FR2843972A1

FR2843972A1 - Substitut cutanes bioactifs comportant un feuillet de cellules cultivees sur une matrice a base de chitosane

Info

Publication number: FR2843972A1
Application number: FR0210853A
Authority: FR
Inventors: Kenda Nathalie Liliane Ropson
Original assignee: 4C Biotech SA
Current assignee: 4C Biotech SA
Priority date: 2002-09-02
Filing date: 2002-09-02
Publication date: 2004-03-05
Anticipated expiration: 2022-09-02
Also published as: FR2843972B1

Abstract

La présente invention concerne des substituts cutanés constitués d'un feuillet cellulaire obtenu par culture de fibroblastes et/ou de kératinocytes humains sur une matrice hydratée, flexible et biorésorbable, à base de chitosane, coulée au fond d'un récipient de culture.

Description

SUBSTITUTS CUTANÉS BIOACTIFS COMPORTANT UN FEULLET DE
CELLULES CULTIVÉES SUR UNE MATRICE # BASE DE CHITOSANE ,
La présente invention concerne des substituts cutanés constitués d'un feuillet cellulaire obtenu par culture de fibroblastes et/ou de kératinocytes humains sur une matrice hydratée, flexible et biorésorbable, à base de chitosane, coulée au fond d'un récipient de culture. Le feuillet cellulaire, qui est de préférence multicouche, peut être constitué de cellules épithéliales (épiderme équivalent), de fibroblastes (derme équivalent) ou être un feuillet mixte de cellules épithéliales et de fibroblastes (peau reconstruite). Le biomatériau à base de chitosane recouvert d'un feuillet de cellules cutanées en multicouche, peut trouver des applications thérapeutiques comme pansement cellulaire bioactif pour le traitement de plaies chroniques (ulcères, escarres), pour le traitement de plaies aiguës (blessures, brûlures), comme agent de cicatrisation, des applications pharmacologiques voire cosmétiques, et des applications dans des tests in vitro en toxicologie.

Le traitement des lésions cutanées sévères telles que les brûlures de second et troisième degré, les ulcères et les escarres, comporte principalement deux aspects : d'une part, il est nécessaire de poser rapidement un pansement pour éviter la déshydratation et les infections et, d'autre part, il faut stimuler la régénération de l'épiderme ou plus généralement de la peau. Actuellement, dans le cas de brûlures gravissimes du troisième degré sur moins de la moitié de la surface corporelle, on effectue une autogreffe de peau du patient après excision de la peau brûlée. Dans ce cas, de la peau saine est prélevée sur le patient, passée dans une machine qui permet d'en augmenter la surface (principe de peau méchée ) et greffée sur le patient au niveau des lésions. Dans le cas de brûlures gravissimes du troisième degré sur plus de la moitié de la surface corporelle, il n'y a plus suffisamment de surface de peau saine pour obtenir de la peau méchée et réaliser l'autogreffe. Il faut alors d'abord

recouvrir de façon temporaire les plaies pour éviter la déshydratation et les infections, au moyen de peau de cadavre ou de substituts cutanés. Des cellules cutanées du patient sont pendant ce temps cultivées in vitro, pour obtenir des feuillets épithéliaux multicouches qui sont ensuite greffés.

Les techniques actuellement utilisées pour cultiver des feuillets épidermiques pour la greffe de grands brûlés, permettent d'obtenir en trois semaines de 1 à 2 m2 d'épiderme, à partir de quelques centimètres-carrés de peau (biopsie). Les feuillets de kératinocytes cultivés in vitro subissent un traitement enzymatique à la dispase pour les détacher du fond de la boîte de culture. Ces feuillets, extrêmement fragiles, doivent ensuite être agrafés sur une compresse vaselinée, avant d'être greffés sur les plaies du patient.

Les pansements acellulaires, destinés au recouvrement temporaire des plaies des grands brûlés, ou à recouvrir des petites plaies en attendant la régénération naturelle de la peau, sont l'objet d'intenses recherches. A titre d'exemples, on peut citer les pansements réalisés à base de polysaccharides de type dextrane ou xanthane sous forme de film hydraté, incorporant, le cas échéant, des facteurs favorisant la cicatrisation (brevet US 6,132,759). Récemment, un film polymère flexible à base de chitosane, destiné à servir de pansement acellulaire, a été décrit (WO 01/41820).

Le chitosane est une fibre d'origine naturelle biodégradable, obtenue après désacétylation de la chitine. La chitine est un biopolymère de haut poids moléculaire, non-toxique et biodégradable, et c'est, après la cellulose, le polysaccharide le plus répandu dans la nature. La chitine est constituée d'une chaîne linéaire dont la structure contient des monomères P-1,4 liés de type glucosamine (GIcN) et de N-acétyl-glucosamine (GIcNAc). L'extraction de la chitine à partir de carapace de crustacés pêchés en pleine mer d'Arabie (une flotte de 3000 bateaux de pêche collectent 10 à 30 tonnes de carapaces chaque jour) se fait par voie chimique, puis la transformation par désacétylation de la chitine dans de la

soude permet d'obtenir du chitosane. Le chitosane est donc obtenu en enlevant suffisamment de groupement acétyl (CH3CO-) pour permettre à la macromolécule d'être soluble dans la plupart des acides dilués. Cette opération, appelée désacétylation, libère les groupes amines et confère au chitosane une nature cationique à pH # 7.

De par sa structure chimique intrinsèque, un biomatériau à base de chitosane est parfaitement compatible avec les tissus, et sa haute tolérance biologique est connue depuis longtemps (il ne présente aucune réaction inflammatoire ou allergique après transplantation, ni aucun caractère antigénique). Le chitosane est complètement biodégradable, des enzymes tel que le lysozyme présent dans les plaies scindent ce polymère en oligomères qui sont ensuite éliminés par le métabolisme naturel.

De part leur biocompatibilité avec les tissus du corps humain et leur propriété cicatrisante, la chitine et ses dérivés désacétylés ont démontré leur efficacité pour toute forme de pansements : peau articificielle, pansement cornéen, fils de suture en chirurgie qui se résorbent naturellement après cicatrisation, mais aussi dans la réparation osseuse ou en chirurgie dentaire dans les implants ou dans la cicatrisation des gencives. On peut également citer, parmi les réalisations, les lentilles de contact bien tolérées. Depuis 1987, une peau artificielle à base de chitine partiellement désacétylée, la Beschitine, est fabriquée au Japon et est vendue à ce jour dans beaucoup de pays européens, en pharmacie. Cette peau se présente sous la forme d'un film à étendre, une seule fois, sur les plaies, ce pansement n'ayant pas besoin d'être renouvelé. En effet, la Beschitine est progressivement biodégradée par des enzymes jusqu'à la formation d'un nouvel épiderme. Pour des brûlures non importantes du premier ou léger second degré, cette peau présente une certaine efficacité, mais pas pour les brûlures sévères du second degré profond et du troisième degré.

La présente invention a pour objectif de fournir des substituts cutanés qui soient à la fois bioactifs et faciles d'utilisation. Elle vise à

surmonter certaines difficultés et certains inconvénients des pansements utilisés à ce jour et mentionnés ci-dessus. Les inventeurs ont en effet démontré qu'il était possible de cultiver des cellules cutanées sur une matrice biorésorbable à base de chitosane coulée au fond d'un récipient de culture. Les feuillets de cellules adhérentes à une telle matrice présentent, par rapport aux feuillets cellulaires de l'art antérieur, un certain nombre d'avantages. En effet, il est possible de détacher ces feuillets du récipient de culture sans utiliser de traitement enzymatique, par un simple détachement mécanique de la matrice à base de chitosane (figure 3). Ceci permet d'éviter une altération des cellules, inévitable lors du traitement enzymatique. De plus, le feuillet cellulaire ainsi obtenu est beaucoup plus résistant et ne nécessite pas d'être transféré sur une gaze et d'y être agrafée. Des avantages non-négligeables des substituts cutanés de l'invention sont liés aux propriétés du chitosane. En effet, le chitosane possède une excellente perméabilité à l'oxygène qui est nécessaire pour permettre une bonne viabilité des cellules au contact avec le support, une fois le substitut placé sur la plaie. Il possède un pouvoir cicatrisant et donc favorise la régénération cellulaire (activité biostimulante sur la reconstitution des tissus). Par ailleurs, le chitosane est antiseptique et peut donc protéger les tissus des infections microbiennes (bactériostatique). Le chitosane est également un agent hydratant particulièrement efficace, ce qui présente un double avantage : apporter de l'eau et éviter la déshydratation. Ce pouvoir hydratant a de plus l'avantage de persister dans le temps.

