FR2546302A1

FR2546302A1 - Methodes immunologiques pour la determination de l'activite cellulaire metastasique

Info

Publication number: FR2546302A1
Application number: FR8407747A
Authority: FR
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1983-05-19
Filing date: 1984-05-18
Publication date: 1984-11-23
Also published as: IT8420998A0; PL247745A1; ZA843539B; ES532597A0; US4677058A; HUT34261A; DD251208A5; DE3418625A1; SE8402703L; IT8420998A1; AU2808784A; ES8605904A1; SE8402703D0; PT78610A; NZ208108A; NL8401616A; FI841897L; DK243184D0; FI841897A7; CA1230052A

Abstract

LA PRESENTE INVENTION A POUR OBJET DE FOURNIR DES METHODES POUR LA DETECTION DE CELLULES TUMORALES MALIGNES AYANT UNE ACTIVITE CELLULAIRE METASTASIQUE, PAR LA DETERMINATION IMMUNOLOGIQUE DE L'ANTIGENE COLLAGENASE DE TYPE IV DANS DES ECHANTILLONS BIOLOGIQUES, COMME DES FLUIDES CORPORELS, DES EXTRAITS DE TISSU, DES LAMELLES DE TISSU, DES CULTURES D'ORGANE OU DE TISSU, DES MILIEUX DE CULTURE, ETC... UN AUTRE OBJET DE LA PRESENTE INVENTION EST DE FOURNIR DES COMPOSITIONS COMPRENANT A LA FOIS DE L'ANTIGENE, A SAVOIR LA COLLAGENASE DE TYPE IV FORTEMENT PURIFIEE, MARQUEE OU NON MARQUEE ET DES ANTICORPS POLYCLONAUX OU MONOCLONAUX MARQUES OU NON-MARQUES DE CET ANTIGENE, A SAVOIR LA COLLAGENASE DE TYPE IV. APPLICATION : DETERMINATION DE L'ACTIVITE CELLULAIRE METASTASIQUE.

Description

2 L 463 02

La présente invention est relative à des méthodes pour la démonstration de l'activité cellulaire métastatique par la détermination immunologique d'antigène collagénase de type IV, par utilisation des anticorps polyclonaux et monoclonaux spécifiques de cet antigène De plus, la pré-

sente invention décrit des compositions, comprenant un anti-

gène marqué ou non-marqué et des anticorps polyclonaux ou

monoclonaux marqués ou non-marqués, spécifiques de cet anti-

gène de type enzyme.

L'une des caractéristiques majeures des cellules malignes est l'invasion et la formation de métastases En conséquence, des méthodes permettant la détection précoce et le contrôle des processus d'invasion, présentent un grand intérêt clinique La formation de métastases est une suite complexe d'évènements, par laquelle des cellules malignes se détachent de la tumeur principale, envahissent le tissu

adjacent, pénètrent dans les canaux lymphatiques ou circu-

latoires, se fixent à la paroi des vaisseaux et y pénètrent en un point éloigné, envahissent le tissu et finalement

prolifèrent pour initier le foyer métastatique.

Les cellules tumorales envahissantes doivent péné-

trer dans des membranes fondamentales, en plusieurs sites

pendant le processus de dissémination Des membranes fonda-

mentales sont des matrices extracellulaires qui forment une feuille tenace continue qui sépare des cellules épithéliales,

endothéliales et parenchymales du tissu conjonctif intersti-

tiel Ces structures sont composées de collagène (type IV) et de composants non-collagéneux, comme la laminine, le protéoglycan, l'entactine et la fibronectine Des membranes fondamentales constituent de notables barrières pour les

cellules tumorales et leur dégradation est donc une impor-

tante étape dans le processus des métastases On suppose maintenant que ce processus est facilité par des enzymes protéolytiques On a décrit la présence de taux élevés en protéases comme des activateurs du plasminogène, des enzymes dégradant le protéoglycan et la cathepsine B et D, à la fois

