437 1438 1439 1440 1441 1442 1443 1444 1445 1446 1447 1449 1451 1452 1453 1454 1457 1459 1460 1461 1462 1463 1464 1469 1471 1472 1473 1474 1475 1647 1998 2003 et un de leurs fragments représentatifs. Preferably, the invention relates to a nucleotide sequence according to the invention characterized in that it codes for a polypeptide of Lactococcus lactis or one of its fragments involved in the functions relating to phages and prophages, and in that it comprises a nucleotide sequence chosen from the following sequences: ORF 448 449 452 455 465 471 493 494 1026 1027 1028 1029 1030 1031 1032 1033 1034 1035 1036 1037 1038 1039 1040 1041 1046 1051 1075 1076 1077 1420 1422 1423 1424 1425 1426 1448 1450 1455 1456 1458 1465 1466 1467 1468 1470 1720, preferably 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 446 447 450 451 453 454 456 457 458 459 460 461 462 463 464 466 467 468 469 470 472 473 474 475 476 477 478 479 480 481 482 483 484 485 486 487 488 489 490 491 492 514 515 516 517 518 519 520 521 522 523 524 525 526 527 528 529 531 532 533 534 1042 1043 1044 1045 1047 1048 1049 1050 1052 1053 1054 1055 1056 1057 1058 1059 1060 1061 1062 1063 1064 1065 1066 1067 1068 1069 1070 1071 1072 1073 1074 1200 1217 1416 1417 1418 1419 1421 1427 1428 1429 1430 1431 1432 1433 1434 1435 1436 1437 1438 1439 1440 1441 1442 1443 1444 1445 1446 1447 1449 1451 1452 1453 1454 1457 1459 1460 1461 1461 1464 1469 1471 1472 1473 1474 1475 1647 1998 2003 and one of their representative fragments.
De manière préférée, l'invention est relative à une séquence nucléotidique selon l'invention caractérisées en ce qu'elle code pour un polypeptide de Lactococcus lactis ou un de ses fragments impliqué dans les fonctions relatives aux transposons et en ce qu'elle comprend une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences suivantes : ORF 53 54 55 56 90 91 93 94 141 142 143 144 145 146 378 379 380 381 649 650 651 652 662 670 737 738 837 838 839 841 842 1224 1225 1231 1232 1236 1286 1287 1591 1741 1742 2082 2083 2129 2130 2131 2132 2201 2202 2203 2204, de préférence Preferably, the invention relates to a nucleotide sequence according to the invention characterized in that it codes for a polypeptide of Lactococcus lactis or one of its fragments involved in the functions relating to transposons and in that it comprises a nucleotide sequence chosen from the following sequences: ORF 53 54 55 56 90 91 93 94 141 142 143 144 145 146 378 379 380 381 649 650 651 652 662 670 737 738 837 838 839 841 842 1224 1225 1231 1232 1236 1286 1287 1591 1741 1742 2082 2083 2129 2130 2131 2132 2201 2202 2203 2204, preferably
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614 694 718 950 1268 1342 1400 1560 1749 1936 1961 1986 1992 2060 2118 2191 2240 et un de leurs fragments représentatifs. 614 694 718 950 1268 1342 1400 1560 1749 1936 1961 1986 1992 2060 2118 2191 2240 and one of their representative fragments.
De manière préférée, l'invention est relative à une séquence nucléotidique selon l'invention caractérisées en ce qu'elle code pour un polypeptide spécifique de Lactococcus lactis ou un de ses fragments, et en ce qu'elle comprend une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences suivantes : ORF 416 1727 1822 87 88 279 332 569 671 700 701 727 840 850 884 891 900 1204 1242 1277 1382 1592 1605 1718 1719 1762 1777 1780 1907 1917 1918 1919 1930 1938 1939 1940 2102 2106 2174 2210 1250 1328 2199 666 948 1381 1990, de préférence 591 618 710 835 1153 1910 1931 1953 2031 17 18 50 57 58 60 78 79 80 84 92 113 114 116 124 125 133 134 139 140 148 149 150 157 159 161 162 170 172 175 176 179 183 184 185 188 189 196 197 214 230 231 232 233 234 235 236 238 247 255 258 264 266 267 268 274 277 283 288 289 293 294 298 299 300 315 317 321 323 325 343 344 366 367 369 370 371 372 373 376 377 384 387 388 399 404 409 410 411 420 433 436 438 443 444 498 499 503 510 512 546 549 553 555 556 557 558 582 583 588 589 592 594 597 599 611 625 637 655 678 688 703 704 708 725 730 735 741 749 756 759 762 763 764 765 769 774 780 798 799 800 803 809 810 811 819 827 830 861 865 880 882 883 899 913 920 924 951 963 964 965 986 987 999 1001 1004 1016 1019 1023 1078 1079 1090 1091 1094 1098 1100 1103 1104 1106 1109 1110 1115 1116 1117 1119 1124 1131 1137 1141 1147 1148 1155 1156 1160 1161 1168 1175 1187 1188 1201 1202 1208 1209 1223 1276 1278 1280 1303 1313 1315 1316 1318 1319 1322 1340 1352 1358 1359 1363 1391 1392 1393 1408 1409 1411 1412 1476 1486 1489 1491 1492 1493 1501 1518 1519 1520 1522 1523 1525 1529 1544 1547 1565 1577 1579 1581 1595 1597 1614 1619 1620 1622 1648 1658 1661 1662 1666 1669 1677 1694 1699 1701 1702 1709 1710 1711 1712 1722 1748 1760 1761 1764 1765 1773 1774 1781 1782 1786 1788 1789 1802 1805 1809 1827 1828 1829 1832 1833 1838 1839 1840 1842 1843 1849 1855 1856 1863 1865 1866 1867 1868 1872 Preferably, the invention relates to a nucleotide sequence according to the invention characterized in that it codes for a specific polypeptide of Lactococcus lactis or one of its fragments, and in that it comprises a nucleotide sequence chosen from among following sequences: ORF 416 1727 1822 87 88 279 332 569 671 700 701 727 840 850 884 891 900 1204 1242 1277 1382 1592 1605 1718 1719 1762 1777 1780 1907 1917 1918 1919 1930 1938 1939 1940 2102 2106 2174 2210 1250 1328 2199 666 948 1381 1990, preferably 591 618 710 835 1153 1910 1931 1953 2031 17 18 50 57 58 60 78 79 80 84 92 113 114 116 124 125 133 134 139 140 148 149 150 157 159 161 162 170 172 175 176 179 183 184 185 188 189 196 197 214 230 231 232 233 234 235 236 238 247 255 258 264 266 267 268 274 277 283 288 289 293 294 298 299 300 315 317 321 323 325 343 344 366 367 369 370 371 372 373 376 377 384 387 388 399 404 409 410 411 420 433 436 438 443 444 498 499 503 510 512 546 549 553 555 556 557 558 582 583 588 589 592 594 597 599 611 625 637 655 678 688 703 704 708 725 730 735 741 749 756 759 762 763 764 765 769 774 780 798 799 800 803 809 810 811 819 827 830 861 865 880 882 883 899 913 920 924 951 962 883 899 913 920 924 951 965 986 987 999 1001 1004 1016 1019 1023 1078 1079 1090 1091 1094 1098 1100 1103 1104 1106 1109 1110 1115 1116 1117 1119 1124 1131 1137 1141 1147 1148 1155 1156 1160 1161 1168 1175 1187 1188 1201 1202 1208 1209 1223 1276 1278 1280 1303 1313 1315 1316 1318 1319 1322 1340 1352 1358 1359 1363 1391 1392 1393 1408 1409 1411 1412 1476 1486 1489 1491 1492 1493 1501 1518 1519 1520 1522 1523 1525 1529 1544 1547 1565 1577 1579 1581 1595 1597 1614 1619 1620 1622 1648 1658 1661 1662 1666 1669 1699 1701 1702 1709 1710 1711 1712 1722 1748 1760 1761 1764 1765 1773 1774 1781 1782 1786 1788 1789 1802 1805 1809 1827 1828 1829 1832 1833 1838 1839 1840 1842 1843 1849 1855 1856 1863 1865 1866 1867 1868 1872
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1634 1643 1645 1646 1653 1659 1660 1665 1672 1691 1698 1700 1703 1706
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1812 1813 1821 1835 1836 1841 1862 1870 1877 1878 1880 1882 1896 1899 1905 1911 1913 1932 1942 1943 1945 1947 1949 1957 1965 1974 1975 1980 1987 1988 1989 1991 1993 1994 1995 1996 1997 1999 2000 2002 2009 2010 2012 2013 2021 2023 2024 2046 2048 2053 2055 2064 2067 2072 2073 2075 2076 2077 2078 2086 2097 2099 2103 2111 2112 2113 2114 2116 2119 2121 2122 2141 2166 2181 2187 2188 2189 2195 2196 2212 2213 2214 2215 2223 2225 2228 2230 2231 2233 2234 2236 2237 2244 2252 2255 2256 2266 2268 2269 2271 2273 2274 et un de leurs fragments représentatifs. 1812 1813 1821 1835 1836 1841 1862 1870 1877 1878 1880 1882 1896 1899 1905 1911 1913 1932 1942 1943 1945 1947 1949 1957 1965 1974 1975 1980 1987 1988 1989 1991 1993 1994 1995 1996 1997 1999 2000 2002 2009 2010 2012 2013 2021 2023 2024 2046 2048 2053 2055 2064 2067 2072 2073 2075 2076 2077 2078 2086 2097 2099 2103 2111 2112 2113 2114 2116 2119 2121 2122 2141 2166 2181 2187 2188 2189 2195 2196 2212 2213 2214 2215 2223 2225 2228 2230 2231 2233 2234 2236 2237 2244 2252 2255 2256 2266 2268 2271 2273 2274 and one of their representative fragments.
Sous un autre aspect, de manière préférée, l'invention a pour objet un polypeptide selon l'invention, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polypeptide de Lactococcus lactis ou un de ses fragments impliqué dans la biosynthèse des acides aminés, et en ce qu'il est choisi parmi les polypeptides de séquences suivantes: SEQ ID N 1507 1508 1511 1512 1513 1514 1515 796 1178 1179 1275 1881 1251 1252 1254 1255 1257 1258 1259 1260 1261 683 1238 1240 1241 1243 1245 1246 1247 1248 1249 860 797, de préférence 500 120 1291 1690 1793 1794 1795 1796 1803 1807 1808 166 361 755 1292 1293 1323 1609 1668 1670 1972 1973 2159 2285 128 129 575 812 813 814 815 1324 1325 1656 1657 1935 2257 75 551 613 615 616 617 1904 et un de leurs fragments. In another aspect, preferably, the invention relates to a polypeptide according to the invention, characterized in that it is a polypeptide of Lactococcus lactis or one of its fragments involved in the biosynthesis of amino acids , and in that it is chosen from the polypeptides of the following sequences: SEQ ID N 1507 1508 1511 1512 1513 1514 1515 796 1178 1179 1275 1881 1251 1252 1254 1255 1257 1258 1259 1260 1261 683 1238 1240 1241 1243 1245 1246 1247 1248 1249 860 797, preferably 500 120 1291 1690 1793 1794 1795 1796 1803 1807 1808 166 361 755 1292 1293 1323 1609 1668 1670 1972 1973 2159 2285 128 129 575 812 813 814 815 1324 1325 1656 1657 1935 2257 75 551 613 615 616 617 1904 and one of their fragments.
Sous un autre aspect, de manière préférée, l'invention a pour objet un polypeptide selon l'invention, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polypeptide de Lactococcus lactis ou un de ses fragments impliqué dans la biosynthèse des cofacteurs, groupes prosthétiques et transporteurs, et en ce qu'il est choisi parmi les polypeptides de séquences suivantes : SEQ ID N 1169 1383 398
1405, de préférence 871 953 1172 1173 1174 1176 1353 1354 610 1157 1615
187 743 744 745 746 747 875 584 585 1362 1487 1011 1012 1013 1014 1123
1145 1871 862 958 1692 1695 497 1130 1300 1301 1302 1526 1120 et un de leurs fragments. In another aspect, preferably, the invention relates to a polypeptide according to the invention, characterized in that it is a polypeptide of Lactococcus lactis or one of its fragments involved in the biosynthesis of cofactors, prosthetic groups and transporters, and in that it is chosen from polypeptides of the following sequences: SEQ ID N 1169 1383 398
1405, preferably 871 953 1172 1173 1174 1176 1353 1354 610 1157 1615
187 743 744 745 746 747 875 584 585 1362 1487 1011 1012 1013 1014 1123
1145 1871 862 958 1692 1695 497 1130 1300 1301 1302 1526 1120 and a fragment thereof.
Sous un autre aspect, de manière préférée, l'invention a pour objet un In another aspect, preferably, the invention relates to a
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polypeptide selon l'invention, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polypeptide d'enveloppe cellulaire de Lactococcus lactis ou un de ses fragments, et en ce qu'il est choisi parmi les polypeptides de séquences suivantes : SEQ ID N 328 329 2288 2320 1296, de préférence 326 327 631 978 1105 1193 1481 2025 2185 280 320 348 350 351 395 552 554 560 885 886 968 1181 1321 1406 1637 1638 1857 1934 1960 2096 2164 2283 2287 153 206 207 212 213 217 218 219 220 221 222 223 224 693 695 697 754 894 930 936 937 939 940 942 944 945 973 1297 1298 1299 1304 1380 1499 1500 1618 1845 2218 2279 2280 et un de leurs fragments. polypeptide according to the invention, characterized in that it is a polypeptide of the cell envelope of Lactococcus lactis or one of its fragments, and in that it is chosen from the polypeptides of the following sequences: SEQ ID N 328 329 2288 2320 1296, preferably 326 327 631 978 1105 1193 1481 2025 2185 280 320 348 350 351 395 552 554 560 885 886 968 1181 1321 1406 1637 1638 1857 1934 1960 2096 2164 2283 2287 153 206 207 212 213 217 218 219 220 221 222 223 224 693 695 697 754 894 930 936 937 939 940 942 944 945 973 1297 1298 1299 1304 1380 1499 1500 1618 1845 2218 2279 2280 and a fragment thereof.
Sous un autre aspect, de manière préférée, l'invention a pour objet un polypeptide selon l'invention, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polypeptide de Lactococcus lactis ou un de ses fragments impliqué dans la machinerie cellulaire, et en ce qu'il est choisi parmi les polypeptides de séquences suivantes : SEQ ID N 20 22 681 1898 1920 1921 402 403 972 417 1015 2134 1779 2206, de préférence 100 818 828 902 914 990 991 1267 1384 1636 1704 2207 508 126 119 562 959 1664 2161 2315 1107 1108 1265 1823 1824 1859 2084 2120 2176 2177 2178 2179 et un de leurs fragments. In another aspect, preferably, the invention relates to a polypeptide according to the invention, characterized in that it is a polypeptide of Lactococcus lactis or one of its fragments involved in the cellular machinery, and in that it is chosen from the polypeptides of the following sequences: SEQ ID N 20 22 681 1898 1920 1921 402 403 972 417 1015 2134 1779 2206, preferably 100 818 828 902 914 990 991 1267 1384 1636 1704 2207 508 126 119 562 959 1664 2161 2315 1107 1108 1265 1823 1824 1859 2084 2120 2176 2177 2178 2179 and a fragment thereof.
Sous un autre aspect, de manière préférée, l'invention a pour objet un polypeptide selon l'invention, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polypeptide de Lactococcus lactis ou un de ses fragments impliqué dans le métabolisme intermédiaire central, et en ce qu'il est choisi parmi les polypeptides de séquences suivantes : SEQ ID N 728 155, de préférence 434 1024 1162 1376 1537 1621 291 716 1289 1538 1539 1728 1729 1732 2005 1663 215 586 712 713 714 715 et un de leurs fragments. In another aspect, preferably, the invention relates to a polypeptide according to the invention, characterized in that it is a polypeptide of Lactococcus lactis or one of its fragments involved in the central intermediate metabolism, and in that it is chosen from the polypeptides of the following sequences: SEQ ID N 728 155, preferably 434 1024 1162 1376 1537 1621 291 716 1289 1538 1539 1728 1729 1732 2005 1663 215 586 712 713 714 715 and one of their fragments .
Sous un autre aspect, de manière préférée, l'invention a pour objet un polypeptide selon l'invention, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polypeptide de Lactococcus lactis ou un de ses fragments impliqué dans le métabolisme énergétique, et en ce qu'il est choisi parmi les polypeptides de séquences suivantes : SEQ ID N 1785 2042 59 1329 1814 1815 1816 1817 1818 1819 In another aspect, preferably, the invention relates to a polypeptide according to the invention, characterized in that it is a polypeptide of Lactococcus lactis or one of its fragments involved in energy metabolism, and in that it is chosen from the polypeptides of the following sequences: SEQ ID N 1785 2042 59 1329 1814 1815 1816 1817 1818 1819
<Desc/Clms Page number 44><Desc / Clms Page number 44>
1820 994 995 677 918 1205 1262 2211 284 345 439 570 656 682 1152 1372 1373 1374 634 1552 1553 1554 2034 2035 2036 2037 2038 2039 684, de préférence 76 136 151 186 242 273 276 342 347 400 643 768 801 843 844 1281 1348 1572 1574 1583 1596 1601 1604 1746 1784 1925 2100 2182 2307 290 502 548 742 751 816 845 846 974 1327 1343 1747 1751 1971 1985 2088 2089 2090 2092 2093 254 256 257 1127 1283 1379 431 609 620 719 720 732 1756 2167 1674 1675 915 916 1125 1142 1207 1290 1707 1858 1864 2068 2069 265 253 385 967 1146 1792 1962 2224 2303 1673 1723 1979 2277 2290 61 62 63 64 26 181 426 440 711 784 834 976 1326 1504 1532 1533 1534 1543 1546 1549 1550 1676 1679 1680 1687 1721 1730 1731 2079 2241 2242 685 1212 1213 1214 1215 1216 et un de leurs fragments. 1820 994 995 677 918 1205 1262 2211 284 345 439 570 656 682 1152 1372 1373 1374 634 1552 1553 1554 2034 2035 2036 2037 2038 2039 684, preferably 76 136 151 186 242 273 276 342 347 400 643 768 801 843 844 1281 1348 1572 1574 1583 1596 1601 1604 1746 1784 1925 2100 2182 2307 290 502 548 742 751 816 845 846 974 1327 1343 1747 1751 1971 1985 2088 2089 2090 2092 2093 254 256 257 1127 1283 1379 431 609 620 719 720 732 1756 2167 1674 1675 915 916 1125 1142 1207 1290 1707 1858 1864 2068 2069 265 253 385 967 1146 1792 1962 2224 2303 1673 1723 1979 2277 2290 61 62 63 64 26 181 426 440 711 784 834 976 1326 1504 1532 1533 1534 1543 1546 1549 1550 1676 1679 1680 1687 1721 1730 1731 2079 2241 2242 685 1212 1213 1214 1215 1216 and a fragment thereof.
Sous un autre aspect, de manière préférée, l'invention a pour objet un polypeptide selon l'invention, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polypeptide de Lactococcus lactis ou un de ses fragments impliqué dans le métabolisme des acides gras et des phospholipides, et en ce qu'il est choisi parmi les polypeptides de séquences suivantes : SEQ ID N 65 72 118 390 413 414 415 576 577 675 786 787 788 789 790 791 792 793 794 795 859 1284 1834 1837 1955 et un de leurs fragments. In another aspect, preferably, the invention relates to a polypeptide according to the invention, characterized in that it is a polypeptide of Lactococcus lactis or one of its fragments involved in the metabolism of fatty acids and phospholipids, and in that it is chosen from polypeptides of the following sequences: SEQ ID N 65 72 118 390 413 414 415 576 577 675 786 787 788 789 790 791 792 793 794 795 859 1284 1834 1837 1955 and one of their fragments.
Sous un autre aspect, de manière préférée, l'invention a pour objet un polypeptide selon l'invention, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polypeptide de Lactococcus lactis ou un de ses fragments impliqué dans le métabolisme des nucléotides, des purines, des pyrimidines ou nucléosides, et en ce qu'il est choisi parmi les polypeptides de séquences suivantes : SEQ ID N 2066 1531 1556 1557 1558 1569 1573 1575 1576 1578 501 1386 1387 1404 1586 1599 21 281 282 947 949 1969 2133 200, de préférence 182 506 992 993 1159 1177 311 1112 1754 226 1164 1563 1564 1568 1689 2007 407 1086 1087 1388 1649 1650 295 605 645 829 854 1165 1482 1483 1485 1708 1908 1950 202 204 205 et un de leurs fragments. In another aspect, preferably, the invention relates to a polypeptide according to the invention, characterized in that it is a polypeptide of Lactococcus lactis or one of its fragments involved in the metabolism of nucleotides, purines, pyrimidines or nucleosides, and in that it is chosen from polypeptides of the following sequences: SEQ ID N 2066 1531 1556 1557 1558 1569 1573 1575 1576 1578 501 1386 1387 1404 1586 1599 21 281 282 947 949 1969 2133 200 , preferably 182 506 992 993 1159 1177 311 1112 1754 226 1164 1563 1564 1568 1689 2007 407 1086 1087 1388 1649 1650 295 605 645 829 854 1165 1482 1483 1485 1708 1908 1950 202 204 205 and one of their fragments.