De plus, selon le chitosane sélectionné et le post-traitement réalisé, il est possible d'obtenir une matrice dont la surface est apte à promouvoir l'adhésion et la prolifération des kératinocytes humains, ou encore à augmenter leur pouvoir clonogénique et leur index mitotique.

Par rapport aux pansements acellulaires constitués d'un film de chitosane, tels que la Beschitine présentée plus haut, les substituts cutanés de l'invention présentent des avantages liés à la présence des cellules cultivées à leur surface ou au sein de la matrice, dans le cas où celle-ci est

poreuse. Les substituts cutanés de l'invention, contrairement aux pansements acellulaires de l'art antérieur, sont donc bioactifs. En effet, les cellules comprises dans ces substituts, qu'il s'agisse de fibroblastes ou de kératinocytes, et qu'elles soient allogéniques ou autologues, synthétisent des facteurs de croissance qui permettront d'améliorer l'efficacité de la cicatrisation, notamment en termes de vitesse et d'esthétique des plaies refermées. De plus, l'association entre une matrice - constituée majoritairement d'un polysaccharide de type chitosane - et des kératinocytes et/ou fibroblastes différenciés, présente une synergie unique en faveur d'une ré-épithélisation et d'une régénération cellulaire optimale, puisque la matrice seule possède déjà un pouvoir cicatrisant.

L'invention porte donc en premier lieu, sur un substitut cutané constitué d'un feuillet cellulaire de kératinocytes et/ou de fibroblastes, adhérents à une matrice biorésorbable à base de chitosane.

Par matrice à base de chitosane , on entend ici une matrice polymérique ou copolymérique comportant entre 60 et 100 % de chitosane, les autres constituants éventuels étant choisis notamment pour optimiser les propriétés mécaniques (élasticité, souplesse, porosité, ...) de la matrice.

Dans la suite du texte, la matrice à base de chitosane sera aussi désignée sous les termes matrice de chitosane , film (à base) de chitosane , membrane (à base) de chitosane , ou mousse (à base) de chitosane . Les termes film ou membrane désignent plutôt un gel de chitosane réticulé obtenu par séchage d'une solution aqueuse comportant du chitosane, suivant un procédé décrit plus bas, tandis que la mousse est obtenue par lyophylisation. Par définition, un film ou une membrane sont donc plus denses qu'une mousse. Le terme matrice recouvre quant à lui tant la forme dense que la mousse.

Dans un substitut cutané de l'invention, le feuillet cellulaire comporte de préférence plusieurs couches de cellules. Ces substituts cutanés constituent un épiderme équivalent lorsque les cellules cultivées sont des kératinocytes obtenus après dissociation dermo-épidermique et

cultivés sur une sous-couche nourricière, ou un derme équivalent lorsque les cellules cultivées sont des fibroblastes différenciés. Il est également possible de réaliser les substituts cutanés de l'invention, en ensemençant des kératinocytes dissociés sur le derme équivalent décrit ci-dessus.

Dans les substituts cutanés de l'invention, le feuillet cellulaire de l'invention peut également comporter des cellules souches. Il peut en effet être avantageux de cultiver des cellules souches in vitro, et d'orienter leur différenciation vers des kératinocytes.

Ceci peut être réalisé soit en utilisant des cellules souches embryonnaires, notamment par les techniques développées par Bagutti et aL sur les cellules souches embryonnaires de souris (Bagutti, Wobus et al.

1996) ou sur les cellules souches adultes murines du type de celles utilisées par l'équipe de Yann Barrandon, utilisant des cellules souches contenues dans les follicules pileux (Oshima, Rochat et al. 2001).

La différenciation des cellules souches en kératinocytes n'étant pas simultanée pour toutes les cellules, on obtient ainsi une culture mixte de cellules souches et de kératinocytes, qui constitue un épiderme équivalent ayant un bon index mitotique. Cette technique permet d'envisager de constituer des épidermes équivalents en vue de greffes allogéniques, notamment pour faire des épidermes de culture allogéniques de grands brûlés en attente de greffes autologues après culture de leurs propres cellules. Ce genre d'épiderme équivalent est certainement préférable à la peau de cadavres utilisés pour recouvrir temporairement les grands brûlés, notamment du fait que les cellules cultivées relarguent certainement davantage de facteurs de croissance que les peaux de cadavres.

L'utilisation de cellules souches comme source de kératinocytes permet en outre d'envisager l'obtention illimitée d'épidermes reconstitués greffables sans risque de rejet. En effet, ces cellules possèdent deux caractéristiques exceptionnelles : (i) elles sont immortelles sans être immortalisées. Cette approche permet donc d'obtenir des kératinocytes, de

manière illimitée, à partir de cellules ES indifférenciées ; (ii) ces cellules sont manipulables aisément par transfection ou recombinaison homologue.

Pour que ces cellules persistent chez un patient receveur, des modifications de certains loci, tel que celui des gènes du complexe majeur d'histocompatibilité (MHC), qui jouent un rôle majeur dans la reconnaissance des cellules étrangères par le système immunitaire, permettraient de créer des lignées pluripotentes universelles immunotolérantes (Milner and Campbell 1992). D'autres modifications géniques pourraient être envisagées sur ces cellules, telles que, par exemple, l'inactivation de gènes de récepteurs viraux pour des transplantations sur des patients souffrant d'infection virale chronique ou l'expression de gènes réparateurs. Les problèmes inhérents aux cultures primaires de kératinocytes (faible quantité de cellules, transfection peu efficace, problèmes d'allogreffes) pourraient donc être évités par cette technique. Ainsi, les centres de traitement des grands brûlés pourraient disposer en routine de substituts cutanés performants et faciles d'utilisation pour des greffes allogéniques temporaires ou permanentes.

Ces épidermes de culture allogéniques pourraient servir également au traitement des plaies chroniques résultant de pathologies veineuses ou de pathologies liées à des défauts de cicatrisation, qui nécessitent des pansements bioactifs libérant progressivement et durablement tous les facteurs de croissance nécessaires, à des concentrations physiologiques.

Le chitosane de la matrice dans les substituts cutanés de l'invention possède de préférence une masse moléculaire comprise entre 100 000 et 500 000 daltons, et un degré de désacétylation moyen compris entre 50 et 100 %, de préférence entre 70 et 90% (en référence à la chitine dont le degré de désacétylation est de 0%). Le degré de désacétylation sera notamment choisi par l'homme du métier en fonction du comportement et de la nature cellulaire qu'il souhaite faire croître à la surface ou au sein de la matrice du substitut cutané (Chatelet, Damour et al. 2001). Le degré

de désacétylation pourra également être choisi par l'homme du métier en fonction de la durée de résorption qu'il souhaite pour la matrice du substitut cutané, qui peut dépendre suivant les applications. En effet, la résorption sera d'autant plus rapide que le degré de désacétylation sera faible. Ainsi, la chitine et le chitosane ayant un degré de déacétylation inférieur à 66% sont très rapidement dégradés (en moins de trois semaines) (Tomihata and Ikada 1997).

Dans les substituts cutanés de l'invention, la matrice de chitosane se présente de préférence sous la forme d'une membrane hydratée tridimensionnelle sous la forme d'un gel réticulé. Cette tridimensionnalité permet notamment un bon pouvoir gonflant de la membrane, du fait de l'incorporation aisée de molécules d'eau au sein du réseau. Cette perméabilité à l'eau, qui résulte de la structure réticulée tridimensionnelle de la membrane, permet également de maintenir un taux d'humidité compris dans une, fenêtre thérapeutique optimale, après implantation du substitut cutané sur le patient, et présente donc l'intérêt d'éviter la déshydratation. La matrice peut également comporter du polyvinyl-alcool ou alcool polyvinylique (PVA), en proportion comprise de préférence entre 10 et 40 %, et/ou du glycérol.

Selon l'invention, la membrane peut se présenter soit sous la forme d'un film dense hydraté, soit comme une mousse poreuse hydratée, qui peut être colonisée par des cellules. Un substitut dermo-épidermique préféré de l'invention est donc constitué d'une mousse à base de chitosane, colonisée par des fibroblastes, et portant à sa surface un feuillet de kératinocytes. Dans ce cas, la porosité permet également une meilleure élimination des liquides exsudés par les plaies, après implantation du substitut cutané sur les patients.

