FI120253B - Osteogeeninen väline ja menetelmä sen valmistamiseksi - Google Patents
Osteogeeninen väline ja menetelmä sen valmistamiseksi Download PDFInfo
- Publication number
- FI120253B FI120253B FI981818A FI981818A FI120253B FI 120253 B FI120253 B FI 120253B FI 981818 A FI981818 A FI 981818A FI 981818 A FI981818 A FI 981818A FI 120253 B FI120253 B FI 120253B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- bmp
- bone
- collagen
- protein
- osteoinductive
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 56
- 230000002188 osteogenic effect Effects 0.000 title claims abstract description 41
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 29
- 102000007350 Bone Morphogenetic Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 310
- 108010007726 Bone Morphogenetic Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 310
- 229940112869 bone morphogenetic protein Drugs 0.000 claims abstract description 301
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims abstract description 81
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims abstract description 75
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims abstract description 75
- 235000014653 Carica parviflora Nutrition 0.000 claims abstract description 45
- 241000243321 Cnidaria Species 0.000 claims abstract description 44
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 44
- 230000002138 osteoinductive effect Effects 0.000 claims abstract description 43
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 42
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims abstract description 17
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 claims abstract description 14
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims abstract description 9
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 claims abstract description 8
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 claims description 163
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 claims description 81
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 claims description 80
- 235000019731 tricalcium phosphate Nutrition 0.000 claims description 78
- 229940078499 tricalcium phosphate Drugs 0.000 claims description 77
- 229910000391 tricalcium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 77
- 102000004266 Collagen Type IV Human genes 0.000 claims description 30
- 108010042086 Collagen Type IV Proteins 0.000 claims description 30
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 28
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 25
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 24
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 claims description 23
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 12
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims description 8
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 claims description 8
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 claims description 8
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 7
- 239000005313 bioactive glass Substances 0.000 claims description 6
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 6
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 4
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-O guanidinium Chemical compound NC(N)=[NH2+] ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 claims description 2
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 claims 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 claims 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 abstract description 20
- 239000003462 bioceramic Substances 0.000 abstract description 18
- 238000012986 modification Methods 0.000 abstract description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 abstract description 6
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 88
- 241000282994 Cervidae Species 0.000 description 49
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 44
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 35
- 239000000316 bone substitute Substances 0.000 description 34
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 32
- 230000011164 ossification Effects 0.000 description 31
- 210000002303 tibia Anatomy 0.000 description 26
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 25
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 24
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 23
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 21
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 19
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 19
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 18
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 17
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 15
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 15
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 14
- 208000010392 Bone Fractures Diseases 0.000 description 12
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 12
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 12
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 12
- 230000004819 osteoinduction Effects 0.000 description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 11
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 11
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 11
- 206010017076 Fracture Diseases 0.000 description 10
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 10
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 10
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 9
- 238000011161 development Methods 0.000 description 9
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 9
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 9
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 9
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 9
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 8
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 8
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 8
- 229910010293 ceramic material Inorganic materials 0.000 description 8
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 8
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 7
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 7
- 210000002805 bone matrix Anatomy 0.000 description 7
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 7
- 230000001054 cortical effect Effects 0.000 description 7
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 7
- 238000011160 research Methods 0.000 description 7
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000766026 Coregonus nasus Species 0.000 description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 6
- 208000035269 cancer or benign tumor Diseases 0.000 description 6
- 238000002591 computed tomography Methods 0.000 description 6
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- 241001447056 Uristes Species 0.000 description 5
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 5
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 5
- 230000010072 bone remodeling Effects 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 5
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 description 5
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 5
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 5
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 5
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 5
- 101100165563 Mus musculus Bmp8a gene Proteins 0.000 description 4
- 241000906034 Orthops Species 0.000 description 4
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 101150067309 bmp4 gene Proteins 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 4
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 4
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 4
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 4
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 4
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 4
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 4
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 4
- 102100027324 2-hydroxyacyl-CoA lyase 1 Human genes 0.000 description 3
- 101100114365 Caenorhabditis elegans col-8 gene Proteins 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- 101001009252 Homo sapiens 2-hydroxyacyl-CoA lyase 1 Proteins 0.000 description 3
- 206010029113 Neovascularisation Diseases 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 3
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 3
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 3
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 3
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 3
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 3
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 3
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 3
- 230000036244 malformation Effects 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 3
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 3
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 3
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 3
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 3
- 241000282979 Alces alces Species 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000020084 Bone disease Diseases 0.000 description 2
- 208000004434 Calcinosis Diseases 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 2
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- VVQNEPGJFQJSBK-UHFFFAOYSA-N Methyl methacrylate Chemical compound COC(=O)C(C)=C VVQNEPGJFQJSBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 229940019748 antifibrinolytic proteinase inhibitors Drugs 0.000 description 2
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 230000037182 bone density Effects 0.000 description 2
- 230000037118 bone strength Effects 0.000 description 2
- 230000002308 calcification Effects 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003913 calcium metabolism Effects 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 230000022159 cartilage development Effects 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 2
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000385 dialysis solution Substances 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 2
- 238000005470 impregnation Methods 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 238000007726 management method Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 238000007431 microscopic evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000003801 milling Methods 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 230000000399 orthopedic effect Effects 0.000 description 2
- 230000004820 osteoconduction Effects 0.000 description 2
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N perchloric acid Chemical compound OCl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 229920002994 synthetic fiber Polymers 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 101800000263 Acidic protein Proteins 0.000 description 1
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 1
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 1
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 241000242757 Anthozoa Species 0.000 description 1
- 102000003928 Bone morphogenetic protein 15 Human genes 0.000 description 1
- 108090000349 Bone morphogenetic protein 15 Proteins 0.000 description 1
- 101001023970 Bos taurus Growth/differentiation factor 6 Proteins 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100039536 Calcium-activated chloride channel regulator 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 108010062745 Chloride Channels Proteins 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 241001550206 Colla Species 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- 208000034656 Contusions Diseases 0.000 description 1
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical compound C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005977 Ethylene Substances 0.000 description 1
- IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide Chemical compound C1CO1 IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000008924 Femoral Fractures Diseases 0.000 description 1
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M Fluoride anion Chemical compound [F-] KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 1
- 240000000950 Hippophae rhamnoides Species 0.000 description 1
- 235000003145 Hippophae rhamnoides Nutrition 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000713936 Homo sapiens Tudor domain-containing protein 7 Proteins 0.000 description 1
- 208000033089 Human immunodeficiency virus transmission Diseases 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 101710167839 Morphogenetic protein Proteins 0.000 description 1
- 101100437777 Mus musculus Bmpr1a gene Proteins 0.000 description 1
- 102100030856 Myoglobin Human genes 0.000 description 1
- 108010062374 Myoglobin Proteins 0.000 description 1
- 206010029825 Nucleated red cells Diseases 0.000 description 1
- KUGRPPRAQNPSQD-UHFFFAOYSA-N OOOOO Chemical compound OOOOO KUGRPPRAQNPSQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JLNTWVDSQRNWFU-UHFFFAOYSA-N OOOOOOO Chemical compound OOOOOOO JLNTWVDSQRNWFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 208000006735 Periostitis Diseases 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 241000283011 Rangifer Species 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 241000212342 Sium Species 0.000 description 1
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 1
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 description 1
- RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N Titanium Chemical compound [Ti] RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 239000000956 alloy Substances 0.000 description 1
- 229910045601 alloy Inorganic materials 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 229910052586 apatite Inorganic materials 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000006065 biodegradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003181 biological factor Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000009875 biological transport Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000010478 bone regeneration Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- KBQXDPRNSDVNLB-UHFFFAOYSA-L calcium;carbonic acid;hydrogen phosphate Chemical compound [Ca+2].OC(O)=O.OP([O-])([O-])=O KBQXDPRNSDVNLB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 239000012050 conventional carrier Substances 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 1
- 239000002178 crystalline material Substances 0.000 description 1
- 208000031513 cyst Diseases 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000005115 demineralization Methods 0.000 description 1
- 230000002328 demineralizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 229910003460 diamond Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 210000003414 extremity Anatomy 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000007903 gelatin capsule Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- BCQZXOMGPXTTIC-UHFFFAOYSA-N halothane Chemical compound FC(F)(F)C(Cl)Br BCQZXOMGPXTTIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003132 halothane Drugs 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 125000004356 hydroxy functional group Chemical group O* 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000008902 immunological benefit Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000009607 mammography Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- 238000000491 multivariate analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000278 osteoconductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000036407 pain Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 235000019371 penicillin G benzathine Nutrition 0.000 description 1
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 description 1
- VSIIXMUUUJUKCM-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;fluoride;triphosphate Chemical compound [F-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O VSIIXMUUUJUKCM-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 230000003239 periodontal effect Effects 0.000 description 1
- 210000003460 periosteum Anatomy 0.000 description 1
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 210000005152 placental membrane Anatomy 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001225 polyester resin Polymers 0.000 description 1
- 239000004645 polyester resin Substances 0.000 description 1
- 239000004626 polylactic acid Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000013139 quantization Methods 0.000 description 1
- 238000002601 radiography Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 1
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 1
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 229910052712 strontium Inorganic materials 0.000 description 1
- CIOAGBVUUVVLOB-UHFFFAOYSA-N strontium atom Chemical compound [Sr] CIOAGBVUUVVLOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000002344 surface layer Substances 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 1
- 210000001694 thigh bone Anatomy 0.000 description 1
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 description 1
- 206010043827 tibia fracture Diseases 0.000 description 1
- 229910052719 titanium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010936 titanium Substances 0.000 description 1
- 229950003937 tolonium Drugs 0.000 description 1
- HNONEKILPDHFOL-UHFFFAOYSA-M tolonium chloride Chemical compound [Cl-].C1=C(C)C(N)=CC2=[S+]C3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 HNONEKILPDHFOL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 210000003741 urothelium Anatomy 0.000 description 1
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/3604—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the human or animal origin of the biological material, e.g. hair, fascia, fish scales, silk, shellac, pericardium, pleura, renal tissue, amniotic membrane, parenchymal tissue, fetal tissue, muscle tissue, fat tissue, enamel
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61F—FILTERS IMPLANTABLE INTO BLOOD VESSELS; PROSTHESES; DEVICES PROVIDING PATENCY TO, OR PREVENTING COLLAPSING OF, TUBULAR STRUCTURES OF THE BODY, e.g. STENTS; ORTHOPAEDIC, NURSING OR CONTRACEPTIVE DEVICES; FOMENTATION; TREATMENT OR PROTECTION OF EYES OR EARS; BANDAGES, DRESSINGS OR ABSORBENT PADS; FIRST-AID KITS
- A61F2/00—Filters implantable into blood vessels; Prostheses, i.e. artificial substitutes or replacements for parts of the body; Appliances for connecting them with the body; Devices providing patency to, or preventing collapsing of, tubular structures of the body, e.g. stents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/14—Macromolecular materials
- A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
- A61L27/227—Other specific proteins or polypeptides not covered by A61L27/222, A61L27/225 or A61L27/24
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/14—Macromolecular materials
- A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
- A61L27/24—Collagen
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/3641—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the site of application in the body
- A61L27/3645—Connective tissue
- A61L27/365—Bones
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
- A61L27/54—Biologically active materials, e.g. therapeutic substances
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/51—Bone morphogenetic factor; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone-inducing factor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61F—FILTERS IMPLANTABLE INTO BLOOD VESSELS; PROSTHESES; DEVICES PROVIDING PATENCY TO, OR PREVENTING COLLAPSING OF, TUBULAR STRUCTURES OF THE BODY, e.g. STENTS; ORTHOPAEDIC, NURSING OR CONTRACEPTIVE DEVICES; FOMENTATION; TREATMENT OR PROTECTION OF EYES OR EARS; BANDAGES, DRESSINGS OR ABSORBENT PADS; FIRST-AID KITS
- A61F2310/00—Prostheses classified in A61F2/28 or A61F2/30 - A61F2/44 being constructed from or coated with a particular material
- A61F2310/00005—The prosthesis being constructed from a particular material
- A61F2310/00365—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
- A61L2300/20—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices containing or releasing organic materials
- A61L2300/252—Polypeptides, proteins, e.g. glycoproteins, lipoproteins, cytokines
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
- A61L2300/40—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a specific therapeutic activity or mode of action
- A61L2300/412—Tissue-regenerating or healing or proliferative agents
- A61L2300/414—Growth factors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
- A61L2430/02—Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of bones; weight-bearing implants
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/827—Proteins from mammals or birds
- Y10S530/84—Bones; tendons; teeth; cartilage
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Botany (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
Description
Osteogeeninen väline ja menetelmä sen valmistamiseksi Osteogeniskt medel och förfarande för framställning av medlet
Esillä oleva keksintö koskee osteogeenistä välinettä, jolla on aiempaan nähden parempia osteoinduktiivisia eli luun muodostumista edistäviä ominaisuuksia. Keksintö koskee myös spesifisen luun morfogeneettisen eli muotouttavan BMP-proteiini-kompleksin valmistamista ja käyttöä aiempaa paremmilla ominaisuuksilla varustetun osteogeenisen välineen valmistuksessa.
Ortopedisen ja periodontaalisen kirurgian alojen suuri haaste on systeemien löytäminen luuston häiriöistä ja epämuodostumista kärsivien potilaiden hoitamiseksi, mukaan lukien vammasta, kasvainten poistosta ja synnynnäisistä epämuodostumista johtuvien suurten luuvajeiden korjaaminen, kuluneiden luuvarantojen uusiminen implantoiduilla endoproteeseilla korjausleikkauksissa sekä murtumien korjaaminen, joiden paraneminen on viivästynyt tai jäänyt tapahtumatta.
Toistaiseksi ihmisluusta otetut autogeeniset verkkomaiset luusiirteet ovat olleet luotettavin ja tehokkain vaihtoehto » » luun korvikkeeksi. Mainittua laajaa kliinistä käyttöä rajoitta- = vat kuitenkin lähteiden rajallinen saatavuus, siirteen otto- , leikkauksen aiheuttamat kivut sekä ihmisen immuunikatoviruksen ^ siirtymisen ja muiden komplikaatioiden aiheuttamat vaarat.
« Korjattavan alueen ollessa laaja on raportoitu myös rasitusmur- s g £ tumien sekä verkkomaisten luusiirteiden liittymättä ja
6 S S
inkorporoitumatta jäämisen esiintymistodennäköisyyksien ,,, kasvusta. Kaupalliseen käyttöön saatuja synteettisiä biomateriaaleja voidaan käyttää ainoastaan täyteaineena tai s # *Γ tukirakenteena, jolla ei ole biologista, luun uusiutumista ί ·'" edistävää aktiivisuutta. Tutkijoiden ja lääkärien löytyväksi a * *·»** toivoma luun korvike saattaisi olla synteettisestä materiaalista : valmistettu rakenne, jolla olisi elävää luuta muistuttavat ; ; kemiallinen koostumus, geometrinen konfiguraatio, mekaaninen 2 lujuus sekä biologinen yhteensopivuus ja johon olisi yhdistetty luun uudelleenmuodostumista indusoimaan tai tehostamaan kykeneviä biologisia kasvutekijöitä. Tällaisella korvikkeella voidaan toivottavasti korvata autosiirteet eli omasta elimistöstä peräisin olevat kudossiirteet ja käyttää sitä laajalti kaikissa kliinisen lääketieteen alan kovakudossiirtoihin liittyvissä yhteyksissä. Synteettisiä biomateriaaleja onkin kehitetty kaupalliseen käyttöön, ja niitä voidaan käyttää täyteaineena tai sekä sisäisenä että ulkoisena tukena. Valitettavasti näiltä materiaaleilta puuttuu biologinen aktiivisuus luun uudistumisen käynnistämiseksi. Polymaitohappojen ja hyaluronihappojen kaltaisista aineista valmistettuja synteettisiä kantajia kuvataan esimerkiksi US-patenttijulkaisussa 5 366 508. Luun morfogeneettinen proteiini (BMP) on osteogee-nisissä välineissä tärkeä tekijä, joka osallistuu aktiivisesti implantaatioprosessiin.
Valtava määrä tutkimusta on kohdistettu BMP:hen sen jälkeen, kun sen merkitys luun biologiassa ensimmäistä kertaa ymmärrettiin ja Urist, joka on BMP:n tutkimuksen alan edelläkävijöitä, julkisti menetelmät sen uuttamiseksi ja puhdistamiseksi. *:**: BMP: tä on myös käytetty satunnaisesti potilaiden hoitami- seksi, joilla murtumien paraneminen on viivästynyt, mutta ·;**· laajalti sitä ei ole vielä käytetty potilaiden hoidossa.
.···, Merkittäviä virstanpylväitä BMP:n historiassa ovat BMP:n tehokkuuden uuden luun muodostumisen indusoinnissa havaitse-. , minen, menetelmien kehittäminen osittain puhdistetun luonnolla lisesti esiintyvän BMP:n eristämiseksi eläinluumatriisista *1 ' sekä BMP-proteiineja koodittavien erilaisten cDNA-sekvenssien ; j eristäminen, joka viime mainittu mahdollistaa BMP:n valmistuk- "*·* sen yhdistelmä-DNA-tekniikoilla.
5 ’ Yhdistelmä-DNA-tekniikoiden kehittäminen mahdollistaa ihmisen yhdistelmä-DNA-luunmuotoutusproteiinein (rhBMP:t) tuottamisen. rhBMP-proteiineja ei kuitenkaan ole vielä hyväksytty kliiniseen hoitoon. Alustavissa kokeissa on ilmennyt, että rhBMP on 3 biologisesti aktiivista ja että sillä on mahdollisesti joitakin immunologisia etuja natiiveihin BMP-proteiineihin verrattuna. rhBMP:n biologinen aktiivisuus on kuitenkin vain 1/10 tai alle puhdistetun tai osittain puhdistetun natiivin BMP:n biologisesta aktiivisuudesta (Bessho, K., et ai. . henkilökohtainen yhteydenotto sekä julkaisu Protein (painossa) 1966).
Alustavat kokeet ovat johtaneet lukuisten biologisten kuljetus-systeemien kehittämiseen BMP:lie in vivo. Vaikka pitkälle puhdistetulla luonnollisesti esiintyvällä BMP:llä ja yhdis-telmä-DNA-BMP:llä kantajia käyttämättä suoritetuissa kokeissa on saatu myönteisiä tuloksia, ilman kantajaa annettu BMP liukenee ja sekoittuu implantaation jälkeen nopeasti ruumiin nesteisiin, jolloin kohta tämän jälkeen osteoinduktion ilmentyminen keskeytyy. Näin muodoin BMP:lie tarvitaan sopiva funktionaalinen kantaja sen aktiivisuuden tehostamiseksi ja moduloimiseksi. Tähän mennessä tavanomaisilla menetelmillä eristetyllä BMP:llä tai rBMP:llä tavanomaisiin kantajiin yhdistettynä saadut tulokset eivät kuitenkaan ole olleet niin lupaavia kuin voisi odottaa.
Osteoinduktiivisen BMP: n siirteissä käytetty kantaja- tai kuljetussysteemi vaikuttaa suuresti BMP:n biologiseen aktiivi -suuteen. Kantaja suojaa BMP:tä nopealta ulospäin suuntautuval-ta diffuusiolta sekä endogeeniseltä proteinisaatiolta. Se pitää yllä BMP:n jatkuvaa pitoisuusgradienttia, joka sopii ‘ yhteen BMP:n kohdesolujen differentiaation ja luun muodostumi sen kanssa, minkä lisäksi se antaa käyttöön tukirakenteen tai **'·* telineen, johon BMP: lie alttiit solut voivat kiinnittyä.
.*·*, BMP: lie tarkoitettuja kuljetussysteemejä ei ole ainoastaan ..... käsitelty lukuisissa julkaisuissa, vaan niitä on julkistettu / , runsaasti myös useissa patentti- ja patenttihakemusjulkaisuis-b” sa. Esimerkiksi US-patenttijulkaisussa 5 443 531 julkistetaan ’ ' kuljetussysteemi, jossa BMP on adsorboitu hydroksiapatiittikan-tajaan kromatografiapylväässä.
4 BMP:n antoon kliinisissä sovellutuksissa käytettyjen kuljetus-systeemien ominaisuuksien parantamiseksi on käytetty kollageeneja, etenkin tyypin IV kollageenia, kantajien impreg-noimiseksi ja biologisen aktiivisuuden parantamiseksi. US-pa-tentti julkaisuissa 4 975 527 ja 4 394 370 julkistetaan BMP: n kollageenipohjaisia kantajia. Tyypin IV kollageenikantajaan yhdistetyn nauta-BMP:n luuta indusoivaa potentiaalia sekä annosriippuvaista vastetta käsitellään julkaisussa Gao et ai., Ann. Chir. Gvnec. 82 (1993) 77 - 84.