dans des extraits de tissus tumoraux et des milieux de cel-

lules tumorales cultivées et l'on a considéré que ces en-

zymes sont des sondes prometteuses pour mesurer le poten-

tiel d'invasion des cellules Cependant, la correlation

entre la libération des enzymes et le caractère envahis-

sant des cellules malignes n'a pas été établie En fait,

des activateurs de plasminogène sont produits par de nom-

breuses lignées cellulaires qui n'ont pas de propriétés envahissantes De plus, comme les protéases mentionnées plus haut ne dégradent pas le collagène de type IV, elles

ne fournissent pas des moyens suffisants pour que des cel-

lules tumorales traversent des membranes fondamentales.

La Demanderesse a démontré que des cellules tu-

morales libèrent une protéase neutre qui dégrade de façon spécifique le collagène de type IV et elle a mis au point des méthodes pour la purification de cette enzyme jusqu'à homogénéité, à partir d'une tumeur métastatique de souris (Liotta et coll, J Natl Cancer Inst, 58, 1427 1431,

1977; Liotta et coll, Proco Natlo Acad Sci, 76, 2268 -

2272, 1978; Salo et coll, The Journal of Biological Che-

mistry, 258, pp 3058 3063, 1983) et à partir de cellules tumorales humaines cultivées également La Demanderesse a aussi montré que l'activité de cette enzyme, dénommée par la suite collagénase de type IV, est en corrélation avec le potentiel métastatique des cellules tumorales

(Liotta et coll, Nature 284, 67 68, 1980).

Depuis qu'on a démontré que l'antigène enzymati-

que, la collagénase de type IV est utile pour mettre en

évidence des cellules malignes ayant une nature métastati-

que, l'enzyme peut présenter un grand intérêt diagnostique.

Cependant, la mesure de l'activité de la collagénase de

type IV ne peut pas être effectuée dans des fluides biolo-

giques, comme des fluides corporels, des extraits de tissu

ou des lames de tissu en raison de la grande quantité d'inhi-

biteurs de protéase dans de tels échantillons.

2 4630 Z

La présente invention a pour objet de fournir des méthodes pour la détection de cellules tumorales malignes

ayant une activité cellulaire métastatique, par la déter-

mination immunologique de l'antigène collagénase de type IV dans des échantillons biologiques, comme des fluides corpo-

rels, des extraits de tissu, des lamelles de tissu, des cul-

tures d'organe ou de tissu, des milieux de culture, etc Un autre objet de la présente invention est de fournir des compositions comprenant à la fois de l'antigène, à savoir

la collagénase de type IV fortement purifiéemarquéeou non-

marquéeet des anticorps polyclonaux ou monoclonaux marqués ou non-marqués de cet antigène, à savoir la collagénase

de type IV.

Des méthodes de purification et de caractérisation

d'antigène collagénase de type IV à partir de cellules ca-

pables de pénétrer dans des membranes fondamentales, en particulier à partir de cellules tumorales malignes, sont d'obligatoires pressions pour la réalisation de la présente invention La Demanderesse a découvert la collagénase de type IV et a mis au point des méthodes pour la purification et la caractérisation de cet antigène (Liotta et coll, J Natl. Cancer Inst, 58, 1427 1431, 1977; Liotta et coll, Proc. Natl Acad Sci, 76, 2268 2272, 1978; Salo et coll, The Journal of Biological Chemistry, 258, ppo 3058 3063, 1983; Salo et coll J Biol Chem, 1983) Pour mesurer

l'activité de la collagénase de type IV, on utilise du pro-

collagène de type IV marqué radioactivement en tant que sub-

strat, ce substrat étant préparé selon une méthode élaborée par la Demanderesse (Tryggvason et coll, Biochemistry, 19, 1284 1289, 1980) Ce dosage d'activité est nécessaire pour déterminer le degré de,purification pendant les étapes distinctes du procédé de purification On peut déterminer par cette méthode, l'activité de l'enzyme dans des milieux

de culture de cellules ou d'organes dépourvus de sérum.

