FI117054B - Interleukiini-15:n valmistusmenetelmä ja sitä koodaava DNA-sekvenssi - Google Patents

Description

1 11

Interleukiini-lS:n valmistusmenetelmä ja sitä DNA-sekvenssi

Keksinnön ala 5 Keksintö liittyy yleisellä tasolla nis epiteeliperäiseen T-solutekijä ("ETF") -polype josta tässä keksinnössä käytetään nimitystä interl 15 {"IL-15"). Tarkemmin sanottuna se liittyy IL-1 logista aktiivisuutta sisältävää polypeptidiä ke 10 eristettyyn cDNA-sekvenssiin, eristettyihin IL-15-tidisekvensseihin ja näiden johdannaisiin, menetel 15-polypeptidien valmistamiseksi yhdistelmä-DNA-te käyttäen, menetelmään T-solujen lisääntymisen ja tumisen indusoimiseksi ja sellaisiin IL-15:ttä sis 15 koostumuksiin, joista saadaan tuumoria vastaan j tiotautia vastaan suunnattua immuniteettia.

Keksinnön tausta T-solut, joista käytetään myös nimitystä syytit, ovat ryhmä immuuniefektorisoluja. T-solut 20 periferaalisissa kudoksissa jakaa kahteen suureen sen perusteella, että ne ilmentävät solun pinnan CD8-molekyylejä, joista toisen ilmentyminen sulke • « · I*, ilmentymisen ulkopuolelle. Tyypilliset CD8+-T-sol ; / tuvat aktivoiduttuaan sytotoksisiksi T-soluiksi j * * * [il 25 hoavat antigeeniä sisältäviä kohdesoluja solujen * · ·

• ·· suoran kosketuksen välityksellä. Aktivoidut CD4H

·.:** tuottavat tavallisesti positiivisia signaaleja, es ··♦ V · si B-soluja varten tarkoitetun "auttaja"-toiminn' tekee mahdolliseksi B-solujen erilaistumisen vasta : 30 muodostaviksi soluiksi), mistä syystä niistä käyte ι«· -***. mitvstä auttaia-T-snl nt-.

2 lymfosyytit· IL-2 havaittiin alun perin humaani-! pitkäaikaista kasvua edistävänä tekijänä. Sen va: ovat T-solujen kasvun lisäksi luonnollisten tapj -solujen ja lymfokiinien aktivoimien tappaja (LA] 5 jen sekä sytotoksisten T-solujen ("CTL") ja ma] aktivaatio ja B-solujen kasvun edistäminen.

IL-4 on 15 - 20 kDa:n suuruinen proteii tuottavat aktivoidut T-solut, luuytimen stroome syöttösolut. IL-4:n avoin lukukehys koodaa 140 ai 10 mittaista muriini-IL-4:ää ja 153 aminohapon mitti maani-IL-4:ää. IL-4 määriteltiin alun perin B-sol vua ja erilaistumista aktivoivaksi tekijäksi. S< tuksia ovat myös makrofagien aktivaatio ja luoka: molekyylien induktio, joidenkin T-solulinjojen j; 15 solulinjojen kasvu, ihmisen periferaalisen veren 1 lisääntyminen ja CTL-solujen muodostuminen näistä jen tuottaman immunoglobuliinin muodostumisen vo nen ja toiminta kasvutekijänä hematopoieettistei kasvussa kantasoluista. IL-4:llä on tärkeä ost 20 säätelyssä, jolla lL-2:n aikaansaamat NK-solu-soluaktiivisuudet lakkaavat vaikuttamasta. Hui 4:llä ei ole aktiivisuutta hiiren soluja kohtaan « · « IL-7 on 20 - 25 kDa:n suuruinen ja 177 ai • ** 1/ mittainen polypeptidi, jota tuottavat luuydin ji lii 25 korvan strooman solut. Vaikkakin IL-7 kuvattiin a * * * * ** esi-B-solujen kasvutekijäksi, niin se edistää se! ...

solujen että pre-B-solujen kasvua. IL-7 indusoi m * · · V * sen periferaalisen veren T-solujen lisääntymistä solujen muodostumista niistä, lL-2:n reseptorin : 30 mistä, IL-2:n muodostumista ja CD4*- ja CD8+-so: sääntymistä. IL-7 vaikuttaa myös synercrisesti IL- 3 di. IL-9 tunnistettiin ensimmäisen kerran auttaj jen kasvutekijäksi. IL-9 stimuloi erytroidisoluj tyrnistä ja voimistaa IL-3:n indusoimaa luuydin syöttösolujen lisääntymistä. Se myös moduloi IL-5 ollessa B-solujen tuottamien IgE:n ja IgG:n muodo Hiiren IL-9:llä on ihmissoluihin kohdistuvaa akt ta, kun taas humaani-IL-9 ei vaikuta hiiren solu Humaani-IL-10 on 16 - 20 kDa:n suun 178 aminohapon mittainen polypeptidi, jota 10 makrofagit ja TH2-T-auttajasolut mutta eivät TH1 jasolut. IL-2:n, IL-4:n ja lL-7:n tavoin IL-1 useita erilaisia biologisia aktiivisuuksia. IL-1 tiin sen perusteella, että se kykenee inhiboimaan tujen T-solujen sytokiinien muodostumista. Sekä 15 että muriini-IL-10 ovat tyraosyyttien ja T-soluj< stimuloivia kofaktoreita lL-7:ään tai lL-2:een 4:ään yhdistettynä. IL-10 stimuloi syöttösolujen ja kasvua IL-4:ään tai IL-3:een ynnä IL-4:ään yh nä. IL-10 indusoi myös B-soluissa tapahtuvan IgG; 20 misen ja MHC: n luokan II molekyylien ilmentymiser näiden solujen elinkykyä viljelmässä.

.V. IL-12 on konstitutiivinen tai se indusoit « i · liesterillä ja kalsiumionoforilla lymfoblastoidi 1 *! lulinjoissa ja sitä muodostavat LPSrllä st * * * 25 makrofagit. IL-2:n molekyylipaino on 70 kDa ja • kenteeltaan poikkeuksellisesti heterodimeerinen j tunut kahdesta disulfidisidoksen yhdistämäst • tt : proteiinista. Kahdesta glykoproteiinialayksikösti on 40 kDa:n suuruinen ja 328 aminohapon mittaii : 30 peptidi. Pienempi glykoproteiinialayksikkö on .***. suuruinen Hs onH nnhannn m H ttai non nnl vnonfl Λ 4 välityksellä toimivaa sytotoksisuutta ja vaikutt kanssa synergisesti LAK-solujen muodostamisessa. IL-2:sta ja lL-7:stä poiketen mutta samoin kuin kaan hyvin vähän tai ei ollenkaan lepotilassa oi 5 riferaalisen veren mononukleaarisolujen lisääntyi

Keksinnön yhteenveto Tässä keksinnössä on eristetty ja puhdist T-solukasvutekijä, josta käytetään tuonnempana "interleukiini-15" ("IL-15"). Tässä keksinnössä 10 tiin apinan IL-15-polypeptidiä koodaava cDNA-s joka sisältää 483 ep:n suuruisen 5'-puoleisen koo man alueen, joka sijaitsee 489 ep:n suuruiser lukukehyksen ja 303 ep:n suuruisen 3'-puoleisen toman alueen edellä. Ihmisen lL-15-polypeptidiä k 15 sa cDNA-sekvenssissä on 316 ep:n suuruinen 5T-koodaamaton alue, joka sijaitsee 489 ep:n suurui men lukukehyksen ja 397 ep:n suuruisen 3'-puole daamattoman alueen edellä. Apinan ja ihmisen avo kukehysten nukleotidi sekvenssit ja niistä päätell 20 happosekvenssit on kuvattu SEKVENSSEISSÄ ID NC Sekä apinan että ihmisen avoimet lukukehykset eVe prekursoripolypeptidiä (SEKVENSSIT ID N0:2 ja 5).