Toivomuksia vastaava luun korvike olisi materiaali, jolta puuttuisivat ihmisperäisiin siirteisiin liittyvät vaarat, jolla synteettisellä materiaalilla olisi elävää luusiirremas-saa muistuttavat ominaisuudet, kuten kemiallinen koostumus, geometrinen konfiguraatio sekä mekaaninen eheys lujuus, ja samalla myös sen kasvutekijöiden biologinen aktiivisuus, jotka tekijät pystyvät indusoimaan tai tehostamaan luun uudelleen-muodostumista.
Gao et ai. ovat julkaisseet artikkelin (Biomaterials 16 (1995) : ; 1175 - 1179) , jossa arvioidaan mikroskoopin avulla hydroksi- %·*«· apatiitin, bioaktiivisen lasin ja trikalsiumfosfaatin välistä kontaktia luusiirteessä, joka on implantoitu lampaan vialli-siin luunvarsiin.
I.I Lupaavia tuloksia on saatu niin sanotuilla biokeraamisilla * aineilla, kuten biokoralleilla, joita saadaan korallirungosta.
Biokoralleja on käytetty runsaasti kantajina. Korallirungosta ***-.* saadun kalsiumkarbonaatin käyttöä bioresorboituvana luumateri-V ' aalina kuvataan esimerkiksi US-patenttijulkaisussa 5 433 751 sekä WO-patenttijulkaisussa 93/02181.
i 5 ΐ # β y ^ Tiettyihin kasvutekijöihin kuten TGF:ään yhdistettyjen bio- P V korallikantajien käyttö on julkistettu WO-patenttijulkaisussa 94/26322. TGF-kasvutekijän käyttö yhdessä BMP:n kanssa on julkaistu myös US-patenttijulkaisussa 5 393 739.
5
Vaikka on ehdotettu lukuisia erilaisia kuljetussysteemejä BMP:tä varten ja eri systeemejä on kokeellisesti testattu (Lindholm ja Gao, Ann. Chir. Gvnaecol. 82 (1993) 3 - 12) , toistaiseksi ei ole löydetty BMP:n ja kantajan täysin tyydyttävää yhdistelmää ihmispotilaiden kliiniseen hoitoon.
On myös osoitettu, että tavanomaisilla menetelmillä eristetyt BMP-proteiinit aiheuttavat sen ohella, että niiden luun muodostumista indusoiva kapasiteetti on matala, immunogeenisiä ja tulehdusreaktioita.
Täten alalla on suuri tarve kehittää uusia, vaihtoehtoisia osteogeenisiä välineitä BMP:n kuljettamiseksi perille aiempaa tehokkaammin aiempaa paremman osteoinduktiivisen vaikutuksen saamiseksi. Samalla on tärkeätä saada käyttöön osteogeeninen väline, jolla olisi vähemmän immunogeenisiä ominaisuuksia.
Esillä olevan keksinnön päätavoite on antaa käyttöön osteogeeninen väline, jonka luun muodostumista indusoiva aktiivisuus on aiempaa parempi ja joka aiheuttaa vähemmän immuno-»o ϊ ^ ϊ geenisiä ja tulehdusreaktioita, jolloin tämä väline on T5: käyttökelpoinen selkärankaisten ektooppisessa luun muodostu- ;Y: misen induktiossa sekä segmentaalisten luuvajeiden korjauk- ..»·· sessa.
Esillä olevan keksinnön toinen kohde on antaa käyttöön uusi osteogeeninen väline, jolla on aiempaa parempia osteoinduktii-visia ominaisuuksia BMP:n, etenkin modifioidun BMP:n, aiempaa tehokkaammaksi bioaktiiviseksi perille kuljettamiseksi.
;Ύ Esillä olevan keksinnön seuraava päämäärä on parantaa BMP:n bioaktiivista kuljetussysteemiä nostamalla kuljetussysteemin / , biologista tehoa impregnoimalla kantaja, etenkin biokeraaminen 5 * kantaja, kollageenilla.
Esillä olevan keksinnön päämääränä on antaa käyttöön uusi osteogeeninen väline, jonka resorboituvuus on aiempaa parempi.
6
Edelleen päämääränä on antaa käyttöön modifioitu BMP-komp-leksi, jonka varastoitavuus on aiempaa parempi.
Kehitetyn aiempaa paremman, edellä mainittuihin ongelmiin ratkaisun tuovan osteogeenisen välineen ominaispiirteet sekä mainitun osteogeenisen välineen valmistusmenetelmän ominaispiirteet määritellään oheisissa patenttivaatimuksissa.
Esillä oleva keksintö koskee osteogeenistä välinettä, joka käsittää ainakin yhtä tyyppiä luun morfogeneettista proteiinia (BMP), edullisesti modifioitua BMP-kompleksia, joka oleellisesti ei sisällä 25 - 55 kD proteiinia, jolla on immunogeeni-siä ja tulehdusominaisuuksia, sopivaa kollageenien yhdistelmää, edullisesti kollageeniseosta, tyypin I kollageenia tai tyypin IV kollageenia sekä sopivaa kantajaa, edullisesti muotoiltavaa kappaletta, lohkoa tai sylinteriä, joka koostuu hydroksiapatiitista, trikalsiumfosfaateista tai biokeraami-sista aineista tai edullisimmin biokorallista, joka on saatu luonnollisesta korallirungosta, jolloin kuitenkin mainittujen {il minkä tahansa kantajatyyppien yhdistelmät ovat mahdollisia.
,·,·» Osteogeeninen väline voi mahdollisesti sisältää kasvutekijöitä kuten TGF : ää .
*,* Luun morf ogeneettinen proteiini voi olla tavanomaisilla ’* ’ menetelmillä puhdistettu BMP, tai yhdistelmä-DNA-teknisesti tuotettu BMP. BMP tulisi edullisesti eristää esillä olevan patenttihakemuksen jättäneiden keksijöiden kehittämällä ja alla kuvatulla menetelmällä, joka menetelmä on modifikaatio , Uristin kehittämistä menetelmistä, joita kuvataan esimerkiksi julkaisussa Urist et ai. ; Lindholm, T.S. (toim.) : New Trends in Bone Grafting, Acta Universitatis Tamperiensis. Tampereen yliopisto, sarja B, 4JD (1992) 27 - 39. Alan ammattilaiset T" huomannevat, että mainittua modifioitua BMP-kompleksia vastaavaa BMP:tä ja sen osteoinduktiivisia komponentteja voidaan tulevaisuudessa valmistaa yhdistelmä-DNA-teknisesti.
7
Edullinen modifioitu BMP-kompleksi käsittää seoksen, jossa on BMP-fraktiota, jonka molekyylipaino (MW) on korkea, sekä proteiinifraktiota, jonka MW on matala (kD), ja sille on lisäksi tunnusomaista, että se on ei-gelatinoitu, ei-kollageeninen, lipidipitoinen osteoinduktiivinen BMP-polypeptidi, josta immunogeeninen, tulehdusta aiheuttava fraktio on poistettu .
Edullinen modifioitu BMP-kompleksi (mBMPc) voidaan saada menetelmällä, joka käsittää seuraavat vaiheet: (a) Demineralisoitu luumateriaali jauhetaan hienoksi (pulverisoidaan); (a) Uutetaan pulverisoitua tai jauhettua luumateriaalia guanidiniumhydrokloridilla (GuHCl); (c) Suoritetaan suodatus tangentiaalisen virtauksen menetelmällä (d) Suoritetaan geelisuodatus, jolloin vaiheessa (a) saadusta uutteesta saadaan osittain puhdistettu BMP-kompleksi, jolla • .§ esiintyy kolme piikkiä ja joka käsittää kolme proteiinifraktiota, . joiden MW on korkea, keskimääräinen ja vastaavasti matala.
Mainittujen kolmen fraktion molekyylipainot ovat tunnusomaisesti erilaiset: fraktion I MW on korkea (100 - 700 kD) ja fraktiolla I on osteoinduktiivista BMP-aktiivisuutta, fraktion II MW on %*y' keskimääräinen (25 - 55 kD) ja fraktio II on immunogeeninen proteiini, jolla ei ole BMP-aktiivisuutta, ja fraktion III MW on ». matala (15 - 25 kD) ja fraktio III on proteiini, jolla on osteoinduktiivista BMP-aktiivisuutta; ja 1 > (e) poistetaan osittain puhdistetusta BMP:stä proteiinifraktion, *! jolla on immunogeenisiä ja tulehduksellisia ominaisuuksia ja ’/>» jonka molekyylipaino on 25 - 55 kD geelisuodatuksella 'ϊ'-'ί määritettynä.
8
Keksinnön toisessa edullisessa suoritusmuodossa puhdistusta varten suoritetaan vähintään yksi HPLC-geelisuodatus.
mBMPc voidaan vaihtoehtoisesti saada käyttämällä menetelmää, johon edellä määriteltyjen vaiheiden lisäksi sisältyvät seuraavat valinnaiset vaiheet: (1) suoritetaan vaiheessa (a) saadulle uutteelle ainakin yksi dialyysi vettä tai sopivaa puskuriliuosta vastaan, jolloin edullisesti sille suoritetaan kaksi dialyysiä, joista toinen on vettä vastaan ja toinen sopivaa puskuriliuosta vastaan; (2) suoritetaan ainakin yksi hydrolyysi, jossa käytetään kollagenaasia; (3) suodatetaan vaiheista (a) ja/tai (b) ja/tai (c) saatu uute käyttäen ultrasuodatussysteemiä konsentroidun liuoksen saamiseksi; ja (4) puhdistetaan BMP-uutetta jollain käyttökelpoisella proteiinipuhdistusmenetelmällä, joka ei oleellisesti haittaa » » ominaisuuksia, jotka edellä mainituilla vaiheilla voidaan saada.
# ’» *
Keksintö koskee myös menetelmää edellä kuvatun osteogeenisen välineen valmistamiseksi.
Kollageeneja, edullisesti kollageenia I, kollageenia IV tai kaupallisesti saatavia kollageeniseoksia inkuboidaan liuok--». sella, jossa on osittain puhdistettua tai puhdistettua natii- via tai yhdistelmä-DNA-BMP:tä tai modifioitua BMP-kompleksia. Edullinen BMP voidaan saada menetelmällä, joka on modifikaatio ; menetelmästä, jota kuvataan julkaisussa Urist et ai.; Lind- * holm, T.S. (toim.): New Trends in Bone Grafting, Acta Univer- « *> sitatis Tamperiensis, Tampereen yliopisto, sarja B, 40 (1992) ’! '! 27 - 39. Esillä olevan keksinnön mukaiselle mBMPc:lie on 9 tunnusomaista, että se käsittää seoksen, jossa on proteiini-fraktio, jonka MW on korkea, sekä proteiinifraktio, jonka MW on matala, jolla on BMP-aktiivisuutta ja josta oleellisesti puuttuu keskimääräisen MW:n immunogeeninen proteiini.
Kantaja, edullisesti biokeraaminen kantokappale, edullisimmin korallirungosta saatu biokoralli, upotetaan BMP-kollageeni-liuokseen ja inkuboidaan aika, joka riittää kollageenin impregnoimiseen BMP:llä. BMP-kollageeni-biokeraamikappaletta dialysoidaan ja kappale sekä dialyysiin käytetty liuos erotetaan toisistaan. Dialyysiin käytetystä liuoksesta mahdollisesti saostuneet BMP-jätteet, -jäännökset tai -jäämät tulevat adsorboiduiksi muotoiltavaan, huokoiseen kantajaan, jolloin saadaan biokeraaminen osteogeeninen väline. Mainittu väline kuivataan ja steriloidaan tavanomaisilla hyväksytyillä menetelmillä varastointiajän pidentämiseksi.
Kuviossa 1 on Sephacryl^· S-200-geelisuodatuskromatogrammi osittain puhdistetusta hirvi-BMP:stä. Esitetään jatkoana-lyyseihin otetut fraktiot. Fraktiot I ja III osoittivat ,V, osteoinduktiivisuutta biomäärityksessä hiirellä. Spesifikaa- tiot: virtausnopeus 0,9 ml/min; ajopuskuri: 0,06 M K-fosfaat- o * ti, pH 6,9, + 150 mM NaCl + 6 M urea + detergenttejä; injek- tiotilavuus 1,8 ml; injektoitu määrä 120 mg.
;**' Kuviossa 2 on HPLC-kromatogrammi, jonka perusteella osittain *·* * puhdistettu hirvi-BMP-valmiste määritellään multimeeriksi, joka koostuu kolmesta pääfraktiosta, joiden molekyylipainot » e ovat vastaavasti 11 - 40, 40 - 140 ja 500 - 700 kD.
Kuviossa 3 esitetään 45ca_in]corp0raat:ion variaatiot erilaatuisissa implanteissa BALB-hiirten lihastaskuissa 10. ja 20. päivänä implantaatiosta. Käytetyt osteogeeniset välineet on ·,*·; merkitty seuraavasti: luonnollinen koralli-kollageeni-BMP
*:*" (NC/COL/BMP) ; trikalsiumfosfaatti-kollageeni-BMP (TCP/COL/- BMP); kollageeni-BMP (COL-BMP); luun morfogeneettinen proteiini sellaisenaan (BMP); luonnollinen koralli-kollageeni 10 (NC/COL); trikalsiumfosfaatti-kollageeni (TCP-COL); luonnollinen koralli (NC); trikalsiumfosfaatti (TCP).
Esillä olevassa keksinnössä käytetään useita ilmaisuja, jotka ovat luusiirrännäisten alalta, mutta joitakin ilmaisuja käytetään jossain määrin modifioidussa merkityksessä, minkä vuoksi patenttiselityksessä ja -vaatimuksissa käytetyt ilmaisut määritellään yksityiskohtaisemmin seuraavassa.
Ilmaisulla osteogeeninen väline tarkoitetaan osteoinduktii-visen BMP:n kuljetussysteemiä, joka käsittää kollageenia impregnoituna komposiittimateriaalille, joka koostuu ainakin yhdestä muotoiltavasta, huokoisesta kantajasta, joka on edullisesti bioaktiivinen kantaja, mukaan lukien biokorallit, hydroksiapatiitti, bioaktiivinen lasi tai muu, tavanomaisesti luukirurgiassa käytetty hyväksyttävä materiaali.
Ilmaisulla osteoinduktiivinen tarkoitetaan prosessia, jossa yksi kudos saa tai siitä peräisin olevat tuotteet saavat toisen, ei-differentioituneen kudoksen differentioitumaan luukudokseksi. Prosessiin liittyy kahden systeemin: indusoivan *l*·; ja reagoivan systeemin, välinen vuorovaikutus. Osteoinduktios- lll sa indusoiva systeemi käsittää ruston liikakasvua, vastamuodos- tunutta tai demineralisoitua luumatriisia, transitionaalista epiteeliä ja BMP:tä. Reagoiva kohde koostuu mesenkyymikudosso-luista, jotka pystyvät muuttumaan osteoblasteiksi eli luuta muodostaviksi soluiksi.
Ilmaisulla osteokonduktio tarkoitetaan, että implantoitu *·* ’ materiaali toimii suhteellisen inerttinä tukisäleikkönä f**; isännän luun vähittäiselle korvautumiselle.
.* , Ilmaisulla osteogeneesi tarkoitetaan prosessia, jossa eloon- ’· ” jääneet esiosteoblastit ja osteoblastit muodostavat uutta * * luuta autosiirteissä tai vaurioituneen luukudoksen ympärille in situ.
11
Ilmaisulla luun morfogeneettinen proteiini (BMP) tarkoitetaan osittain tai täysin puhdistettua natiivia BMP:tä, jota voidaan saada luonnollisista luulähteistä entuudestaan tutuilla, usein käytetyillä eristysmenetelmillä.
Luun morfogenettinen proteiini (BMP) on ei-spesifinen, hydrofobinen matriisiglykoproteiini, joka kuuluu beta-transformoi-vien kasvutekijöiden (TGF-beta) ryhmään. Ollessaan sekä differentiaatiotekijä että mitogeeni BMP:llä on tärkeä osa alkion sekä sikiönjälkeisen elämän sekä ruston että luun muodostuksessa. Luonnollista BMP:tä on uutettu sekä karakterisoitu naudan, ihmisen, sian, kaniinin, rotan luusyöpäkudok-sesta sekä hirvestä ja porosta. Erot uuttoprosessissa talteen saaduissa määrissä sekä biologisissa määrityksissä mitatussa osteoinduktiivisessa tehossa ovat osoittaneet, että näistä eri lähteistä peräisin olevien BMP-proteiinien välillä on lajiliit-teisiä ristiriitaisuuksia. Humaanikäyttöön soveltuvat kuitenkin vain BMP:n spesifiset, hyväksytyt tyypit.
Ilmaisulla luun morfogeneettinen yhdistelmä-DNA-proteiini lYl (rBMP), etenkin ihmisalkuperää olevalla rBMP:llä (rhBMP), tarkoitetaan BMPrtä, jota voidaan saada tavanomaisilla yhdis-,%·, telmä-DNA-tekniikoilla.
. . Ilmaisulla modifioitu luun morfogeneettinen proteiinikompleksi *f* (mBMPc) tarkoitetaan luun morf ogeneettista proteiinia, joka ft 8 β *·' ‘ käsittää seoksen, jossa on BMP-fraktiota, jonka molekyylipaino (MW) on korkea (100 - 700 kD), sekä BMP-fraktiota, jonka MW on *.V alhainen (15 - 25 kD) , jolloin kompleksi ei oleellisesti V ; sisällä immunogeenistä ja tulehdusta aiheuttavaa proteiinitrak- ,···, tiota, jonka MW on 25 - 55 kD. Mainittua mBMPc :tä voidaan saada menetelmällä, joka käsittää ainakin vaiheet, joissa » uutetaan jauhettua, demineralisoitua luuta GuHCl:llä ja a « *, *i fraktioidaan HPCL-geelifraktioinnilla patenttivaatimuksissa *·“· määritellyn mukaan.
12
Esillä olevassa keksinnössä ilmaisulla kollageeni tarkoitetaan ensisijassa tyypin I kollageenia, joka on pääasiallinen luumatriisissa esiintyvä kollageeni, tai tyypin IV kollageenia, joka on tyvikalvojen pääkomponentti, jotka liittyvät solujen differentiaatioon ja orientaatioon, membraanipolari-säätiöön, makromolekyylien selektiiviseen permeabiliteettiin, mutta tähän määritelmään sisältyy myös muun tyyppisiä kollageeneja, etenkin atelopeptidikollageeneja ja niiden seoksia mukaan lukien kaupallisesti saatavat kollageeniseokset.
Ilmaisulla keraamiset aineet tarkoitetaan edullisesti bio-keraamisia kantajia, jotka koostuvat muotoiltavista kappaleista, lohkoista tai sylintereistä, kuten hydroksiapatiitti, trikalsiumfosfaatti, bioaktiivinen lasi ja etenkin luonnollisista korallirungoista saatu biokoralli.
Koralli on meren erilaisten selkärangattomien lajien kalkki-kivirunko. Tietyn tyyppisten korallien huokoinen rakenne sekä mitat muistuttavat mikroskoopissa ihmisen ansasluuta. Korallin pääasiallinen epäorgaaninen aineosa on aragoniittikiteiden muodossa pääasiassa kalsiumkarbonaatti (98 % CaCC>3) , mutta # § tavataan myös vähäisiä määriä fluoridia, strontiumia ja s s magnesiumia.
3 5 β m s § a . Koska implantoitu BMP hajaantuu nopeasti in vivo. BMP-tutkimuk- sen haasteellisimpia tutkimusalueita, ennen kuin BMP voidaan t 5 a V * saattaa perustutkimuksen piiristä laboratoriossa kliiniseen käyttöön, on sellaisen ihanteellisen kuljetussysteemin seu-iJJ lominen esiin, jonka avulla pienet määrät BMP:tä voivat olla !j i tehokkaita pitkän aikaa.
* ; BMP:n kuljettajina on tutkittu ei-kollageeniproteiinia, kolla-, geenejä, hydroksiapatiittia, trikalsiumfosfaattia, polymaito- *, happoa ja titaania (Lindholm ja Gao, Ann. Chir. Gvn. 82 (1993) ’r;; 3 - 12) .