La collagénase de typé IV peut être obtenue à

2 & 46302

partir de milieux de culture d'organe débarassés de sérum

de tissu de tumeur maligne ou de milieux de-cellules tumo-

rales cultivées Les morceaux de tissu ou les cellules sont généralement cultivés in vitro pendant 5 jours et le milieu collecté chaque jour On fait précipiter la protéine du milieu contenant l'antigène, la collagénase de type IV,

avec du sulfate d'ammonium, puis on le fait passer à tra-

vers plusieurs colonnes de chromatographie, ainsi que cela

est décrit dans les exemples ci-après.

L'antigène purifié, la collagénase de type IV, a

un poids moléculaire d'environ 70 000 et lorsqu'il est étu-

dié par électrophorèse sur gel, il consiste en deux chaînes polypeptidiques ayant un poids moléculaire de 62 000 et

68.000 L'antigène collagénase de type IV requiert une acti-

vation protéolytique pour avoir une activité maximum et il a un p H optimum de 7,4 L'antigène, à savoir la collagénase de type IV, est une enzyme dépendant d'un métal et il a

besoin de calcium pour être actif L'antigène est spécifi-

que et ne dégrade pas le collagène interstitiel des types

I, II ou III, d'autres composants de la membrane fondamen-

tale ou la caséine.

L'isolation et la purification de l'antigène, la

collagénase de type IV, rend possible la production d'anti-

corps spécifiques pour cet antigène La production de ces

anticorps permet le développement de méthodes immunologi-

ques sensibles, pour détecter l'activité cellulaire méta-

statique par la détermination qualitative ou quantitative d'antigène collagénase de type IV dans des échantillons biologiques, comme des fluides corporels, des extraits de tissu, des corps de tissu, des cultures de cellule ou d'organe, des milieux de culture, etc

La préparation d'antisérums, anticorps polyclo-

naux ainsi que monoclonaux, peut être effectuée par des méthodes déjà établies Pour préparer des antisérums, on injecte l'antigène purifié, la collagénase de type IV, par voie sous-cutanée, à plusieurs reprises dans des animaux d'expérience, comme des lapins ou des cobayes et apres une période de temps convenables, on prélève du sérum du ou des

animaux La présence des anticorps spécifiques dans l'anti-

sérum est alors testée par des techniques, comme le dosage

d'immunosorbant lié à une enzyme (ELISA), la technique uti-

lisée en Occident d'immuno-transfert sur papier filtre et

des méthodes de coloration immunologiques, qui sont con-

nues des spécialistes.

On a produit des antisérums de l'antigène colla-

génase de type IV de murin, par des méthodes mises au point

par la Demanderesse Les antisérums réagissent avec l'an-

tigène de la souris ainsi que cela est montré par des techni-

ques d'immuno-transfert sur papier filtrptechniques d'im-

munofluorescence et ELISA.

Pour préparer un antisérum classique, il faut que

l'antigène collagénase de type IV soit une protéine extre-

mement pure et homogène I 1 est extrêmement difficile d'obte-

nir des quantités suffisantes d'antigène collagénase de type IV humain absolument pur, pour produire des antisérums

classiques chez des lapins et des cobayes Afin de surmon-

ter ce problème, la Demanderesse -a utilisé la méthode de Ke 5 hler

et Milstein (Nature,256, 49 b, 1975) pour preparer des antioo:ps e Dno-

clonaux Cette méthode offre un avantage en ce que l'anti-

gène n'a pas besoin d'être absolument pur, parce que des

clones de cellules produisant l'anticorps spécifique (hy-

brides) peuvent être choisis dans des conditions in vitro.

Confonrmément à la méthode indiquée ci-dessus, on immunise à deux reprises par voie sous-cutanée des souris BALB/C, avec 100 Fg de collagénase de type IV hautement

purifiée, isolée à partir de milieux de culture de cellu-

les de fibrosarcome humain Six semaines plus tard, on

teste les antisérums avec la méthode ELISA Si les résul-

tats obtenus sont satisfaisants, les souris sont immunisées une fois de plus par voie intraveineuse avec une quantité convenable d'antigène collagénase de type IV Des cellules de rate provenant de deux souris immunisées et des cellules

de myélome de souris (NS-1) sont alors hybridées et culti-

vées selon une technique classique dans des plaques de micro-

titrage Parmi les 453 puits des plaques, 46 sont positifs

en ce qui concerne les anticorps, ainsi que cela est déter-

miné par la méthode ELISA.