I \ prekursoripolypeptidl koostuu 48 aminohapon ml « i »

/ johtosekvenssistä ja kypsää apinan tai ihmisen IL

***** 25 peptidiä koodaavasta sekvenssistä. Apinan ja ih «« i : '.· tiiviset IL-15-polypeptidit on kuvattu SEKVENi \.V NO:3 ja 6 tässä järjestyksessä ilmoitettuna.

•J : Tämä keksintö sisältää lisäksi muita sell 15-polypeptidejä, joita koodaavat nukleotidise : 30 jotka hybridi soi tuvat kohtalaisen rajoittavista • »·

.·*·. teista erittäin ra Λ eittäviin olosuhteisiin SEKVG

5 ilmentymistä. Tämä keksintö sisältää lisäksi nu sekvenssejä, jotka geneettisen koodin degenerati johdosta koodaavat edellä kuvattujen nukleotidise ja näiden suhteen komplementaaristen sekvenssien 5 IL-15-polypeptidej ä.

Tästä keksinnöstä saadaan vielä lisäksi edellä olevia nukleotidisekvenssejä, esimerkiksi misvektoreita tai plasmideja, sisältäviä yhdist molekyylejä, IL-15-polypeptidien valmistamisessi 10 kelpoisia transformoituja isäntäsoluja sekä m yhdistelmä-IL-15-polypeptidien valmistamiseksi nä kyylejä käyttäen.

Lyhyt kuvaus piirroksista

Kuvio 1 esittää aktiivista apinatyyppiä o 15 15:n nukleotidisekvenssiä Ja tästä pääteltyä am sekvenssiä.

Kuvio 2 esittää IL-15:n aktiivista ihm olevaa nukleotidisekvenssiä ja pääteltyä amino venssiä.

20 Kuvio 3 esittää puhdistuskaaviota ja pr sekvensointikaaviota, jotka soveltugvat käytettä .I,., 15-polypeptidien eristämiseen.

I \ Kuvio 4 esittää humaanityyppistä IL-15:tt * · * / natyyppistä IL-15:ttä koodaavien nukleotidise * * *

Vf 25 välillä vallitsevaa homologiaa. Humaanisekvenss: 2 .* tetty apinan sekvenssin yläpuolella.

Kuvio 5 esittää humaani tyyppisen IL-15:n V * tyyppisen IL-I5:n aminohapposekvenssien välisti giaa. Humaanisekvenssi on esitetty apinasekvenssl ; 30 lella. Molemmissa tyypeissä johtosekvenssi (amine .***. 48) oilkkoutuu Drekursorinalvnentidistä. mistä 6 ro -olosuhteissa määritettiin käyttäen nousevia raatioita yhdistelmä-sytokiiniä (ilmoitettuna y] ng/ml). Koetulokset on ilmoitettu soluihin kerääni tymidiinin cpm-arvoina (x 10'3).

5 Kuvio 7 esittää OTL-solujen lyyttisen akti; indusoitumista rIL-15:lla ja IL-2:lla. Antigeenisi sytolyyttisiä T-lymfosyyttejä (CTL) muodostettiin -olosuhteissa. Yhdeltä verenluovuttajalta peräis ihmisen periferaalisen veren mononukleaarisolu 10 stimuloitiin allogeeniselta verenluovuttajalta olevilla säteilytetyillä PBL-soluilla viljelmisi sisälsivät useita eri konsentraatioita joko IL-humaani-rIL-15:ttä. Viljelmistä määritettiin nii< lyyttinen aktiivisuus 51Cr-leimalla varustettuja k 15 ja vastaan, jotka olivat peräisin siltä verenluo ta, jonka soluja oli alun perin käytetty stimu Myyttiset yksiköt laskettiin käyttäen sen reago: jelmän murto-osan käänteisarvoa, joka tarvittiii aikaan 50 % maksimaalisesta spesifisestä 51Cr:n v 20 sesta.

Kuvio 8 esittää LAK-solujen lyyttisen akti .V. indusoitumista rlL-15:llä ja IL-2:lla. Lymfokiini * * * .·/. voituja tappaja (LAK) -soluja valmistettiin in vi * ·* ly suhteissa. Humaani-PBL-soluja stimuloitiin säteil 25 autologisilla PBL-solui 11a ja sytolyyttinen ak * * * 5 ·* määritettiin lymfoblastoidista Daudi-soluiinjaa

Lyyttiset yksiköt laskettiin sen reagoivan vilje ·*# * to-osan käänteisarvona, joka tarvittiin saamaa 30 % maksimaalisesta spesifisestä 51Cr:n vapautum 30 Kuvio 9 esittää NK-solujen lyyttisen akti

:***: indusoitumisen rIL-15:ttä ja IL-2:ta käyttäen. L

7 CD16:tta vastaan suunnattuja monoklonaalisia vas ta. Puhdistettuja NK-soluja kasvatettiin 3 päivää lyyttinen aktiivisuus määritettiin K562-erytrole lulinjaa vastaan.

5- Keksinnön yksityiskohtainen selitys

Hlnterleukiini-15" tai "IL-15" tarkoittaa den polypeptidejä, jotka muistuttavat rakenteelt keksinnössä kuvattuja polypeptidejä ja jotka st T-lymfosyyttejä lisääntymään ja erilaistumaan. 10 erotettavissa IL-2:sta, IL-4:stä, IL-7:stä, 1L-I0:stä ja 1L-I2:sta rakenteensa perusteella j rusteella, mistä soluista se on peräisin (taulukk 15-polypeptidiä muodostuu kädellisten epiteel ensin 162 aminohapon mittaisena prekursori-lL 15 peptidinä. Tämä prekursori sisältää 48 aminohapo sen johtosekvenssin, joka poistetaan prekur peptidistä kypsän polypeptidin muodostamiseksi. 15-polypeptidi kykenee toimimaan signaalina prek solujen tai kypsien T-solujen lisääntymiselle ja 20 laistumiselle. Tätä proteiinia voidaan tästä syy tää T-lymfosyyttien ja T-solulinjojen pitkäaikais .V, lyn edistämiseen in vitro -olosuhteissa.

* « 1 2 3 4 5 .1/1 "sIL-15" tarkoittaa apinatyyppistä IL-15:t • Il

elm/ 15" tarkoittaa humaanityyppistä IL-15:ttä. "rIL

25 koittaa yhdistelmä-IL-15:ttä. Sekä puhdistettu sl 2 • · 1 3 ! l rIL-15 stimuloivat CTLL-2-solujen [Gillis ja Smit

:;j;: 268 (1977) 154; ATCC TIB 214] lisääntymistä. S

4 : solujen supernatantit, jotka oli transfektoitu prekursorimuodolla ja oikeaan lukukehykseen valmi 30 kypsillä muodoilla, joita oli ilmennetty yhdist 5 tplrni ilrnn ηνιιΊ Ί a eaivaf a^lraan Γ"ΤΤΤ__9·« 1 ie· 8 ("PBL"). rIL-15:n havaittiin tässä keksinnössä st fytohemagglutiniinin ("PHA") kanssa etukäteen vi PBT- ja PBL-solujen lisääntymistä. rIL-15 stimi PHA: 11a aktivoitujen CD4+- ja CD8*-solujen lisää: 5 rIL-15 stimuloi lepovaiheessa olevien humaani-tai lepovaiheessa olevien hiiren T-solukloonier tyrnistä CD3:a (T-solureseptoria) vastaan suunnatt ta-aineiden läsnä ollessa. PHA:11a aktivoiduilla luilla suoritetut kokeet osoittavat, että rlL-li 10 kaan kasvua stimuloivat vaikutuksensa IL-2:sta r tomalla tavalla siinä mielessä, että IL-2:ta tai septoria vastaan suunnatut vasta-aineet eivät in 15:ttä.

