FI96224B - Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen A83543-yhdisteen valmistamiseksi - Google Patents

Description

-96224

Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen A83543-yhdis-teen valmistamiseksi

Jakamalla erotettu FI-patenttihakemuksesta 896053 5 Tämä keksintö koskee menetelmää uuden makrolidiyh-disteryhmän valmistamiseksi. Makrolidit ovat aktiivisia hyönteis- ja punkkimyrkkyinä. Uusille hyönteis- ja punkki-myrkyille on vakava tarve, koska kohde-eliöt ovat nopeasti 10 tulossa resistenteiksi nykyisin käytössä oleville hyönteis- ja punkkimyrkyille. Resistenssi hyönteismyrkyille on laajalle levinnyt niveljalkaisissa ainakin 400 lajin ollessa resistentti ainakin yhdelle hyönteismyrkylle. Resistenssin kehittyminen vanhemmille hyönteismyrkyille, kuten 15 DDT:lie, karbamaateille ja organofosfsateille, on hyvin tunnettu. Kuitenkin resistenssiä on kehittynyt jopa joillekin uudemmille pyretroidihyönteismyrkyille ja -punkki-myrkyille. Siksi on tarvetta uusille hyönteis- ja punkki-myrkyille.

20 Ektoparasiittien, kuten kirppujen, punkkien, pure vien kärpästen ja sen kaltaisten, torjunta on pitkään tunnustettu tärkeäksi ongelmaksi karjanhoidossa. Perinteiset hoidot kotieläimille olivat paikallisesti annettuja hyönteismyrkkyjä, kuten kuuluisat lampaiden upotuskäsittelyt. 25 Tosiaankin tällaiset käsittelyt ovat yhä laajassa käytös-sä. Nykyisin kuitenkin tutkimuksen pääpaino on ollut löytää yhdisteitä, joita voidaan antaa eläimille, erityisesti suun kautta, ja jotka torjuisivat ektoparasiittejä myrkyttämällä parasiitin, kun se saa sisäänsä käsitellyn eläimen 30 verta.

Tämä keksintö koskee uutta fermentaatiotuotetta nimeltään "A83543", joka koostuu yksittäisistä komponenteista A83543A, A83543B, A83543C, A83543D, A83543E, A83543F, A83543G, A83543H ja A83543J. A83543 ja yksittäi-35 set A83543-komponentit ovat hyödyllisiä hyönteisten tor- -.96224 2 juntaan, erityisesti Lepidoptera-lajien, kuten "Southern armyworm", ja Diptera-lajien, kuten raatokärpäsen, pisto-kärpäsen ja hyttysen, tuoden siten köytettäväksi hyönteis-myrkkykoostumuksia ja menetelmiä hyönteis- ja punkkipopu-5 laatioiden vähentämiseksi käyttäen A83543-yhdisteitä.

Keksinnön kohteena on menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen A83543-yhdisteen valmistamiseksi, jolla on kaava 1:

RO

10 15 \r— R3 20 jossa R on H tai ryhmä <CH3)2N-k. CHg (CH3)NH->. CH3 - ” (») (b) 30 NHa-K^CHa (CH3)2N—^ ; “ tai CH3 ^ (c) (d)

II

- 96224 3 R2 on 5 λΙλλ R1, R3, R5 ja R6 ovat vety tai metyyli; ja R4 on metyyli tai etyyli; 10 tai sen happoadditiosuolan valmistamiseksi, kun R on muu kuin vety.

Tämän keksinnön mukaisesti valmistettavat edulliset yhdisteet, valmistamisen helppouden kannalta, ovat niitä, joissa R, R1, R3, R4, R5 ja R6 esiintyvät jonakin seuraavis-15 ta yhdistelmistä: R Rl R3 R4 R5 R6 2Q (a) Me H Et Me Me (b) Me H Et Me Me (c) Me H Et Me Me (a) Me Me Et Me Me (a) Me H Me Me Me 2g (a) H H Et Me Me (d) Me H Et Me Me (a) Me H Et H Me

(a) Me H Et Me H

H Me H Et Me Me _ _ H Me Me Et Me Me 30 H Me H Me Me Me .H H H Et Me Me H Me H Et H Me

H Me H Et Me H

35 - - 96224 4 tai niiden happoadditiosuoloja, kun R on muu kuin vety.

A83543A:n aminosokerin on osoitettu olevan B-D-fo-rosamiini, ja neutraali sokeri A83543A:ssa on a-2,3,4-tri-O-metyyliramnoosi.

5 Yhdeksän A83543-komponenttia on karakterisoitu.

Nämä komponentit ovat kaavan 1 mukaisia yhdisteitä, joissa R on muu kuin H. Niillä on seuraavat rakenteet: R R1 R3 R4 Rs R6 10 Yhdiste A (a) Me H Et Me Me B (b) Me H Et Me Me C (c) Me H Et Me Me D (a) Me Me Et Me Me 15 E (a) Me H Me Me Me F (a) H H Et Me Me G (d) Me H Et Me Me H (a) Me H Et H Me

J (a) Me H Et Me H

20

Aminosokeri voidaan poistaa A83543-komponenteista pseudoaglykonien (kaavan 1 mukaisten yhdisteiden, joissa R « H) saamiseksi. Komponenteilla A, B, C ja G on yhteinen 25 pseudoaglykoni (A83543A:n pseudoaglykoni eli pseudo-A).

A83543A:n pseudoaglykonia havaittiin myöhemmin tuotettavan luonnollisesti A83543-komponenttina. Kullakin komponenteista D, E, F, H ja J on omanlaisensa pseudoaglykoni. A83543:n pseudoaglykoneilla on seuraavat rakenteet:

II

- 96224 5 a R1 R3 R4 R5 R6

Pseudoaglykoni A83543A Me B Et Me Me 5 A83543D Me Me Et Me Me A83543E Me H Me Me Me A83543F H H Et Me Me A83543H Me H Et H Me

A83543J Me H Et Me H

aR = H

Pseudoaglykonit ovat hyödyllisiä välituotteina esimerkiksi A83543-komponentteihin.

15 Seuraavissa kappaleissa esitetään tiivistelmä A83543-komponenttien ja -pseudoaglykonien fysikaalisista ja spektriominaisuuksista. Jäljempänä tulevissa tarkasteluissa käytetään seuraavia lyhenteitä: EI-MS: elektroni-impaktimassaspektrometria 20 FAB-MS: nopea-atomipommitusmassaspektrometria FD-MS: kenttädesorptiomassaspektrometria HPLC: korkean suorituskyvyn nestekromatografia IR: infrapuna NMR: ydinmagneettinen resonanssi 25 UV: ultravioletti A83543A:n ominaispiirteitä Molekyylipaino: 731 Empiirinen kaava: C41H65NO10 FD-MS: katso kuvio 4 30 FAB-MS (M+l): Havaittu: 732,4706; Laskettu * C41H66NO10 * 732,4687 (katso kuvio 8) « EI-MS: Havaittu: 731,4612; Laskettu: 731,4608 (katso kuvio 10) UV (EtOH)λ max: 243 nm (6 8920) - 96224 6 IR (CHClj): Ό (laktoni) 1713; (konjugoitu ketoni) 1657; monia huippuja C-H -värähtelyille 2940 paikkeilla ja C-0 -värähtelyille 1060 cm-* paikkeilla (katso kuvio 1) [a]D529: -121,8° (c 1,03, CHC13) 5 [a]D365: +6,8° (c 1,03, CHC13) I)

Taulukko I esittää yhteenvedon A83543A:lle havai tusta 1H- ja 13C-NMR-datasta (asetoni-d6:ssa).

Taulukko I: A83543A:n 3Η- ja 13C-NMR-data asetoni- - 96224 7 d6: ssa.

5 ___

Asema 13q ljja 1 172.02 10 2 3383 3,07/2,45 3 48'13 2,94 4 41,65 3.48 5 129.12 5*86 6 129 66 5.89 7 41,46 2,15 8 36,50 1,99/1,34 15 9 76 ?31+ 4.31 10 37*65 2,36/1,36 11 46',42 0,93 12 49,74 2,87 13 147.78 7,01 14 144*27 15 202,46 16 47,74 3,30 20 17 80.41 3,53 18 30*,33 1,51 19 21,85 1,78/1,17 20 34,45 1,50 21 76,24+ 4,66 22 28,51 1,48 23 8,97 0 <81 25 24 15,71 1,12 : 1' 96.34 4,81 2’ 77,61 3,51 3’ 81.87 3,37 4’ 82,43 3,00 5’ 68,03 3,48 6' 17,64 1>18 30

Taulukko I: A83543A:n 1H- ja 13C-NMR-data asetoni- d6:ssa (jatkoa).

96224 8 * 13C 1Ha

Asema ^ 5 2'-OCH3 56,66* 5737 31-OCH3 58 i39* 3,41 4'-OCH3 60,12 3,45 1" 103,45 4,45 2” 31,24 1,92/1,37 3" 18,14 1,84/1^52 4" 65,34 2,12 in 5" 73.35 3,56 6 * ' 18.87 1,21 N(CH3)2 40,38 2,22 “Jotkin mittausarvot otettiin lH/13C-korrelaatiosta.

15 + ,*Samalla yläindeksillä varustetut resonanssit voi vat olla keskenään toisinpäin.

A83543B:n ominaispiirteitä Molekyylipaino: 717 Empiirinen kaava: C40H63NO10 20 FAB-MS: (katso kuvio 9) A83543C:n ominaispiirteitä Molekyylipaino: 703 Empiirinen kaava: C39H61N010 FD-MS: (katso kuvio 5) 25 A83543D:n ominaispiirteitä

Molekyylipaino: 745 Empiirinen kaava: c«h67no10 UV (EtOH)p(max: 244 nm (6 9910) IR (CHClj): \) (laktoni) 1708; (konjugoitu ketoni) 30 1658; monia huippuja C-H -värähtelyille 2940 paikkeilla ja C-0 -värähtelyille 1070 cm-1 paikkeilla (katso kuvio 2) [a]D389: -142,9° (c 1,02, CHC13) [a]D365: -29,9° (c 1,02, CHC13) FD-MS: katso kuvio 6

II

Taulukko II esittää yhteenvedon A83543D:lle havai tusta 1H- ja 13C-NMR-datasta ( asetoni-d6: ssa).

Taulukko II: A83543D:n 3H- ja 13C-NMR-data asetoni- - 96224 9 d6: ssa.

5

Asema 13C 1H3 10 -- 1 172,68 2 34,38 3,08/2.43 3 49,01 2,90' 4 42,83 3,47 5 123.27 5,54 6 137,26 6-CH3 20,81 1.74 7 44,41 2 j18 8 35.61 2,01/1.45 9 76.72 4.32 10 38^64 2,37/1,37 11 47,04 1,02 12 50,05 2.78 20 13 148,47 7*04 14 145,19 15 203,16 16 48,47 3,30 17 81,03 3,53 18 30,99 1.49 19 22,51 1.70/1.19 20 35,12 ’1,49· .z:> 21 76,84 4.65 22 29,16 1.48 23 9,55 0.81 24 16,32 1.12 1' 97,11 4.85 2' 78,33 3 i 54 3' 82,58 3,40 30

Taulukko II: A83543D:n ΧΗ- ja 13C-NMR-data asetoni- d6:ssa (jatkoa).

- 96224 10

Asema 13C ijja 5 41 83.15 3,03 5' 68.71 3,50 6' 18 ^ 26 1,18 2'-0CH3 57.31* 3,40 3'-OCH3 59,02* 3,43 4 *-OCH3 60,71 3,47 1" 104,14 4,47 10 2' * 31,96 1,94/1,39 3'' 18,83 1,81/1,49 4'' 66,06 2,12 5” 74,12 3,55 6" 19:42 1,20 N(CH3)2 40,99 2,21 15 -— •Jotkin paikanmääritykset tehtiin 1H/13C-korrelaation perusteella.

'Resonanssit voivat olla keskenään toisinpäin. A83543E:n ominaispiirteitä 20 Molekyylipaino: 717

Empiirinen kaava: C40H63NO10 FAB-MS (M+l): Havaittu: 718,4526; Laskettu C4oH6iN010 = 718,4530 UV (EtOH)Λ max: 244 nm (6 8600) .25 IR (KBr) (katso kuvio 13) « 11 96224 11

Taulukko III esittää yhteenvedon A83543E:lle havaitusta 1H- ja 13C-NMR-datasta (asetoni-d6: ssa).

Taulukko III: A83543E:n XH- ja 13C-NMR-data asetoni- d6: ssa.

5

Asema 13C XH

10 1 172,46 2 34,95 3,06/2,40 3 48,88 2.95 4 42,11 3,43 5 129,78 5,86 6 130,39 5,90 7 42,11 2.14 8 37,18 1r96/1,39 9 77,06 4,33 10 38,31 2.36/1,36 11 47.18 0.93 12 50,40 2,86 13 148,37 7,06 14 144,84 15 203.09 20 16 48.’05 3,34 17 81,35 3,55 18 34,98 1,62/1,48 19 22,25 1,77/1,13 20 33,73 1,50 21 72,97 4,68 22 21,61 1,12 23 25 24 16,52 1,13 1' 97,11 4,83 2' 78,36 3,55 3' 82,55 3,37 4' 83,13 3,02 5' 68,72 3,50 6’ 18 r26 1,18 30 -,96224 12

Taulukko III: A83543E:n ΧΗ- ja 13C-NMR-data asetoni-d6:ssa (jatkoa).

» 13 r 1 Ha

Asema c 5 2'-OCH3 59,01 3,43 3’-OCH3 57,30 3,40 4’-OCH3 60.69 3,46 1" 104^24 4,47 2" 32.00 1,93/1.39 3” 18 ^ 86 1,82/1,50 4 * 1 66)06 2,12 5" 74,13 3,57 10 6·» 19,42 1,21 N(CH3)2 40,99 2,21 "Jotkin mittausarvot otettiin ^/^C-korrelaatiosta. 15 A83543F:n ominaispiirteitä

Molekyylipaino: 717 Empiirinen kaava: C40H63NO10 FAB-MS (M+l): Havaittu: 718,4534; Laskettu C40H64NO10 = 718,4530 20 UV (EtOH)Amax: 243 nm (e 10500) ja 282 nm (e 109) IR (KBr) (katso kuvio 14)

II

Taulukko IV esittää yhteenvedon A83543F:lle havai tusta XH- ja 13C-NMR-datasta (asetoni-d6:ssa).

Taulukko IV: A83543F:n 1H- ja 13C-NMR-data asetoni- - 96224 13 d6: ssa.

5

Asema i3C ijja 1n 1 172.60 2 34|50 3,06/2,42 3 48,82 2,95 4 42,46 3,45 5 129,56 5,87 6 130,39 5.92 7 42.19 2416 8 37 418 1,97/1,35 15 9 77^15 4.65 10 38,30 2,33/1,34 11 46,89 0,94 12 50,34 2,84 13 148,86 7,03 14 145,73 15 198,68 2o 16 45,49 3,22/2,50 17 74,17 3,58 18 30,74 1,52 19 22,41 1f 70/1,17 20 34,45 1,51 21 77,09 4,32 22 29,05 1,48 23 9,56 0,81 : 25 1* 97,19 4.83 2' 78,38 3,53 3' 82.58 3,38 4' 83\15 3,00 5' 68,74 3,48 6' 18,25 1,18 30

Taulukko IV: A83543F:n 1H- ja 13C-NMR-data asetoni- d6:ssa (j atkoa).

- 96224 14 . Uf i Ha

Asema n 5 2'-0CH3 59,02 3,43 3’-OCH3 57.31 3,40 41-OCH3 60'69 3.47 lff 100,19 4,53 2" 32.41 1,80/1,38 3'1 18,86 1,83/1,53 4” 66,16 ‘2,13 10 5’’ 74,01 4,01 6 * * 19,46 1,22 N(CH3)2 41,01 2.22 ‘Jotkin mittausarvot otettiin 1H/13C-korrelaatiosta. 15 A83543G:n ominaispiirteitä

Molekyylipaino: 731 Empiirinen kaava: C41H65NO10 FAB-MS (M+l): Havaittu: 732,4661; Laskettu C41H66NO10 = 732,4687 20 UV (EtOH) λ max: 243 nm (6 8970) IR (KBr) (katso kuvio 15) 11 - 96224 15

Taulukko V esittää yhteenvedon A83543G:lle havaitusta ΧΗ- ja 13C-NMR-datasta (asetoni-d6:ssa).

Taulukko V: A83543G:n ‘h- ja 13C-NMR-data asetoni- d6: ssa.

5

Aseina 13c *** 10 1 172r59 2 34 f 67 3,04/2<46 3 48,72 2,94 4 42,25 3,50 5 129,85 5.84 6 130.26 5,89 7 42.'02 2,14 8 37;12 1,95/1,34 15 9 76.99 4.32 10 38^28 2,36/1,36 11 47123 0,91 12 50.43 2,87 13 148 j 28 7,04 14 144.61 15 203^20 20 16 47,94 3,30 17 81.73 3,57 18 35|20 1,55 19 21,68 1,64/1,16 20 31,41 1,64/1,36 21 76,47 4,64 22 28,84 1,48 23 9,61 0,80 25 24 15,29 1,18 ; 1' 96,98 4,81 2» 78,23 3,52 3' 82,46 3,37 4' 83,05 2.29 5» 68,64 3,49 6' 17,18 1,12 30 - 96224 16

Taulukko V: A83543G:n ja nC-NMR-data asetoni- dt:ssa (jatkoa).