On a trouvé 10 lignées d'hybrides convenables par

la méthode qui est décrite plus haut Ces 10 lignées d'hy-

brides sont fortement positives pour les cellules de fibro-

sarcome humain malin et de carcinome du sein, mais seule-

ment faiblement réactives avec des fibroblastes normaux de

la peau humaine Trois de ces 10 lignées de cellules hy-

brides, qui présentaient les plus forts titres, ont été choisies pour effectuer le clonage in vitro par la technique

de dilution et la production d'anticorps monoclonaux.

Les anticorps monoclonaux et polyclonaux de l'anti-

gène collagénase de type IV, produits, isolés et purifiés de la façon décrite plus haut, peuvent être marqués avec des éléments de marquage radioactifs, enzymatiques ou fluorescents convenables par des méthodes classiques, qui doivent être évidents pour les spécialistes Les anticorps polyclonaux et monoclonaux et cet

antigène collagénase de type IV, marqués ainsi que non-mar-

qués, pourraient être fixés sur des supports solides conve-

nables et utilisés dans des méthodes immunologiques, qui

forment une partie de la présente invention.

Conformément aux méthodes utilisées pour la dé-

tection de cellules malignes ayant une activité cellulaire

métastatique, on détermine la présence de l'antigène colla-

génase de type IV dans des échantillons biologiques, comme des fluides corporels, des extraits de tissu, et des corps

de tissu, etc, avec des méthodes immunologiques classi-

ques, à l'aide de compositions d'antigène collagénase de type IV fixé ou non-fixé, marqué ou non-marqué, ainsi que

de compositions d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux, fi-

xés ou non-fixés, marqués ou non-marqués.

On a utilisé dans les méthodes immunologiques, de l'antisérum de lapin pour déterminer la présence d'antigène collagénase de type IV Ainsi que cela est montré par la technique utilisée en Occident d'immuno-transfert sur papier filtre, l'antisérum a coloré deux protéines dans la région de 62 K et 68 K, qui correspondent à l'antigène collagénase de type IV purifié De plus, l'antisérum est utilisé pour la coloration immunologique des tissus du sein normal et du cancer du sein humain Des lamelles de tissus traitées par le froid sont d'abord incubées avec l'antisérum et ensuite

avec l'anti Ig G de lapin conjugué avec du FITC Les résul-

tats ont montré que, sur 10 échantillons de tissus normaux, aucun n'a donné de fluorescence positive, c'est-à-dire

qu'ils ne contenaient pas l'antigène collagénase de type IV.

D'un autre côté, 25 des 25 échantillons de tissu de cancer du sein ont montré une intense fluorescence dans la région

située en bordure de la tumeur En conséquence, les métho-

des immunologiques décrites dans la présente invention

permettent la détection de la présence de cellules de tu-

meur malignes dans des tissus et, comme on a aperçu la colo-

ration principalement sur le bord de la tumeur il est évi-

dent que l'antigène collagénase de type IV est enrichi en

cellules envahissantes.

Des anticorps spécifiques de l'antigène collagé-

nase de type IV humain produits à partir de clones hybri-

des de souris, sont utilisés pour effectuer la coloration immunologique des cellules cultivées Les cellules étudiées étaient des cellules de fibrosarcome (HT-1080) humain, de carcinome du sein (MCF-7) et des fibroblastes de la peau ' humaine normale On a cultivé les cellules sur des plaques de microtitrage et on les a incubé avec les anticorps Les plaques sont alors lavées et incubées avec de l'anti-Ig G/ Ig M de souris de cheval biotinylé et ensuite lavées Après cela, on a ajouté des réactifs d'avidine-biotine-peroxydase

pour colorer les complexes d'immunoglobuline de souris-

anti-immunoglobuline de souris fixés aux cellules Les ré-

sultats ont montré que les cellules malignes HT-1080 et MCF-7 sont colorées, tandis que les fibroblastes cutanés normaux ne sont pas teintés Il est donc évident que des anticorps monoclonaux du collagénase humain de type IV,

peuvent être utilisés pour différencier des cellules mali-

gnes contenant l'antigène collagénase de type IV, des cel-

lules normales ne contenant pas cet antigène.

Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de

la description qui va suivre.

L'invention sera mieux comprise à l'aide du com-

plément de description qui va suivre, qui se réfère à des

exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention. Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples de mise en oeuvre, sont donnés uniquement à titre

d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne cons-

tituent en aucune manière une limitation.

EXEMPLE 1

Isolation de l'antigène collagénase de type IV.

Pour préparer de la collagénase de type IV de

souris, on fait d'abord croître des tumeurs PMT métasta-

tiques dans des souris C 57 B 1/6 J Après environ deux se-

maines de croissance, les tumeurs sont excisées, hachées menu et incubées dans un milieu RPMI-1640 débarassé du sérum, en tant que cultures d'organe, pendant 5 jours Le milieu est collecté chaque jour et sa protéine précipitée

avec du sulfate d'ammonium (saturé à 25 60 %) Le préci-

pité est dissous dans le tampon d'enzyme (Tris-CH 1 0,05 M, p H 7,4, Na Cl 0,2 M 10 m M de Ca C 12) et envoyé à travers une colonne d'agarose et concanavaline-A, à laquelle se fixe la plus grande partie de l'activité de l'enzyme L'activité fixée est élevée avec 1 M d' a-méthyl mannoside et envoyée sur une colonne d'agarose avec collagène de type IV Le collagène couplé à la colonne est extrait à partir de la matrice de membrane fondamentale EHS formant une tumeur et purifié et il contient des chaînes intactes de colla-

gène de type IV ( 185 K et 175 K) Afin d'éviter la dégra-

dation du collagène-agarose par l'enzyme, les tampons sont

dépourvus de Ca C 12 pendant ce passage de colonne L'acti-

vité de l'enzyme est éluée de la colonne avec le tampon

d'enzyme contenant 1 M de Na Cl ou 50 % d'éthylèneglycol.

La purification finale de l'enzyme est obtenue par un tamis moléculaire, par exemple, du Bio-Gel A 0,5 m, dans lequel elle migre avec un poids moléculaire apparent d'environ 000 L'enzyme purifiée de cette façon contient deux chaînes de polypeptide de poids moléculaire 68 K et 62 K. L'activité de la collagène humaine de type IV

est préparée de la même façon que l'enzyme de murin à par-

tir de milieux débarrassés de sérum, de cellules de fibro-

sarcome humain cultivées (HT-1080) Les cellules sont cul-

tivées jusqu'à confluence dans un milieu d'Eagle modifié par Dubelcco (DMEM) contenant 10 % de sérum de veau featal,

dans des flacons roulants; après quoi, le milieu est chan-

gé en un même milieu dépourvu de sérum Le milieu est col-

lecté tous les jours pendant 5 jours.

EXEMPLE 2

Préparation d'antisérum à la collagénase de souris de type IV.

On injecte l'antigène ( 100 200 pg) par voie sous-

cutanée dans des volumes égaux de solution saline tamponnée par du phosphate (PBS) et de l'adjuvant complet de Freund et quatre semaines plus tard, avec de l'adjuvant de Freund incomplet On administre alors des injections de rappel à deux reprises,à 3 semaines d'intervalle Du sang est prélevé 3 semaines après le dernier rappel et la spécificité et le titre du sérum sont testés par les techniques ELISA, les

techniques utilisées en Occident d'immuno-transfert sur pa-

pier filtre et d'immuno coloration.

EXEMPLE 3

Préparation et caractérisation des anticorps monoclonaux.