Tyypin IV kollageenin luuta indusoiva potentiaali nauta-BMP:n 13 kantajana on määritelty aiemmissa tutkimuksissa (Lindholm et ai. julkaisussa Lindholm, T.S. (toim.) : New Trends in Bone
Grafting, Acta Universitatis Tamperiensis, Tampereen yliopisto, sarja B, 40. (1992) 45 - 50; ja Gao et ai. , Ann. Chir. Gyn, 82 (1993) 77 - 84) . Vaikka saatiinkin myönteisiä tulok sia, rakennegeometrian ja mekaanisen eheyden puuttuminen estää tätä kollageenikantajaa olemasta hyväksyttävä luun korvike luun bioaktiiviselta komposiittikorvikkeelta odotetun sekä osteoinduktion että osteokonduktion osalta. Synteettisiin tai luonnollisiin materiaaleihin perustuvan luukorvikkeen ihanteellisten ominaisuuksien saamiseksi yksi esillä olevan keksinnön ideoista on jonkin geometriselta rakenteeltaan sopivan biokeraamisen aineen käyttäminen BMP-kantajan runkona. Trikalsiumfosfaattia, joka koostuu samoista ioneista kuin luun pääosan muodostavat, käytetään lääketieteessä laajalti implan-taatio- ja päällystysmateriaalina.
Luonnollista korallia sekä korallien mineraalirungoista saatuja johdoksia käytetään niinikään luusiirteiden resorboi-tuvina, osteokonduktiivisina ja osteofiilisinä korvikkeina hammaslääketieteessä. Esillä olevan keksinnön puitteissa ""l suunniteltiin ja suoritettiin kokeita tyypin IV kollageenilla , . impregnoidun luonnollisen korallin ja trikalsiumfosfaatti- * ”, keramiikkojen käyttämiseksi BMP:n komposiittikuljettajana.
* / Koska komposiittikantajien vaikutuksista BMP:n bioaktiivi- '**·* suuteen in vivo ei löydy kvantitatiivisia vertailututkimuksia ® s s * koskevia raportteja, tämän tutkimuksen päämääränä oli sel vittää, onko komposiittikantaja parempi kuin kollageenikantaja sekä mikä komposiittimateriaaleista, valtaosin luonnollisesta korallista vai trikalsiumfosfaatista koostuva, toimii paremmin s >'·* osteoinduktiossa kalsiummetabolian kannalta.
s s , Osteogeeninen väline kliiniseen käyttöön saatiin yhdistämällä 3 9 puhdistettuja naudan osteoinduktiivisia proteiineja kuten *;**: naudan luun morfogeneettinen nautaproteiine j a eri kantaja- materiaaleihin. Tämän osteogeenisen välineen käyttöindikaa-tioita olivat pseudoniveltaudin, yhteen liittymättä jääneiden 14 luunosien, luuvajeiden sekä luukystojen kirurginen hoitaminen sekä murtumien paranemisen nopeuttaminen endoprosteettisessa (erit. tekonivel-) kirurgiassa.
Näkyvää luunmuodostusta in vivo indusoimaan tarvittavaa minimaalista BMP-annosta käytettiin eri lähteistä peräisin olevan BMP:n bioaktiivisuuden määrittämiseksi käytännössä. Tyypillisesti lihaksensisäiseen osteoinduktioon tarvitaan yli 2 mg osittain puhdistettua nauta-BMP:tä. Esimerkiksi hirvi-BMP:llä oli korkea osteoinduktiivinen potentiaali, koska radiologisesti detektoitua ektooppista osteogeneesiä havaittiin käytettäessä niinkin vähäistä määrää kuin 0,2 - 2,0 mg osittain puhdistettua hirvi-BMP:tä. Nauta-BMP:hen verrattuna suhteellisen korkea hirvi-BMP:n saanto uuttoprosessissa osoitti, että BMP:tä oli runsaasti villin, ei-sukukypsän hirven luunvarressa. Vaikka on selvitetty, että BMP:tä on runsaammin nuorissa lajiedustajissa kuin vanhemmissa, variaatiot BMP:n määrässä sekä fenotyyppi- ilmennyksessä villien ja kotieläinten välillä ovat vielä selvittämättä. Koska ei-dissosioitunut hirvi-BMP on bioaktiivinen kokonaisuus, se koostuu polypeptidif raktioista, jotka kattavat laajan mole-kyylipainoskaalan. Hirvi-BMP:n, jossa hallitsevat molekyyli-painot olivat 11 - 40 kD, liittyminen ei-osteogeenisten matriisiproteiinien aggregaatteihin, jotka välittävät hirvi-,, BMP:n osteoinduktiivista aktiivisuutta kohdesoluille, saat- • * taisi selittää, miksi osittain puhdistetulla hirvi-BMP:llä on ’·’ * luu-induktiossa voimakas potentiaali. Alustavassa tutkimuk sessamme hirvi-BMP:n ilmeiset ominaispiirteet olivat korkea %V osteoinduktiivisuus sekä bioaktiivisen muodon runsas pitoisuus ϊ i ϊ sekä suuri molekyylimultimeeri.
Kalsiumin kerääntyminen implantaatiokohtaan osoittaa metabo-. lisesti osteogeneesiä varhaisessa vaiheessa. Kalsiumin saos- ·,*·: tumisen huippu vastamuodostuneessa luussa esiintyy tavalli- *:**: sesti päivinä 10 - 20 jyrsijöillä. 5Ka. 1 siUm±n inkorporaation merkittävä kasvu kohdissa, joissa oli komposiittivalmiste-implantti, osoitti kvantitatiivisesti, että komposiittikanta- 15 jät, luonnollinen koralli tai trikalsiumfosfaatti yhdistettynä tyypin IV kollageeniin, toimivat paljon paremmin BMP:n bioak-tiivisuuden kuljetuksessa kuin yksikomponenttikantajat. Luonnollinen koralli ja trikalsiumfosfaatti ovat molemmat runsaasti kalsiumia sisältäviä biokeraamisia aineita, joiden rakenne on hyvin huokoinen ja jotka ovat kudosopillisesti sopivia. Käytettäessä trikalsiumfosfaattia tai tyypin IV kollageenia yksinään BMP:n kantajana saatiin suotuinen tulos. Arvellaan, että BMP sitoutuu keraamisen aineen huokoiseen rakenteeseen, joka suojaa sitä diffundoitumiselta ulospäin in vivo sekä lisää reaktiivisen solun ja BMP:n kontaktipinta-alaa.
On osoitettu, että tyypin IV kollageeni sitoo sekä luonnollista että denaturoitua BMP:tä ja tehostaa BMP:n vaikutusta mesenkyymisolujen ja luunmuodostuksen kantasolujen differen-tiaatioon ja lisääntymiseen in vitro. Tyypin IV kollageeni sitoo samoin hanakasti BMP:stä vapautuneita kasvu- ja diffe-rentiaatiotekijöitä ja ohjaa niitä optimaaliseen konformaa-tioon uuden luun muodostumisen käynnistämiseksi paikallisesti. Keraamisten aineiden runsaasti huokosia sisältävä rakenne yhdistettynä tyypin IV kollageenin biologiseen modulaatioon ja s $ BMP: n bioakt iivisuuteen komposiittivalmisteissa lisäsi huo-.V, mättävästä BMP:n paikallista vaikutusta indusoituviin soluihin osteogeneesin tehostamiseksi. Komposiittikantajan keraaminen runko muodostaa täten tukirakenteen, johon indusoituvat solut 5,V voivat kiinnittyä, jossa ne voivat lisääntyä ja johon mine-V * raaleja voi kerääntyä. Läsnä olevat geometria ja mekaaninen eheys tekevät valmisteesta ihanteellisen luuvajeiden täyttäisi miseksi painoa kantavissa kohdissa. Mahdollisesti niinikään kalsiumioneilla, jotka vapautuvat komposiittivalmisteiden runsaasti kalsiumia sisältävien keraamisten aineiden liue-tessa, oli aktiivinen osa BMP:n bioaktiivisuuden säätelyssä 4 * , ja ilmentymisessä.
·;**·. Koralli-kollageeni-BMP: stä koostuvan komposiittivalmisteen osteoinduktiivinen potentiaali oli parempi kuin trikalsium- 16 kollageeni-BMP:n, mikä ilmenee tämän patenttiselityksen kokeellisesta osasta. 45Ca-otto, vastamuodostuneen luun määrä radiografiässä sekä uuden luun kasvu huokosiin histologisissa määrityksissä olivat kaikki edukkaammat luonnollinen koralli-kollageeni -BMP:tä käytettäessä trikalsiumfosfaattikollageeni-BMP-valmisteeseen verrattuna. Erojen katsottiin pääasiassa johtuvan aineosien ja lähteiden vaihteluista komposiitti-kantajissa käytettyjen kahden keraamisen aineen välillä.
97 % luonnollisen korallin rakenteesta on aragoniitiksi kutsutun ortorombisen kiteen muodossa kalsiumkarbonaattia. Kun suoritettiin luonnollisen korallin implantaatio in vivo, tapahtui ennen uuden luun muodostumista pinnan nopea modifikaatio. Pinnan ensin tapahtuneessa liukenemisessa ympäröivään nesteeseen vapautui kalsium- ja karbonaatti-ioneja, minkä jälkeen tapahtui kalsium- fosfaattikerroksen saostuminen tai depositio ja/tai karbonaattipintakerroksen muuttuminen karbonaatti- kalsiumfosfaatiksi. Luonnollisen korallin runsaasti kalsiumia ja fosfaattia sisältävä kerros oli keskeinen rakenne-pohja sekä uuden luun muodostumiselle että soluvälitteiselle ·*,*. degradaatiolle. On osoitettu, että luonnollinen korallirunko bio-integroituu täydellisesti ja että sillä on myös jonkin verran osteoinduktiivisia ominaisuuksia. Näin muodoin 45Ca:n korkeampi inkorporaatio luonnollista korallia käsittävissä , , verrokeissa kollageenilla tai ilman verrattuna trikalsiumfos- *t* faattiin kollageenilla tai ilman osoittaa osteogeenisen vai- *·’ ’ kutuksen varhaisessa vaiheessa implantaation jälkeen. Toinen merkittävä seikka on, että luonnollista korallia saadaan V,· skleraktiniaanisten korallien luonnollisesta mineraalirungos- a * * ·' ta, jonka rakenne poikkeaa ihmisen valmistamasta trikalsium-fosfaatista. Luonnollisen lähteen sekä rakenteen johdosta koralli voi assimiloida enemmän BMP:tä, säädellä BMP:n biofunk-, tiota sekä vetää puoleensa enemmän luunmuodostuksen kanta- *,**; soluja.
Yksityiskohtainen mekanismi on vielä selvitettävä. Koska luonnollinen koralli osoitti parempaa bioresorboituvuutta, mekaa 17 nista vastustuskykyä sekä BMP:n kuljetustehoa, se on todennäköisesti kliiniseltä kannalta eräs ihanteellinen vaihtoehto BMP-kantajaksi.
Annosriippuvainen luunmuodostus on BMP:n biologisten ominaisuuksien eräs tärkeä mittatikku. Indusoituneen luun määrä kas-voi suhteessa komposiittivalmisteeseen lisättyihin hirvi-BMP-annoksiin. 4^korporaatio komposiittivalmisteilla, jotka sisälsivät 4 mg hirvi-BMP:tä, oli esimerkiksi paljon pienempi kuin käytettäessä 8 mg hirvi-BMP:tä sekä 10. että 20. päivänä. Keraamisiin aineisiin ja kollageeniin yhdistetyn mBMP:n indu-soima annosriippuvainen luuinduktio ei häiritse hirvi-BMP:n biologista funktiota.
Komposiittivalmisteet, joissa oli hirvi-BMP:tä ja tyypin IV kollageenia tai ei, synnyttivät 10 päivässä voimakkaamman osteoinduktion kuin 20 päivässä. Epäselvää on, mistä tämä omituinen ilmiö johtuu. Koska yhteisymmärrykseen ei ole päästy siitä, miten BMP:n yhdistäminen keraamiseen kantajaan voi nopeuttaa tai hidastaa luuinduktion aikakäyttäytymistä, tässä tutkimuksessa käytetty yhdistelmämenetelmä, jossa käytetään * \ kolmea komponenttia, saattaisi helpottaa BMP-fenotyypin ilmen- . , tyrnistä sekä luunmuodostusta.
# · 0 * s • se»» BMP-polypeptidikompleksissa esiintyvien homo- ja hetero-dimee-’·*·' risten muotojen aiheuttamat komplikaatiot saattavat nostaa tai * s » * laskea aktiivisuuksia tai jopa estää ne luuinduktiosysteemis-sä. Heterogeenisen BMP:n implantaation aiheuttama immunologi-: nen ongelma saattaa ilmetä myös reaktiivisten tulehdussolujen :T; infiltraationa hirvi-BMP:tä sisältävien valmisteiden ympärille eri ryhmissä. Useita eri molekyylipainoa vastaavia fraktioita sisältävien hirvi-BMP-kompleksien bioaktiivinen kokonaisuus myötävaikutti kompleksin osteoinduktiiviseen potentiaaliin sekä immunogeeniseen vaikutukseen, joka katkaisi osteoinduk- *;·-*· tion tai laski sitä 20. päivänä implantaatiosta. Erilaisten dissosioituneiden hirvi-BMP-fraktioiden immunogeenisyyteen liittyviä tapahtumia tutkitaan paraikaa.
3.8 BMP:hen kohdistettu runsas tutkimus on avannut uusia näköaloja bioaktiivisten luukorvikkeiden kehitykselle. BMP:llä, joka on erityisesti kovakudosmatriisissa sijaitseva glykoproteiini, on tärkeä osa sekä ruston että luun muodostuksessa sekä alkiolla että sikiövaiheen jälkeen. Suuria, parantumatta jääneitä luu-vajeita on korjattu menestyksekkäästi luonnollisesti esiintyvällä BMP:llä, kun tämä kuljetettiin perille sopivalla kulje-tussysteemillä. Kun käytettiin osittain puhdistettua ihmisen BMP:tä, joka oli saatu autogeenisistä luusiirteistä tai auto-lysoidusta antigeeniuutetusta allogeenistä luusta, saatiin rohkaisevia alustavia tuloksia pyrittäessä hallitsemaan sitkeitä reisiluun rikkoumia, jolloin kuitenkin potilaista saatavien autogeenisten verkkomaisten siirteiden rajallinen määrä oli turhauttava ongelma.
Joitakin biokeraamisia aineita on käytetty BMP:n kantajina kokeellisissa tutkimuksissa. Selvitetyt huokoisuus, mekaaninen eheys sekä kudosyhteensopivuus pätevöittivät jotkut näistä biokeraamisista aineista BMP:n mahdollisiksi kantajiksi. Jäljellä olevissa ongelmissa keskeinen seikka on, miten yhdistää BMP, joka on biologinen tekijä, keraamisiin ainei-. » siin, jotka ovat luonteeltaan epäorgaanisia, ensinnäkin * *, tehokkaasti sekä siten, että rekonstituutiossa BMP:n biolo ginen funktio säilyy tai sitä jopa moduloidaan.
V · Käyttäen lampaan BMP:llä ja tyypin IV kollageenilla impregnoi tuja trikalsiumfosfaattisylintereitä tutkittiin tämän kompo-;V: siittiluukorvikkeen tehoa lampaiden sääriluun segmentaalisten luuvaurioiden korjaamisessa. Tämän subkliinisen tutkimuksen päämääränä oli tutkia mahdollisuuksia ja näköaloja bioaktiivi-*·**’ sen luukorvikkeen kehittämiselle kliiniseen käyttöön.
BMP-tutkimuksen paras käytännön sovellutus on potilaiden hoito, joilla on hankalia, umpeutumatta jääneitä murtumia tai suuria luuvajeita. Monien tutkijoiden päämääränä on ollut jo 19 kahden vuosikymmenen ajan kattaa aukko BMPrtä koskevan perustutkimuksen sekä sen kliinisen käytön välillä. Keskeistä suurien, etenkin painoa kantavissa raajoissa sijaitsevien luuvajeiden menestyksekkäässä hallinnassa on samanaikaisesti uudelleenrakentaa luun jatkuvuus mekaanisesti lujana sekä helpottaa luun paikallista uudelleenmuodostumista.
Implantin mekaaninen eheys parantaa vauriokohdan paikoillaan pysymistä varhaisessa vaiheessa sekä suo tukirakenteen osteo-geeniselle kudokselle. Tapahtuva luun muodostuminen varmistaa vaurion paranemisen. Tähän mennessä tapahtunut biokeraamisten aineiden kehitys on antanut kliiniseen käyttöön laajan valikoiman bioyhteensopivia luuntäytemateriaaleja, jolloin kuitenkaan ei ole raportoitu mistään biokeraamisesta aineesta, joka olisi selvästi osteoinduktiivinen.
Käyttämällä luonnollisesti esiintyvää tai yhdistelmä-DNA-humaani-BMP:tä on menestyksekkäästi korjattu suuria luuvajeita rotta-, kaniini-, koira-, lammasmalleissa sekä ihmisessä, jolloin osteogeeniset proteiinit on vastaavasti yhdistetty ;V; kollageenijohdoksiin, polymaitohappoon ja autolysoituun, anti- geeni-uutettuun allogeeniseen (AAA) luuhun. Toivotun geo-metrisen konfiguraation sekä mekaanisen eheyden puuttuminen * r\ näiltä BMP-kantajilta tekivät kuitenkin edelleen näistä komposiittisiirteistä kirurgisesti mahdottomia.
*·’ * Kun käytimme komposiittiluukorviketta, joka koostui kolmesta aineosasta: trikalsiumfosfaatista, joka oli impregnoitu luon-·,V nollisesti esiintyvällä BMP:llä sekä tyypin IV kollageenilla, : : : saamamme koetulokset osoittivat, että tietämyksemme mukaan ensimmäistä kertaa tämän bioaktiivisen komposiittiluukorvik-"**, keen mekaaninen lujuusprof iili sekä kapasiteetti riittivät . indusoimaan segmentaalisen luunvarsivaurion paranemisen ί/·· lampaassa.
Tarkoituksenmukainen kuljetussysteemi suorittaa useita oleellisia funktioita BMP:n osteoinduktiviteetin edistämiseksi, 20 mukaan lukien BMP:n rajoitettu vapauttaminen tehokkaana annoksena ajankohtana, joka sattuu kohdesolujen akkumulaation ja lisääntymisen ajankohtaan, sekä solujen ja luunmuodos-tuksen välisen vuorovaikutuksen kunkin vaiheen huomioiminen. Käytetyn materiaalin on oltava bioyhteensopiva ja biohajoava ja sen tulisi toimia substraattina paikalle kerääntyneiden luuta muodostavien kantasolujen kiinnittymiselle.
Urist et ai. . Clin. Orthop. 187 (1993) 277 - 280, kuvasivat trikalsiumfosfaattikiekkoa nauta-BMP:n kantajaksi. Hiiren lihastaskuissa oli 21 päivän kuluttua implantaatiosta muodostunut trikalsiumfosfaattia ja BMP:tä sisältävässä implantissa 12-kertainen määrä uutta luuta verrattuna pelkästään 1,0 mg BMP:tä käsittävään implanttiin. Tyypin IV kollageenin tehostava vaikutus nauta-BMP:n osteoinduktiviteettiin on osoitettu aiemmasssa tutkimuksessamme.
Työhypoteesi, jonka perusteella rekonstituoimme tässä kokeessa kolmea aineosaa käyttävän komposiittiluukorvikkeemme, oli, että trikalsiumfosfaattisylinterin tarjoama mekaaninen lujuus, bioyhteensopivuus, huokoisuus sekä BMP:n sitoutumiskohtien saa-'·’·* tavuus yhdistettynä tyypin IV kollageenin BMP:n osteogeenistä * i r« l * * kapasiteettia tehostavaan vaikutukseen tekisi tästä komposiit- ·.·.* tiluukorvikkeesta paremmin soveltuvan kliiniseen käyttöön.
» ; l l Koetulokset ovat osoittaneet 3 viikosta implantaation jälkeen ;*·*; eron sillan muodostavan uudisluun määrässä 100 mg lampaan BMP:tä käsittävän komposiittiluukorvikkeen sekä komposiitti-luukorvikkeen välillä, joka käsitti 13 mg lampaan BMP:tä tai trikalsiumfosfaattia ja tyypin IV kollageenia, jolloin ero oli ί a e ilmeinen 6 viikon kuluttua implantaatiosta. Tämä vahvisti, § φ * %,,· että BMP:n indusoima luumuodostuskaskadi ilmentyi tavallisesti *"·; ajankohdasta 7 päivää 4 viikkoon riippuen eläinlajista sekä , j eri kantajista ja implantaatiokohdasta. Koska luukalvo säästyi ' _ tässä tutkimuksessa, paremmin aktivoidut mesenkyymityypin solut ja indusoitavat solut luukalvon tai luun ydinonteloa 21 ympäröivä kalvon lähinnä luuta olevasta osasta myötävaikuttivat runsaaseen luun uudelleenmuodostumiseen BMP-impreg-noitujen implanttien ympärillä lampaan sääriluussa.