Sous un autre aspect, de manière préférée, l'invention a pour objet un In another aspect, preferably, the invention relates to a
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polypeptide selon l'invention, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polypeptide de Lactococcus lactis ou un de ses fragments impliqué dans les fonctions de régulation, et en ce qu'il est choisi parmi les polypeptides de séquences suivantes : SEQ ID N 1263 1331 1559 2041 2316 405 406 908 909 1022 1478 1641 1725 1696 1726 890 1555 1506 7, de préférence 6 8 110 131 137 154 167 243 245 261 324 335 421 424 429 445 541 565 622 674 771 832 847 877 905 929 946 982 1084 1151 1186 1197 1233 1294 1310 1349 1490 1494 1521 1524 1566 1624 1639 1652 1654 1717 1745 1753 1766 1830 1831 1846 1852 1853 1928 1956 2001 2032 2043 2059 2095 2216 2243 2258 2262 2270 2291 2296 2306 1020 1477 1642 1724 1752 1797 1798 740 1545 1688 2200 2205 24 340 383 386 1274 1345 1603 1927 543 435 1480 1498 1681 804 975 1211 1336 117 603 723 757 785 926 1344 1517 1527 1585 2172 227 229 360 770 1171 1333 1635 2071 2299 et un de leurs fragments. polypeptide according to the invention, characterized in that it is a polypeptide of Lactococcus lactis or one of its fragments involved in the regulatory functions, and in that it is chosen from the polypeptides of the following sequences: SEQ ID N 1263 1331 1559 2041 2316 405 406 908 909 1022 1478 1641 1725 1696 1726 890 1555 1506 7, preferably 6 8 110 131 137 154 167 243 245 261 324 335 421 424 429 445 541 565 622 674 771 832 847 877 905 929 946 982 1084 1151 1186 1197 1233 1294 1310 1349 1490 1494 1521 1524 1566 1624 1639 1652 1654 1717 1745 1753 1766 1830 1831 1846 1852 1853 1928 1956 2001 2032 2043 2059 2095 2216 2243 2258 2262 2270 2291 2296 2306 1020 1477 1642 1724 1752 1797 1797 1797 1766 740 1545 1688 2200 2205 24 340 383 386 1274 1345 1603 1927 543 435 1480 1498 1681 804 975 1211 1336 117 603 723 757 785 926 1344 1517 1527 1585 2172 227 229 360 770 1171 1333 1635 2071 2299 and one of their fragments.
Sous un autre aspect, de manière préférée, l'invention a pour objet un polypeptide selon l'invention, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polypeptide de Lactococcus lactis ou un de ses fragments impliqué dans le processus de réplication, et en ce qu'il est choisi parmi les polypeptides de séquences suivantes : SEQ ID N 4 5 2 3 362 363 563 600 663 664 665 2030 2180 2198 2265 2281, de préférence 573 644 806 856 872 873 1089 1360 1361 1869 101 102 240 349 401 408 428 507 513 542 572 657 761 766 767 857 878 898 923 997 1000 1002 1025 1088 1129 1138 1139 1140 1266 1270 1693 1791 1883
1948 2098 2247 2251 2263 2264 2267 2301 et un de leurs fragments. In another aspect, preferably, the invention relates to a polypeptide according to the invention, characterized in that it is a polypeptide of Lactococcus lactis or one of its fragments involved in the replication process, and in that it is chosen from the polypeptides of the following sequences: SEQ ID N 4 5 2 3 362 363 563 600 663 664 665 2030 2180 2198 2265 2281, preferably 573 644 806 856 872 873 1089 1360 1361 1869 101 102 240 349 401 408 428 507 513 542 572 657 761 766 767 857 878 898 923 997 1000 1002 1025 1088 1129 1138 1139 1140 1266 1270 1693 1791 1883
1948 2098 2247 2251 2263 2264 2267 2301 and a fragment thereof.
Sous un autre aspect, de manière préférée, l'invention a pour objet un polypeptide selon l'invention, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polypeptide de Lactococcus lactis ou un de ses fragments impliqué dans le processus de transcription, et en ce qu'il est choisi parmi les polypeptides de séquences suivantes : SEQ ID N 1237 1332 564, de préférence 817 960 1906 2314 14 619 646 648 709 779 1314 1367 1368 1607 1612 1623 1850 1851 2124 2160 2222 2297 359 419 1613 et un de leurs fragments. In another aspect, preferably, the invention relates to a polypeptide according to the invention, characterized in that it is a polypeptide of Lactococcus lactis or one of its fragments involved in the transcription process, and in that it is chosen from the polypeptides of the following sequences: SEQ ID N 1237 1332 564, preferably 817 960 1906 2314 14 619 646 648 709 779 1314 1367 1368 1607 1612 1623 1850 1851 2124 2160 2222 2297 359 419 1613 and one of their fragments.
<Desc/Clms Page number 46> <Desc / Clms Page number 46>
Sous un autre aspect, de manière préférée, l'invention a pour objet un polypeptide selon l'invention, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polypeptide de Lactococcus lactis ou un de ses fragments impliqué dans le processus de traduction, et en ce qu'il est choisi parmi les polypeptides de séquences suivantes : SEQ ID N 1239 313 396 706 858 1778 1854 1861 1929 2105 571 1776 97 98 680 2127 782 783 2128, de préférence 68 382 394 807 831 1113 1114 1763 1775 1879 1902 1914 1964 1983 1984 2020 2022 2094 2109 2183 2229 260 303 624 1606 1697 2027 2028 2045 2047 2192 374 911 1600 2062 107 135 198 246 292 301 302 748 760 781 805 853 892 906 1097 1099 1307 1308 1617 1644 1790 1893 1894 1937 2056 2057 2123 2125 2126 2135 2136 213721382139214021422143 21442145214621472148214921502151 2152 2153 2154 2155 2156 2162 2209 2246 2248 2310 2311 2318 2319 13
132 158 168 169 171 496 638 705 852 1144 1923 1944 358 607 707 989 1126 1895 1912 2065 2208 2317 et un de leurs fragments. In another aspect, preferably, the invention relates to a polypeptide according to the invention, characterized in that it is a polypeptide of Lactococcus lactis or one of its fragments involved in the translation process, and in that it is chosen from the polypeptides of the following sequences: SEQ ID N 1239 313 396 706 858 1778 1854 1861 1929 2105 571 1776 97 98 680 2127 782 783 2128, preferably 68 382 394 807 831 1113 1114 1763 1775 1879 1902 1914 1964 1983 1984 2020 2022 2094 2109 2183 2229 260 303 624 1606 1697 2027 2028 2045 2047 2192 374 911 1600 2062 107 135 198 246 292 301 302 748 760 781 805 853 892 906 1097 1099 1307 1308 1617 1644 1790 1893 1894 1937 2056 2057 2123 2125 2126 2135 2136 213721382139214021422143 21442145214621472148214921502151 2152 2153 2154 2155 2156 2162 2209 2246 2248 2310 2311 2318 2319 13
132 158 168 169 171 496 638 705 852 1144 1923 1944 358 607 707 989 1126 1895 1912 2065 2208 2317 and a fragment thereof.
Sous un autre aspect, de manière préférée, l'invention a pour objet un polypeptide selon l'invention, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polypeptide de Lactococcus lactis ou un de ses fragments impliqué dans le processus de transport et de liaison des protéines, et en ce qu'il est choisi parmi les polypeptides de séquences suivantes : SEQ ID N 1256 1787 330 550 699 717
1330 1496 1497 1810 1888 1889 1890 1891 1892 2091 1771 566 919 1551 2040 2104 635676 1970 121 122 437 81 82 726 927 2221, de préférence 11 74 104 262 263 269 270 271 285 286 287 318 319 333 334 544 545 579 580 672 673 729 855 881 888 889 917 983 984 1080 1121 1122 1203 1311 1312
1366 1567 1602 1667 1800 1801 1825 1826 1844 1926 2051 2052 2074 2157 2260 2261 2313 2321 70 115 331 352 353 354 355 356 357 364 365 375 574 698 824 863 864 955 956 957 1128 1182 1183 1184 1185 1750 1811 1847
1848 1873 2087 2107 2250 52 308 309 310 1767 1768 1769 1770 1772 208 209 259 430 933 934 1282 1369 1370 1371 1530 1540 1541 1542 1548 1671
1678 1683 1684 1685 1686 1733 1734 1735 2239 99 193 194 316 336 337 338 In another aspect, preferably, the invention relates to a polypeptide according to the invention, characterized in that it is a polypeptide of Lactococcus lactis or one of its fragments involved in the transport process and binding of proteins, and in that it is chosen from the polypeptides of the following sequences: SEQ ID N 1256 1787 330 550 699 717
1330 1496 1497 1810 1888 1889 1890 1891 1892 2091 1771 566 919 1551 2040 2104 635676 1970 121 122 437 81 82 726 927 2221, preferably 11 74 104 262 263 269 270 271 285 286 287 318 319 333 334 544 545 579 580 672 673 729 855 881 888 889 917 983 984 1080 1121 1122 1203 1311 1312
1366 1567 1602 1667 1800 1801 1825 1826 1844 1926 2051 2052 2074 2157 2260 2261 2313 2321 70 115 331 352 353 354 355 356 357 364 365 375 574 698 824 863 864 955 956 957 1128 1182 1183 1184 1185 1750 1811 1847
1848 1873 2087 2107 2250 52 308 309 310 1767 1768 1769 1770 1772 208 209 259 430 933 934 1282 1369 1370 1371 1530 1540 1541 1542 1548 1671
1678 1683 1684 1685 1686 1733 1734 1735 2239 99 193 194 316 336 337 338
<Desc/Clms Page number 47><Desc / Clms Page number 47>
339 341 392 587 636 691 848 849 869 932 1194 1195 1295 1341 1355 1356 1357 1407 1528 1640 1655 2058 2169 2170 2171 2305 896 1166 1651 23 25 180 422 423 425 630 833 977 1149 1150 1505 1757 1758 1759 127 130 160 244 314 389 621 679 721 722 1389 1561 1584 1682 2220 2292 et un de leurs fragments. 339 341 392 587 636 691 848 849 869 932 1194 1195 1295 1341 1355 1356 1357 1407 1528 1640 1655 2058 2169 2170 2171 2305 896 1166 1651 23 25 180 422 423 425 630 833 977 1149 1150 1505 1757 1758 1759 127 130 160 244 314 389 621 679 721 722 1389 1561 1584 1682 2220 2292 and a fragment thereof.
Sous un autre aspect, de manière préférée, l'invention a pour objet un polypeptide selon l'invention, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polypeptide de Lactococcus lactis ou un de ses fragments impliqué dans l'adaptation aux conditions atypiques, et en ce qu'il est choisi parmi les polypeptides de séquences suivantes : SEQ ID N 174 540 568 654 686 970 1570, de préférence 69 173 195 312 346 418 653 912 971 1102 1170 1414 2085 et un de leurs fragments. In another aspect, preferably, the invention relates to a polypeptide according to the invention, characterized in that it is a polypeptide of Lactococcus lactis or one of its fragments involved in the adaptation to the conditions. atypical, and in that it is chosen from polypeptides of the following sequences: SEQ ID N 174 540 568 654 686 970 1570, preferably 69 173 195 312 346 418 653 912 971 1102 1170 1414 2085 and one of their fragments.
Sous un autre aspect, de manière préférée, l'invention a pour objet un polypeptide selon l'invention, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polypeptide de Lactococcus lactis ou un de ses fragments dans la sensibilité aux médicaments et analogues, et en ce qu'il est choisi parmi les polypeptides de séquences suivantes : SEQ ID N 1244, de préférence 1860 2249 et un de leurs fragments. In another aspect, preferably, the invention relates to a polypeptide according to the invention, characterized in that it is a polypeptide of Lactococcus lactis or one of its fragments in the sensitivity to drugs and the like. , and in that it is chosen from the polypeptides of the following sequences: SEQ ID N 1244, preferably 1860 2249 and one of their fragments.
Sous un autre aspect, de manière préférée, l'invention a pour objet un polypeptide selon l'invention, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polypeptide de Lactococcus lactis ou un de ses fragments impliqué dans les fonctions relatives aux phages et prophages, et en ce qu'il est choisi parmi les polypeptides de séquences suivantes : SEQ ID N 448 449 452 455 465 471 493 494 1026 1027
1028 1029 1030 1031 1032 1033 1034 1035 1036 1037 1038 1039 1040 1041
1046 1051 1075 1076 1077 1420 1422 1423 1424 1425 1426 1448 1450 1455
1456 1458 1465 1466 1467 1468 1470 1720, de préférence 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 446 447 450 451 453 454 456 457 458 459 460 461 462 463 464 466 467 468 469 470 472 473 474 475 476 477 478 479 480 481 482 483 484 485 486 487 488 489 490 491 492 514 515 516 517 518 519 520 521 522 523 524 525 526 527 528 529 531 532 533 In another aspect, preferably, the invention relates to a polypeptide according to the invention, characterized in that it is a polypeptide of Lactococcus lactis or one of its fragments involved in the functions relating to phages and prophages, and in that it is chosen from polypeptides of the following sequences: SEQ ID N 448 449 452 455 465 471 493 494 1026 1027
1028 1029 1030 1031 1032 1033 1034 1035 1036 1037 1038 1039 1040 1041
1046 1051 1075 1076 1077 1420 1422 1423 1424 1425 1426 1448 1450 1455
1456 1458 1465 1466 1467 1468 1470 1720, preferably 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 446 447 450 451 453 454 456 457 458 459 460 461 462 463 464 466 467 468 469 470 472 473 474 475 476 477 478 479 480 481 482 483 484 485 486 487 488 489 490 491 492 514 515 516 517 518 519 520 521 522 523 524 525 526 527 528 529 531 532 533
<Desc/Clms Page number 48><Desc / Clms Page number 48>
534 1042 1043 1044 1045 1047 1048 1049 1050 1052 1053 1054 1055 1056 1057 1058 1059 1060 1061 1062 1063 1064 1065 1066 1067 1068 1069 1070 1071 1072 1073 1074 1200 1217 1416 1417 1418 1419 1421 1427 1428 1429 1430 1431 1432 1433 1434 1435 1436 1437 1438 1439 1440 1441 1442 1443 1444 1445 1446 1447 1449 1451 1452 1453 1454 1457 1459 1460 1461 1462 1463 1464 1469 1471 1472 1473 1474 1475 1647 1998 2003 et un de leurs fragments. 534 1042 1043 1044 1045 1047 1048 1049 1050 1052 1053 1054 1055 1056 1057 1058 1059 1060 1061 1062 1063 1064 1065 1066 1067 1068 1069 1070 1071 1072 1073 1074 1200 1217 1416 1417 1418 1419 1421 1427 1428 1429 1430 1431 1432 1433 1434 1435 1436 1438 1439 1440 1441 1442 1443 1444 1445 1446 1447 1449 1451 1452 1453 1454 1457 1459 1460 1461 1462 1463 1464 1469 1471 1472 1473 1474 1475 1647 1998 2003 and a fragment thereof.
Sous un autre aspect, de manière préférée, l'invention a pour objet un polypeptide selon l'invention, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polypeptide de Lactococcus lactis ou un de ses fragments impliqué dans les fonctions relatives aux transposons, et en ce qu'il est choisi parmi les polypeptides de séquences suivantes : SEQ ID N 53 54 55 56 90 91 93 94 141 142 143 144 145 146 378 379 380 381 649 650 651 652 662 670 737 738 837 838 839 841 842 1224 1225 1231 1232 1236 1286 1287 1591 1741 1742 2082 2083 2129 2130 2131 2132 2201 2202 2203 2204, de préférence 614 694 718 950 1268 1342 1400 1560 1749 1936 1961 1986 1992 2060 2118 2191 2240 et un de leurs fragments. In another aspect, preferably, the invention relates to a polypeptide according to the invention, characterized in that it is a polypeptide of Lactococcus lactis or one of its fragments involved in the functions relating to transposons , and in that it is chosen from the polypeptides of the following sequences: SEQ ID N 53 54 55 56 90 91 93 94 141 142 143 144 145 146 378 379 380 381 649 650 651 652 662 670 737 738 837 838 839 841 842 1224 1225 1231 1232 1236 1286 1287 1591 1741 1742 2082 2083 2129 2130 2131 2132 2201 2202 2203 2204, preferably 614 694 718 950 1268 1342 1400 1560 1749 1936 1961 1986 1992 2060 2118 2191 2240 and one of their fragments.
Sous un autre aspect, de manière préférée, l'invention a pour objet un polypeptide selon l'invention, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polypeptide spécifique de Lactococcus lactis ou un de ses fragments, et en ce qu'il est choisi parmi les polypeptides de séquences suivantes : SEQ ID N 416 1727 1822 87 88 279 332 569 671 700 701 727 840 850 884 891 900 1204 1242 1277 1382 1592 1605 1718 1719 1762 1777 1780 1907 1917 1918 1919 1930 1938 1939 1940 2102 2106 2174 2210 1250 1328 2199 666 948 1381 1990, de préférence 591 618 710 835 1153 1910 1931 1953 2031 17 18 50 57 58 60 78 79 80 84 92 113 114 116 124 125 133 134 139 140 148 149 150 157 159 161 162 170 172 175 176 179 183 184 185 188 189 196 197 214 230 231 232 233 234 235 236 238 247 255 258 264 266 267 268 274 277 283 288 289 293 294 298 299 300 315 317 321 323 325 343 344 366 367 369 370 371 372 373 376 377 384 In another aspect, preferably, the invention relates to a polypeptide according to the invention, characterized in that it is a specific polypeptide of Lactococcus lactis or one of its fragments, and in that it is chosen from the polypeptides of the following sequences: SEQ ID N 416 1727 1822 87 88 279 332 569 671 700 701 727 840 850 884 891 900 1204 1242 1277 1382 1592 1605 1718 1719 1762 1777 1780 1907 1917 1918 1919 1930 1938 1939 1940 2102 2106 2174 2210 1250 1328 2199 666 948 1381 1990, preferably 591 618 710 835 1153 1910 1931 1953 2031 17 18 50 57 58 60 78 79 80 84 92 113 114 116 124 125 133 134 139 140 148 149 150 157 159 161 162 170 172 175 176 179 183 184 185 188 189 196 197 214 230 231 232 233 234 235 236 238 247 255 258 264 266 267 268 274 277 283 288 289 293 294 298 299 300 315 317 321 323 325 343 344 366 367 369 370 371 372 373 376 377 384
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Il est important de noter toutefois qu'un organisme vivant est un tout et doit être pris comme tel. Ainsi, afin de pouvoir se développer et d'exhiber ses propriétés, tout organisme a besoin d'interactions entre les différentes voies métaboliques. Ainsi, la classification énoncée ci-dessus ne doit pas être considérée comme limitative, un gène pouvant être impliqué dans deux voies métaboliques distinctes. It is important to note, however, that a living organism is a whole and should be taken as such. Thus, in order to be able to develop and exhibit its properties, any organism needs interactions between the different metabolic pathways. Thus, the classification stated above should not be considered as limiting, a gene being able to be involved in two distinct metabolic pathways.
La présente invention a également pour objet les séquences A subject of the present invention is also the sequences
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nucléotidiques et/ou de polypeptides selon l'invention, caractérisées en ce que lesdites séquences sont enregistrées sur un support d'enregistrement dont la forme et la nature facilitent la lecture, l'analyse et/ou l'exploitation de ladite ou desdites séquence (s). supports peuvent également contenir d'autres informations extraites de la présente invention, notamment les analogies avec des séquences déjà connues, comme mentionné dans le Tableau III et/ou des informations concernant les séquences nucléotidiques et/ou de polypeptides d'autres microorganismes afin de faciliter l'analyse comparative et l'exploitation des résultats obtenus. nucleotides and / or polypeptides according to the invention, characterized in that said sequences are recorded on a recording medium, the form and nature of which facilitate the reading, analysis and / or use of said sequence or sequences ( s). supports may also contain other information extracted from the present invention, in particular analogies with already known sequences, as mentioned in Table III and / or information concerning the nucleotide and / or polypeptide sequences of other microorganisms in order to facilitate comparative analysis and exploitation of the results obtained.
Parmi cesdits supports d'enregistrement, on préfère en particulier les supports lisibles par un ordinateur, tels les supports magnétiques, optiques, électriques ou hybrides, en particulier les disquettes informatiques, les CDROM, les serveurs informatiques. De tels supports d'enregistrement sont également objet de l'invention. Among said recording media, preference is given in particular to media readable by a computer, such as magnetic, optical, electric or hybrid media, in particular computer diskettes, CDROMs, computer servers. Such recording media are also the subject of the invention.
Les supports d'enregistrement selon l'invention, avec les informations apportées, sont très utiles pour le choix d'amorces ou de sondes nucléotidiques pour la détermination de gènes dans Lactococcus lactis ou souches proches de cet organisme. De même, l'utilisation de ces supports pour l'étude du polymorphisme génétique de souche proche de Lactococcus lactis, en particulier par la détermination des régions de colinéarité, est très utile dans la mesure où ces supports fournissent non seulement la séquence nucléotidique du génome de Lactococcus lactis IL 1403, mais également l'organisation génomique dans ladite séquence. Ainsi, les utilisations de supports d'enregistrement selon l'invention sont également des objets de l'invention. The recording media according to the invention, with the information provided, are very useful for the choice of primers or nucleotide probes for the determination of genes in Lactococcus lactis or strains close to this organism. Likewise, the use of these supports for the study of the genetic polymorphism of a strain close to Lactococcus lactis, in particular by the determination of the regions of collinearity, is very useful insofar as these supports not only provide the nucleotide sequence of the genome. of Lactococcus lactis IL 1403, but also the genomic organization in said sequence. Thus, the uses of recording media according to the invention are also subjects of the invention.
Un procédé d'étude du polymorphisme génétique entre les souches proches de Lactococcus lactis, par détermination des régions de colinéarité, peut comprendre les étapes de fragmentation de l'ADN chromosomal de ladite autre souche (sonication, digestion), A method of studying the genetic polymorphism between strains close to Lactococcus lactis, by determining the regions of collinearity, can comprise the steps of fragmentation of the chromosomal DNA of said other strain (sonication, digestion),
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séquence des fragments d'ADN, - analyse d'homologie avec le génome de Lactococcus lactis IL 1043 (SEQ ID N 1). sequence of DNA fragments, - homology analysis with the genome of Lactococcus lactis IL 1043 (SEQ ID N 1).
Ce procédé qui comprend une étape d'analyse d'homologie avec le génome de Lactococcus lactis IL1403, en particulier grâce à l'aide d'un support d'enregistrement, est également l'objet de l'invention. This method, which comprises a step of analyzing homology with the genome of Lactococcus lactis IL1403, in particular by means of a recording medium, is also the subject of the invention.
L'analyse d'homologie entre différentes séquences s'effectue en effet avantageusement à l'aide de logiciels de comparaisons de séquences, tels le logiciel Blast, ou les logiciels de la trousse GCG, décrits précédemment. The analysis of homology between different sequences is in fact advantageously carried out using sequence comparison software, such as the Blast software, or the software of the GCG kit, described above.