Des souris BALB/C sont immunisées avec 100 pg

d'enzyme HT-1080 partiellement purifiée dans de l'adju-

vant de Freund complet et réimmunisêes à deux reprises

avec 50 pg d'antigène, à des intervalles de 3 semaines.

Les titres des antisérums sont testés 3 semaines après la dernière injection et, comme ils sont satisfaisants

(dilution < 1:500) tels que déterminés par ELISA, on ad-

ministre 50 pg d'antigène par voie intraveineuse aux ani-

maux Quatre jours plus tard, l'hybridation est effectuée selon la méthode de Kahler & Milstein (Nature, 256, 496, 1975) Des cellules de rate immunisées provenant de deux

souris, sont fusionnées avec NS-1 ou des cellules de myé-

lome correspondants et les cellules fusionnées sont dépo-

sées sur des plaques de microtitrage à 96 puits, à rai-

son d'environ 2 105 cellules/puits; des cellules de péritoine de souris (macrophages) sont utilisées comme

cellules d'alimentation ( 6 o 103) Les cellules sont culti-

vées dans un milieu HAT sélectif (DMEM contenant 10 4 M d'hypoxanthine, 10-7 M d'aminopeptine, 1,6 x 10 M et 20 % de FCS) pendant 3 4 semaines Le milieu ne laisse se

développer que les cellules hybrides On teste la produc-

tion d'anticorps par les cellules avec ELISA et en géné-

ral, environ 10 % des puits sont positifs La spécificité des anticorps est aussi testée par la technique utilisée en Occident d'immuno-transfert sur papier filtre et de

coloration immunologique.

La méthode ELISA est réalisée avec des plaques de microtitrage à 96 puits On introduit environ 50 à 100 ng d'antigène dans chaque puits et l'on sèche Des sites de liaison libres sont bloqués par incubation pendant 3 Q minutes avec 50 pl de 1 % de FCS et les puits sont

lavés avec du PBS On ajoute alors des supernageants hy-

brides comme antisérums dans les puits ( 50 PI) et on incube Apres lavage avec du PBS, on ajoute 50 pil d'une

solution d'anti-Ig G de souris de cheval biotinylée conte-

nant 1 % de FCS et on incube pendant 30 minutes, puis on

lave avec du PBS Après cela, un réactif d'avidine-biotine-

peroxydase est ajouté et incubé Puis, on ajoute le sub-

strat de peroxydase ( 0,01 % d'o-dianisidine, 0,0 1 %

de H 202 dans du PBS) et l'on mesure la couleur brune for-

mée dans un spectrophotomètre Titertek Multiscan.

La technique utilisée en Occident d'immuno-

transfert sur papier filtre peut être utilisée pour mieux i O caractériser les anticorps, parce qu'elle montre avec exactitude les chaînes de polypeptide avec lesquelles réagit l'anticorps L'antigène ou un mélange protéinique

contenant l'antigène, est d'abord séparé par électropho-

rèse sur un gel de polyacrylamide avec 10 % de dodécyl-

sulfate de sodium, après quoi, les protéines sont transférées

horizontalement sur une feuille de nitrocellulose en uti-

lisant un courant de 0,1 A pendant une nuit La feuille est

alors colorée avec une solution de coloration d'héparine-

toluidine Les bandes de nitrocellulose contenant la pro-

téine sont alors découpées et la couleur enlevée avec une solution ( 50 % d'éthanol, 8 % d'acide acétique, 42 %

d'eau) L'immunocoloration des bandes est ensuite effec-

tuée avec la même méthode que celle qui est utilisée dans ELISA Des anticorps positifs donnent une couleur brune

de l'antigène seulement, mais il faut noter que, si l'an-

ticorps est dirigé contre une structure tertiaire de l'an-

tigène, on peut obtenir un résultat négatif parce que les protéines sont dénaturées pendant l'électrophorèse sur gel.

EXEMPLE 4

Immunocoloration de collagénase de type IV.