. 13r> «H®

Asema u ” 2’-OCH3 —— 50 f97 3,42 5 3 *-OCH3 57 r 25 3,39 4'-OCH3 60,70 3,46 1*« 99,51 4,00 2” 29,62 1,07/1.48 3 ’ * 19,31 1,73 4'» 62.13 2,29 5" 69.93 4,20 10 6' ' 18,22 1(^-7 N(CH3)2 43,47 2.24 “Jotkin mittausarvot otettiin 1H/l3C-korrelaatiosta. 15 A83543H:n ominaispiirteitä

Molekyylipaino: 717 Empiirinen kaava: C„HMNO10 UV (EtOH) max: 243 nm (6 10100)* IR (KBr): katso kuvio 16* 20 * määritetty A83543 H:J -seoksesta (58:42) A83543J:n ominaispiirteitä Molekyylipaino: 717 Empiirinen kaava: C40H63no10 UV (EtOH) max: 243 nm (€ 10100)* 25 IR (KBr): katso kuvio 16* * määritetty A83543 H:J -seoksesta (58:42) A83543H ja J erotettiin A83543:sta seoksena (H:J-suhde * 58:42), joka voidaan erottaa analyyttisellä korkean suorituskyvyn nestekromatografiällä (HPLC:llä), kuten 30 jäljempänä kuvataan. A83543H:lle ja J:lle määritetyt rakenteet perustuvat A83543 H:J-seoksen *Η- ja 13C-NMR-tutki-muksiin asetoni-d6: ssa. NMR-spektrit muistuttavat A83543A:n vastaavia, ja niitä vertailtiin näihin. Suurimmat muutokset H:n ja J:n spektreissä keskittyvät ramnoosisokerin ym-35 pärille. Komponenteissa H ja J on vain kaksi OCH3-ryhmää 11 - 96224 17 tässä sokerissa. Komponentissa H, H-l' on siirtynyt noin 0,1 δ 1H-NMR-spektrissä ja 3 6 13C-NMR-spektrissä (vastaavasti 4,81 ja 99,68). Nämä siirtymät johtuvat metyyliryh-män puuttumisesta 2'-aseman metoksista. Siirtymät kompo-5 nentissa J vastaavat samankaltaista metyyliryhmän puuttumista 3'-aseman metoksista.

A83543A-pseudoaglykonin ominaispiirteitä Molekyylipaino: 590 Empiirinen kaava: C33HS0O9 10 UV (EtOH)λ max: 243 nm (€ 10300) IR (CHC13): v (laktoni) 1724; (konjugoitu ketoni) 1652; monia huippuja C-H -värähtelyille 3017 paikkeilla; monia huippuja C-0 -värähtelyille 1140 cm-1 paikkeilla (katso kuvio 3) 15 FD-MS: katso kuvio 7 EI-MS: katso kuvio 11 A83543D-pseudoaglykonln ominaispiirteitä Molekyylipaino: 604 Empiirinen kaava: C34H5209 20 A83543-komponentit voidaan erottaa toisistaan käyt

täen jotakin seuraavista analyyttisistä HPLC-systeemeistä: Systeemi I

Pylväs: ODS, 3 μ, 4,5 x 50 mm (IBM)

Ajoliuos: CH30H:CH3CN:H20 (2:2:1) 25 Virtausnopeus: 1,0 ml minuutissa

Detektio: UV aallonpituudella 245 nm Lämpötila: Huoneenlämpö

Komponentti Retentioaika (minuuttia) 30 A 8,50 B 6,15 C 3,92 D 11,47 - 96224 18

Systeemi II

Pylväs: 4,6 x 100 mm, ODS (AQ-301, S-5; YMC, Inc.,

Mt. Freedom, NJ)

Ajoliuokset: CH3OH:CH3CN:0,05 % NH40Ac(H20) 5 (A) 35:35:30 - pH 7,8 (B) 45:45:10 - pH 6,7 Virtausnopeus: 2,0 ml minuutissa Ajoaika: 35 minuuttia Detektio: UV aallonpituudella 250 nm 10 Gradientti: 10 %:sesta B:stä 25 %:seen B:hen 20 minuutissa; 50 %:seen B:hen 30 minuutissa

Komponentti Retentioaika (minuuttia) A 22,62 15 A-pseudoaglykoni 7,27 B 12,65 C 10,62 D 25,47 E 19,22 20 F 16,30 G 18,92 H 16,30 J 17,50

. 25 Systeemi III

Pylväs: 4,6 x 100 mm, ODS (AQ-301, S-5; YMC, Inc.,

Mt. Freedom, NJ)

Ajoliuokset: CH3OH:CH3CN:0,05 % NH40Ac(H20) 35:35:30 - pH 6,0 30 Virtausnopeus: 2,0 ml minuutissa

Ajoaika: 10 minuuttia Detektio: UV aallonpituudella 250 nm

II

- 96224 19

Komponentti Retentioaika (minuuttia) F 4,32 H 3,42 J 3,42 5 A83543-komponentit eivät ole liukoisia veteen, mutta ovat liukoisia sellaisiin liuottimiin kuten metanoliin, etanoliin, dimetyyliformamidiin, dimetyylisulfoksidiin, asetonitriiliin, asetoniin ja näiden kaltaisiin.

10 A83543 ja yksittäiset komponentit, kuten A83543A, A83543B, A83543C, A83543D, A83543E, A83543F, A83543G, A83543H ja A83543J voivat reagoida muodostaen erilaisia suoloja. Kaikki tällaiset näiden yhdisteiden muodot ovat osa tätä keksintöä. A83543-suolat ovat hyödyllisiä esimer-15 kiksi A83543:n eristämiseksi ja puhdistamiseksi. Lisäksi joillakin suoloilla on parempi liukoisuus veteen.

A83543-suoloja valmistetaan käyttäen normaaleja suolanvalmistusmenetelmiä. Esimerkiksi A83543 voidaan neutraloida sopivalla hapolla happoadditiosuolan muodosta-20 miseksi.

Happoadditiosuolat ovat erityisen edullisia. Edustaviin soveliaisiin suoloihin kuuluvat ne suolat, jotka muodostetaan tavanomaisilla reaktioilla yhtä hyvin orgaanisten kuin epäorgaanisten happojen kanssa, kuten esimer-25 kiksi rikki-, suola-, fosfori-, etikka-, meripihka-, sitruuna-, maito-, maleiini-, fumaari-, koliini-, pamoiini-, musiini-, glutamiini-, kamferi-, glutaari-, glykoli-, ftaali-, viini-, muurahais-, lauriini-, steariini-, sali-syyli-, metaanisulfoni-, bentseenisulfoni-, sorbiini-, 30 pikriini-, bentsoe- ja kanelihapon ja näiden kaltaisten happojen kanssa.

Keskusteltaessa hyödyllisyydestä, termi "A83543-yhdiste" tarkoittaa edullisesti jäsentä ryhmästä A83543, yksittäiset komponentit A83543A, A83543B, A83543C, - 96224 20

A83543D, A83543E, A83543F, A83543G, A83543H ja A83543J

sekä niiden happoadditiosuolat.

Fermentaatiotuotetta A83543 tuotetaan viljelemällä uuden mikro-organismin Saccharopolyspora spinosan kantaa, 5 joka voi olla NRRL 18395, NRRL 18537, NRRL 18538 ja NRRL 18539 tai näiden A83543:a tuottava mutantti, aerobisissa olosuhteissa pinnanalaisessa viljelyssä soveliaassa elatusaineessa, kunnes talteen otettavissa oleva määrä A83543:a on muodostunut. Kuten fermentaatioprosessien am-10 mattimiehet huomaavat, A83543:n komponenttien suhteet tulevat vaihtelemaan riippuen sen tuottamiseen käytetyistä fermentaatio-olosuhteista. Yleensä A83543 sisältää noin 85-90 % A83543A:ta, noin 10-15 % A83543D:tä ja pieniä määriä A83543B:tä, C:tä, E:tä, F:ä, G:tä, H:ta ja J:tä sekä 15 A83543A-pseudoaglykonia. Yksittäiset komponentit, kuten A83543A, A83543B, A83543C, A83543D, A83543E, A83543F, A83543G, A83543H ja A83543J sekä A83543A-pseudoaglykoni voidaan erottaa ja eristää kuten jäljempänä kuvataan.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle A83543-yhdisteen 20 tuottamiseksi, on tunnusomaista, että viljellään Saccharopolyspora spinosan kantaa NRRL 18395, NRRL 18537, NRRL 18538 tai NRRL 18539 elatusaineessa, joka sisältää assimiloitavissa olevat hiilen, typen ja epäorgaanisten suolojen lähteet, aerobisissa pinnanalaisissa fermen-25 taatio-olosuhteissa, kunnes talteen otettavissa oleva mää rä A83543:a on tuotettu. Yksittäiset komponentit voidaan sitten eristää sinänsä tunnetulla tavalla.

Mukavuuden takia seuraavissa tarkasteluissa kannoille on annettu seuraavat nimet: A83543.1, A83543.3, 30 A83543.4 ja A83543.5. Viljelmä A83543.1 saatiin aiheutta malla kemiallisesti mutaatio viljelmälle (A83543), joka oli eristetty Neitsytsaarilta kerätystä maaperänäytteestä. Viljelmät A83543.3, A83543.4 ja A83543.5 saatiin viljelmän A83543.1 johdannaisista aiheuttamalla kemiallisesti mutaa-35 tioita.

Il - 96224 21

Viljelmät A83543.1, A83543.3, A83543.4 ja A83543.5 on tallennettu ja liitetty osaksi viljelmien varastokoko-elmaa Midwest Area Northern Regional Research Center, Agricultural Research Service, United States Department of 5 Agriculture, 1815 North University Street, Peoria, Illinois, 61604, josta ne ovat yleisölle saatavana seuraavilla hakunumeroi11a: NRRL No. Kanta No.

18395 A83543.1 10 18537 A83543.3 18538 A83543.4 18539 A83543.5

Viljelmän A83543.1 taksonomiset tutkimukset suoritti Frederick P. Mertz Lilly Research Laboratories'ista.

15 Näiden tutkimusten perusteella mikro-organismit A83543.1, Ά83543.3, A83543.4 ja A83543.5 luokitellaan uuden Saccha-ropolyspora-suvun lajin, jota kutsutaan nimellä Saccharo-polyspora sp. nov., jäseniksi. Tämä luokittelu perustuu suoriin laboratoriovertailuihin ja samankaltaisten lajien 20 julkaistujen kuvausten tutkimiseen.

Käytetyt menetelmät

Noudatetut menetelmät olivat niitä, joita kansainvälinen Streptomyces-projekti (International Streptomyces Project, ISP) suosittelee Streptomyces-lajien karakteri-25 sointiin [E. B. Shirling ja D. Gottlieb, "Methods for Characterization of Streptomyces species", Int. J. Syst. Bac-teriol. 16:313-340 (1966)], ja niitä, joita ovat suositelleet Nocardia-lajien karakterisointiin R. E. Gordon, D. A. Barnett, J. E. Handerhan ja C. H. Pang, "Nocardia coe-30 liaca, Nocardia autotrophlca, and the Nocardin Strain", Int. J. Syst. Bacterlol. 24(1), 54-63 (1974)].

Värikarttoja ISCC-NBS Centroid Color Charts, standard sample No. 2106 (National Bureau of Standards, 1958, U.S. Department of Commerce, Washington, D. C.), käytet-35 tiin värinimien määrittämiseksi kääntöpuolelle ja ilmarih-moille.

-.96224 22

Morfologiaa tutkittiin käyttäen optista valomikro-skooppia ja pyyhkäisyelektronimikroskooppia (SEM).

Diaminopimeliinihapon (DAP) ja hiilihydraattien isomeerit kokonaisten solujen hydrolysaateissä selvitet-5 tiin kromatografisin menetelmin, jotka ovat kuvanneet Becker ym. [B. Becker, M. P. Lechevalier, R. E. Gordon ja H. E. Lechevalier, "Rapid Differentiation between Nocardia and Streptomyces by Paper Chromatography of Whole-cell Hydrolysates, Appi. Microbiol♦ 12, 421-423 (1964)] sekä 10 Lechevalier ja Lechevalier [M. P. Lechevalier ja H. Lechevalier, "Chemical Composition as a Criterion in the Classification of Aerobic Actinomycetes", Int. J. Syst. Bacte-riol. 20, 435-443 (1970].

Fosfolipidit määritettiin M. P. Lechevalier'n ja H. 15 Lechevalier'n menetelmällä [teoksessa A University Laboratory Approach, Dietz ja Thayer (toim.), Society for Industrial Microbiology Special Publication No. 6, Arlington, VA, s. 227-233 (1980)].

Menakinonikoostumus määritettiin noudattaen R. M. 20 Kroppenstedtin [teoksessa Chemical Methods in Bacterial Systematics, M. Goodfellow ja D. E. Minnikin (toim.), 1985, s. 173-196] ja M. D. Collinsin (mts. 267-285) menetelmiä.

Resistenssi antibiooteille mitattiin painamalla 25 antibioottiherkkyyskiekkoja ympättyjen ISP No. 2 -agarmal-jojen pinnalle.

Tärkkelyksen hydrolyysi määritettiin testaamalla tärkkelyksen läsnäoloa jodilla ISP No. 4 (epäorgaaniset suolat-tärkkelys) -agarmaljoilla.

30 Rasvahappoanalyysi tehtiin käyttäen HP 5898A mikro- bientunnistussysteemiä [katso L. Miller ja T. Berger, "Bacterial Identification by Gas Chromatography of Whole Cell Fatty Acids", Hewlett-Packard Application Note 228-41, 8 s. (1985)]

II

-96224 23

Rasvahappojen metyyliestereitä tehtiin kylmäkuivatuista kokonaisista soluista, joita oli kasvatettu identtisissä olosuhteissa.

Pääkomponenttianalyysi oli kaksiulotteinen ja tie-5 tokoneella tuotettu. Mittayksiköt pääkomponenttikuvaajassa (näytetty kuviossa 12) ovat standardipoikkeamia.

Mykolihapot määritettiin Minnikinin ehdottamilla menetelmillä [D. E. Minnikin, I. G. Hutchinson ja A. B. Caldicott, "Thin-Layer Chromatography of Methanolysates of 10 Mycolic Acid-Containing Bacteria", J. Chromatography 188, 221-233 (1980)].

Viljelyominaispiirteet

Viljelmä A83543.1 kasvo! hyvin sekä kompleksisilla että määritellyillä elatusaineilla. Viljelmä tuotti ilma-15 myseeliä kaikilla käytetyillä elatusaineilla. Ilmaitiömas-san väri oli valtaosin kellertävän vaaleanpunainen mutta oli valkoinen joukolla elatusaineita.

Kääntöpuoli oli keltaisesta kellanruskeaan. Selkeää pigmentaatiota ei esiintynyt. Liukoinen ruskea väriaine 20 vapautui elatusaineeseen joissakin elatusaineissa.

Viljelyominaispiirteiden yhteenveto esitetään taulukossa VI.

- 96224 24 <0 id fd φ φ φ ^ * tn tn tn Φ 3 3 3 C H k Μ

•H G C C

fd <d rd ffl •Η Φ φ Φ ^ ιΗ ι—I *Η :<d id rtj ro rd id <d > id φ id Φ Φ fd > Ai > X X > C W 1/)(/1 φ *H Ή *H · 3 Ή · 3 -Η -H 3 C WMWrH « W rH 05WWP5 Ή -H 0 a: 3

*H

Cl λ; λ ac φ Αί .¾ C C C H-> cc Φ φ Ή *Η ·Η ·Η Φ ·Η Ή

cu aa χ +J a A

•H -H >, >, >, S -H I >, >, x js i x ~ S JS · · r · 15 I · •h ia a cu ι y aa m >, a atl · ro ro · ... roro - ·

^ CN) lO t—I t-H (—I rH * VO CO rH A

OI (N Π n rororo (Ti CN CN ro ro •H c c c rH φ φ φ φ c c c

φ ·Η Ή *H

m φ <0 its

>, ω usMtnairHrH uirH

6c ro (ä ca co <a <o <o <e 3 ro> m «u «d «s ui m m u-> -p «o w +j e w c > > c ccc x x > c x

Ή (0 3 >. >i 3 333 O O >i 3 O

h« axxA ««« suitsea; « ro +j

Q) -H

Φ Sh 4J :(0

Sh > *r| •H C >1 a <1S rö ui i—ι shShqs as <ush •ho m o -p >< u >H4-i cq >h (0 3 >, -H O 5* -H O -H >1 e a £ X l Xl •H:0 · rH s . · 5 - · 2 = >t E-u -h >i a a >1 ι a >< ι ή σ . · o e ; >i«o · ^ * · ... ....

rH «o CO CO (N ΓΟ U N (N ΓΟ CN CN CO O

as X, ["(NCTir·' co os o r~ cr> σ\ r~ <r> •ro

rH

•H

> e cu e e ·· Ή rH <d • co en tn tn tn rH m m <d td id td fd fdid 3 tn :id »fd tn tn tn tn s<d u »id en *<d m > c>>c ccc > ,c > e > ro tn 3 >i >i 3 333 > O >1 3 >1 co fd es x a: os ts is es x * a: es se

.. < ÄS

φ CN ro LO r- c

.. *H CN

M fd r*-

> φ en h C

C 3 I I I I Λ I

O -H -P ssssViOWS-W -H -H

a; ns ro ι ι ι ι cd sh -p e -p -h e en o» x tn rH a>c-P3HJCA;oo«

33 φ < φ ·Η (0 ·Η Φ CO O

-H4J UCWiO-HaiHAiS

3 (0 AAAAArtJU C >—I I HJ (0 φ 3 Λ io rH c/owwcncnMEHOioio-HNg'-io)

Eh w

II

- .96224 25 id η) <υ id d ft <u ft w x

M3 M

3 P 3

μ C P

CM C

MO) <d

d) E Ή E

C 6 M § •μ 3 id 3

Id E-I > Eh

•H

IH · · -Η -H

id t3 η ω ω Ό > c <u c

•H

0

3 X X <U

η p c e -p

j oq ή ή α> -H

X ft ft P -C

>1 x ·μ s • £ >1 · 3

O’ ft 0* X

•H · Q) P . . . n :<d O *H rH VO · > oo ro m rg a> I^C * . - a) · -π o> ^ « p o i g οι c > u ε <o 0) -H g a) Ph

w (d o CO H

>1 MMM iH ecmm

S3 id id id o id 5 5 ro "L

id> MWMCP T!TJ ^ EM CCCOÄ -ΡΛ **

—* >—) id 33330 OH O) CJ

id h ft ft « ft sc ft <H C to x 3 ® Λ

X3 0) Λ P

10 £ 'O a) 1-1 Eh C ® Ό - (0 ή c id (0 r* *2 p w « 5 k a) h to B ft a/ μ οι (0 -p *.

p 'id u! ή P i> μ t» cn , λ) +h

-μ X ·~\ ,¾ P

•μ C O’-1 r O

Qj d) fl) -H 2 d CO Ή )H >iM e-. S f-f •HO 0Q^^*fTJ0Q O SC «4 ίΤ3 P >1 M>1 U m c a · o . tw · 2 * β

*H *0 · >i >1 · sfl *rl ^ - JJ

E P OOiDi>HE SqJO^ +1

χ .* ..... > ^ Q) C

ι-n Md coooror- -H v (0 - C U

Φ ft x σι in σι x so μ I h μ ‘P

I? Λ (0 e (0 £

μ ,. .h S’ 2 w ® S

> C H(0>Cv ^ r~.