Termien IL-15, slL-15 ja hIL-15 piiriin 15 nisäkkäiden natiivien polypeptidien analogit tai köt, joita koodaavat sellaiset nukleiinihapot, . toutuvat kuvioissa 1 ja 2 oleviin nukleiinihapp seihin (SEKVENSSEISSÄ ID NO:1 ja 4 esitettyihin deihin 145 - 489, rajakohdat mukaan lukien) ma 20 rajoittavien olosuhteiden vallitessa ja saavat < lymfosyyttien lisääntymisen ja erilaistumisen ja vat T-solulinjojen ja eristettyjen PBT-solujen * « mistä.

• · « • M • · • · • · ♦ • t · • · M ♦ • « « • · • 0 0 • ♦ · il· ··· 000 4 I · • I 4 • ♦ • · · • · · 000 000 0 0 0 Λ 9

Taulukko 1 T-solukasvutekijöiden alkuperä ja rakenne

Amino-hap-Koko pojen

Tekijä (kDa) lukumäärä* Materiaalilähde 5 _ _ _ _ IL-2 15 153 Aktivoidut lymfc IL-4 15-20 153 Aktivoidut T-lyi syytit, Luuytinw stroomasolut, solut IL-7 25 177 Luuytimen ja ka^ korvan stroomast IL-9 30 - 40 144 Aktivoidut T-lyi syytit 10 IL-10 16 - 20 178 Th2-lymfosyyyti· IL-12** 40 ja 35 328 ja 253 B-lymfoblastoid: linjat • a V.J IL-15 15-17 162 Epiteelisolut • I « » » • aa • a a a :.V * Avoimen lukukehyksen koodaama lukumäärä hun aa a : *.* 15 peptideissä.

**Aktiivisuuteen tarvitaan kaksi glykoproteiini :T: köä.

a . "Yhdistelmä-DNA-tekniikka" tai "yhdiste] • aa .·*·. 20 koittaa tässä keksinnössä tekniikoita ja meneteln 10 mahdollistamiseksi on transformoitu tai trans kloonatuilla tai synteettisillä DNA-sekvensseini syloitumiseitaan natiiveja muotoja saadaan aikaai taan käyttämällä nisäkässoluilmentämisjärjestelm: 5 tuottaa oman muista erottuvan glykosylaatiomuodoi tämisestä prokaryoottisissä soluissa (esimerl colissa) saadaan tavallisesti polypeptidejä, j esiinny glykosylaatiota.

"Biologisesti aktiivinen" tarkoittaa, et1 10 nimenomainen lL-15-polypeptidi kykenee stimulo lymfosyyttien lisääntymistä ja/tai erilaistumista ja hlL-15:n tapauksessa tämä biologinen aktiivisu myös hiirten tai kädellisten, esimerkiksi ihmist lulinjojen tai PBT-solujen lisääntymisen stimula< 15 "Nukleotidisekvenssi” tarkoittaa erillisen tin muodossa tai suuremman DNA-konstruktion koi muodossa, kuten kloonausvektorin muodossa, olevaa leotidia, joka on peräisin vähintään kerran hu< puhtaana eristetystä DNA:sta, toisin sanoen 20 esiinny endogeenisesta materiaalista peräisin ol< taminaatiota) ja jota on sellainen määrä tai jc ,V* sentraatio on sellainen, että sen komponentteii * · · nukleotidisekvenssit kyetään tunnistamaan, näitt • ·« 1 / käsittelemään ja niitä kyetään saamaan talteen • * * ; 25 tavallisia biokemiallisia menetelmiä [menetelmä • · * : ·* teoksessa Sambrook, et ai., Molecular Clc • · *···* Laboratory Manual, 2nd ed«, Cold Spring Harbor Lal ··· : Cold Spring Harbor, NY (1989) pääpiirteittäin menetelmät]. Nämä sekvenssit hankitaan käyttöön e· : 30 ti avoimen lukukehyksen muodossa, joiden yhtäjak evät keskeytä eukaryoott isissä geeneissä tyyp 11 lukukehyksestä, jossa nämä eivät häiritse k< alueiden käsittelyä tai ilmentymistä.

"Yhdistelmä-ilmentämisvektori" tarkoittaa dia, joka sisältää sellaisesta kokoonpanosta 1 5 transkriptioyksikön, joka sisältää (1) geneettise: tin tai elementtejä, joiden tehtävänä on säädelli ilmentymistä ja joita ovat esimerkiksi promootl käynnistäjät, (2) rakenteellisen tai koodaavan se] joka transkriptoituu mRNA:ksi ja jolle tapahtuu 10 tio IL-15:n biologista aktiivisuutta sisältäväksi tidiksi, ja (3) asiaankuuluvat transkription ja ' tion aloitus- ja lopetussekvenssit. Edempänä on t< tu useita erilaisia säätelyelementtejä, joiden k< tulla kysymykseen (ks. kappale Yhdistelmä-DNA-mem 15 Hiivailmentämisjärjestelmissä käytettäviksi aioti teelliset elementit sisältävät edullisesti johti sin, jolla hiivaisäntäsolu kykenee erittämään tra; avulla syntyneen polypeptidin solun ulkopuolelle telmäpolypeptidi voi vaihtoehtoisesti bakteeri-ili 20 järjestelmässä sisältää N-terminaalisen metioniii N-terminaalinen metioniiniryhmä voidaan myöhemmi: ilmennetystä yhdistelmäpolypeptidistä jatkopuhd • » i • . soveltuvan tuotteen aikaansaamiseksi.

• « « *. .* " Yhdi s telmä-mikrobi-i lmentämi s järjestelmä 25 taa sopivan mikro-organismin, esimerkiksi bakteer + * : ·' E. colin, tai hiivan, kuten S. cerevisiaen, hui *·!·' homogeenista viljelmää, jossa esiintyy vain tätä «ti V: mia ja jossa yhdistelmä-transkriptioyksikkö on pysyvästi kromosomaaliseen DNA:hän tai joka sisj : 30 distelmä-transkriptioyksikön plasmidiin kuuluvar nenttina. Yhdistelmä-mikrobi-ilmentämisjärjestel 12 dejä ilmennettävään rakennenukleotidisekvenssiir tyjen säätelyelementtien indusoitumisen jälkeen.