On a utilisé de l'antisérum de lapin vis-à-vis

de collagénase purifiée de souris de type IV pour étu-

dier la localisation de l'enzyme dans des tissus humains du sein normal et du cancer malin du sein Des lamelles traitées par le froid ( 5 pm d'épaisseur) provenant de 10 échantillons de tissu normal du sein et 25 échantillons de tissu cancéreux du sein, sont pré-incubées avec l %

de FCS et ensuite lavées avec du PBS Après cela, l'anti-

sérum (dilution 1:50) est incubé avec les échantillons

* pendant 2 heures à 2 OC, puis lavé avec du PBS Les lamel-

les sont ensuite incubées avec-un antisérum de lapin, de chèvre conjugué avec du FITC pendant une nuit à 4 WC et

lavées avec du PBSO La fluorescence est alors étudiée.

Les résultats ont montré qu'aucun des tissus normaux n'est

coloré, tandis que tous les 25 tissus cancéreux fournis-

sent une fluorescence nette La coloration est la plus in-

tense dans la bordure des tumeurs envahissantes et entre

et 80 % des cellules tumorales sont positives.

On a utilisé des anticorps monoclonaux spécifi-

ques collagénase de type IV de cellules de sarcome humain HT-1080 pour colorer des cellules cultivées HT-1080, des

cellules de carcinome du sein humain (MCF-7) et des fibro-

blastes de peau humaine Les cellules sont cultivées sur des couvre-objets jusqu'à sous-confluence et fixées avec du méthanol à -20 WC pendant 10 minutes Les cellules sont ensuite pré-incubées avec 1 % de FCS et lavées avec du PBS,

après quoi elles sont incubées avec les anticorps de sou-

ris pendant 2 heures à 200 C et lavées Ensuite, les cellu-

les sont incubées pendant 30 minutes avec de l'anti-Ig G de souris de cheval biotinylé, lavées et incubées avec un réactif d'avidine-biotineperoxydase Enfin, les cellules

sont incubées avec le substrat de peroxydase Les anti-

corps fournissent une coloration nette des cellules ma-

lignes HT-1080 et MCF-7, tandis que les fibroblastes sont négatifs. Les deux exemples d'immuno-coloration indiquent

que les anticorps vis-à-vis de collagénase de type IV peu-

vent détecter des cellules tumorales malignes ayant des

propriétés envahissantes.

L 5463 O z

Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'inven-

tion ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre de réalisation et d'application qui viennent d'être

décrits de façon plus explicite; elle en embrasse au con-

traire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni

de la portée, de la présente invention.

L 546302

Claims

REVEND I CATIONS

1. Enzymes dégradant le collagène de la membrane fondamentale, caractérisées en ce qu'elles sont utiles pour

la détection de cellules malignes avec activité métastati-

que.

2. Enzymes dégradant le collagène de la membrane fondamentale suivant la revendication 1, caractérisées en ce que l'enzyme est uneprotéinase métallique et le substrat

est du collagène de type IV.

3 Enzymes dégradant la membrane fondamentale suivant la revendication 1, caractérisées en ce qu'elles comprennent des antigènes collagénase purifiés de type IV,

qui ont un poids moléculaires d'environ 70 000 et consis-

tent en 2 chaînes polypeptiques ayant un poids moléculaire

d'environ 62 000 à 68 000, tel que déterminé par électro-

phorèse sur gel.

4. Enzymes dégradant la membrane fondamentale

suivant l'une quelconque des revendications 1, 2 et 3, ca-

ractérisées en ce que les antigènes collagénases purifiées

de type IV, sont marqués avec un marqueur convenable.

5. Compositionsd'anticorps utiles pour la détec-

tion de cellules malignes avec activité cellulaire mé-

tastatique, caractérisées en ce qu'elles comprennent des

anticorps spécifiques des antigènes collagénases de type IV.

6 Compositions d'anticorps suivant la revendi-

cation 5, caractérisées en ce qu'elles comprennent de l'an-

tisérum récupéré à partir du sérum du sang d'animaux, aux-

quels on a inoculé au préalable des antigènes collagénases

purifiés de type IV.