L'invention vise également les vecteurs de clonage et/ou d'expression, qui contiennent une séquence nucléotidique selon l'invention. On préfère en particulier, les séquences nucléotidiques codant pour des polypeptides impliqués dans la machinerie cellulaire, en particulier la sécrétion, le métabolisme intermédiaire central, en particulier la production de sucre, le métabolisme énergétique, les processus de synthèse des acides aminés, de transcription et de traduction, de synthèse de polypeptides, ou les séquences nucléiques impliquées dans les fonctions relatives aux phages et prophages. The invention is also aimed at the cloning and / or expression vectors, which contain a nucleotide sequence according to the invention. Particularly preferred are nucleotide sequences encoding polypeptides involved in cellular machinery, in particular secretion, central intermediate metabolism, in particular sugar production, energy metabolism, amino acid synthesis, transcription and process. translation, polypeptide synthesis, or nucleic acid sequences involved in functions relating to phages and prophages.
Les vecteurs selon l'invention sont avantageusement utilisés pour la génération de souches bactériennes qui présentent des propriétés de fermentation améliorée et/ou une stabilité accrue. En particulier, on recherche les souches bactériennes, de préférence de Lactococcus lactis, qui présentent une résistance accrue aux phages, ou des capacités de sécrétion améliorées. The vectors according to the invention are advantageously used for the generation of bacterial strains which exhibit improved fermentation properties and / or increased stability. In particular, the search is for bacterial strains, preferably of Lactococcus lactis, which exhibit increased resistance to phages, or improved secretion capacities.
Les vecteurs selon l'invention comportent de préférence des éléments qui permettent l'expression et/ou la sécrétion des séquences nucléotidiques dans une cellule hôte déterminée. The vectors according to the invention preferably comprise elements which allow the expression and / or the secretion of the nucleotide sequences in a given host cell.
Le vecteur doit alors comporter un promoteur, des signaux d'initiation et de terminaison de la traduction, ainsi que des régions appropriées de régulation de la transcription. Il doit pouvoir être maintenu de façon stable dans la cellule hôte et peut éventuellement posséder des signaux particuliers qui The vector must then comprise a promoter, signals for initiation and termination of translation, as well as appropriate regions for the regulation of transcription. It must be able to be maintained stably in the host cell and may possibly have specific signals which
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spécifient la sécrétion de la protéine traduite. Ces différents éléments sont choisis et optimisés par l'homme du métier en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. A cet effet, les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent être insérées dans des vecteurs à réplication autonome au sein de l'hôte choisi, ou être des vecteurs intégratifs de l'hôte choisi. specify the secretion of the translated protein. These different elements are chosen and optimized by those skilled in the art depending on the cellular host used. For this purpose, the nucleotide sequences according to the invention can be inserted into vectors which replicate autonomously within the chosen host, or be vectors integrating the chosen host.
De tels vecteurs sont préparés par des méthodes couramment utilisées par l'homme du métier, et les clones résultant peuvent être introduits dans un hôte approprié par des méthodes standards, telle que la lipofection, l'électroporation, le choc thermique, ou des méthodes chimiques. Such vectors are prepared by methods commonly used by those skilled in the art, and the resulting clones can be introduced into a suitable host by standard methods, such as lipofection, electroporation, heat shock, or chemical methods. .
Les vecteurs selon l'invention sont par exemple des vecteurs d'origine plasmidique ou virale. Ils sont utiles pour transformer des cellules hôtes afin de cloner ou d'exprimer les séquences nucléotidiques selon l'invention. The vectors according to the invention are, for example, vectors of plasmid or viral origin. They are useful for transforming host cells in order to clone or express the nucleotide sequences according to the invention.
L'invention comprend également les cellules hôtes transformées par un vecteur selon l'invention. The invention also comprises the host cells transformed with a vector according to the invention.
L'hôte cellulaire peut être choisi parmi des systèmes procaryotes ou eucaryotes, par exemple les cellules bactériennes mais également les cellules de levure ou les cellules animales, en particulier les cellules de mammifères. On peut également utiliser des cellules d'insectes ou des cellules de plantes. Les cellules hôtes préférées selon l'invention sont en particulier les cellules procaryotes, de préférence les bactéries appartenant au genre Lactococcus, à l'espèce Lactococcus lactis, ou les microorganismes associés à l'espèce Lactococcus lactis. L'invention concerne également les animaux et végétaux, excepté l'homme, qui comprennent une cellule transformée selon l'invention. The cellular host can be chosen from prokaryotic or eukaryotic systems, for example bacterial cells but also yeast cells or animal cells, in particular mammalian cells. Insect cells or plant cells can also be used. The preferred host cells according to the invention are in particular prokaryotic cells, preferably bacteria belonging to the genus Lactococcus, to the species Lactococcus lactis, or the microorganisms associated with the species Lactococcus lactis. The invention also relates to animals and plants, except man, which comprise a transformed cell according to the invention.
Les cellules transformées selon l'invention sont utilisables dans des procédés de préparation de polypeptides recombinants selon l'invention. Les procédés de préparation d'un polypeptide selon l'invention sous forme recombinante, caractérisés en ce qu'ils mettent en #uvre un vecteur et/ou une cellule transformée par un vecteur selon l'invention sont eux-mêmes compris dans la présente invention. De préférence, on cultive une cellule transformée par un The cells transformed according to the invention can be used in processes for preparing recombinant polypeptides according to the invention. The processes for preparing a polypeptide according to the invention in recombinant form, characterized in that they use a vector and / or a cell transformed with a vector according to the invention are themselves included in the present invention. . Preferably, a cell transformed with a
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vecteur selon l'invention dans des conditions qui permettent l'expression dudit polypeptide et on récupère ledit peptide recombinant. Les cellules hôtes selon l'invention peuvent également être utilisées pour la préparation de compositions alimentaires, qui sont elles-mêmes objet de la présente invention. vector according to the invention under conditions which allow expression of said polypeptide and said recombinant peptide is recovered. The host cells according to the invention can also be used for the preparation of food compositions, which are themselves the subject of the present invention.
Ainsi qu'il a été dit, l'hôte cellulaire peut être choisi parmi des systèmes procaryotes ou eucaryotes. En particulier, il est possible d'identifier des séquences nucléotidiques selon l'invention, facilitant la sécrétion dans un tel système procaryote ou eucaryote. Un vecteur selon l'invention portant une telle séquence peut donc être avantageusement utilisé pour la production de protéines recombinantes, destinées à être sécrétées. En effet, la purification de ces protéines recombinantes d'intérêt sera facilité par le fait qu'elles sont présentent dans le surnageant de la culture cellulaire plutôt qu'à l'intérieur des cellules hôtes. As has been said, the cellular host can be chosen from among prokaryotic or eukaryotic systems. In particular, it is possible to identify nucleotide sequences according to the invention, facilitating secretion in such a prokaryotic or eukaryotic system. A vector according to the invention carrying such a sequence can therefore be advantageously used for the production of recombinant proteins, intended to be secreted. Indeed, the purification of these recombinant proteins of interest will be facilitated by the fact that they are present in the supernatant of the cell culture rather than inside the host cells.
On peut également préparer les polypeptides selon l'invention par synthèse chimique. Un tel procédé de préparation est également un objet de l'invention. L'homme du métier connaît les procédés de synthèse chimique, par exemple les techniques mettant en #uvre des phases solides (voir notamment Steward et al., 1984, Solid phase peptides synthesis, Pierce Chem. Company, Rockford, 111,2ème éd., (1984)) ou des techniques utilisant des phases solides partielles, par condensation de fragments ou par une synthèse en solution classique. Les polypeptides obtenus par synthèse chimique et pouvant comporter des acides aminés non naturels correspondant sont également compris dans l'invention. The polypeptides according to the invention can also be prepared by chemical synthesis. Such a preparation process is also an object of the invention. Those skilled in the art are familiar with chemical synthesis processes, for example techniques using solid phases (see in particular Steward et al., 1984, Solid phase peptides synthesis, Pierce Chem. Company, Rockford, 111.2nd ed. , (1984)) or techniques using partial solid phases, by condensation of fragments or by conventional solution synthesis. The polypeptides obtained by chemical synthesis and which may contain corresponding unnatural amino acids are also included in the invention.
L'invention comprend également les polypeptides hybrides qui comprennent au moins la séquence d'un polypeptide selon l'invention, et la séquence d'un polypeptide susceptible d'induire une réponse immunitaire chez l'homme ou l'animal. L'invention comprend également les séquences nucléotidiques qui codent pour de tels polypeptides hybrides, ou les vecteurs qui contiennent ces séquences nucléotidiques. Ce couplage entre un polypeptide The invention also comprises hybrid polypeptides which comprise at least the sequence of a polypeptide according to the invention, and the sequence of a polypeptide capable of inducing an immune response in humans or animals. The invention also includes the nucleotide sequences which encode such hybrid polypeptides, or the vectors which contain these nucleotide sequences. This coupling between a polypeptide
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selon l'invention et un polypeptide immunogène, peut être effectué par voie chimique, ou par voie biologique. Ainsi, selon l'invention, il est possible d'introduire un ou plusieurs élément(s) de liaison, notamment des acides aminés pour faciliter les réactions de couplage entre le polypeptide selon l'invention, et le polypeptide immunostimulateur, le couplage covalent de l'antigène immunostimulateur pouvant être réalisé à l'extrémité N ou C-terminale du polypeptide selon l'invention. Les réactifs bifonctionnels permettant ce couplage sont déterminés en fonction de l'extrémité choisie pour réaliser ce couplage, et les techniques de couplage sont bien connues de l'homme du métier. according to the invention and an immunogenic polypeptide, can be carried out chemically or biologically. Thus, according to the invention, it is possible to introduce one or more binding element (s), in particular amino acids to facilitate the coupling reactions between the polypeptide according to the invention, and the immunostimulatory polypeptide, the covalent coupling of the immunostimulatory antigen which can be produced at the N or C-terminus of the polypeptide according to the invention. The bifunctional reagents allowing this coupling are determined as a function of the end chosen to carry out this coupling, and the coupling techniques are well known to those skilled in the art.
Les conjugués issus d'un couplage de peptides peuvent être également préparés par recombinaison génétique. Le peptide hybride (conjugué) peut en effet être produit par des techniques d'ADN recombinant, par insertion ou addition à la séquence d'ADN codant pour le polypeptide selon l'invention, d'une séquence codant pour le ou les peptide (s) antigène (s), immunogène (s) ou haptène (s). Ces techniques de préparation de peptides hybrides par recombinaison génétique sont bien connues de l'homme du métier (voir par exemple Makrides, 1996, Microbiological Reviews 60, 512-538). The conjugates resulting from a coupling of peptides can also be prepared by genetic recombination. The hybrid (conjugated) peptide can in fact be produced by recombinant DNA techniques, by insertion or addition to the DNA sequence encoding the polypeptide according to the invention, of a sequence encoding the peptide (s) (s). ) antigen (s), immunogen (s) or hapten (s). These techniques for preparing hybrid peptides by genetic recombination are well known to those skilled in the art (see for example Makrides, 1996, Microbiological Reviews 60, 512-538).
De préférence, ledit polypeptide immunitaire est choisi dans le groupe des peptides contenant les anatoxines, notamment le toxoïde diphtérique ou le toxoïde tétanique, les protéines dérivées du Streptocoque (comme la protéine de liaison à la séralbumine humaine), les protéines membranaires OMPA et les complexes de protéines de membranes externes, les vésicules de membranes externes ou les protéines de chocs thermiques. Preferably, said immune polypeptide is chosen from the group of peptides containing toxoids, in particular diphtheria toxoid or tetanus toxoid, proteins derived from Streptococcus (such as the human sereralbumin binding protein), OMPA membrane proteins and complexes. outer membrane proteins, outer membrane vesicles or thermal shock proteins.
Les séquences nucléotidiques et vecteurs, codant pour un polypeptide hybride selon l'invention sont également objet de l'invention. The nucleotide and vector sequences encoding a hybrid polypeptide according to the invention are also subject of the invention.
Les polypeptides hybrides selon l'invention sont très utiles pour obtenir des anticorps monoclonaux ou polyclonaux, capables de reconnaître spécifiquement les polypeptides selon l'invention. En effet, un polypeptide hybride selon l'invention permet la potentiation de la réponse immunitaire, The hybrid polypeptides according to the invention are very useful for obtaining monoclonal or polyclonal antibodies, capable of specifically recognizing the polypeptides according to the invention. Indeed, a hybrid polypeptide according to the invention allows the potentiation of the immune response,
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contre le polypeptide selon l'invention couplé à la molécule immunogène. De tels anticorps monoclonaux ou polyclonaux, leurs fragments, ou les anticorps chimériques, reconnaissant les polypeptides selon l'invention, sont également objets de l'invention. against the polypeptide according to the invention coupled to the immunogenic molecule. Such monoclonal or polyclonal antibodies, their fragments, or chimeric antibodies, recognizing the polypeptides according to the invention, are also subjects of the invention.
Les anticorps monoclonaux spécifiques peuvent être obtenus selon la méthode classique de culture d'hybridome décrite par Kôhler et Milstein (1975, Nature 256, 495). The specific monoclonal antibodies can be obtained according to the conventional hybridoma culture method described by Köhler and Milstein (1975, Nature 256, 495).
Les anticorps selon l'invention sont par exemple des anticorps chimériques, des anticorps humanisés, des fragments Fab, ou F(ab')2. Il peut également se présenter sous forme d'immunoconjugué ou d'anticorps marqué afin d'obtenir un signal détectable et/ou quantifiable. The antibodies according to the invention are, for example, chimeric antibodies, humanized antibodies, Fab or F (ab ') 2 fragments. It can also be in the form of an immunoconjugate or a labeled antibody in order to obtain a detectable and / or quantifiable signal.
Ainsi, les anticorps selon l'invention peuvent être employés dans un procédé pour la détection et/ou l'identification de bactéries appartenant à l'espèce Lactococcus lactis ou à un microorganisme associé dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mise en contact de l'échantillon biologique avec un anticorps selon l'invention ; b) mise en évidence du complexe antigène-anticorps éventuellement formé. Thus, the antibodies according to the invention can be used in a method for the detection and / or identification of bacteria belonging to the species Lactococcus lactis or to an associated microorganism in a biological sample, characterized in that it comprises the following steps: a) bringing the biological sample into contact with an antibody according to the invention; b) demonstration of the antigen-antibody complex possibly formed.
Les anticorps selon la présente invention sont également utilisables afin de détecter une expression d'un gène de Lactococcus lactis ou de microorganismes associés. En effet, la présence du produit d'expression d'un gène reconnu par un anticorps spécifique dudit produit expression peut être détectée par la présence d'un complexe antigène-anticorps formé après la mise en contact de la souche de Lactococcus lactis ou du microorganisme associé avec un anticorps selon l'invention. La souche bactérienne utilisée peut avoir été préparée , c'est-à-dire centrifugée, lysée, placée dans un réactif approprié pour la constitution du milieu propice à la réaction immunologique. En particulier, on préfère un procédé de détection de l'expression dans le gène, The antibodies according to the present invention can also be used in order to detect an expression of a gene of Lactococcus lactis or of associated microorganisms. Indeed, the presence of the expression product of a gene recognized by an antibody specific for said expression product can be detected by the presence of an antigen-antibody complex formed after bringing the strain of Lactococcus lactis or the microorganism into contact. associated with an antibody according to the invention. The bacterial strain used may have been prepared, that is to say centrifuged, lysed, placed in a reagent suitable for constituting the medium suitable for the immunological reaction. In particular, a method of detecting expression in the gene is preferred,
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correspondant à un Western blot, pouvant être effectué après une électrophorèse sur gel de polyacrylamide d'un lysat de la souche bactérienne, en présence ou en l'absence de conditions réductrices (SDS-PAGE). Après migration et séparation des protéines sur le gel de polyacrylamide, on transfère lesdites protéines sur une membrane appropriée (par exemple en nylon) et on détecte la présence de la protéine ou du polypeptide d'intérêt, par mise en contact de ladite membrane avec un anticorps selon l'invention. corresponding to a Western blot, which can be carried out after electrophoresis on polyacrylamide gel of a lysate of the bacterial strain, in the presence or in the absence of reducing conditions (SDS-PAGE). After migration and separation of the proteins on the polyacrylamide gel, said proteins are transferred to an appropriate membrane (for example nylon) and the presence of the protein or polypeptide of interest is detected, by bringing said membrane into contact with a antibody according to the invention.
Ainsi, la présente invention comprend également les kits ou nécessaires pour la mise en #uvre d'un procédé tel que décrit (de détection de l'expression d'un gène de Lactococcus lactis ou d'un microorganisme associé, ou pour la détection et/ou l'identification de bactéries appartenant à l'espèce Lactococcus lactis ou un microorganisme associé), comprenant les éléments suivants : a) un anticorps polyclonal ou monoclonal selon l'invention ; b) éventuellement, les réactifs pour la constitution du milieu propice à la réaction immunologique ; c) éventuellement, les réactifs permettant la mise en évidence des complexes antigène-anticorps produits par la réaction immunologique. Thus, the present invention also comprises the kits or necessary for the implementation of a method as described (for detecting the expression of a Lactococcus lactis gene or of an associated microorganism, or for the detection and / or the identification of bacteria belonging to the species Lactococcus lactis or an associated microorganism), comprising the following elements: a) a polyclonal or monoclonal antibody according to the invention; b) optionally, the reagents for constituting the medium suitable for the immunological reaction; c) optionally, the reagents allowing the detection of the antigen-antibody complexes produced by the immunological reaction.
Les polypeptides et les anticorps selon l'invention peuvent avantageusement être immobilisés sur un support, notamment une puce à protéines. Une telle puce à protéines est un objet de l'invention, et peut également contenir au moins un polypeptide d'un microorganisme autre que Lactococcus lactis ou un anticorps dirigé contre un composé d'un microorganisme autre que Lactococcus lactis. The polypeptides and the antibodies according to the invention can advantageously be immobilized on a support, in particular a protein chip. Such a protein chip is an object of the invention, and can also contain at least one polypeptide of a microorganism other than Lactococcus lactis or an antibody directed against a compound of a microorganism other than Lactococcus lactis.
Les puces à protéines ou filtres à haute densité contenant des protéines selon l'invention peuvent être construits de la même manière que les puces à ADN selon l'invention. En pratique, on peut effectuer la synthèse des polypeptides fixés directement sur la puce à protéines, ou effectuer une synthèse ex situ suivie d'une étape de fixation du polypeptide synthétisé sur ladite puce. The protein arrays or high density filters containing proteins according to the invention can be constructed in the same way as the DNA arrays according to the invention. In practice, it is possible to synthesize the polypeptides fixed directly to the protein chip, or to carry out an ex situ synthesis followed by a step of fixing the polypeptide synthesized on said chip.
Cette dernière méthode est préférable, lorsque l'on désire fixer des protéines de The latter method is preferable, when it is desired to fix proteins of
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taille importante sur le support, qui sont avantageusement préparées par génie génétique. Toutefois, si l'on ne désire fixer que des peptides sur le support de ladite puce, il peut être plus intéressant de procéder à la synthèse desdits peptides directement in situ. large size on the support, which are advantageously prepared by genetic engineering. However, if it is desired to fix only peptides on the support of said chip, it may be more advantageous to proceed with the synthesis of said peptides directly in situ.
Les puces à protéines selon l'invention peuvent être avantageusement utilisées dans des kits ou nécessaires pour la détection et/ou l'identification de bactéries associées à l'espèce Lactococcus lactis ou à un microorganisme, ou de façon plus générale dans des kits ou nécessaires pour la détection et/ou l'identification de microorganismes. Lorsque l'on fixe les polypeptides selon l'invention sur les puces à ADN, on recherche la présence d'anticorps dans les échantillons testés, la fixation d'un anticorps selon l'invention sur le support de la puce à protéines permettant l'identification de la protéine dont ledit anticorps est spécifique. The protein chips according to the invention can be advantageously used in kits or necessary for the detection and / or identification of bacteria associated with the species Lactococcus lactis or with a microorganism, or more generally in kits or necessary for the detection and / or identification of microorganisms. When the polypeptides according to the invention are fixed on the DNA chips, the presence of antibodies is sought in the samples tested, the fixing of an antibody according to the invention on the support of the protein chip allowing the identification of the protein for which said antibody is specific.
De préférence, on fixe un anticorps selon l'invention sur le support de la puce à protéines, et on détecte la présence de l'antigène correspondant, spécifique de Lactococcus lactis ou d'un microorganisme associé. Preferably, an antibody according to the invention is fixed on the support of the protein chip, and the presence of the corresponding antigen, specific for Lactococcus lactis or an associated microorganism, is detected.
Une puce à protéines ci-dessus décrite peut être utilisée pour la détection de produits de gènes, pour établir un profil d'expression desdits gènes, en complément d'une puce à ADN selon l'invention. A protein chip described above can be used for the detection of gene products, to establish an expression profile of said genes, in addition to a DNA chip according to the invention.
Les puces à protéines selon l'invention sont également extrêmement utiles pour les expériences de protéomique, qui étudie les interactions entre les différentes protéines d'un microorganisme donné. De façon simplifiée, on fixe des peptides représentatifs des différentes protéines d'un organisme sur un support. Puis, on met ledit support en contact avec des protéines marquées, et après une étape optionnelle de rinçage, on détecte des interactions entre lesdites protéines marquées et les peptides fixés sur la puce à protéines. The protein chips according to the invention are also extremely useful for proteomics experiments, which studies the interactions between the different proteins of a given microorganism. In a simplified manner, peptides representative of the various proteins of an organism are fixed on a support. Then, said support is brought into contact with labeled proteins, and after an optional rinsing step, interactions between said labeled proteins and the peptides attached to the protein chip are detected.
Ainsi, les puces à protéines comprenant une séquence polypeptidique selon l'invention ou un anticorps selon l'invention sont objet de l'invention, ainsi que les kits ou nécessaires les contenant. Thus, the protein chips comprising a polypeptide sequence according to the invention or an antibody according to the invention are the subject of the invention, as well as the kits or kits containing them.
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La présente invention couvre également un procédé de détection et/ou d'identification de bactéries appartenant à l'espèce Lactococcus lactis ou à un microorganisme associé dans un échantillon biologique, qui met en #uvre une séquence nucléotidique selon l'invention. The present invention also covers a method for detecting and / or identifying bacteria belonging to the species Lactococcus lactis or to an associated microorganism in a biological sample, which uses a nucleotide sequence according to the invention.