Transformoidut isäntäsolut ovat yh< ilmentämisvektori11a transformoituja tai transf< 5 soluja. Ilmentynyt nisäkkäiden IL-15 paikantuu soluun ja/tai erittyy viljelmäsupernatanttiin isi tyypin ja isäntäsoluun liitetyn geenikonstruktioi Alan ammattikokemuksen perusteella tunnet! laisen voimakkaasti rajoittavat hybridisaatio-oi 10 tarkoittavat sellaisena kuin ne on määritelty ti sinnössä olosuhteita, joita on kuvattu esimerkil sessa Sambrook, et ai., ks. edellä, Voi 2, 8.46 9.47 - 9.55. Kohtalaisen voimakkaasti rajoitta suhteet, sellaisena kuin ne on määritelty 15 Sambrook et ai., sisältävät esimerkiksi sen, että saatio yön yli ja hybridisäätiön jälkeiset pesui 55 °C:ssa, 5 x SSC:ssa ja 0,5-%:isessa SDS:ssä. kaasti tai erittäin voimakkaasti rajoittavat o ovat olosuhteita, joissa käytetään vielä k 20 hybridisaatiolämpötiloja ja hybridisäätiön jälke sujen lämpötiloja tai pienempiä suolakonsentraat: ;\\ IL-15-polypeptidit Tässä keksinnössä on puhdistettu apinatyyp • ** lmS 15 (sIL-15) ja sekvensoitu kypsän sIL-15:n N-term S: 25 peptidi. Tässä keksinnössä on eristetty sIL-15:ää * * * * ;* cDNA käyttäen hyväksi N-terminaalista aminohapposi '«·* ja PCR:ää ja määritetty kypsän slL-15:n nukleotid V : si ja tästä päätelty aminohapposekvenssi (kuvic

sIL-15-polypeptidin prekursorin nukleotidisekvi li: 30 tästä päätelty aminohapposekvenssi (SEKVENSSI II

SEKVENSSI ID N0:2). Apinalajeissa esiintyvä IL

13 T-solulinjojen (esimerkiksi CTLL-2) lisääntymis stimuloi humaani-PBT-solujen lisääntymistä ja e] mistä.

Tämä keksintö käsittää myös muiden nisäkki 5 15:n, mukaan lukien humaani-IL-15:n, joka sisältä biologista aktiivisuutta ja jota koodaavat nukle< venssit, jotka hybridisoituvat SEKVENSSIN ID NO:! telemiin koettimiin olosuhteissa, jotka ulottuvi laisesti rajoittavista olosuhteista erittäin voii

10 rajoittuviin olosuhteisiin. Humaani-IL-I5:n cDNA

telmä-kloonin sisältävä plasmidi talletettiin tali tokseen American Type Culture Collection, 12301

Drive, Rockville, MD 20852 USA ("ATCC*) patentoi] telytarkoituksla varten tehtävän mikro-organismit 15 tuksen kansainvälisestä hyväksymisestä tehdyn B' sopimuksen ehtojen mukaisesti 19.2.1993 hakunumer 69245. Talletukselle oli annettu nimitys "141-hE1 sisälsi E. coli -kannan, johon sisältyi plasmj pCD406, jossa oli 316 ep:n suuruinen ei-koodas 20 joka oli 489 ep:n suuruisen avoimen lukukeh; 397 ep:n suuruisen 31-puoleisen koodaamattomai .V. edellä, joita alueita reunustivat molemmilla • * · .·/; SEKVENSSEISSÄ ID NO 7 ja 8 esitetyt Sal I -ai • ·· ly Kaikki talletetun materiaalin yleistä saatavuutta • · t .1 ‘ 25 rajoitukset poistetaan peruuttamattomasti patenl * * · : ** tämisen jälkeen.

* . .

*·«* Tässä keksinnössä kuvattujen IL-15-poly: V : aminohapporakennetta voidaan modifioida muodostai valenttisia tai aggregatiivisla konjugaatteja mui 30 allisten ryhmien, kuten glykosyyliryhmien, lipid :***: faatin, asetyyliryhmien ja muiden näitä vastaavie 14 hin tai nisäkkäiden IL-15-polypeptidin N-termi: tai C-terminaaliseen päähän. Muita tämän keksinn piiriin kuuluvia nisäkkäiden IL-I5:n johdannai nisäkkäiden IL-15;n tai sen fragmenttien kovalc 5 aggregatiiviset konjugaatit, joihin on käytetty m telineja tai polypeptidejä, kuten johdannaiset, saatu aikaan syntetoimalla yhdistelmä-DNA-tekniik viljelmässä N-terminaalisena tai C-terminaalisen na. Konjugoitu polypeptidi voi esimerkiksi olla 10 den IL-15-polypeptidin N-termlnaalisella alueell seva signaali (tai johto) -polypeptidisekvenss tarkoituksena on kuljettaa polypeptidi sen syntee ta solumembraanin tai soluseinämän sisä- tai ulk olevaan kohtaan (esimerkiksi hiivan a-tekijän 15 venssi). lL-15-polypeptidejä voidaan tavanomaisin min ilmentää lisäksi polypeptidifuusioina, jotka vät vielä muita polypeptidisekvenssejä, kuten Fc sin tai muita immunoglobuliinien sekvenssejä, ky venssejä tai muita sekvenssejä, jotka edistävät 20 lypeptidien puhdistamista ja tunnistamista. Lisäk polypeptidifuusiot voivat vielä sisältää muihin neihin tehtyjä fuusioita uusien polyfunktionaalis • « 4 a·/· naisuuksien aikaansaamiseksi. Muita sytokiineja ' / merkiksi mitkä tahansa interleukiineista 1-13, t · i .·*·’ 25 ekroositekijä (TNF), granulosyyttimakrofagipesäke * · · • tlotekij ä (GM-CSF), granylosyyttipesäkestimulaa (G-CSF), syöttösolujen kasvutekijä (MGF) ja muut • 9 * ·.· : nit, jotka vaikuttavat immuuni solujen kasvuun, e miseen tai toimintaan.

30 Tämä keksintö sisältää vielä glykosyla «·« e. « , _ _ « . . . , - . „ . . . . ....

15 samanlaisia tai merkittävästi erilaisia. Tämä oi vainen siitä, mikä ilmentämisjärjestelmä on vai: tettäväksi. Kun IL-15-polypeptidej ä ilmennetään 1 ilmentämisjärjestelmissä, kuten E. colissa, ni 5 saadaan glykosyloitumattomia molekyylejä.

01igonukleotidisynteesiä ja ligaatiota t« mutageneesimenetelmiä käyttämällä voidaan syntet< merkiksi inaktivoituja N-glykosylaatiokohtia s humaani-IL-15:n tai muiden nisäkkäiden IL-15:n t 10 lisiä mutatoituneita analogeja. IL-15-polypeptii naisia voidaan ilmentää homogeenisessa muodoss hiilihydraattipitoisuus on tavallista pienempi, hiivailmentämisjärjestelmiä. Eukaryoottisissa p deissä esiintyville N-glykosylaatiokohdille on 15 omaista aminohappotripletti Asn-Φ-Ω, Φ on mike aminohappo paitsi pro ja Ω on Ser tai Thr. IL-1 toitunut johdannainen on tässä keksinnössä pol joka on huomattavassa määrin homologinen nisäkk. 15:n natiivin sekvenssin suhteen mutta jonka am 20 sekvenssi poikkeaa nisäkkäiden IL-15:n natiivista tidistä deleetion, insertion tai substituution v •\\ IL-15-muteiinien lL-15-polypeptidien bio vastaavia analogeja voidaan konstruoida valm * ·.

ly useita eri aminohapporyhmien tai sekvenssien s .11 25 tioita tai deletoimalla biologiselle aktiivisuud • · · : ·* peettomia terminaalisia tai sisäisiä ryhmiä tai s • · *.