(U N (0 3 ί h CO

C C * (0 S C , § " * (0 -P T-I 3 O P rn Ί M M M " M 5 .2 S * U 8l **

m 3 Id Id Id Id Id CO -H P P CT

«s· > inmwpw ·· P 3 ^ _ O ror5 in M CCCjCC OQ)(0 O Η Π

m id 33303 ο -μ .V * H CO P

co ft ft a ft ft ft Tj , co ό ^ n p

< O P CD 2^n°C

"S!«d5

h 3 t i · · 3 ' i S

> c -μ ο -μ <μ·μ O Ο P ft ft id oem ÄCiO*>5>_j®p ft ω μ h c 3Η(0ΤΪ<0μ>Ι 3 3 at ·μ c ijijp v P r p -μ *μ p μ μ -μ ο Ό <υ ·±Τ>5«Ηλ-Η_ι<1) 3 μ x x > o < < G P fl) (0i2 m μ μ

Id I-1 rH rH Id ft S Q H < Jj m JF b * (d Η W O tn ft Eh Eh X «.ouPCUuB·»» - 96224 26

Morfologiset ominaispiirteet

Viljelmä A83543.1 tuotti laajan alustamyseelin, joka katkeili liuosfermentaatiossa. Katkeilua ei havaittu, kun viljelmää kasvatettiin agarelatusaineella.

5 Valkoisia, pyöreitä pesäkkeitä, 8-10 mm halkaisi jaltaan, keskusta koholla ja kääntöpuolen väri kellanruskea, havaittiin, kun viljelmä maljättiin ISP-elatusaineel-le 1.

Hyvin muodostuneita ilmarihmoja esiintyi useimmilla 10 elatusaineilla. Ilmarihmat olivat jakautuneet pitkiksi itiöketjuiksi, jotka olivat järjestyneet mutkiksi ja avoimiksi silmukoiksi. Myös spiraaleja havaittiin, mutta ne olivat lyhyitä ja epätäydellisiä.

Yleinen morfologia oli Rectus-flexibilis (RA).

15 Ilmarihmoilla oli selvä helminauhamainen ulkonäkö, monin tyhjin aukoin itiöketjussa. Tämä piirre osoitti, että itiöketjua ympäröi itiötuppi. Tämä itiötuppi oli erittäin silmiinpistävien piikkien peittämä. Piikit olivat noin 1 pm pitkiä ja pyöreäpäisiä.

20 Itiön muoto oli pitkulainen ja koko keskimäärin 1,1 x 1,5 pm. Itiöketjun pituus oli pitkälti yli 50 itiötä. Sik-sak-piirteitä, sklerotioita, sporangioita tai liikkuvia soluja ei havaittu.

Fysiologiset ominaispiirteet 25 Viljelmä A83543.1 tuotti happoa seuraavista hiili hydraateista: adonitoli, D-arabinoosi, erytritoli, fruktoosi, glukoosi, glyseroli, mannitoli, mannoosi, riboosi ja trehaloosi.

Viljelmä ei tuottanut happoa seuraavista: L-arabi-30 noosi, sellobioosi, selluloosa, dekstriini, dulsitoli, etanoli, galaktoosi, glykogeeni, inositoli, inuliini, laktoosi, maltoosi, melitsitoosi, melibioosi, a-metyyli-D-glukosidi, raffinoosi, L-ramnoosi, salisiini, sorbitoli, L-sorboosi, sakkaroosi, ksylitoli tai ksyloosi.

Il - 96224 27

Kasvua havaittiin galaktoosilla, maltoosilla ja melitsitoosilla, mutta happoa ei tuotettu näistä hiilihydraateista.

Viljelmä A83543.1 käytti seuraavia happoja natrium-5 suoloina: asetaatti, butyraatti, sitraatti, formiaatti, laktaatti, malaatti, propionaatti, pyruvaatti ja sukki-naatti. Viljelmä ei käyttänyt bentsoaattia, musaattia, oksalaattia eikä tartaraattia.

A83543.1 hajotti allantoiinia, kalsiummalaattia, 10 kaseiinia, elastiinia, hippuraattia, hypoksantiinia, testosteronia, L-tyrosiinia ja ureaa. Se ei pystynyt hajottamaan adeniinia, eskuliinia, guaniinia, tärkkelystä eikä ksantiinia.

A83543.1 tuotti katalaasia, fosfataasia, ureaasia 15 ja H2S:a. Se nesteytti gelatiinia ja pelkisti nitraattia.

Se oli resistentti lysotsyymille eikä tuottanut melanoidi-pigmenttejä. Se ei peptonisoinut eikä hydrolysoinut rasvatonta maitoa. A83543.1 kesti NaCl-tasoja 11 %:in asti, raja mukaanlukien. Se ei kyennyt selviämään kahdeksaa tun-20 tia 50 eC:ssa, mutta kasvoi lämpötiloissa 15-37 ÖC.

A83543.1 oli resistentti kefalotiinille (30 pg), penisilliini G:lie (10 yksikköä) ja rifampisiinille (5 pg). Se oli herkkä basitrasiinille (10 yksikköä), gentamy-siinille (10 pg), linkomysiinille (2 pg), neomysiinille -25 (30 pg), oleandomysiinille (15 pg), streptomysiinille (10 pg), tetrasykliinille (30 pg), tobramysiinille (10 pg) ja vankomysiinille (30 pg).

Soluseinän analyysi

Hydrolysoidut kokonaiset A83543.1-solut sisälsivät 30 meso-diaminopimeliinihappoa. Diagnostiset sokerit kokoso-lu-uutteissa olivat galaktoosi ja arabinoosi. Siis A83543.1:llä soluseinän koostumus on tyyppiä IV ja sokeri-koostumus tyyppiä A (Lechevalier ja Lechevalier, aiemmin mainittu teos). Solut eivät sisällä mykolihappoja.

96224 28

Fosfolipidimääritykset kokonaisista soluista osoittivat fosfatidyylikoliinin ja kardiolipiinin läsnäolon. Fosfatidyylietanoliamiinia ei havaittu. Siis A83543:l:llä on fosfolipidikoostumus tyyppiä PUI [M. P. Lechevalier, 5 A. E. Stern ja H. E. Lechevalier, "Phospholipids in the Taxonomy of Actinomycetes", teoksessa Actinomycetes, Zbl. Bakt Suppl. 11, K. P. Schaal ja G. Pulverer (toim.), Gustav Fischer Verlag, New York, 1981].

Pääasiallinen havaittu menakinoni oli MK-9(H4). Pie-10 ni määrä MK-9(H6):ta havaittiin.

Faagimaljaus

Joukko Streptomycetesin, Saccharopolysporan ja Amy-colatopsisin faageja maljattiin A83543.1:lie. Plakkeja ei havaittu.

15 A83543.1:n identiteetti

Kuten edellä on keskusteltu, viljelmällä A83543.1 on soluseinän koostumus tyyppiä IV ja koko solun sokeri-koostumus tyyppiä A. Seuraavat 13 sukua ovat solun kemialliselta olemukseltaan tällaisia: Nocardia, Rhodococcus, 20 Corynebacterium, Caseobacter, Mycobacterium, Faenia (Mic- ropolyspora), Pseudonocardia, Saccharomonospora, Saccharo-polyspora, Actinopolyspora, Amycolata, Amycolatopsis ja Kibdelosporangium. Nämä suvut eroavat toisistaan mykoli-happojen läsnäolon tai puuttumisen, rasvahappokoostumuksen . 25 sekä fosfolipidi- ja menakinonityyppien perusteella. Fae- nialla, Pseudonocardialla ja Saccharopolysporalla on A83543.1:n kanssa identtiset kemotaksonomiset ominaispiirteet, mutta nämä suvut poikkeavat A83543.1:stä morfologisten ja viljelyominaisuuksien suhteen.

30 Suvulla Faenia (Micropolyspora) on sileät itiöt ja lyhyet itiöketjut, joita on sekä ilma- että alustarihmois-sa. Sen ilmarihmat ovat harvoja ja väriltään valkeita. Se on termofiili, joka kasvaa 60 eC:ssa. A83543.1:llä ei ole mitään näistä ominaisuuksista, ja se on siis eri kuin Fae-35 nia.

li -96224 29

Suvulla Pseudonocardia on itiöitä sekä ilma- että alustarihmoissa. Sille on tunnusmerkillistä akropetaalinen kuroutuminen ja blastosporit. Sen rihmoilla on tyypillinen sik-sak-morfologia. Rihmojen on kuvattu olevan nivelikkäi-5 tä mutta väliseinättömiä [katso A. Henssen ja D. Schafer, "Amended Description of the Genus Pseudonocardia Henssen and Description of a New Species Pseudonocardia spinosa Schafer", Int. J. Syst. Bacteriol. 21^:29-34 (1971)]. Se kasvaa hyvin hitaasti. Katkeilemista ei ole tai sitä ha-10 vaitaan hyvin harvoin. A83543.1:llä ei ole mitään näistä ominaisuuksista.

Suvulle Saccharopolyspora on tunnusmerkillistä itiötuppi ja tyypillinen itiöketjun helminauhamainen ulkonäkö. Tämä piirre on erittäin silmiinpistävä 15 A83543.l:ssä. Myös katkeilemista on havaittu suvussa Sac charopolyspora . Tyyppilaji, S. hirsuta, eristettiin soke-riruo'on murskausjätteestä. Kantaviljelmä, josta A83543.1 saatiin, eristettiin sokeritehtaalta. Koska A83543.1:llä on monia tämän suvun piirteitä, sen katsotaan siksi olevan 20 Saccharopolyspora-kanta.

Ainoat pätevästi julkaistut lajit suvussa Saccharopolyspora ovat S. erythraea ja S. hirsuta. Tunnetut alalajit ovat S. hirsuta subsp. taberi ja S. hirsuta subsp. kobensis. A83543.1 eroaa näistä kannoista joko ilman kans-25 sa kosketuksessa olevan tai kääntöpuolen värin perusteella tai liukoisten pigmenttien tuoton perusteella.

Biokemiallista samankaltaisuutta mitattiin laatimalla samankaltaisuuskertoimien taulukko perustuen mahdollisimman moneen biokemialliseen mittaukseen. Jaccardin 30 kerrointa S_, ja yksinkertaisen vastaavuuden (simple mat-, ching) kerrointa S,e käytettiin [katso W. Kurylowicz, A.

Paszkiewlcz, W. Woznicka, W. Kurzatkowski ja T. Szulga, "Numerical Taxonomy of Streptomycetes", Polish Medical Publishers, Varsova, 1975, s. 37].

- 96224 30

Taulukossa VII on yhteenveto näistä samankaltai-suuskertoimista.

Taulukko VII: Samankaltaisuuskertoimet A83543.1:lle ja Saccharopolyspora-lajeille 5

Viljelmä S Sj sm A83543.1 100 100 ^ S. hirsute subsp. taberi 68 57 S. hirsuta subsp. kobensis 67 60 S. erythraea 63 54 S. hirsuta ' 55 50 15 A83543.1:n ja tunnettujen Saccharopolyspora-lajien rasvahappoanalyysi osoitti, että jokaisessa on sekä tyydytettyjä että haaraketjuisia rasvahappoja. A83543.1:n ras-20 vahappokoostumus on samankaltainen, mutta ei identtinen, muiden lajien kanssa. Taulukko VIII vertailee A83543.1:n ja tunnettujen Saccharopolyspora-lajien rasvahappokoostu-musta.

Il -96224 31 <β

4-1 (O

3 · ·Η <J in ιΛ (Ί Ni-iNfsn>iinNO

nan βιΝΟΌ I oo<rr-ioooo>co<to U M ä I ---- - — —

•η p a> r- ·— σ\ os OO'NOHO'if'H

j3 3 ,Ο ^ w o

M

col <9

4J

. 3 <r oo h ^ invooN o co <r co r-* vj <r ro\o h I n h » oo rs O u — ~ I -.1--1 _rm~w Μ ή m '-i in <t cn \o <t ts ’-ι <τ <o i—i (0 -C rl »-· <n < Ä n m Ml

0 CO

10 3 w e c 5 a) co T-> o 3 0

P -X

a) a S

Cd <β C (0 u

3 X JS ό n o r- r^voo -< -< -T

r, ~ 4-> oonr- I σ\ i ro-jcr, ι o o n n -t-’Jp >, ---1 ·- I ---1 - - - - > V4 r-i-im r- n n h h (M h h (0 CO 1) ·—I ON rl r-t i-l n (0 c u “· ·· c ι-H (J) • c o ro p g) ^ -P S' in p 5

oo c -H

oo a) c ϊί · o>i man oior-in^n-n-m }-> to oo vo -i ri n ι mmr-\Ot~~o4in—« μ ••Η -J — — — — — I - — - - — - - — ^ HQ) m rt o O) H N l~- ΙΟ f—I CM »—· r~- ·-—· 0)

M en —I tM *—* ·—< 4J

M c « tn > ® < « O O § * P -¾ .x c 2 3 (0 ·* H JK Ϊ 3 1 o o> o p ίο n o m w a HU n -H W («4 Ο ·Η H 4-) n §; oi c u 4) x 3* 04-)0100004-) SO »«s

o 2 MCMUlAMVia o m o O II

CO "3 )—I C ΗΊ {H >“II—)>—I < n (J N H H ··

s CO

,_j J! O O O ^ »-h **h O O ^ O ^ ^ <C γ-h CO

_ Vi ······«················»· (Q pQ

S 3 unmOOr-r-r-r^r-^-r-Ooom H

W* r·* r-* »-* rH ^ ^ r·* <0 - 96224 32

Taulukossa VIII esitettyjen rasvahappokoostumusten pääkomponenttianalyysi osoittaa riittävää hajontaa viita-takseen siihen, että viljelmät ovat kaikki eri lajeja samassa suvussa. Taulukon VIII tietojen pääkomponenttikuvaa-5 ja esitetään kuviossa 12.

Taulukko IX vertailee A83543.1:n fysiologisia ominaispiirteitä olemassaolevien Saccharopolyspora-lajien ja -alalajien vastaaviin.

tl - 96224 33

IQ

+> W 3 -H

nan in _ Λ •H JS S + + + +§ + § I + § + I + §

A 3 X) O

WO <N

X

col IQ · ·Η «J a ^ cn

3 W U Q

n ^ X) + + + + i + i iiiiS + + + + + + +

tj 3 π) O

•<-4 W 4-1 IN

C J3 a> Π ail 1-( '

10 I—I

1 "> (0 ti

^ w O

0 >-i m m

a Ή + + + +1 I + + + + I >1 I + + + + + I

£ -0 S3

H »I

Q.

0 μ m

(0 S

.C +> <5 U Q) u cn φ .μ μ + + + +I + I ιιιιρ + + + + + + + w μ & °Ä _. -H 4)

<0 iH

ή a .·, r in OT|

„ -H

·. h m . c - n ’d ri r- 5 -a· <n h

u")0 m I I I i+ + + I I · I »—· + IIIIII

rr> CO m rn μ °0 — 5 a) < ”· cn

.. -H

X 0> M 0 r-1 0 0 „ Ä -H F- ·· u ä m + c 3 & 5 S ~ £ ..

Hm _ 2s o >i e a 3 3 2 ee«2- a .¾ o * + *> « » 3 , . Γ* g G ® *0 <0 *HOCkV0)4>>4Jew P +] H cSce^-j^-Tl ««^QiM-HWcovew ä ~sli23SS*Sssi85iS^"S8 « S sHS55 s s i 5 S « s 3 Λ « 8 I 3 8 3 3 a μ « μ3Ηίϊο5«ϊ2ΐ,ϋι:»(:ί,ι*'ϊ5«

§ B 5¾ SS^^SSSiii^SS^S S^S5§I

- 96224 34 <β *j in 3 · ·Η in ΐί, in

u W c θ θ P P

Hid £ + i S + i £ S r + XI 3 A m o • Ji

Ml

VS · -H

«Jan 3 m u a

in xi xi 1++1 + 11 + 1S

l-ι 3 «β

ς* -rl tn *J

Q) -0

•H

n toi

<0 H

«τι Ό

to 4J

M 3 O w to HJ Τί §++!+ + + + + + >1 O ^ 1-1 Ä op toi a «o O -(-) M w (0 Λ

& -μ V

q a) 2

o ai £ Q

,5 f μ + + + + + +111S

WP >, ^ ·Η ^ (0 ,H <u o.

