FI75184B

FI75184B - Foerfarande foer framstaellning av en monoklonal antikropp mot maenskliga t-cellers antigener med en ny hybridcellinje.

Info

Publication number: FI75184B
Application number: FI810026A
Authority: FI
Inventors: Patrick Chung-Shu Kung; Gideon Goldstein
Original assignee: Ortho Pharma Corp
Priority date: 1980-01-08
Filing date: 1981-01-07
Publication date: 1988-01-29
Also published as: HK24486A; NO159621C; DE33578T1; PT72312A; YU45069B; AU545225B2; EP0033578B1; NO159621B; SG7286G; US4364937A; GR72758B; IE810018L; FI75184C; ZA8199B; JPH0159871B2; FI810026L; DK154092B; NZ195939A; PH20552A; IL61876A0

Description

751 84

Menetelmä monoklonaalisen vasta-aineen valmistamiseksi ihmisen T-solujen antigeenille uuden hybridisolulinjän avulla 5 Keksintö kohdistuu menetelmään monoklonaalisen vasta-aineen valmistamiseksi pinta-antigeenille, joka on löydetty käytännöllisesti katsoen kaikista ihmisen normaaleista perifeerisistä T-soluista ja noin 95 %:lta ihmisen normaaleja tymosyyttejä. Menetelmässä käytetään 10 hyväksi uutta hybridisolulinjaa. Vasta-ainetta voidaan käyttää terapeuttisiin tarkoituksiin.

Kohler ja Milstein yhdistivät vuonna 1975 hiiren myeloomasoluja immunisoitujen hiirien pernasoluihin /Nature 256 (1975) 495-4977, jolloin ensimmäisen kerran ha-15 valttiin, että oli mahdollista valmistaa jatkuva solu-linja homogeenisen (ns. "monoklonaalisen") vasta-aineen tuottamiseksi. Tämän jälkeen erilaisten hybridisolujen (ns. hybridomien) valmistamista on yritetty monin tavoin ja näiden hybridomien tuottamaa vasta-ainetta yritetty 20 soveltaa tieteelliseen käyttöön. Katso esimerkiksi:

Current Topics in Microbiology and Immunology, vol. 81 - "Lymphosyte Hybridomas", toimittajat F. Melchers, M. Potter ja N. Warner, Springer Verlag 1978 ja julkaisun sisältämät kirjallisuusviitteet; C.J. Barnstable 25 et al., Cell 14 (toukokuu 1978) 9-20; P. Parham ja W.F. Bodmer, Nature 276 (1978) 397-399; Handbook of Experimental Immunology, 3. painos, vol. 2, toimittaja D.M. Wier, Blackwell 1978, kappale 25; ja Chemical and Engineering News, tammikuu 1 (1979) 15-17.

30 Näissä viitteissä on esitetty saavutetut tulokset ja esiintyneet vaikeudet yritettäessä valmistaa hybrido-meista monoklonaalista vasta-ainetta. Vaikka valmistusmenetelmä periaatteessa tunnetaan hyvin, vaikeuksia esiintyy paljon ja jokainen tapaus on erilainen. Ei voi-35 da etukäteen taata, että yritettäessä valmistaa haluttua hybri- 75184 2 domaa siinä onnistutaan ja että tässä onnistuttaessa hyb-ridoma tuottaa vasta-ainetta ja että näin muodostuneella vasta-aineella on haluttu spesifisyys. Onnistuminen riippuu pääasiassa käytetystä antigeenilajista ja halu-5 tun hybridoman eristämisestä käytetystä selektiotekniikas-ta.

Monoklonaalista ihmisen lymfosyyttien pinta-antigeeneille spesifistä vasta-ainetta on yritetty valmistaa vain harvoissa tapauksissa. Katso esimerkiksi: Current 10 Topics in Microbiology and Immunology, vol. 81, 66-69 ja 164-169. Näissä kokeissa käytetyt antigeenit olivat viljeltyjä ihmisen lymfoblastoidileukemiasolulinjoja ja kroonisen lymfosyyttileukemian solulinjoja. Monet näin valmistetut hybridomat tuottivat vasta-ainetta, joka vaikutti 15 kaikkiin ihmisen solujen erilaisiin pinta-antigeeneihin.

Mikään näistä hybridomeista ei tuottanut tietylle ihmisen lymfosyyttilajille spesifistä vasta-ainetta.

Äskettäin on esitetty julkaisuja, joissa on kuvattu sellaisten hybridomien valmistus ja testaus, jotka tuotta-20 vat tietyille T-solujen antigeeneille spesifistä vasta-ainetta. Katso esim. Reinherz, E.L., et ai., J. Immunol. 123, 1312-1317 (1979); Reinherz, E.L., et ai., Proc. Natl. Acad. Sei., 76, 4061-4065 (1979); ja Rung, P.C., et ai., Science, 206, 347-349 (1979).

25 Ihmisen ja eläinten elimistön immunologisiin toimin toihin osallistuu kaksi lymfosyyttien pääryhmää. Näistä toinen (kateenkorvasta peräisin oleva solu eli T-solu) erilaistuu kateenkorvassa hemopoieettisista kantasoluista. Kateenkorvassa olevia erilaistuvia soluja nimitetään "ty-30 mosyyteiksi". Kypsät T-solut irtoavat kateenkorvasta ja joutuvat sen jälkeen verenkiertoon, kudoksiin ja imukudok-seen. Nämä T-solut muodostavat suuren osan elimistössä kiertävistä pienistä lymfosyyteistä. Ne ovat immunologises-ti spesifisiä ja osallistuvat efektorisoluina suoraan so-35 lujen välityksellä tapahtuviin immunologisiin reaktioihin 75184 3 (esimerkiksi elinsiirtojen yhteydessä esiintyvä hylkiminen) . Vaikka T-solut eivät eritä vasta-aineita elimistön nesteisiin, toinen myöhemmin käsiteltävä lymfosyyttiryh-mä tarvitsee eräissä tapauksissa T-soluja pystyäkseen 5 itse erittämään vasta-aineita. Eräät T-solulajit toimivat toisissa immunologisissa järjestelmissä säätelevästä. Tämän solujen yhteistoimintamuodon mekanismia ei vielä täysin tunneta.

Toiseen lymfosyyttiryhmään (luuytimestä peräisin 10 oleviin soluihin eli B-soluihin) kuuluvat ne, jotka erittävät vasta-aineita. Ne kehittyvät myös hemopoieettisista kantasoluista, mutta kateenkorva ei säätele niiden erilaistumista. Linnuilla ne erilaistuvat kateenkorvalle analogisessa elimessä, joka on nimeltään "Bursa of Fabri-15 cius". Imettäväisistä ei kuitenkaan ole löydetty vastaavaa elintä, ja täten B-solujen arvellaan erilaistuvan luuytimessä.