*···* jä. Esimerkiksi Cys-ryhmät voidaan deletoida ta; *·* : toisilla aminohapoilla vääränlaisten molekyylin disulfidisiltojen muodostumisen ehkäisemiseksi m 30 uudelleennaturoitaessa. Muita mutageneesilähesty ·***· nvat afpn aml nnhamvtruhml on ιηηΗΊ filraa 11 16 taan natiivin ryhmän ominaisuuksia muistuttavaa · poa.

Antisense- tai sense-oligonukleotidit s: yksijuosteisia nukleiinihapposekvenssejä (joko 5 DNA-sekvenssejä), jotka kykenevät sitoutumaan sen: mRNA-sekvenssiin tai antisense-IL-15-cDNA-sek1 Tämän keksinnön mukainen antisense- tai senseolij tidi sisältää kuvioissa 1 tai 2 esitettyjen mil sekvenssin fragmentin tai kuvioissa 1 tai 2 es: 10 nukleotidisekvenssien suhteen komplementaarisen RNA-muodon fragmentin. Tällainen fragmentti sis< hintään noin 14 nukleotidia ja se kykenee sitout 15:n DNA:hän. Sitä, miten antisense- tai sense-i leotidi kyetään muodostamaan IL-15:n cDNA-sekvei 15 rusteella, on kuvattu esimerkiksi julkaisuissa Cohen, Cancer Res. 48 (1988) 2659 ja van der Krol BioTechniques 6 (1988) 958.

IL-15:n eristäminen ja luonnehtiminen ei-; mäsolumateriaalilähteestä edellyttää, että saate 20 IL-15:ttä tuottava nisäkässolulinja sekä reagoiva ja, joka lisääntyy vasteena IL-15:lla suoritettu laatloon. Nisäkkäiden IL-15:n biologisessa määr * « * I '. voidaan lymfoidisolujen lisääntymistä indusoivien I * *; den havaitsemisessa käyttää kasvutekijästä riippu \**·9 25 solui in jaa. Nisäkkäiden IL-15-polypeptidien määri : .* voidaan myös käyttää ihmisistä tai muista nisäkkä * ·.:.· tuista verinäytteistä eristettyjä T-soluja.

* * * ·,· ! IL-15:stä riippuvainen solulinja voi olla hiiren CTLL2-soluista. Tämä solulinja reagoi puhd : 30 humaani-IL-2:een, hiiren lL-2:een ja yhdistelmä

• M

*** H-M Ύ*θΤ\ TT + mi iH—ha TT.-1 «aan TT.-Q*non 17 lekyylien aikaansaamiseksi lajien väliseen hybrid käytettävien menetelmien avulla. Suoritus tapat piirteittäin siten, että kuviossa 1 tai SEKVEN! N0:1 kuvatussa muodossa olevan slL-15:n cDNA:n ta 5 sa 2 tai SEKVENSSISSÄ ID NO:4 kuvatussa muodosi hIL-15:n cDNA:n proteiinia koodaavan alueen nu sekvenssistä valmistetaan oligonukleotldikoetin. tin voidaan valmistaa tavallisin menetelmin, ku sessa Sambrook, et ai., supra, kuvatuilla mene 10 Apina- tai humaanikoetinta käytetään nisäkkäiden jaston tai genomisen DNA-kirj aston seulontaan koh ti rajoittuvissa olosuhteissa. Nisäkkäiden cDNA-voidaan valmistaa esimerkiksi hiiren periferaali lymfosyyteistä eristetyistä mRNA-molekyyleistä. 15 toisesti voidaan muita useista eri kudoksista tai joista valmistettuja cDNA-kirjastoja tai näistä e jä mRNA-molekyylejä seuloa Northern-hybridisaatic van nisäkkäiden IL-15:n DNA:n tai 1L-I5:n mRNA:n 1ilähteen selvittämiseksi· 20 CV-l/EBNA-soluista peräisin olevan XL-15: tus Tässä keksinnössä on IL-15 puhdistettu ei « « « nisesta proteiiniliuoksesta, kuten IL-15:ttä llm ; soluista talteen otetusta käytetystä kasvatusm • * · [il 25 peräisin olevan eristetyn polypeptidi valmisteen a « « · * ·* miseksi. Ennen kuin IL-I5:n biologinen aktiivisu Λ väittävissä tässä keksinnössä kuvattuja biologia V : tysmenetelmiä käyttäen, tarvitaan tyypillisesti yhtä puhdistusvaihetta.

: 30 Ei-homogeeninen proteiini liuos, esimerklk • · · 18

Dulbecco’s Modified Essential Medium ("DMEM", Edullisimmin käytetään kasvatusmediumia ja tuot< umia. sIL-15:n eristämiseen käytetty kasvatusme tässä keksinnössä kuvatulla tavalla suuren gluko< 5 suuden (4 500 mg/1) sisältävä DMEM, jonka täydei oli käytetty 7,5 % fetaalista naudanseerumia, 50 nisilliiniä, 50 pg/ml streptomysiiniä, 3 - 4,0 n tamiinia, 1 mM natriumpyruvaattia, 0,1 mM ei-väl· miä aminohappoja ja 10 mM N-[2-hydroksietyyli]-pi] 10 ni-N' -[2-etaanisulfonihappo] ("HEPES") -puskuria tuotantoon ja puhdistamiseen kehitettiin seerumi tantomedium, joka sisälsi DMEM:ää, josta fenold jätetty pois mutta jonka täydentämiseen oli 50 u/ml penisilliiniä, 50 pg/ml streptomysiii 15 4,0 mM L-glutamiinia, 1 mM natriumpyruvaattia, 0 välttämättömiä aminohappoja ja 10 mM HEPES-puski 1/EBNA-solut olivat riippuvaisia kiinnittymisestä ja niitä voitiin kasvattaa maljoilla, pulloissa, pulloissa (roller bottles) tai mikrokantajien pii 20 Tarkemmin sanottuna IL-15:ttä tuotettiin mällä CV-1/EBNA-soluja kontrolloidussa biorei .V. mikrokantajien pinnalla. Solujen kantapreparaatte * * · lm\ tettiin elatuspulloissa (roller bottles). Tuota! ; ,* käynnistämiseksi solut trypsinisoitiin ja ne ; • * * I;*;* 25 elatuspulloihin (spinner bottles), jotka sisälsiv • * t ' ·* kuvattua kasvatusmediumia ja 5 g/1 Cytodex· 3 mi] jia (Pharmacia). Solutiheys oli kasvatusta aloi : 1,5 - 3,5 x 105 solua/ml. Sen varmistamiseksi, e- kiinnittyivät tehokkaasti mikrokantajiin, pidetti : 30 elatuspulloissa (spinner bottles) 2-24 tunnin a *· * :*"· tuspullo (spinner bottle) -viljelmää inkuboitiin : 19 pitoisuuden ja ravistelun asetukset olivat 37 20-%:inen kylläisyysaste (ilman suhteen ilmoitei 75 - 85 kierrosta minuutissa, mainitussa järje ilmoitettuna. Solujen kasvun ja kunnon päivittäis 5 kailuun tarkasteltiin näytteitä helotaustamikros

Solujen kasvu kvantitoitiin laskemalla vapautun< mien lukumäärä sellaisella liuoksella suoritetun lyn jälkeen, joka sisälsi 100 mM sitruunahappoa kristalliviolettia.