¢- tn toi ·· ’d _1 (0 ' c * Λ ^ co Zi rf g <0 in O >3· rx m 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 £2 p 00 < m < ·« Ή * g >1 H H £

.* -p s S

55 JJJ <u n 3 μ rj 3 p ϋ S ^ 3 -H οιοβββ ^ (OP _j ö.*j*«(dv 0« c_. Zf, Τ’ anaiovraeioje+Je 1 ^ ® Ql (0·Η·Ην«·Η·Ρ·Ρ3«ν > m x3n«m-H«naHMn _

(O _J OQ-HCO-H-rtOlH-H Q

rt Ή «δδο-Höeaioc ^ P (0 βΉςορκρδαν-Η

p Ά vo-Hoaeooi-HP

Tn c v-h>w c-riX'-ivii.a-t -k P -H OHKixjjsjizna p e sgeeeeaeioc ¢) g

II

- 96224 35

Tehdyt vertailut osoittavat, että A83543.1 poikkeaa riittävästi aikaisemmin kuvatuista Saccharopolyspora-la-jeista ollakseen uusi Saccharopolyspora-laji, jolle on valittu nimi Saccharopolyspora spinosa. Nimi spinosa kuvaa 5 tämän lajin itiöiden piikkistä koristelua.

Kannat A83543.3, A83543.4 ja A83543.5 ovat makroskooppisesti riittävän samankaltaisia kannan A83543.1 kanssa tullakseen luokitelluiksi Saccharopolyspora spinosa-kannoiksi . Nämä neljä kantaa poikkeavat toisistaan 10 tuottamansa A83543:n määrän suhteen. Kanta A83543.3 tuottaa A83543:a likimain neljä kertaa niin paljon kuin kanta A83543.1, ja kannat A83543.4 ja A83543.5 tuottavat likimain 8-9 kertaa niin paljon kuin kanta A83543.1 tuottaa.

Kuten asia on muidenkin eliöiden kohdalla, tässä 15 esitettyjen A83543:a tuottavien viljelmien, Saccharopolyspora spinosa NRRL 18395:n, NRRL 18537:n, NRRL 18538:n ja NRRL 18539:n, ominaispiirteet ovat jatkuvasti muutoksen alaisia. Siten näiden kantojen mutantteja voidaan saada sinänsä tunnetuilla fysikaalisilla ja kemiallisilla mene-20 telmillä. Esimerkiksi muita kantoja voidaan saada käsittelemällä kemikaaleilla, kuten N-metyyli-N'-nitro-N-nitroso-guanidiinilla.

Saccharopolyspora spinosa -viljelmien kasvattamiseen käytettävä elatusaine voi olla mikä vain joukosta 25 elatusaineita. Kuitenkin tuotannon taloudellisuuden, opti-maalisen saannon ja tuotteen eristyksen helppouden takia tietyt elatusaineet ovat edullisia. Siten esimerkiksi edullisia hiilen lähteitä suuren mittakaavan fermentaati-ossa ovat glukoosi ja maltoosi, vaikka riboosia, ksyloo-30 siä, fruktoosia, galaktoosia, mannoosia, mannitolia, liukoista tärkkelystä, perunadekstriiniä, metyylioleaattia, öljyjä, kuten soijaöljyä, ja näiden kaltaisia voidaan myös käyttää.

Edullisia typen lähteitä ovat puuvillansiemenjauho, 35 peptonisoitu maito ja digestoitu soijajauho, vaikka kala- - 96224 36 jauhoa, maissiniiotusvettä, hiivauutetta, entsyymeillä hydrolysoitua kaseiinia, lihauutetta ja näiden kaltaisia voidaan käyttää.

Epäorgaanisiin ravinnesuoloihin, joita voidaan pan-5 na mukaan elatusaineeseen, kuuluvat tavanomaiset liukoiset suolat, joista voidaan saada sinkkiä, natriumia, magnesiumia, kalsiumia, ammoniumia, kloridia, karbonaattia, sulfaattia, nitraattia ja näiden kaltaisia ioneja.

Organismin kasvulle ja kehittymiselle olennaiset 10 hivenaineet pitäisi myös sisällyttää elatusaineeseen. Tällaiset hivenaineet yleisesti esiintyvät epäpuhtauksina elatusaineen muissa ainesosissa organismin kasvuvaatimuksille riittävässä määrin.

Yleensä, jos vaahtoaminen on ongelma, pieni määrä 15 (ts. 0,2 ml/1) vaahdonestoainetta, kuten polypropyleeni-glykolia, voidaan lisätä suuren mittakaavan fermentaation elatusaineeseen. A83543:a tuottavien viljelmien kohdalla kuitenkin tavanomaiset vaahdonestoaineet estävät A83543:n tuotantoa. Vaahtoamista voidaan kontrolloida sisällyttä-20 mällä soijaöljyä tai "pluronic L-101":tä (BASF) elatusaineeseen (1-3 %). Lisää öljyä voidaan lisätä, jos vaahtoa kehittyy.

Tietyn A83543-komponentin prosenttiosuutta voidaan vaihdella muutoksilla elatusaineessa. Esimerkiksi valii-25 nin, isovoihapon tai propionihapon lisääminen lisää tuotetun A83543D:n prosenttiosuutta.

Huomattavien A83543-määrien tuottamiseksi aerobinen pinnanalainen fermentaatio sekoituksessa olevissa bioreak-toreissa on edullista. Pieniä määriä A83543:a voidaan saa-30 da ravistelussa olevasta pulloviljelmästä. Johtuen tuotannon aikaviiveestä, joka yleisesti liittyy suurten bioreak-torien ymppäämiseen eliön itiömuodolla, on edullista käyttää vegetatiivista ymppiä. Vegetatiivinen ymppi valmistetaan ymppäämällä pieni tilavuus elatusainetta eliön itiö-35 muodolla tai myseelifragmenteilla tuoreen, aktiivisesti

II

- 96224 37 kasvavan viljelmän saamiseksi eliöstä. Sitten vegetatiivi-nen ymppi siirretään suurempaan bioreaktoriin. Vegetatii-visen ympin elatusaine voi olla sama kuin suuremmissa fer-mentaatioissa käytettävä, mutta myös muut elatusaineet 5 ovat soveliaita.

A83543:a tuottavat organismit tuottavat A83543:a kasvatettaessa lämpötilassa noin 24 °C ja 33 °C välillä. Optimilämpötila A83543:n tuotolle näyttää olevan 28-30 eC.

Kuten on tapana aerobisissa pinnanalaisissa vilje-10 lymenetelmissä, steriiliä ilmaa puhalletaan astiaan poh jalta samaan aikaan, kun elatusainetta sekoitetaan tavanomaisilla turbiinijuoksupyörillä. Yleensä ilmastusnopeuden ja sekoitusnopeuden pitäisi olla riittäviä pitämään liuenneen hapen taso arvossa 35 % tai ylempänä, edullisesti 15 arvossa 50 % tai ylempänä, ilmalla kyllästyksestä, astian sisäisen paineen ollessa 0,34 ilmakehää.

A83543-komponenttien tuotantoa voidaan seurata fer-mentaation aikana testaamalla liemen uuttonäytteitä. HPLC, käyttäen esimerkissä 1 kuvattua systeemiä, on hyödyllinen 20 määritysmenetelmä tähän tarkoitukseen.

Aerobisissa pinnanalaisissa fermentaatio-olosuh-teissa tuottamisen jälkeen A83543-komponentit voidaan ottaa talteen fermentaatioelatusaineesta sinänsä tunnetulla tavalla. A83543:a tuottavan organismin fermentaation aika-25 na tuotettu A83543 tavataan sekä myseelistä että liemestä. A83543 vaikuttaa olevan lipofiilinen. Siten, jos fermen-taatiossa käytetään huomattava määrä öljyä, koko liemen uuttaminen on tehokkaampaa. Jos vain pieniä määriä öljyä käytetään, suurin osa A83543:stä on myseelissä. Tässä ta-30 pauksessa A83543:n tehokkaampaan talteenottoon päästään, kun elatusaine aluksi suodatetaan liemen erottamiseksi myseelimassasta (biomassasta).

A83543 voidaan saada talteen biomassasta joukolla eri tekniikoita. Edulliseen tekniikkaan kuuluu, että ero-35 tettua biomassaa pestään vedellä jäljelle jääneen liemen - 96224 38 poistamiseksi, biomassa sekoitetaan polaariseen liuotti-meen, Johon A83543 on liukoinen, esim. metanoliin tai asetoniin, erotetaan ja konsentroidaan liuotin, uutetaan kon-sentraattia ei-polaarisella liuottimena ja/tai adsorboi-5 daan se käänteisfaasipiidioksidigeeliadsorbenttiin, kuten RP-C8:an tai RP-C18:an tai erittäin huokoiseen polymeeriin, kuten HP-20:en ja sen kaltaiseen.

Aktiivinen materiaali eluoidaan adsorbentista soveliaalla liuottimena kuten esimerkiksi asetonitriili:me-10 tanoli-seoksilla, joissa on pieni määrä THF:a.

A83543 voidaan eristää yksittäisiksi komponenteiksi A83543A, A83543B, A83543C, A83543D, A83543E, A83543F, A83543G, A83543H ja A83543J sekä A83543A-pseudoaglykoni samankaltaisilla menetelmillä. Edulliseen erotusmenetel-15 mään kuuluu käänteisfaasipiidioksidigeelikromatografia ( Cjj tai Cg).

Vaihtoehtoisesti viljelmän kiinteät aineet, mukaan luettuina elatusaineen ainesosat ja myseeli, voidaan käyttää ilman uuttoa tai eristystä, mutta edullisesti veden 20 poistamisen jälkeen, A83543:n lähteenä. Esimerkiksi, A83543:n tuottamisen jälkeen, koko fermentaatioliemi voidaan kuivata kylmäkuivauksella, rumpukuivauksella tai at-seotrooppisella tislauksella ja kuivauksella. Kuivattu liemi voidaan sitten käyttää suoraan, esim. sekoittamalla 25 se suoraan rehusekoitteeseen.

Hyönteis- ja punkkimyrkkyaktiivisuus Tämän keksinnön mukaisesti valmistettavat yhdisteet ovat hyödyllisiä hyönteisten ja punkkien torjunnassa, jolloin hyönteisen tai punkin sijaintipaikkaan pannaan hyön-30 teisiä tai punkkeja inhiboiva määrä A83543-yhdistettä.

A83543-yhdisteillä havaitaan tehoa joukkoa hyönteisiä ja punkkeja vastaan. Tarkemmin, yhdisteet osoittavat tehoa "Southern armyworm"ia (erään yökkösen toukka) vastaan, joka on jäsen hyönteislahkossa Lepidoptera. Muita 35 tyypillisiä jäseniä tässä lahkossa ovat "codling moth", il - 96224 39 "cutworms" (yökkösten toukkia), vaatekoit, intianjauhokoi-sa, "leaf rollers" (lehtiin kääriytyviä toukkia), "corn earworm" (Heliothis armigera, "cotton bollworm" (He-liothis zea, "European corn borer" (Pyrausta nubialisin 5 toukka, kaaliperhosen toukka, kaalimittari, "pink boll- worm" (yökkösen toukka, pussikehrääjien toukat, "Eastern tent Caterpillar" (kehrääjän Malacasoma americanum toukka, suom. huom.), "sod webworm" (koisaperhosten toukkia, ja "fall armyworm" (Laphygma frugipedan toukka.

10 Yhdisteet osoittavat aktiivisuutta myös puuvilla- kirvaa ("cotton aphid") vastaan, joka on hyönteislahkon Homoptera jäsen. Muihin Homopteran jäseniin kuuluvat kaskaat, päärynäkemppi, omenakemppi, kilpikirvat, Jauhiaiset ja sylkikaskaat, kuin myös joukko muita isäntäspesifisiä 15 kirvalajeja.

Lisäksi A83543-yhdisteet osoittavat tehoa pistokär-päsiä, raatokärpäsiä ja hyttysiä vastaan, jotka ovat hyön-teislahkon Diptera jäseniä. Vielä eräs tyypillinen jäsen tässä lahkossa on tavallinen huonekärpänen.

20 A83543-yhdisteet ovat hyödyllisiä hyönteis- tai punkkipopulaatioiden vähentämiseen, ja niitä käytetään menetelmässä, jolla inhiboidaan hyönteis- tai punkkipopu-laatiota, jolloin hyönteisen tai punkin sijaintipaikkaan pannaan hyönteisen tai punkin inaktivoimiseksi tehokas , 25 määrä A83543-yhdistettä.

Hyönteisten tai punkkien "sijaintipaikka" viittaa ympäristöön, jossa hyönteiset tai punkit elävät tai jossa niiden munia on, mukaan luettuina niitä ympäröivä ilma, niiden syömä ruoka tai esineet, joihin ne ovat kosketuk-30 sissa. Esimerkiksi kasveja syöviä hyönteisiä tai punkkeja ' voidaan torjua panemalla aktiivista yhdistettä kasvin osiin, joita hyönteiset tai punkit syövät tai joissa ne asuvat, erityisesti lehtiin.

On ajateltu, että yhdisteet voisivat olla myös hyö-35 dyllisiä suojaamaan tekstiilejä, paperia, varastoitua vil- 40 - 967:24 jaa tai siemeniä, kun pannaan aktiivista yhdistettä tällaisiin aineisiin.

Termi "inhiboida hyönteistä tai punkkia" viittaa elävien hyönteisten tai punkkien lukumäärän vähenemiseen 5 tai elinkykyisten hyönteisen tai punkin munien lukumäärän vähenemiseen. Yhdisteellä saavutettavan vähenemisen määrä riippuu tietenkin yhdisteen käyttömäärästä, kulloinkin käytetystä yhdisteestä ja kohdehyönteis- tai -punkkilajista. Ainakin hyönteisiä inaktivoivaa tai punkkeja inakti-10 voivaa määrää pitäisi käyttää.

Termejä "hyönteisiä inaktivoiva määrä” ja "punkkeja inaktivoiva määrä” käytetään kuvaamaan määrää, joka riittää aiheuttamaan mitattavan vähenemisen käsitellyssä hyönteis- tai punkkipopulaatiossa. Yleensä aktiivista yh-15 distettä käytetään määrä välillä noin 1-1000 miljoonasosaa (tai 0,01-1 kg/ha).

Edullisesti voidaan esimerkiksi inhiboida Lepidop-tera-lahkon herkkää hyönteistä, jolloin kasviin pannaan hyönteisiä inaktivoimaan tehokas määrä A83543-yhdistettä. 20 Tämän keksinnön edullinen suoritusmuoto liittyy menetelmään, jolla inhiboidaan Diptera-lahkon purevia kärpäsiä eläimissä, jolloin eläimelle annetaan suun kautta tai parenteraalisesti syöpäläisiä inhiboimaan tehokas määrä A83543-yhdistettä.

25 Punkki-/hyönteisseulonta A83543-yhdisteistä testattiin hyönteismyrkky- ja punkkimyrkkyaktiivisuutta seuraavalla punkki-/hyönteis-seulonnalla.

Kukin testattava yhdiste formuloitiin liuottamalla 30 yhdiste asetoni/alkoholi-seokseen (1:1), jossa oli 23 g "Toximul R" :ä (sulfonaatti/ei-ioninen emulsiointiaineseos) ’ ja 13 g "Toximul S":ä (sulfonaatti/ei-ioninen emulsiointi aineseos) litraa kohti. Sitten nämä seokset laimennettiin vedellä ilmoitettujen pitoisuuksien saamiseksi.

Il -.96224 41

Vihannespunkkia (Tetranychus urtlcae Koch) ja puu-villaklrvaa (Aphis gossypli Glover) pantiin kesäkurpitsan sirkkalehdille, ja niiden annettiin pesiytyä lehtien molemmille pinnoille. Muihin kasveihin samassa käsittelyruu-5 kussa ei lisätty tuholaisia. Sitten lehdet suihkutettiin 5 ml:11a testattavaa liuosta käyttäen DeVilbliss-sumutinta paineella 69 kPa (10 psi). Lehtien molempia pintoja kasteltiin, kunnes liuos loppui, ja sitten niiden annettiin kuivua tunnin ajan. Sitten kaksi tuholaisetonta lehteä 10 leikattiin irti ja pantiin Petri-maljalle, jossa oli "Southern armyworm"ia (Spodoptera eridania Cramer).

Muita hyönteisiä arvioitiin käyttäen samankaltaisia formulaatioita ja arviointimenetelmiä, ilmoitettuja poikkeuksia lukuunottamatta.

15 Normaalien altistusaikojen jälkeen kuolleisuuspro- sentti määritettiin. Tulokset raportoidaan seuraavissa taulukoissa. Seuraavia lyhenteitä käytetään:

Termi Hyönteinen/punkki Tieteellinen nimi BW puuvillakärsäkäs Anthonomus grandis 20 CA puuvillakirva Aphis gossypii CBW "cotton bollworm" Heliothis zea CLH maissikaskas Dalbulus maidis CRW "Southern corn Diabrotica undecimpuntata rootworm" howardi 25 SAW "Southern armyworm" Spodoptera eridania SM vihannespunkki Tetranychus urticae

Taulukko X: A83543A:n aktiivisuus vastasyntyneitä CBW-toukkia vastaan -.96224 42 Käsittely Päivää" Määrä Inhibitio- 5 %b

Paikallinen0 1 1,00 20,00 5.00 100,00 10.00 100,00 10 50.00 100,00 100,00 100,00

Ravintod 4 1,00 30,00 5.00 100.00 15 f f 10.00 100,00 50.00 100,00 100,00 100,00 on 6 10,00 0,00 20 Munat 1 ’ 50.00 0,00 100.00 30,00

Paikallinen0 1 0,50 10,00 1.00 40,00 25 5,00 80,00 10.00 100,00 50.00 100,00 100.00 70,00 30 Ravinto 3 0,50 15,00 1.00 45,00 5.00 100,00 10.00 100,00 50,00 100,00

II

35 - 96224 43 * Päivien lukumäärä käsittelyn ja havainnoinnin välillä b Kahden testatun rinnakkaisen keskiarvo e Käsitelty 1 ml:11a formuloitua A83543A:ta d Ravinto on pintakäsitelty A83543A:lla, annettu kuivua ja 5 lisätty tuholaisia * Munat käsitelty paikallisesti A83543A:lla ja pidetty, kunnes kontrollimunat ovat täydellisesti kuoriutuneet.