T-solut jakaantuvat ainakin kolmeen alalajiin, joita nimitetään "auttaja"-, "heikentäjä"- ja "tappaja"-T-20 soluiksi, nämä joko nopeuttavat tai hidastavat reaktiota tai tappavat (liuottavat) vieraita soluja. Nämä alaluokat ovat hyvin tunnettuja hiirien elimistössä, mutta vasta äskettäin niiden toimintaa on kuvattu ihmiselimistössä. Katso esimerkiksi: R.L. Evans et ai., Journal of Experimen-25 tai Medicine 145 (1977) 221-232 ja L. Chess ja S.F. Schloss-man - "Functional Analysis of Distinct Human T-cell Subsets Bearing Unique Differentiation Antigens", teoksessa "Contemporary Topics in Immunobiology", toimittaja O. Stutman, Plenum Press 1977, vol. 7, 363-379.

30 Eri T-solulajien tai -alalajien identifiointi tai niiden heikentäminen on tärkeää erilaisten immunoregula-toristen häiriöiden diagnoosissa ja hoidossa.

Esimerkiksi tiettyjen leukemia- ja imukudoskasvain-muotojen prognoosi on erilainen sen mukaan, ovatko ne 35 lähtöisin B- tai T-soluista. Täten taudin prognoosia arvioitaessa on tärkeää, että nämä kaksi lymfosyyttiryhmää 4 75184 pystytään erottamaan toisistaan. Katso esimerkiksi: A.C. Aisenberg ja J.C. Long, The American Journal of Medicine 58 (1975) 300; D. Belpomme et ai., teoksessa "Immunological Diagnosis of Leukemias and Lymphomas", 5 toimittajat S. Thierfelder et al., Springer, Heidelberg 1977, 33-45; ja D. Belpomme et al., British Journal of Haematology 38 (1978) 85.

Tietyissä tautitiloissa (esim. nuorten nivelreumassa, pahanlaatuisissa tautitiloissa ja agammaglobulinemias-10 sa) T-solujen alaryhmät ovat joutuneet epätasapainoon.

On ehdotettu, että autoimmuunisissa sairauksissa yleensä "auttaja"-T-soluja esiintyy ylimäärin ja tietyistä "hei-kentäjä"-T-soluista on puutetta, kun taas agammaglobuli-nemiaan liittyy tiettyjen "heikentäjä"-T-solujen ylimää-15 rä tai "auttaja"-T-solujen puute. Pahanlaatuisissa tautitiloissa yleensä "heikentäjä"-T-soluja esiintyy ylimäärin. Joissakin leukemiamuodoissa pysähtyneessä kehitysvaiheessa olevia T-soluja muodostuu ylimäärin. Diagnostinen onnistuminen voi täten riippua siitä, pystytäänkö tämä epätasapaino tai 20 ylimäärä havaitsemaan tai määrittämään, mitä kehitysvaihetta esiintyy ylimäärin. Katso esimerkiksi: J. Kersey et al., "Surface Markers Define Human Lymphoid Malignancies with Differing Prognoses", teoksessa "Haematology and Blood Transfusion", vol. 20, Springer-Verlag 1977, 17-23 ja jul-25 kaisun sisältämät viitteet sekä E.L. Reinberg et al., J. Clin. Invest. 64 (1979) 392-397.

Agammaglobulinemiaan, tautitilaan, jossa immuno-globuliinia ei muodostu, kuuluu ainakin kaksi eri tyyppiä. Tyypissä I immunoglobuliinia ei muodostu, koska heikentäjä-30 T-soluja esiintyy ylimäärin, kun taas tyypissä II tämä aiheutuu auttaja-T-solujen puutteesta. Molemmissa tyypeissä potilaan B-solut eli lymfosyytit, jotka vastaavat vasta-aineen varsinaisesta erityksestä, ovat täysin normaaleja eikä niistä esiinny puutetta, sen sijaan näiden B-solujen toimin-35 taa joko heikennetään tai niitä "ei auteta", mikä vähentää huomattavasti immunoglobuliinin tuotantoa tai keskeyttää

II

751 84 5 tuotannon kokonaan. Agammaglobulinemiatyyppi voidaan siten määrittää sen perusteella, esiintyykö heikentäjä-T-soluja ylimäärin vai onko auttaja-T-soluista puutetta.

On havaittu viitteitä siitä, että annettaessa auto-5 immuunista tautia tai pahanlaatuisia tauteja sairastaville potilaille vasta-aineita, jotka ovat spesifisiä ylimäärin esiintyvälle T-solulajille, vasta-aineet voivat vaikuttaa taudin kehitykseen edullisesti. Esimerkiksi auttaja-T-so-lusyöpää (tiettyjä ihon T-soluimukudoskasvaimia ja tietty-10 jä T-solujen akuutteja lymfoblastileukemiamuotoja) voidaan hoitaa antamalla potilaalle auttaja-T-soluantigeenille spesifistä vasta-ainetta. Autoimmuunista tautia, joka aiheutuu auttaja-solujen ylimäärästä, voidaan myös hoitaa samalla tavalla. Sellaisia tauteja (esim. pahanlaatuisia tautitilo-15 ja tai tyyppiä I olevaa agammaglobulinemiaa), jotka aiheutuvat heikentäjä-T-solujen ylimäärästä, voidaan hoitaa antamalla potilaalle vasta-ainetta, joka on spesifinen heikentä jä-T-soluantigeenille .

Antiseerumit, jotka vaikuttavat ihmisen kaikkiin T-so-20 luihin (ns. ihmisen vastainen tymosyyttiglobuliini eli ATG), ovat osoittautuneet terapeuttisesti käyttökelpoiseksi hoidettaessa potilaita, joille on suoritettu elintensiirtoja.

Koska T-solut vaikuttavat solujen välityksellä tapahtuviin immunologisiin reaktioihin (siirrettyjen elinten hylkimis-25 mekanismi), T-soluille spesifisen vasta-aineen saaminen estää tai hidastaa tätä hylkimisprosessia. Katso esimerkiksi: Cosimi et ai., "Randomized Clinical Trial of ATG in Cadaver Renal Allgraft Recipients: Importance of T Cell Monitoring", Surgery 40 (1976) 155-163, ja julkaisun sisältämät viit-30 teet, ja Wechter et ai., "Manufacture of Antithymocyte

Globulin for Clinical Trials", Transplantation 28(4)(1979) 303-307.