10 Viljelmää täydennettiin uudella kasvatusm silloin, kun ammoniakkipitoisuudet saavuttivi 5,0 mM. Tämä toistettiin siihen asti, kunnes mikr en pinnalla kasvavat solut olivat kasvaneet ki: siinsa. Tämän jälkeen viljelymedium korvattiin e 15 vatulla seerumittomalla tuotantomediumilla. Tätä mää käytettiin antamalla mikrokantajien laskeutu rin pohjalle, poistamalla kasvatusmedlum imulla j maila se tuotantomediumilla. Tätä toistettiin si | kunnes oli saavutettu 3 125-kertainen laimentumi: 20 tettavissa olevien tuotantosyklien määrä on 2 - kin syklissä solujen annettiin tuottaa 4-7 päi minkä jälkeen 80 % tuotantomediumista koottiin » I · • *· Tätä toistettiin siihen asti, kunnes solut olivi ♦ ·· I.* neet kokonaan mikrokantajien pinnalta.

• · · 25 sIL-15:n puhdistamiseen ja proteiinin va » > a : *' seen tämän N-aminohapposekvenssin selvittämiseks tiin noin 64 litraa CV-l/EBNA-solujen kasvatuksee · tyä mediumia. Puhdistuskaavioon sisältyi kuviossa tyllä tavalla ultrasuodatus, hydrofobinen kroma 30 anioninvaihtokromatografia, korkean suori tuskyv ***** teisfaasinestekromatoarafia iRP-HPLC^ 1a natriumd 20 raan PVDF-membraanilta. N-terminaalisen aminohap soinnin avulla selvitettiin ensimmäiset 33 ami jotka on esitetty SEKVENSSISSÄ ID NO:3. Myöhemmin tun CV-l/EBNA:n cDNA-kirjestosta saadun cDNA-klo

5 vensoinnin avulla saatiin selville SEKVENSSIN ID

kaista polypeptidiä koodaava DNA-sekvenssi. Täx sisältää SEKVENSSISTÄ ID NO:2 peräisin olevan suh lyhyen 48 aminohapon mittaisen johtosekvenssin ja SIN ID NO:3 edustaman kypsän polypeptidin.

10 Yhdistelmä-DNA-eenetelmät.

Humaani-IL-15-polypeptidejä, apinan IL

peptidejä ja muiden nisäkkäiden IL-15-polypeptide taan edullisesti yhdistelmä-DNA-menetelmillä. Näi telmiin sisältyy se, että humaani-IL-15-polypep 15 jonkin muun nisäkkään IL-15-polypeptidiä tai tämä naista koodaava cDNA liitetään ilmentämisvektori

Nisäkkäiden IL-15-polypeptidien tai näide naisten tuotannossa yhdistelmä-DNA-menetelmillä muksena, että ensin eristetään DNA-klooni (tois

20 cDNA), joka ilmentyessään koodaa nisäkkäiden IL

peptidiä tai tämän johdannaista. cDNA-kloonit ov ,V. sin nisäkkäiden IL-15-polypeptidejä ilmentävist * # · .·/. risista soluista tai solulinjoista. Ensimmäiseks • ** ly tään solujen kokonais-mRNA ja mRNA:sta valmisteta

; 25 cDNA-kirjasto käyttäen käänteistranskriptiota. T

t « » : sinnössä esitettyä DNA:n sekvenssi-informaatiota m m * *·ί·* voidaan eristää ja tunnistaa cDNA-klooni, jota » » » : käyttää lajienvälisessä hybridi säätiössä käytettä timen tai PCR-alukkeiden suunnitteluun edellä : 30 tavalla.

»««

«1« —_ · _ * . . _ —jm -i -| · . , -1-1 J

21 käyttää genomista DNA:ta, j oka sisältää asiaa nisäkkäiden IL-15-polypeptidien ilmentymistä nukleotidisekvenssejä. Eristetty cDNA voidaan ; tällä alalla tunnetuin menetelmin, minkä tarkoit 5 edistää IL-15:n biologista aktiivisuutta sisälti 15:n johdannaisten tai analogien valmistusta.

Yhdistelmä-ilmentämisvektorit sisältävät s siä tai cDNA:sta peräisin olevia DNA-fragmentte koodaavat IL-I5:tä tai tämän biologisesti aktiiv 10 dannaisia. 1L-I5:ttä tai tämän johdannaista koo< on liitetty toiminnallisesti sopivaan transkrip' translaation säätely- tai rakennenukleotidisek kuten nisäkkään, mikrobin, viruksen tai hyönte: nelstä peräisin olevaan sekvenssiin. Esimerkkejä 15 sekvensseistä ovat esimerkiksi geneettinen sekven la on säätelytehtävä geenien ilmentymisessä (es transkription promoottori tai käynnistäjät), ma operaattorisekvenssi transkription ohjaamiseksi, si, joka koodaa sopivia ribosomien sitoutu 20 mRNA:ssa, ja sopivat transkription ja translaat tusta ja lopetusta ohjaavat sekvenssit. Nukleotid .V. sit on liitetty toiminnallisesti silloin, kun sä » * *

!*. venssi liittyy toiminnallisesti rakennegeeniin. E

l / si signaalipeptidin (erittymisen johtosekvenssin) • * » 25 venssi voi olla liitetty toiminnallisesti nisäkk * * * • ·* 15:n DNA-sekvenssin tai tämän johdannaisen rake DNA-sekvenssi in, jos signaalipeptidi esiintyy o; *·φ : kursorin aminohapposekvenssiä ja osallistuu ni IL-15:n erittymiseen. Lisäksi promoottorin nu : 30 sekvenssi liittyy toiminnallisesti koodaavaan se * · 9 ***** /AsfiRerlrilrs1! ralrennenoArrl n nrn 22 15:ttä koodaavaan sekvenssiin), jos ribosomien si kohta vektorissa sijaitsee translaatiota edistäv dassa.

Sopivia isäntäsoluja nisäkkäiden IL-15:n 5 johdannaisten ilmentämiseksi asiaankuuluvien prom ohjaamana ovat prokaryootit, hiiva tai korkeamme oottisolut. Prokaryootteja ovat gramnegatiiviset positiiviset organismit, esimerkiksi E» coli tai set. Sopivia prokaryoottisia isäntäsoluja transfo 10 ovat esimerkiksi E· coli. Bacillus subtilis, S typhimurium ja useat muut Pseudomonas-, Streptoi Staphylococcus -sukuihin kuuluvat lajit. Edempi tyiskohtaisemmin kuvattavalla tavalla ovat es sopivista isäntäsoluista myös hiiva, kuten S. ce 15 nisäkässolulinja, kuten kiinanhamsterin raunas (CHO-solut) tai hyönteissolut. Nisäkkäiden IL-tämän johdannaisten tuotantoon voitaisiin myös solut torni a translaatiojärjestelmiä tässä keksinnö tuista DNA-konstruktioista peräisin olevia RNA-mo 20 käyttäen. Asiaankuuluvia kloonaus- ja ilmentämis ta, jotka soveltuvat käytettäväksi bakteeri-, sie .V. va- ja nisäkässoluisäntien yhteydessä, on kuvatt 4 t * I** kiksi teoksessa Pouwels, et ai., Cloning Vectors • »· .* ratory Manual, Elsevier, New York, 1985.

ft ft 4 25 Kun nisäkkäiden IL-15:ttä tai tämän joh * . .