Selon une réalisation particulière des substituts cutanés de l'invention, la matrice de chitosane a une épaisseur comprise entre 0,1 et 2 mm, de préférence entre 0,3 et 1 mm.

Selon une réalisation préférée de l'invention, la matrice de chitosane de l'invention est imbibée par un ou plusieurs facteur (s) de croissance destiné (s) favoriser la cicatrisation, et/ou un ou plusieurs antibiotique (s). Cette propriété découle intrinsèquement du procédé d'obtention des substituts cutanés de l'invention, décrit plus loin, puisque ces facteurs de croissance et antibiotique (s) être présents dans le milieu de culture des cellules, qui diffère en fonction des cellules inoculées (kératinocytes, fibroblastes, ou cellules souches), et dans lequel le substrat dermique est équilibré. A titre d'exemples non limitatifs de facteurs de croissance utilisables, on peut citer l'EGF (Epidermal Growth Factor) humain d'origine recombinante, la triiodotyronine et la toxine cholérique (Vibriocholerae) d'origine bactérienne. On peut également utiliser le KGF (Keratinocyte Growth Factor) et FGF (Fibroblast Growth Factor) humains. Les substituts cutanés de l'invention peuvent également être imbibés par des hormones et corticoïdes, telles que l'insuline et l'hydrocortisone. A titre d'antibiotiques utilisables, et de façon non limitative, on peut citer la gentamicine (Geomicine), l'amphétéricine B (Fungysone), la pénicilline et la streptomycine.

Les substituts cutanés de l'invention peuvent être conditionnés ou emballés pour assurer leur conservation dans de bonnes conditions, notamment pour assurer leur transport. Des modes de conditionnement sont notamment décrits dans la demande de brevet EP 1 085 081. Selon un mode de conditionnement préféré, les substituts cutanés de l'invention sont conditionnés dans une barquette individuelle scellée comportant du milieu nutritif gélifié et un mélange stérile d'environ 95 % d'air et 5 % de C02.

La matrice biorésorbable à base de chitosane qui est incluse dans les substituts cutanés de l'invention est de préférence entièrement biodégradable. Sa résorption in vivo se fait par dégradation enzymatique, et non par hydrolyse chimique.

La présente invention porte également sur un support de culture cellulaire pour la production de substituts cutanés ; ces supports comportent au moins une matrice à base de chitosane telle que décrite cidessus, dont la surface est supérieure ou égale à 15 cm2.

De manière préférée, le chitosane de la matrice des supports de culture selon l'invention a un degré de désacétylation compris entre 50 et 100 %, de manière encore préférée entre 70 et 90 %. Son poids moléculaire est compris de préférence entre 100 000 et 500 000 daltons .

Selon une réalisation préférée des supports de culture cellulaire de l'invention, la membrane tridimensionnelle de chitosane est stablilisée en milieu aqueux. De manière encore préférée, cette matrice (film dense) présente un bon pouvoir gonflant en milieux aqueux. Ceci présente l'intérêt non négligeable de permettre le maintien du taux d'humidité optimal au niveau des plaies. Dans une réalisation particulière, la matrice de chitosane est sous la forme d'une mousse poreuse, qui peut être obtenue par la technique de freeze drying , ou lyophlisation, décrite ci-dessous.

Comme indiqué plus haut, une telle mousse présente l'avantage de pouvoir être colonisée par des cellules, permettant la réalisation de modèles de dermes équivalents ou de modèles dermo-épidermiques. Ceci présente aussi l'intérêt de permettre l'évacuation des liquides exsudés par les plaies.

Selon une réalisation particulière des supports de culture cellulaire de l'invention, la matrice de chitosane comporte également du polyvinyl-alcool (PVA). La matrice de tels supports comporte de préférence entre 60 et 90 % de chitosane et entre 10 et 40 % de polyvinyl-alcool. Le polyvinyl-alcool compris dans la matrice des supports de culture cellulaire de l'invention est de préférence soluble à froid et a un degré d'hydrolyse qui se situe de préférence entre 85 et 90%. Un paramètre important du polyvinyl-alcool utilisé dans les supports de culture cellulaire de l'invention est sa viscosité, qui se situe de préférence entre 20 et 30 centipoises à 20 C pour une solution à 4% en poids.

Dans les supports de culture cellulaires de l'invention, la matrice à base de chitosane a de préférence une épaisseur comprise entre 0,1 et 2 mm, de manière encore préférée entre 0,3 et 1 mm. Selon une réalisation préférée de ces supports, la matrice de chitosane non poreuse est transparente, ce qui permet d'avoir un support de culture transparent permettant un suivi précis de la progression de la culture des cellules.

Dans les supports de culture cellulaires décrits ci-dessus, le film de chitosane est de préférence adhérent au fond d'un support solide, dont il est détachable par action mécanique. Le support solide en question présente de préférence la propriété de pouvoir être ouvert par le haut ; des exemples non limitatifs de supports utilisables sont les flacons pelables tels que ceux commercialisés par exemple par la firme TPP (Techno Plastic Producs AG, Suisse) sous les références 90551 et 90651 , ou les boîtes de Pétri de toute taille supérieure à 15 cm2 et de toute géométrie. Dans les supports de cultures cellulaires de l'invention, la matrice à base de chitosane est de préférence biorésorbable. Comme mentionné plus haut, la dégradation du chitosane in vivo s'effectue par dégradation enzymatique et non par hydrolyse chimique.

Les inventeurs ont identifié un chitosane particulièrement adapté à la constitution de supports de cultures cellulaires selon l'invention : il s'agit du chitosane extrait de plumes de calmar, commercialisé par exemple par la société France Chitine (Marseille, France). D'autres chitosanes utilisables dans le cadre de la présente invention sont par exemple le chitosane d'origine fongique commercialisé par Kitozyme (Belgique), et le chitosane d'origine animale et de qualité GMP commercialisé par Pronova (Canada). Bien entendu, ces sources de chitosane sont indiquées à titre d'illustration, et d'autres chitosanes peuvent être utilisés pour réaliser l'invention, comme par exemple des chitosanes synthétiques.

Un autre aspect de l'invention est une culture de cellules adhérentes, choisies dans un groupe comprenant les kératinocytes, les

fibroblastes et les cellules souches, sur un support de culture cellulaire tel que décrit ci-dessus. Une telle culture de cellules, lorsque la matrice de chitosane a été coulée au fond d'un flacon de culture, peut être transportée facilement, par exemple en remplissant ledit flacon de milieu de culture, le cas échéant supplémenté avec de l'hépès.

L'invention porte également sur un procédé de production d'un support de culture cellulaire tels que ceux décrits plus haut, comportant les étapes suivantes : (a) dissoudre du chitosane dans une solution aqueuse d'acide dilué, (b) couler cette solution homogénéisée dans un récipient de culture de surface supérieure ou égale à 15 cm2, (c) sécher jusqu'à obtention d'une matrice solide, ou lyophyliser jusqu'à obtention d'une mousse poreuse, et (d) post-traiter ladite matrice ou ladite mousse avec une solution basique, puis éliminer la base en excès n'ayant pas réagi ; les sels éventuellement formés et piégés dans la matrice (maléate d'ammonium par exemple), sont également éliminés, au moins partiellement, à ce stade ; (e) en tant que de besoin, équilibrer par rinçages ladite matrice avec le milieu de culture utilisable pour les cellules que l'on souhaite cultiver.

Dans une mise en #uvre préférée de ce procédé, la solution préparée à l'étape (a) comprend entre 1 et 5 % de chitosane, de préférence entre 1,5 et 3 %. La solution d'acide diluée peut par exemple être une solution d'acide maléique, ou d'un autre acide, de préférence à chaîne carbonée supérieure à C2 ou C3, par exemple d'acide acétique, succinique, ou glutamique. Il est également possible de mélanger ces différents acides, ou d'utiliser d'autres acides. La concentration totale en acide dans cette solution est comprise de préférence entre 0,09 et 0,27 mol/L. Le pH de la

solution préparée à l'étape (a) est par exemple compris entre 1 et 5, de préférence entre 2 et 4.