Ihmisen T-solulajien ja -alalajien identifiointiin ja heikentämiseen on tähän asti käytetty spontaaneja autovas-35 ta-aineita tai ihmisen T-soluille selektiivisiä antiseerumeja, jotka on valmistettu immunoimalla eläimiä ihmisen 75184 6 T-soluilla, poistamalla eläimistä veri seerumin saamiseksi ja adsorboimalla antiseerumi esimerkiksi autologisilla ei-allogeenisilla B-soluilla vasta-aineiden poistamiseksi, joilla on ei-haluttu reaktiivisuus. Näiden antiseerumien 5 valmistus on erittäin vaikeaa erikoisesti adsorptio- ja puhdistusvaiheissa. Adsorboidut ja puhdistetut antiseerumitkin sisältävät halutun vasta-aineen lisäksi useista syistä monia epäpuhtauksia. Eräs syy on se, että seerumi sisältää miljoonia vasta-ainemolekyylejä jo ennen immunoin-10 tia T-soluilla. Toiseksi immunointi aiheuttaa vasta-aineiden muodostumisen useita antigeenilajeja vastaan, joita on löydetty kaikista injektoiduista ihmisen T-soluista. Ei pystytä selektiivisesti tuottamaan tietylle antigeenille spesifistä vasta-ainetta. Kolmanneksi näillä menetelmillä 15 valmistetun spesifisen vasta-aineen tiitteri on tavallisesti melko alhainen (esim. laimennusten ollessa suurempia kuin 1:100 vasta-aine on inaktiivinen) ja spesifisen ja ei-spesifisen vasta-aineen suhde on pienempi kuin 1/10^.

Katso esimerkiksi Chessin ja Schlossmanin edellä mai-20 nittua artikkelia (sivulta 365 eteenpäin) sekä edellä mainittua artikkelia "the Chemical and Engineering News"-lehdessä, näissä on kuvattu tähän asti käytettyjen antiseerumien puutteellisuuksia ja monoklonaalisen vasta-aineen etuja.

25 Nyt on keksitty uusi hybridoma (OKT 11), joka pystyy tuottamaan uutta monoklonaalista vasta-ainetta pinta-antigeenille, jota on löydetty käytännöllisesti katsoen kaikista ihmisen normaaleista perifeerisistä T-soluista ja noin 95 %:lta ihmisen normaaleja tymosyyttejä, mutta jota ei ole 30 löydetty ihmisen normaaleista B-soluista eikä nollasoluista. Näin muodostunut vasta-aine on monospesifinen yhdelle ainoalle ihmisen normaalien T-solujen pinta-antigeenideter-minantille, eikä se sisällä käytännöllisesti katsoen lainkaan muita ihmisen vastaisia immunoglobuliineja, päin vas-35 toin kuin tähän asti tunnetut antiseerumit (jotka sisältävät luonnostaan epäpuhtauksina vasta-aineita, jotka reagoi- 7 75184 vat hyvin monien ihmisen antigeenien kanssa), ja tähän asti tunnetut monoklonaaliset vasta-aineet (jotka eivät ole monospesifisiä yhdelle ainoalle ihmisen tymosyytin antigeenille) . Lisäksi tätä hybridomaa voidaan viljellä vasta-ai-5 neen tuottamiseksi, jolloin eläinten käyttö vasta-aineen tuottamiseen ei ole välttämätöntä eikä myöskään tarvita monimutkaisia adsorptio- ja puhdistusvaiheita, jotka tähänastisissa epäpuhtaidenkin antiseerumien valmistusmenetelmissä ovat olleet välttämättömiä.

10 Sekä esillä olevasta hybridomasta että sen tuotta masta vasta-aineesta käytetään tässä yhteydessä nimitystä "OKT11", asiayhteydestä ilmenee, kumpaa kulloinkin tarkoitetaan. Esillä oleva hybridoma on talletettu 13.12.1979 laitokseen "The American Type Culture Collection", 12301 15 Parlawn Drive, Rockville, Maryland 20852, ja sille on annettu ATCC-talletusnumero CRL 8027.

Vasta-aineelle 0KT11 on tunnusomaista, että se a) reagoi käytännöllisesti katsoen kaikkien ihmisen normaalien perifeeristen T-solujen kanssa ja noin 95 %:n 20 kanssa ihmisen normaaleja tymosyyttejä, mutta ei reagoi ihmisen normaalien B-solujen eikä nollasolujen kanssa, b) reagoi ihmisen varhaisten, tavallisten ja kypsien tymosyyttien kanssa sekä ihmisen indusoija- ja sytotoksis-ten/heikentäjä-T-solujen kanssa, mutta ei ihmisen proty- 25 mosyyttien kanssa, c) määrittelee T-solupopulaation (OKT11), jota esiintyy normaalia pienempinä pitoisuuksina myasthenia graviksessa ja multippeliskleroosissa, normaalia suurempina pitoisuuksina akuutissa elinsiirtoreaktiossa, hyper IgE:ssä, 30 akuutissa tarttuvassa mononukleoosissa ja primäärisessä maksakirroosissa ja joka puuttuu täydellisesti kaikissa Hodgkinsin taudin vaiheissa ja psoriasiksessa.

Vasta-aineen OKT11 valmistus uuden hybridisolulinjän ATCC CRL 8027 avulla on kuvattu patenttivaatimuksissa 1 35 ja 2.

75184 8

Hybridoma valmistettiin pääpiirteittäin Milsteinin ja Kohlerin esittämällä menetelmällä. Tässä immunisoitiin ensin hiiriä T-solujen akuuttia lymfoblastileukemiaa (T-ALL) sairastavasta potilaasta eristetyillä leukemiaso-5 luilla ja sen jälkeen immunisoitujen hiirien pernasolut yhdistettiin hiiren myeloomasolulinjoihin, ja viljelmän pintanesteestä seulottiin ne hybridomat, jotka tuottivat ihmisen normaaleihin E-rosettipositiivisiin T-soluihin ja/tai ihmisen E-soluihin selektiivisesti sitoutuvaa vas-10 ta-ainetta. Halutut hybridomat kloonattiin ja karakterisoitiin. Tulokseksi saatiin hybridoma, joka tuottaa vasta-ainetta (OKT11) antigeenille, jota on löydetty käytännöllisesti katsoen kaikista ihmisen normaaleista perifeerisistä T-soluista. Sen lisäksi, että tämä vasta-aine 15 reagoi käytännöllisesti katsoen kaikkien ihmisen normaalien perifeeristen T-solujen kanssa, se reagoi myös noin 95 %:n kanssa ihmisen normaaleja tymosyyttejä, mutta ei reagoi ihmisen normaalien B-solujen eikä nollasolujen kanssa.

20 Otettaessa huomioon tähän asti esiintyneet vaikeu det ja huonot tulokset käytettäessä pahanlaatuisten tautien solulinjoja antigeeninä, on yllättävää, että esillä olevalla menetelmällä saatiin aikaan haluttu hybridoma.

On korostettava, että hybridisolujen valmistuksessa esiin-25 tyvien arvaamattomien tekijöiden vuoksi ei pystytä tietyllä antigeeni/solu-yhdistelmällä saatujen tulosten perusteella ennustamaan jonkin muun antigeeni/solu-yhdistelmän käyttäytymistä. On nimittäin havaittu, että käytettäessä antigeeninä pahanlaatuisen taudin T-solulinjoja tai solun 30 pinnalta eristettyjä puhdistettuja antigeenejä, ei yleensä ole saatu onnistuneita tuloksia.

Hybridoman ja sen tuottaman vasta-aineen valmistus ja karakterisointi on tarkemmin selostettu keksinnön kuvauksessa ja esimerkeissä.