* ·* ilmennetään hiivaisäntäsolussa, niin nukleotidi (esimerkiksi nisäkkäiden 1L-I5:n tai tämän joh # * » : ilmentymistä koodaava rakennegeeni) voi sisälti sekvenssin. Hiivasolu voi johtosekvenssin avulli : 30 translaatiossa syntyneen polypeptidin erittymist

Ml n _ -| - 23 1 sisältävät usein 2p-hiivaplesmidista peräisin oli likaation aloitussekvenssin, autonomisesti repi sekvenssin (ARS), promoottorialueen, polyadenyl venssit ja transkription lopetussekvenssit. Hiiv 5 sisältävät edullisesti replikaation alkukohtasekv selektiomarkkerin. Hllvavektoreille sopivia pro sekvenssejä ovat metallotioneiinipromoottori, 3-seraattikinaasin [Hitzeman, et ai., J. Biol. C (1980) 2073] promoottori tai muiden glykolyytti! 10 syymien [Hess, et ai., J. Adv. Enzyme Reg. 7 (196 Holland, et ai., Biochem. 17 (1978) 4900], kute; s in, glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenasin, he sin, pyruvaattidekarboksylaasin, fosfofruktokinaa koosi-6-fosfaatti-isomeraasin,3-fosfoglyseraatti 15 pyruvaattikinaasin, trioosifosfaatti-isomeraasin lukoosi-isomeraasin ja glukokinaasin, promoottor sopivia vektoreita ja promoottoreita, jotka s käytettäväksi ilmentämiseen hiivassa, on kuvattu kohtaisemmin Hitzeman, EP-hakemusjulkaisussa 73 20 Hiivavektoreiden kokoonpanoon voidaan käy merkiksi pBR322:sta peräisin olevia DNA-sekvensse soveltuvat selektioon ja replikaatioon E. colis * * * ,·/: geeni ja replikaation aloituskohta). Muita hiivan * t# venssejä, joita voidaan ottaa mukaan hiivailment ...

,* * 25 truktioon, ovat glukoosilla repressoituva ADH2-pr : i ja α-tekijän erityksen johtosekvenssi. ADH2-pro « i · *···* ovat kuvanneet Russel, et ai. [J. Biol. Chem. 2 V : 2674 ja Beier, et ai. [Nature 300 (1982) 724. ] tekijän johtosekvenssi ohjaa heterologisten poly ί,ϊ): 30 erittymistä, a-teki jän johtosekvenssi liitetään u ***** mnn'h'fwt 4a raVannA/taan^ v\ Ί 4 24 sältää yhden tai useamman restriktiokohdan. Tämj johtosekvenssin fuusiointia rakennegeeniin.

Hiivan transformaatiomenetelmät ovat tä ammattikokemuksen perusteella tunnettuja. Hinnen 5 Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75 (1978) 1929, kuvaa laista menetelmää. Hinnen, et ai.' :n menetelmässä daan Trp+-transformantteja selektiomediumissa selektiomediumin koostumus on 0,67 % hiivan ty; ravinnetta, 0,5 % kasaminohappoja, 2 % glukoosia, 10 adeniinia ja 20 mg/ml urasiilia.

ADH2-promoottorisekvenssin sisältävillä vei transformoituja hiivaisäntäsoluja voidaan kasvatt tämisen indusoimiseksi "rikkaassa" mediumissa, rikkaasta mediumista on medium, joka sisältää 1 15 uutetta, 2 % peptonia ja 1 % glukoosia ja jonka miseen on käytetty 80 mg/ml adeniinia ja 80 mg/m lia. ADH2-promoottori derepressoituu glukoosin loppuun mediumista.

Prokaryootti-isäntäsolussa, kuten E. col: 20 nisäkkään IL-15 tai tämän johdannainen sisältää toisesti N-terminaalisen metioniiniryhmän, joll« .V. koitus edistää yhdlstelmäpolypeptldin ilmentymä * * · karyootti-isäntäsolussa. N-terminaalinen Met void / koa ilmentyneestä nisäkkään yhdistelmä-IL-15:sta » i i ill 25 Nisäkkään yhdistelmä-IL-15:n rakennegeeni • · 1 : * tidisekvenssin tai tämän johdannaisen sisältävät ί·1 mäilmentämisvektorit transfektoidaan tai transf 25 mistaa monistuminen isännässä. Muut käyttökelpo: karyootti-isäntäsolujen iImentämisvektorit sisält pallisesti saatavilla olevista plasmideista perä van bakteeriperäisen selektiomarkkerin. Tämä sele! 5 keri voi sisältää kloonausvektorin pBR322 (ATC geneettisiä elementtejä. pBR322 sisältää ampisil tetrasykliiniresistenssigeenit ja siitä saada käyttöön yksinkertainen keino transforraoituneide tunnistamiseksi. pBR322:n "runko"-osat yhdistetää 10 kuuluvaan promoottoriin ja nisäkkäiden IL-15:n geenisekvenssiin. Muita kaupallisesti saataviin vektoreja ovat esimerkiksi pKK223-3 (Fharma< Chemicals, Uppsala, Ruotsi) ja pGEMl (Promegs Madison, WI, USA).

15 Prokaryoottistenisäntäsoluyhdistelmäilmen torien kyseessä ollessa käytetään yleisesti pro sekvenssejä. Tavallisia promoottorisekvenssejä o laktamaasi (penisiliinaasi), laktoosipromoottorij mä [Chang, et ai., Nature 275 (1978) 615; ja Go 20 ai., Nature 281 (1979) 544], tryptofaani (trp)-p rijärjestelmä [Goeddel, et ai., Nucl. Acids Res. 4057; ja EPÄ 36 776] ja tac-promoottori [Sambrook » « « l \ Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spri I .* Laboratory, (1989)]. Erityisen käyttökelpoisessa « * » 25 oottisessa isäntäsoluilmentämisjärjestelmässä käj • * : ·* faagin PL-promoottoria ja lämpölabiilin cl857ts-re sekvenssiä. Plasmidivektoreita, jotka ovat saatav «· · letuslaitoksesta American Type Culture Collectii sisältävät λ:η PL-promoottorin johdannaisia, ovat

:Γ; 30 pHUB2 [tämä sisältyy E. coli -kantaan JMB9 (ATG

.·*·. Ha r+-ämä eieälfvv P r>r»1 H RP1 ·αοη f 1ΦΓΓ R

26 solujen COS-7-solulinjät [Gluzman, et ai., Cell : 175; ATCC CRL 1651], L-solut, C127-solut, 3T3-SO CCL 163), CHO-solut, HeLa-solut (ATCC CCL 2) ja : CRL 10) -solullnjat. Sopivat nisäkäsilmentämi 5 sisältävät transkriptioon osallistumattomia elei kuten replikaation alkukohta, promoottoris rakennegeeniin liittyvä käynnistäjäsekvenssi, n venssiä ympäröivät 5' - tai 31-puoleiset trans osallistumattomat sekvenssit, kuten ribosomin si 10 kohdat, polyadenylaatiokohta, silmukoinnin do: akseptorikohdat ja transkription terminaatiosekv Nisäkäs i säntäsoluilmentämisvektoreiden s transkription ja translaation ohjaussekvenssit saada viruslähtömateriaaleista. Esimerkiksi tav 15 käytetyt nisäkässolujen promoottorisekvenssit ja täjäsekvenssit ovat peräisin polyomasta, adenovir Simian Virus 40:stä (SV40) ja humaanisytomegalovi SV40-viruksen genomista peräisin olevia DNA-sek esimerkiksi SV40:n alkukohtaa, varhaista ja myöhä 20 moottoria, käynnistäjää, silmukointikohtaa ja p laatiokohtia, voidaan käyttää sellaisten muiden g .V. ten yksiköiden saamiseksi käyttöön, joita tarvita i · « #·/. negeenin sekvenssin ilmentämiseen nisäkäsisänt ly Virusten varhaiset ja myöhäiset promoottorit ova ; 25 sen käyttökelpoisia, koska näitä molempia saadaan • * * : ·* virusgenomista fragmenttina, joka voi myös sisält *-i·* sen replikaation alkukohdan [Fiers, et ai·, Ni : (1978) 113). Voidaan myös käyttää pienempiä tai SV40:n fragmentteja, edellyttäen, että niihin 30 noin 250 ep:n suuruinen sekvenssi, joka ulottuu ·"** _IrnKHae+a rnlrean ranl ‘llfoaf Ίηη a 1 Iriaoc> 27 kelpoisia nisäkäs!lmentämisvektoreita on kuvat 1 tenttihakemuksessa nro 07/480 694, joka on 14.2.1990, ja US-patenttihakemus nro 07/543 193 jätetty 5.6.1990.