Lampaan reisiluun segmentaalisen vaurion korjaamiseen yhdis-telmä-DNA-BMP:llä verrattuna sillan muodostavan uudisluun muodostuminen tapahtui meidän tutkimuksessamme aikaisemmin. 100 mg lammas-BMP:tä käsittävällä komposiittiluukorvikkeella (CBS) on tietokoneavusteisella kuvantamisanalyysillä määritetty siltaa muodostavan uudisluun merkittävästi suurempi alue ja parempi lujuus kuin komposiittiluukorvikkeella, jossa on 13 mg lammas-BMP:tä, tai trikalsiumfosfaattisylinteri-implan-teilla sekä ajankohtana 3 että 6 viikkoa.
BMP:n annosriippuvainen luuinduktio oli yksi merkittävistä biologisista ominaispiirteistä. Yleisesti on tunnettua, että mitä korkeammasta eläinlajista on kysymys ja mitä suurempi on muodostunut vaje, sitä enemmän BMP:tä tarvitaan vaurion korjaamiseen. Ilman, että ilmeni tilastollisesti merkitseviä eroja uudisluun pinta-alassa ja lujuudessa eri ajankohtina tai ,%·, mekaanisessa lujuudessa 13 mg lammas-BMP:tä käsittävän kompo- trtt· siitti-luukorvikkeen ja trikalsiumfosfaattisylinterien välil- , , lä, esillä olevan keksinnön mukaisissa kokeissa osoitettiin 4 *, niinikään, että suurien luuvajeiden parantaminen korkeammissa nisäkkäissä vaatii suuren BMP-annoksen.
« ύ 9 V · Siltaa muodostavan uudisluun jakaumat ja muodot BMP:llä impreg noitujen trikalsiumfosfaatti- ja BMP:tä sisältämättömien lY; trikalsiumfosfaatti-implanttien välillä olivat selvästi eri- laiset etenkin ajankohtana 6 viikkoa. Tämä mielenkiintoinen ilmiö saattaa antaa lisää todisteita BMP:n paikallisesta '1 vaikutuksesta osteoinduktioon. Yhteensopivasti siltaa muodos tavan uudisluun määrän kasvun kanssa käytettäessä varhaisessa ;Yj vaiheessa 100 mg lammas-BMP:tä käsittävää komposiittiluu- i korviketta uudisluun akkumuloitu tiheys oli merkittävästi kasvanut kokeen lopussa suoritetun tietokonetomografia- (CT) pyyhkäisyn mukaan. Tämä kasvu osoitti, että enemmän kypsää 22 uudisluuta ja suurempi mineraalipitoisuus muodostui 100 mg lammas-BMP:tä käsittävää komposiittiluukorviketta käytettäessä kuin käytettäessä trikalsiumfosfaattisylintereitä. Se, että siltaa muodostavan uudisluun pinta-alan laajuus varhaisessa vaiheessa korreloi uudisluun tiheyden kasvuun myöhemmässä vaiheessa BMP-impregnoiduissa implanteissa, saattaa viitata siihen, että BMP edistää myös luiden uudelleenmuotoutumista.
Kokeellisissa tutkimuksissa mekaaninen lujuus on osoitettu murtuman biologisen paranemisen kultaiseksi nyrkkisäännöksi. Vääntökokeen arveltiin olevan luun lujuuden kattava ja luotettava parametri. Komposiittiluukorvike-ryhmissä kaikki vääntö-kokeen parametrit paranivat lammas-BMP-annosta komposiitti-implantissa nostettaessa trikalsiumfosfaattisylinteri-ryhmään verrattuna. Huolimatta kahden limittyvän AO-levyn jäykän immo-bilisaation stressiltä suojaavasta vaikutuksesta luutunut sääriluu, joka käsitti 100 mg lammas-BMP:tä käsittävästä kom-posiittiluukorvikkeesta koostuvan implantin, oli jopa vahvempi kuin vastapuolen sääriluu, jossa oli kohdakkain osuvat reiät.
Kohtasimme tutkimuksessamme myös suuria vääntökoeparametrien standardipoikkeamia, jolloin kuitenkin parantuneessa, luutu-neessa sääriluussa, johon oli implantoitu 100 mg lammas-BMP: tä * käsittävää komposiittiluukorviketta, ilmeni luujäykkyyden *,V merkittävästi kasvanut prosenttiosuus vastapuolen sääriluuhun verrattuna verrattaessa tätä yhdistelmää trikalsiumfosfaatti-: Yi sylintereihin ajankohtana 16 viikkoa. Koska komposiittinen luun korvike ei ainoastaan lisännyt siltaa muodostavan uudisluun määrää, vaan indusoi myös uuden luun kasvamista tri-kalsiumfosfaattihuokosiin, histologisesti todettiin uuden luun 1· sekä komposiittiluukorvikkeen välinen hyvä osteointegraatio.
Se, että murtumalinja esiintyi mekaanisessa testauksessa implantti-luurajaviivan läpi kulkevana vain yhdessä kuudesta 100 mg lammas-BMP:tä käsittävästä komposiittiluukorvikkeesta, antoi lisää todisteita hyvästä osteointegraatiosta.
23
Havaittu osteointegraatio ja uudelleenmuovautuminen, ankkuroidut trikalsiumfosfaattisylinterit vajeessa sekä pidentynyt havainnointiaika selitettiin johtuviksi luun kasvaneesta jäykkyydestä 100 mg lammas-BMP:tä käsittävää komposiittiluu-korviketta saaneessa ryhmässä. Kaiken kaikkiaan spiraalimaiset murtumakuviot vastasivat myös paranemisen biomekaanista vaihetta. Vääntökokeessa vastapuolen sääriluuta, johon oli tehty vastaavat reiät, käytettiin autokontrollina parantuneen sääriluun suhteellisen lujuuden määrittämiseksi.- Ajatuksena oli luoda jäljittelevät testiolosuhteet ja vähentää parametri-vaihteluita, jotka johtuivat ruumiinpaino- ja ikäerojen vaikutuksista luun lujuuteen. Kuitenkin reikiä käsittävän lampaan sääriluun mekaanisen suorituskyvyn heikentyminen ehyeen sääriluuhun verrattuna on vielä osoitettava.
Johtopäätöksenä kolme aineosaa käsittävä komposiittiluukorvike tuotti etuina osteoinduktion, osteokonduktion ja mekaanisen vastustuskyvyn. Nykyisin biomateriaaleja koskevassa tutkimuksessa tehdyt edistysaskelet ovat suoneet paremmat mahdollisuudet sopivan biomateriaalin esiin seulomiseksi kompo- siittiluukorvikkeen rungoksi. Luonnollisesti esiintyvän BMP:n rajoitetun saannin ja epäpuhtauden aiheuttamat ongelmat *.*.* voidaan kiertää valmistamalla yhdistelmä-DNA-BMP: tä. Rekons- tituutiotekniikoiden kehityksen myötä humaanikäyttöön saadaan toivomuksia vastaava komposiittiluukorvike. Tässä kokeelli-·:*·: sessa tutkimuksessa oli korostetusti keskeistä osoittaa, miten j’;’: tärkeätä ja edukasta synteettisen bioaktiivisen luukorvikkeen »·*.*. kehittäminen lääketieteen käyttöön on.
.. Ihmiskunnan suuri haaste ei ole ainoastaan sellaisten uusien *„’ ja aiempaa parempien kuljetussysteemien BMP: lie kehittäminen, joita voidaan käyttää luuston häiriöistä ja epämuodostumista : ί kärsivien potilaiden hoitamiseksi, vaan tärkeätä on myös ·;·*: osteogeenisissä välineissä käytettyjen komponenttien ominai- , suuksien kehittäminen.
24
Luun morfogeneettinen proteiini BMP eristetään yleensä Uristin et ai. kehittämillä menetelmillä; julkaisut Lindholm, T.S. (toim.): New Trends in Bone Grafting, Acta Universitatis
Tamperiensis, Tampereen yliopisto, sarja B, 40. (1992) 27 - 39; Urist et ai. , PNAS 76 (1979) 1828 - 1932 jne. BMP:tä, sen eristämistä, puhdistamista ja ominaisuuksia kuvataan myös esimerkiksi seuraavissa US-patenttijulkaisuissa: 5 433 751; 4 294 753; 4 455 256; 4 563 489; 4 596 574; 4 789 732; ja 4 795 804.
Nykyään useimmissa alan laboratorioissa käytetään Uristin et ai. kehittämiä uuttomenetelmiä, joille on tunnusomaista guanidiniumhydrokloridi- (GuHCl) uuton käyttäminen sekä edelleen tunnusomaista seuraavat piirteet. Luumatriisi jauhetaan ensiksi ja gelatinoidaan ei-kollageeniperäisten proteiinien vapauttamiseksi. Uutto suoritetaan kalsiumkloridin ja prote-aasi-inhibiittorien läsnä ollessa. Raakamateriaalista poistetaan lipidit, jotka häiritsevät puhdistusprosessia. Täten BMP-proteiinit, joita voidaan saada natiivista luumatriisista tavanomaisilla laboratoriomenetelmillä, ovat gelatinoituja eivätkä oleellisesti sisällä lipidejä. Ne saattavat sisältää hivenpitoisuuksia proteinaasi-inhibiittoreita sekä ylimäärin '·*»* Ca2 + - ione j a .
·.·,· Luun morfogeneettinen proteiinia on valmistettu myös yhdis- *!**: telmä-DNA-tekniikoilla. Tällaisia menetelmiä on julkistettu esimerkiksi WO-patentti julkaisuissa 90/11 366 ja 95/24 474.
Tällainen rhBMP ei sisällä natiivista luumatriisista mitään sellaisia jäämiä, jäännöksiä tai loppuosia, jotka mahdolli-sesti ovat vielä kiinnittyneinä natiiviin BMP:hen, joka on saatu yleensä käytetyillä menetelmillä uuttamalla. rhBMP:stä puuttuvat esimerkiksi luonnollisesta luusta peräisin olevan BMP:n mahdollisesti sisältämät lipidit ja muut aineet.
Esillä olevan hakemuksen laatineet tutkijat huomasivat yllät-. täen, että mikäli mainittuja tavanomaisia laboratoriomenetel miä modifioidaan jonkin verran, saadaan uuden tyyppistä , 25 BMP:tä. Mainitulla uuden tyyppisellä BMP:llä, eli esillä olevan keksinnön mukaisella modifioidulla BMP-kompleksilla (mBMPc), yhdistettynä kollageeniin ja muotoiltaviin kantajiin, kuten biokeraamisiin aineisiin mukaan lukien biokorallit, saatiin yllättävän hyviä tuloksia luun muodostumisessa.
Esillä olevan keksinnön mukaisesta menetelmästä poikkeavilla menetelmillä uutetut natiivit BMP:t eivät ole osoittautuneet yhtä tehokkaiksi kuin esillä olevan keksinnön mukaisella menetelmällä uutettu mBMPc yhdistettynä esillä olevan keksinnön mukaisessa osteogeenisessä välineessä käytettyihin kanto-materiaaleihin. Kuitenkaan vain kantomateriaali ei ole tärkeä luun bioresorptiossa, vaan myös käytetyn BMP-kompleksin tyyppi sekä sen ominaisuudet ovat hyvin tärkeitä haluttujen osteo-induktiivisten ominaisuuksien saamiseksi.
Tämän keksinnön suorittajat ovat saaneet parhaat tuloksensa käyttäen mBMPc:tä, mikä viittaa siihen, että gelatinoidulta BMP:Itä tai rhBMP:ltä puuttuu jokin tai jotkut oleelliset komponentit, jotka ovat oleellisia hyvän implantin saamiseksi. Täten keksijämme ovat todenneet, että yllättävän hyviin osteoinduktiivisiin ominaisuuksiin voidaan päästä käyttämällä '.*·* osteogeenistä välinettä, joka sisältää modifioitua BMP-kom- *·*’* pleksia, joka on eristetty Uristin menetelmien modifikaa- V.: tiolla, joka määritellään oheisissa patenttivaatimuksissa, T"; yhdistettynä tyypin IV kollageeniin ja biokorallikantajaan.
.T. Näin muodoin esillä olevan keksinnön edullisessa suoritus muodossa BMP uutetaan menetelmillä, joita kuvaavat Jortikka, L. , et ai. (Ann. Chir. Gynaecol. 82 (1993) 25 - 30); ja
Jortikka et. ai. (Ann. Chir. Gvnaecol. 82 (1993) 31 - 36) . Mainitut menetelmät perustuvat Uristin et ai. kuvaamaan menetelmään; julkaisu Lindholm, T.S. (toim.) : New Trends in
Bone Grafting, Acta Universitatis Tamperiensis, Tampereen yliopisto, sarja B, 40. (1992) 27 - 39. Alla esitetään, mitkä ovat oleelliset erot Uristin käyttämien uuttomenetelmien sekä uuttomenetelmän välillä, jota on käytetty esillä olevan keksinnön mukaisessa osteogeenisessä välineessä käytetyn modifioidun BMP-kompleksin valmistamiseksi.
26
Esillä olevan keksinnön mukaisessa menetelmässä jauhettua luumatriisia ei gelatinoida, koska nyt kyseessä olevat keksijät ovat havainneet, että ei-kollageeniproteiinien erotus, irrotus tai vapauttaminen guanidinium-HCl:ää (GuHCl) käyttäen on yhtä tehokasta gelatinointia käyttämättä kuin sitä käyttäen. Täten saatu tuote ei ole gelatinoitu. Kollagenaasin käyttäminen tässä uuttomenetelmässä on mahdollista ja joskus edullista mutta ei välttämätöntä.
Toinen erottava piirre on, että esillä olevan keksinnön mukaisessa menetelmässä GuHCl-uuton yhteydessä ei käytetä kalsiumkloridia, jolloin uuttomenettelyyn ei kohdistu Ca2 + -ionien kelatoivaa vaikutusta. Täten esillä olevan keksinnön mukaisella menetelmällä saadussa tuotteessa ei ole ylimäärin Ca2+-ioneja.
Keksijämme ovat lisäksi havainneet, että proteaasit eivät ole aktiivisia pitoisuudessa 1,5 - 5,0 M, edullisesti 4 N, GuHCl. Näin muodoin esillä olevan keksinnön mukaisissa uuttovaiheissa :Y: ei käytetä proteinaasi-inhibiittoreita, jolloin saatu modi- .;·« fioitu BMP-kompleksi ei sisällä lainkaan proteinaasi-inhibiit- torijäämiä (hivenpitoisuuksia) , jotka saattaisivat olla haitallisia tai tuhoisia potilaalle.
9 # *»,*, Koska käytetään tangentiaalista ultrasuodatuslaitteistoa, *·* lipidi-uuttoa ei tarvita. Lipidit eivät häiritse mainitun laitteiston toimintaa, joten lipidien poistamista ennen %V konsentrointia ei tarvita. Koska raakatuotteen valmistuksen V : viimeinen vaihe on HPCL-geelisuodatus, uuttoprosessin väli- vaiheissa ei tarvitse poistaa muita proteiinimolekyyle j ä laimealla GuHCl-liuoksella. Samasta syystä Triton X-100-uuttoa ei tarvita.
27
Raakapreparaatin tuotannossa viimeinen ja oleellinen vaihe on HPLC-geelisuodatus, josta saadaan kolme erillistä fraktiota. Näitä toisistaan poikkeavia fraktioita kutsutaan fraktioiksi I, II ja III. Fraktio I sisältää proteiinia, jonka molekyyli-paino (MW) on korkea (100 - 700 kD) ; fraktio II sisältää proteiinia, jonka MW on keskimääräinen (25 - 55 kD) ja fraktio III sisältää proteiinia, jonka MW on alhainen (15 - 25 kD) .
Keskimääräistä MW:tä (25 - 55 kD) vastaava fraktio II aiheuttaa ilmeisiä tulehdusreaktioita eikä indusoi luun muodostumista. Koska mainittu fraktio II vaikuttaa immunogeeniseltä, se jätetään käyttämättä ja heitetään pois. Talteen otetaan kaksi muuta HPCL-geelisuodatuksella saatua fraktiota: fraktio I, eli BMP, jonka MW on korkea, sekä fraktio III, eli BMP, jonka MW on matala.
Mainittuja kahta fraktiota voidaan käyttää erikseen. Hyvän varastoitavuutensa johdosta fraktio III on erityisen edullinen. Fraktiot I ja III yhdistetään (sekoitetaan) mahdollisesti, ja saatua osittain puhdistettua preparaattia voidaan käyttää sellaisenaan tai sitä voidaan puhdistaa edelleen käyttäen preparatiivista isoelektristä fokusointia tai prepa-ratiivista SDS-PAGE:ea (BioRad-laite). Kliinisessä käytössä ·.·.1 ilmeisestikin osittain puhdistettuja preparaatteja käyttämällä saadaan parhaat osteoinduktiiviset ominaisuudet.
« ® 1 *;2: Näin muodoin modifioitu BMP-kompleksi, joka voidaan saada edellä kuvatulla menetelmällä, on ei-gelatinoitu, ei-kolla-geeninen, ei-kelatoitu, lipidipitoinen proteiinikompleksi, joka käsittää seoksen ainakin kahdesta eri BMP:stä, joiden , , molekyylipainot poikkeavat toisistaan (100 - 700 kD ja 156 - 25 kD) , ja josta kompleksista puuttuu immunogeeninen, 25 - 55 kD:tä vastaava fraktio. Raakapreparaatti voidaan kylmäkuivata, ; h steriloida, ja sen varastointiaika on pitkä.
. Preparaattia voidaan käyttää suoraan keksinnön mukaisten osteo- 2 *4 : geenisten välineeiden valmistamiseksi, mutta mahdollista on myös virittää kylmäkuivattu BMP-preparaatti ja käyttää sitä 28 varastoinnin jälkeen esillä olevan keksinnön mukaisen osteo-geenisen välineen valmistamiseksi.
Ei-kollageeninen, vesiliukoinen luun morfogeneettinen proteiini- (BMP) materiaali, joka voidaan saada edellä kuvatulla menetelmällä, sekoitetaan liukoisiin kollageeneihin, edullisesti tyypin IV kollageeniin tai tyypin I kollageeniin, ja seoksella impregnoidaan luonnollista biokorallia, jota voidaan mahdollisesti käyttää yhdessä hydroksiapatiitin, bioaktiivisen lasin tai muun sopivan kantomateriaalin kanssa.
Keksintöä kuvataan yksityiskohtaisemmin seuraavissa esimerkeissä ja kokeissa. Ymmärrettäneen, että esimerkkien ja kokeiden tarkoituksena on ainoastaan havainnollistaa keksintöä yksityiskohtaisemmin eikä rajoittaa sen suojapiiriä.
Esimerkki 1
Osteoinduktiivisten polypeptidien, BMP:n puhdistaminen naudan kortikaalisesta luusta Lähtömateriaalina osteoinduktiivisten polypeptidien, kuten luun morfogeneettisten proteiinien (BMP) eristämiseksi käytet-%*,* tiin naudan kortikaalista luuta, jolloin käyttöä edelsi •V" alue-eläinlääkärin kontrolli ja hyväksyntä. Välittömästi eläin- ; ten kuoltua pitkät kortikaaliset luut poistettiin ja jäähdytet- ·;**· tiin sekä pidettiin kylmässä kunnes uuttomenettely aloitet- ,*,*» tiin. BMP:n puhdistukseen ryhdyttiin 3 0 tunnin kuluessa.
s 2 s # s ^
Naudan kortIkaalinen luumateriaali jauhettiin 1-2 mm3 partikkeleiksi ja demineralisoitiin 0,6 N HCl:ssä. Ei-kollageeni-proteiinit uutettiin demineralisoiduista luupartikkeleista 4 M *·’ ' guanidiniumhydrokloridiin (GuHCl) . GuHCl: ään liukoista pro- teiinimateriaalia dialysoitiin vettä vastaan ja veteen liukene-maton materiaali otettiin talteen. Tämä materiaali liuotettiin jälleen GuHCl:ään ja liukenematta jäänyt materiaali heitettiin pois. Lopuksi proteiinimateriaalin käsittävää GuHCl:ää dialysoitiin 0,2 M sitraattipuskuria, pH 3,1, vastaan.
29
Sitraattipuskuriin liukenematta jäänyt materiaali suodatettiin eroon geelisuodatuksella ja osteoinduktiivisia polypeptidejä eli BMP:tä sisältävät fraktiot yhdistettiin sekä fraktioitiin käyttäen preparatiivista SDS-PAGE:ea. Osteoinduktiiviset fraktiot yhdistettiin jälleen pooliksi ja ne fraktioitiin toistamiseen käyttäen HPLC-käänteisfaasikromatografiaa. Tuloksena talteen saatiin kolme erilaista polypeptidiä (kuviot 1 & 2) .
Saatujen fraktioiden osteoinduktiivisten BMP-ominaisuuksien biologinen testaus suoritettiin hiiren lihastasku-määrityk-sellä, joka osoitti kyvyn muodostaa uutta luuta. Biomääritys-menettelyn yksityiskohtien osalta katso esimerkki 4.