35 Hybridoman valmistusmenetelmä koostuu pääpiirteit täin seuraavista vaiheista: 9 751 84 A. Hiiriä immunisoidaan T-ALL-leukemiaa sairastavasta potilasta eristetyillä T-ALL-leukemiasoluilla. Yleensä naaraspuoliset CAF^-hiiret on havaittu tähän parhaiten soveltuviksi, mutta myös muiden hiirikantojen käyttöä voi- 5 daan ajatella. Immunisointiaikataulun ja T-solupitoisuu-den pitäisi olla sellainen, että saadaan käyttökelpoiset määrät sopivasti esikäsiteltyjä splenosyyttejä. Kolme im- 7 munisointia 2 x 10 solulla/hiiri/ruiske 0,2 mlrssa fosfaatilla puskuroitua suolaliuosta 14 päivän välein on ha-10 vaittu tehokkaaksi.

B. Pernat poistetaan immunisoiduista hiiristä, ja valmistetaan pernasuspensio sopivaan väliaineeseen. Sopiva väliainemäärä on yksi millilitra yhtä pernaa kohti. Nämä koemenetelmät ovat sinänsä tunnettuja.

15 C. Suspendoidut pernasolut yhdistetään sopivasta so- lulinjasta saatuihin hiiren myeloomasoluihin sopivan katalysaattorin avulla. Edullinen suhde on noin viisi perna- g solua yhtä myeloomasolua kohti. Noin 10 splenosyytille sopiva yhdistämiseen käytetyn väliaineen kokonaistilavuus 20 on noin 0,5 - 1,0 ml. Monet hiiren myeloomasolulinjät ovat tunnettuja ja saatavissa yleensä akateemisista tutkimuslaitoksista tai erilaisista talletuspankeista, esimerkkinä mainittakoon the Salk Institute Cell Distribution Center,

La Jolla, Ca. Käytetyn solulinjan pitäisi edullisesti kuu-25 lua ns. lääkeaineille vastustuskykyiseen lajiin, jotta myeloomasolut eivät eläisi selektiivisessä väliaineessa, jossa hybridisolut puolestaan elävät. Yleisimpään lajiin kuuluvat 8-atsaguaniinille vastustuskykyiset solulinjat, joista puuttuu hypoksantiiniguaniinifosforibosyyli-trans-30 feraasientsyymi, ja täten tämä laji ei elä HAT-väliaineessa (sisältää hypoksantiinia, aminopteriiniä ja tymidiiniä).

On myös yleensä edullista, että käytetty myeloomasolulinja kuuluisi "ei-erittävään" lajiin, jolloin se ei itse tuota mitään vasta-ainetta, mutta myös vasta-ainetta tuottavia 35 lajeja voidaan käyttää. Kuitenkin eräissä tapauksissa vasta-aineita tuottavat myeloomasolulinjät voivat olla edulli- 751 84 10 siä. Edullinen solujen yhdistämiseen käytettävä katalysaattori on polyetyleeniglykoli, jonka keskimääräinen mo-lekyylipaino on 1000 - 4000 (kaupallisesti saatavilla nimikkeellä PEG 100 jne.), mutta myös muita sinänsä tunnet-5 tuja yhdistämiskatalysaattoreita voidaan käyttää.

D. Vapaiden pernasolujen, vapaiden myeloomasolujen ja yhdistettyjen solujen seos laimennetaan, ja laimennuksia viljellään erillisillä alustoilla selektiivisessä väliaineessa, jossa vapaat myeloomasolut kuolevat noin yh-10 dessä viikossa. Laimennus voi olla ns. rajaava laimennus, jossa laimennukseen käytetyn nesteen tilavuus on tilastol-sesti laskettu niin, että pystytään eristämään haluttu määrä soluja (esim. 1-4) kullekin erilliselle alustalle (esim. mikrotitrauslevyn kuhunkin syvennykseen). Väliai-15 neena käytetään esim. HAT-väliainetta, jossa lääkeaineille (esim. 8-atsaguaniinille) vastustuskykyinen vapaa myelooma-solulinja tuhoutuu. Koska vapaat pernasolut eivät ole pahanlaatuisia, niiden lisääntymiskyky on rajattu. Täten tietyn ajan kuluttua (noin yhdessä viikossa) vapaiden per-20 nasolujen lisääntyminen lakkaa. Yhdistetyt solut sen sijaan lisääntyvät jatkuvasti, koska ne ovat toisaalta peräisin myeloomasoluista, jotka on eristetty pahanlaatuisesta kasvaimesta ja toisaalta pernasoluista, jotka pystyvät elämään selektiivisessä väliaineessa.

25 E. Tarkastetaan, löytyykö eri kasvatusalustojen pin- tanesteestä, joka sisältää hybridoman, E-rosettipositiivi-sille puhdistetuille ihmisen T-soluille tai tymosyyteille spesifistä vasta-ainetta.

F. Valitaan (esim. rajaavalla laimennuksella) ja 30 kloonataan hybridomat, jotka tuottavat haluttua vasta-ainetta.

Kun haluttu hybridoma on eristetty ja kloonattu, muodostuvaa vasta-ainetta voidaan tuottaa eri tavoin. Puhtainta monoklonaalista vasta-ainetta saadaan viljelemällä 35 haluttua hybridomaa in vitro sopivassa väliaineessa sopivan pituisen ajan, minkä jälkeen haluttu vasta-aine eriste-

II

75184 11 tään pintanesteestä. Sopiva väliaine ja viljelyajan pituus ovat tunnettuja tai ne voidaan helposti määrittää. Tämä in vitro-menetelmä tuottaa käytännöllisesti katsoen mono-spesifistä monoklonaalista vasta-ainetta, joka ei sisällä 5 käytännöllisesti katsoen lainkaan muita ihmisen vastaisia spesifisiä immunoglobuliineja. Muita immunoglobuliineja on mukana pieni määrä, koska väliaine sisältää ksenogee-nistä seerumia (esim. vasikan sikiöseerumia). Tällä in vitro-menetelmällä ei kuitenkaan saada tiettyihin tarkoi-10 tuksiin riittävää vasta-ainemäärää tai riittävän suurta vasta-ainepitoisuutta, koska monoklonaalisen vasta-aineen pitoisuus on vain noin 50 pg/ml.