Taulukko XI: Prosenttia vastasyntyneitä CBW-touk-10 kia kontrolliin verrattuna A83543-komponenteilla1 miljoonasosaa_

Komponentti^ 0*5 1 5 10 15 A 55 (d) 100 (a) 100 (a) 100 (a) B 35 (e) 80 (c) 100 (a) 100 (a) C 5 (g) 85 (bc) 93 (bc) 100 (a) D 58 (d) 90 (ac) 100 (a) 100 (a) E 28 (ef) 58 (d) 100 (a) 100 (a) 20 F 0 (g) 0 (g) 0 (g) 95 (ab) G 0 (g) 0 (g) 20 (f) 80 (c) 25 1) Käsittelyt, joiden perässä on suluissa sama kirjain, • eivät poikkea toisistaan 0,05-tasolla.

2) Paikallinen pipettimenetelmä käyttäen 20 toukkaa/rin-nakkainen ja 4 rinnakkaista; yksi päivä käsittelyn ja havainnoinnin välillä.

Taulukko XII: A83543A:n aktiivisuus SAW-toukkia vastaan 96224 44

Vaihe Käsittely Päivää* Määrä Inhibitio- 5 %b

Vasta- Lehdet/salkopapuC 3 1,00 10,00 syntynyt 5,00 40.00 10,00 100^00 50.00 100,00 10 100.00 100,00

Vasta- Paikallinen*^ 3 1.00 0,00 syntynyt 5)00 60,00 10)00 100,00 50.00 100,00 100.00 100)00 15

Vasta- ( Lehdet/salkopapu6 4 0,50 0,00 syntynyt i,00 66,67 5,00 100,00 10.00 100.00 50f 00 100)00 on Toinen Paikallinen*^ 1 1,00 0,00 toukka- 5}00 0,00 aste 10.00 0.00 5θ)θΟ 8θ)θΟ 100.00 100,00

Toinen Lehdet/salkopapu*^ 4 1,00 0,00 toukka- 5(00 0,00 aste 10,00 80,00 50.00 80,00 100)00 100,00

Kolmas Paikallinen® 2 1,00 0,00 toukka- 5.00 0,00 aste 10)00 13,33 50.00 73 j33

Kolmas Lehdet/salkopapu® 4 0,50 0,00 toukka- 1r00 0,00 aste 5j00 40,00 10f00 100,00 50.00 100.00 il 45 - 96224

Taulukko XII (jatkoa):

Vaihe Käsittely Päivää* Määrä Inhibitio- ___ %b_ 5

Viides Paikallinen® 2 10,00 0,00 toukka- 50,00 0,00 aste

Viides Lehdet/salko- * 10,00 0,00 toukka- papu® 50,00 0,00 aste 10 * Päiviä käsittelyn ja havainnoinnin välillä b Testattujen rinnakkaisten keskiarvo 15 c Yksi rinnakkainen d Kaksi rinnakkaista * Kolme rinnakkaista f Käsiteltiin paikallisesti 1 ml:11a formuloitua A83543A:ta Taulukko XIII: A83543A:n aktiivisuus aikuista 20 BW:tä vastaan Käsittely Määrä (miljoonasosaa) Inhibitio- -_____%a

Paikallinen1* 1,00 0,00 5,00 20,00 25 10,00 20,00 50.00 100,00 100.0 100,00 a Yksi rinnakkainen; havainnoitiin kolme päivää käsittelyn jälkeen 30 b Formuloitua A83543A:ta (1 ml) kaadettiin aikuisten hyön- *: teisten päälle Petri-maljalla.

- 96224

Taulukko XIV: A83543A:n aktiivisuus kasvihuoneko- keissa eri viljelykasvituholaisia vastaan 46

Viljelykasvi Tuholainen Määrä Inhibitio* 5 “

Maissi CRW 30 100 15 50 7.5 10 3,75 0

Kesäkurpitsa SAW 250 100 10 125 100 62 r 5 100 31i25 55 15,63 40 7.8 20 3 , 9 20 1.9 0 15 Kesäkurpitsa SM 250 70 125 40 62.5 20 31r 25 0

Kesäkurpitsa CA 100 0 50 0 20 Maissi CLH 200 90 100 30 50 0

Salkopapu SAW 100 100 50 80 25 40 25 12,5 0 SM 100 100

Salkopapu 50 80 25 30 12.5 10 6,25 0 fi - 96224 47

Taulukko XIV (jatkoa): A83543A:n aktiivisuus kas-vihuonekokeissa eri viljelykasvituholaisia vastaan Viljelykasvi Tuholainen Määrä Inhibitio* 5 CÄ 100 80

Kesäkurpitsa 50 40 25 0 CRW 6 30 3 0

Maissi 10 Taulukko XV vertailee A83543A-käsittelyn tehok kuutta ja kestävyyttä metomyylin vastaaviin ulkoilmaruuk-kutesteissä "Southern armyworm”ia vastaan.

Taulukko XV: A83543:n tehokkuus Spodoptera erida-niaa vastaan ulkoilmaruukkutesteissä 15 Päivää käsittelyn jälkeen* Käsittely Määrä milj.osaa 1 5 7 14 20 _- _~_”_ A83543A 63 100 88 90 5 A83543A 125 100 88 95 90 A83543A 250 100 95 100 100 25 A83543A 500 100 100 100 100 metomyyli 63 100 20 15 0 metomyyli 125 100 35 40 20 metomyyli 250 100 85 45 40 30 metomyyli 500 100 90 85 60

Ei mitään 0 0 0 0 o

Ei mitään 0 0 0 0 0 35 “ Tulokset annettu kuolleisuusprosenttina 96224 48

Taulukossa XVI on yhteenveto LC50-arvoista, letaa-lisista konsentraatloista, joilla testattava yhdiste inhiboi 50 % testattavasta hyönteisestä tai punkista, A83543A:n osoittamat arvot verrattuna tunnetun hyönteis-5 myrkyn metomyylin osoittamiin.

Taulukko XVI: LC50-arvot A83543:lle* LC50 (miljoonasosaa)

Kohde A83543 metomyyli 10 CRW 15 6

Viljakirva ("grain aphid") >250 5,4 SM 150 71.4 SAW/Lehdet 1,3 11,4 CBW/Kontakti 0,6 14,5 15 • "Corn rootworm"ille määrä maaperässä painon mukaan; kaikille muille sumutteen pitoisuus.

A83543-komponentit olivat aktiivisia keltakuume-hyttysen (Aedes aegypti) toukkia vastaan normaalissa in 20 vitro sääskentoukkamyrkkytestissä. Taulukot XVII ja XVIII ovat yhteenveto komponenttien aktiivisuudesta näissä kokeissa.

li - 96224 49

Taulukko XVII: A83543B:n ja A83543C:n in vitro -aktiivisuus ensimmäisen toukka-asteen sääskentoukkia vastaan A83543- Minimaalinen inhiboiva 5 komponentti konsentraatio (pg/ml)* A 0,016, 0,031b B 0,016 C 0,031 * Alin konsentraatio, jolla havaittiin 100 % inhibitio 24 10 tunnin kuluttua (mikrotiitterilevyillä) b Kahden erän testit

Taulukko XVIII: A83543-komponenttien aktiivisuus neljännen toukka-asteen sääskentoukkia vastaan* Komponentti Prosenttia kontrollista* 15 A 60,70b B 60 C 60 D 30 E 80 20 F 0 G 0 “ 24 tunnin kohdalla 0,312 miljoonasosalla käsiteltynä b Kahden testin tulokset Kenttäkokeet 25 A83543A:ta arvioitiin kenttäkokeissa. Näissä ko keissa A83543A osoitti aktiivisuutta kaaliperhosen toukkaa ja kaalimittaria vastaan itävässä parsakaalissa ja soija-mittarien ("soybean loopers") (75 %) ja "fall armyworm"ien (25 %) seosta vastaan soijapavussa.

30 Hyönteismyrkkykoostumuksia A83543-yhdisteitä käytetään koostumusten muodossa. Nämä koostumukset käsittävät hyönteisiä tai punkkeja inaktivoivan määrän A83543-yhdistettä ja fytologisesti soveliaan inertin kantajan. Vaikuttava aine, siis A83543-35 yhdiste, voi olla mukana 1) yksittäisenä A83543-komponent- - 96224 50 tina, 2) kahden tai useamman komponentin seoksena, 3) eristettynä A83543-seoksena tai 4) A83543:nä yhdessä sen fermentaatioelatusaineen kuivatun osan kanssa, jossa se on tuotettu, siis epäpuhtaana, kuivattuna fermentaatiolieme-5 nä.

Koostumukset ovat joko konsentroituja formulaa-tioita, jotka hajotetaan veteen käyttöä varten, tai pöly-tai raeformulaatioita, joita käytetään ilman jatkokäsittelyä .

10 Koostumuksia valmistetaan niiden menetelmien ja ohjeiden mukaan, jotka ovat tavanomaisia maatalouskemikaa-lialalla, mutta jotka ovat uusia ja tärkeitä, koska mukana on yksi tai useampi A83543-yhdiste.

Dispersiot, joihin yhdisteet tai epäpuhdas kuivat-15 tu materiaali pannaan, ovat useimmiten vesipohjaisia sus pensioita tai emulsioita, jotka valmistetaan yhdisteiden tai epäpuhtaan materiaalin konsentroiduista formulaatiois-ta. Tällaiset vesiliukoiset, veteen suspensoitavissa olevat tai emulsioitavissa olevat formulaatiot ovat yleensä 20 kiinteitä aineita (tunnetaan yleensä kostutettavissa olevina jauheina) tai nesteitä (tunnetaan yleensä emulsioitavissa olevina tiivisteinä tai vesipohjaisina suspensioina) .

Kostutettavissa olevat jauheet, jotka voidaan tii-25 vistää veteen, jotta muodostettaisiin dispersoitavissa olevia rakeita, käsittävät aktiivisen yhdisteen, inertin kantajan ja pinta-aktiivisten aineiden läheisen seoksen.

Aktiivisen yhdisteen pitoisuus on yleensä noin 1 %:sta, edullisesti 10 %:sta, noin 90 %:in painon mukaan. Inertti 30 kantaja valitaan yleensä joukosta attapulgiittisavet, montmorilloniittisavet, piimaat ja puhdistetut silikaatit.

Tehokkaat pinta-aktiiviset aineet, jotka käsittävät yleensä noin 0,5-10 % kostutettavasta jauheesta, löytyvät joukosta sulfonoidut ligniinit, kondensoidut nafta-35 leenisulfonaatit, naftaleenisulfonaatit, alkyylibentseeni- v

N

11 - 96224 51 sulionaatit, alkyylisulfaatit ja ei-ioniset pinta-aktii-vlset aineet, kuten alkyylifenolien etyleenioksidiadduk-tit.

Yhdisteen emulsioitavissa olevat konsentraatlt kä-5 sittävät sopivan pitoisuuden yhdistettä, kuten 50-500 grammaa nestelitraa kohti, vastaten noin 10-50 %, liuotettuna inerttiin kantajaan, joka on joko veteen sekoittuva liuotin tai seos veteen sekoittumatonta orgaanista liuotinta ja emulsiointiaineita.

10 Hyödyllisiä orgaanisia liuottimia ovat aromaat tiset liuottimet, erityisesti ksyleenit, ja raaköljyja-keet, erityisesti korkeakiehumapisteiset naftaleeni- ja olefiiniosat raakaöljystä, kuten aromaattinen raskas polttoöljy. Myös muita orgaanisia liuottimia voidaan käyttää, 15 kuten terpeeniliuottimia mukaan luettuina hartsijohdan-naiset, alifaattisia ketoneita kuten sykloheksanonia, ja kompleksisia alkoholeja kuten 2-etoksietanolia.

Sopivat emulsiointiaineet emulsioitavissa oleviin konsentraatteihin valitaan tavanomaisista ei-ionisista 20 pinta-aktiivisista aineista, kuten aiemmin mainituista.

Vesipohjaiset suspensiot käsittävät veteen liukenemattomat A83543-yhdisteet dispersoituna vesipohjaiseen kantajaan pitoisuudessa välillä noin 5-50 painoprosenttia. Suspensioita valmistetaan jauhamalla yhdiste hienoksi ja 25 sekoittamalla sitä voimakkaasti kantajaan, joka muodostuu vedestä ja pinta-aktiivisista aineista, jotka valitaan samoista tyypeistä kuin edellä on käsitelty. Inerttejä ainesosia, kuten epäorgaanisia suoloja ja synteettisiä tai luonnonkumeja, voidaan myös lisätä vesipohjaisen kantajan 30 tiheyden ja viskositeetin lisäämiseksi. On usein tehokkainta jauhaa ja sekoittaa yhdiste samanaikaisesti valmistamalla vesipohjainen seos ja homogenisoimalla se sellaisessa välineessä kuten hiekkamyllyssä, kuulamyllyssä tai mäntätyyppisessä homogenisaattorissa.

- 96224 52

Yhdisteitä voidaan myös käyttää rakeisina koostumuksina, jotka ovat erityisen hyödyllisiä maaperään käytettäviksi. Rakeiset koostumukset yleensä sisältävät noin 0,5-10 painoprosenttia yhdistettä dispersoituna inerttiin 5 kantajaan, joka koostuu kokonaan tai suurelta osin savesta tai samankaltaisesta halvasta aineesta.

Tällaisia koostumuksia valmistetaan yleensä liuottamalla yhdiste sopivaan liuottimeen ja panemalla se rakeiseen kantajaan, joka on ennakolta valmistettu sopivaan 10 hiukkaskokoon, välillä noin 0,5-3 mm. Tällaisia koostumuksia voidaan myös formuloida tekemällä taikina tai tahdas kantajasta ja yhdisteestä sekä murskaamalla ja kuivaamalla se halutun rakeiden hiukkaskoon saamiseksi.

Yhdisteitä sisältäviä pölyjä valmistetaan yksin-15 kertaisesti läheisesti sekoittamalla yhdiste jauhemuodossa soveliaan, pölymäisen maataloudessa käytettävän kantajan, kuten kaoliinisaven, jauhetun vulkaanisen kiven tai näiden kaltaisten kanssa. Pölyissä voi edullisesti olla noin 1-10 % yhdistettä.

20 On yhtä käytännöllistä, kun se mistä tahansa syys tä on haluttavaa, käyttää yhdistettä liuosmuodossa sopivassa orgaanisessa liuottimessa, yleensä miedossa paloöljyssä, kuten ruiskutusöljyissä, joita käytetään laajasti maatalouskemiassa.

25 Hyönteis- ja punkkimyrkkyjä käytetään yleensä vai kuttavan aineen dispersiona nestemäisessä kantajassa. Tapana on viitata käytettäviin määriin vaikuttavan aineen pitoisuuden kantajassa mukaan. Laajimmin käytetty kantaja on vesi.

30 A83543-yhdisteitä voidaan myös käyttää aerosoli- koostumuksen muodossa. Tällaisissa koostumuksissa vaikuttava aine on liuotettu tai dispersoitu inerttiin kantajaan, joka on paineen aiheuttava ponneaineseos. Aerosoli-koostumus pakataan astiaan, josta seosta sumutetaan hajot-35 tavan venttiilin läpi. Ponneaineseokset koostuvat joko

II

- 96224 53 matalalla kiehuvista hiilihalogeeneistä, jotka voivat olla sekoitettuina orgaanisiin liuottimiin, tai vesipohjaisista suspensioista, jotka on paineistettu inerteillä kaasuilla tai kaasumaisilla hiilivedyillä.

5 Kulloinkin hyönteisten tai punkkien sijaintipaik kaan käytettävä yhdisteen määrä ei ole kriittinen, ja ammattimiehet voivat määrittää sen vaivatta annettujen esimerkkien valossa. Yleensä pitoisuuksien 10-5000 miljoonasosaa odotetaan saavan aikaan hyvän torjunnan. Monilla yh-10 disteistä pitoisuudet 100-1000 miljoonasosaa riittävät. Pelloilla oleville viljelykasveille, kuten soijapavulle ja puuvillalle, sopiva yhdisteiden käyttömäärä on noin 0,01-1 kg/ha, tyypillisesti käytettynä 0,47-4,7 1/ha (5-50 gal-lonaa/eekkeri) sumutusformulaatiota.

15 Sijaintipaikka, johon yhdistettä käytetään, voi olla mikä tahansa sijaintipaikka, jossa hyönteinen tai punkki asuu, esimerkiksi viljellyt vihannekset, hedelmä-ja pähkinäpuut, viiniköynnökset ja koristekasvit.

Punkkien munien ainutlaatuisen kyvyn vastustaa 20 myrkkyvaikutuksia takia toistuva käyttö voi olla haluttavaa vasta ilmestyneiden toukkien torjumiseksi, kuten asia on muilla tunnetuilla punkkimyrkyillä.

Ektoparasiittimyrkkyaktiivisuus A83543-yhdisteet ovat myös aktiivisia hyönteislah-25 kon Diptera jäseniä vastaan. Taulukot XIX-XX1 ovat yhteenveto in vitro -tutkimuksista A83543A:lla ja A83543D:llä.