Löydettiin kaksi osteoinduktiivista polypeptidifraktiota, joilla oli BMP-aktiivisuutta, ja nämä fraktiot, fraktiot I ja II, yhdistettiin, saostettiin vedellä ja pestiin kahdesti tislatulla vedellä. Vaihtoehtoisesti sama menettely suoritettiin pelkästään fraktiolla III. Lopuksi saatu materiaali pestiin steriloidulla vedellä aseptisissa olosuhteissa ja varastoitiin -20 °C:seen.
Esimerkki 2 ..... Osittain puhdistettujen BMP-aktiivisten osteoinduktiivisten polypeptidien valmistaminen ei-sukukypsästä hirvestä (Alces alces) .
y; Kaikkiaan 102 kg tuoreita pitkiä luita ei-sukukypsästä hir- *·' " vestä (Alces alces) jäähdytettiin päivän kuluessa eläinten kuolemasta. Luun pääosa, luukalvo ja luuydin poistettiin V%* mekaanisesti. Jäädyttämisen nestetypessä jälkeen puhdistettu ! « ’ kortikaalinen luu sahattiin ja jauhettiin 0,5 - 1,0 mm·^ ,··», partikkeleiksi.
, Jauhettua luumateriaalia demineralisoitiin 0,6 M HCl:ssä 72 ‘/J tunnin ajan, minkä jälkeen sitä uutettiin 4 M guanidinium- HCl:ssä (GuHCl) 96 tunnin ajan demineralisoidusta luumatrii- 30 sista rasvaa poistamatta tai sitä gelatinoimatta. GuHCl:ään uutettu liuos suodatettiin 0,30 μπι suodattimen läpi käyttäen tangentiaalista virtaussysteemiä ja ultrasuodatettiin suodattimen läpi, jonka erotuskynnys oli 10 kD (Minitan, Millipore, Maryland, USA).
BMP-kompleksin sisältävää konsentroitua GuHCl-liuosta dialysoi-tiin vettä vastaan 24 tunnin ajan ja veteen liukenematonta materiaalia dialysoitiin toistamiseen vastaan 7 . tilavuutta 0,25 M sitraattipuskuria, pH 3,1. Tämän jälkeen menettelyn päätteeksi lyofilisoimalla sitraattipuskuriin liukenemattomasta materiaalista saatiin talteen kaikkiaan 5,85 g osittain puhdistettua hirvi-BMP:tä.
Osittain puhdistetun hirvi-BMP:n saanto oli 57,35 mg/kg tuoretta luuta. Tässä käytetty valmistusmenettely oli modifioitu menetelmästä, jota ovat aiemmin kuvanneet Jortikka, L., et ai. . Clin. Orthop. 297 (1993) 33 - 37; ja Urist et ai. .
Lindholm, T.S. (toim. ) : New Trends in Bone Grafting, Acta
Universitatis Tamperiensis, Tampereen yliopisto, sarja B, 4_0 (1992) 27 - 39.
V,* Esimerkki 3 *; ’! Ei-sukukypsästä hirvestä eristettyjen osittain puhdistettujen BMP-aktiivisten osteoinduktiivisten polypeptidien karakterisoi sointi ,*·/. Osittain puhdistetun hirvi-BMP :n karakterisoimiseksi 120 mg lyofilisoitua preparaattia liuotettiin 1 ml:aan 6 M ureaa ja , , liuoksella suoritettiin kromatografia-ajo Sephacryl^ S-200 *♦* f -HPCL-geelisuodatuskolonnissa, josta kromatogrammi esitetään V 5 kuviossa 1. Eluoimalla talteen saatuja fraktioita verrattiin I*”;: molekyylipainomerkkeihin, joina toimivat tyroglobuliini, .»:J beta-amylaasi , alkoholidehydrogenaasi, muna - albumi ini, karboni- y , happoanhydraasi ja myoglobiini. Kerätyt fraktiot lyofilisoi- ’* '= tiin erikseen jatkokarakterisointia ja biomääritystä varten.
31 20 mikrogrammaan lyofilisoituja fraktioita I ja III, joilla oli osoitettu olevan luun muodostumista indusoivaa aktiivisuutta hiiren reisilihasbiomäärityksessä (katso esimerkki 4 jäljempänä), lisättiin natriumdodesyylisulfaattia (SDS) ja panostettiin 1 mm polyakryyliamidigeeliin (pH-alue 3,5 - 9,5) isoelektristä fokusointia varten proteiinien isoelektristen pisteiden määrittämiseksi. Standardi saatiin kalibrointipak-kauksesta isoelektristä fokusointia varten (Pharmacia AB, Uppsala, Ruotsi). Geeli värjättiin 0,005-%:isella Coomassie Brilliant Blue -väriliuoksella. Hiiren reisilihasbiomäärityksessä BMP-aktiivisuutta osoittavien fraktioiden I ja III iso- . elektriset pisteet olivat alueella 5,3 - 5,6 pelkistävissä olosuhteissa.
Esimerkki 4 BMP:n biomääritys
Osittain puhdistetun BMP:n karakterisoimiseksi HPLC-geeli-suodatuksella 0,5 mg BMP:tä liuotettiin 2,0 ml:aan 4 M GuHCl:ää ja liuos panostettiin 300 mm pituiseen Sephacryl „·«·» 200-HPLC-kromatograf iakolonniin (Pharmacia Diagnostics,
Ruotsi) . Eluoituneiden, automaattisesti kerättyjen fraktioiden absorbanssia (280 nm) verrattiin standardiproteiineihin. 0,5, * k 1, 2, 5, 10 ja 15 mg osittain puhdistettua BMP:tä dispergoi- tiin N 0,5 gelatiinikapseleihin, minkä jälkeen ne implantoi-%*,* tiin erikseen lihastaskuihin BALB-hiirten takaraajoissa. 10 ja nai ·»· * 21 päivän kuluttua implantaatiosta ektooppinen uudisluunmuodos- tus arvioitiin röntgen- teknologisesti ja histologisesti.
j'·’; Osittain puhdistetun BMP:n biomääritykset suoritettiin välittö mästi uuttomenettelyn jälkeen ja ne toistettiin 15 kuukauden kuluttua tästä, jona ajankohtana suoritettiin myös fraktiointi ja fraktioiden I - III biomääritykset sekä isoelektrinen fokusointi.
32
Esimerkki 5 BMP:n säilytys
Uutettu ja lyofilisoitu materiaali säilytettiin kuivana kuivissa, steriloiduissa suljetuissa lasiputkissa eksikaattorissa +1 °C:ssa.
Esimerkki 6
Osteogeenisen välineen valmistus Kollageenin impregnointi BMP:llä
Vesiliukoista, puhdistettua BMP:tä valmistettiin edellä kuvatun mukaisesti. Ihmiskäyttöön sopivat kollageenivaihto-ehdot ovat kaupallisesti saatavana oleva tyypin IV kollageeni (Sigma Corp., nro C5533 ihmisen istukan tyvikalvosta) tai atelopeptidityypin I kollageeni (Nitta Gelatin Inc., Osaka, Japani) sekä LyostyptR (B. Braun Meisungen AG, Saksa).
Vesiliukoista, puhdistettua BMP:tä ja kollageenia liuotetaan NaCl-liuokseen huoneenlämpötilassa ja seosta inkuboidaan 4 °C:ssa 12 tunnin ajan BMP:n sitomiseksi täydellisesti kolla-*„%· geeniin.
·.,· Esimerkki 7 ’****: Osteogeenisen välineen valmistus :V: BMPrllä impregnoidun kollageenin adsorbointi kantajaan
Huokoiseksi substraatiksi tai kantajaksi tarvitaan ihmis-käyttöön hyväksyttyjä biokeraamisia aineita. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää ihmisen demineralisoitua kortIkaalista luuta. *. Mikäli käytetään ihmisluumateriaalia, luupankin the Bone Bank
System, Ortopedian ja traumatologian osasto, Tampereen ylio-pistollinen sairaala, Suomi, tulee se testata ja hyväksyä. ; Tällaisissa tapauksissa ihmisluumateriaalin demineralisointi ’ 0,6 N HCl:llä sekä jatkoprosessointi suoritetaan tavanomaisil la kirjallisuudessa kuvatuilla menetelmillä.
33
Ihmiskäyttöön hyväksytyistä biokeraamisista aineista, joita voidaan käyttää osteogeenisissä välineissä runkoina, seuraavia materiaaleja voidaan käyttää joko sellaisenaan tai sopivina yhdistelminä: (1) BiocoralR (Inoteb Corp., Saint Gonnery, Ranska); (2) hydroksiapatiitti (Bioland Corp., Toulouse, Ranska) ,- (3) trikalsiumfosfaatti (Skeleton Repair System, Norian Corp., CA, USA) ; (4) trikalsiumfosfaatti (Howmedica, Warsaw, USA); ja (5) bioaktiivinen lasi.
BMP:llä impregnoitu kollageeni adsorboidaan huokoisiin substraatti- tai kantajablokkeihin seuraavasti: (1) Kantajablokki upotettiin BMP:llä impregnoidun kollageenin seosliuokseen astiassa, joka sijoitettiin sitten tyhjöuuniin 25 - 30 °C:seen kunnes kaikki kuplat olivat vapautuneet substraatista. Astiaa, jossa olivat sekä BMP:llä impregnoitu kollageeniliuos että lisäksi tähän upotetut kantajablokit, pidettiin 4 °C:ssa 6 tunnin ajan, jotta vielä lisää BMP:tä tulisi sidotuksi huokoiseen substraattiin tai kantajaan.
S e (2) Huokoisen substraattiblokin käsittävä liuosseos kaadettiin ‘V"l dialyysiputkiin (erotuskynnys 12 000 - 14 000 daltonia), joita :V; dialysoitiin 10 mM glysiinipuskuria, pH 5,9, vastaan sekoit- taen 4 °C:ssa 24 tunnin ajan.
. ^ (3) Kun dialyysi oli saatu valmiiksi, blokit siirrettiin '«! dialyysiliuoksesta muoviseen, muotoon istuvaan muottiin, joita *. oli valmistettu eri kokoisina ja muotoisina kantajablokkien : mittoihin sopiviksi, minkä jälkeen lopuksi dialysoitu liuos ysentrifugoitiin (3 200 rpm, 20 min) .
s 1 (4) Liuoksen sentrifugoinnista saatu supernatantti, joka ei sisältänyt BMP-impregnoitua kollageenia, heitettiin pois, ja tämän jälkeen yksittäiset kantajablokit muotoon istuvassa 34 muotissa päällystettiin erillä uudelleensuspendoitua sakkaa, joka sisälsi jonkin verran sentrifugiputkiin impregnoituneen BMP:n jäämiä tai jätettä.
(5) Osteogeeniset välineet muovisissa muotoon istuvissa muoteissa lyofilisoitiin.
BMP:n ja kollageenin pitoisuus valmistetussa osteogeenisessä välineessä määritettiin yksiköissä mikrogrammaa/cm3 kantajaa, jolloin saatiin 100 mikrogrammaa BMP:tä ja 500 - 1 000 mikrogrammaa kollageenia/cm3 kantajaa.
Esimerkki 8
Komposiitti-implanttien rekonstituutio
Trikalsiumfosfaattisylinterit (B247, DePuy, Warsaw, IL, USA) ja luonnolliset korallisauvat (Biocoral^, Inoteb, Saint-Gonnery, Ranska) ovat kaupallisesti saatavana olevia biomateriaaleja, jotka arkkitehtuuriltaan muistuttavat ihmis-luuta. Trikalsiumfosfaatin ja luonnollisen korallin huokoisuus on 20 - 50 % ja huokoskoko 150 - 500 mikronia, ja läsnä on LL’ runsaasti sisäisiä yhdistäviä väyliä. Keraamiset aineet ; " työstettiin koneellisesti kiekoiksi, joiden halkaisija oli 4
s S
} mm ja paksuus 2 mm. Tyypin IV kollageenia (Sigma, ST. Louis, *:**: MO, USA) liuotettiin 0,25 M HCl:ään, joka sisälsi 0,5 M NaCl, ;Vj dialysoitiin vettä vastaan ja sentrifugoitiin epäpuhtauksien poistamiseksi.
. Osittain puhdistettua mBMP:tä ja dialysoitua tyypin IV kolla- geeniä suhteessa 4:1 liuotettiin 4 M GuHCl-liuokseen ja *·* inkuboitiin 20 °C:ssa yön yli. Sitten trikalsiumfosfaatti- ja luonnollinen korallikiekot upotettiin seosliuoksiin, jotka r*; sisälsivät vastaavasti korkean tai matalan pitoisuuden hirvi- / , BMP:tä. Kolmen aineosan seoksen käsittäviä liuoksia dialy- ’ soitiin vastaan 10 tilavuutta 10 mM glysiinipuskuria, pH 5,9, samalla sekoittaen 24 tunnin ajan. Sen jälkeen, kun trikalsiumfosf aatti- ja luonnollinen korallikiekot oli siirretty yksit- 35 täisiin pieniin putkiin, seosliuokset sentrifugoitiin nopeudella 3 200 rpm. Sentrifugiputkien käsittämä sakkaerä dis- pergoitiin mainittuihin pieniin putkiin, jotka sisälsivät trikalsiumfosfaatti- tai luonnollinen korallikiekot, ja putket sijoitettiin lyofilisaattoriin 48 tunniksi.
Kukin luonnollinen koralli-kollageeni-BMP:tä ja trikalsium-fosfaatti-kollageeni-BMP:tä käsittävä komposiitti- preparaatti sisälsi 8 mg hirvi-BMP:tä suuren annoksen käsittävässä ryhmässä ja 4 mg BMP:tä pienen annoksen käsittävässä ryhmässä.
Käyttäen samaa menettelyä valmistettiin kantajaverrokeiksi BMP:n, trikalsiumfosfaatin ja luonnollisen korallin yhdistelmiä tyypin IV kollageenin kanssa (kollageeni-BMP, trikal-siumfosfaatti-kollageeni ja luonnollinen koralli-kollageeni). Hirvi-BMP:tä, trikalsiumfosfaattia ja luonnollista korallia yksinään käytettiin aineosaverrokkeina. Kaikki implantit steriloitiin etyleenioksidilla ennen implantaatiota.
Esimerkki 9 „ . Osteogeenisen välineen sterilointi ja varastointi , . Laitteen steriloimiseksi on käytettävissä useita tavanomaisia s'*·* menetelmiä. Jotkut niistä, esim. gamma-säteilytys, eivät kuitenkaan ole hyväksyttyjä tietyissä maissa eikä lämpösteri-*.*.* lointi tule kysymykseen proteiinien denaturoitumisen vuoksi.
Näin muodoin osteogeenisen välineen sterilointiin käytetään etyleenidioksidikaasua 2 tunnin ajan tiiviisti suljetussa sterilointilaitteistossa, minkä jälkeen haihdutetaan tuulettaen 2-3 tunnin ajan.
Esimerkki 10 j’ J Komposiittiluukorvikkeen valmistaminen lampaille
Trikalsiumfosfaattisylinteri oli kaupallisesti saatavana oleva biokeraaminen aine, joka arkkitehtoonisesti ja kemiallisesti 36 muistuttaa ihmisluuta. Muotoiltujen sylinterien halkaisija oli 15 mm ja pituus 16 mm ja kumpikin pää käsitti pituudeltaan 3 mm:n tulpan. Pitkien luiden ydinkanavan jäljittelemiseksi porattiin pitkittäin keskelle reikä, jonka halkaisija oli 4 mm. Tyypin IV kollageenia liuotettiin 0,25 M HCl-liuokseen, joka sisälsi 0,5 M NaCl, ja liuosta dialysoitiin epäpuhtauksien poistamiseksi. Luun morfogeneettista proteiinia, joka oli laboratoriossamme uutettu kemiallisesti 4 M GuHCl:llä lampaan tuoreista sääri- ja reisiluista, puhdistettiin osittain suodattamalla 0,65 mikrometrin suodattimen läpi tangentiaa-lista virtaussysteemiä käyttäen, dialysoitiin ja lyofili-soitiin.
Vähimmäisannostus edellä esimerkin 1 mukaisesti uutettua, osittain puhdistettua lammas-BMP:tä, joka indusoi radiolo-gisesti todettavaa ektooppista luumuodostusta BALB-hiirten lihastaskuissa, oli 4,8 mg mitattuna 3 viikon kuluttua implan-taatiosta. Suuri tai pieni annostus lammas-BMP:tä ja puhdistettua tyypin IV kollageenia liuotettiin 4 M GuHCl-liuokseen suhteessa 5:1 ja inkuboitiin 20 °C:ssa yön yli. Trikalsium-f osf aattisylinteri upotettiin seosliuokseen, minkä jälkeen
• ö S
dialysoitiin vastaan 10 tilavuutta 10 mM glysiinipuskuria, pH . , 5,9, 24 tunnin ajan. Trikalsiumfosfaattisylinteri siirrettiin ’<**** muoviseen, muotoon istuvaan muottiin, minkä jälkeen dialysoitu * * seosliuos sentrifugoitiin.
'J : Sentrifugiputkesta lammas-BMP-jäämän sisältävä sakka päällys tettiin vastaavan trikalsiumfosfaattisylinterin muotissa *Υ; pinnalle. Lyofilisoinnin jälkeen kukin komposiittiluukorvike sisälsi 13 mg lammas-BMP:tä matalan annoksen komposiittiluu-korvikeryhmässä (CBSL) ja 100 mg lammas-BMP:tä korkean an-noksen luukomposiittikorvikeryhmässä (CBSH). Verrokiksi valmistettiin samalla menetelmällä trikalsiumfosfaattisylin-tereitä, jotka oli impregnoitu pelkästään vastaavalla annok-sella tyypin IV kollageenia. Kaikki valmistetut implantit steriloitiin etyleenioksidilla ennen implantaatiota.
37
Koe 1
Osittain puhdistetun hirvi-BMP:n ja fraktioiden I, II ja III luun muodostumista indusoiva aktiivisuus
Osittain puhdistetun hirvi-BMP:n ja fraktioiden I, II ja III Sephacryl^ S-200 -geelisuodatuksesta (kuvio 2) luunmuodostusta indusoivan aktiivisuuden biomääritys suoritettiin 28 - 35 päivän ikäisissä BALB-hiirissä. Hiirten molemminpuolisiin reisilihastaskuihin implantoitiin erikseen eri annoksia käsittäviä kapseleita.
Koe 2
Tulokset uudisluumuodostuksesta hiirissä käytettäessä modifioitua osteoinduktiivista BMP-kompleksia
Kohta esimerkissä 2 saadun hirvi-BMP:n uuton jälkeen voitiin radiografisesti ja histologisesti todeta uudisluun muodostusta lihastaskuissa annoksella 2 mg BMP:tä 21 päivän kuluttua implantaatiosta. Osittain puhdistetun hirvi-BMP-annoksen kasvaessa 5-10 mg:sta vastamuodostuneen luun määrä oli osittain lisääntynyt radiografeissa ajankohtana 21 päivää. 15 *»'·' mg: n annoksella BMP:tä ei kuitenkaan tapahtunut enempää ’***· vastamuodostuneen luun lisäystä. Histologisessa analyysissä ilmeni, että vastamuodostunut kudos käsitti pääasiassa ku-*ί'*ί dotusta luusta koostuvaa pikkuluuta, jossa oli luuydin.
s s s = s·*» Toistettaessa biomääritys 15 kuukauden kuluttua puhdistettua BMP:tä käyttäen radiografeissa todettiin vain pieni määrä ektooppista kalsifioitua kudosta ensimmäisiin biomäärityksiin verrattuna, minkä lisäksi 21 päivän kuluttua implantaatiosta kalsifioidun kudoksen määrä ja tiheys olivat selvästi mata-lammat verrattuna vastaavilla annoksilla ajankohtana 10 päivää *:*·: saatuihin. Histologisessa analyysissä todettiin pala rustoa ^ = ajankohtana 10 päivää ja pieni saareke kudottua luuta ajan- § i 4 ’ kohtana 21 päivää implantaatiosta. Tulehdussoluja havaittiin ajankohtana 21 päivää enemmän vastamuodostuneen luun ympärillä kuin ajankohtana 10 päivää.
38
Geelisuodatuksesta saatu saalis koostui kolmesta proteiini-fraktiosta, joiden molekyylipainot poikkesivat toisistaan (kuvio 1). Fraktioiden I, II ja III molekyylipainoiksi määriteltiin vastaavasti 700 - 100, 55 - 25 ja 25 - 15 kD. Hiiren reisilihasbiomäärityksessä BMP-aktiivisuutta osoittaneiden fraktioiden I ja III isoelektriset pisteet olivat alueella 5,3 5,6 pelkistävissä olosuhteissa. Kummankin BMP-aktiivisen fraktion tällä pl-alueella voitiin tunnistaa kolme eri prote-iininauhaa. Hirvi-BMP:n kaksi luun muodostusta indusoivaa fraktiota olivat happamia proteiineja yksivaiheisen fraktioin-nin jälkeen.