Haluttaessa valmistaa paljon suurempia pitoisuuksia hieman epäpuhtaampaa monoklonaalista vasta-ainetta, halut-15 tu hybridoma voidaan ruiskuttaa hiiriin, edullisesti syn-geenisiin tai semisyngeenisiin hiiriin. Hybridoma aiheuttaa vasta-ainetta tuottavien kasvainten muodostumisen hiiriin sopivan inkubaatioajän kuluttua, mikä johtaa halutun vasta-aineen pitoisuuden kohoamiseen hiiren veressä (noin 20 5-20 mg/1) ja peritoneaalisessa tulehdusnesteessä (vesi- vatsa) . Vaikka näiden hiirten veressä ja vesivatsassa on myös tavallisia vasta-aineita, näiden pitoisuus on vain noin 5 % monoklonaalisen vasta-aineen pitoisuudesta. Koska sitä paitsi nämä tavalliset vasta-aineet eivät ole ih-25 misen vastaisia spesifisyydeltään, eristetyistä vesivat-soista ja seerumista saatu monoklonaalinen vasta-aine ei sisällä käytännöllisesti katsoen lainkaan kontaminoivia ihmisen vastaisia immunoglobuliineja. Tämän monoklonaalisen vasta-aineen tiitteri on korkea (aktiivinen laimennuk-30 sissa 1:50 000 ja myös suuremmissa laimennuksissa), ja sen spesifisen ja ei-spesifisen immunoglobuliinin suhde on korkea (noin 1/20). Sellaiset muodostuneet immunoglobulii-nit, joiden rakenteessa on kevyitä K-myeloomaketjuja, ovat ei-spesifisiä, ei-vaikuttavia peptidejä, jotka pelkästään 35 laimentavat monoklonaalista vasta-ainetta vaikuttamatta haitallisesti sen spesifisyyteen.

12 75184

Esimerkki 1

Monoklonaalisten vasta-aineiden valmistus A. Immunisointi ja somaattinen solujen hybridisointi

Naaraspuolisia CAF^-hiiriä (Jackson Laboratories, 5 hiirien ikä 6-8 viikkoa) immunoitiin intraperitoneaalises-ti 2 x 107 ihmisen T-ALL-leukemiasoluilla 0,2 ml:ssa fosfaatilla puskuroitua suolaliuosta 14 päivän välein. Neljän päivän kuluttua kolmannesta immunisointikerrasta hiiristä poistettiin pernat, ja näistä valmistettiin yhtä solulaatua 10 sisältävä suspensio puristamalla kudos ruostumattomasta teräksestä valmistetun seulan lävitse.

Solujen yhdistäminen suoritettiin Kohlerin ja Mil- g steinin käyttämällä menetelmällä. 1 x 10 splenosyyttiä yhdistettiin 0,5 ml:ssa yhdistämisväliainetta, joka koos-15 tui 35 %:sta polyetyleeniglykolia (PEG 1000) ja 2 %:sta di-metyylisulfoksidia RPMI-1640-väliaineessa (Gibco, Grand 7

Island, NY), 2 x 10 P3X63Ag8Ul-myeloomasoluun, jotka toimitti tohtori M. Scharff, Albert Einstein College of Medicine, Bronx, NY. Nämä myeloomasolut erittävät IgG^:n K-ke-20 vyitä ketjuja.

B. Hybridoman eristys ja kasvatus

Kun solut oli yhdistetty, niitä viljeltiin HAT-väli-aineessa (sisälsi hypoksantiinia, aminopteriiniä ja tymi-diiniä) 37°C:ssa 5 % hiilidioksidia sisältävässä kosteassa 25 atmosfäärissä. Useita viikkoja myöhemmin 4-100 ^1 viljelmien hybridomapitoista pintaliuosta siirrettiin alustalle, joka sisälsi 10^ perifeeristä lymfosyyttiä, jotka oli jaettu E-rosettipositiivisiin (E+) ja E-rosettinegatiivisiin (E~)-populaatioihin, nämä oli valmistettu terveiden ihmis-30 ten verestä Mendesin kuvaamalla menetelmällä /J. Immunol. Ill (1973) 8607. Näihin soluihin sitoutuneet hiiren hybridoman tuottamat vasta-aineet todettiin epäsuoralla immuno-fluoresenssimenetelmällä. Viljelmien pintaliuoksissa inku-boidut solut värjättiin fluoresiinilla käsitellyllä vuohes-35 sa valmistetulla anti-hiiri-IgG:llä (G/M FITC) (Meloy Laboratories, Springfield, VA, F/p = 2,5) ja fluoresoivat vas-

II

13 751 84 ta-aineella värjätyt solut analysoitiin sen jälkeen solu-fluorografilia FC200/4800A (Ortho Instruments, Westwood, MA) esimerkissä 3 kuvatulla tavalla. Hybridomaviljelmät, jotka sisälsivät spesifisesti E+-lymfosyyttien (T-solujen) 5 ja/tai tymosyyttien kanssa reagoivia vasta-aineita, eristettiin ja kloonattiin kahdesti rajaavalla laimennusmene- telmällä syöjäsolujen läsnäollessa. Sen jälkeen kloonit .... 7 siirrettiin mtrapentoneaalisesti ruiskuttamalla 1 x 10 tietyn kloonin solua (0,2 ml:n tilavuudessa) CAF^-hiireen, 10 joka oli esikäsitelty 2,6,10,14-tetrametyylipentadekaanil-la, jota toimittaa Aldrich Chemical Company kauppanimellä "Pristine". Näiden hiirien pahanlaatuisia vesivatsoja käytettiin sen jälkeen lymfosyyttien karakterisoimiseen esimerkissä 2 esitetyllä tavalla. Hybridivasta-aineen OKTIO 15 todettiin standardimenetelmillä kuuluvan IgG^-alaluokkaan. Esimerkki 2 OKTll-vasta-aineen reaktiivisuuden karakterisointi A. Lymfosyyttikantojen eristäminen

Terveiden vapaaehtoisten verenluovuttajien (ikä 15-20 40 vuotta) verestä erotettiin perifeeriset yksitumaiset verisolut Ficoll-Hypaque-tiheysgradienttisentrifugointi-menetelmällä (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NH), Boyumin esittämällä tavalla, Scand. J. Clin. Lab. Invest.

21 (suppl. 97) (1968) 77. Fraktioimattomat yksitumaiset 25 solut erotettiin pinta-Ig+ (B)- ja pinta-Ig - (T- ja nol-lasolu)-populaatioiksi käyttämällä Sephadex G-200 anti-F(ab')2~pylväskromatografiaa menetelmällä, jonka ovat aikaisemmin kuvanneet Chess et ai., J. Immunol. 113 (1974). T-solut otettiin talteen E-rosetoimalla Ig -populaatio 30 5 %:lla lampaan punasoluja (Microbiological Associates,

Bethesda, MD). Rosetoitu seos sentrifugoitiin Ficoll-Hypa-que-sentrifugissa ja talteenotettu E+-pelletti käsiteltiin 0,155-m NH^Clrlla (10 ml 10® solua kohti). Näin saatu T-solupopulaatio oli <2 %:isesti EAC-rosettipositiivinen ja 35 >95 %:isesti E-rosettipositiivinen standardimenetelmillä määritettynä. Lisäksi rosetteja muodostamaton Ig (nollaso- 75184 14 lu)-populaatio erotettiin Ficoll-rajapinnalta. Tämä jälkimmäinen populaatio oli <5 %:isesti E-positiivinen ja £ 2-%:isesti slg-positiivinen. Pinta-Ig+ (B)-populaatio erotettiin Sephadex-G-200-pylväästä eluoimalla normaalilla 5 ihmisen gammaglobuliinilla, kuten aikaisemmin on kuvattu. Tämä populaatio oli >95-%:isesti pinta-Ig-positiivinen ja <5-%:isesti E-positiivinen.