-.96224 54

Taulukko XIX: A83543A:n In vitro -tehokkuus mustan raatokärpäsen toukkia vastaan Annostaso Aktiivisuus1 (miljoonasosaa) 5 100 100 50 100 25 100 10 100 10 5 100 2 100 1 95 0.5 60 0.25 25 15

Aktiivisuus = kuolleisusprosentti

Taulukko XX: A83543A:n in vitro -tehokkuus aikuisia pistokärpäsiä vastaan 20 Annostaso 24 tunnin 48 tunnin (miljoonasosaa) Aktiivisuus1 Aktiivisuus1 100 100 100 50 100 100 25 25 100 100 10 100 90 5 80 100 2 70 90 1 10 60 30 0 f 5 0 10

Aktiivisuus = kuolleisusprosentti li - 96224 55 μ 43 o o o o in tn o o o σ> cn

CO H H H

Γ * tn n

|J

μ 43 O o o o o in o o» o» ffl in is

Q ^ H

tn cm tn tn ω <1 μ 43 o o o o o o o σ> o «Τ' vo

00 H H

tn i w

0) < d> G

4J H d) i M h ra xjoooooo ha: O in N n h >t 3 m -μ -m +J (VJ SO ra h ran > h -μ

H H

C (0 H μ Hi 43 O O O O O O J-> G o o o o σ' m en 0 " 00 H H H H d) i.

o *j< ra £ en h i:

^ tn h V

in cq h ^ tn ,j to

00 h G

< μ E ^ _ Λ o o o o o m d) ro o o o o vo cm a: e

1 J <4J H H H H H

e tn cm Tl S

*- hi -μ e T Φ +J 3 n S ® “ e 2 S a g ® g £ 43 O O O O O O ° M 5 (0 g o o o o n- tn £ X a: < «hhhh & ro μ -¾ * G -n SO g lii tn 3

3 W ® * S

* < ΐ N B g J

<d ro o μ □ d) q, ra ra X 43000000 Τί'-· SO o x ω tn en <N ö h e α m ro ί* 2 -h s μ ro h cm ·* 0) S SO e 3 e ** h ·* o ro § t? ro R o H cn ij V» «P *Π • 5 : * j S J ‘ ‘ S e a tn cm ij E d) n X B tn es H c3dJ nn X ft in cm Φ en Λ μ Ai n,

O ft » v ·- s 0) H γλ tn E

r o tn cm h o o ΐ dl so ^ CQ ft H ί » n i J ft ,96224 56

In vivo -kokeissa A83543-yhdisteet osoittivat systeemistä hyönteismyrkkyaktiivisuutta marsuissa ja lampaissa raatokärpäsen toukkaa ja aikuista pistokärpästä vastaan ilman mitään ilmeistä merkkiä toksisuudesta. Edustavia 5 yhdisteitä A83543A ja A83543D on testattu laboratoriossa ja kohde-eläimissä aktiivisuuden laajuuden määrittämiseksi. Seuraavat kokeet ovat kuvaavia.

Systeeminen koe marsussa

Aikuisia marsuja käytetään tässä koejärjestelyssä. 10' Testattavat yhdisteet liuotetaan polyvinyylipyrrolidonin vesiliuokseen tai polyetyleeniglykoli 200:an ja tarvittava määrä liuosta annetaan joko suun kautta tai vatsaontelon-sisäisenä ruiskeena. Useita yhdisteen annoksia käytetään, kuten jäljempänä seuraavissa taulukoissa esitetään.

15 Verta otetaan marsuista 30 minuutin kohdalla, mil loin toisin ei mainita, ja verinäytteet sentrifugoidaan. Hammaslääkärin imutukkoja kyllästetään veren seerumilla, ja sitten ne asetetaan Petri-maljoille aikuisille pisto-kärpäsille esille; raatokärpäsen toukat altistetaan koe-20 putkissa. 24 ja 48 tunnin kuluttua hyönteiset tutkitaan, ja kuolleiden määrä lasketaan. Kokeiden tulokset kirjataan kuolleiden hyönteisten prosenttiosuutena.

Systeeminen koe lampaassa

Kokeet suoritetaan lampaassa käyttäen edellä mar-25 sukokeessa kuvattua koemenetelmää. Testattava yhdiste annetaan vatsaontelonsisäisenä tai suonensisäisenä ruiskeena tai pötsinsisäisesti; verinäytteet otetaan 24 tunnin kohdalla näissä kokeissa.

Systeemisistä kokeista marsussa ja lampaassa käyt-30 täen A83543A:ta ja A83543D:tä esitetään yhteenveto taulukoissa XXII-XXV.

A83543A ei osoittanut loismatojen vastaista aktiivisuutta lampaissa, joita käsiteltiin vatsaontelonsisäi-sellä tai pötsinsisäisellä kerta-annoksella 50 mg painoki-35 loa kohti, eikä hiirissä, jotka oli kokeellisesti infek- ii 57 96224 toitu suolistosukkulamadolla Nematospiroides dubius, kun niille annettiin suun kautta yhtenä pakkoruokinta-annokse-na 500 mg/kg.

58 96224 κ ΟΖΖΖΖΖΖΖΖ

H

tuOOOOOOOO ιο m m r~ σ> <h <

tuooooooom £Q oo o es o o N

t-3 r—l rH rH

I - ^ >* λ; AiOÄO<Zfl40iOS>ti »—< *—* i—I t—i I—i i—I i—t ►—« +" u θ' - — — — — — — — <2 >1 -i ^ E e \oooooomo 0 w a) tT-HiHnfoini/)<s >* •H C E rH p 0) Ή X ®

PE

CO) es 2 o <0 z <o ί* P ft e

C ra 2 P

• >i £ p m j* p o =2 e

> e c <D

•h ro ra > ra x £ o αοζζζζζ £ p e e h ti o.

h ra 2 « J 2 a e 5 s m · p ra ® < e p 3 $2 * O ,¾ C 0) in tn o o o o o 00 Η e ra p g 2 mo* .v S S 5 e e 5 < H ra 3 a x h o) **· p ·* P 3 Φ e

,, >1 f SO O *0 P

Λ *0 S X P P *J

rl e U o e « U -nTjpCflJ -h cc O r* pLrararamrara n 2 & ° ° 2 2 2 > n Q «1 β O P P <0 o e m ^22 2 o. ra ra h #o =ra p

-5 P »J I-IH CedP3lt)(BWraP

± f -h6(bso3>;ppp3 Ξ 2 cmc.xmccmmra d · ® cS-hoppocca: 2 S3 ft sä^praraiopo) ^ 2 £ "prao .PPoa ®w Cs«0PPPl0O33 p « * T Τ' Τ' Τ' T ai 3 ra > & ra ra ? C ti. un# p 3 jx ι-i n m ι-t o pT} il h n n n

P W \ — — — — — p ft tn X

H 1¾ 5 o z o* k > a* X ra E o o o o o * «<PE-*— pppo (OS r-ι es eo in m il 59 96224 h co o o o ooo o o o

' H

Q * 3 » m § n tn

oo *H

< .S

3 M

4j ml o o o ooo id o in ^ tJ| d- es

G

0) c H .

p In S to o o o ooo ooo ooo oo

fll dt> < in OTi»mvD

ij < I M

« 3 S

är S 5 m -h H < ;h D ij tu n S cq ooo ooo ooo omin oo tt <t> tn m o σ> di o

ID r-t rH

CO 00 < « «

π M I

c -H ° G G G G

"3 -M -H -H -H -H

< CT o SÄÄ EX5J3 EÄÄ EÄÄ ΛΛ ^iJo S S O IS) rp OLDTf O ΙΛ ^ O l/l ^ ID ^ S e tu-rnncNCDDinDinDJ di c £ > Ό <1)

2 W « C

<3 Λί Λ C

..3 λ: o. a)

MW G M G

M -H O SO -H

M > P .* SO

X -H ' - O ® * !p -H <D w w

Ov 1 O, Pn di di <0 W -H G

Viri O S m ·“· m m P 30 Oi O

M 5, ti £ O O. H

g j? s 5 «as® m λ; so <d p 3 ΐ a: g g a >1 o Tl 2 MP P G <0 M « λ w

^ <0 -H P

φ O Λ (0 p Λ >

C O' «H

o M ·* » N, 0 \ O O O O O Ui Ui S C tr M 0>l n ID ID CO CO Oi

Jj E J < M

96224 60

C

(0 in! <1 o o o o o o (0

' -M

- 0) >1 Hl o o o o o o t;

Ή r—* CNi in O

lie ft (0 <rl <1 o o o o o o ^ «0 0) >> > •Hl iJI O o o o o o

^ -» Ό -PC

^ (0 -H

u o

en <100000 O PH

llrt ® H

’£ X o H tJI o o o o o o fi*'”’

«e es oo σ\ P

υ ft C

M *0 I <* ® § >1 M 0) i cmoooooo o mm

P CO P « »—* CN <N r* ® S

H β) 0 3 > PH

Il m - « H Hl O O O O O O P XÖ « > V 't ft W W W ^

li r “ - C

I S « g -I <' ° ° O o o ° ~ Φ X Ό 0* X “0, i> ._j μ h E > c Ξ >iiöiö e -h hi o o o o o o n 5 is S JJ m M! li o\ O O) <0

|aH p ft S e -P

® E w e •H (0 CO -H (0 03 H 3 ® <10 0000 O Λ1 P P PjB rl rl r rn e M <0 5 C “ ·0 un «J Ai

•p 0) Tt >| hi o o m o o o aO *H

> -n ^ * ^vr<Mrn Σ <

P M '"n Λ U

p ® g C -P 1 -h <100000 o ·· Q) « ε rt f\J rl < P i S m h «ei <2 *" p on hi o o o m o o • I V *n esi in P Γ ro H ^ 5 ® e oi <1000000 e ® ® fi Jj C ®

>-tHH # Hl OOOOO O ¥ O, -H

M e H ft g P *0 C

x ® fi ® Rxow g

x 3 3 p ^ H C C

^-Rpp e. o n ® ή ^>1 ^ gpecao

0 P <1 «I IO oc o 00 >-1 en in <x> H! β) O Ή CO

• Αί -P (Ί C 3C - J2 H H aÖ -H

• X e H ^ 00 r-ι <r in -ht o Cu 0) CO CO

.. 3 o e E 3ft en co tn m ^ en O* p H C

hO<B3 ^ ^ Jo C C W O

3 P P SolOCE

(O CO CO Q) ·5 C ® "H -H

Eh3H® _ . H -H CO CO Ai

€ S ” ii;£„,SJ s 5 S S S

cc® <uK55><o-h<i> E μ !> a h OOH Pwwwt-i-inpp W <0

εκ., _i *<-> k-/ rö M -P C 11 U U

g« □ Ή H H N +J4J ‘H»0 tt u H " " 2·®- <λ * * v ccuiP u _ ^

(O 3 *<TJ OOlH X ro O »<T3 «Ö j K

K I -P S i S ί * * * E r1 < H M M

II

61 96224

ιΛ| d O O O O O O

ro G

s , S

21 Pl m uo m o o o ±j « « N ^ a a p o < <100000 o cm cm ro (0

«ö P

> >-j| 00000 o P

n c » a) ft ^ ro Cl OOOOO O ti ζ

—i CM l'- CM JO -H

'5 Im O

·> ^

u ;3 pi o o a o o o OH

f a w 2 2 I o « 1 · J> 2 p «) JJ 3 Csll <IOOOOO O G ‘

•H W O w .cd1 ro r- ctx ~ (0 G

Im (0 -h > <U

aO{D(0 "J piooooo o 2S

xO Im ij □ '£ cm o o O X

lf s 1 ~ “ ui

i S c J ^ ~ 1 C

CV ό 5 a) > I —^ qj e -H ® m ;«l ^1 0 s s 0 o 0 CO to

_J Ui „ <U \ E

m E “ Öl (0

p <0 R ,S <1000000 EP

C H t >,·“ rt 'Ί N N — G

•O c -H 1 m ® ΡI O I/O © O O O Ti- C 42, H ~ ^ ^ ~ £2

5 ? - Λ -H

— P I e s <

G+j -rl <1000000 iT1U

·· Φ O E ~ 00 ~ S P H uo U °> P ro Pl o o o uo o o l_ -H tH 1-1 cm n £ > CO — _ r < ro G o <1 o o o o o o JS e1

Ή - H > v aO G

“ Ή ^ H ,3 pi 00000 o TS O1 P

a guaoc S t» S ® H so tn <d * g £ p ^ p g g p R p e o tn a> p

n >m ^ j1 g+JCCaO

o o 10 1 cf-' Hi m o ή to •5 P 2 C s e“ « « Hh ^ 1« ^ S m H Λ m 5 C 1 -ri 1 -36 eo r-Γ MT ^ MT o o. a s 2 r

_R O g a ro ro ro cm 'ϊ ro PPG

P CJ G G 1· a P C C to O

gq)p 7) <5 o c e totopa) 7; c <0 -h p ehsmoj H p tn tn .1 -G p tn λ ti 3 p p tn U<U. c-» ^ . i, 2 jä n o <0

CPfl) (l)ftlOSDS^~'|l-|r-l 1, p > Οι P

O G p u Ό ε O h ^wwwHH.nQP .. II H n O) >i P 'H — — cm OPP15 "» (0 jr 3 ϋΐΤ!,Τ{2_1ΡΡ ·Η>ο fvr»'·^ 2 p R «ajJiS^'Tectnp j

35 P S^ÖOl/IXigQinjtflj # < H M W

uOuOCM-iyi^v^E

62 96224

In vitro -testeissä lampaan sukkulamatoa Haemon-chus contortusta vastaan, A83543A tappoi 30 % madoista pitoisuudessa 100 miljoonasosaa.

Ektoparasiittimyrkkymenetelmiä 5 Tämä keksintö liittyy siis myös menetelmään, jolla torjutaan sellaisten hyönteisektoparasiittien populaatiota, jotka syövät isäntäeläimen verta, jolloin isäntäeläi-melle annetaan tehokas määrä A83543-yhdistettä. Hyönteis-ektoparasiitteihin kuuluvat hyönteis- ja punkkiparasiitit. 10 Antotapa eläimelle voi olla ihon kautta, suun kautta tai vatsaontelonsisäisesti.

Parasiittihyönteisiin ja -punkkeihin kuuluvat verta imevät kuin myös lihaa syövät lajit, jotka ovat para-siittisiä koko elämänkiertonsa ajan tai vain osan elämän-15 kiertoaan, kuten vain toukkavaiheessa tai vain aikuis-vaiheessa. Edustaviin lajeihin kuuluvat seuraavat:

Paarma Tabanus spp.

pistokärpänen Stomyxos calcitrans 20 mäkärä Simulium spp.

hevostäi Haematopinus asinl syyhypunkki Sarcoptes scabiei "scab mite"-punkki Psoroptes equi "horn fly" Haemotobia irritans . 25 "cattle biting louse" -nautatäi Bovicola bovis nautatäi Haematopinus eurystemus "longnosed cattle louse" -nautatäi Linognathus vltuli 30 tsetse-kärpänen Glossina spp.

• "cattle follicle mite" ' -täi Democex bovis "cattle tick" Boophilus microplus ja B. decolo- -puutiainen ratus 35 "Gulf coast tick" -puutiainen Amblyomma maculatum

II

96224 63 "Lone Star tick" -puutiainen Amblyomma americanum "ear tick"-puutiainen Otobius megnini "Rocky Mountain wood 5 tick" -puutiainen Dermacentor andersoni "screwworm fly" Cochliomyia hominivorax petolude Reduvius spp.

hyttynen Culiseta inornata "brown ear tick" 10 -puutiainen Rhipicephalus appendiculatus "African red tick" -puutiainen Rhipicephalus everts "bont tick" -puutiainen Amblyomma sp.

15 "bont legged tick" -puutiainen Hyalomma sp.

sikatäi Haematooinus suis hietakirppu Tunga penetrans "body louse" -täi Haematopinus ovillus 20 "foot louse" -täi Linognathus oedalis lampaan täikärpänen Melophagus ovinus "sheep scab mite" -punkki Psoroptes ovis "greenbottle fly" 25 (vihreä raatokärpänen) Phaenicia sericata musta raatokärpänen Phormia regina "secondary screw-worm" Cochliomyia macellaria lampaan raatokärpänen Phaenicia cuprina lutikka Cimex lectularius 30 "Southern chicken flea" -kirppu Echidnophaga gallinacea "fowl tick" -puutiainen Argas persicus "chicken mite" 35 -punkki Dermanyssus gallinae - 96224 64 "scalyleg mite" -punkki Knemidokoptes mutans "depluming mite" -punkki Knemidokoptes gallinae 5 "dog follicle mite" -punkki Demodex canis koirankirppu Ctenocephalis canis "American dog tick" -puutiainen Dermacantor variabilis 10 "brown dog tick" -puutiainen Rhlplcephalus sanguineus

Menetelmää voidaan käyttää suojaamaan hyöty- ja seuraeläimiä ektoparasiiteiltä. Esimerkiksi yhdisteitä 15 voidaan edullisesti antaa hevosille, naudoille, lampaille, sioille, vuohille, koirille, kissoille ja näiden kaltai sille, kuin myös eksoottisille eläimille, kuten kameleille, laamoille, peuroille ja muille lajeille, joita yleensä nimitetään villieläimiksi. Yhdisteitä voidaan myös edulli-20 sesti antaa siipikarjalle ja muille linnuille kuten kalkkunoille, kananpojille, ankoille ja näiden kaltaisille. Edullisisesti menetelmää sovelletaan hyötyeläimiin, ja edullisimmin nautoihin ja lampaisiin.

Tehokkaan antamisen määrä, ajoitus ja tapa vaihte- : 25 levät paljon riippuen siitä, mikä parasiitti kulloinkin on * kyseessä, parasiittihyökkäyksen asteesta ja muista tekijöistä. Yhdistettä voidaan antaa tietyin väliajoin isännän koko elinajan, tai vain parasiittihyökkäyksen huippukauden ajan. Yleensä ektoparasiittitorjuntaan päästään käyttämäl-30 lä paikallisesti nestemäisiä formulaatioita, jotka sisäl-'· tävät noin 0,00005-95,0 % ydistettä, edullisesti 5 %:in asti ja edullisimmin 1 %:in yhdistettä asti. Tehokas parasiittien torjunta saavutetaan antomäärillä noin 5-100 mg/kg.

li 65 96224

Yhdisteitä käytetään isäntäeläimiin tavanomaisten eläinlääketieteellisten menettelytapojen mukaisesti. Yleensäyhdisteet formuloidaan ektoparasiittimyrkkykoostu-muksiksi, jotka käsittävät yhdisteen ja fysiologisesti so-5 veliaan kantajan. Esimerkiksi nestemäiset koostumukset voidaan yksinkertaisesti sumuttaa niiden eläinten päälle, joiden ektoparasiittejä halutaan torjua. Eläimet voivat myös käsitellä itseään sellaisten laitteiden avulla, kuten selänraaputtimien, jotka voivat sisältää myrkky-yhdisteen 10 esimerkiksi kankaassa, joita vasten eläimet voivat kävellä ja joutua kosketuksiin. Kastamisaltaita voidaan myös käyttää aktiivisen aineen viemiseksi isäntäeläimeen.