La solution préparée à l'étape (a) peut également contenir du polyvinyl-alcool (PVA), de préférence en quantité telle que la matrice au sein du support finalement obtenu contienne entre 10 et 40 % de polyvinylalcool, de préférence environ 20 % en poids par rapport au poids de chitosane. Il faut pour cela utiliser entre 0,2 et 1 g de PVA dans 100 ml de solution filmogène à couler (soit 0,2 à 1 % en poids). Cette solution peut également contenir un troisième élément, qui sera au moins partiellement éliminé au cours de l'étape de post-traitement (d) et d'étapes ultérieures de rinçage (e). Dans une mise en oeuvre préférée des procédés ci-dessus, la solution préparée à l'étape (a) est une solution triphasique qui contient entre 0,4 et 1,2% de glycérol dans 100 ml de solution filmogène à couler, du chitosane et du PVA, de préférence dans les proportions indiquées cidessus.

Dans une mise en #uvre des procédés de l'invention, la surface du récipient de culture est comprise entre 100 et 200 cm2, de préférence entre 115 et 150 cm 2. Des récipients utilisables dans ces procédés sont, par exemple, des flacons de 150 cm 2, ou des flacons de 115 cm 2, ces derniers permettant d'obtenir un support de culture de géométrie rectangulaire. Dans une mise en #uvre préférée des procédés de l'invention, le récipient est un flacon pelable ou la partie inférieure d'un tel flacon avant soudure du film pelable. En effet, il peut être avantageux, dans une chaîne de production de supports de culture cellulaire tels que décrit plus haut, de couler la solution préparée à l'étape (a) du procédé ci-dessus au fond d'un flacon dont la partie supérieure est encore ouverte, ce qui permet d'obtenir plus facilement une surface bien homogène et un séchage plus rapide et efficace. Dans une telle chaîne de production, le couvercle du récipient, qui dans le cas d'un flacon pelable, consiste en une pellicule de film plastique souple collée aux arrêtes des parois verticales, est rajoutée après les étapes de coulage et séchage ou

lyophilisation (b) et (c) ci-dessus et même éventuellement après l'étape (d; de post-traitement de la matrice.

Dans les procédés de production de supports tels que mentionnés ci-dessus, l'étape (c) de séchage peut être effectuée pai évaporation sous flux d'air, à une température comprise entre 15 et 50 C de préférence entre 20 et 40 C. Cette étape peut également être réalisée par lyophylisation à basse température entre -40 C et 0 C, de préférence entre -30 C et -20 C, suivant la technique du freeze drying décrite pai l'équipe de J. Chen (Ma, Wang et al. 2001), afin d'obtenir une moussE poreuse qui pourra être colonisée par des cellules.

La solution de chitosane est préparée comme à l'étape (a), avec ou sans ajout de PVA et/ou de glycérol, et en présence d'un agen porogène dissout dans la solution, tel que le chlorure de sodium, le glucosE ou le sucrose. Le mélange est alors coulé dans le moule adéquat pou l'invention, immédiatement congelé à -28 C, et enfin lyophilisé dans ur freeze-dryer (FTSTM Systems Inc, USA) pour donner une éponge poreuse. L'épaisseur de l'éponge de chitosane sèche peut être contrôlée en changeant la quantité de solution de chitosane utilisée.

L'étape (d) de post-traitement de la matrice dans les procédé: de production du support de l'invention a notamment pour objectif dE rendre cette matrice stable en solution aqueuse. Cette étape peut être effectuée par immersion de la matrice dans une solution basique, pa exemple dans une solution d'hydroxyde d'ammonium ou d'hydroxyde dE sodium dont la concentration est comprise de préférence entre 0,2 et 1,( mol/L, ou par simple contact de la matrice avec des vapeur; d'ammoniaque. Cette étape de post-traitement basique de la matrice présente plusieurs avantages : - elle permet de neutraliser les résidus acides contenus dans lé matrice à l'issue de l'étape (c) ; - elle permet une stabilisation de la matrice par réticulatior ionique des chaînes de chitosane ; et

- elle génère des fonctions amines libres qui améliorent l'adhésion des cellules en culture et notamment des kératinocytes.

Après ce traitement en milieu basique, la matrice est stable et ne peut se dissoudre en milieu aqueux. Elle peut donc supporter un stockage prolongé sous sa forme hydratée, en conditions de culture, en préservant son intégrité, notamment ses caractéristiques mécaniques.

Avant la culture cellulaire, les supports de l'invention sont soumis à une étape (e) supplémentaire, qui consiste à rincer la matrice en milieu aqueux (le cas échéant, après un premier rinçage dans une solution d'isopropanol à 70%), par exemple dans du PBS et/ou du milieu de culture, ce qui permet : - de rééquilibrer le pH de la matrice ; - de relarguer les résidus de base ; et, éventuellement, - de relarguer partiellement le glycérol soluble dans l'eau, provenant de l'étape (a), dont la présence n'est pas souhaitée à une concentration élevée dans le produit final.

Le cas échéant, il est également possible de perfectionner les supports de l'invention en rajoutant une étape (f) de traitement de la surface de la matrice pour permettre une adhésion sélective de certains types cellulaires, en greffant à la surface du film de chitosane, par couplage chimique, des adhésines microbiennes, des enzymes ou des principes actifs (tels que l'héparine par exemple via son groupement aldéhyde terminal), ou des polymères fonctionnalisés (fonction amine en surface).

Un aspect important des procédés de production de supports selon l'invention est que les supports obtenus doivent être stériles. Ceci peut être obtenu de différentes manières. Dans une mise en #uvre préférée des procédés de l'invention, tous les composés utilisés pour fabriquer la matrice sont stérilisés et chacune des étapes (a) à (e) ou, le cas échéant, (a) à (f) mentionnées ci-dessus, est effectuée en conditions stériles. Trois principaux modes de stérilisation peuvent être utilisés : la

filtration sur membrane de porosité 0,22 , la stérilisation par rayonnement, par exemple par rayonnements y, ou l'autoclavage. L'autoclavage de solutions aqueuses de polysaccharides entraînant une oxydation des produits, il est nécessaire de désoxygéner une solution comportant du chitosane avant son passage à l'autoclave. Ceci est réalisé en général par bullage avec un gaz neutre, par exemple l'azote. Les différents composés de la solution de l'étape (a) peuvent être stérilisés par l'une de ces méthodes. Par exemple, dans le cas d'une matrice constituée de chitosane et de PVA en présence de glycérol, le chitosane et le PVA sont y-stérilisés et le glycérol en solution est filtré sur 0,22 avant de l'introduire dans la solution aqueuse d'acide dilué (stérile) de l'étape (a) ci-dessus. Il est également possible de stériliser la solution de chitosane réalisée à l'étape (a), avant coulage, en l'autoclavant après l'avoir totalement désoxygénée par bullage à l'azote.

De façon complémentaire ou alternative, les procédés de production de supports mentionnés ci-dessus comportent une étape finale de stérilisation, qui est effectuée de préférence par irradiation sous rayonnement p ou y, ou par décontamination chimique dans une solution alcoolique, par exemple dans de l'isopropanol à 70%. Dans le cas où cette étape est effectuée par irradiation, la quantité de rayonnement devra toutefois être limitée, car elle peut entraîner une dégradation des composants de la matrice. Les doses utilisées en agroalimentaire, classiquement de l'ordre de 25 Kilograys, ne sont pas utilisables dans le cadre de la présente invention, à moins de partir d'un chitosane ayant une masse moléculaire beaucoup plus élevée que celle indiquée plus haut, pour tenir compte de la dégradation subséquente à l'irradiation. Cette étape a lieu de préférence après l'étape (d), ou, alternativement, après l'étape (e) de rinçage ou après l'étape (f) de modification par greffage du support obtenu en (d) ou (e).

On peut enfin envisager que la stérilisation soit conduite à n'importe quelle étape intermédiaire du procédé de production, les étapes ultérieures étant alors réalisées en conditions stériles.

Un autre type de support de culture cellulaire pour la production de substituts cutanés selon l'invention comporte des fibroblastes piégés dans un gel réticulé à base de chitosane. L'invention porte également sur un procédé d'obtention d'un tel support, tel que décrit à l'exemple 3, et comportant les étapes suivantes : (a) dissoudre du chitosane dans une solution aqueuse d'acide dilué, (b) homogénéiser la solution et en ajuster le pH entre 6,5 et
7,5, (c) ajouter dans la solution des fibroblastes individualisés, (d) couler 'cette solution contenant les fibroblastes dans un récipient de culture de surface supérieure ou égale à
15 cm2, (e) laisser reposer la solution jusqu'à réticulation du gel de chitosane.