Il doit être entendu que le terme échantillon biologique concerne dans la présente invention les échantillons prélevés à partir d'un organisme vivant (en particulier sang, tissus, organes ou autres prélevés à partir d'un mammifère) ou un échantillon contenant du matériel biologique, c'est-à-dire de l'ADN. Un tel échantillon biologique englobe donc les compositions alimentaires contenant des bactéries (par exemple les fromages, les produits laitiers), mais également des compositions alimentaires contenant des levures (bières, pains) ou autres. It should be understood that the term biological sample relates in the present invention to samples taken from a living organism (in particular blood, tissues, organs or other taken from a mammal) or a sample containing biological material, that is, DNA. Such a biological sample therefore encompasses food compositions containing bacteria (for example cheeses, dairy products), but also food compositions containing yeasts (beers, breads) or others.
* Le procédé de détection et/ou d'identification mettant en #uvre les séquences nucléotidiques selon l'invention peut être de diverse nature. * The detection and / or identification method using the nucleotide sequences according to the invention can be of various nature.
On préfère un procédé comportant les étapes suivantes : a) éventuellement, isolement de l'ADN à partir de l'échantillon biologique à analyser, ou obtention d'un ADNc à partir de l'ARN de l'échantillon biologique ; b) amplification spécifique de l'ADN de bactéries appartenant à l'espèce Lactococcus lactis ou à un micro-organisme associé à l'aide d'au moins une amorce selon l'invention ; c) mise en évidence des produits d'amplification. A method comprising the following steps is preferred: a) optionally, isolating DNA from the biological sample to be analyzed, or obtaining a cDNA from the RNA of the biological sample; b) specific amplification of the DNA of bacteria belonging to the species Lactococcus lactis or to an associated microorganism using at least one primer according to the invention; c) demonstration of amplification products.
Ce procédé est basé sur l'amplification spécifique de l'ADN, en particulier par une réaction d'amplification en chaîne. This method is based on the specific amplification of DNA, in particular by an amplification chain reaction.
On préfère également un procédé comprenant les étapes suivantes : a) mise en contact d'une sonde nucléotidique selon l'invention avec un échantillon biologique, l'acide nucléique contenu dans l'échantillon biologique ayant, le cas échéant, préalablement été rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions permettant l'hybridation de la sonde à l'acide nucléique d'une bactérie A method comprising the following steps is also preferred: a) bringing a nucleotide probe according to the invention into contact with a biological sample, the nucleic acid contained in the biological sample having, where appropriate, been made previously accessible to hybridization, under conditions allowing hybridization of the probe to the nucleic acid of a bacterium
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appartenant à l'espèce Lactococcus lactis ou à un micro- organisme associé ; b) mise en évidence de l'hybride éventuellement formé entre la sonde nucléotidique et l'ADN de l'échantillon biologique. belonging to the species Lactococcus lactis or to an associated microorganism; b) demonstration of the hybrid possibly formed between the nucleotide probe and the DNA of the biological sample.
Un tel procédé ne doit pas être limité à la détection de la présence de l'ADN contenu dans l'échantillon biologique attesté, il peut être également mis en #uvre pour détecter l'ARN contenu dans ledit échantillon. Ce procédé englobe en particulier les Southern et Northern blot. Such a method should not be limited to detecting the presence of the DNA contained in the certified biological sample, it can also be used to detect the RNA contained in said sample. This process encompasses in particular the Southern and Northern blotting.
Un autre procédé préféré selon l'invention comprend les étapes suivantes : a) mise en contact d'une sonde nucléotidique immobilisée sur un support selon l'invention avec un échantillon biologique, l'acide nucléique de l'échantillon, ayant, le cas échéant, été préalablement rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions permettant l'hybridation de la sonde à l'acide nucléique d'une bactérie appartenant à l'espèce Lactococcus lactis ou à un micro-organisme associé ; b) mise en contact de l'hybride formé entre la sonde nucléotidique immobilisée sur un support et l'acide nucléique contenu dans l'échantillon biologique, le cas échéant après élimination de l'ADN de l'échantillon biologique n'ayant pas hybridé avec la sonde, avec une sonde nucléotidique marquée selon l'invention ; c) mise en évidence du nouvel hybride formé à l'étape b). Another preferred method according to the invention comprises the following steps: a) bringing a nucleotide probe immobilized on a support according to the invention into contact with a biological sample, the nucleic acid of the sample having, where appropriate , been made accessible beforehand for hybridization, under conditions allowing hybridization of the probe to the nucleic acid of a bacterium belonging to the species Lactococcus lactis or to an associated microorganism; b) bringing the hybrid formed into contact between the nucleotide probe immobilized on a support and the nucleic acid contained in the biological sample, where appropriate after removing the DNA from the biological sample which has not hybridized with the probe, with a labeled nucleotide probe according to the invention; c) demonstration of the new hybrid formed in step b).
Ce procédé est avantageusement utilisé avec une puce à ADN selon l'invention, l'acide nucléique recherché s'hybridant avec une sonde présente à la surface de ladite puce, et étant détecté par l'utilisation d'une sonde marquée. Ce procédé est avantageusement mis en #uvre en combinant une étape préalable d'amplification de l'ADN ou de l'ADN complémentaire obtenu éventuellement par transcription inverse, à l'aide d'amorces selon l'invention. This method is advantageously used with a DNA chip according to the invention, the desired nucleic acid hybridizing with a probe present on the surface of said chip, and being detected by the use of a labeled probe. This method is advantageously implemented by combining a preliminary step of amplifying the DNA or the complementary DNA optionally obtained by reverse transcription, using primers according to the invention.
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Ainsi, la présente invention englobe également les kits ou nécessaires pour la détection et/ou l'identification de bactéries appartenant à l'espèce Lactococcus lactis ou à un micro-organisme associé, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants : a) une sonde nucléotidique selon l'invention ; b) éventuellement, les réactifs nécessaires à la mise en #uvre d'une réaction d'hybridation ; c) éventuellement, au moins une amorce selon l'invention ainsi que les réactifs nécessaires à une réaction d'amplification de l'ADN. Thus, the present invention also encompasses the kits or necessary for the detection and / or identification of bacteria belonging to the species Lactococcus lactis or to an associated microorganism, characterized in that it comprises the following elements: a) a nucleotide probe according to the invention; b) optionally, the reagents necessary for carrying out a hybridization reaction; c) optionally, at least one primer according to the invention as well as the reagents necessary for a DNA amplification reaction.
De même, la présente invention englobe également les kits ou nécessaires pour la détection et/ou l'identification de bactéries appartenant à l'espèce Lactococcus lactis ou à un micro-organisme associé, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants : a) une sonde nucléotidique, dite sonde de capture, selon l'invention; b) une sonde oligonucléotidique, dite sonde de révélation, selon l'invention ; c) éventuellement, au moins une amorce selon l'invention ainsi que les réactifs nécessaires à une réaction d'amplification de l'ADN. Likewise, the present invention also encompasses the kits or necessary for the detection and / or identification of bacteria belonging to the species Lactococcus lactis or to an associated microorganism, characterized in that it comprises the following elements: a ) a nucleotide probe, called a capture probe, according to the invention; b) an oligonucleotide probe, called a revelation probe, according to the invention; c) optionally, at least one primer according to the invention as well as the reagents necessary for a DNA amplification reaction.
Enfin, les kits ou nécessaires pour la détection et/ou l'identification de bactéries appartenant à l'espèce Lactococcus lactis ou à un micro-organisme associé, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants : a) au moins une amorce selon l'invention ; b) éventuellement, les réactifs nécessaires pour effectuer une réaction d'amplification d'ADN ; c) éventuellement, un composant permettant de vérifier la séquence du fragment amplifié, plus particulièrement une sonde oligonucléotidique selon l'invention. sont également objets de la présente invention. Finally, the kits or necessary for the detection and / or identification of bacteria belonging to the species Lactococcus lactis or to an associated microorganism, characterized in that it comprises the following elements: a) at least one primer according to invention; b) optionally, the reagents necessary to carry out a DNA amplification reaction; c) optionally, a component making it possible to verify the sequence of the amplified fragment, more particularly an oligonucleotide probe according to the invention. are also objects of the present invention.
De préférence, lesdites amorces et/ou sondes et/ou polypeptides et/ou Preferably, said primers and / or probes and / or polypeptides and / or
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anticorps selon la présente invention utilisés dans les procédés et/ou kits ou nécessaires selon la présente invention sont choisis parmi les amorces et/ou sondes et/ou polypeptides et/ou anticorps spécifiques de l'espèce Lactococcus lactis. De manière préférée, ces éléments sont choisis parmi les séquences nucléotidiques condant pour une protéine sécrétée, parmi les polypeptides sécrétés, ou parmi les anticorps dirigés contre des polypeptides sécrétés de Lactococcus lactis. antibodies according to the present invention used in the methods and / or kits or necessary according to the present invention are chosen from primers and / or probes and / or polypeptides and / or antibodies specific for the species Lactococcus lactis. Preferably, these elements are chosen from the nucleotide sequences leading to a secreted protein, from the secreted polypeptides, or from the antibodies directed against secreted polypeptides of Lactococcus lactis.
La présente invention a également pour objet les souches de Lactococcus lactis et/ou de microorganismes associés contenant une ou plusieurs mutation (s) une séquence nucléotidique selon l'invention, en particulier une séquence ORF, ou leurs éléments régulateurs (en particulier promoteurs). A subject of the present invention is also the strains of Lactococcus lactis and / or associated microorganisms containing one or more mutation (s), a nucleotide sequence according to the invention, in particular an ORF sequence, or their regulatory elements (in particular promoters).
On préfère, selon la présente invention, les souches de Lactococcus lactis présentant une ou plusieurs mutation (s) dansles séquences nucléotidiques codant pour des polypeptides impliqués dans la machine cellulaire, en particulier la sécrétion, le métabolisme intermédiaire central, en particulier la production de sucres, le métabolisme énergétique, les processus de synthèse des acides aminés, de transcription et de traduction, de synthèse des polypeptides, ou dans la résistance et/ou l'adaptation au stress ou les séquences nucléiques impliquées dans les fonctions relatives aux phages et prophages. Preference is given, according to the present invention, to strains of Lactococcus lactis exhibiting one or more mutation (s) in the nucleotide sequences encoding polypeptides involved in the cellular machine, in particular the secretion, the central intermediate metabolism, in particular the production of sugars. , energy metabolism, the processes of amino acid synthesis, transcription and translation, synthesis of polypeptides, or in resistance and / or adaptation to stress or nucleic acid sequences involved in functions relating to phages and prophages.
Lesdites mutations peuvent mener à une inactivation du gène, ou en particulier lorsqu'elles sont situées dans les éléments régulateurs dudit gène, à une surexpression de celui-ci. Said mutations can lead to inactivation of the gene, or in particular when they are located in the regulatory elements of said gene, to overexpression thereof.
Ainsi, on recherche en particulier des souches de Lactococcus lactis présentant une résistance accrue à l'infection et/ou la propagation des phages, sur-exprimant ou sous-exprimant (en particulier n'exprimant plus du tout) un polypeptide selon l'invention, impliquées dans les fonctions relatives aux phages et prophages. Une souche de Lactococcus lactis qui présente une résistance accrue à l'infection et/ou la propagation des phages, contenant un gène toxique sous le contrôle d'un agent régulateur de l'expression des gènes codant pour les Thus, we are looking in particular for strains of Lactococcus lactis exhibiting increased resistance to infection and / or propagation of phages, over-expressing or under-expressing (in particular no longer expressing at all) a polypeptide according to the invention. , involved in functions relating to phages and prophages. A strain of Lactococcus lactis which exhibits increased resistance to infection and / or spread of phages, containing a toxic gene under the control of an agent regulating the expression of genes encoding them.
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fonctions relatives aux phages et prophages, est également un objet de l'invention. functions relating to phages and prophages, is also an object of the invention.
De telles souches de Lactococcus lactis modifiées sont très utiles pour augmenter la biosynthèse ou la biodégradation de composés d'intérêt. En particulier, on recherche une amélioration de la biosynthèse du diacétyle, lorsque l'on désire fabriquer du beurre ou du fromage blanc. Il peut également être intéressant d'améliorer la biodégradation des sucres en particulier les lactoses, présents dans les compositions alimentaires dans lesquelles on rajoute les souches selon l'invention. Such modified strains of Lactococcus lactis are very useful in increasing the biosynthesis or biodegradation of compounds of interest. In particular, an improvement in the biosynthesis of diacetyl is sought when it is desired to manufacture butter or cottage cheese. It may also be of interest to improve the biodegradation of sugars, in particular lactoses, present in the food compositions to which the strains according to the invention are added.
On peut également utiliser un polypeptide selon l'invention, une cellule transformée selon l'invention, et/ou un animal selon l'invention dans un procédé de biosynthèse ou de biodégradation d'un composé d'intérêt, lui-même également objet de la présente invention. It is also possible to use a polypeptide according to the invention, a transformed cell according to the invention, and / or an animal according to the invention in a process for the biosynthesis or biodegradation of a compound of interest, itself also a subject of the present invention.
Enfin, une méthode de diagnostic de la présence de phages dans les levains lactiques et dans les produits laitiers, par l'étude de la présence de l'acide nucléique qui code pour un polypeptide impliqué dans les fonctions relatives aux phages et prophages, est également un objet de l'invention. Finally, a method of diagnosing the presence of phages in lactic starters and in dairy products, by studying the presence of the nucleic acid which codes for a polypeptide involved in functions relating to phages and prophages, is also an object of the invention.
MATERIELS ET METHODES
1. Le séquencage du génome L. lactis IL1403. MATERIALS AND METHODS
1. Sequencing of the L. lactis IL1403 genome.
La stratégie de séquençage du génome de L. lactis IL1403 comportait deux étapes principales. Premièrement, la séquence diagnostique a été établie, avec une redondance de séquençage de seulement 2. Deuxièmement, la qualité de la séquence a été améliorée par séquençage de matrices aléatoires jusqu'à obtenir une redondance de 6. Toute partie du génome qui n'a été séquence que sur un brin a été re-séquencé, en utilisant des matrices générées par PCR à longue distance (Long Range ou LR PCR), afin d'obtenir un taux d'erreur The L. lactis IL1403 genome sequencing strategy involved two main steps. First, the diagnostic sequence was established, with a sequencing redundancy of only 2. Second, the quality of the sequence was improved by sequencing random templates to achieve a redundancy of 6. Any part of the genome that did not been sequenced only on one strand was re-sequenced, using matrices generated by long-range PCR (Long Range or LR PCR), in order to obtain an error rate
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inférieur à 0,01% (moins d'une erreur pour 10. 000 bases). less than 0.01% (less than one error per 10,000 bases).
La stratégie de séquençage avec une faible redondance, du génome de L.lactis, est présentée dans le Tableau 2. Cette stratégie est un compromis entre une approche de séquençage direct et une approche de séquençage au hasard. L'objectif étant de réduire le temps et l'effort nécessaire pour obtenir l'organisation du génome et connaître les gènes qui le compose. Dans un premier temps, un nombre limité de clones choisis au hasard est séquence, ainsi le taux d'accumulation de nouvelles séquences reste approximativement constant. Cette condition s'arrête quand le génome a été couvert à peu près une fois. Dans un second temps, des clones choisis au hasard, et portant un grand insert, sont séquences par primer walking . On peut garder alors une redondance faible en choisissant les oligonucléotides correspondant aux extrémités des contigs prolongés, pour l'étape suivante de primer walking . The low redundancy sequencing strategy of the L. lactis genome is presented in Table 2. This strategy is a compromise between a direct sequencing approach and a random sequencing approach. The objective is to reduce the time and effort required to obtain the organization of the genome and to know the genes that compose it. First, a limited number of randomly selected clones are sequenced, so the rate of accumulation of new sequences remains approximately constant. This condition ends when the genome has been covered roughly once. In a second step, clones chosen at random, and carrying a large insert, are sequenced by primer walking. Low redundancy can then be kept by choosing the oligonucleotides corresponding to the ends of the extended contigs, for the next step of primer walking.
Cette étape est poursuivie jusqu'à ce que l'obtention d'une nouvelle séquence soit supérieure à l'obtention d'@ nouvelle base pour 3 bases séquencées. L'étape finale du séquençage s'achève par l'utilisation d'une autre méthode directe, qui est appelée multiplex long accurate PCR (MLA PCR) (Sorokin et al, 1996, A new approach using multiplex long accurate PCR and yeast artificial chromosomes for bacterial chromosome mapping and sequencing, Genome Res, 6 : 448-53). Celle-ci implique le mélange d'un grand nombre d'oligonucléotides correspondant aux extrémités des contigs. Un produit sera obtenu chaque fois que la distance entre 2 sites sur le génome, correspondant aux extrémités de deux contigs, est inférieure à la taille maximale pouvant être synthétisée par LR PCR. Pour la taille du génome de L. lactis, la probabilité d'obtenir ce type de produit est entre 0,5 et 1, si 20 oligonucléotides sont mélangés (au moins la moitié des réactions de PCR contenant 20 oligonucléotides choisis au hasard, donneront un produit d'amplification). Les données statistiques de l'application de cette stratégie pour le séquençage de L. lactis sont présentées dans le tableau 3. Une banque contenant 2854 clones avec des inserts d'une taille comprise This step is continued until obtaining a new sequence is greater than obtaining @ new base for 3 bases sequenced. The final step in sequencing ends with the use of another direct method, which is called multiplex long accurate PCR (MLA PCR) (Sorokin et al, 1996, A new approach using multiplex long accurate PCR and yeast artificial chromosomes for bacterial chromosome mapping and sequencing, Genome Res, 6: 448-53). This involves the mixing of a large number of oligonucleotides corresponding to the ends of the contigs. A product will be obtained each time the distance between 2 sites on the genome, corresponding to the ends of two contigs, is less than the maximum size that can be synthesized by LR PCR. For the size of the genome of L. lactis, the probability of obtaining this type of product is between 0.5 and 1, if 20 oligonucleotides are mixed (at least half of the PCR reactions containing 20 oligonucleotides chosen at random, will give a amplification product). The statistical data of the application of this strategy for the sequencing of L. lactis are presented in table 3. A library containing 2854 clones with inserts of a size included
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entre 1 et 2 Kb, a été construite en utilisant les vecteurs pBluescript II KS+ (Stratagène) ou pSGMU2 (Errington J, 1986, A general method for fusion of the Escherichia coli lacZ gene to chromosomal genes in Bacillus subtilis, J Gen Microbiol, 132 : 2953-66). 2625 clones ont été séquences avec l'oligonucléotide direct (M13-21) et 2168 avec l'oligonucléotide réverse (M13RP1), avec un taux de séquences réussies d'environ 90 %. Après l'obtention d'environ 2100 kb de séquences, 2357 oligonucléotides ont été synthétisés pour fermer les espaces entres les séquences directes et réverses. Un total d'environ 3,3 Mb de séquences a ainsi été obtenu. between 1 and 2 Kb, was constructed using the vectors pBluescript II KS + (Stratagene) or pSGMU2 (Errington J, 1986, A general method for fusion of the Escherichia coli lacZ gene to chromosomal genes in Bacillus subtilis, J Gen Microbiol, 132 : 2953-66). 2625 clones were sequenced with the direct oligonucleotide (M13-21) and 2168 with the reverse oligonucleotide (M13RP1), with a success rate of approximately 90%. After obtaining approximately 2100 kb of sequences, 2357 oligonucleotides were synthesized to close the spaces between the direct and reverse sequences. A total of about 3.3 Mb of sequences was thus obtained.
Le vecteur #-FIXII (Stratagène) a été utilisé pour construire une banque de grands inserts. Le chromosome de L. lactis a été partiellement digéré avec Sau3A, fractionné par centrifugation en gradient de sucrose, traité avec la Klenow polymérase en présence de dGTP et de dATP, et ligaturé avec le vecteur #-FIXII lui-même digéré par XhoI et traité avec la Klenow polymérase en présence de dCTP et de dTTP. 262 phages ont été choisis au hasard et les extrémités des inserts ont été séquencées avec l'oligonucléotide T7 (Stratagène). Parmis ces 262 phages séquences, 122 phages ayant permis d'obtenir une séquence unique avec l'oligonucléotide T7, ont alors été séquences avec l'oligonucléotide T3 (Stratagène). Environ 250 kb de séquences ont ainsi été obtenues de cette façon. The # -FIXII vector (Stratagene) was used to construct a library of large inserts. The L. lactis chromosome was partially digested with Sau3A, fractionated by sucrose gradient centrifugation, treated with Klenow polymerase in the presence of dGTP and dATP, and ligated with the vector # -FIXII itself digested with XhoI and treated. with Klenow polymerase in the presence of dCTP and dTTP. 262 phages were chosen at random and the ends of the inserts were sequenced with the oligonucleotide T7 (Stratagene). Among these 262 sequenced phages, 122 phages which made it possible to obtain a unique sequence with the T7 oligonucleotide, were then sequenced with the T3 oligonucleotide (Stratagene). About 250 kb of sequences were thus obtained in this way.
La MLA PCR a été utilisée pour obtenir des produits pour de nouvelles séquences. L'étape critique de la méthode a été de déterminer quels mélanges de 2 oligonucléotides donnaient un produit utilisable pour le séquençage. Le protocole développé précédemment et qui requérait deux étapes pour l'identification (Sorokin et al, 1996, A new approach using multiplex long accurate PCR and yeast artificial chromosomes for bacterial chromosome mapping and sequencing, Genome Res, 6: 448-53), a été modifié ici de façon à ce qu'une seule étape soit requise. Au total, 1641 réactions de séquençage sur des produits de tailles variant entre 1 et 20 kb ont été obtenues, et environ 0,77 Mb de séquences ont été lues. Cette étape a permis de MLA PCR was used to obtain products for new sequences. The critical step of the method was to determine which mixtures of 2 oligonucleotides gave a product which can be used for sequencing. The protocol developed previously and which required two steps for identification (Sorokin et al, 1996, A new approach using multiplex long accurate PCR and yeast artificial chromosomes for bacterial chromosome mapping and sequencing, Genome Res, 6: 448-53), a been modified here so that only one step is required. In total, 1641 sequencing reactions on products of sizes varying between 1 and 20 kb were obtained, and approximately 0.77 Mb of sequences were read. This step made it possible to
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finir l'assemblage complet du chromosome, donnant un contig de 2,34 Mb. La redondance totale est proche de 2. Pour vérifier que l'assemblage est correct, les Inventeurs ont effectué des amplifications de type LR PCR sur le génome entier, en utilisant 266 oligonucléotides, séparés par des distances prédites entre 10 et 20 kb. complete the complete assembly of the chromosome, resulting in a contig of 2.34 Mb. The total redundancy is close to 2. To verify that the assembly is correct, the inventors carried out amplifications of the LR PCR type on the entire genome, using 266 oligonucleotides, separated by predicted distances between 10 and 20 kb.