Radiografisesti näkyvää ektooppista luumuodostusta indusoivat tässä kokeessa 4,5 mg BMP-fraktiota I ja 5,5 mg fraktiota III. Fraktioiden I ja III samoilla annosmäärillä indusoidut ektoop-pisen luun määrä ja tiheys olivat radiologisesti todettuina ajankohtana 21 päivää suuremmat kuin ajankohtana 10 päivää, mikä oli vastakkaista osittain puhdistettuun BMP:hen nähden 15 kuukauden kuluttua uutosta.
e e » * e
Histologisesti BMP-fraktiot I ja III indusoivat täysin kehitty-. nyttä rustoa 10 päivässä ja ruston alustava muuttuminen kudotuksi luuksi voitiin havaita. Täydellinen pikkuluu normaalein luuydinkudoksin kehittyi 21 päivässä. 21 päivän kuluttua implantaatiosta havaittiin fraktiolla I fraktioon III verrattuna vastamuodostuneen pikkuluun pitemmälle edistynyt muotoutuminen. Fraktioiden I ja III kohdalla ilmeni tuskin ollenkaan ;Y: tulehdussolujen infiltraatiota sen paremmin ajankohtana 10 ;*»‘j kuin 21 päivääkään, mikä oli vastakkaista osittain puhdis- ,*,» tettuun hirvi-BMP:hen tai fraktioon II nähden.
Fraktio II käynnisti radiografisesti näkyvän ektooppisen f*J kalsifioinnin laikun 10 päivässä, mutta tämä oli pienentynyt »j.»j 21 päivän kuluttua implantaatiosta. Näytteiden mikroskooppi- tarkastelussa ilmeni, että kalsifikaatiot koostuivat rakei- 39 sesta kiteisestä aineesta, jolta puuttui luun tai ruston arkkitehtuuri.
Kiteitä ympäröivät suuret määrät tulehdussoluja osoittivat vakavaa tulehdusreaktiota. Jälkeäkään uudisluun muodostuksesta ei havaittu mikroskoopilla 21 päivän kuluttua implantaatiosta. Identtisiin annoksiin osittain puhdistettua BMP-kompleksia 15 kuukauden varastoinnin jälkeen verrattuna fraktiot I ja III indusoivat ektooppisesti kypsempää uudisluuta varhaisemmassa vaiheessa ja tuottivat samalla vähäisemmän tulehdusreaktion.
Osittain puhdistetun BMP:n luun muodostumista indusoiva aktiivisuus vastasi kuitenkin hyvin fraktioiden I ja III ajankohtana 15 kuukautta suoritetusta geelisuodatuksesta aktiivisuutta .
Koe 3
Hirvi-BMP:llä ja tyypin IV kollageenilla impregnoidun luonnollisen koralli- ja trikalsiumfosfaattikeraamin osteoinduk-tiivinen potentiaali hiirissä määritettynä Käyttämällä esimerkissä 2 kuvatulla menetelmällä saadulla , , osittain puhdistetulla hirven luun morfogeneettisella proteii- nilla ja tyypin IV kollageenilla impregnoitua luonnollinen koralli- ja trikalsiumfosfaattikeraameja komposiittien osteo-
S S
induktiivinen potentilaali määritettiin 45Ca-inkorporaationa * BALB-hiirissä. Komposiitti-implantit valmistettiin dialyysin ja päällystyksen käsittävällä yhdistelmämenetelmällä.
: ti 132 BALB-hiirtä jaettiin 12 koeryhmäksi hirvi-BMP:n eri aineosien ja annoksen komposiittissa mukaan (katso taulukko 1) . 4!3Ca-inkorporaatio eri komposiittipreparaateilla oli huomattavasti suurempi kuin pelkästään kollageeni-BMP:llä ja ;\J BMP:llä (p<0,01). 45Ca-inkorporaation korkein huippu esiintyi 4,,; 8 mg mBMP:tä käsittävällä luonnollinen koralli-kollageenilla 10. päivänä. Huippu oli merkittävästi korkeampi kuin 8 mg hirvi-BMP:tä käsittävällä trikalsiumfosfaatti-kollageenilla, 40 kollageeni-BMP:llä ja BMP:llä yksinään.
Taulukko 1
Koehiirten ja lihastaskuun implantoitujen materiaalien ryhmittely __
Ryhmä Implantti sisältö hiiriä
Koe NC/COL/BMP 8 14 NC/COL/BMP 4 14 TCP/COL/BMP 8 14 TCP/COL/BMP 4 12
Verrokki COL/BMP 8 12 COL/BMP 4 10 BMP 8 10 BMP 4 10 NC/COL 8 NC 8 TCP/COL 8 .v. TCP/COL 8 ί i 0 ft sa ä»» , » Yhteensä 12 132 S 3 « a ® β I I .1 .............. I. ................ ........... — M. 1...11. .
*.*.* Ektooppista uudisluumuodostusta tutkittiin radiograf isesti •J * (100 tnA, 20 kV, 0,08 s/eksp.; Mamex de Maq, Soredex, Orion
Corporation Ltd) ja hematoksyliini-eosiinilla ja atsuurilla värjätyillä histologisilla viipaleilla 10 ja 21 päivänä «*»“» kuluttua implantaatiosta.
“ - ’ * * Ero (p<0,01) ilmeni sekä 10. että 20. päivänä myös kompo- * ' siitti-implanttiparien välillä, joissa identtisiin kompo- nentteihin oli lisätty 8 ja 4 mg hirvi-BMP:tä. Komposiitti-:»»»,» kantajat, luonnollinen koralli-kollageeni ja trikalsiumf os- faattikollageeni, lisäsivät BMP:n osteoinduktiivista tehoa. Luonnollinen koralli- kollageeni-BMP-komposiitin luun muodos 41 tumista indusoiva vaikutus on jopa voimakkaampi kuin tri-kalsiumfosfaatti-kollageeni-BMP-komposiitin. Runsaasti huokosia käsittävä rakenne, läsnä oleva geometria sekä erilaiset kemialliset ominaisuudet, jotka keraamisilla aineilla on, yhdistettyinä tyypin IV kollageenin BMP:tä biologisesti moduloivaan vaikutukseen ilmeisesti tehostavat BMP:n paikallista vaikutusta induktiolle alttiisiin soluihin.
Koe 4
Implantaatio- ja analyysimenetelmiä 132 BALB-hiirtä, jotka olivat 28 - 32 päivän ikäisiä, jaettiin 12 koeryhmään. Riippumattomia muuttujia olivat komposiitti-implanttien tai pelkästään kantajien läsnäolo, hirvi-BMP yhdistettynä kollageeniin tai ilman tätä ja luonnollinen koralli tai trikalsiumfosfaatti yksinään. Implantit istutettiin lihastaskuihin kaksipuolisesti hiiren takaraajoihin. Eläinten ja implanttimatriaalien ryhmittely on esitetty taulukossa 2. Havainnointiaika oli 10 ja 20 päivää.
. . 24 tuntia ennen tappamista kullekin hiirelle annettiin vatsa- * *. ontelon sisäisenä ruiskeena laimennettua kantajatonta 45Ca- [ / liuosta, (Amersham, Englanti) määrä 4 mikrocurieta/kg ruumiin- *·'.* painoa. Irti leikatuista implantit käsittävistä takaraajoista * * otettiin röntgenkuva mammografiana (100 mA, 20 kV, 0,06 sek) ;A* ennen näytteenottoa. Implantin ja vastamuodostunutta luuta iJ i käsittävä kudos otettiin näytteeksi en bloc.
42
>04 CO
Q-i (N (M H cm σι r-1 i i t—i co
O \ \ O \ \ VO
:cö cm co σ h o cm <+ H =f0 H * 3 •H CQ :fd S 3 =3 H A £ -H CQ 3
«H O A
fi Tl 3
<D O i—I
ö) 3 tJ g 3 Ö 3 d)
:0 3 -H
3 3 jj Ή A · W CQ > CM CM O CM CM 3 :3
Jj-HiijHiHrHH σ 3 CQ
A Tl ^^^.^COCOCOs+HUDUOHr^HCQ
ra 3 O CM CM O CM W W W W H a-H
O P H H H H H OOCM^OOOOO O £4-1
T) -H CQ
o \ a
il =3 <U
§ iH JJ
3 =3 3 =ns 3
H £ :(TS
ra 3 :<c -h t> oo ro ο- σ aa
Tl h ro h vo <+ 3d) 3 tn..... i-Hjj 3 £ in lti h o o -h \ > +1 +1 +1 +1+1 3 h 3 S a σ h cm ro (Dd) Φ Cu σ·3ΐησοο'+>'+·Η<νο·=+·^ 3 cq Ö Qon--·' -h
H 04 H CO VD ro <+COVOrOOOOO (DJJ
a jj a) a jj cq
O in <+ C·. l> ro ro ro >iA
0 H O =+ H CM sJW =3 >i A ------- fijj
»*»·» Ai OOOOOOO -H
*.*„* d) +1 +1 +1 +1 +1 +1 +! 3 AI
„ vo o σ h m H o 0)3 «···· Cd CM CO σ CO 04 H VO JJ 0) ** -ro ...... > CQ £
ss H LT) rH O H CM 04 *H
: i ; Ö · ro o in o- >3 -H a α3^00ίΩΓ003^ι04'ν4ιΐησΉι -HO) « A 3 - - - ' ^ICOOICOO^OH -H Tl
" ί ‘ -H 0 CM VO Γ0 CM -......· ~ JJ -H
0) A +1 +1 +1 +1 O O O O O O O O -H CD
4J 3 > VO CO ID 04 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 CQ JJ
·.,».* JJ -na o σ =+ ro cnoooLQCflLnm 03 P' Ö i - - - - o σ vo σ co co co vo acu cd in o co h σ vo p V’* rH ># H CM CM H H CD (M 41 04 H CM O O ·· >1
a CQ H
S 3 H 0) 3 . . o)--. a ai
lii 0 AO 0 -H
-H >,3 o 3 £ . ’ : * , Jj =3 3 >Φ <+ 04 VO VD VO CM O O σ :fÖ
* - · (β ΊΖ'-' CM CM 04 CM HrHHHCOHHCO H 3JJ
CÖ 0 A
; ; # 3 Ή ‘H
: : o — a cq =»+ a a tn A =oi
> cm 3 SS 3 A
;‘i O CQ ' co *+ co -+ co + co ^ Tl O A 3 3
’ A Ö -H -HO
A -H A \ \ 0 A
3 i a \ \ p p a a p oi 3
1—I nl 3 P P O O S S PO AH
3 u m OOUOCQPQ O o cq 3 ‘ ' Cd m h o U \ w U \ -03 IH ^ a \ a aaaoappaa aa a * ih s ososusasoossuuuu p
h smsmHmEHmoommppHEH
43
Pala takaraajan lihaksesta ja reisiluusta otettiin 45Ca-in-korporaation verrokiksi samasta eläimestä peräisin oleville eri kudoksille. Kaikki näytteet punnittiin ja niitä pilkottiin seoksella, jossa oli 0,2 ml 70-%:ista perkloorihappoa ja 0,4 ml 33-%:ista peroksidia, 70 °C:ssa 3 tunnin ajan (Mahin et ai., Anal. Biochem. 16 (1966) 500 - 509) . Tämän jälkeen 0,6 ml pilkottua liuosta pipetoitiin diffuusiin tuikepulloon ja lisättiin 5 ml tuikekoktailia (OptiPhase Hi-Safe 3, Wallac, Englanti).
Homogeeniset näytteet laskettiin nestetuikelaskijalla (Wallac 1410, Pharmacia, Suomi) käyttäen sisäistä spektrikirjastoa. 45Ca:n inkorporaatio vastamuodostuneeseen luuhun, lihakseen ja reisiluuhun laskettiin vastaavasti yksiköissä DPM/mg kudosta. Kustakin ryhmästä otettiin näytepari, joka kiinnitettiin 70-%:isella kylmällä etanolilla ja sijoitettiin sitten metyyli-metakrylaattiin (MMA). Leikkaus-jauhatusmenetelmää (Exakt-Apparatebau, Hampuri, Saksa) käyttäen valmistettiin 10 mikro-metrin paksuinen ei-demineralisoitu viipale, joka värjättiin toluidiinisinisellä valomikroskooppista analyysiä silmällä pitäen. Tilastollisessa analyysissä käytettiin GLM-ANOVA- ja Scheffe-testiä ja merkitseväksi eroksi määriteltiin p<0,01.
:V: Koe 5 ·;··* Tulokset »*«% Hirvi-BMP:n karakterisointi ja bioaktiivisuus HPLC-kromatografiällä selvitettiin, että osittain puhdistettu mBMP-preparaatti oli multimeeri, jonka molekyylipaino oli 11 -700 kD. Hallitsevat komponentit käsittivät spektrissä 11 - 40 kD:n matalan molekyylipainon polypeptidifraktioita (kuvio 2) . Hirvi-BMP:n ektooppista luuta indusoiva kyky varmistettiin radiograf isesti ja histologisesti 10 ja 21 päivän kuluttua ,* , implantaatiosta. Uuden luun muodostumista lihastaskuun voitiin ’· ** todeta radiologisesti niinkin pienellä annoksella kuin 2,0 mg * * osittain puhdistettua hirvi-BMP:tä. Annoksen kasvaessa 0,5 - 15 milligrammasta vastamuodostuneen luun määrä selvästikin 44 kasvoi. Histologinen analyysi osoitti, että vastamuodostunut luu koostui pääasiassa normaalista liikakasvurustosta ja kudotusta luusta, joka käsitti ydinkudosta.
Koe 6 45ca-inkorporaatio 45Ca-inkorporaatio komposiitti-implantteja käsittävissä eri koeryhmissä oli selvästi voimakkaampaa kuin kollageeni-BMP:tä, BMP:tä, luonnollinen koralli-kollageenia, trikalsiumfosfaatti-kollageenia, luonnollista korallia ja trikalsiumfosfaattia pelkästään käsittävissä verrokeissa. 45Ca-inkorporaation korkein huippu (28,05+2,83 DPM/mg kudosta) esiintyi päivänä 10 luonnollinen koralli-kollageeni-BMP-komposiitilla, joka käsitti suuren annoksen hirvi-BMP:tä. Huippuarvo oli merkittävästi suurempi kuin arvot, jotka saatiin trikalsium-fosfaatti-kolla-geeni-BMP-komposiitille (19,45+3,05 DPM/mg kudosta), kollageeni-BMP : lie ja BMP:lle (6,09 + 0,43 ja 5,6 + 0,24 DPM/mg kudosta), kun käytettiin vastaavasti korkeaa hirvi-BMP:n annosta ja suoritettiin mittaus 10. päivänä.
*·*·’ Sama suunta havaittiin 20. päivänä ryhmillä, jotka saivat » ’** * suuren annoksen hirvi-BMP: ta, ja sekä 10. että 20. päivänä ·„·„· ryhmillä, jotka saivat pienen annoksen hirvi-BMP: tä. Vastaa- viin ryhmiin 10. päivänä verrattuna komposiitti-implantti-, kollageeni-BMP- ja BMP-ryhmille todettiin merkittävästi matalammat 45ca-inkorporaatiot 20. päivänä. Ristiriitaisuuksia todettiin myös identtiset komponentit käsittävien komposiitti-• » implanttiparien välillä sekä suuren hirvi-BMP- että pienen hirvi-BMP-annoksen ryhmissä samoina havainnointiajankohtina (p<0,01). 45Ca-inkorporaation taso erilaisissa keraamisissa verrokeissa oli enemmän tai vähemmän lähellä lihaksen tasoa.
*:*“ Luonnollisella korallilla kollageenia käyttäen tai ilman ; havaittiin kuitenkin korkeampi 4^Ca-inkorporaatio kuin tri- kalsiumfosfaatilla kollageenia käyttäen tai ilman 10. päivänä verrattuna 20. päivään (kuvio 3).
45 45Ca-inkorporaatiossa lihaksiin tai reisiluihin ei ollut merkittävää eroa 10. ja 20. päivän välillä hiirillä, joihin oli implantoitu hirvi-BMP:tä tai ei ollut implantoitu hirvi-BMP:tä. Hirvi-BMP:n implantaatiolla paikalliseen lihastaskuun ei ilmeisestikään ollut vaikutusta systeemiseen kalsiumaineen-vaihduntaan.
Koe 7
Radiologinen ja histologinen arvio
Yhteensopivasti 45Ca-hivenjäämätulosten kanssa näkyvää ek-tooppista osteoinduktiota voitiin radiologisesti osoittaa komposiitti-implantti-, kollageeni-BMP- ja BMP-ryhmissä, mutta ei kaikissa keraamisissa verrokeissa, joissa käytettiin tai ei käytetty kollageenia, 10. ja 20. päivänä implantaatiosta. Vastamuodostunut luu ympäröi ja rajasi keraamiset kiekot, jotka antoivat terävän kontrastin lihasvarjoon nähden röntgen-filmeillä. 20 päivän kuluttua implantaatiosta vastamuodostu-neen luun määrä ja tiheys olivat selvästi alhaisempia vastaaviin ryhmiin verrattuna ajankohtana 10 päivää. Osteoinduktio-, „ nopeudet eri ryhmissä ja eri ajankohtina esitetään taulukossa *· *' 2. Histologisessa analyysissä ilmeni, että vastamuodostunut luu koostui pääasiassa normaalia kudottua luuta käsittävistä laikuista ja rustoa oli komposiitti-implanttien keraamisten kiekkojen ympärillä sekä kerääntyneenä niiden huokosiin. 10 • päivässä muodostui enemmän uutta luuta ja rustoa kuin 20 päivässä. Osa kudostusta luusta ja rustosta oli fragmentoi-tunut ja runsaasti tumallisia punasoluja (karyosyytteja) oli saapunut paikalle sektioihin 20 päivänä kuluttua implantaa-
5 S S
tiosta. BMP:tä sisältämättömissä verrokeissa ei havaittu luun . muodostusta, mutta havaittiin sidekudoksen lisääntymistä ilman *>..* selvää karyosyytti - inf iltraat iota .
46
Koe 8
Luun muodostumisen induktio ja paraneminen lampaissa Sääriluun luunvarren segmentiaalisia vaurioita 18 lampaassa käytettiin arvioitaessa luonnollisesti esiintyvällä lammas-BMP:llä ja tyypin IV kollageenilla impregnoidun trikalsium-fosfaattisylinterin käsittävän komposiitti-luukorvikkeen luun muodostumisen induktiota ja paranemista tuottavaa tehoa. Komposiittiluukorvikkeisiin panostettiin vastaavasti pieni annos 13 mg ja suuri annos 100 mg lammas-BMP: tä. Pelkästään tyypin IV kollageenilla impregnoituja trikalsiumfosfaatti-sylintereitä ja trikalsium- fosfaattisylintereitä käytettiin verrokkina. Yhteensopivasti lammas-BMP:n annosriippuvaiseen luuinduktioon nähden vastamuodostuneen ulkoisen uudisluun merkittävästi suurempi alue ja paremmin integroitu intensiteetti suuren annoksen komposiittiluukorvikkeen ja pienen annoksen komposiittiluukorvikeen tai trikalsiumfosfaatti-sylinterien välillä kvantitoitiin tietokoneavusteista kuva-analysaattoria käyttäen ajankohtina sekä 3 että 6 viikkoa. Vääntötesti osoitti, että leikatun, implantoidun ja sitten , , parantuneen sääriluun maksimaalinen vääntövastus, maksimaali- ’·’·* nen deformaatiokulma, energian absorptio ja luun jäykkyys olivat 49 - 80 % trikalsiumfosfaattisylintereillä, 72 - 109 % *.* = * pienen annoksen komposiittiluukorvikkeella ja 117 - 175 % suuren annoksen komposiittiluukorvikkeella verrattuna vastaa-:‘ * vaan vastapuolen sääriluuhun ajankohtana 16 viikkoa. Suuren :T: annoksen komposiittiluukorvikkeen kohdalla luun jäykkyys oli selvästi parempi kuin pienen annoksen komposiittiluukorvik-/,% keella. Tässä tutkimuksessa määritelty komposiittiluukorvike, jolla on korkea osteoinduktiviteetti, osteokonduktiviteetti ja mekaaninen lujuus, on muita sopivampi kliiniseen käyttöön.
s ’* Koe 9 ; Kirurgisia toimenpiteitä Sääriluun segmentiaalisen vaurion mallia käytettiin luun paranemisen tutkimiseksi 18 täysikasvuisessa lampaassa, joista 14 oli naarapuolisia ja 4 urospuolisia ja joiden keskimää räinen ruumiinpaino oli 44,11±6,35 kg. Lampaita pidettiin lammasaitauksissa 4-7 päivänä ajan ennen leikkausta.