L'invention porte également sur un procédé d'obtention d'un substitut cutané, par culture in vitro de cellules sur un support tel que ceux décrits plus haut, ou sur un support susceptible d'être obtenu par un des procédés décrits ci-dessus, comportant en outre une étape mécanique de détachement desdits substituts cutanés hors du flacon de culture. Les cellules utilisées dans ce procédé pourront notamment être choisies parmi les kératinocytes, les fibroblastes et les cellules souches embryonnaires ou adultes. Ce procédé d'obtention d'un substitut cutané peut également comporter une étape de conditionnement des substituts cutanés dans des barquettes individuelles scellées, sur un lit de milieu nutritif gélifié, sous une atmosphère stérile d'un mélange d'air et de CO2.

Un autre aspect de la présente invention est l'utilisation d'un substitut cutané tel que ceux décrits ci-dessus ou tel que ceux susceptibles d'être obtenus par les procédés vus plus haut, pour effectuer des tests in vitro de compositions cosmétiques et/ou pharmaceutiques.

Une utilisation préférée des substituts cutanés de l'invention a pour objectif la fabrication de greffons pour la réparation de lésions cutanées. Ces lésions cutanées peuvent être soit des plaies aiguës (blessures et/ou brûlures), soit des plaies chroniques (notamment des ulcères de la jambe et des escarres). Les substituts cutanés selon l'invention peuvent également être utilisés pour la fabrication de greffons pour le traitement des naevi congénitaux. En effet, l'opération des naevi congénitaux chez de jeunes enfants laisse le plus souvent des cicatrices disgracieuses qui peuvent être plus ou moins gênantes suivant l'endroit où elles se trouvent. L'utilisation de substituts cutanés selon l'invention peut permettre de fabriquer des greffons autologues qui pourront donner un bien meilleur résultat lors de l'opération de ces naevi.

La présente invention porte également sur des méthodes de traitement de lésions cutanées aiguës (brûlures et/ou blessures) ou chroniques (ulcères, escarres...). Comme mentionné plus haut, des substituts cutanés de l'invention, notamment des substituts épidermiques obtenus à partir de cellules souches seules ou en co-culture avec des kératinocytes et/ou des fibroblastes, peuvent avantageusement être utilisés dans le cas des grands brûlés et d'ulcères veineux, notamment d'ulcères de la jambe, pour recouvrir leurs plaies en attendant une greffe autologue.

Ces substituts cutanés pourraient remplacer avantageusement la peau de cadavres utilisée actuellement.

Un autre aspect de la présente invention est une méthode de traitement des naevi congénitaux comportant des étapes de prélèvement d'une biopsie de peau du patient à traiter, une étape de culture de ces cellules sur une matrice de chitosane dans un support de culture cellulaire

selon l'invention, puis la greffe du substitut cutané autologue ainsi obtenu, après excision de la peau constituant le naevus.

Les exemples et figures ci-après illustrent certains aspects de la mise en #uvre et de l'intérêt de la présente invention, sans toutefois en limiter la portée.

Légende des Figures Figure 1 : d'une membrane de chitosane au sein d'un flacon de culture pelable commercial. Schéma du procédé de préparation d'un récipient de culture contenant une membrane de chitosane telle qu'obtenue dans l'exemple 1. Les critères apparaissant dans des cadres correspondent aux contrôles à effectuer avant de passer à l'étape suivante.

Figure 2 : du procédé de culture in vitro menant au substitut cutané tel qu'obtenu dans l'exemple 3. Les critères apparaissant dans des cadres correspondent aux contrôles à effectuer avant de passer à l'étape suivante.

Figure 3 : illustrant un des avantages du procédé : le détachement mécanique aisé hors du récipient de culture du substitut cutané à l'aide de pinces stériles (sans enzyme et transfert) Figure 4 : illustrant l'adhésion et la prolifération de kératinocytes adultes (3 donneurs distincts) à la surface d'un film à base d'un gel de chitosane réticulé au sein d'un flacon pelable (ou peel-off en anglais) de 150 cm2 (densité d'inoculation:10.000 cellules/cm2) en comparaison avec une surface contrôle (fond du flacon pelable):
A. après 2 jours d'ensemencement des kératinocytes sur couche nourricière ;
B. après 3 jours de culture (pour les 3 donneurs);
C. après 5 jours de culture (pour les 3 donneurs);

D. entre 7 et 14 jours de culture pour un même donneur adulte (KDo 62).

Exemple 1 : supports de culture dans lequel la matrice à base d'un ciel de chitosane réticulé est sous la forme d'un film dense
Le récipient de culture utilisé ici est un flacon de culture de type pelable, ou peel off , commercialisé par la firme Techno Plastic Products AG (en Suisse). Ce récipient peut avoir une surface rectangulaire de 115 cm2(référence 90551), ou une surface polygonale de 150 cm2 (référence 90651 ).

Dans un premier temps, les inventeurs ont recherché à optimiser et à définir les spécifications des matières premières constituant la solution à couler au sein du récipient de culture qui sert de moule dans le procédé.

La solution en question, dite solution filmogène doit permettre que le film final présente un certain nombre de caractéristiques, dont certaines sont détaillées plus bas.

La solution filmogène est préparée en dissolvant, dans 100 ml de solution aqueuse d'acide maléique (environ 1. 4% en poids ; 0. 12 mol/L), à pH autour de 3, les matières premières suivantes : - 2 g de chitosane purifié ayant un degré de déacétylation entre 80% et 90% et une masse moléculaire Mv entre 150,000 et 300,000 daltons. On peut utiliser du chitosane de plus haute viscosité (Mv entre 300,000 et 500,000 daltons), mais il faut alors dissoudre des quantités deux fois plus faibles pour un même volume; - 0,5 g de polyvinylalcohol synthétique de qualité USP (pharmacopée américaine), ayant un degré d'hydrolyse d'environ 88% et une viscosité (à 20 C) entre 20 et 30 CentiPoises ; - 0,6 g de glycérol de qualité Ph Eur (pharmacopée européenne).

Cette proportion de chacun des constituants dans la solution complète à couler a été optimisée de manière à obtenir après séchage un film solide de chitosane répondant notamment aux exigences suivantes : - avoir une adhésivité suffisante au fond du moule (récipient de culture), à la fin de toutes les étapes de mise en #uvre et durant toute la durée du procédé ultérieur de culture in vitro (cellules épidermiques) ; - avoir l'aptitude de se détacher mécaniquement (à l'aide de pinces fines et stériles) hors du récipient de culture pelable, une fois le film combiné avec le feuillet cellulaire (en fin de procédé de culture in vitro) en une seule pièce sans se déchirer ; - avoir une bonne adhésivité à la surface de la peau préalablement humidifiée lors de la pose de la greffe in vivo en préservant un taux d'humidité optimal de la plaie.

Ces exigences impliquaient d'optimiser la composition chimique de la solution initialement coulée dans le moule et, par conséquent, la composition chimique finale du film prêt à recevoir les cellules, afin que ce produit semi-fini possède une flexibilité et une résistance mécanique (propriétés physico-mécaniques) ainsi qu' un contenu en eau (taux de gonflement) adéquats et reproductibles.

Après addition des 3 constituants de la solution acidulée, celle-ci a été agitée quelques heures à température ambiante avant d'être autoclavée puis filtrée sur un filtre 100 m. Un volume (V=50ml) de solution stérile a ensuite été coulé dans un flacon pelable (S=115 cm2) stérile. Cette solution a ensuite été séchée à température ambiante sous un flux d'air continu (dans une hotte stérile) jusqu'à obtention d'un film dense solide.

L'épaisseur de ce film, qui influence les propriétés élastiques et de résistance mécanique du film, peut être contrôlée par la quantité de solution filmogène utilisée par unité de surface. Le temps de séchage du film est aussi dépendant de cette quantité de solution coulée par unité de surface.

Le film dense solide obtenu a ensuite subi un post-traitement qui consiste à l'immerger, pendant 1 heure à température ambiante, dans une solution (V=60 ml) d'hydroxyde d'ammonium dans un mélange alcool-eau (concentration en NH40H d'environ 1 % en poids ou 0,2 mol/L). La quantité de base utilisée et le temps de contact de cette solution basique avec la matrice ont été optimisés afin de neutraliser efficacement les fonctions acides contenues au sein du film et de générer des fonctions amines libres dans les chaînes polysacharides, permettant la réticulation ionique du gel de chitosane et d'alcool polyvinylique (PVA) constituant la matrice. Après ce traitement, la matrice est stable et ne peut donc plus se dissoudre en milieu aqueux : elle peut donc être stockée pendant un temps prolongé, sous sa forme hydratée, dans les conditions de culture (PH autour de 7) en préservant ses propriétés physico-mécaniques.