Les produits espérés ont été obtenus, indiquant que l'assemblage est correct. The expected products have been obtained, indicating that the assembly is correct.
Pour améliorer la qualité de la séquence finale, et ainsi faciliter l'étape suivante d'annotation, une autre banque de plasmides contenant des petits inserts (1-2 kb) du génome de L. lactis IL1403, a été construite et les inserts obtenus séquences avec les oligonucléotides directs (M13-21) et réverses (M13RP1). Au total 7665 plasmides ont été séquences avec succès, ce qui a permis d'obtenir 15310 gels lus, contenant 9671085 caractères. Ces séquences couvrent 93 % de la séquence contiguë obtenue lors de l'étape de séquençage basse-redondance, et sont distribuées dans 358 groupes le long de la séquence contiguë. 978 oligonucléotides ont alors été synthétisés pour séquencer les produits de LR PCR générés en utilisant la séquence connue d'IL1403. La base de données de la séquence finale contient 26036 gels lus, contenant 14842630 caractères. La taille moyenne des gels lus est donc de 570 bases. La longueur de la séquence génomique d'IL1403 est de 2365589 bases, la redondance de la séquence finale est 6,27. To improve the quality of the final sequence, and thus facilitate the following annotation step, another library of plasmids containing small inserts (1-2 kb) of the genome of L. lactis IL1403, was constructed and the inserts obtained. sequences with the direct (M13-21) and reverse (M13RP1) oligonucleotides. A total of 7665 plasmids were successfully sequenced, resulting in 15,310 read gels, containing 9,671,085 characters. These sequences cover 93% of the contiguous sequence obtained during the low-redundancy sequencing step, and are distributed in 358 groups along the contiguous sequence. 978 oligonucleotides were then synthesized to sequence the LR PCR products generated using the known sequence of IL1403. The final sequence database contains 26,036 read gels, containing 14,842,630 characters. The average size of the gels read is therefore 570 bases. The length of the IL1403 genomic sequence is 2,365,589 bases, the redundancy of the final sequence is 6.27.
2. L'annotation du génome d'IL1403
2. 1. Prédiction des gènes codant pour les protéines dans L. lactis
IL1403. 2. The annotation of the IL1403 genome
2. 1. Prediction of genes encoding proteins in L. lactis
IL1403.
Les fenêtres ouvertes de lecture prédites ont d'abord été identifiées en utilisant TGA, TAA et TAG comme codons stops et en utilisant le code génétique bactérien standard. La région codante pouvant coder pour une protéine a été considérée comme ayant une taille de plus de 60 acides aminés. The predicted open reading windows were first identified using TGA, TAA and TAG as stop codons and using the standard bacterial genetic code. The coding region capable of encoding a protein was considered to be greater than 60 amino acids in size.
Les séquences homologues à l'extrémité 3' de l'ARNr 16S de L.lactis (3' UCUUUCCUCCA...5') en amont des codons potentiels d'initation, qui sont The sequences homologous to the 3 'end of the 16S rRNA of L. lactis (3' UCUUUCCUCCA ... 5 ') upstream of the potential initiation codons, which are
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ATG, GTG, ou TTG, ont été systématiquement recherchées pour assurer la fonctionnalité du gène putatif trouvé. Plusieurs gènes dans L. lactis IL1403 ont ainsi été trouvés, ils ont été appelés ARNm leaderless et démarrent au codon ATG de l'extrémité 5'. Ceci est applicable en particulier aux gènes impliqués dans le processus de transformation génétique. Ceci peut expliquer que L. lactis est protégé de cette façon de l'expression de gènes occasionnels due à une mutation ou à une insertion d'une séquence ayant une activité promotrice. ATG, GTG, or TTG, have been systematically researched to ensure the functionality of the putative gene found. Several genes in L. lactis IL1403 have thus been found, they have been called leaderless mRNA and start at the ATG codon of the 5 'end. This is particularly applicable to genes involved in the process of genetic transformation. This may explain that L. lactis is protected in this way from occasional gene expression due to mutation or insertion of a sequence having promoter activity.
Les protéines prédites sont ensuite systématiquement testées au niveau de leur homologie avec les protéines connues contenues dans les bases de données. Finalement, ceci a révélé 2323 gènes avec ou sans fonctions assignées, présentés dans le tableau 1. Les gènes sont classés selon un schéma de classification proposé par M. Riley (Riley M, 1993, Functions of the gene products of Escherichia coli, Microbiol Rev, 57 : Plusieurs catégories de gènes de L. lactis IL1403 sont décrits ci-dessous. The predicted proteins are then systematically tested for their homology with the known proteins contained in the databases. Finally, this revealed 2323 genes with or without assigned functions, presented in Table 1. The genes are classified according to a classification scheme proposed by M. Riley (Riley M, 1993, Functions of the gene products of Escherichia coli, Microbiol Rev , 57: Several categories of genes of L. lactis IL1403 are described below.
2. 2 Les éléments IS et les prophages chez L. lactis IL1403. 2. 2 IS elements and prophages in L. lactis IL1403.
Trois éléments IS étaient déjà connus dans le génome de L. lactis IL1403, désignés IS981, IS982 et IS1076. Leur nombre de copies (respectivement dix, une et sept) et leur localisation approximative sont rapportés. Les données de séquençage des Inventeurs révèlent que dans toutes les localisations chromosomiques où IS1076 a été cartographié, la séquence nucléotidique identique à IS904 est présente. Le dernier nom est gardé sur la carte. Un autre élément, appelé IS1077, était présent dans chacun de ces sept sites. Quinze copies d'un élément, qui n'avait pas été décrit précédemment pour l'espèce Lactococcus et appelé IS983, ont été détectées dans le génome de IL1403. L'élément le plus proche relativement d'une autre bactérie lactique, qui est IS1070, a été découvert dans le plasmide pNZ63 de Leuconostoc lactis NZ6009. Three IS elements were already known in the genome of L. lactis IL1403, designated IS981, IS982 and IS1076. Their number of copies (respectively ten, one and seven) and their approximate location are reported. The inventors' sequencing data reveal that in all the chromosomal locations where IS1076 has been mapped, the nucleotide sequence identical to IS904 is present. The last name is kept on the card. Another element, called IS1077, was present in each of these seven sites. Fifteen copies of an element, which had not previously been described for the Lactococcus species and called IS983, were detected in the genome of IL1403. The relatively closest member to another lactic acid bacterium, which is IS1070, was found in the plasmid pNZ63 from Leuconostoc lactis NZ6009.
Pour identifier les prophages potentiels présents dans le chromosome, les Inventeurs ont utilisé la recherche d'homologies dans les bases de données To identify the potential prophages present in the chromosome, the inventors used the search for homologies in the databases.
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contenant des séquences protéiques de phages connus. La base de données est composée de 1219 séquences protéiques, comprenant l'ensemble complet des 50 protéines putatives dérivées de la séquence du phage tempéré rit de L. lactis (Van Sinderen, D., Karsens, H., Kok, J., Terpstra, P., Ruiters, M. H., Venema, G., & Nauta, A., 1996, Sequence analysis and molecular characterization of the temperate lactococcal bacteriophage rit, Mol Microbiol 19: 1343-1355). Une distribution des homologies non redondantes lancées sur le génome de L. lactis a été générée. Cette distribution indique la présence de trois régions, autour de 470,1060 et 1430 Kb, qui contiennent les prophages identifiés précédemment par des tests biologiques. Deux sites, autour de 45 et 2020 Kb, indiquent un quatrième et un cinquième prophages. containing protein sequences of known phages. The database consists of 1219 protein sequences, comprising the complete set of 50 putative proteins derived from the sequence of the temperate phage rit of L. lactis (Van Sinderen, D., Karsens, H., Kok, J., Terpstra , P., Ruiters, MH, Venema, G., & Nauta, A., 1996, Sequence analysis and molecular characterization of the temperate lactococcal bacteriophage rit, Mol Microbiol 19: 1343-1355). A distribution of non-redundant homologies launched on the genome of L. lactis was generated. This distribution indicates the presence of three regions, around 470.1060 and 1430 Kb, which contain the prophages previously identified by biological tests. Two sites, around 45 and 2020 Kb, indicate a fourth and a fifth prophages.
2. 3. Le biais GC, l'origine de réplication et le terminus. 2. 3. GC bias, origin of replication and terminus.
Pour prédire les sites de l'origine de la réplication et le terminus, les Inventeurs ont utilisé les biais GC et AT dans des schémas similaires (Lobry, J. R., 1996, Asymmetric substitution patterns in the two DNA strands of bacteria, Mol Biol Evol, 13 : 660-665). Les distributions des valeurs (CG)/ (C+G) et (A-T)/(A+T) le long de la région chromosomique montre une transition bien franche entre les valeurs positives et négatives, et indique la présence de l'origine de réplication dans le voisinage de gène dnaA. Cette région contient quatre boites DnaA, qui indiquent aussi la présence de l'origine de réplication. Les Inventeurs ont choisi le point de départ de la présentation circulaire du génome de L. lactis au milieu du site HindIII près de l'origine de réplication et la carte est orientée de façon avec la direction de transcription des gènes dnaA et dnaN. To predict the sites of the origin of replication and the terminus, the Inventors used the GC and AT biases in similar schemes (Lobry, JR, 1996, Asymmetric substitution patterns in the two DNA strands of bacteria, Mol Biol Evol, 13: 660-665). The distributions of (CG) / (C + G) and (A-T) / (A + T) values along the chromosomal region show a very sharp transition between positive and negative values, and indicate the presence of the origin of replication in the vicinity of dnaA gene. This region contains four DnaA boxes, which also indicate the presence of the origin of replication. The inventors have chosen the starting point for the circular presentation of the L. lactis genome in the middle of the HindIII site near the origin of replication and the map is oriented so with the direction of transcription of the dnaA and dnaN genes.
Les biais GC et AT indiquent aussi la localisation du terminus de réplication. La transition entre les valeurs positives et négatives se produit près de la position 1260 K. Ceci est en corrélation avec la localisation du terminus de réplication basée sur l'orientation des gènes potentiels de transcription et la distribution des sites chi le long du génome. The GC and AT biases also indicate the location of the replication terminus. The transition between positive and negative values occurs near the 1260 K position. This correlates with the location of the replication terminus based on the orientation of potential transcription genes and the distribution of chi sites along the genome.
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3 Description des catégories de gènes
3. 1. Biosynthèses d'acides aminés de vitamines et de nucléotides. 3 Description of gene categories
3. 1. Biosynthesis of amino acids, vitamins and nucleotides.
Les analyses des Inventeurs ont montré que L. lactis a un potentiel génétique pour synthétiser les 20 acides aminés standards et au moins 4 co-facteurs (l'acide folique, la ménaquinone, la riboflavine et la thiorédoxine). Cependant, cette bactérie est délicate d'un point de vue nutritionnel et nécessite de nombreux métabolites qu'il faut ajouter au milieu synthétique (Jensen & Hammer, 1993, Minimal requirements for exponential growth of lactococcus lactis, Appl Env Microbiol, 59 :4363-4366). Le problème des exigences nutritionnelles délicates des souches L. lactis a récemment été abordé par l'application de la techique de simple omission (Cocaign-Bousquet, M., Garrigues, C., Novak, L., Lindley, N. D., & Loubiere, P., 1995, Rational development of a simple synthetic medium for the sustained growth of Lactococcus lactis, J Appl Bacteriol, 79- 108-116) et des approches génétiques. Il a également été montré que l'auxotrophie de IL1403, utilisée comme une souche laitière, pour l'histidine et les acides aminés à chaine ramifiée est dûe à des mutations récemment acquises. La mise à disposition du complément complet des gènes biosynthétiques présents dans L. lactis fournira de nombreux éléments pour la compréhension et l'utilisation efficace du métabolisme biosynthétique dans ces bactéries. The inventors' analyzes have shown that L. lactis has a genetic potential for synthesizing the 20 standard amino acids and at least 4 co-factors (folic acid, menaquinone, riboflavin and thioredoxin). However, this bacterium is delicate from a nutritional point of view and requires many metabolites which must be added to the synthetic medium (Jensen & Hammer, 1993, Minimal requirements for exponential growth of lactococcus lactis, Appl Env Microbiol, 59: 4363- 4366). The problem of the delicate nutritional requirements of L. lactis strains has recently been addressed through the application of the simple omission technique (Cocaign-Bousquet, M., Garrigues, C., Novak, L., Lindley, ND, & Loubiere, P., 1995, Rational development of a simple synthetic medium for the sustained growth of Lactococcus lactis, J Appl Bacteriol, 79-108-116) and genetic approaches. The auxotrophy of IL1403, used as a dairy strain, for histidine and branched chain amino acids has also been shown to be due to recently acquired mutations. Providing the full complement of the biosynthetic genes present in L. lactis will provide many elements for the understanding and efficient use of biosynthetic metabolism in these bacteria.
Les Inventeurs ont détecté 60 gènes impliqués dans la biosynthèse et la préservation des nucléotides et nucléosides. La plupart des gènes pour la biosynthèse des purines sont regroupés près de l'opéron purDEK, qui a été récemment caractérisé. Une copie de IS983 a été détectée entre l'opéron purDEK et d'autres gènes de la biosynthèse des purines. The inventors have detected 60 genes involved in the biosynthesis and preservation of nucleotides and nucleosides. Most of the genes for purine biosynthesis are clustered near the purDEK operon, which has been recently characterized. A copy of IS983 has been detected between the purDEK operon and other genes involved in purine biosynthesis.
3. 2. Métabolisme énergétique et transporteurs. 3. 2. Energy metabolism and transporters.
Le potentiel génétique de L. lactis à croître sur différentes sources carbonées peut être estimé à partir de la présence des gènes de biodégradation et des transporteurs adéquats. IL1403 a des gènes qui peuvent être utilisés pour la The genetic potential of L. lactis to grow on different carbon sources can be estimated from the presence of biodegradation genes and suitable transporters. IL1403 has genes that can be used to
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croissance sur différentes sources de carbone : le glucose (les gènes de glycolyse), le fructose (positions 1519 et 2230 kb, fructokinase and glucoso-6P-isomérase, scrK et pgiA), la N-acétyl glucosamine (1032 kb, gène codant pour la glucosaminefructoso-6P aminotransférase, glmS), le xylose (1550 kb, opéron xyl), le ribose (1685 kb, opéron rbs), le mannose (779 kb, mannose-6P isomérase, pmi), le gluconate (608,2254 et 2254 kb, 6P gluconate déshydrogénases et gluconate kinase, gnd, gntZ and gntK), maltose (692,700 et 1526 kb, maltodextrine glucosidases and 4-[alpha]-glucanotransférase, malQ), le lactose (2041 kb, p- galactosidase, lacZ), le galactose (2045 kb, opéron gal), le mannitol (33 kb, mannitol-lP 5-déshydrogénase, mtlD), les différents p-glucosides (186,419, 830, 1490 et 1520 kb, glucosidases, 6P p-glucosidases, bglS, bglA, yidC, bglH, dexB). growth on different carbon sources: glucose (the glycolysis genes), fructose (positions 1519 and 2230 kb, fructokinase and glucoso-6P-isomerase, scrK and pgiA), N-acetyl glucosamine (1032 kb, gene coding for glucosaminefructoso-6P aminotransferase, glmS), xylose (1550 kb, xyl operon), ribose (1685 kb, rbs operon), mannose (779 kb, mannose-6P isomerase, pmi), gluconate (608.2254 and 2254 kb, 6P gluconate dehydrogenases and gluconate kinase, gnd, gntZ and gntK), maltose (692,700 and 1526 kb, maltodextrin glucosidases and 4- [alpha] -glucanotransferase, malQ), lactose (2041 kb, p-galactosidase, lacZ) , galactose (2045 kb, operon gal), mannitol (33 kb, mannitol-lP 5-dehydrogenase, mtlD), the various p-glucosides (186,419, 830, 1490 and 1520 kb, glucosidases, 6P p-glucosidases, bglS , bglA, yidC, bglH, dexB).
L'opéron catabolique du glucuronate ou du galacturonate (1670 kb, opéron uxu- kdg) peut être utilisé pour l'utilisation des produits de dégradation de la pectine comme une source supplémentaire d'énergie et de carbone. Les composants des systèmes de transports dépendant de l'enzyme II sucre-spécifique du phosphoénolpyruvate ont été trouvés pour le mannitol (30 kb, mtlAF), le sucrose ou le tréhalose (435 kb, yedF), le fructose (984, fruA), le mannose (1748 kb, opéron ptn) et des p- glucosides (175,416, 830,1144 et 1489 kb, celB, opéron ptc, yidB, yleDE, ptbA). The glucuronate or galacturonate catabolic operon (1670 kb, uxu- kdg operon) can be used for utilizing the degradation products of pectin as an additional source of energy and carbon. The components of the sugar-specific enzyme II-dependent transport systems of phosphoenolpyruvate have been found for mannitol (30 kb, mtlAF), sucrose or trehalose (435 kb, yedF), fructose (984, fruA), mannose (1748 kb, operon ptn) and p-glucosides (175,416, 830,1144 and 1489 kb, celB, operon ptc, yidB, yleDE, ptbA).
L'analyse de la séquence du chromosome de IL 1403 a révélé que les gènes codant pour la voie PTS-dépendante de l'utilisation du lactose étaient absents dans cette souche. Le chromosome contient cependant un autre système pour l'utilisation du lactose dépendant du transport par le produit du gène lacS, codant pour un symporteur H+ ou un anti-porteur galactose-lactose. L'analyse des Inventeurs a détecté 19 gènes impliqués dans la glycolyse, complétant la description de ce système et a révélé un second gène de déshydrogénase glyceraldéhyde-phosphate. Analysis of the chromosome sequence of IL 1403 revealed that genes encoding the PTS-dependent pathway of lactose utilization were absent in this strain. The chromosome, however, contains another system for the utilization of lactose dependent on transport by the product of the lacS gene, encoding an H + symporter or an anti-galactose-lactose carrier. The inventors' analysis detected 19 genes involved in glycolysis, completing the description of this system and revealed a second glyceraldhyde-phosphate dehydrogenase gene.
Ceci a également confirmé l'absence d'un cycle complet de l'acide citrique. Un gène impliqué dans la gluconéogenèse a été identifié ; il s'agit du gène codant pour la fructose 1,6 bisphosphatase. Aucun gène codant pour la phosphoénolpyruvate carboxykinase ou la phosphoénolpyruvate synthétase n'a été trouvé. This also confirmed the absence of a full cycle of citric acid. A gene involved in gluconeogenesis has been identified; this is the gene encoding fructose 1,6 bisphosphatase. No gene encoding phosphoenolpyruvate carboxykinase or phosphoenolpyruvate synthetase was found.
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Les importeurs et exporteurs de différents métabolites sont largement représentés dans les bactéries par les transporteurs ABC. Les importeurs sont impliqués dans le transport vers l'intérieur de la cellule de différents sucres ainsi que d'oligosacharides, oligopeptides et acides aminés, anions et cations. Les exporteurs sont impliqués dans l'excrétion des métabolites dangereux pour la cellule et sont donc souvent impliqués dans la résistance de la cellule à différents antibiotiques ou autres drogues. L'inventaire complet de tels transporteurs a été réalisé à partir du séquençage complet de plusieurs microorganismes, y compris de levures telles que Sacharomyces cerevisiae, Escherichia coli et Bacillus subtilis. Importers and exporters of different metabolites are widely represented in bacteria by ABC transporters. Importers are involved in the transport into the cell of various sugars as well as oligosacharides, oligopeptides and amino acids, anions and cations. Exporters are involved in the excretion of metabolites that are dangerous for the cell and are therefore often involved in the cell's resistance to different antibiotics or other drugs. The complete inventory of such transporters was made from the complete sequencing of several microorganisms, including yeasts such as Sacharomyces cerevisiae, Escherichia coli and Bacillus subtilis.
Dans L. lactis plusieurs systèmes codant pour les transporteurs ABC ont été caractérisés. L'un d'entre eux, oppDFBCA, code pour un transporteur d'oligopeptides et semble être important pour la croissance dans un milieu contenant des oligopeptides. Le système codé par l'opéron lcnCD est impliqué dans la sécrétion et la maturation de lactococcine A et est important dans le développement de la résistance à cet antibiotique. II a été montré que le gène lmrA, impliqué dans la résistance multi-drogues, est capable de complémenter le gène humain MDR1, responsable de la résistance à la chimiothérapie dans plusieurs formes de cancers. Il a été montré que les gènes busAA et busAB responsables du transport de la bétaïne sont importants pour la résistance aux chocs osmotiques. L'inventaire complet des transporteur ABC dans le chromosome de L. lactis IL1403 est présenté dans le Tableau ABC. La présente invention fournit les moyens pour détecter les gènes correspondants dans différentes souches de L. lactis et apparentés de façon étroite aux Streptocoques. Dans ces derniers, les transporteurs correspondants peuvent être impliqués dans le développement de la pathogénicité. In L. lactis several systems encoding ABC transporters have been characterized. One of these, oppDFBCA, encodes an oligopeptide transporter and appears to be important for growth in medium containing oligopeptides. The system encoded by the lcnCD operon is involved in the secretion and maturation of lactococcin A and is important in the development of resistance to this antibiotic. It has been shown that the lmrA gene, involved in multidrug resistance, is capable of complementing the human MDR1 gene, responsible for resistance to chemotherapy in several forms of cancer. The busAA and busAB genes responsible for betaine transport have been shown to be important for resistance to osmotic shock. The complete inventory of ABC transporter in the L. lactis IL1403 chromosome is presented in Table ABC. The present invention provides the means for detecting the corresponding genes in different strains of L. lactis and closely related to Streptococci. In the latter, the corresponding transporters may be involved in the development of pathogenicity.
3. 4. Enveloppe cellulaire. 3. 4. Cellular envelope.