Puheena olevilla yhdisteillä tavataan systeemistä ektoparasiittimyrkkyaktiivisuutta. Yhdisteillä on kyky 15 kulkeutua sen isäntäeläimen kudosten läpi, jolle jotakin näistä yhdisteitä on annettu. Hyönteisparasiitit, jotka sitten syövät isäntäeläimen verta tai muita eläviä kudoksia, kuolevat siitä. Yhdisteitä voidaan antaa dermaalista, suun kautta tai perkutaanista antotapaa käyttäen.

20 Tässä kuvataan myös ektoparasiittimyrkkykoostumuk- sia, jotka käsittävät fysiologisesti soveliaan inertin kantajan ja A83543-yhdisteen. Nämä koostumukset voidaan valmistaa sinänsä tunnetulla tavalla, esimerkiksi liuottamalla yhdiste johonkin monista fysiologisesti soveliaista .25 apuaineista tai laimennusaineista. Suun kautta antaminen voidaan toteuttaa sekoittamalla yhdiste eläinten rehuun tai juomaveteen, tai antamalla annosvalmisteita, kuten tabletteja, kapseleita, boleja tai implantabletteja. Per-kutaaninen antotapa toteutetaan vaivattomasti injektio-30 kelpoisen formulaation ihonalaisella, vatsaontelonsisäi-sellä tai laskimonsisäisellä injektiolla.

Valmisteet voidaan formuloida suun kautta annettaviksi tavallisiin muotoihin, kuten pakkolääkitysannoksik-si, tableteiksi tai kapseleiksi. Tällaiset koostumukset 35 vaativat tietenkin suun kautta otettavaksi soveliaita • 96224 66 inerttejä kantajia. Yhdisteet voidaan myös formuloida in-jektiokelpoiseksi liuokseksi tai suspensioksi ihonalaista, dermaalista, pötsinsisäistä, vatsaontelonsisäistä, lihaksensisäistä tai laskimonsisäistä injektiota varten. Jois-5 sakin sovellutuksissa yhdisteet formuloidaan vaivattomasti yhdeksi komponentiksi eläinten normaalia rehua. Tässä ilmenemismuodossa on tavallista formuloida yhdiste ensin esiseokseksi, jossa yhdiste on dispersoituna nestemäiseen tai hienojakoiseen kiinteään kantajaan. Esiseos voi sisäl-10 tää noin 4,4-550 grammaa yhdistettä kiloa kohti. Esiseos puolestaan formuloidaan lopulliseen rehuun tavanomaisesti sekoittamalla.

Koska ektoparasiittihyökkäyksiä yleensä esiintyy huomattavan osan isännän elinajasta, on edullista antaa 15 tämän keksinnön mukaisesti valmistettuja yhdisteitä sellaisessa muodossa, josta yhdistettä vapautuu jatkuvasti ajan kuluessa. Tavanomaisiin menetelmiin kuuluu fyysisesti liukenemista estävän matriksin käyttö, jossa matriksi on vahamainen puolikiinteä aine, kuten kasvivahat tai korkea-20 molekyylipainoinen polyetyleeniglykoli. Hyvä tapa antaa yhdisteitä on sellaisen pitkävaikutteisen bolin avulla, kuten Labylla, yhdysvaltalainen patentti 4 251 506, ja Simpsonilla, brittiläinen patentti 2 059 767. Tällaista bolia varten yhdiste olisi suljettuna sellaiseen polymee-25 rimatriksiin kuten Nevinillä, yhdysvaltalainen patentti 4 273 920. Tämän keksinnön mukaisesti valmistettujen yhdisteiden jatkuvaan vapautumiseen voidaan myös päästä käyttämällä implantaattia, esimerkiksi silikonia sisältävästä kumista.

30 Tämän keksinnön toiminnan havainnollistamiseksi täydellisemmin, seuraavat esimerkit annetaan:

Esimerkki 1 A83543:n HPLC-määritysmenetelmä

Seuraava analyyttinen HPLC-menetelmä on hyödylli-35 nen A83543:n tuotannon seuraamiseksi fermentaatiossa:

II

- 96224 67

Sentrifugoi näyte koko liemestä, dekantoi ja poista supernatantti. Lisää biomassaan riittävästi metanolia näytteen palauttamiseksi alkuperäiseen tilavuuteensa, sekoita ja anna seoksen seistä vähintään 15 minuuttia. Sent-5 rifugoi ja suodata supernatantti 0,45 pm:n suodattimen läpi.

Vaihtoehtoisesti kokolientä voidaan uuttaa asetoni triilillä (1:4 liemi:liuotin) tai asetonilla.

HPLC-systeemi: 10 Pylvään kiinteä faasi: 8 x 100 mm pylväs, pal lomainen 4 pm:n C18-piidioksidigeeli (Nova C18, Waters)

Liikkuva faasi: CH3CN/Me0H/H20 (45/45/10), joka sisältää 0,05 % ammoniumasetaattia

Virtausnopeus: 4 ml minuutissa 15 Detektio: UV aallonpitudella 250 nm

Retentioajat: A83543A - 3,6-3,7 minuuttia A83543D - 4,4-4,5 minuuttia

Esimerkki 2 A83543:n valmistus viljelemällä A83543.1:tä 20 A. Fermentaatio ravisteltavissa pulloissa

Saccharopolyspora spinosa NRRL 18395:n viljelmää, joko kylmäkuivattuna solunappina tai nestetypessä pidettynä suspensiona, käytetään sellaisen vegetatiivisen ela-tusaineen ymppäämiseen, jolla on koostumus A tai B (ela-« 25 tusaine B on edullinen suuren mittakaavan tuotantoon):

Vegetatiivinen elatusaine A Ainesosa Määrä (%) "Trypticase" -soijaliemi* 3,0

Hiivauute 0,3 30 MgS04 7H20 0,2 : Glukoosi 0,5

Maltoosi 0,4

Deionisoitu vesi q.s. 1 litraan pH:ta ei säädetä 35 *Baltimore Biological Laboratories 68 96224

Vegetatiivinen elatusaine B Ainesosa Määrä (%)

Entsyymihydrolysoitu kaseiini* 3,0 Hiivauute 0,3 5 MgSO, 7H20 0,2

Glukoosi 1,0

Deionisoitu vesi q.s. 1 litraan pH 6,2, säädetään arvoon 6,5 NaOH:lla *NZ Amine A, Sheffield Products, P.O. Box 638, 10 NY 13815

Vinopintoja tai maljoja voidaan valmistaa lisäämällä 2,5 % agaria vegetatiiviseen ymppielatusaineeseen A tai B. Ympättyä vinopintaa inkuboidaan 30 °C:ssa noin 10-14 päivää. Kypsää vinopintaviljelmää raaputetaan sterii-15 Iillä työvälineellä itiöitten irrottamiseksi ja myseeli-kerroksen poistamiseksi ja hajottamiseksi. Noin neljäsosa näin saaduista irrotetuista itiöistä ja viljelmän kasvustosta käytetään 50 ml:n ensimmäisen vaiheen vegetatiivista siiroste-elatusainetta ymppäämiseksi. Vaihtoehtoisesti 20 ensimmäisen vaiheen elatusaine voidaan ympätä nestetyppi- ampullista.

Kun viljelmää säilytetään nestetypessä, ampullit valmistetaan käyttäen yhtä suuret tilavuudet vegetatiivista viljelmää (48-72 tunnin inkubaatio, 30 eC) ja suspen-:· 25 sointielatusainetta. Suspensointielatusa.ine sisältää lak toosia (100 g), glyserolia (200 ml) ja deionisoitua vettä (q.s. 1 litraan).

Nestetyppiampullia käytetään 100 ml:n vegetatiivista elatusainetta ymppäämiseksi 500 ml:n Erlenmeyer-pul-30 loissa (tai 50 ml:n elatusainetta 250 ml:n pulloissa).

, Viljelmiä inkuboidaan 30 “C:ssa 48 tuntia ravistelijassa, joka kiertää 5,08 cm ympyrää nopeudella 250 rpm.

Inkuboitua viljelmää (5 %:n ymppi tilavuuksien mukaan) käytetään 100 ml:n tuotantoelatusainetta, jolla on 35 seuraava koostumus, ymppäämiseen:

II

- 96224 69

Tuotantoelatusaine I

Ainesosa Määrä (%)

Glukoosi 4

Kasvisproteiini, osaksi 5 entsyymihydrolysoitu* 1,5-3

Puuvillansiemenj auho** 1,0

CaC03 (reagenssi- tai tekninen puhtaus) 0,3

Soijaöljy 1,0 10 Hanavesi q.s. 1 litraan (pH ennen sterilointia säädetään arvoon 7,0 NaOH:11a) *Sheftone H, Sheffield Products **Proflo, Traders Protein, P.O. Box 8407, Memphis, 15 TN 38108

Ympättyä tuotantoelatusainetta inkuboidaan 500 ml:n Erlenmeyer-pulloissa 28-30 eC:ssa 6-8 päivää ravis-telijassa, joka kiertää 5,08 cm ympyrää nopeudella 250 rpm.

20 B. Fermentaatio sekoitetussa bioreaktorissa

Suuremman ymppitilavuuden tuottamiseksi 10 ml in-kuboitua ensimmäisen vaiheen elatusainetta, valmistettu kuten jaksossa A on kuvattu, käytetään 400 ml:n toisen vaiheen vegetatiivisen elatusaineen, jolla on sama koos-'25 tumus kuin ensimmäisen vaiheen vegetatiivisella elatus- aineella, ymppäämiseen. Tätä toisen vaiheen elatusainetta inkuboidaan 2 l:n laajasuisessa Erlenmeyer-pullossa noin 48 tuntia 30 eC:ssa ravistelijassa, joka kiertää 5,08 cm ympyrää nopeudella 250 rpm.

30 Näin valmistettua inkuboitua toisen vaiheen vege- • tatiivista elatusainetta (2 1) käytetään 80-115 litran steriiliä tuotantoelatusainetta, valmistettu kuten jaksossa A on kuvattu, ymppäämiseen. Lisää soijaöljyä lisätään vaahtoamisen estämiseksi tarvittaessa.

70 96224

Ympätyn tuotantoelatusaineen annetaan fermentoitua 165 l:n sekoitetussa bloreaktorlssa 5-8 päivää 28 °C lämpötilassa. Ilman virtauksen ja sekoittajan nopeutta sekoitetussa astiassa säädetään tietokoneella, jotta pidettäi-5 siin yllä liuenneen hapen taso, joka vastaa ainakin 50-prosenttista ilmalla kyllästystä.

Esimerkki 3 A83543A:n, B:n ja C:n eristys

Fermentaatiolientä (225 litraa), valmistettu kuten 10 esimerkissä 2 on kuvattu, suodatettiin käyttäen suodatus-apuainetta (1 % Hyflo), ja erotettu biomassa pestiin vedellä (»50 1). Sitten biomassaa sekoitettiin metanolin kanssa (»100 1) noin tunnin ajan ja suodatettiin.

Metanolisuodos konsentroitiin noin litran tilavuu-15 teen. Konsentraattia uutettiin kolmesti dietyylieetterillä (1 1 joka kerralla). Yhdistetyt eetteriuutokset konsentroitiin noin 200 ml:n tilavuuteen.

Osa konsentraattia (8 ml) ajettiin piidioksidigee-lipylväskromatografiässä (RP-8 Lobar, koko B, E.M. Scien-20 ce, a Division of E.M. Industries, Inc.).

Tätä menettelyä toistettiin yhteensä 12 ajon (syklin) verran. Preparatiivisen kromatografian "Autoprep"-moodissa suorittamisen instrumenttijärjestely ja toteutustapa kuvataan seuraavassa: 25 Täydellinen "Autoprep"-HPLC-systee^i koostuu kol mesta Rainin Rabbit HPX -pumpusta, yhdestä painemodulista, yhdestä Gilsonin malli 20 IB -HPLC-fraktionkerääjästä, yhdestä ISCO-V4-absorbanssidetektorista ja yhdestä Apple Macintosh Plus -tietokoneesta. Koko systeemi on järjestet-30 ty niiden ohjeiden mukaan, jotka on annettu Dynamax HPLC · Method Manager -käsikirjassa yhtiöltä Rainin Instrument

Company, Inc. "AutoprepM-HPLC-järjestely käyttää hyväkseen systeemin automatisointia ja mahdollistaa preparatiivisten erotusten ajon toistetusti käytännössä identtisissä olo-35 suhteissa käytännössä identtisin tuloksin. Toisiaan vas- |] 71 96224 taavien fraktioiden keräys ja yhdistäminen useammista ajoista antaa kromatografiakapasiteettia ilman, että tarvitsee suurta pylvästä.

Kahta liuotinseosta A ja B käytetään isokraat-5 tisesti virtausnopeudella 8,0 ml minuutissa.

Liuotinsysteemit Määrä (ml)

Liuotin A B

CH30H 95 100 10 CH3CN 95 100 H20 10 Käytetty isokraattinen seos sisältää 60 % liuotinta B.

Ajoaika joka syklille on 28,0 minuuttia. Eluaatti 15 ensimmäisten 16 minuutin ajalta joka ajosta heitetään pois. Seuraavat eluaatit kerätään kuudessa aikafraktiossa, 2 minuuttia (16 ml) kukin.

Automaattisesti yhdistetyt fraktiot kustakin 12 syklistä johtivat kuuteen lopulliseen fraktioon ("kromato-20 grafiaviipaleeseen").

Aktiivisten A83543-yhdisteiden läsnäolo määritetään analysoimalla jokaisesta lopullisesta fraktiosta sääskentoukka-aktiivisuus ja myös analyyttisellä HPLC:llä.

Sitten aktiiviset fraktiot yhdistetään aktiivisuu-.. 25 tensa ja HPLC-profiiliensa mukaan, ja puhdistetaan edel leen, käyttäen samaa "Autoprep" HPLCrtä ja liuotinsystee-miä, mutta korkeaerotuskykyisellä, 21,4 mm x 25 cm prepa-ratiivisella pylväällä (Rainin Dynamax), valmiiksi pakattu 8 pm: n C-18-käänteisfaasipiidioksidigeelillä, tuloksena 30 A83543-komponentit A, B, C ja D. Tekijät A ja D kiteytyvät ^ metanolin ja veden seoksesta.

A83543C:n FD-MS esitetään piirrosten kuviossa 5, ja A83543B:n FAB-MS esitetään kuviossa 9.

- 96224 72

Esimerkki 4 A83543A:n ja D:n puhdistus

Fermentaatiolientä (10 1) valmistettiin kuten on kuvattu esimerkin 2 jaksossa A, paitsi että 1) 200 ml tuo-5 tantoelatusainetta käytettiin 1 l:n pulloissa; 2) soijaöl-jy jätettiin pois tuotantoelatusaineesta; ja 3) inkubaatio oli 30 °C:ssa 4-6 päivää. Liemi suodatettiin. Suodos, joka sisälsi 40 pg A83543A:ta/ml eikä havaittavia määriä A83543B:tä, C:tä tai D:tä, heitettiin pois.

10 Biomassaa pestiin vedellä ja uutettiin tunnin ajan metanolilla. Uutos (7 1) sisälsi 720 pg A83543A:ta/ml ja 70 pg A83543D:tä/ml.

Metanoliuutos konsentroitiin 5 l:n tilavuuteen, ja pantiin vedessä (2 1) olevan HP-20-hartsin (150 ml, Mitsu-15 bishi Chemical Industries, Ltd., Japani) päälle. Seosta sekoitettiin tunnin ajan.

Sitten HP-20-hartsiseos pantiin lasipylvääseen. Aluksi läpituleva liuos ja eluaatti käyttäen liuosta me-tanolirvesi (1:1, 1 1) eivät olleet aktiivisia. Toinen 20 eluaatti käyttäen liuosta metanoli:vesi (7:3, 1 1) sisälsi hyvin pieniä määriä A83543A:ta. Seuraava eluaatti käyttäen metanolia (11) sisälsi A83543A- ja A83543D-aktiivisuuden.

Metanolieluaatti konsentroitiin ja yhdistettiin kahteen samankaltaiseen fraktioon toisista alkupuhdistuk-.. 25 sista ja konsentroitiin kuiviin. Jäännös liuotettiin 75 ml:an liuosta metanoli:THF (4:1) ja seostettiin lisäämällä kymmenkertaiseen tilavuuteen asetonitriiliä. Seos suodatettiin, ja suodos konsentroitiin kuiviin.

Jäännös liuotettiin metanoliin (25 ml) ja pantiin 30 5,5 x 90 cm pylvääseen metanolissa olevaa LH-20 Sephadexia | (Pharmacia LKB Biotechnology Inc, U.S.A.) keräten ja ana lysoiden 125 25 ml:n fraktiota esimerkissä 1 kuvattua HPLC-menetelmää käyttäen.

Halutut yhdisteet sisältävät fraktiot yhdistettiin 35 ja konsentroitiin. Jäännös liuotettiin metanoliin (10 ml)

II

- 96224 73 ja pantiin 41,1 mm x 25 cm preparatiivisella pylvääseen, joka oli valmiiksi pakattu 8 pm:n C-18-käänteisfaasipii-dioksidigeelillä (Rainin Dynamax).

Pylväs oli tasapainotettu liuokseen metanoli:ase-5 tonitriili:vesi (37,5:37,5:25). Näytteen lataamisen jälkeen pylvästä ajettiin käyttäen 180 minuutin lineaarista gradienttia seuraavista liuottimista:

Liuotinsysteemi Määrä (ml)

10 Liuotin A B

CH30H 37,5 45 CH3CN 37,5 45 H20 25 10

Gradientti ajettiin 100 % A:sta 100 % B:hen kerä-15 ten 25 ml:n fraktioita.