Avant son utilisation, la matrice doit être rinçée dans de l'isopropanol 70% pour neutraliser cette fois l'excès de base utilisée à l'étape de réticulation précédente, puis dans du tampon phosphate (pH = 7) pour rééquilibrer le pH au sein de la matrice (autour de 7).

Le film dense à base d'un gel de chitosane réticulé est finalement équilibré dans du milieu de culture dont la nature et la composition dépendent de la nature cellulaire (kératinocytes, fibroblastes ou encore cellules souches) utilisée dans le procédé de culture in vitro ultérieur en vue de préparer un épiderme équivalent, un derme équivalent ou une peau reconstruite. Cette étape d'équilibration permet de fixer divers principes actifs présents dans le milieu de culture tels que des antibiotiques, des facteurs de croissance, des hormones ou encore des corticoïdes. La matrice de chitosane imbibée de milieu favorise leurs effets.

Le préconditionnement de cette matrice de chitosane dans du milieu de culture mène ainsi au support de culture prêt à être mis au contact avec les cellules épidermiques (voir exemples 4 ou 7).

Les différentes étapes du procédé décrit dans cet exemple sont schématisées à la figure 1, qui fait également apparaître les contrôles effectués à la fin de chaque étape.

Un exemple de prolifération cellulaire est illustré à la figure 4.

Exemple 2 : Supports de culture dans lequel la matrice de chitosane est sous la forme d'une mousse poreuse
Dans cet exemple, la matrice de chitosane est sous la forme d'une mousse poreuse. Le récipient de culture destiné à servir de support pour cette mousse est identique au support utilisé dans l'exemple 1.

Dans un premier temps, les inventeurs ont cherché à obtenir une mousse de chitosane ayant des spécifications requises et caractérisée par une porosité permettant une colonisation des cellules (de type fibroblastes) au sein de cette matrice poreuse tridimensionnelle (et non plus une croissance cellulaire exclusivement à la surface du film dense de chitosane, ce qui est le cas dans l'exemple 1). Cette matrice poreuse remplie de fibroblastes humains constitue un équivalent de derme (exemple 5), utilisé en pansement temporaire sur des plaies, ou encore un support idéal pour reconstruire un épiderme (peau reconstruite: exemple 7).

Dans cet exemple, la solution filmogène à couler dans le récipient de culture est préparée en dissolvant du chitosane (2 g) dans 100 ml de solution aqueuse d'acide maléique (0,12M) et en y ajoutant éventuellement une proportion de PolyVinylAlcohol adaptée à la culture de fibroblastes (cellules dermiques). Au lieu de dissoudre dans la solution à couler comme troisième composant du glycérol (comme c'est le cas dans l'exemple 1), un agent porogène soluble dans l'eau - tel que le chlorure de sodium, le glucose ou le sucrose - est dissout (à raison de 1 à 6 % en poids) dans la solution de chitosane et/ou PVA. La quantité et la nature de l'agent porogène utilisé influence la morphologie de la mousse obtenue, à savoir la proportion, la taille et la configuration des pores générés au cours de la lyophilisation.

La proportion de chacun des constituants dans la solution complète à couler a également été optimisée de manière à obtenir après lyophilisation une mousse de chitosane répondant aux mêmes exigences que celles mentionnées dans l'exemple 1 mais, en outre, à des critères de porosité spécifiques (type, taille des pores).

La solution complète une fois bien homogénéisée sous agitation est filtrée sur 100 microns, ensuite stérilisée après dégazage à l'azote par autoclave. La solution stérile est coulée dans le moule adéquat pour l'invention (récipient de culture stérile, ici un flacon pelable). Elle est ensuite immédiatement congelée à basse température (-28 C). Une fois bien congelée, la solution complète est alors lyophilisée dans un lyophilisateur pour donner une éponge poreuse de chitosane.

L'épaisseur de l'éponge de chitosane sèche peut être contrôlée en changeant également la quantité de solution complète coulée par unité de surface. Dans ce protocole de préparation, la mousse sèche de chitosane peut avoir une épaisseur contrôlée de l'ordre de 50 à 250 microns. L'épaisseur d'un derme humain normal est de l'ordre de 0. 5 à 2 mm dépendant de l'âge, du sexe et de l'endroit de prélèvement. Le but d'un substitut dermique artificiel est de construire un réseau propice à l'attachement et à la prolifération des fibroblastes dermiques, plutôt dans l'optique d'un pansement temporaire que pour un implant permanent. Ainsi, l'épaisseur du substitut dermique artificiel est généralement très inférieure à celle du derme humain réel.

Le post-traitement de la mousse solide obtenue, ainsi que les lavages et l'équilibration dans le milieu de culture (DMEM complet ou Green) propre aux cellules dermiques (fibroblastes humains) sont réalisés stérilement comme décrit dans l'exemple 1, et conduisent au support de culture prêt à être mis au contact des cellules cutanées (voir exemple 5).

Il est également envisageable de couler, au dessus de la mousse poreuse de chitosane ainsi préparée, une solution filmogène complète telle que préparée à l'exemple 1, pour préparer un film dense de

chitosane propice à l'adhésion des cellules épidermiques (voir procédure dans l'exemple 1). Cette procédure conduit alors à la construction d'une structure tridimensionnelle de type "bicouche", à la surface de laquelle la reconstruction d'un épiderme in vitro peut se faire pour mener à une peau totale reconstruite (Voir exemple 7).

Exemple 3: Supports de culture dans lesquel la matrice est constituée d'un gel de chitosane auquel sont associés des fibroblastes humains vivants (film dense)
Dans cet exemple, le récipient de culture dans lequel est mis en #uvre le gel de chitosane associé à des fibroblastes (en discontinu) est une boîte de petri commerciale (de toute taille) ou un flacon de culture pelable tel que mentionné plus haut.

Les cellules dermiques utilisées dans cet exemple sont les fibroblastes humains, qui constituent la seule population cellulaire du derme (100% des cellules). Une suspension de fibroblastes individualisés est isolée au départ d'une biopsie de peau humaine (déchet opératoire), par dissociation dermo-épidermique et traitement conventionnel enzymatique (à la trypsine). Ces cellules peuvent être cultivées plusieurs cycles mais seulement utilisées dans l'intervalle jusqu'à 7 à 8 cycles de "subculture" après la culture primaire.

Dans cet exemple, la solution filmogène à couler dans le récipient de culture est préparée en dissolvant du chitosane (entre 3 et 5% en poids) dans du milieu Green légèrement acidulé (et en y ajoutant ou non une proportion de PVA adaptée aux fibroblastes).

Il est important, dans ce cas, de réajuster la valeur de pH de cette solution visqueuse constituée du gel de chitosane vers la neutralité (pH=7) avant d'y associer les cellules dermiques. Au lieu de dissoudre dans la solution à couler un autre constituant (comme c'est le cas dans les exemples 1 et 2), une suspension dans du milieu DMEM complet de

fibroblastes individualisés venant juste d'être récoltés par traitement à la trypsine, est mélangée avec le gel de chitosane.

Dans cet exemple, la réticulation du gel de chitosane contenant les fibroblastes a lieu une fois les deux éléments (gel de chitosane et fibroblastes) mis au contact l'un de l'autre (sans nécessiter une étape d'évaporation suivie de l'étape de neutralisation en milieu basique). La réticulation du gel de chitosane et l'organisation des fibroblastes au sein du gel de chitosane réticulé (réseau 3D) peut provoquer une contraction du gel (réduction de la taille du support, de la membrane) qui est stabilisé après quelques jours de culture en immersion.

Dans cet exemple, la membrane constituée du gel de chitosane en association avec les fibroblastes humains est dès le départ placée en immersion dans le milieu de culture (de Green). Les fibroblastes humains une fois piégés au sein de ce réseau n'ont plus l'aptitude à proliférer, mais ils sont toujours vivants et donc secrètent encore des facteurs de croissance d'intérêt dans le milieu de Green: ils sont dits quiescents .

Ainsi, on obtient un équivalent de derme pouvant être utilisé soit comme pansement temporaire (substitut dermique allogénique) sur des plaies, soit comme support idéal pour reconstruire un épiderme (peau reconstruite: exemple 6).