L'analyse des Inventeurs a révélé 81 gènes impliqués dans les fonctions de l'enveloppe cellulaire, y compris 10 protéines de membrane, 28 gènes de la biosynthèse des peptidoglycanes et muréine succulus et 43 gènes de la biosynthèse des polysaccharides de surface. The inventors' analysis revealed 81 genes involved in the functions of the cell envelope, including 10 membrane proteins, 28 genes for the biosynthesis of peptidoglycans and murein succulus and 43 genes for the biosynthesis of surface polysaccharides.
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3. 5. Machinerie cellulaire. 3. 5. Cellular machinery.
Parmi les gènes impliqués dans le fonctionnement de la machinerie cellulaire, listés dans le Tableau 1, les plus importants pour les applications portentielles sont ceux impliqués dans la sécrétion protéique et le développement de la compétence génétique. La liste complète des gènes détectés pertinents est présentée dans le Tableau 1. Leur présentation est détaillée en partie ci-dessus. Among the genes involved in the functioning of the cellular machinery, listed in Table 1, the most important for portal applications are those involved in protein secretion and the development of genetic competence. The complete list of relevant detected genes is presented in Table 1. Their presentation is detailed in part above.
L'exemple correspondant d'isolement de tels gènes par la mise en #uvre de la présente invention est fourni ci-après. The corresponding example of isolation of such genes by practicing the present invention is provided below.
3. 6. Fonctions de régulation. 3. 6. Regulatory functions.
L'analyse a révélé 126 gènes potentiellement impliqués dans la régulation, qui représentent à peu près 5,6 % du nombre total des ORFs identifiés. The analysis revealed 126 genes potentially involved in regulation, which represent approximately 5.6% of the total number of ORFs identified.
3.7. Réplication, transcription et traduction. 3.7. Replication, transcription and translation.
65,27 et 128 gènes ont été attribués aux catégories fonctionnelles de réplication, transcription et traduction respectivement. Il apparaît que le système de réplication de L. lactis est très similaire à celui de B. subtilis. La contrepartie des gènes de dnaB et dnaD, essentiels pour la réplication de l'ADN chez B. subtilis et non présents dans les bactéries gram négatives, ont été détectés. Deux gènes d'ADN-polymérase III de chaîne a, l'un correspondant à polC et un autre à dnaE de B. subtilis, ont également été détectés chez L. lactis. E. coli possède seulement ce dernier gène. La machinerie transcriptionnelle et traductionnelle ne semble pas présenter de différence remarquable avec celle de B. subtilis. Il semble que B. subtilis, avec ses outils génétiques bien développés, puisse être un organisme hôte convenable pour étudier la régulation des gènes dans les systèmes de L. lactis. 65,27 and 128 genes have been assigned to the functional categories of replication, transcription and translation respectively. It appears that the L. lactis replication system is very similar to that of B. subtilis. The counterpart of the dnaB and dnaD genes, essential for DNA replication in B. subtilis and not present in gram-negative bacteria, were detected. Two α-chain DNA polymerase III genes, one corresponding to polC and another to dnaE from B. subtilis, were also detected in L. lactis. E. coli has only the latter gene. The transcriptional and translational machinery does not seem to present any remarkable difference from that of B. subtilis. It appears that B. subtilis, with its well-developed genetic tools, may be a suitable host organism to study gene regulation in L. lactis systems.
EXEMPLES
1. Détection des régions de longue colinéarité et établissement de l'organisation correspondante des gènes dans la souche L. lactis EXAMPLES
1. Detection of regions of long collinearity and establishment of the corresponding organization of genes in the strain L. lactis
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MG1363 étroitement apparentée à L lactis IL1403. MG1363 closely related to L lactis IL1403.
Comme base pour la détection de gènes chez une bactérie qui est proche de L. lactis IL1403, la présente invention propose le séquençage d'un nombre limité de fragments d'ADN pris au hasard. Leur nombre doit être défini de façon à permettre une densité suffisamment élevée de distribution de leur site d'homologie par rapport au génome de L. lactis IL1403. Dans cet exemple, pour la souche L. lactis MG1363, il y a 513 séquences qui ont en moyenne un site sur chaque 5 kb. As a basis for the detection of genes in a bacterium which is close to L. lactis IL1403, the present invention provides for the sequencing of a limited number of DNA fragments taken at random. Their number must be defined so as to allow a sufficiently high density of distribution of their site of homology with respect to the genome of L. lactis IL1403. In this example, for the L. lactis MG1363 strain, there are 513 sequences which have an average of one site on every 5 kb.
Les séquences des fragments d'ADN correspondant à 2 sites les plus proches du gène d'intérêt sur le génome de IL1403 sont utilisées pour choisir les oligonucléotides pour l'amplification par PCR de la zone correspondante à partir du génome de MG1363 Dans les régions des génomes considérées comme colinéaires, le fragment amplifié devra contenir le gène d'intérêt de MG1363, du fait de la colinéarité des génomes. The sequences of the DNA fragments corresponding to 2 sites closest to the gene of interest on the genome of IL1403 are used to choose the oligonucleotides for the amplification by PCR of the corresponding zone from the genome of MG1363 In the regions of genomes considered to be collinear, the amplified fragment must contain the MG1363 gene of interest, due to the collinearity of the genomes.
L'ADN chromosomique de la souche MG1363 est digéré par l'enzyme de restriction AluI ou par sonication randomisée. Après séparation dans un gel d'agarose à 0,8 %, une fraction contenant des fragments ayant une taille de 500 bp à 1 kb est isolée. Cet ADN est ligaturé au plasmide pSGMU2, digéré par SmaI et déphosphorylé par la phosphatase alkaline de E. coli. La déphosphorylation du vecteur d'ADN était nécessaire pour empêcher une auto-ligature et ainsi augmenter le nombre de colonies qui portent l'ADN chromosomique de MG1363 inséré dans le vecteur. L'ADN ligaturé a été transformé dans des cellules TG1 de E. coli, qui ont été rendues compétentes par un traitement avec une solution de CaCl2 à 50 mM Les cellules ont été étalées sur un milieu d'agar, qui contenait 50 g/ml d'ampicilline, 20 g/ml de X-gal et 20 g/ml d'IPTG. Les colonies blanches ont été prises pour le séquençage des inserts par des amorces sens (M13-21) et reverses (M13RP1). 665 plasmides au total ont été séquences et ils ont donnés 882 gels lus contenant 258919 caractères. Ces séquences ont été réparties dans 539 groupes de liaison, chacun correspondant à une unique séquence de l'ADN génomique de MG1363 avec une taille moyenne de 348 bp et une longueur totale de 185292 bp. The chromosomal DNA of strain MG1363 is digested with the restriction enzyme AluI or by randomized sonication. After separation in a 0.8% agarose gel, a fraction containing fragments having a size of 500 bp to 1 kb is isolated. This DNA is ligated to the plasmid pSGMU2, digested with SmaI and dephosphorylated with alkaline phosphatase from E. coli. Dephosphorylation of the DNA vector was necessary to prevent self-ligation and thereby increase the number of colonies which carry the MG1363 chromosomal DNA inserted into the vector. The ligated DNA was transformed into E. coli TG1 cells, which were made competent by treatment with 50 mM CaCl2 solution The cells were plated on agar medium, which contained 50 g / ml of ampicillin, 20 g / ml of X-gal and 20 g / ml of IPTG. The white colonies were taken for the sequencing of the inserts by forward (M13-21) and reverse (M13RP1) primers. A total of 665 plasmids were sequenced and yielded 882 read gels containing 258,919 characters. These sequences were distributed into 539 linker groups, each corresponding to a unique sequence of the genomic DNA of MG1363 with an average size of 348 bp and a total length of 185292 bp.
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L'analyse de l'homologie avec le génome de L. lactis IL1403 a été réalisée en utilisant les algorithmes de FASTA et de BLASTx. Les résultats de cette analyse ont été utilisés pour détecter les zones de forte homologie entre les deux génomes et pour détecter les régions de colinéarité potentielle dans les organisations de génome. Homology analysis with the L. lactis IL1403 genome was performed using the FASTA and BLASTx algorithms. The results of this analysis were used to detect areas of strong homology between the two genomes and to detect regions of potential collinearity in genome organizations.
L'estimation d'un niveau d'homologie statistiquement significatifa été donnée par le calcul de la distribution des contigs (tags ou étiquettes) séquences avec un pourcentage donné d'homologie par rapport au génome de la souche IL1403. Le niveau d'homologie entre les différentes parties des génomes de MG1363 et IL1403 qui peuvent être considérées comme des contreparties est compris entre 65 et 100 %, avec un nombre maximum de régions homologues proche de 85 %. The estimate of a statistically significant level of homology was given by calculating the distribution of contigs (tags or labels) sequenced with a given percentage of homology with respect to the genome of strain IL1403. The level of homology between the different parts of the genomes of MG1363 and IL1403 which can be considered as counterparts is between 65 and 100%, with a maximum number of homologous regions close to 85%.
240 oligonucléotides (SEQ ID N 2324 à 2563) ont été synthétisés et utilisés dans des réactions de Long Range PCR, dans le but de confirmer la colinéarité des régions détectées. Les zones correspondant aux zones de colinéarité peuvent être facilement amplifiées par LR PCR en utilisant les oligonucléotides correspondants comme amorces. L'organisation des gènes dans ces zones de colinéarité est conservée dans ces deux souches. Ce fait peut donc être utilisé pour amplifier les gènes désirés à partir d'autres souches de Lactocoques et les utiliser pour des manipulations génétiques. Certains systèmes génétiques particuliers, amplifiés à partir de la souche MG1363 par utilisation de l'information génomique pour IL1403 et l'approche décrite dans cet exemple, sont décrits dans les exemples 2 et 3. 240 oligonucleotides (SEQ ID N 2324 to 2563) were synthesized and used in Long Range PCR reactions, with the aim of confirming the collinearity of the regions detected. The areas corresponding to the areas of collinearity can be easily amplified by LR PCR using the corresponding oligonucleotides as primers. The organization of genes in these areas of collinearity is conserved in these two strains. This fact can therefore be used to amplify desired genes from other strains of Lactococci and use them for genetic engineering. Certain particular genetic systems, amplified from strain MG1363 by use of the genomic information for IL1403 and the approach described in this example, are described in Examples 2 and 3.
La présente invention fournit donc les séquences pour le génome de L. lactis MG1363, qui permet la détection d'un gène quelconque existant dans les deux souches : IL1403 et MG1363. Puisque l'homologie et la colinéarité des deux génomes sont estimées à 65 %, il y a 65 % de tous les gènes listés dans les Tableaux 1 et II, représentant une annotation fonctionnelle du génome de IL1403. The present invention therefore provides the sequences for the genome of L. lactis MG1363, which allows the detection of any gene existing in the two strains: IL1403 and MG1363. Since the homology and collinearity of the two genomes are estimated at 65%, there are 65% of all genes listed in Tables 1 and II, representing a functional annotation of the IL1403 genome.
L'invention concerne une méthode pour l'estimation de la colinéarité entre l'organisation chromosomique de deux génomes. Les parties de deux génomes sont colinéaires si les régions homologues sont situées à égale distance dans les deux The invention relates to a method for estimating the collinearity between the chromosomal organization of two genomes. The parts of two genomes are collinear if the homologous regions are located equidistant in both
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génomes. Ceci signifie en premier lieu que dans les régions colinéaires pour deux génomes donnés, l'organisation des gènes est conservée. Ceci signifie en second lieu que les oligonucléotides homologues des régions colinéaires devraient donner, par amplification PCR, des fragments de taille similaire pour les deux génomes. Ainsi, pour les régions colinéaires, la similarité de l'amplification PCR devrait indiquer la similarité de l'organisation des gènes. Dans les parties des génomes considérées comme colinéaires, estimées par amplification PCR, les fragments amplifiés devraient contenir des gènes similaires pour les deux génomes, du fait de la colinéarité des génomes. genomes. This means in the first place that in the collinear regions for two given genomes, the organization of the genes is conserved. This means secondly that the homologous oligonucleotides of the collinear regions should give, by PCR amplification, fragments of similar size for the two genomes. Thus, for collinear regions, the similarity of the PCR amplification should indicate the similarity of the organization of the genes. In the parts of the genomes considered to be collinear, estimated by PCR amplification, the amplified fragments should contain similar genes for the two genomes, due to the collinearity of the genomes.
La présente invention fournit donc les moyens de déterminer les séquences du génome de L. lactis MG1363 et permet la détection d'un gène quelconque qui existe dans les deux souches : IL1403 et MG1363. L'homologie des deux génomes est estimée à 85 %. Les Inventeurs ont estimé que les régions de non-colinéarité, qui sont une partie du génome et dont la densité de distribution de tags séquences inférieure à celle attendue à partir d'une distribution randomisée, est d'environ 800 kb. Ces régions ne peuvent pas être amplifiées par PCR utilisant la méthode basée sur l'estimation de la colinéarité entre les deux génomes, fournis par la présente invention. D'autres régions peuvent être amplifiées en utilisant cette méthode. Ainsi, en utilisant cette méthode, 65 % de tous les gènes L. lactis peuvent être détectés dans une autre souche de L. lactis que IL1403. Ceci signifie également que la préparation de tous les fragments représentatifs à partir de l'ADN de la souche IL,1403, ou à partir d'une quelconque autre souche d'intérêt, en utilisant les méthodes décrites ci-dessus, donnera au minimum 65 % de tous les gènes d'une quelconque souche de L. lactis. Cet ensemble représentatif de fragments peut être utilisé pour détecter des différences entre les génomes entiers de souches de L. lactis ou pour étudier l'expression de gènes par hybridation à de l'ARN extrait. Cette détection de 65 % des gènes ou de leur expression dans L. lactis est également basée sur la séquence génomique de IL 1403 présentée à la Figure 1, sur l'annotation fonctionnelle de ce génome fournie au Tableau 1 et sur la méthode de la détection The present invention therefore provides the means of determining the sequences of the genome of L. lactis MG1363 and allows the detection of any gene which exists in the two strains: IL1403 and MG1363. The homology of the two genomes is estimated at 85%. The inventors have estimated that the non-collinearity regions, which are part of the genome and whose sequence tag distribution density is lower than that expected from a randomized distribution, is approximately 800 kb. These regions cannot be amplified by PCR using the method based on the estimation of the collinearity between the two genomes, provided by the present invention. Other regions can be amplified using this method. Thus, using this method, 65% of all L. lactis genes can be detected in another strain of L. lactis than IL1403. This also means that the preparation of all representative fragments from the DNA of strain IL, 1403, or from any other strain of interest, using the methods described above, will give a minimum of 65 % of all genes from any strain of L. lactis. This representative set of fragments can be used to detect differences between the entire genomes of strains of L. lactis or to study gene expression by hybridization to extracted RNA. This detection of 65% of the genes or their expression in L. lactis is also based on the genomic sequence of IL 1403 presented in Figure 1, on the functional annotation of this genome provided in Table 1 and on the method of detection.
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de gènes selon la présente invention. of genes according to the present invention.
2. Détection des gènes impliqués dans la biosynthèse de l'arginine dans la souche L lactis MG1363. 2. Detection of the genes involved in the biosynthesis of arginine in the L lactis MG1363 strain.
Un opéron codant pour cinq gènes nécessaires à la biosynthèse de l'arginine a été détecté aux environs de 805 kb du génome de L. lactis IL1403. Bien que le séquençage généré à partir de l'ADN génomique de L. lactis MG1363 n'a pas révélé un tag séquence homologue à un quelconque gène de la biosynthèse de l'arginine, on peut s'attendre à ce que de tels gènes soient localisés dans le génome de MG1363 dans la région à partir de 800 à 850 kb, qui est colinéaire entre les deux souches. Les Inventeurs ont choisi deux tags séquences, les plus proches de la zone, qui doivent contenir des gènes de la biosynthèse de l'arginine dans le génome de MG1363. Il s'agit de contigs séquences qui ont révélé une homologie avec les gènes yhjD et yibC. En synthétisant les homologues oligonucléotides des séquences à partir de ces deux contigs, ma86 (SEQ ID N 2564) et ma87 (SEQ ID N 2565), et en réalisant une amplification par LR PCR sur l'ADN chromosomique de MG1363, un produit d'amplification d'une taille de 19 kb, ou proche de cela, contenant des gènes de la biosynthèse de l'arginine était attendu. L'amplification a donné lieu à un fragment de la taille de 19 kb. Le séquençage des extrémités de ce fragment a montré que le fragment correspondait effectivement à la zone attendue et que les gènes de la biosynthèse de l'arginine étaient contenus dans cette zone du génome de MG1363. Cette méthode peut être appliquée à d'autres souches de L. lactis pour détecter les gènes de l'arginine dans la plupart des environnements génétiques recherchés. Les gènes argG et argH, codant pour la synthase arginosuccinate et la lyase respectivement, peuvent également être détectés de la même façon. Ils ont été détectés dans le génome de la souche IL,1403 proche de 130 kb. Des manipulations génétiques avec ces gènes peuvent être mises en #uvre pour augmenter ou diminuer le niveau de production de l'arginine, ce qui a de nombreuses applications dans l'industrie alimentaire, l'agriculture ou la médecine. An operon encoding five genes necessary for the biosynthesis of arginine was detected around 805 kb of the genome of L. lactis IL1403. Although the sequencing generated from the genomic DNA of L. lactis MG1363 did not reveal a sequence tag homologous to any gene of arginine biosynthesis, one would expect that such genes would be located in the MG1363 genome in the region from 800 to 850 kb, which is collinear between the two strains. The inventors have chosen two sequence tags, the closest to the zone, which must contain genes for the biosynthesis of arginine in the genome of MG1363. These are sequenced contigs which have revealed homology with the yhjD and yibC genes. By synthesizing the oligonucleotide homologs of the sequences from these two contigs, ma86 (SEQ ID N 2564) and ma87 (SEQ ID N 2565), and by carrying out an amplification by LR PCR on the chromosomal DNA of MG1363, a product of amplification of or near 19 kb in size containing genes for arginine biosynthesis was expected. Amplification resulted in a fragment the size of 19 kb. Sequencing of the ends of this fragment showed that the fragment did indeed correspond to the expected area and that the genes for arginine biosynthesis were contained in this area of the MG1363 genome. This method can be applied to other strains of L. lactis to detect arginine genes in most of the genetic environments sought. The argG and argH genes, encoding arginosuccinate synthase and lyase respectively, can also be detected similarly. They were detected in the genome of strain IL, 1403 close to 130 kb. Genetic manipulations with these genes can be used to increase or decrease the level of arginine production, which has many applications in the food industry, agriculture or medicine.
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3. Détection des gènes de la déshydrogénase pyruvate dans la souche de
L. lactis MG1363. 3. Detection of the pyruvate dehydrogenase genes in the strain of
L. lactis MG1363.
La déshydrogénase pyruvate est l'une des enzymes importantes dans la régulation des flux du métabolisme du pyruvate dans les microorganismes. En manipulant les niveaux d'activité de cette enzyme dans la cellule, il est possible de faire passer une bactérie de fermentation homolactique en fermentation acide mixte et ainsi influencer les rendements les différents produits de fermentation, ce qui peut influencer la saveur du produit final alimentaire. Un opéron codant pour quatre gènes nécessaires à la biosynthèse de la déshydrogénase pyruvate a été détecté aux environs de 60 kb dans le génome de L. lactis IL1403. Le séquençage généré à partir de l'ADN génomique de L. lactis MG1363 a révélé un contig, homologue du gène pdhD, codant pour une sous-unité de la désydrogénase pyruvate. Un autre tag séquence qui peut être utilisé pour amplifier ces gènes a été détecté comme homologue du gène yahG dans le génome annoté de IL1403. Par synthèse des oligonucléotides homologues aux séquences à partir de ces deux contigs, ma08 (SEQ ID N 2566) et ma09 (SEQ ID N 2567), et par la mise en #uvre d'une amplification par LR PCR sur l'ADN chromosomique de MG1363, un produit d'amplification de la taille de 15 kb, ou proche de cela, contenant les gènes de la biosynthèse de la déshydrogénase pyruvate était attentdu. L'amplification a effectivement donné un fragment de la taille de 15 kb. Le séquençage des extrémités de ce fragment a montré que ce fragment correspondait bien à la zone attendue et que les gènes de la biosynthèse de la déshydrogénase pyruvate étaient contenus dans cette zone du génome de MG1363. Cette méthode peut être appliquée à d'autres souches de L. lactis pour la détection des gènes de la déshydrogénase de pyruvate dans les environnements génétiques les plus recherchés. D'autres gènes également impliqués dans la glycolyse ont été détectés dans différentes parties du chromosome de la souche IL1403. Il s'agit de enoA (633 kb) et enoB (274 kb), tous deux codant pour une énolase, de pgk (242 kb) codant pour une phosphoglycératekinase, de pgm Pyruvate dehydrogenase is one of the important enzymes in the regulation of pyruvate metabolism fluxes in microorganisms. By manipulating the activity levels of this enzyme in the cell, it is possible to switch a bacteria from homolactic fermentation to mixed acid fermentation and thus influence the yields of the different fermentation products, which can influence the flavor of the final food product. . An operon encoding four genes necessary for the biosynthesis of pyruvate dehydrogenase was detected at around 60 kb in the genome of L. lactis IL1403. The sequencing generated from the genomic DNA of L. lactis MG1363 revealed a contig, homologous to the pdhD gene, encoding a subunit of pyruvate dehydrogenase. Another sequence tag that can be used to amplify these genes has been detected as a homologue of the yahG gene in the annotated genome of IL1403. By synthesis of the oligonucleotides homologous to the sequences from these two contigs, ma08 (SEQ ID N 2566) and ma09 (SEQ ID N 2567), and by carrying out an amplification by LR PCR on the chromosomal DNA of MG1363, an amplification product of or near the size of 15 kb containing the genes for pyruvate dehydrogenase biosynthesis was observed. Amplification did give a fragment the size of 15 kb. Sequencing of the ends of this fragment showed that this fragment corresponded well to the expected area and that the genes for the biosynthesis of pyruvate dehydrogenase were contained in this area of the MG1363 genome. This method can be applied to other strains of L. lactis for the detection of pyruvate dehydrogenase genes in the most sought after genetic environments. Other genes also involved in glycolysis have been detected in different parts of the chromosome of strain IL1403. These are enoA (633 kb) and enoB (274 kb), both encoding an enolase, pgk (242 kb) encoding a phosphoglycerate kinase, pgm
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(332 kb) codant pour une phosphoglycérate mutase, de pgmB (442 kb) codant pour une betta-phosphoglycomutase, de gapA (554 kb) et de gapB (2315 kb) les deux codant pour une déshydrogénase de glycéraldéhyde 3-phosphate, de tpiA (1148 kb) codant pour une isomérase triosephosphate, de pyk (1370 kb) codant pour une pyruvate kinase, de fbaA (1963 kb) codant pour une aldolase fiuctose-bisphosphate, depgiA (2228 kb) codant pour une glucose-6-phosphate isomérase. Par la synthèse des oligonucléotides homologues des séquences à partir des contigs proches des zones où ces gènes étaient détectés dans IL1403, et la mise en #uvre d'une amplification par LR PCR sur l'ADN chromosomique de MG1363, un produit d'amplification contenant les gènes de la glycolyse était attendu. Ces gènes représentent l'ensemble complet des gènes de la glycolyse et peuvent être trouvés dans Lactococcus lactis. (332 kb) encoding a phosphoglycerate mutase, pgmB (442 kb) encoding a betta-phosphoglycomutase, gapA (554 kb) and gapB (2315 kb) both encoding a glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, tpiA (1148 kb) encoding a triosephosphate isomerase, pyk (1370 kb) encoding a pyruvate kinase, fbaA (1963 kb) encoding a fiuctose-bisphosphate aldolase, depgiA (2228 kb) encoding a glucose-6-phosphate isomerase . By the synthesis of the homologous oligonucleotides of the sequences from the contigs close to the areas where these genes were detected in IL1403, and the implementation of an amplification by LR PCR on the chromosomal DNA of MG1363, an amplification product containing genes for glycolysis was expected. These genes represent the full set of genes for glycolysis and can be found in Lactococcus lactis.