7 Compositions d'anticorps suivant la revendi-

cation 5, caractérisées en ce qu'elles comprennent des an-

ticorps monoclonaux -de ces antigènes collagénases de type IV.

8. Compositions d'anticorps suivant l'une quel-

conque des revendications 5, 6 et 7, caractérisées en-ce

que ces anticorps sont marqués avec des marqueurs convena-

bles. 2546302 l

9. Compositions d'anticorps suivant l'une quel-

conque des revendications 5, 6, 7 et 8, caractérisées en

ce que ces anticorps sont fixes à des supports solides con-

venables.

10 Méthode immunologique utile pour la détec-

tion de cellules malignes avec activité cellulaire, mé-

tastatique, caractérisée en ce qu'elle comprend la déter-

mination d'antigènes collagénases de type IV dans des

échantillons biologiques, à l'aide d'anticorps de ces an-

tigènes collagénases de type IV.

11. Méthode suivant la revendication 10, carac-

térisée en ce que ces anticorps sont marqués avec des mar-

queurs convenables.

12. Méthode suivant l'une quelconque des reven-

dications 10 et 11, caractérisée en ce que les anticorps

sont fixes à un support solide convenable.

13. Méthode immunologique utile pour la détec-

tion de cellules malignes avec activité cellulaire métasta-

tique, caractérisée en ce qu'elle comprend la détermination

de l'antigène collagénase de type IV à l'aide d'un immuno-

titrage de concurrence utilisant des antigènes collagéna-

ses de type IV marqués ainsi que des anticorps de cet an-

tigène.

14. Méthode suivant la revendication 13, carac-

térisée en ce que les antigènes collagénases de type IV

sont fixes à des supports solides convenables.

15. Méthode de coloration immunologique utile

pour la détection de cellules malignes avec activité cel-

lulaire métastatique, par la détermination d'antigène colla-

génase de type IV dans des échantillons biologiques, ca-

ractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes: (a) on incube des cellules ou des lamelles de

tissu avec un premier anticorps spécifique de ces antigè-

nes collagénases de type IV; (b) on laisse ces premiers anticorps sefixer à cet antigène; et

(c) on ajoute un second anticorps marqué au pre-

mier anticorps, cet anticorps marqué se fixera au premier

anticorps en indiquant ainsi la présence d'antigène colla-

génase de type IV dans l'échantillon.

16 Méthode immunologique utile pour la détection

de cellules malignes avec activité cellulaire métastati-

que par détermination d'antigène collagénase de type IV dans des échantillons biologiques, caractérisée en ce qu'elle camprend les étapes suivantes: (a) on incube un antigène collagénase de type IV

marqué avec un premier anticorps spécifique de cet anti-

gène, en présence de l'échantillon à tester; (b) on laisse se dérouler la réaction, si bien que l'antigène collagénase de type IV de l'échantillon va entrer en concurrence avec l'antigène collagénase de type IV marqué, pour réagir avec l'anticorps; (c) on sépare le complexe antigèneanticorps ainsi formé; et

(d) on détermine la quantité d'antigène collagé-

nase marque de type IV, dans le complexe ou dans le surna-

geant.

17. Méthode immunologique utile pour la détection de cellules malignes avec activité cellulaire métastatique par détermination d'antigène collagénase de type IV dans des échantillons biologiques, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes:

(a) on incube des anticorps des antigènes colla-

génases de type IV avec un échantillon; (b) on laisse l'antigène (collagénase de type IV) se fixer sur l'anticorps; (c) on ajoute un second anticorps marqué qui se fixera en un site différent de l'antigène (collagénase de type IV); et (d) on mesure la quantité d'anticorps marqué qui n'est pas capable de se fixer à l'antigène (collagénase

de type IV).

18. Méthode de purification, caractérisée en

ce que les antigènes (collagénases de type IV) sont puri-

fiés à l'aide d'anticorps spécifiques de ces antigènes (collagénase de type IV), ces anticorps étant fixés à des supports solides convenables.