47
Nukutus suoritettiin Propolol-valmisteella (2 mg/kg) ja sitä ylläpidettiin 2 - 2,5 %:lla Halothane-valmistetta hapessa puolisuljetussa tuuletussysteemissä inkuboinnin jälkeen. Oikeanpuolimainen sääriluu paljastettiin steriileissä olosuhteissa keskiviiltoa käyttäen. Levyn proksimaaliset ja distaaliset ruuvireiät porattiin etukäteen ja tilkittiin ennen keskiosan poistoa. Gigli-sahalla tehtiin segmentiaaliset unilateraaliset 16 mm pituisiksi standardoidut leikkausvauriot luukalvon alaisesti. Kun leikkausalue oli perusteellisesti huuhdeltu, vauriokohdat korvattiin vastaavasti kuudella pienen annoksen komposiittiluukorvikeimplantilla ja kuudella tri-kalsiumfosfaattisylinteri-implantilla. Implantti kiinnitettiin tukevasti vauriokohtaan päissä sijaitsevilla ydin-kanavaan työnnetyillä tulpilla. Leikattu sääriluu immobili-soitiin kahdella limittyvällä muotoillulla, 4 mm paksulla autokompressiolevyllä, joissa oli 8 ja vastaavasti 6 reikää », sekä kortikaaliruuvit sääriluun keskiosan puolella. Lihakset % % ja iho suljettiin kerroksittain. Kullekin lampaalle annettiin infektiosuojaksi yksi annos bentsyylipenisilliiniä (66 000
«SS
V.* I.U.) laskimonsisäisesti tuntia ennen leikkausta sekä pro- kaiini-penisilliiniä (36 000 I.U.) lihaksensisäisesti annos : päivässä 4 perättäisenä leikkauksen jälkeisenä päivänä.
:T; Eläinten annettiin kävellä vapaasti heti leikkauksen jälkeen.
Koe 10 ,,, Kuvakvantiointi g, s s s %,,* Leikatusta sääriluusta otettiin sarja kraniokaudaalisia # i;“* (kallosta häntään päin) ja lateromediaalisia (sivuttain ; keskeltä) röntgenkuvia 3, 6, 12 ja 16 viikon kuluttua leikkauk- sesta. Kaikki 3-12 viikon välillä otetut radiogrammit pyyhkäistiin tietokoneavusteisella optisella tiheyspyyhkäi-sijällä Bio Image System (6 XRS, Millipore Corporation, USA), 48 joka oli liitetty Sunspark Station EIPX -asemaan, ja analysoitiin 2D-systeemiohjelmistolla kvantitaatiivisten muutosten seuraamiseksi pinta-alassa ja integroidussa intensiteetissä, joka saatiin kunkin näytteen kraniokaudaalisista ja latero-mediaalisista kuvista, jolloin standardointi oli 1/4 uudisluun vastaavasti kokonaispinta-alasta ja integroidusta intensiteetistä. Yksiköksi määriteltiin mm2 pinta-alan osalta ja optinen tiheys integroidun intensiteetin osalta. Pehmytkudoksen ja levyjen poistamisen jälkeen lampaan sääriluulle suoritettiin tietokoneavusteinen tomografinen analyysi (CT) peräkkäisistä aksiaalisista sektioista 3 mm välein uudisluun keskimääräisen poikkipinta-alan ja tiheyden kvantitoimiseksi. Tiheys ilmaistiin Hunsfield-yksiköissä (10).
Koe 11
Mekaaninen testaus
Kaikki kummankin puolen sääriluut pidettiin kosteina fysiologisessa suolaliuoksessa, ne pakattiin erikseen ja tiiviisti muovipusseihin ja jäädytettiin -20 °C:ssa odottamaan mekaa-„ , nista testiä.
’ ‘ Mekaaninen testaus suoritettiin käyttäen modifioitua vääntö- *»’,* testikonetta (Lepola et ai. . elin. Orthop. 297 (1993) 55 - 61) . Strömbergin et ai. (Acta Orthop. Scand. 47 (1976) 257 -: I ί 263) tutkimuksen mukaan esiasetuksena käytettiin vakiollista kulmanopeutta 6,5 °/s. Kone sisältää elektronisen virtapiirin jännityksenmittauseksitaatioon ja vääntömomentin mittaukseen. ,%% Koneen ei-pyörivä pää oli varustettu jännityksen mittaukseen perustuvalla vääntömomenttisensorilla. Koneen maksimaalinen kuormakapasiteetti oli 250 Nm. Koneen kokonaisvirhe oli alle 1 %. Vääntökuormakuvaajat rekisteröitiin piirturin avulla.
, % i Sääriluut sulatettiin huoneenlämpötilassa 4 tunnissa, minkä J jälkeen niiden päät siistittiin ja ne pakattiin epäsymmetri- ä s siin ympyränmuotoisiin alumiinimuotteihin polyesterihartsia käyttäen. Muotin orientaatiota ja luun pysymistä keskellä ylläpidettiin vartavasten suunnitellulla muottituella.
49 Vääntövarreksi määriteltiin 135 mm. Näytteet olivat kyllästetyt suolaliuoksella preparoinnin ja testauksen aikana. Vääntökoe suoritettiin lisäämällä kuormaa kulmanopeudella 6,5 °/s kunnes sääriluun murtumapiste saavutettiin. Vastapuolen sääriluuta, johon oli tehty vastaavat reiät, käytettiin leikatun luun parittaisena verrokkina.
Laskettiin prosenteissa vastapuolen sääriluuhun verraten leikatun luun maksimaalinen vääntövastus (MTC), maksimaalinen deformaatiokulma (MA), energian absorptio (AE) sekä luun jäykkyys (BS).
Ei-leikatuilla lampaan sääriluilla suoritetun pilottikokeen mukaan menetelmän standardivirheet olivat seuraavat: MTC 4,7 %; MA 8,4 %; BS 8,6 %; ja AE 13,1 %. Murtumaviiva-kohdat rekisteröitiin ja niitä verrattiin sääriluissa, joihin e e oli implantoitu komposiittiluukorvikkeita ja toisaalta tri-*:**: kalsiumfosf aattisylintereitä.
»j* = » Koe 12
Histologia a s a S 0 a
Mekaanisen testin jälkeen implantoidut materiaalit käsittävät , , näyteblokki sahattiin poikittain timanttinauhasahaa käyttäen (Accutome 5, Struers Tech A/S, Kööpenhamina, Tanska) 0,4 - 2,0 * mm paksuiksi viipaleiksi, jotka kiinnitettiin välittömästi ? Ί 10-%:isella neutraalilla formaliiniliuoksella ja upotettiin - f metyylimetakrylaattiin. Leikkaus-jauhamismenetelmää käytettäen / , valmistettiin ei-demineralisoitu 12 - 20 mikrometriä paksu * i 5 % j histologinen viipale, joka värjättiin Van Gieson -värillä valomikroskooppista analyysiä varten.
50
Koe 13
Tilastollinen analyysi ja tulokset
Kaikkien kvantitatiivisten tulostietojen tilastolliseen analyysiin käytettiin GLM-ANOVA-varianssianalyysiohjelmaa ja Duncanin monivertailutestiä. Merkitseväksi katsottiin tulokset, joille p<0,05.
Koe-ajanjakson aikana yksi lammas trikalsiumfosfaatti-kol-lageeniryhmästä suljettiin pois kokeesta 5 viikon jälkeen, koska leikatun luun distaalisessa tyngässä oli halkeamis-murtuma ja immobilisaatio oli menetetty. Yksi pienen annoksen lammas-BMP:tä saanut lammas jouduttiin uhraamaan levyjen paljastuttua ja leikatun kohdan infektoiduttua 8 viikon kuluttua leikkauksesta. 16 lammasta oli jäljellä tutkimuksen päättyessä 16 viikon jälkeen.
Koe 14
Kuva-analyys i ; Y: Näkyvää uudisluun muodostumista implanttien ympärille osoi- tettiin radiograf isesti kaikissa ryhmissä 3 viikon kuluttua leikkauksesta. Kasvaneen uudisluun määrä oli maksimissaan 6 viikon kohdalla, minkä jälkeen se laski välillä 12 - 16 viikkoa. Uudisluun radiografinen tiheys kasvoi asteittain Y välillä 3-16 viikkoa. Uutta luuta muodostui leikkauskohtien ¢- s 9 * ympärille lukuun ottamatta levyn alla olevaa puolta. Vasta- muodostunut yhdistävä uudisluu oli paikallisesti komposiitti-luukorvikkeen ympärillä näissä ryhmissä paremminkin kuin V * jakaantuneena pitkittäin luukalvon alle kuten trikalsium- f osf aattisylinteriryhmissä.
. Tietokoneavusteinen kuva-analyysi osoitti, että yhdistävän uudisluun pinta-ala ja integroitu intensiteetti olivat paljon *’”* korkeammat komposiittiluukorvikeryhmässä, joka oli saanut suuren, 100 mg annoksen lammas-BMP:tä, kuin komposiittiluukorvikeryhmässä, jolle oli annettu 13 mg lammas-BMP: tä, tai 51 trikalsiumfosfaattisylinteriryhmässä ajankohtana 3-12 viikkoa implantaatiosta. Huomattavia eroja uudisluun sekä pinta-alassa että integroidussa intensiteetissä havaittiin näiden kolmen ryhmän sekä eri viikkojen välillä.
Kokeen päättyessä havaittiin hyvä yhdistyminen, osteointe-graatio, vastamuodostuneen uudisluun ja implanttien välillä tietokoneavusteisen tomografia- (CT) pyyhkäisyn poikkileikkauksissa. Implanttien ja yhdistävän uudisluun välillä ei ollut selvää rajaviivaa. Tietokoneavusteisen kuva-analyysin kanssa yhteensopivasti ristiriita uudisluun keskitiheydessä CT-pyyh-käisyn peräkkäisissä aksiaalisissa sektioissa oli merkitsevä eri ryhmien välillä 16 viikon kohdalla. Kuitenkaan samanaikaista merkitsevää eroa uudisluun pinta-alassa ei todettu eri ryhmien välillä (taulukko 3) .
Trikalsiumfosfaattisylinterien biohajoamista havainnoitiin radiografisesti ja tomografisesti CT-pyyhkäisyillä. Trikalsiumfosf aattisylinterin resorptiota tapahtui sylinterin kehällä sekä sen keskellä olevan reiän sisäseinää pitkin ajankohdasta : V: 6 viikkoa implantaatiosta eteenpäin. Jotkut trikalsiumfos- f aattisylintereistä f ragmentoituivat ja jotkut säilyivät ehjinä kokeen loppuun. Komposiittiluukorvikeryhmässä vaikutti tapahtuvan enemmän trikalsiumfosf aattisylinterin hajoamista kuin trikalsiumfosfaatti-kollageeniryhmässä.
s s s *** 1 Taulukko 3
Uudisluun keskimääräinen poikkipinta-ala ja tiheys CT-pyyh-ΐ'ΐ'ΐ käisyfilmillä 16 viikon kuluttua implantaatiosta V · Pinta-ala (cm2) Tiheys (HU) TCPC 1,94+0,91 1258,36+201,43 ·:·: CBSL 3,51±1,48 1036,84±149,85 . CBSH 2,93±0,8 0 1401,32 + 75,95 ’ 1 p-arvo,< 0,21 0,011
Merkitsevä ero (GLM-ANOVA-analyysi) 52
Koe 15
Mekaaninen testi Vääntökokeen tulokset on koottu taulukkoon 4.
Leikatun ja implantoidun sääriluun maksimaalinen vääntövastus, murtumisen maksimaalinen deformaatiokulma, energian absorptio ja luun jäykkyys olivat 49 - 80 % trikalsium- fosfaatti- kollageeniryhmällä, 72 - 109 % pienen annoksen komposiitti- luukorvikeryhmällä ja 117 - 175 % suuren annoksen komposiitti-luukorvikeryhmällä verrattuna vastaavaan vastapuolen sääriluuhun ajankohtana 16 viikkoa. Trikalsiumfosfaatti-kollageeni-verrokkiin verrattuna mekaaniset parametrit olivat korkeammat pienen annoksen komposiittiluukorvike- ja suuren annoksen komposiitti- luukorvikeryhmillä.
Suuren annoksen komposiittiluukorvikeryhmässä parantuneen sääriluun kaikki parametrit olivat jopa korkeammat kuin vastapuolen sääriluun, jossa oli vastaavat reiät. Luun jäyk- ·,*.· kyyden keskimääräiset prosentuaaliset arvot poikkesivat suuren « annoksen komposiittiluukorvikeryhmällä merkittävästi tri-: : : kalsiumfosfaatti-kollageeniryhmästä tai pienen annoksen ·;·*: komposiittiluukorvikeryhmästä, mutta eivät poikenneet mer- jY'» kittävästi näistä ryhmistä, kun vertailu suoritettiin käyttäen GLM-ANOVA- ja Duncanin monivertailutestiä.
. 53 d
JJ
H
o jj d (0
rH
S
H
d
O
d
-H
>d C"~
-H — CM Cn O O rH
O 1¾ com H UI H > σ-ι
TO s [> m - LP H - - - H
pq co - vo ro cn i> ro co o in h m * -o co - -ro ooctih co h ro 0) tn m h +i cm m +i +i +i +i - - +i H B +i +i m +i +i cm cn o in o o cn h vo co i> r- co en m i> vo +1+1^ H Ho cn m - ho- - - - oh - O m o ^ - - o co co o c- cm in
-H CQHOHOm ^ Π H h cn i> --CM
M O ^ CO CM H H H i—I CMi—I H CM CM ϊ—1 d ns > 3 *
0 CO O ro H
rH rH rH ΓΟ O
H
U O O O O O O
:rä —. o cn v o v oov hv :fld CLj CO U) rl H s—I - *· H [“"*
M X Cn » O OOVD0 H LT) - 0 CO CM - O
pq -coco> - - «-f > r- co > m^cMi>
<D VO H H f-1 O m +1 d +1+1 H M - - CM M
h ns tn +i +i +i rö +i +i cm ns -ψ ^ +i ns o o +i m HO £ ro ro ro i ^ own i ococoi +1+1 Hi •H ,¾ m comma rooo-a - -cm ft cm m h a ra ω ro- - - - - - <n m h - cm·^1- -H-H cq h m ^ ro cm ö hcooc co m vo d - - h d
H -H 0^- CM CO O (U H H H Cl) H CM CO 0) CM CM cn <D
id > d d ö ö
* * ® O OS ·Η -H -H -H
e a * a 0 Ή VO i—I i—I i—I i—I
» -uh =m =m =m =m Ö > > > > 0) nj cm co . ♦ £ d CO fi VO d CM H CM d VOd » ; l ö) nS σ\ ·· o o ro ·· - - o ·· cm ·· ·* Q)4J r~H-UroH-OHCM-UcnH-U —
,,,,ϊ ra ,d m cm co Pj - - σν Λ ro co i> Pj h ro cn Pj -H
8 ^ O - -HU COCMHU +1+1 CM O --HO CO
d M H O +1 E-I +1 +1 +1 En CM VO +1 E-I O O +IEh >1 , *, ’, nS d +i +i cm m cn cm m cm cn +1 +i o >, nSnS O oo cn cm -h co i> cm -h --cm-h hcovo-h h , „. a -ro Pj — - - - m - - - m coo-tö oH-ns ns • · * £ nj Um h cm ro -U cmoojj ro <n jj - -o o d *.'* nS E-ι — CMrovo hhi> h cm h cmcmco ns h - d d d d i ns ·· ·· ·· ·· < -di-) H H H dl > * · -h ·· cn cn cn cn o >:» diu mm mm mm m m s *· o co - ou - jju - dU - dU <1
0) ffl -H — CO ·Η .—-CO -H — CO -H -—-CO I
’ ,,·** g u +j -H -h m jj -h -h m jj -h -h m o -h -h m s (d ΟϋΛτΊ jJMM-n Odd-n p ... m m d Λί o a M o dM o ΰ M o o il ns -ro m o k d modd m o d d m o m d — ä 1—i d d · i—i d d · · i—i d d · i—i d d · · : -H:ns a d ai m a d <u m <u κ a d <u m o o - ·; iirns £ cu > cn £ <u > cn £a)>cn £ cu > cn d ra ·· -h > m -h > m -h > m -h > m cu • . ai m - — o\° o - o\» o — — Λ» o —- o\» o +) cn =m % 3 m > , 4-1 u 0)
” Φ — — CO
'ora- <u <u -n
,¾ -H :rtS JJ -U -H
riid-U-U — CO CO 34 d m ·· i -h cu m m d h ns u m d — 4-> · \ as 2 34 ft d ϋ U £ co £ £ s
aso)u m cu ES ^m ms cn S
E-I S EH Pj £ s— s— < — m— * 54
Kaikki näytteet murtuivat spiraalisessa murtumakuviossa, mikä sopi käytettyyn vääntövoimakuormaan. Murtumaviiva implantti-luukosketuspinnan läpi esiintyi kahdessa viidestä trikalsium-fosfaattisylinteristä, kahdessa viidestä pienen annoksen komposittiluukorvikkeesta ja yhdessä kuudesta suuren annoksen komposiittiluukorvikkeesta.
Koe 16 Histologia
Uuden luun muodostumista voitiin havaita BMP:tä käsittävillä tai ei käsittävillä trikalsiumfosfaattisylintereillä sisä-huokosten yhdistämissä väylissä sekä kehällä. Hyvin muodostunut sälöinen luu oli morfologisesta normaali, eikä tulehdussoluja suotunut implanttien ympärille sen paremmin kom-posiittiluukorvike- kuin trikalsiumfosfaattikollageeniryhmässä-kään ajankohtana 16 viikkoa. Pitemmälle muotoutunutta uutta luuta havaittiin komposiittiluukorvikeryhmillä, jotka olivat saaneet pienen tai suuren annoksen lammas-BMP:tä. Normaalit luuydinsolut vaikuttivat kansoittaneen trikalsiumfosfaatti-; : : sylinterien keskireikien viereiset uudisluu-alueet. Side- »;*· kudosta ei esiintynyt vastamuodostuneen luun ja trikalsium- fosfaattisylinterin rajapinnassa. Komposiittiluukorvikeryh- mässä havaittiin enemmän trikalsiumfosfaattisylinterin ab-= . sorptiota ja liukenemista endoperiosteaalisen uudisluun ja hl ydinkanavan lähellä kuin trikalsiumfosfaatti-kollageeniryh- * mässä.
*,*,* Päätelmänä todetaan, että kolme komponenttia käsittävän ·,* * komposiittiluukorvikeen etuja olivat osteoinduktio, osteo- ,*·*, konduktio sekä mekaaninen lujuus. Nykyään edistyminen bio- materiaaleja koskevassa tutkimuksessa on suonut paremmat • mahdollisuudet sopivan biomateriaalin esiin seulomiseksi *; komposiittiluukorvikkeen rungoksi. Luonnollisesti esiintyvän t *i BMP:n rajalliset lähteet ja epäpuhtaus voitaisiin ongelmana ohittaa valmistamalla yhdistelmä-DNA-BMP:tä. Rekonstituutio-tekniikoiden kehittymisen myötä käyttöön tullaan saamaan 55 toivomuksia vastaava komposiittiluukorvike korvaamaan auto-geeniset tai allogeeniset siirteet ihmisellä. Tässä kokeellisessa tutkimuksessa oli keskeisesti oleellista valaista synteettisen bioaktiivisen luunkorvikkeen kehittämisen lääketieteen käyttöön tarpeellisuutta ja etuja.
Koe 17
Luun indusointi ja paraneminen ihmisessä
Kliininen koe aloitetaan (on aloitettu) maaliskuussa 1996. Mainitussa kliinisessä kokeessa biokoralli-nauta-BMP:stä ja trikalsiumfosfaatti-nauta-BMP:stä koostuvaa komposiittimateriaalia tullaan käyttämään potilaiden hoidossa, joilla on vaikeasti parannettaviksi osoittautuneita luunmurtumia. Komposiittimateriaalit valmistetaan edellä kuvatun mukaisesti ja testit on määrä suorittaa oleellisesti samoin kuin edellä on kuvattu.
t s s a ess
Claims (10)
1. Osteogeeninen väline, joka käsittää luun morfogeneettisen proteiinin BMP, koilageenikomponentin, muotoiltavan huokoisen kantajarungon ja mahdollisia kasvutekijöitä, tunnettu siitä, että BMP on modifioitu BMP-kompleksi, joka käsittää osittain puhdistetun BMP:n, jolta puuttuu proteiinifraktio, jolla on immunogeenisiä ja tulehduksellisia ominaisuuksia ja jonka molekyylipaino on keskimääräinen (25-55 kD) geelisuodatuksella määritettynä, jolloin mainittu modifioitu BMP-kompleksi koostuu oleellisesti proteiinifraktiosta, jonka molekyylipaino on korkea (100 - 700 kD) geelisuodatuksella määritettynä ja jolla on osteoinduktiivista BMP-aktiivisuutta, ja/tai proteiinifraktiosta, jonka molekyylipaino on alhainen (15 - 20 kD) geelisuodatuksella määritettynä ja jolla on osteoinduktiivista BMP-aktiivisuutta.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen väline, tunnettu siitä, että modifioitu BMP-kompleksi koostuu oleellisesti proteiinifraktiosta, jonka molekyylipaino on alhainen (15 - 25 kD) geelisuodatuksella määritettynä ja jolla on osteoinduktiivista BMP-aktiivisuutta ja paremmat säilytysominaisuudet.