Cette méthode peut être appliquée à d'autres souches de L. lactis pour la détection des gènes de la glycolyse dans la plupart des environnements génétiques recherchés. La modification de ces gènes par mutagénèse pourrait donner lieu à la construction de nouvelles souches de niveau alimentaire qui auraient de nombreuses applications dans l'industrie alimentaire et l'agriculture. This method can be applied to other strains of L. lactis for the detection of glycolysis genes in most of the genetic environments sought. The modification of these genes by mutagenesis could give rise to the construction of new food-grade strains which would have many applications in the food industry and agriculture.
4. Isolement et surproduction d'une chaperone extracytoplasmique
Les protéines sécrétées sont souvent dégradées au cours ou après leur sécrétion par des protéases présentes à la surface des cellules. Cette dégradation est souvent d'autant plus importante que la protéine sécrétée est d'origine étrangère, et ceci probablement parce que leur repliement est soit trop lent, soit mal synchronisé avec la synthèse et/ou la sécrétion. L'expression amplifiée de certains enzymes dont le rôle est de faciliter leur repliement permet parfois de protéger ces protéines de cette dégradation. Dans l'exemple suivant, les Inventeurs ont isolé la séquence complète d'un gène dont le meilleur homologue dans les bases de donnée est prsA de B. subtilis et dont l'activité semble être celle d'aider les protéines sécrétées à mieux se replier. 4. Isolation and overproduction of an extracytoplasmic chaperone
Secreted proteins are often degraded during or after their secretion by proteases present on the surface of cells. This degradation is often all the more important when the secreted protein is of foreign origin, and this probably because their folding is either too slow or poorly synchronized with synthesis and / or secretion. The amplified expression of certain enzymes whose role is to facilitate their folding sometimes makes it possible to protect these proteins from this degradation. In the following example, the inventors have isolated the complete sequence of a gene whose best homolog in the databases is prsA from B. subtilis and whose activity seems to be that of helping the secreted proteins to better fold. .
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Deux amorces PCR (SEQ ID N 2568 et SEQ ID N 2569) ont été déduites de la séquence de L. lactis IL1403 et ont permis d'amplifier le gène correspondant à prsA chez L. lactis. Ce gène a été cloné dans le vecteur pGEMT (Promega) et sa séquence vérifiée. Le plasmide obtenu a ensuite été fusionné au site Ncol au plasmide pNZ8037 contenant le promoteur de l'opéron nisine de L. lactis. La partie pGEMT de cet hybride a ensuite été délétée par coupure PstI et recircularisation avec la T4-ligase. Ce plasmide a ensuite été transformé dans la souche NZ9000, un dérivé de L. lactis subsp. cremoris MG1363 contenant le système permettant d'induire le promoteur placé en amont du gène homologue de prsA de L. lactis. Two PCR primers (SEQ ID N 2568 and SEQ ID N 2569) were deduced from the sequence of L. lactis IL1403 and made it possible to amplify the gene corresponding to prsA in L. lactis. This gene was cloned into the vector pGEMT (Promega) and its sequence verified. The obtained plasmid was then fused at the Ncol site to the plasmid pNZ8037 containing the promoter of the nisin operon of L. lactis. The pGEMT part of this hybrid was then deleted by PstI cleavage and recircularization with T4-ligase. This plasmid was then transformed into the strain NZ9000, a derivative of L. lactis subsp. cremoris MG1363 containing the system making it possible to induce the promoter placed upstream of the homologous prsA gene of L. lactis.
Cette souche a ensuite été testée pour la production de la lipase de Staphylococcus hyicus qui est dégradée en plusieurs formes tronquées lors de sa sécrétion chez L. lactis (Drouault et al. 2000, Appl Environ Microbiol., 66, 588). Dans cette souche, aucune forme dégradée de la lipase n'a pu être visualisée montrant que la production sur plasmide de l'homologue de prsA de L. lactis IL 1403 permet d'éviter l'accumulation de forme dégradée d'un enzyme hétérologue sécrété par une souche de L. lactis subsp. cremoris
5. Contrôle du métabolisme des sucres
La majeure partie du galactose métabolisé par L. lactis et en général les bactéries lactiques est transformé dans la voie de la glycolyse via la voie de Leloir. This strain was then tested for the production of Staphylococcus hyicus lipase which is degraded into several truncated forms during its secretion in L. lactis (Drouault et al. 2000, Appl Environ Microbiol., 66, 588). In this strain, no degraded form of the lipase could be visualized showing that the production on the plasmid of the prsA homolog of L. lactis IL 1403 makes it possible to avoid the accumulation of degraded form of a secreted heterologous enzyme. by a strain of L. lactis subsp. cremoris
5. Control of sugar metabolism
Most of the galactose metabolized by L. lactis and in general lactic acid bacteria is transformed in the glycolysis pathway via the Leloir pathway.
En effet, du fait du métabolisme fermentaire des bactéries lactiques, ces réactions sont plus actives que celles ayant trait à la synthèse de sucres nucléotides, precurseur du glycogène, d'acide lipotechoique et d'exopolysaccharides. Une des étapes limitant la synthèse d*EPS, en particulier chez Streptococcus thermophilus, bactéries du yaourt, est la réaction glucose-6-phosphate vers le glucose 1-phosphate par la phosphoglucomutase (aPGM). Son amplification est donc souhaitable pour permettre d'augmenter la production des EPS. Indeed, due to the fermentative metabolism of lactic acid bacteria, these reactions are more active than those relating to the synthesis of nucleotide sugars, precursor of glycogen, of lipotechoic acid and of exopolysaccharides. One of the steps limiting the synthesis of EPS, in particular in Streptococcus thermophilus, yoghurt bacteria, is the reaction glucose-6-phosphate towards glucose 1-phosphate by phosphoglucomutase (aPGM). Its amplification is therefore desirable to make it possible to increase the production of EPS.
Le gène codant pour [alpha]PGM, pgm, a été caractérisé pour en obtenir une The gene encoding [alpha] PGM, pgm, has been characterized to obtain a
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surexpression. Aucun gène [alpha]PGM de bactérie gram positive, et en particulier de bactérie lactique, n'avait été encore caractérisé génétiquement. Les Inventeurs ont donc recherché des séquences potentielles codant pour de tels gènes chez L. lactis sur la base de motifs court du site actifdes protéines de cette famille comprenant des phosphoglucomutases, des phosphomannomutases, des phosphoNacetylglucosamine-mutases et des gènes de fonction inconnue dont mrsA de E coli (Swissprot p31120). Les Inventeurs ont ensuite réalisé des alignements multiples des protéines homologues aux gènes homologues chez L. lactis et défini pour chacun des régions conservées afin de faire la synthèse d'oligonucléotides dégénérés permettant d'amplifier les régions correspondantes du génome de différente bactéries comme par exemple Streptococcus thermophilus. Une PCR dégénérée a été réalisée avec ces oligonucléotides SEQ ID N 2570 et SEQ ID N 2571 sur l'ADN total d'une souche de Streptococcus thermophilus. Il ont permis d'amplifier un fragment de 1. 2 kb dont la séquence a montré qu'il contenait un gène homologue à celui de L. lactis. overexpression. No [alpha] PGM gene from gram-positive bacteria, and in particular from lactic acid bacteria, had yet been genetically characterized. The inventors therefore searched for potential sequences encoding such genes in L. lactis on the basis of short motifs of the active site of proteins of this family comprising phosphoglucomutases, phosphomannomutases, phosphoNacetylglucosamine-mutases and genes of unknown function including mrsA from E coli (Swissprot p31120). The inventors then carried out multiple alignments of the proteins homologous to the homologous genes in L. lactis and defined for each of the conserved regions in order to synthesize degenerate oligonucleotides making it possible to amplify the corresponding regions of the genome of different bacteria such as for example Streptococcus thermophilus. Degenerate PCR was carried out with these oligonucleotides SEQ ID N 2570 and SEQ ID N 2571 on the total DNA of a strain of Streptococcus thermophilus. They made it possible to amplify a 1.2 kb fragment, the sequence of which showed that it contained a gene homologous to that of L. lactis.
Le reste du gène a ensuite été obtenu par PCR inverse (Ochman et al., 1990, Biotechnology, 8,759). L'ADN chromosomique est digérée avec des enzymes de restriction puis les produits de coupure sont circularisés par ligation avec la ligase puis amplifiés par PCR "Long Range" en utilisant des primers complémentaires au brin opposé. Les bandes obtenues sont extraites du gel et séquencées. La taille du gène pgm de Streptococcus thermophilus est de 1350 pb. The rest of the gene was then obtained by reverse PCR (Ochman et al., 1990, Biotechnology, 8,759). The chromosomal DNA is digested with restriction enzymes then the cleavage products are circularized by ligation with ligase and then amplified by “Long Range” PCR using primers complementary to the opposite strand. The bands obtained are extracted from the gel and sequenced. The size of the pgm gene of Streptococcus thermophilus is 1350 bp.
Les Inventeurs ont montré par la suite que ce gène correspond bien à l'a-PGM de S. thermophilus bien qu'il ait été isolé à partir de séquence supposée être codante pour les mannomutases. The inventors have subsequently shown that this gene corresponds well to the α-PGM of S. thermophilus although it was isolated from a sequence supposed to be coding for mannomutases.
Pour montrer que ce gène codait pour l'a-PGM, les Inventeurs ont adopté une stratégie d'inactivation par insertion d'un vecteur dans le gène par recombinaison homologue. Dans un premier temps, des plasmides dont la réplication est thermosensible contenant des fragments internes au gène pgm (Biswas et al., 1993, J Bacteriol., 175,3628) ont été construits. Une souche de Streptococcus To show that this gene coded for α-PGM, the inventors adopted an inactivation strategy by inserting a vector into the gene by homologous recombination. First, plasmids whose replication is thermosensitive containing fragments internal to the pgm gene (Biswas et al., 1993, J Bacteriol., 175,3628) were constructed. A strain of Streptococcus
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thermophilus contenant le plasmide pG+host contenant l'insert interne a pgm a été mise à pousser à 42 C sur boites M17 lactose contenant l'erythromycine pour détecter les événements d'intégration. L'ADN chromosomique préparée à partir d'une souches ainsi obtenue a été digéré par KpnI puis analysé par Southern en utilisant une sonde PCR couvrant le gène pgm. La bande correspondant à l'hybridation avec le gène pgm du chromosome est transformée en deux bandes correspondant à l'intégration du vecteur dans le gène pgm. Ce plasmide est donc bien intégré par recombinaison homologue. II est attendu qu'une souche contenant une mutation dans le gène pgm pousse normalement sur milieu contenant du glucose et du galactose mais pas sur milieu contenant du galactose ou glucose seul. thermophilus containing the plasmid pG + host containing the internal insert a pgm was grown at 42 ° C. on M17 lactose dishes containing erythromycin in order to detect the integration events. The chromosomal DNA prepared from a strain thus obtained was digested with KpnI and then analyzed by Southern using a PCR probe covering the pgm gene. The band corresponding to hybridization with the pgm gene of the chromosome is transformed into two bands corresponding to the integration of the vector into the pgm gene. This plasmid is therefore well integrated by homologous recombination. A strain containing a mutation in the pgm gene is expected to grow normally on medium containing glucose and galactose but not on medium containing galactose or glucose alone.
Le clone obtenu après intégration ne pousse pas sur glucose ou galactose seul, mais normalement en lactose ou sur un mélange glucose et galactose. Ceci montre que le métabolisme du glucose et du galactose a bien été découplé dans cette souche et que le gène dont l'activité a été affectée est bien pgm. Le travail réalisé dans la présente invention permet de montrer que le gène inactivé code bien pour l'enzyme connectant la voie des EPS et la glycolyse. II code donc probablement pour l'a-PGM dont la séquence n'était pas encore caractérisée expérimentalement chez les bactéries lactiques. Ces expériences montrent aussi que l'on peut, en s'appuyant sur les séquences du génome de L. lactis, isoler des gènes d'autres bactéries et notamment des Streptococcus. The clone obtained after integration does not grow on glucose or galactose alone, but normally on lactose or on a mixture of glucose and galactose. This shows that the metabolism of glucose and galactose has indeed been decoupled in this strain and that the gene whose activity has been affected is indeed pgm. The work carried out in the present invention makes it possible to show that the inactivated gene does indeed code for the enzyme connecting the EPS pathway and glycolysis. It therefore probably codes for α-PGM, the sequence of which was not yet characterized experimentally in lactic acid bacteria. These experiments also show that it is possible, by relying on the sequences of the genome of L. lactis, to isolate genes from other bacteria and in particular from Streptococcus.
6. Résistance au stress
L'annotation de IL1403 par comparaison avec d'autres bactéries telles que B. subtilis ou E. coli, permet d'identifier les gènes codant pour des activités répertoriées comme importantes en conditions de stress à la suite d'études biochimiques. Ainsi, l'invention permet l'identification de protéines mises en évidence par analyse protéomique quelle que soit la souche de L. lactis étudiée.
Par exemple, la comparaison de certaines séquences N-terminales rapportées par Kilstrup et al. (1997, Appl Environ Microbiol., 63,1826, souche MG1363) 6. Stress resistance
The annotation of IL1403 by comparison with other bacteria such as B. subtilis or E. coli, makes it possible to identify the genes coding for activities listed as important under stress conditions following biochemical studies. Thus, the invention allows the identification of proteins demonstrated by proteomic analysis regardless of the strain of L. lactis studied.
For example, the comparison of certain N-terminal sequences reported by Kilstrup et al. (1997, Appl Environ Microbiol., 63,1826, strain MG1363)
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et Frees et Ingmer (1999, Mol Microbiol., 31,79, souche MG1363) avec les orfs détectées dans la séquence de IL1403 permet de confirmer les fonctions assignées ou d'en attribuer. Ce type d'analyse devrait permettre d'identifier des gènes appartenant aux différents régulons de stress. Il deviendra possible de rechercher des séquences régulatrices communes entre les gènes d'un régulon puis dans l'ensemble de la séquence génomique afin d'en identifier tous les éléments. Les gènes codant pour la H±ATPase ou la désimination de l'arginine dont les activités augmentent en condition de stress, sont désormais identifiés chez IL 1403. On peut envisager de les modifier pour renforcer ou réduire la résistance des souches aux conditions acides. and Frees and Ingmer (1999, Mol Microbiol., 31,79, strain MG1363) with the orfs detected in the sequence of IL1403 makes it possible to confirm the assigned functions or to attribute them. This type of analysis should make it possible to identify genes belonging to the various stress regulons. It will become possible to search for common regulatory sequences between the genes of a regulon and then in the whole of the genomic sequence in order to identify all its elements. The genes encoding the H ± ATPase or the de-elimination of arginine, the activities of which increase under stress conditions, are now identified in IL 1403. It is possible to envisage modifying them to reinforce or reduce the resistance of the strains to acid conditions.
Cette annotation comparée permet aussi de bénéficier des connaissances acquises chez d'autres micro-organismes sur les réponses aux stress. En exemple, il peut être mentionné l'identification chez IL1403 d'un homologue du gène pexB de B. subtilis aussi appelé dps chez B. subtilis et E. coli. Ce gène a chez ces deux bactéries un rôle majeur dans la protection contre des dommages oxydatifs de l'ADN. Il est extrêmement probable, au vu de sa conservation, qu'il remplisse la même fonction chez L. lactis et soit important pour la survie au stress oxydatif et en phase stationnaire. Cette annotation révèle aussi des gènes de métabolisme du glycogène, de polyphosphate et de tréhalose dont il est bien établi qu'ils ont des rôles importants dans la survie en condition de phase stationnaire et de carence. Mais l'annotation révèle aussi des différences majeures entre IL1403 et B. subtilis : le facteur sigma-B contrôle chez B. subtilis une centaine de gènes de stress, la séquence de IL 1403 ne révèle aucun homologue de ce facteur sigma. This comparative annotation also makes it possible to benefit from the knowledge acquired in other microorganisms on responses to stress. As an example, there may be mentioned the identification in IL1403 of a homologue of the pexB gene of B. subtilis also called dps in B. subtilis and E. coli. In these two bacteria, this gene plays a major role in protecting against oxidative damage to DNA. It is extremely likely, in view of its storage, that it fulfills the same function in L. lactis and is important for oxidative stress and stationary phase survival. This annotation also reveals genes for glycogen, polyphosphate and trehalose metabolism which are well established to have important roles in survival in stationary phase and deficiency conditions. But the annotation also reveals major differences between IL1403 and B. subtilis: the sigma-B factor controls in B. subtilis around a hundred stress genes, the sequence of IL 1403 does not reveal any homolog of this sigma factor.
L'identification des régulateurs de stress doit donc reposer sur d'autres voies que la stricte comparaison. Là encore, la séquence permet d'envisager plusieurs solutions d'une part, elle révèle un certains nombre de régulateurs dont on peut désormais déterminer l'implication dans les phénomènes de résistance aux stress, d'autre part, elle permet le développement d'outils The identification of stress regulators must therefore be based on other avenues than strict comparison. Here again, the sequence makes it possible to consider several solutions on the one hand, it reveals a certain number of regulators whose involvement in stress resistance phenomena can now be determined, on the other hand, it allows the development of tools
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(notamment des puces à ADN) qui faciliteront cette étude. L'identification des régulateurs est très importante pour le développement d'applications puisque la modification d'un seul gène (le régulateur) affectera l'expression de l'ensemble des gènes appartenant à 1 régulon de stress. (especially DNA chips) which will facilitate this study. The identification of the regulators is very important for the development of applications since the modification of a single gene (the regulator) will affect the expression of all the genes belonging to 1 stress regulon.
La présente invention permet d'identifier les réseaux de gènes de résistance aux stress de L. lactis, leur régulateurs et leurs interactions. Des applications potentielles sont i) de trouver des marqueurs de stress pertinents, ii) de modifier ces gènes et/ou leur expression pour changer la capacité de résistance/sensibilité aux stress des Lactocoques et iii) de complémenter de façon pertinente l'absence de certains systèmes chez les Lactocoques éventuellement en implémentant de nouvelles fonctions. The present invention makes it possible to identify the networks of stress resistance genes of L. lactis, their regulators and their interactions. Potential applications are i) to find relevant stress markers, ii) to modify these genes and / or their expression to change the capacity of resistance / sensitivity to stress of Lactococci and iii) to complement in a relevant way the absence of certain systems in Lactococci possibly by implementing new functions.
Enfin, cette invention constitue un outil de diagnostic i) des stress réellement perçus par les Lactocoques au cours d'un procédé donné, ii) du potentiel de résistance/sensibilité d'une nouvelle souche et de son adéquation à un procédé, iii) pour choisir entre l'utilisation d'OGM ou de mutants naturels ou chimiques plus résistants aux stress et le cas échéant, identifier et contrôler la(es) mutation(s). Finally, this invention constitutes a diagnostic tool i) the stresses actually perceived by Lactococci during a given process, ii) the resistance / sensitivity potential of a new strain and its suitability for a process, iii) for choose between the use of GMOs or natural or chemical mutants more resistant to stress and, if necessary, identify and control the mutation (s).
7. Cycle des phases
L'analyse de la séquence du chromosome de la souche IL 1403 a permis d'identifier 6 prophages et de caractériser les régions du génome dans lesquelles ils sont insérés. Au total, 256 orfs ont été identifiées, ainsi que les régions putatives de régulation de leur expression. Sur les 256 protéines codées par ces orfs, 186 sont homologues à des protéines de bactériophages ou de bactéries présentes dans les banques de données, mais 70 sont nouvelles, sans homologie avec des protéines déjà décrites. De plus, l'analyse des Inventeurs a permis d'établir que certaines protéines ont une structure modulaire. Ceci implique que ces protéines, bien qu'homologues sur une partie de leur longueur à des protéines déjà décrites, puissent néanmoins présenter des spécificités 7. Phase cycle
Analysis of the chromosome sequence of strain IL 1403 made it possible to identify 6 prophages and to characterize the regions of the genome into which they are inserted. A total of 256 orfs were identified, as well as the putative regions regulating their expression. Of the 256 proteins encoded by these orfs, 186 are homologous to proteins of bacteriophages or bacteria present in the databases, but 70 are new, without homology with proteins already described. In addition, the inventors' analysis has made it possible to establish that certain proteins have a modular structure. This implies that these proteins, although homologous over part of their length to proteins already described, can nevertheless present specificities.