L'épaisseur du derme équivalent peut être contrôlée en changeant également la quantité de solution (chitosane + fibroblastes) coulée par unité de surface. Dans cette procédure de préparation, le support peut avoir une épaisseur de l'ordre de 50 à 250 microns.

Les différentes étapes de ce protocole sont résumées à la figure 2.

Exemple 4 : Substituts cutanés constitués de cellules épidermiques cultivées sur film dense de chitosane
Dans cet exemple, les substituts cutanés sont constitués d'un film de chitosane tel que préparé dans l'exemple 1, recouvert d'un feuillet

épidermique multicouches. Dans ce cas, la matrice de chitosane a été conditionnée dans du milieu de Rheinwald et Green (contenant de L'EGF, de la toxine cholérique, de l'insuline, de l'hydrocortisone, de la triiodothyronine ainsi que deux antibiotiques : Géomycine et fungizone).

Les cellules épidermiques utilisées dans cet exemple sont des kératinocytes, qui constituent la principale population cellulaire épidermique (95% des cellules). Une suspension de cellules épidermiques est obtenue au départ d'une biopsie de peau humaine (déchet opératoire), par dissociation dermo-épidermique et traitement enzymatique. Cette suspension contient des kératinocytes et des mélanocytes qui peuvent croître et donc être amplifiées spécifiquement (100% de cellules d'un seul type), grâce à un milieu sélectif.

La veille de l'ensemencement des kératinocytes, une souscouche nourricière constituée de cellules fibroblastiques 3T3, soit irradiées, soit mytomycinées et, par conséquent, en arrêt de croissance, est inoculée sur la matrice de chitosane, équilibrée dans du milieu de Rheinwald et Green. La densité d'inoculation de ces 3T3 en arrêt de croissance est de 20. 000 cellules/cm2 et la culture se fait sous une atmosphère humidifiée avec 5% de C02 à 37 C.

Dans les 24 heures qui suivent l'inoculation des 3T3, une suspension de kératinocytes dissociés est alors inoculée sur la couche nourricière, à raison de 4000 à 10.000 cellules/cm2. La co-culture selon la technique de Rheinwald et Green est poursuivie jusqu'à atteindre la confluence plus 3 jours. Durant les derniers jours de culture, un processus de différentiation est initié, qui aboutit à la formation d'un feuillet épithélial multicouches (3 à 6 couches de kératinocytes), sans atteindre cependant la formation de la couche cornée superficielle constituée des cellules mortes anuclées, aplaties, nommées les cornéocytes, qui forment une barrière imperméable et protectrice.

Après cette culture in vitro, la matrice de chitosane recouverte du feuillet cellulaire multicouche est alors détachée mécaniquement à l'aide de

fines pinces stériles. Cette récupération du substitut cutané hors du récipient de culture ne nécessite donc aucun traitement enzymatique (à la dispase) tel que celui pratiqué pour produire les feuillets épidermiques autologues commerciaux. En outre, la résistance du feuillet cellulaire ancré sur la matrice de chitosane après simple détachement mécanique est adéquate. La préparation du substitut cutané de l'invention ne nécessite donc pas un transfert du feuillet sur une gaze stérile à l'aide d'agrafes chirurgicales coûteuses tel que pratiqué pour produire les feuillets épidermiques autologues commerciaux.

Après la récupération du feuillet sur film hors du flacon, celui-ci est rincé dans du MEM et ensuite déposé sur un lit de milieu de culture MEM gélifié dans une solution d'agarose Low Melting Point à 2%, à l'intérieur de barquettes individualisées. Les substituts cutanés de l'invention sont alors placés sous une atmosphère stérile constituée d'un mélange air/COz 95/5 dans ces barquettes individuelles, avant que celles-ci ne soient scellées stérilement et hermétiquement.

Une fois les substituts cutanés conditionnés, ils sont finalement transportés à basses températures jusqu'au centre de soins (lieu de la transplantation) dans les 24 à 48 heures.

Exemple 5: Substituts cutanés constitués de cellules dermiques cultivées au sein de la matrice poreuse à base de chitosane
Dans cet exemple, les substituts cutanés sont constitués d'une mousse de chitosane tell que préparée dans l'exemple 2, colonisée par des fibroblastes humains vivants et différenciés. Dans cet exemple, la mousse de chitosane est conditionnée soit dans du milieu de culture adapté aux fibroblastes humains (DMEM contenant 10% de sérum tel que le FCS ainsi que des antibiotiques) si l'on veut réaliser un derme équivalent à usage temporaire, soit dans du milieu de Green si le substrat dermique est utilisé ultérieurement comme support pour reconstruire un épiderme.

Les cellules dermiques utilisées dans cet exemple sont les fibroblastes qui constituent la seule population cellulaire du derme (100% des cellules). Une suspension de fibroblastes est isolée au départ d'une biopsie de peau humaine (déchet opératoire), par dissociation dermo- épidermique et traitement conventionnel enzymatique (à la trypsine). Ces cellules peuvent être utilisées jusqu'à 7 à 8 cycles de "subculture" après la culture primaire.

Une fois la mousse équilibrée dans du milieu DMEM-10%FBS, on y ensemence les fibroblastes dissociés, à une densité d'inoculation autour de 20.000 cellules/cm2. La culture se fait sous une atmosphère humidifiée avec 5% de C02 à 37 C.

La culture est poursuivie jusqu'à colonisation complète du volume poreux constituant la mousse de chitosane. Durant les derniers jours de culture, un processus de différentiation des fibroblastes associés à la matrice de chitosane est également initié.

Après cette culture in vitro, la mousse de chitosane colonisée par des fibroblastes différenciés est alors détachée mécaniquement à l'aide de fines pinces stériles. Les étapes de récupération du substitut cutané hors du récipient de culture, de conditionnement et de transport de ce substitut dermique (ou derme équivalent) sont tout à fait similaires à celles décrites pour le substitut épidermique (épiderme équivalent) dans l'exemple 4.

Exemple 6 : Substituts cutanés constitués de cellules épidermiques cultivées sur un équivalent de derme issu de l'association d'un gel de chitosane et de fibroblastes humains sous forme d'un film dense
Dans cet exemple, les substituts cutanés sont constitués d'un support constitué d'un gel de chitosane associé à des fibroblastes tel que préparé dans l'exemple 3, recouverts d'un épiderme reconstruit. Dans ce cas, le support, équivalent de derme, est préconditionné dans du milieu de

Rheinwald et Green (contenant de L'EGF, de la toxine cholérique, de l'insuline, de l'hydrocortisone, de la triiodothyronine ainsi que deux antibiotiques : Géomycine et fungizone).

Les cellules épidermiques utilisées dans cet exemple sont les kératinocytes, qui constituent la principale population cellulaire épidermique (95% des cellules). Une suspension de cellules épidermiques est obtenue au départ d'une biopsie de peau humaine (déchet opératoire), par dissociation dermo-épidermique et traitement enzymatique. Cette suspension contient des kératinocytes et des mélanocytes qui peuvent croître et donc être amplifiées spécifiquement (100% de cellules d'un seul type), grâce à un milieu sélectif.

Dès que le système gel de chitosane associé aux fibroblastes est stabilisé après quelques jours en milieu de Green, une suspension de kératinocytes dissociés (venant juste d'être récoltés par traitement à la trypsine) est alors inoculée entre 4000 et 10.000 cellules/cm2 à la surface du substrat dermique. La prolifération des cellules épidermiques se produit durant 7 jours dans une phase d'immersion (milieu de Green).

Ensuite, durant les 7 jours suivants, la culture est placée en émersion, de manière à induire le processus de différentiation du feuillet épithelial multicouches, jusqu'à la formation de la couche cornée superficielle constituée des cornéocytes (cellules mortes anuclées, aplaties, qui forment une barrière imperméable et protectrice).

Après cette culture in vitro, la peau reconstruite est alors détachée mécaniquement à l'aide de fines pinces stériles.

Les étapes de récupération du substitut cutané hors du récipient de culture, de conditionnement et de transport de ce substitut dermique (ou derme équivalent) sont tout à fait similaires à celles décrites pour le substitut épidermique (épiderme équivalent) dans l'exemple 4.

Exemple 7 : Substituts cutanés constitués de cellules épidermiques et dermiques cultivées sur matrice poreuse à base de chitosane
Les substituts cutanés sont ici constitués d'une simple mousse de chitosane, ou encore d'une structure tridimensionnelle de type "bicouche", constituée en dessous d'une mousse de chitosane et audessus d'un film dense de chitosane tel que cela a été décrit dans l'exemple 2. Dans ce cas, les substituts cutanés en tant que peau reconstruite proviennent de l'ensemencement de kératinocytes dissociés, sur un derme équivalent tel que celui obtenu cette fois dans l'exemple 5.