B. Tymosyyttien eristäminen

Normaali ihmisen kateenkorvarauhanen saatiin poti-10 lailta, joille oli tehty korjaavia sydänleikkauksia ja joiden ikä vaihteli kahdesta kuukaudesta 14 vuoteen. Kateenkorvarauhanen paloiteltiin, ja palaset asetettiin heti 199(Gibco)-väliaineeseen, jossa oli 5 % vasikan sikiöseeru-mia, ne hienonnettiin huolellisesti pihdeillä ja saksilla 15 ja sen jälkeen muodostettiin yhtä solulajia sisältävä suspensio puristamalla seos terässeulan läpi. Seuraavaksi solut sentrifugoitiin Ficoll-Hypaque-sentrifugissa ja pestiin kohdassa A kuvatulla tavalla. Näin saadut tymosyytit olivat >95-%:isesti elinkykyisiä ja £ 90-%:isesti E-rosettiposi-20 tiivisia.

Esimerkki 3

Soluiluorografinen analyysi ja solujen erotus

Monoklonaalisten vasta-aineiden ja kaikkien solupopulaatioiden reaktiotuotteiden solufluorografinen analyysi 25 suoritettiin epäsuoralla immunofluoresenssimenetelmällä, jossa solut värjättiin fluoresiiniin liitetyllä vuohessa valmistetulla antihiiri-IgG:llä (G/M FITC) (Meloy Laboratories) , analyysiin käytettiin solufluorografia FC200/4800A (Ortho Instruments). Tällöin 1 x 10^ solua käsiteltiin 30 0,15 mlrlla vasta-ainetta OKT5 laimennuksen ollessa 1:500, soluja inkuboitiin 4°C:ssa 30 minuutin ajan ja pestiin kahdesti. Solujen annettiin sen jälkeen reagoida 0,15 ml:n kanssa G/M FITC (laimennus 1:40) 4°C:ssa 30 minuutin ajan, reaktiotuote sentrifugoitiin ja pestiin kolme kertaa. Nämä 35 solut analysoitiin sen jälkeen solufluorografiällä, jossa kunkin solun aiheuttama fluoresenssi-intensiteetti rekiste- 75184 15 röitiin pulssinkorkeusanalysaattorilla. Reaktiivisuusmalli oli samanlainen laimennuksella 1:10 000, mutta suuremmilla laimennuksilla reaktioita ei tapahtunut. Taustavärjäyksen intensiteetti määritettiin 0,15 ml:11a suhteessa 1:500 lai-5 mennettuna vesivatsanestettä, joka oli saatu intraperito-neaalisesti ei-tuottavalla hybridikloonilla immunisoidusta CAF^-hiirestä.

Kuviossa 1 on esitetty solufluorograafista saatu fluoresenssispektri normaaleille ihmisen tymosyyteille ja 10 perifeerisille E+- ja E -soluille, joiden on annettu reagoida OKTll:n ja muiden monoklonaalisten vasta-aineiden (laimennus 1:500) sekä G/M FITC:n kanssa. Taustafluoresens-sivärjäys määritettiin lisäämällä kuhunkin populaatioon suhteessa 1:500 laimennettua vesivatsanestettä hiiristä, 15 johon oli injektoitu ei-tuottavaa kloonia, ja inkuboimal-la seosta.

Hybridoma valmistettiin, ja monoklonaalinen vasta-aine valmistettiin ja karakterisoitiin edellä olevissa esimerkeissä kuvatulla tavalla. Vaikkakin suuria määriä esil-20 lä olevaa vasta-ainetta valmistettiin injektoimalla esillä olevaa hybridomaa intraperitoneaalisesti hiiriin ja erottamalla hiiristä pahanlaatuiset vesivatsat, on selvää, että hybridomaa voidaan viljellä myös alalla hyvin tunnetuilla in vitro-menetelmillä, jolloin vasta-aine erotetaan viljel-25 mien pintanesteestä.

Taulukosta 1 ilmenee monoklonaalisten vasta-aineiden OKT1, OKT3-6 ja OKT8-11 reaktiivisuus ihmisen eri lymfoi-disolupopulaatioiden kanssa. Muun muassa tämän reaktiivi-suuskaavan avulla esillä oleva vasta-aine OKT11 voidaan 30 todeta ja erottaa muista vasta-aineista.

Kuviossa 1 on esitetty solufluorografista saatu fluo-resenssispektri ihmisen normaaleille tymosyyttisuspensioil-le sekä perifeerisille E+- ja E -soluille, joiden on annettu reagoida vasta-aineiden OKT11, OKT10 ja OKT8 (laimennus 35 1:500) sekä G/M FITC:n kanssa. Päinvastoin kuin OKT1- ja OKT3-T-soluantigeenit (joiden määrä lisääntyy tymosyyttien 16 75184 kypsyessä perifeerisiksi T-soluiksi), OKTll-antigeenin määrä samanaikaisesti pienenee. Muun muassa kuvion 1 mukaisen reaktiivisuuskaavan avulla esillä oleva vasta-aine 0KT11 voidaan todeta ja erottaa muista vasta-aineista.

5 Taulukossa 2 on esitetty ihmisen T-lymfosyyttien an- tigeenifenotyypit käyttäen vasta-ainetta 0KT11 ja muita monoklonaalisia vasta-aineita. Myös tämän fenotyyppikaa-vion avulla vasta-aine 0KT11 voidaan todeta ja erottaa muista vasta-aineista.

10 Taulukosta 3 ilmenee perifeeristen T-solujen sekä T-solujakeiden pitoisuuksien ja eri tautitilojen välinen suhde. Näitä suhteita voidaan käyttää terapeuttisiin tarkoituksiin tautitilan aiheutuessa jonkin T-solujakeen kohonneesta pitoisuudesta (esim. tyyppiä I oleva agammaglo-15 bulinemia). Terapeuttisessa käytössä potilaalle, jolla jotakin T-solujaetta esiintyy ylimäärin, annetaan sopivaa monoklonaalista vasta-ainetta, jolloin ylimäärä saadaan vähenemään tai kokonaan poistetuksi. Myös taulukossa 3 esitettyjen suhteiden avulla vasta-aine OKT11 voidaan to-20 deta ja erottaa muista vasta-aineista.

Muita monoklonaalisia vasta-aineita tuottavia samojen hakijoiden valmistamia hybridomeja (OKT1, OKT3, 0KT4 ja OKT5 sekä OKT6, OKT8, OKT9 ja OKTIO) ja menetelmiä näiden hybridomien ja vasta-aineiden valmistamiseksi on kuvattu 25 FI-patenttihakemuksissa 800846, 801343, 801342 ja 802917 sekä 803755, 803758, 803756 ja 803757.