A83543A:ta sisältävät fraktiot yhdistettiin, konsentroitiin kuiviin, liuotettiin t-BuOH:in (5 ml) ja kyl-mäkuivattiin tuloksena 778 mg puhdasta A83543A:ta.

A83543A:n IR-spektri CHCl3:ssa esitetään kuviossa • 20 1. A83543A:n FD-MS-spektri esitetään kuviossa 4, A83543A:n FAB-MS-spektri esitetään kuviossa 8 [FAB-dispersointiaine ditiotreitoli:ditioerytritoli (5:1)], ja A83543A:n EI-MS-spektri esitetään kuviossa 10.

A83543D:tä sisältävät fraktiot yhdistettiin D:tä 25 sisältäviin fraktioihin kuudesta samankaltaisesta erotuksesta ja konsentroitiin ja ajettiin kromatografiässä kuten edellä on kuvattu, käyttäen samaa pylvästä mutta eri liuottimia. Pylväs oli tasapainotettu liuokseen metanoli:ase-tonitriili:vesi (40:40:20). Liuotinsysteemit, joita käy-30 tettiin pylvään ajamiseen 180 minuutin lineaarisessa gra-dienttioperaatiossa olivat:

Liuotinsysteemit Määrä (ml)

Liuotin A B

35 CH3OH 40 95 CH3CN 40 95 H20 20 10 • 96224 74 A83543D:tä sisältävät fraktiot yhdistettiin ja konsentroitiin. Jäännös liuotettiin t-BuOH:in (5 ml) ja kylmäkuivattiin tuloksena 212 mg A83543D:tä.

A83543D:n IR-spektri CHCl3:ssa esitetään kuviossa 5 2, ja A83543D:n FD-MS-spektri esitetään kuviossa 6.

Esimerkki 5 A83543-komponenttien E, F, G, H ja J sekä A:n pseudoaglykonin eristys.

Fermentaatiolientä (81), joka oli tuotettu saman-10 kaltaisilla menetelmillä kuin esimerkissä 2 kuvatut, käsiteltiin kuten esimerkissä 4 on kuvattu. Haluttuja yhdisteitä sisältävät fraktiot Sephadex LH-20 -pylväästä yhdistettiin vastaaviin fraktioihin samankaltaisista fermentaa-tioista. Koska komponentteja E, F, G, H, J ja A:n pseudo-15 aglykonia tuotetaan hyvin pieniä määriä, lukuisia fermen- taatioita tarvitaan riittävien määrien hankkimiseksi jat-kopuhdistusta varten.

Tällä tavalla valmistettu vähempimääräisten tekijöiden yhdistelmä, joka sisälsi noin 1,6 g kiinteää aines-• 20 ta, pantiin HPLC-pylvääseen (Rainin Dynamax), joka oli valmiiksi pakattu 8 pm:n C-18-käänteisfaasipiidioksidigee-lillä (ODS), kuten esimerkissä 4 on kuvattu. Pylväs oli tasapainotettu liuokseen CH30H:CH3CN:H20 (75:75:50), ja gra-dientti ajettiin 100 %:sta liuotinta A 50 %:in liuotinta B 25 seuraavilla liuotinsysteemeillä:

Liuotinsysteemit Määrä (suhteellinen osuus)

Liuotin A B

30 CH30H 75 95 CH3CN 75 95 : H20 50 10 keräten 25 ml:n fraktioita. Seuraavat fraktiot yhdistettiin:

II

- 96224 75

Pooli Fraktiot 1 31-44 2 45-63 3 64-69 5 4 70-80 5 81-130 6 131-160

Osa poolia 5 (100 ml) konsentroitiin jäännökseksi, liuotettiin metanoliin (1 ml) ja pantiin 21,4 mm x 250 mm 10 HPLC-pylvääseen (Rainin Dynamax) kuten esimerkissä 3 on kuvattu. Pylväs oli tasapainotettu käyttäen liuotinsystee-miä A seuraavista liuotinsysteemeistä:

Liuotinsysteemit Määrä (suhteel linen osuus)

15 Liuotin A B

CHjOH 30 95 CH3CN 30 95 H20 (1 N NH40Ac, pH 5,0) 40 H20 — 10 20 ja ajettiin käyttäen 120 minuutin lineaarista gradienttia 100 %:sta liuotinta A 50 %:in liuotinta B keräten 15 ml:n !! fraktioita virtausnopeudella 7,5 ml minuutissa. Eluutiota jatkettiin 50 %:sella B:llä vielä 60 minuuttia. Seuraavat fraktiot yhdistettiin: 25 Pooli Fraktio Komponentti

1 37 F

2 38-48 E

3 52-63 B, G

4 65-70 H, J

30 Nämä poolit yhdistettiin pooleihin muista kromatograflaajoista, joissa oli käytetty samankaltaisia lähtöaineita. Yhdistettyjä pooleja puhdistettiin edelleen käyttäen pyl-väskromatografiaa kuten edellä on kuvattu, niistä poistettiin suolat HP-20-hartseilla normaalitekniikoita käyt-35 täen, ja ne konsentroitiin ja kylmäkuivattiin seuraavien komponenttien saamiseksi: 76 96224

Komponentti Määrä (mg) Mol.paino* IR** E 249 717 Kuvio 13 F 4 717 Kuvio 14 G 104 717 Kuvio 15 5 H,J 87 717 Kuvio 16

Pseudo-A 288 590 Kuvio 3 ♦massaspektrometrialla **KBr-tabletti A83543A-pseudoaglykonin FD-MS- ja EI-MS-spektrit 10 esitetään vastaavasti kuvioissa 7 ja 11.

Esimerkki 6 A83543:n tuottaminen viljelemällä A83543.3:a A. Fermentaatio ravistelluissa pulloissa Käyttäen samankaltaisia menetelmiä kuin esimerkis- 15 sä 2, jaksossa A, Saccharopolyspora spinosa NRRL 18537:n viljelmää viljellään ravistelluissa pulloissa, mutta käyttäen seuraavan mukaista vegetatiivista elatusainetta C: Vegetatiivinen elatusaine C Ainesosa Määrä • 20 Entsyymihydrolysoitu kaseiini* 30,0 g

Hiivauute 3,0 g

MgS04 7H20 0,2 g

Glukoosi 10,0 g

Glyseroli 20 ml 25 Deionisoitu vesi q.s. 1 litraan

pH 6,6, säädetään arvoon 7,0 NaOH:lla *NZ Amine A

B. Fermentaatio sekoitetussa bioreaktorissa Viljelmän nestetyppiampulleja valmistetaan kuten 30 esimerkissä 2 on kuvattu käyttäen jakson B yleisiä menettelytapoja. Yksi ampulli käytetään ensimmäisen vaiheen ' vegetatiivisen viljelmän (50 ml elatusainetta C 250 ml:n pulloissa) ymppäämiseen, ja sitä inkuboidaan noin 48-72 tuntia. Inkuboitua ensimmäisen vaiheen viljelmää käytetään 35 ymppäämään (10 ml:n ymppi) toisen vaiheen viljelmä (400 ml il - 96224 77 elatusainetta C 2 l:n pulloissa), jota inkuboidaan noin 48 tuntia. Inkuboitua toisen vaiheen viljelmää (5 1) käytetään ymppäämään tuotantoelatusaine (115 1), jolla on seu-raava koostumus:

5 Tuotantoelatusaine II

Ainesosa Määrä (g/1)

Glukoosi 80

Peptonisoitu maito* 20

Puuvillansiemenjauho** 20 10 CaC03 5

Metyylioleaatti 30 ml/1

Hanavesi q.s. 1 litraan * Peptonized Milk Nutrient, Sheffield Products; jatkuvaa lisäruokintaa, neljännestä päivästä alkaen, nopeudella 5 15 mg/ml/päivä, voidaan käyttää.

** Proflo (pH ennen sterilointia säädetään arvoon 7,0 NaOH:lla)

Ympätyn tuotantoelatusaineen annetaan fermentoitua 165 l:n sekoitetussa bioreaktorissa noin 8-10 päivää tai 20 kauemmin 30 °C:en lämpötilassa. Liuenneen hapen (LH) tasoja seurastaan tietokonejärjestelmillä, jotka on säädetty pitämään LH-taso yli 50 %:ssa ilmalla kyllästyksestä kuten esimerkissä 2, jaksossa B on kuvattu.

Esimerkki 7 25 A83543:n valmistus viljelmällä A83543.5 A. Fermentaatio ravistelluissa pulloissa Käyttäen samankaltaisia menetelmiä kuin esimerkissä 2, jaksossa A, Saccharopolyspora spinosa NRRL 18539:n viljelmää viljellään ravistelluissa pulloissa käyttäen 30 vegetatiivista elatusainetta B.

· B. Fermentaatio sekoitetussa bioreaktorissa

Viljelmän nestetyppiampulleja valmistetaan kuten esimerkissä 2 on kuvattu käyttäen jakson B yleisiä menettelytapoja. Yksi ampulli käytetään ensimmäisen vaiheen 35 vegetatiivisen viljelmän (50 ml elatusainetta B 250 ml:n - 96224 78 pulloissa) ymppäämiseen, ja sitä inkuboidaan noin 48-72 tuntia. Inkuboitua ensimmäisen vaiheen viljelmää käytetään ymppäämään (10 ml:n ymppi) toisen vaiheen viljelmä (400 ml elatusainetta B 2 l:n pulloissa), jota inkuboidaan noin 48 5 tuntia. Inkuboitua toisen vaiheen viljelmää (2 1) käytetään ymppäämään tuotantoelatusaine (115 1), jolla on jompikumpi seuraavista koostumuksista:

Tuotantoelatusaine III

Ainesosa Määrä (g/1) 10 Glukoosi 80

Kasvisproteiini, osittain entsyymihydrolysoitu* 20

Puuvillansiemenjauho** 10

CaC03 5 15 Metyylioleaatti 30 ml/1

Hanavesi q.s. 1 litraan * Sheftone H ** Proflo (pH ennen sterilointia säädetään arvoon 7,0 NHyOH:lla)

20 Tuotantoelatusaine IV

Ainesosa Määrä (%)

Glukoosi 8

Puuvillansiemenjauho* 3

Peptonisoitu maito** 2 . 25 Maissinliotusvesi 1 • <

CaC03 (tekn. puhtaus) 0,5

Metyylioleaatti 3,0

Hanavesi q.s. 1 litraan * Proflo 30 ** Peptonized Milk Nutrient (pH ennen sterilointia säädetään arvoon 7,0 NaOH:lla)

Ympätyn tuotantoelatusaineen annetaan fermentoitua 165 l:n sekoitetussa bioreaktorissa noin 8-10 päivää tai kauemmin 30 °C:en lämpötilassa. LH-tasoja säädellään kuten 35 esimerkissä 6 on kuvattu.

Il - 96224 79

Esimerkki 8 A83543:n valmistus viljelmällä A83543.4 Käyttäen samankaltaisia menetelmiä kuin esimerkeissä 2 ja 7, viljelmää Saccharopolyspora spinosa NRRL 5 18538 viljellään, mutta käyttäen vegetatiivista elatusai- netta B ja tuotantoelatusainetta III.

Esimerkki 9

Fermentaatiolientä valmistetaan kuten esimerkissä 8 on kuvattu. A83543 erotetaan liemestä seuraavasti: 10 1. Lisää liemeen yhtä suuri tilavuus asetonia ja suodata, käyttäen keraamista suodatinta tai suodatusapu-ainetta suodatuspuristimessa.

2. Säädä suodosliemen pH arvoon 10.

3. Lisää etyyliasetaattia (%-% liemen tilavuudes- 15 ta).

4. Ota talteen etyyliasetaattiuutos dekantoimalla pois sekoittumaton vesifaasi, ja konsentroi etyyliasetaattiuutos puoleen tilavuuteen alipaineella.

5. Uuta konsentroitua etyyliasetaattiliuosta vii-20 nihapon 0,1 M vesiliuoksella (½ tilavuutta) ja erota faasit.

6. Poista liuennut etyyliasetaatti vesifaasista tyhjiöhaihdutuksella (noin 5 %). Konsentroi vesiliuos käänteisosmoosioperaatiolla.

‘ 25 7. Säädä konsentroidun vesiliuoksen pH arvoon ΙΟ Ι 1 natriumhydroksidilla.

8. Erota sakka suodattamalla, pese vedellä ja kuivaa tyhjiössä, tuloksena A83543.

Esimerkki 10 30 A83543A-pseudoaglykoni .· Pääasiassa komponenttia A sisältävä A83543-näyte (n. 100 mg) liuotettiin metanoliin (50 ml), veteen (2 ml) ja väkevään suolahappoon (3 ml). Tämä liuos konsentroitiin kuiviin 50 eC:ssa. Jäännöstä käsiteltiin kahdesti dietyy-35 lieetterillä (200 ml kummallakin kerralla), ja liukenema- - 96224 80 ton aines heitettiin pois. Yhdistetyt epäpuhtaan pseudo-aglykonin sisältävät eetteriliuokset konsentroitiin kuiviin. Jäännös liuotettiin metanoliin (20 ml) ja puhdistettiin käyttäen esimerkissä 3 kuvattua AUTOPREP-HPLC-systee-5 miä, tuloksena 20 mg puhdasta A83543A-pseudoaglykonia. Esimerkki 11 A83543D-pseudoaglykoni valmistetaan A83543D:stä käyttäen samankaltaista menettelyä kuin esimerkissä 10 kuvattu.

10 Esimerkki 12

Seuraavat formulaatiot ovat tyypillisiä tässä keksinnössä hyödyllisille hyönteismyrkkykoostumuksille.

A. Vesisuspensio A83543A 12,5 % 15 "Tergitol TMN-6" (ei-ioninen pinta-aktiivinen aine) 1,0 % "Zeosyl 200" (piidioksidi) 1,0 % "AF-100" (silikonipohjainen vaahdonestoaine) 0,2 %

Ksantaaniliuos (2 %) 10,0 % , 20 "Makon 10" (10 moolia etyleenioksidia/ nonyylifenoli -pinta-aktiivinen aine) 9,0 %

Hanavesi 66,3 B. Emulsioitavissa oleva tiiviste A83543D 12,4 % 25 "Exxon 200" (naftaleeniliuotin) 83,6 % "Toximul H" (ei-ioninen/anioninen pinta-aktiivinen aineseos) 2,0 % "Toximul D" (ei-ioninen/anioninen pinta-aktiivinen aineseos) 2,0 % .96224 81

Esimerkki 13

Seuraavat esimerkkikoostumukset kuvaavat formu-laatioita, joissa käytetään A83543-yhdistettä.

A. Rehuun sekoitettava seos 5 A83543A 10 %

Riisinkuoria 85

Kevyttä mineraaliöljyä 5 B. Rehuun sekoitettava seos A83543E 25 % 10 Sinimailasjauho 60

Hienonnettu savi 5

Melassi 10 C. Suspensio A83543A 30 % 15 Naftaleenisulfonaattisuola 5

Ei-ioninen pinta-aktiivinen aine 5

Savustettu ("fumed") piidioksidi 1

Vesi 59 D. Päälletiputettava liuos 20 A83543A 20 %

Ei-ioninen pinta-aktiivinen aine 0,8

Propyleeniglykoli 15

Vesi 64,2 E. Päälletiputettava suspensio 25 A83543B 10 %

Ei-ioninen pinta-aktiivinen aine 1

Kevyt mineraaliöljy 89 F. Injektiokelpoinen liuos A83543A 15 % 30 Propyleeniglykoli 85 G. Injektiokelpoinen suspensio A83543C 25 %

Propyleeniglykoli 15

Vesi 60 35 H. Injektiokelpoinen suspensio A83543E 30 %

Polyvinyylipyrrolidoni 2

Vesi 68

Claims (4)

1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen A83543-yhdisteen valmistamiseksi, jolla on kaava 1:

5 RO ,R1 r ° r\-H h/\ ..l0R2 10 l / \ / R3 jossa R on H tai ryhmä 15 (CK3)2N-vCH3 (CH3)NH-k^CH3 'U ''U. (b) 20 (a) (CH3)2N-k^ Ν^Λ ch3 N^A tai 25 ! (c) <d) R2 on R50 p,— OCH3 30 ?\-^—OR6 ^ΛΛΛ R1, R3, R5 ja R6 ovat vety tai metyyli; I! - 96224 83 R4 on metyyli tai etyyli; tai sen happoadditiosuolan valmistamiseksi, kun R on muu kuin vety, tunnettu siitä, että viljellään Saccharopolyspora spinosa -kantaa NRRL 18395, NRRL 18537, NRRL 18538 tai NRRL 18539 elatus-5 aineessa, joka sisältää assimiloitavissa olevat hiilen, typen ja epäorgaanisten suolojen lähteet, aerobisissa pinnanalaisissa fermentaatio-olosuhteissa, kunnes talteen otettavissa oleva määrä A83543:a on tuotettu.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 10 tunnettu siitä, että valmistetaan A83543-yhdiste, jossa R, R1, R3, R4, R5 ja R6 esiintyvät jonakin seuraavista yhdistelmistä: R Rt R3 R4 R5 R6 15 _______ (a) Me H Et Me Me (b) Me H Et Me Me (c) Me H Et Me Me (a) Me Me Et Me Me 20 (a) Me H Me Me Me (a) H H Et Me Me (d) Me H Et Me Me (a) Me H Et H Me (a) Me H Et Me H : 25 H Me H Et Me Me H Me Me Et Me Me tai sen happoadditiosuola, kun R on muu kuin vety.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, 30 tunnettu siitä, että valmistetaan A83543-yhdiste, jossa R on (a)-ryhmä; R1, R5 ja R6 = CH3, R3 = H; ja R4 on etyyli; tai sen happoadditiosuola.

4. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan A83543-yhdiste, 35 jossa R on (a)-ryhmä; R1, R3, R5 ja R6 = CH3; ja R4 on etyyli; tai sen happoadditiosuola. 96224 84