Une fois que la mousse est bien colonisée avec des fibroblastes humains dans du milieu de Green, une suspension de kératinocytes dissociés (venant juste d'être récoltés par traitement à la trypsine) est alors inoculée entre 4000 et 10.000 cellules/cm2 à la surface du substrat dermique. La prolifération des cellules épidermiques se produit durant 7 jours dans une phase d'immersion (milieu de Green).

Ensuite, durant les 7 jours suivants, la culture est placée en émersion, de manière à induire le processus de différentiation du feuillet épithelial multicouches jusqu'à la formation de la couche cornée superficielle constituée de cornéocytes (cellules mortes anuclées, aplaties, qui forment une barrière imperméable et protectrice).

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Claims

REVENDICATIONS 1. Substitut cutané constitué d'un feuillet cellulaire de kératinocytes et/ou de fibroblastes, adhérant à une matrice tridimensionnelle biorésorbable à base de chitosane.
2. Substitut cutané selon la revendication 1, dans lequel le feuillet cellulaire comporte plusieurs couches de cellules.
3. Substitut cutané selon la revendication 1 ou 2, dans lequel le feuillet cellulaire comporte en outre des cellules souches.
4. Substitut cutané selon la revendication 3, dans lequel les cellules souches peuvent être d'origine embryonnaire ou adulte.
5. Substitut cutané selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel la matrice à base de chitosane est sous la forme d'un film dense hydraté ou d'une mousse poreuse hydratée.
6. Substitut cutané selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel la matrice à base de chitosane comporte également du polyvinyl alcool et/ou du glycérol.
7. Substitut cutané selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel la matrice à base de chitosane est imbibée par un ou plusieurs facteur (s) de croissance destiné (s) favoriser la cicatrisation et/ou un ou plusieurs antibiotique(s).
8. Substitut cutané selon les revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il est conditionné dans une barquette scellée contenant du milieu nutritif gélifié et un mélange stérile d'environ 95% d'air et 5% de CO2.

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9. Support de culture cellulaire pour la production de substituts cutanés selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel la surface de culture est constituée d'une matrice tridimensionnelle à base de chitosane, dont la surface est supérieure ou égale à 15 cm2.
10. Support de culture cellulaire selon la revendication 9, dans lequel le chitosane de la matrice a un degré de désacétylation compris entre 50 et 100%, de préférence entre 70 et 90% et a une masse moléculaire comprise entre 100 000 et 500 000 Daltons.
11. Support de culture cellulaire selon l'une quelconque des revendications 9 à 10, dans lequel la matrice à base de chitosane est sous la forme d'une mousse poreuse.
12. Support de culture cellulaire selon l'une quelconque des revendications 9 à 11, dans lequel la matrice à base de chitosane comporte également du polyvinyl alcool et/ou du glycérol.
13. Support de culture cellulaire selon l'une quelconque des revendications 8 à 12, dans lequel la matrice à base de chitosane a une épaisseur comprise entre 0,1 et 2 mm, de préférence entre 0,3 et

1 mm.
14. Support de culture cellulaire selon l'une quelconque des revendications 9 à 13, caractérisé en ce que la matrice à base de chitosane adhère au fond d'un support solide hors duquel elle est détachable par action mécanique.
15. Support de culture cellulaire selon la revendication 14, caractérisé en ce que le support solide est un flacon pelable ou une boîte de Pétri.
16. Culture de cellules adhérentes choisies dans un groupe comprenant les kératinocytes, les fibroblastes et les cellules souches, sur un

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support de culture cellulaire selon l'une quelconque des revendications 9 à 15.
17. Procédé de production d'un support de culture cellulaire selon l'une quelconque des revendications 9 à 15, comportant les étapes suivantes : (a) dissoudre du chitosane dans une solution aqueuse d'acide dilué, (b) couler cette solution homogénéisée dans un récipient de culture de surface supérieure ou égale à 15 cm2, (c) sécher jusqu'à obtention d'une matrice solide ou lyophyliser jusqu'à obtention d'une mousse poreuse, et (d) post-traiter ladite matrice ou ladite mousse avec une solution basique, puis éliminer la base en excès.
18. Procédé selon la revendication 17, comportant en outre une étape (e) de lavage de la matrice ou de la mousse à base de chitosane avec une solution tamponnée et/ou avec du milieu de culture.
19. Procédé selon la revendication 17, comportant une étape supplémentaire de traitement par greffage ou couplage de principes actifs sur la matrice obtenue en (d) ou en (e) pour permettre une adhésion sélective de certains types cellulaires.
20. Procédé selon l'une quelconque des revendications 17 à 19, dans lequel la solution préparée à l'étape (a) comprend entre 1 et 5% de chitosane, de préférence entre 1,5 et 3% en poids et est à un pH compris entre 1 et 5, de préférence entre 2 et 4.
21. Procédé selon l'une quelconque des revendications 17 à 20, dans lequel la solution préparée à l'étape (a) contient de l'acide maléique et/ou de l'acide acétique, et/ou de l'acide succinique, et/ou de l'acide

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glutamique, dans une concentration telle que la concentration finale en acide est comprise entre 0,09 et 0,27 mol/L.
22. Procédé selon l'une quelconque des revendications 17 à 21, dans lequel la solution préparée à l'étape (a) contient en outre 0,2 à 2% en poids de glycérol et/ou 0,2 à 1 % en poids de polyvinyl alcool.
23. Procédé selon la revendication 17, dans lequel la surface du récipient est comprise entre 100 cm2 et 200 cm2.
24. Procédé selon l'une quelconque des revendications 17 à 23, dans lequel le récipient est un flacon pelable, ou la partie inférieure d'un tel flacon.
25. Procédé selon la revendication 17, dans lequel l'étape (c) est effectuée par évaporation sous flux d'air, à une température comprise entre 15 et 50 C, de préférence entre 20 et 40 C, ou par lyophylisation à basse température entre -40 C et 0 C, de préférence entre -30 C et -20 C.
26. Procédé selon la revendication 17, dans lequel l'étape (d) est effectuée par immersion de la matrice dans une solution basique ou par simple contact de la matrice avec des vapeurs d'ammoniaque.
27. Procédé selon la revendication 26, dans lequel la solution basique est une solution d'hydroxyde d'ammonium ou d'hydroxyde de sodium, dont la concentration est comprise de préférence entre 0,2 et 1,0 mol/L.
28. Procédé selon la revendication 17, comportant en outre une étape de stérilisation, qui est effectuée de préférence par irradiation sous rayonnement béta ou gamma, ou par décontamination chimique dans une solution alcoolique.

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29. Procédé d'obtention d'un support de culture cellulaire pour la production de substituts cutanés, comportant les étapes suivantes : (a) dissoudre du chitosane dans une solution aqueuse d'acide dilué, (b) homogénéiser la solution et en ajuster le pH entre 6,5 et

7,5, (c) ajouter dans la solution des fibroblastes individualisés, (d) couler cette solution contenant les fibroblastes dans un récipient de culture de surface supérieure ou égale à 15 cm2, (e) laisser reposer la solution jusqu'à réticulation de la matrice à base de chitosane.
30. Procédé d'obtention d'un substitut cutané, par culture de cellules sur un support suivant l'une quelconque des revendications 9 à 15, ou susceptible d'être obtenu par un procédé suivant l'une quelconque des revendications 17 à 29, comportant une étape mécanique de détachement des substituts cutanés hors du flacon de culture.
31. Procédé suivant la revendication 30, comportant en outre une étape de conditionnement des substituts cutanés dans des barquettes individuelles scellées, sur un lit de milieu nutritif gélifié, sous une atmosphère stérile de mélange air/C02.
32. Utilisation d'un substitut cutané selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, ou susceptible d'être obtenu par un procédé suivant l'une quelconque des revendications 30 et 31, pour effectuer des tests in vitro de compositions cosmétiques et/ou pharmaceutiques.
33. Utilisation d'un substitut cutané selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, ou susceptible d'être obtenu par un procédé suivant l'une quelconque des revendications 30 et 31, pour la

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fabrication de greffons pour la réparation de lésions cutanées, pour le traitement de plaies aigues, ou pour le traitement de plaies chroniques, ou pour le traitement de naevi congénitaux.