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d'action différentes. C'est le cas en particulier des protéines d'initiation de la réplication de l'ADN (Orfl6, Orfl5 et Orfl4 respectivement pour les phages bIL285, bIL286 et bIL309) qui, bien qu'ayant des domaines homologues, reconnaissent vraisemblablement des origines de réplication différentes sur l' ADN. different actions. This is the case in particular for DNA replication initiation proteins (Orfl6, Orfl5 and Orfl4 respectively for the phages bIL285, bIL286 and bIL309) which, although having homologous domains, probably recognize the origins of different replication on DNA.
L'analyse de la séquence du chromosome de la souche IL1403 a permis d'identifier des gènes codant pour des protéines impliquées dans des étapes clé de la multiplication des phages telles que la régulation du choix entre cycle lytique et cycle tempéré, la réplication de l'ADN, la recombinaison, la morphogenèse et la lyse cellulaire. En perturbant l'expression ou la fonction de certaines de ces protéines, il serait possible de développer des systèmes de résistance aux phages. Deux stratégies seraient utilisables :
1) le développement de phages infectants pourrait être gravement perturbé en changeant la concentration de l'une ou plusieurs des ces protéines ; ceci pourrait être fait en surproduisant, ou au contraire en titrant ces protéines et/ou leurs régulateurs ;
2) les systèmes de contrôle temporel d'expression des gènes de phages pourraient être utilisés ; en plaçant des gènes toxiques sous le contrôle de tels systèmes d'expression, il serait possible de développer des systèmes suicides dans lesquels l'infection par un phage entraînerait la mort des cellules infectées avant qu'elles ne puissent libérer de nouveaux phages. Analysis of the chromosome sequence of strain IL1403 made it possible to identify genes encoding proteins involved in key stages of phage multiplication such as the regulation of the choice between lytic cycle and temperate cycle, replication of the DNA, recombination, morphogenesis and cell lysis. By disrupting the expression or function of some of these proteins, it would be possible to develop phage resistance systems. Two strategies could be used:
1) the development of infectious phages could be seriously disturbed by changing the concentration of one or more of these proteins; this could be done by overproducing, or on the contrary by titrating, these proteins and / or their regulators;
2) phage gene expression temporal control systems could be used; by placing toxic genes under the control of such expression systems, it would be possible to develop suicide systems in which infection with a phage results in the death of infected cells before they can release new phages.
La présente invention a également permis de mieux décrire la variété des génomes existant parmi les phages du groupe P335. Cette connaissance pourrait être utilisée pour développer de meilleurs systèmes de diagnostic des phages présents dans les levains lactiques et les produits laitiers. The present invention has also made it possible to better describe the variety of genomes existing among the phages of the P335 group. This knowledge could be used to develop better diagnostic systems for phages present in lactic acid starter and dairy products.
8. Expression des gènes et milieu d'identification des souches. 8. Gene expression and strain identification medium.
L'une des applications directes de l'information découlant de la séquence One of the direct applications of the information arising from the sequence
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génomique est la construction de filtres à haute densité ou de puces, qui peuvent être utilisés pour étudier l'expression des gènes de la cellule entière ou pour comparer des génomes de souches différentes. La base pour la construction d'une telle expression de gènes et les milieux d'identification de souches est la séquence génomique et son annotation. Ainsi, l'information nécessaire pour la construction de filtres à haute densité et de puces pour L. lactis IL1403 est la séquence génomique (SEQ ID N 1) et son annotation présentée dans le Tableau II. La préparation de tels filtres ou puces consiste à synthétiser des oligonucléotides qui correspondent aux parties terminales 5' et 3' des gènes. Ces oligonucléotides sont sélectionnés en utilisant la séquence génomique et son annotation telle que fournie par la présente invention. La température d'annelage des oligonucléotides aux endroits correspondants sur l'ADN doit être approximativement la même pour chaque nucléotide. Ceci permet de préparer les fragments correspondants d'ADN pour chaque gène en utilisant des conditions standards de PCR dans des expérimentations par PCR automatisée à haut débit. Les fragments amplifiés sont ensuite immobilisés sur les filtres ou des supports de verre et ces milieux sont utilisés pour l'hybridation. genomics is the construction of high density filters or chips, which can be used to study whole cell gene expression or to compare genomes from different strains. The basis for the construction of such gene expression and strain identification media is the genomic sequence and its annotation. Thus, the information necessary for the construction of high density filters and chips for L. lactis IL1403 is the genomic sequence (SEQ ID N 1) and its annotation presented in Table II. The preparation of such filters or chips consists in synthesizing oligonucleotides which correspond to the 5 ′ and 3 ′ end parts of the genes. These oligonucleotides are selected using the genomic sequence and its annotation as provided by the present invention. The annealing temperature of the oligonucleotides at the corresponding locations on the DNA should be approximately the same for each nucleotide. This allows the preparation of the corresponding DNA fragments for each gene using standard PCR conditions in high throughput automated PCR experiments. The amplified fragments are then immobilized on filters or glass supports and these media are used for hybridization.
La disponibilité de tels filtres et la séquence annotée correspondante permet d'étudier l'expression de l'ensemble des gènes dans le microorganisme en préparant l'ADNc correspondant et en l'hybridant à de l'ADN immobilisé sur le filtre. L'hybridation de l'ADN immobilisé sur le filtre avec l'ADN total de différentes souches permet également d'étudier la divergence de l'organisation génomique chez différentes souches. The availability of such filters and the corresponding annotated sequence makes it possible to study the expression of all the genes in the microorganism by preparing the corresponding cDNA and by hybridizing it to DNA immobilized on the filter. Hybridization of the DNA immobilized on the filter with the total DNA of different strains also makes it possible to study the divergence of the genomic organization in different strains.
Les différences des séquences de gènes chez différentes souches peuvent largement influencer l'intensité de l'hybridation et ainsi influencer la précision de l'interprétation des données. Il est donc nécessaire d'avoir exactement l'ADN de la souche qui est étudiée pour l'immobiliser sur le filtre. Dans ce but, la méthode de la détection des gènes telle que fournie par la présente invention est utile. La procédure consiste dans ce cas à amplifier l'ADN de la souche d'intérêt en utilisant l'information sur la cartographie des régions colinéaires et la méthode de détection Differences in gene sequences in different strains can greatly influence the intensity of hybridization and thus influence the precision of data interpretation. It is therefore necessary to have exactly the DNA of the strain which is being studied in order to immobilize it on the filter. For this purpose, the method of gene detection as provided by the present invention is useful. The procedure in this case consists in amplifying the DNA of the strain of interest using the information on the mapping of the collinear regions and the detection method.
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des gènes conformément à l'invention. genes according to the invention.
L'utilisation de l'expression des gènes et le milieu d'identification de la souche fournira un ensemble de nouvelles connaissances sur la régulation des gènes des souches de L. lactis présentant un intérêt industriel et dans différentes conditions de croissance. Ceci permettra également l'identification rapide des différences génomiques dans les souches utilisées pour des applications industrielles multiples. The use of gene expression and the strain identification medium will provide a body of new knowledge on the regulation of genes of strains of L. lactis of industrial interest and under different growth conditions. This will also allow rapid identification of genomic differences in strains used for multiple industrial applications.
La souche de Lactococcus lactis IL 1403 a été déposée le 7 avril 2000 à la Collection National de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Dr Roux, 75724 PARIS Cedex 15, France, selon les provisions du traité de Budapest, et a été enregistrée sous le numéro d'ordre 1-2438. The strain of Lactococcus lactis IL 1403 was deposited on April 7, 2000 at the National Collection of Cultures of Microorganisms, Institut Pasteur, 25 rue du Dr Roux, 75724 PARIS Cedex 15, France, according to the provisions of the Budapest Treaty, and was registered under order number 1-2438.
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TABLEAU I Coordonnées des ORF par rapport à SEQ ID N 1
TABLE I Coordinates of the ORFs with respect to SEQ ID N 1
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<Desc/Clms Page number 131> <Desc / Clms Page number 131>
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<tb> TABLEAU <SEP> II. <SEP> Classification <SEP> des <SEP> protéines <SEP> de <SEP> L. <SEP> lactis <SEP> (SEQ <SEP> IDs) <SEP> en
<tb> groupes <SEP> fonctionnels
<tb> BIOSYNTHESE <SEP> DES <SEP> ACIDES <SEP> AMINES
<tb> Général
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<tb> Famille <SEP> acides <SEP> aminés <SEP> Aromatiques
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<tb> Famille <SEP> Aspartate
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<tb> Famille <SEP> Chaîne <SEP> ramifiée
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<tb> Famille <SEP> Glutamate
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<tb> Famille <SEP> Histidine
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<tb> Famille <SEP> Pyruvate
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<tb> Famille <SEP> Sérine
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<tb> BIOSYNTHESE <SEP> de <SEP> COFACTEURS, <SEP> GROUPES <SEP> PROSTHETIQUES, <SEP> et <SEP> TRANSPORTEURS
<tb> acide <SEP> folique
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<tb> Hème <SEP> et <SEP> porphyrine
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<tb> Ménaquinone <SEP> et <SEP> ubiquinone
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<tb> Pantothénate
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<tb> Riboflavine <SEP> et <SEP> cobalamine
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<tb> Thiorédoxine, <SEP> glutarédoxine, <SEP> et <SEP> glutathione
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<tb> Thiamine
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<tb> Nucléotides <SEP> Pyridine
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<tb> <tb>
<tb> TABLE <SEP> II. <SEP> Classification <SEP> of <SEP> proteins <SEP> of <SEP> L. <SEP> lactis <SEP> (SEQ <SEP> IDs) <SEP> in
<tb> functional <SEP> groups
<tb> BIOSYNTHESIS <SEP> DES <SEP> ACIDS <SEP> AMINES
<tb> General
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<tb><SEP> Aspartate family
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<tb> Family <SEP> Branched <SEP> string
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<tb> Family <SEP> Glutamate
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<tb><SEP> Histidine family
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<tb> Family <SEP> Pyruvate
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<tb> Family <SEP> Serine
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<tb> BIOSYNTHESIS <SEP> of <SEP> COFACTORS, <SEP> GROUPS <SEP> PROSTHETICS, <SEP> and <SEP> TRANSPORTERS
<tb> folic <SEP> acid
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<tb> Heme <SEP> and <SEP> porphyrin
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<tb> Menaquinone <SEP> and <SEP> ubiquinone
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<tb> Pantothenate
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<tb> Riboflavin <SEP> and <SEP> cobalamin
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<tb> Thioredoxin, <SEP> glutaredoxin, <SEP> and <SEP> glutathione
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<tb> Thiamine
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<tb> Nucleotides <SEP> Pyridine
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<tb>
<tb> ENVELOPPE <SEP> CELLULAIRE
<tb> Membranes, <SEP> lipoprotéines, <SEP> et <SEP> porines
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<tb> Muréine <SEP> sacculus <SEP> et <SEP> peptidoglycane
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<tb> Polysaccharides <SEP> de <SEP> Surface, <SEP> lipopolysaccharides <SEP> et
<tb> antigènes
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<tb> MACHINERIE <SEP> CELLULAIRE
<tb> Division <SEP> cellulaire
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<tb> Mort <SEP> cellulaire
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<tb> Chaperones
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<tb> Détoxification
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<tb> Sécrétion <SEP> des <SEP> Protéines <SEP> et <SEP> peptides
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<tb> Transformation
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<tb> METABOLISME <SEP> INTERMEDIAIRE <SEP> CENTRAL
<tb> Sucres <SEP> aminés
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<tb> Dégradation <SEP> des <SEP> polysaccharides
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<tb> Composés <SEP> phosphorés
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<tb> Biosynthèse <SEP> de <SEP> la <SEP> Polyamine
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<tb> Autres
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<tb> <tb>
<tb> CELLULAR <SEP> ENVELOPE
<tb> Membranes, <SEP> lipoproteins, <SEP> and <SEP> porins
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<tb> SEQ <SEP> IDs: <SEP> 2185
<tb> Murein <SEP> sacculus <SEP> and <SEP> peptidoglycan
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<tb> Polysaccharides <SEP> of <SEP> Surface, <SEP> lipopolysaccharides <SEP> and
<tb> antigens
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<tb> CELLULAR <SEP> MACHINERY
<tb> Cell <SEP> Division
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Cell <tb> Death <SEP>
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<tb> Chaperones
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<tb> Detoxification
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<tb> Secretion <SEP> of <SEP> Proteins <SEP> and <SEP> peptides
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<tb> Transformation
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<tb> SEQ <SEP> IDs: <SEP> 2177 <SEP> 2178 <SEP> 2179 <SEP> 2206
<tb> METABOLISM <SEP> INTERMEDIATE <SEP> CENTRAL
<tb> Amino <SEP> sugars
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<tb><SEP> degradation of <SEP> polysaccharides
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<tb> Phosphorus <SEP> compounds
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<tb> Biosynthesis <SEP> of <SEP> the <SEP> Polyamine
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<tb> Others
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<tb>
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<tb>
<tb> METABOLISME <SEP> ENERGETIQUE
<tb> Aérobique
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<tb> Acides <SEP> aminés <SEP> et <SEP> amines
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<tb> Anaérobique
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<tb> Interconversion <SEP> force <SEP> motrice <SEP> ATP-proton
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<tb> Transport <SEP> d'Electron
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<tb> Entner-Doudoroff
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<tb> Fermentation
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<tb> Gluconéogenèse
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<tb> Glycolyse
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<tb> Voie <SEP> Pentose <SEP> phosphate
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<tb> Pyruvate <SEP> déhydrogénase
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<tb> Sucres
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<tb> Cycle <SEP> TCA
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<tb> METABOLISME <SEP> DES <SEP> ACIDES <SEP> GRAS <SEP> ET <SEP> PHOSPHOLIPIDES
<tb> Général
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<tb> <tb>
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<tb> Aerobic
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<tb> Amino <SEP><SEP> and <SEP> amine acids
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<tb> Anaerobic
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<tb> Interconversion <SEP> driving force <SEP><SEP> ATP-proton
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Electron <tb> Transport <SEP>
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<tb> Entner-Doudoroff
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<tb> Fermentation
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<tb> Gluconeogenesis
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<tb> Glycolysis
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<tb> Channel <SEP> Pentose <SEP> phosphate
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<tb> Pyruvate <SEP> dehydrogenase
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<tb> Sugars
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<tb> TCA <SEP> cycle
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<tb> METABOLISM <SEP> OF <SEP> FATTY ACIDS <SEP><SEP> AND <SEP> PHOSPHOLIPIDS
<tb> General
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<tb>
<Desc/Clms Page number 134> <Desc / Clms Page number 134>
<tb>
<tb> PURINES, <SEP> PYRIMIDINES, <SEP> NUCLEOSIDES <SEP> ET <SEP> NUCLEOTIDES
<tb> métabolisme <SEP> 2'-deoxyribonucleotide
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<tb> Interconversions <SEP> Nucléotide <SEP> et <SEP> nucléoside
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<tb> Biosynthèse <SEP> des <SEP> ribonucléotides <SEP> Purine
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<tb> biosynthèse <SEP> des <SEP> ribonucléotides <SEP> Pyrimidine
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<tb> biosynthèse <SEP> Sucre-nucléotide <SEP> et <SEP> interconversions
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<tb> FONCTIONS <SEP> DE <SEP> REGULATION
<tb> Général
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<tb> Systèmes <SEP> deux-composants
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<tb> Régulateurs <SEP> de <SEP> la <SEP> famille <SEP> LacI
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<tb> Régulateurs <SEP> de <SEP> la <SEP> famille <SEP> AraC
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<tb> Régulateurs <SEP> de <SEP> la <SEP> famille <SEP> BglG
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<tb> <tb>
<tb> PURINES, <SEP> PYRIMIDINES, <SEP> NUCLEOSIDES <SEP> AND <SEP> NUCLEOTIDES
<tb> metabolism <SEP>2'-deoxyribonucleotide
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<tb> Interconversions <SEP> Nucleotide <SEP> and <SEP> nucleoside
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<tb> Biosynthesis <SEP> of <SEP> ribonucleotides <SEP> Purine
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<tb><SEP> biosynthesis of <SEP> ribonucleotides <SEP> Pyrimidine
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<tb> SEQ <SEP> IDs: <SEP> 1649 <SEP> 1650
<tb> Recovery <SEP> of <SEP> nucleosides <SEP> and <SEP> nucleotides
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<tb> biosynthesis <SEP> Sugar-nucleotide <SEP> and <SEP> interconversions
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<tb><SEP> REGULATION <SEP> FUNCTIONS
<tb> General
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<tb> Two-component <SEP> systems
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<tb> Regulators <SEP> of <SEP> the <SEP> family <SEP> AraC
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<tb> Regulators <SEP> of <SEP> the <SEP> family <SEP> DeoR
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<tb> Regulators <SEP> of <SEP> the <SEP> family <SEP> MarR
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<tb> Regulators <SEP> of <SEP> the <SEP> family <SEP> BglG
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<tb>
<Desc/Clms Page number 135> <Desc / Clms Page number 135>
<tb>
<tb> Protéines <SEP> liant <SEP> le <SEP> GTP
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<tb> REPLICATION
<tb> Dégradation <SEP> de <SEP> l'ADN
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<tb> SEQ <SEP> IDs: <SEP> 1361 <SEP> 1869
<tb> Réplication, <SEP> Restriction, <SEP> modification, <SEP> recombination,
<tb> et <SEP> réparation <SEP> de <SEP> l'ADN
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<tb> TRANSCRIPTION
<tb> Dégradation <SEP> de <SEP> l'ARN
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<tb> Synthèse, <SEP> modification <SEP> de <SEP> l'ARN, <SEP> et <SEP> transcription <SEP> de
<tb> l'ADN
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<tb> Maturation <SEP> moléculaire <SEP> de <SEP> l'ARN
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<tb> TRADUCTION
<tb> synthétases <SEP> d'ARNt <SEP> amino <SEP> acyl
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<tb> Dégradation <SEP> des <SEP> protéines, <SEP> peptides, <SEP> et <SEP> glycopeptides
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<tb> SEQ <SEP> IDs <SEP> : <SEP> 1861 <SEP> 1929 <SEP> 2027 <SEP> 2028 <SEP> 2045 <SEP> 2047 <SEP> 2105 <SEP> 2192
<tb> Modification <SEP> des <SEP> protéines
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<tb> Protéines <SEP> Ribosomales <SEP> : <SEP> et <SEP> modification
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<tb> Modification <SEP> de <SEP> l'ARNt
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<tb> <tb>
<tb> Proteins <SEP> binding <SEP> the <SEP> GTP
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<tb> REPLICATION
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<tb> SEQ <SEP> IDs: <SEP> 1361 <SEP> 1869
<tb> Replication, <SEP> Restriction, <SEP> modification, <SEP> recombination,
<tb> and <SEP> repair <SEP> of <SEP> DNA
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<tb> TRANSCRIPTION
<tb><SEP> degradation of <SEP> the RNA
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<tb> Synthesis, <SEP> modification <SEP> of <SEP> RNA, <SEP> and <SEP> transcription <SEP> of
<tb> DNA
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<tb><SEP> molecular <SEP> maturation of <SEP> RNA
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<tb> TRANSLATION
tRNA <SEP> amino <SEP> acyl <tb> synthetases <SEP>
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<tb><SEP> degradation of <SEP> proteins, <SEP> peptides, <SEP> and <SEP> glycopeptides
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<tb> Modification <SEP> of the <SEP> proteins
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<tb> Ribosomal <SEP> proteins <SEP>: <SEP> and <SEP> modification
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<tb> Modification <SEP> of <SEP> tRNA
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<tb>
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<tb> Facteurs <SEP> de <SEP> traduction
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<tb> SEQ <SEP> IDs: <SEP> 2128 <SEP> 2208 <SEP> 2317
<tb> TRANSPORT <SEP> ET <SEP> LIAISON <SEP> DES <SEP> PROTEINES
<tb> Général
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<tb> Acides <SEP> aminés, <SEP> peptides <SEP> et <SEP> amines
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<tb> Anions
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<tb> Hydrates <SEP> de <SEP> Carbone, <SEP> alcools <SEP> organiques <SEP> et <SEP> acides
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<tb> Cations
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<tb> Nucléosides, <SEP> purines <SEP> et <SEP> pyrimidines
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<tb> Système <SEP> PTS
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<tb> Résistance <SEP> Multidrogue
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<tb> AUTRES <SEP> CATEGORIES
<tb> Adaptations <SEP> aux <SEP> conditions <SEP> atypiques
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<tb> Sensibilité <SEP> aux <SEP> médicaments <SEP> et <SEP> analogues
<tb> <tb>
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<tb> Translation <SEP> factors
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<tb> SEQ <SEP> IDs: <SEP> 2128 <SEP> 2208 <SEP> 2317
<tb> TRANSPORT <SEP> AND <SEP> LINK <SEP> OF <SEP> PROTEINS
<tb> General
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<tb><SEP> amino acids, <SEP> peptides <SEP> and <SEP> amines
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<tb> Anions
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<tb> Hydrates <SEP> of <SEP> Carbon, <SEP> organic <SEP> alcohols <SEP> and <SEP> acids
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<tb> Cations
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<tb> Nucleosides, <SEP> purines <SEP> and <SEP> pyrimidines
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<tb> System <SEP> PTS
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<tb> Resistance <SEP> Multi-drug
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<tb> OTHERS <SEP> CATEGORIES
<tb> Adaptations <SEP> to <SEP> atypical <SEP> conditions
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<tb> Sensitivity <SEP> to <SEP> drugs <SEP> and <SEP> analogues
<tb>
<Desc/Clms Page number 137> <Desc / Clms Page number 137>
<tb>
<tb> SEQ <SEP> IDs: <SEP> 1244 <SEP> 1860 <SEP> 2249
<tb> Fonctions <SEP> relatives <SEP> aux <SEP> phages <SEP> et <SEP> prophages
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<tb> TABLEAU <SEP> III. <SEP> Homologies <SEP> des <SEP> protéines <SEP> de <SEP> L.lactis <SEP> IL1403 <SEP> avec <SEP> des <SEP> protéines <SEP> connues
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<tb> hygroscopicus <SEP> ; <SEP> Bacillus <SEP> subtilis
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<tb> synthesis <SEP> gene <SEP> cluster <SEP> of <SEP> streptomyces
<tb> hygroscopicus <SEP>;<SEP> Bacillus <SEP> subtilis
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<tb> salivarius
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Table IV. Genes involved in secretion phenomena
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