Kyseisen vasta-aineen OKT11 havaittiin kuuluvan IgG^-alaluokkaan, joka on yksi hiirien IgG:n neljästä alaluokasta. Nämä immunoglobuliini G:n alaluokat eroavat toisistaan 30 ns. "kiinteiltä" alueiltaan, vaikkakin tietylle antigeenille spesifisen vasta-aineen rakenteessa on ns. "vaihtuva" alue, joka on toiminnallisesti samanlainen riippumatta siitä, mihin immunoglobuliini G:n alaluokkaan se kuuluu. Toisin sanoen monoklonaalinen vasta-aine, jolla on edellä 35 kuvatut tunnusmerkit, voi kuulua alaluokkiin IgG^ - IgG2a, IgG2b tai IgG^ tai luokkiin IgM tai IgA tai muihin Ig-luok-

II

75184 17 kiin. Näiden luokkien tai alaluokkien erot eivät vaikuta vasta-aineen reaktiivisuuden selektiivisyyteen, mutta ne voivat vaikuttaa siihen, miten vasta-aine reagoi myöhemmin muiden aineiden, esimerkiksi komplementin tai anti-5 hiiri-vasta-aineiden kanssa.

Tautitiloja, jotka aiheutuvat OKTll+-solujen ylimäärästä, voidaan hoitaa antamalla potilaalle terapeuttisesti vaikuttava määrä OKTll-vasta-ainetta. Reagoimalla selektiivisesti OKTll+-antigeenin kanssa, vaikuttava määrä 10 OKTll-vasta-ainetta vähentää ylimäärin esiintyviä 0KT11+-soluja vaikuttaen täten taudin kulkuun edullisesti. Vasta-ainetta 0KT11 voidaan sisällyttää terapeuttisiin koostumuksiin, jotka muodostuvat vaikuttavista määristä OKTll-vasta-ainetta ja farmaseuttisesti hyväksyttävistä kantaja-15 aineista.

Koska perifeeriset T-solut vaikuttavat aiheuttamalla siirrettyjen elimien hylkimistä, eräs esimerkki vasta-aineen OKT11 terapeuttisesta käytöstä on, että annetaan vieraan elimen vastaanottajalle sellainen määrä OKTll-vasta-20 ainetta, joka riittää heikentämään hylkimisreaktioita tai poistamaan sen kokonaan. Tällä tavalla edellä mainittu an-titymosyyttiglobuliini voitaisiin korvata OKTll-vasta-ai-neella, jolloin spesifisyys saataisiin huomattavasti paremmaksi .

ie 75184

Taulukko 1 OKT-antiqeenien jakaantuminen soluihin ja kudoksiin Monoklonaalinen vasta-aine ig-tyyppi Perifeerinen Perna Luuydin Kateenkorva veri (15)x (4) (6) (15) 5 E* E~ 0KT1 IgGi 100** 0 29+9 <5 18+8 OKT3 I?G2a 100 0 31+8 <5 21+8 10 ~ 0KT4 IgG2b 64+4 0 16+3 <5 75+10 OKT5 IgGi 25+4 0 15+4 <5 77+8 OKT6 IgG]_ 0 0 o <5 68+8 15 OKT8 IgG2a 34+3 0 17+4 <5 81+7 OKT9 IgGi 0 0 0 <5 4+3 OKT10 IgGi 5+3 13+4 10+5 16+4 96+4 OKT11 IgGi 100 o NT+ NT 95+3 20 “ x tutkittujen näytteiden määrä - IS.D.

+ ei määritetty ++ tutkittiin viisi näytettä perifeerisestä verestä ja viisi kateenkorvanäytettä.

Il 19 751 8 4

rH

1 + + + + + + o o

H

g + + + + + Il o σ» g I +l +l I t i i

CO

.J H

•H ^ 1 I + I + I + a ° >1 >1 +> c ^ <U E"

+1 g I I + l i II

G

<D

dl tr> <N -H U-> M ί g I I + I + , +

M

G C

rH CL)

G -H

(Ö -P __

En -P Z

>H v! -H

Sn 5£ 1 + + + I + | tn tn o tn

0 C

m ti) E tn & — — (L·

rH CH SS H

1 E- ie. o ^ g i i i + + + + 3

C +J

0) O

tn _ ^ e | £ 2 2 | H g I I 1 + + + + .¾ > C $ e-H -H e rto , 3a 13 S iiss -h 6 >1 tn -H >1 >1 -H -n Λί -P O) r'^ x^ ® :(ϋ " 8 $ .8 § Λ

fill lii» s il! I

I. k « £

oj to m +> rH

<D > -H Q) O 11 -ph h tn tn 28 StJ ^ s 20 75184 o' + + ' 2 I 2 + 2 +) tu tu 44 J Ή ·Η

Ό -H O

w e-, + MW

^ £ + I , + d d -P

'2 ,, O + + + 00233 <U * O +> w ^ Ä to M 0) ö -H <D -H -H -H :<0

Ti 'O O O C U

-1-1 d 4-·4-· Ή :n3 H d Ή ·Η ·η :rö ti “ in O O r-4 g d -H Ό ^ §

Hl O E* ·Η -H

4-> 4-> * Ql Oi Cd

--. 0.°1 ' O + , O oooii dM

>4 m g ‘ * c

<U C d tU <U

0) d -H CO

+J -n 00 . tn O -H -H

ui d μ I g «j

Ό H y · (0 (0 6 i—I

d O O I I 0 , * -H <U -H

dtnwl 1 o + * + 2 H iH CO 4-)

U1 + Ä ^ z m m -HO

-h c η mm m a

o aj g G X

+* +J U, 44 M -H C

-H tn “J O O <0 <U

Qj -H I C C -n M (0 d cmoi i o o *4. „ _ n n o -u (U m ^ + · i 222 λ: 4->

•n φ · + + I Ai -H

d -4 -H Ai •H λ; O -h 4-1

Od+ , d tn tn > d

tn c Tr I +oJdd+J

o e-ι i + A d d c _ _ · c tn tn -h 4-> tu O n A ° 1 02 · 22 * O -h -h O (0 0-PS · · Ai O O C >

Ai tn o 4-> 4-> d) h o . λ: -h -h -h tn

d 4i l ^ o Oi tn -H

ή fö i d Ai <0

d (0 TL d -h -H -H E

(tJQJV] . . -P O O <1> H

H H S2 1 o · |+ ~ - 4J g g -H -H

a: * . ^ 2 i 2 ^ g g ro

dO O d 44 C Ό -P

c -- o d tu ε d o rn d -h M > e w il tn o o d

0 fl· C H

ε a) tn o <o <o , ,

Ή (0 *—1 H "P -P

C -H <U H H n m <U -H :ttJ S (0 tO > > 4-> tn Ai 5 (tJ (0 dj <u tn o -P g tn g e uh •H O -H > -Ή > d 44 Π 1-1 o 44 ρ o — _ tn h d o o tu p oo $ o Hinder'd

(U H H ^ K o H OB -H tO

>44 Ai tn 0)0- o> o -h ·η 4-> tn •H (0 o ti tn tn 4->Λ -h --10044---4-14-.4-)1)--.