* · * 3. patenttivaatimuksen 1 väline, tunnettu siitä, että .·»*, modifioitu BMP-kompleksi koostuu oleellisesti S S s ,··% proteiinifraktiosta, jolla on osteoinduktiivista BMP- aktiivisuutta ja jonka molekyylipaino on 100 - 700 kD geelisuodatuksella määritettynä.
*,,,· 4. patenttivaatimuksen 1 mukainen väline, tunnettu siitä, että kollageeni valitaan ryhmästä, jonka muodostavat kollageeniseokset, atelopeptidikollageenit, tyypin IV kollageeni ja tyypin I kollageeni.
5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen väline, tunne ttu siitä, että kollageenikomponentti on tyypin IV kollageeni.
6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen väline, tunne ttu siitä, että muotoiltava, huokoinen kantajarunko valitaan ryhmästä, jonka muodostavat hydroksiapatiitti, trikalsiumfos-faatti, bioaktiivinen lasi ja korallirungosta saatu biokoral-li.
7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen väline, tunnettu siitä, että muotoiltava, huokoinen kantajarunko on koralli-rungosta valittu biokoralli.
8. Menetelmä modifioidun BMP-kompleksin valmistamiseksi patenttivaatimuksen 1 mukaista osteogeenistä välinettä varten, tunnettu siitä, että modifioitu BMP-kompleksi voidaan saada menetelmällä, joka käsittää seuraavat vaiheet: (a) demineralisoitu luumateriaali jauhetaan hienoksi; « » (b) vaiheesta (a) saatua luumateriaalia uutetaan guanidinium- * *. hydrokloridilla (GuHCl); * * (c) suoritetaan suodatus käyttäen tangentiaalisen virtauksen , . järjestelmää; * * ® 5 * (d) suoritetaan geelisuodatus, jolla voidaan saada osittain . . puhdistettu BMP-kompleksi, jolla ilmenee kolme piikkiä ja joka *,* käsittää kolme proteiinifraktiota, joilla on eri Γ molekyylipainot, fraktion I ollessa korkean molekyylipainon * *' (100-700 kD) proteiini, jolla on osteoinduktiivista BMP- *”*’ aktiivisuutta, fraktion II ollessa keskitasoisen O molekyylipainon (25-55 kD) immunogeeninen proteiini, jolta :/’** puuttuu BMP-akti ivisuus, ja fraktion lii ollessa alhaisen molekyylipainon (15-25 kD) proteiini, jolla on osteoinduktiivista BMP-aktiivisuutta; ja (e) poistetaan osittain puhdistetusta BMP:stä proteiinifraktio, jolla on immunogeenisiä ja tulehduksellisia ominaisuuksia ja jonka molekyylipaino on 25-55 kDa geelisuodatuksella määritettynä.
9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että puhdistusta varten suoritetaan vähintään yksi suuren erotuskyvyn kromatografiän (HPLC) geelisuodatus.
10. Modifioidun BMP-kompleksin käyttö, jossa mainittu BMP- kompleksi käsittää proteiinifraktion, jolla on osteoinduktiivista BMP-aktiivisuutta ja jonka molekyylipaino on 100-700 kD geelisuodatuksella määritettynä, ja/tai proteiinifraktion, jolla on osteoinduktiivista BMP-aktiivisuutta ja jonka moleyyiipaino on 15-25 kD geelisuodatuksella määritettynä, sellaisen osteogeenisen välineen valmistamiseksi, jolla on parantuneet osteoinduktiiviset ominaisuudet, mainitun parannuksen ollessa immunogeenisten ja tulehduksellisten ominaisuuksien puuttuminen ja parantuneet säilytysominaisuudet. * e · ® e e » e a » β * s *
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI981818A FI120253B (fi) | 1996-02-29 | 1998-08-25 | Osteogeeninen väline ja menetelmä sen valmistamiseksi |
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/FI1996/000118 WO1997031661A1 (en) | 1996-02-29 | 1996-02-29 | An osteogenic device and a method for preparing the device |
| FI9600118 | 1996-02-29 | ||
| FI981818A FI120253B (fi) | 1996-02-29 | 1998-08-25 | Osteogeeninen väline ja menetelmä sen valmistamiseksi |
| FI981818 | 1998-08-25 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI981818A0 FI981818A0 (fi) | 1998-08-25 |
| FI981818L FI981818L (fi) | 1998-10-12 |
| FI120253B true FI120253B (fi) | 2009-08-31 |
Family
ID=8556642
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI981818A FI120253B (fi) | 1996-02-29 | 1998-08-25 | Osteogeeninen väline ja menetelmä sen valmistamiseksi |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7186811B2 (fi) |
| EP (1) | EP0883410B1 (fi) |
| AT (1) | ATE273723T1 (fi) |
| AU (1) | AU4721696A (fi) |
| DE (1) | DE69633197T2 (fi) |
| ES (1) | ES2225870T3 (fi) |
| FI (1) | FI120253B (fi) |
| WO (1) | WO1997031661A1 (fi) |
Families Citing this family (43)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU731916B2 (en) * | 1997-07-07 | 2001-04-05 | Australian Institute Of Marine Science | Shaped products or structures for medical or related purposes |
| EP0994735A4 (en) * | 1997-07-07 | 2004-05-26 | Australian Inst Marine Science | MOLDED BODIES OR STRUCTURES FOR MEDICAL OR MEDICAL RELATED PURPOSES |
| CN1068198C (zh) * | 1998-12-21 | 2001-07-11 | 冶金工业部钢铁研究总院 | 骨形态发生蛋白与胶原颗粒复合剂型的制造方法 |
| WO2000045871A1 (en) | 1999-02-04 | 2000-08-10 | Sdgi Holdings, Inc. | Highly-mineralized osteogenic sponge compositions, and uses thereof |
| US7687462B2 (en) | 1999-10-05 | 2010-03-30 | The Regents Of The University Of California | Composition for promoting cartilage formation or repair comprising a nell gene product and method of treating cartilage-related conditions using such composition |
| DE19962248A1 (de) | 1999-12-22 | 2001-06-28 | Tutogen Medical Gmbh | Verfahren zur Herstellung eines mit Knochenwachstumsfaktoren angereicherten Knochenmaterials |
| US6949251B2 (en) | 2001-03-02 | 2005-09-27 | Stryker Corporation | Porous β-tricalcium phosphate granules for regeneration of bone tissue |
| FI117963B (fi) | 2001-04-26 | 2007-05-15 | Eija Marjut Pirhonen | Luuta korvaavat materiaalit |
| DK1448246T4 (en) * | 2001-11-19 | 2015-12-21 | Scil Technology Gmbh | Homogeneously coated device with osteoinductive and osteoconductive properties |
| CN1302822C (zh) * | 2002-11-28 | 2007-03-07 | 上海瑞邦生物材料有限公司 | 自固化磷酸钙原位成骨活性骨水泥及其制备方法和应用 |
| US6974862B2 (en) | 2003-06-20 | 2005-12-13 | Kensey Nash Corporation | High density fibrous polymers suitable for implant |
| US8415302B2 (en) | 2004-01-28 | 2013-04-09 | The Regents Of The University Of California | Surgical applications for BMP binding protein |
| US8193312B2 (en) | 2004-01-28 | 2012-06-05 | The Regents Of The University Of California | Bone morphogenic protein binding peptide |
| US8188219B2 (en) | 2004-01-28 | 2012-05-29 | The Regents Of The University Of California | Bone morphogenic protein binding peptide |
| US7189409B2 (en) * | 2004-03-09 | 2007-03-13 | Inion Ltd. | Bone grafting material, method and implant |
| EP1604694A1 (en) * | 2004-06-09 | 2005-12-14 | Scil Technology GmbH | Composite device having osteoinductive and osteoconductive properties |
| US7722895B1 (en) | 2004-09-20 | 2010-05-25 | Warsaw Orthopedic, Inc. | Osteogenic implants with combined implant materials, and materials and methods for same |
| JP2008540328A (ja) * | 2004-11-29 | 2008-11-20 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | 脱灰骨基質（ｄｅｍｉｎｅｒａｌｉｚｅｄｂｏｎｅｍａｔｒｉｘ）の活性化抽出 |
| US8506646B2 (en) | 2005-04-29 | 2013-08-13 | Warsaw Orthopedic, Inc. | Multi-purpose medical implant devices |
| US7531190B2 (en) * | 2005-05-25 | 2009-05-12 | Biomet Manufacturing Corp. | Porous ceramic structure containing biologics |
| US7833270B2 (en) * | 2006-05-05 | 2010-11-16 | Warsaw Orthopedic, Inc | Implant depots to deliver growth factors to treat osteoporotic bone |
| JP2009544411A (ja) | 2006-07-26 | 2009-12-17 | ザ・リージェンツ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・カリフォルニア | 骨形成増進組成物 |
| US20080233203A1 (en) | 2007-03-21 | 2008-09-25 | Jennifer Woodell-May | Porous orthapedic materials coated with demineralized bone matrix |
| AU2008255016B2 (en) * | 2007-05-15 | 2013-05-09 | Stryker Corporation | Concentrated protein preparations of bone morphogenetic proteins and methods of use thereof |
| US8133553B2 (en) * | 2007-06-18 | 2012-03-13 | Zimmer, Inc. | Process for forming a ceramic layer |
| US8309521B2 (en) | 2007-06-19 | 2012-11-13 | Zimmer, Inc. | Spacer with a coating thereon for use with an implant device |
| US8608049B2 (en) * | 2007-10-10 | 2013-12-17 | Zimmer, Inc. | Method for bonding a tantalum structure to a cobalt-alloy substrate |
| US20090187256A1 (en) * | 2008-01-21 | 2009-07-23 | Zimmer, Inc. | Method for forming an integral porous region in a cast implant |
| US20090198286A1 (en) * | 2008-02-05 | 2009-08-06 | Zimmer, Inc. | Bone fracture fixation system |
| KR20120018202A (ko) | 2009-05-26 | 2012-02-29 | 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 | 파이브로모듈린 펩타이드 |
| MX371080B (es) | 2009-06-23 | 2020-01-15 | Univ California | Aumento de retención de bmp. |
| US8994666B2 (en) * | 2009-12-23 | 2015-03-31 | Colin J. Karpfinger | Tactile touch-sensing interface system |
| AU2011250934B2 (en) | 2010-05-11 | 2016-02-25 | Howmedica Osteonics Corp., | Organophosphorous, multivalent metal compounds, & polymer adhesive interpenetrating network compositions & methods |
| ES2552668T3 (es) | 2010-06-28 | 2015-12-01 | Bbs - Bioactive Bone Substitutes Oy | Una preparación de proteína ósea en una matriz de polietilenglicol/glicerol |
| US9301976B2 (en) | 2010-08-19 | 2016-04-05 | The Regents Of The University Of California | Compositions comprising perivascular stem cells and nell-1 protein |
| US8551525B2 (en) | 2010-12-23 | 2013-10-08 | Biostructures, Llc | Bone graft materials and methods |
| JP5996330B2 (ja) * | 2012-08-21 | 2016-09-21 | 株式会社シャネル化粧品技術開発研究所 | 複合粒子及びそれを含む化粧料組成物 |
| WO2015140320A1 (en) | 2014-03-20 | 2015-09-24 | Encubator Ab | A composition for use in the treatment of intervertebral disc-related pain |
| US10238507B2 (en) | 2015-01-12 | 2019-03-26 | Surgentec, Llc | Bone graft delivery system and method for using same |
| US10265284B2 (en) | 2015-09-14 | 2019-04-23 | Stayble Therapeutics Ab | Composition for use in the treatment of intervertebral disc-related pain |
| CN105624058A (zh) * | 2015-12-04 | 2016-06-01 | 辽宁省海洋水产科学研究院 | 一株海洋柴油降解菌bhb-16及其固定化方法 |
| US10687828B2 (en) | 2018-04-13 | 2020-06-23 | Surgentec, Llc | Bone graft delivery system and method for using same |
| US11116647B2 (en) | 2018-04-13 | 2021-09-14 | Surgentec, Llc | Bone graft delivery system and method for using same |
Family Cites Families (28)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4789732A (en) | 1980-08-04 | 1988-12-06 | Regents Of The University Of California | Bone morphogenetic protein composition |
| US4294753A (en) | 1980-08-04 | 1981-10-13 | The Regents Of The University Of California | Bone morphogenetic protein process |
| US4761471A (en) | 1980-08-04 | 1988-08-02 | The Regents Of The University Of California | Bone morphogenetic protein composition |
| US4455256A (en) | 1981-05-05 | 1984-06-19 | The Regents Of The University Of California | Bone morphogenetic protein |
| US4434094A (en) | 1983-04-12 | 1984-02-28 | Collagen Corporation | Partially purified osteogenic factor and process for preparing same from demineralized bone |
| US4804744A (en) | 1984-01-04 | 1989-02-14 | International Genetic Engineering, Inc. | Osteogenic factors |
| US4608199A (en) | 1984-03-20 | 1986-08-26 | Arnold Caplan | Bone protein purification process |
| ATE128715T1 (de) | 1984-07-16 | 1995-10-15 | Celtrix Pharma | Polypeptide induzierende faktoren in knochen und knorpel. |
| US4843063A (en) | 1984-07-16 | 1989-06-27 | Collagen Corporation | Polypeptide cartilage-inducing factors found in bone |
| US4627982A (en) | 1984-07-16 | 1986-12-09 | Collagen Corporation | Partially purified bone-inducing factor |
| US4563350A (en) | 1984-10-24 | 1986-01-07 | Collagen Corporation | Inductive collagen based bone repair preparations |
| US4886747A (en) | 1985-03-22 | 1989-12-12 | Genentech, Inc. | Nucleic acid encoding TGF-β and its uses |
| US4681763A (en) | 1985-06-11 | 1987-07-21 | University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey | Composition for stimulating bone growth |
| JPH0662679B2 (ja) * | 1985-06-21 | 1994-08-17 | 新田ゼラチン株式会社 | 組織親和性コラ−ゲンとその製法 |
| US4798885A (en) | 1986-02-07 | 1989-01-17 | Genentech, Inc. | Compositions of hormonally active human and porcine inhibin containing an α chain and 62 chain |
| US4737578A (en) | 1986-02-10 | 1988-04-12 | The Salk Institute For Biological Studies | Human inhibin |
| US5459047A (en) | 1986-07-01 | 1995-10-17 | Genetics Institute, Inc. | BMP-6 proteins |
| US6150328A (en) | 1986-07-01 | 2000-11-21 | Genetics Institute, Inc. | BMP products |
| US5631142A (en) | 1986-07-01 | 1997-05-20 | Genetics Institute, Inc. | Compositions comprising bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) |
| US5187076A (en) | 1986-07-01 | 1993-02-16 | Genetics Institute, Inc. | DNA sequences encoding BMP-6 proteins |
| US5011691A (en) | 1988-08-15 | 1991-04-30 | Stryker Corporation | Osteogenic devices |
| US5108753A (en) | 1988-04-08 | 1992-04-28 | Creative Biomolecules | Osteogenic devices |
| US4968590A (en) | 1988-04-08 | 1990-11-06 | Stryker Corporation | Osteogenic proteins and polypeptides |
| US5106626A (en) | 1988-10-11 | 1992-04-21 | International Genetic Engineering, Inc. | Osteogenic factors |
| US5071655A (en) * | 1990-01-12 | 1991-12-10 | Baylink David J | Pharmaceutical combination for treatment of bone-wasting diseases |
| WO1992009697A1 (en) * | 1990-11-30 | 1992-06-11 | Celtrix Laboratories, Inc. | USE OF A BONE MORPHOGENETIC PROTEIN IN SYNERGISTIC COMBINATION WITH TGF-β FOR BONE REPAIR |
| KR100259827B1 (ko) | 1991-11-04 | 2000-06-15 | 브루스 엠. 에이센, 토마스 제이 데스로저 | 재조합 골형태 형성 단백질 헤테로다이머, 그 조성물 및 사용방법 |
| FR2706768B1 (fi) * | 1993-05-13 | 1995-12-01 | Inoteb |
-
1996
- 1996-02-29 DE DE69633197T patent/DE69633197T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-02-29 EP EP96903037A patent/EP0883410B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-02-29 AU AU47216/96A patent/AU4721696A/en not_active Abandoned
- 1996-02-29 ES ES96903037T patent/ES2225870T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-02-29 AT AT96903037T patent/ATE273723T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-02-29 WO PCT/FI1996/000118 patent/WO1997031661A1/en not_active Ceased
-
1998
- 1998-08-25 FI FI981818A patent/FI120253B/fi not_active IP Right Cessation
-
2004
- 2004-01-20 US US10/759,244 patent/US7186811B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FI981818L (fi) | 1998-10-12 |
| DE69633197D1 (de) | 2004-09-23 |
| WO1997031661A1 (en) | 1997-09-04 |
| ES2225870T3 (es) | 2005-03-16 |
| EP0883410B1 (en) | 2004-08-18 |
| ATE273723T1 (de) | 2004-09-15 |
| US7186811B2 (en) | 2007-03-06 |
| FI981818A0 (fi) | 1998-08-25 |
| DE69633197T2 (de) | 2005-08-18 |
| AU4721696A (en) | 1997-09-16 |
| EP0883410A1 (en) | 1998-12-16 |
| US20050142164A1 (en) | 2005-06-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI120253B (fi) | Osteogeeninen väline ja menetelmä sen valmistamiseksi | |
| RU2104703C1 (ru) | Способ получения материала для остеопластики и полученный этим способом материал | |
| AU2003237198B2 (en) | Allograft bone composition having a gelatin binder | |
| Takaoka et al. | Ectopic bone induction on and in porous hydroxyapatite combined with collagen and bone morphogenetic protein | |
| Katthagen | Bone regeneration with bone substitutes: an animal study | |
| JP4020962B2 (ja) | 骨移植組成物 | |
| EP0679097B1 (en) | Tgf-beta formulation for inducing bone growth | |
| CA1259914A (en) | Methods of bone repair using collagen | |
| Kamegai et al. | Bone formation under the influence of bone morphogenetic protein/self-setting apatite cement composite as a delivery system | |
| JP2013542837A (ja) | 骨空隙充填剤 | |
| CA2652338A1 (en) | Allograft bone composition having a gelatin binder | |
| EP4023267B1 (en) | Foraminifera-derived bone graft material | |
| KR101229436B1 (ko) | 골재생재 및 그 제조방법 | |
| US20050244450A1 (en) | Heat-treated implantable bone material | |
| RU2367475C1 (ru) | Мембрана для использования при направленной регенерации тканей | |
| JANOVEC et al. | Autolyzed antigen-extracted allogeneic bone for bridging segmented diaphyseal bone defects in rabbits | |
| Giardino et al. | A resorbable biomaterial shaped as a tubular chamber and containing stem cells: a pilot study on artificial bone regeneration | |
| Safian Boldaji et al. | The Synthetic Powders Extracted of Ostrich Eggshell and Evaluated the Effect of These Bone Powders on Bone Remodeling and Repairing | |
| Volpon et al. | The use of decalcified granulated homologous cortical bone matrix in the correction of diaphyseal bone defect: An experimental study in rabbits | |
| CN112089891A (zh) | 一种骨诱导活性提取物及其制备方法 | |
| Köhler et al. | Osteogenic enhancement of diaphyseal reconstruction: comparison of bone grafts in the rabbit | |
| KR100435418B1 (ko) | 골형성 및 골경화 촉진용 조성물 | |
| Tuominen | Native bovine bone morphogenetic protein in the healing of segmental long bone defects | |
| Eskandar et al. | The use of coral as a graft in a large cortical bone defect | |
| JPH0326616B2 (fi) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| GB | Transfer or assigment of application |
Owner name: BIOACTIVE BONE SUBSTITUTES OY, AB |
|
| FG | Patent granted |
Ref document number: 120253 Country of ref document: FI |
|
| MA | Patent expired |