M tn oh -h -H 44 '2 4-) h tr> h tn tn Ό d

tu Ai P H > <3 -H « d dHH\Ort<TjdH

Λ (0 (U4J(0-S H S i_i L] C H >>dd g H -H p H tn H -hm ^ O .p 4J4J" ·Η t) b! tnto

MU o > cl,, ^ c tutu H +> +> H

C tn d ^ Q ötutu rö 4J -P O ·

<U H to ro S H nnn -, ε 'H -C-GintOiOtO-^-P

<0 C H 4-) -H ti 0 ^ ΓΓ w tn H -H H g g ε ‘2 h h tu Cm tr> -h c njtotnPoot:i<> H 44 04-)0)¾ H Tr, £T H 4-· H >>tOOdd„.:(ö 4J;to ο>ιΛ·η 4-»^ηη , -3 * hcx:£::2’2 •H :t0 -H C 4J Q 4J 2 44dKÖ> 44 ε > p e -e c tn f di gj d ti o il il il s :2 d -h - h tu ti ^ dä o Λί ^ o tn z.c (044O4dTJ>ia) U2C, >1 C ^ K 02+1^

HO'-'StU2'^<^ * ^ +|K

il

Claims

21 75184
1. Menetelmä monoklonaalisen vasta-aineen valmistamiseksi, joka vasta-aine 5 a) reagoi käytännöllisesti katsoen kaikkien ihmi sen normaalien perifeeristen T-solujen kanssa ja noin 95 %:n kanssa ihmisen normaaleja tymosyyttejä, mutta ei reagoi ihmisen normaalien B-solujen eikä nollasolujen kanssa, 10 b) reagoi ihmisen varhaisten, tavallisten ja kyp sien tymosyyttien kanssa sekä ihmisen indusoija- ja sy-toksisten/heikentäjä-T-solujen kanssa, mutta ei ihmisen protymosyyttien kanssa, c) määrittelee T-solupolulaation (OKTll), jota 15 esiintyy normaalia pienempinä pitoisuuksina myasthenia graviksessa ja multippeliskleroosissa, normaalia suurempina pitoisuuksina akuutissa elinsiirtoreaktiossa, hyper IgE:ssä, akuutissa tarttuvassa mononukleoosissa ja primäärisessä maksakirroosissa ja joka puuttuu täydelli- 20 sesti kaikissa Hodgkinsin taudin vaiheissa ja psoriasiksessa, tunnettu siitä, että menetelmään kuuluu seuraavat vaiheet: A) valmistetaan hybridooma ATCC CRL 8027 i) immunoimalla hiiriä ihmisen T-ALL-leukemiaso- 25 luilla, ii) poistamalla pernat mainituista hiiristä ja valmistamalla pernasolususpensio, iii) yhdistämällä mainitut pernasolut hiiren mye-loomasoluihin yhdistämiskatalysaattorin läsnäollessa, 30 iv) laimentamalla ja viljelemällä yhdistettyjä so luja erillisissä syvennyksissä väliaineessa, jossa vapaat myeloomasolut eivät kasva, v) arvioimalla eri syvennysten hybridoomapitoinen pintaneste sen suhteen, sisältääkö se E-rosettipositiivi- 35 sille puhdistetuille T-soluille tai ihmisen tymosyyteille spesifistä vasta-ainetta, 22 7 518 4 vi) valikoimalla ja kloonaamalla hybridooma ATCC CRL 8027, joka tuottaa vasta-ainetta, joka reagoi käytännöllisesti katsoen kaikkien ihmisen normaalien perifeeristen T-solujen ja noin 95 %:n kanssa ihmisen normaaleja 5 tymosyyttejä, mutta ei reagoi ihmisen normaalien B-solujen eikä nollasolujen kanssa, ja B) valmistetaan monoklonaalinen vasta-aine vii) viljelemällä hybridoomaa ATCC CRL 8027 sopivassa väliaineessa, ja 10 viii) ottamalla vasta-aine talteen mainitun hybri- dooman pintanesteestä.
2. Menetelmä monoklonaalisen vasta-aineen valmistamiseksi, joka vasta-aine a) reagoi käytännöllisesti katsoen kaikkien ihmisen 15 normaalien perifeeristen T-solujen kanssa ja noin 95 %:n kanssa ihmisen normaaleja tymosyyttejä, mutta ei reagoi ihmisen normaalien B-solujen, eikä nollasolujen kanssa, b) reagoi ihmisen varhaisten, tavallisten ja kypsien tymosyyttien kanssa sekä ihmisen indusoija- ja syto- 20 soksisten/heikentäjä-T-solujen kanssa, mutta ei ihmisen protymosyyttien kanssa, c) määrittelee T-solupopulaation (OKTll), joka esiintyy normaalia pienempinä pitoisuuksina myasthenia graviksessa ja multippeliskleroosissa, normaalia suurem- 25 pina pitoisuuksina akuutissa elinsiirtoreaktiossa, hyper IgE:ssä, akuutissa tarttuvassa mononukleoosissa ja primäärisessä maksakirroosissa ja joka puuttuu täydellisesti kaikissa Hodgkinsin taudin vaiheissa ja psoriasiksessa, tunnettu siitä, että menetelmään kuuluu seu- 30 raavat vaiheet: A) valmistetaan hybridooma ATCC CRL 8027 i) immunoimalla hiiriä ihmisen T-ALL-leukemiaso- luilla, ii) poistamalla pernat mainituista hiiristä ja val- 35 laistamalla pernasolususpensio, iii) yhdistämällä mainitut pernasolut hiiren mye- II 23 751 84 loomasoluihin yhdistämiskatalysaattorin läsnäollessa, iv) laimentamalla ja viljelemällä yhdistettyjä soluja erillisissä syvennyksissä väliaineessa, jossa vapaat myeloomasolut eivät kasva, 5 v) arvioimalla eri syvennysten hybridoomapitoinen pintaneste sen suhteen sisältääkö se E-rosettipositiivi-sille puhdistetuille T-soluille tai ihmisen tymosyyteille spesifistä vasta-ainetta, vi) valikoimalla ja kloonamalla hybridooma ATCC
10 CRL 8027, joka tuottaa vasta-ainetta, joka reagoi käytännölliset! katsoen kaikkien ihmisen normaalien perifeeristen T-solujen ja noin 95 %:n kanssa ihmisen normaaleja tymosyyttejä, mutta ei reagoi ihmisen normaalien B-solu-jen eikä nollasolujen kanssa, ja
15 B) valmistetaan monoklonaalinen vasta-aine vii) siirtämällä hybridooma ATCC CRL 8027 intraperi-toneaalisesti hiiriin ja viii) ottamalla vasta-aine talteen hiirien pahanlaatuisesta vesivatsasta tai seerumista. 24 751 84