5 Nisäkkäiden yhdistelmä-IL-15;n puhdistus IL-15-polypeptidejä voidaan valmistaa vil transformoituja isäntäsoluja sellaisissa vilje teissä, jotka ovat tarpeellisia nisäkkäiden IL-15 tidien tai näiden johdannaisten ilmentämiselle. T 10 saatuja ilmennettyjä polypeptidejä voidaan tämä: puhdistaa viljelymediumista tai solu-uutteista, den IL-15-polypeptidi tai tämän johdannainen voi sentroida käyttäen kaupallisesti saatavilla olev iinien konsentrointisuodatinta, esimerkiksi Am: 15 Millipore Pellieon -ultrasuodatusyksikköä. Kasva voidaan käsitellä joko konsentraatiovaihetta käy ilman tätä vaihetta puhdistusmatriksilla, kuten h sella kromatografiamediumllla. Edullinen medium Sepharose* CL-4B (Pharmacia). Vaihtoehtoisesti 20 käyttää anloninvalhtohartsia, esimerkiksi sella riksla tai substraattia, jonka on ulkopinnaltaa liaminoetyyli (DEAE) -ryhmien peitossa. Matrikse * * * olla akryyliamidi, agaroosi, dekstraani, sellu! • ♦· l .* muita proteiinien puhdistamisessa tavallisesti kä t I i 25 mat riksi tyyppejä. Vaihtoehtoisesti voidaan käytt • * · * ·' suodatusmediumia. Yhdistelmä-IL-15 on stabiili b *·!·* vesipitoisissa puskureissa ja voidaan myös käytt * · · : ninvaihtohartsia.

IL-15:n lisäpuhdistamiseen voidaan käyttä : 30 yhtä tai useampaa korkean suorituskyvyn käänteis ··· . . _ «j . _Λ «vviT n \ j , , t . . . „ , 28 myös käyttää huomattavan homogeenisen yhdistelmäp aikaansaamiseen. Vaihtoehtoisesti voidaan myös joitakin vaiheita tai kaikkia niitä vaiheita, käytetty edellä kuvatussa apinan IL-15:n puhdistu 5 mässä.

Bakteeri viljelmässä valmistettu yhdistelmä eristetään tavallisesti hajottamalla ensin isä sentrifugoimalla materiaali, uuttamalla polypept napeista, jos tämä on liukenematon, tai superna 10 jos tämä on liukoinen, minkä jälkeen suoritetaan useampi konsentrointi, ulossuolaus, ioninvaihto kluusiokromatografiavaihe. Lopuksi viimeisiin p vaiheisiin voidaan käyttää RP-HPLC:tä. Mikrobisi daan hajottaa millä tahansa käyttökelpoisella me 15 lä, mukaan lukien peräkkäiset jäädytys-sulatu ultraäänikäsittely, mekaaninen hajotus tai soluja vien aineiden käyttö.

Transformoituja hiivalsäntäsoluja käytetä^ sesti IL-15:n ilmentämiseen eritettynä polypeptid 20 yksinkertaistaa puhdistamista. Eritetty yhdistelm tidi, joka on peräisin fermentaatiosta hiivaisänt •V. voidaan puhdistaa sellaisten menetelmien suhteen .·/: silla menetelmillä, joita ovat kuvanneet Urdal, €

Chromatog. 296 (1984) 171]. Urdal, et ai. kuvaa .1*1 25 peräkkäistä käänteisfaasi-HPLC-vaihetta humaani- « « » : mä-IL-2:n puhdistamiseen preparatiivisessa HPLC- « e « M*' sa.

: Nisäkkäiden IL-15-polypeptidl ja tämän jo ten koostumusten antaminen t.\i 30 Tästä keksinnöstä saadaan käyttöön menete

««< _ J

29 dannaista oireisiin soveltuvalla tavalla. Site anemian muodon estämiseen voidaan IL-15-koostumuk injektoimalla boli-injektiona, infusoimalla ja antamalla niiden vapautua jatkuvasti implante 5 käyttämällä jotakin muuta sopivaa menetelmää. An voidaan käyttää suonensisäistä ruisketta, ih ruisketta tai parenteraalista tai intraperito infuusiota. Terapeuttisena aineena käytettävää annetaan tyypillisesti farmaseuttisen koostumukse 10 sa, joka sisältää puhdistettua polypeptidiä fysio hyväksyttäviin kantaja-aineisiin, lisäaineisiin mentimiin yhdistettynä. Nämä kantaja-aineet ovat siä potilaille käytetyissä annoksissa ja konsent sa. Tällaisten koostumusten valmistusmenetelmät s 15 tavallisesti sen, että nisäkkään IL-15-polypei tämän johdannainen yhdistetään puskureihin, anti teihin, kuten askorbiinihappoon, pienimoolimassai hemmän kuin noin 10 ryhmää sisältäviin) polypep proteiineihin, aminohappoihin, hiillhydraatteih; 20 ovat glukoosi, sakkaroosi tai dekstraanit, ke aineisiin, kuten EDTA:han, glutationiin ja muih ,V, lointlaineisiin ja lisäaineisiin. Esimerkkejä asi • · « lm'· vista laimentimista ovat neutraali puskuroitu fys • ♦ * ! / suolaliuos tai fysiologinen suolaliuos, joka on y ***** 25 samanlajiseen seerumialbumiiniin.

« · · : ·* Seuraavat esimerkit on esitetty ainoasta *·!.* mistarkoitukeissa eikä rajoittamaan tätä keksint 0: Esimerkki 1

Natiivin sIL-15:n puhdistus ja sekvensoin : :*: 30 Ultrasuodatus • « « ·«· _ _ _ | - _ . * _ . _ . . _ 30 suodatuslaitteissa käyttäen joko YM10- tai YM30- kasettia, onttokuitukasettia tai kiekkomaista me

Edullinen oli kuitenkin Amicon-ultrasuodatusjär jossa käytettiin YM30-spiraallkasettia. Ennen tät 5 ta tai sen jälkeen ei tarvittu puskurien vaihtoa

Epähomogeeninen proteiini liuos, toisin san jen kasvatukseen käytetty medium, hankittiin käyt vattamalla CV-1/EBNA-soluviljelmiä seerumittoma: mediumissa, josta fenolipuna oli jätetty pois, b 10 reissä, joissa käytettiin 5 g/1 Cytodex· 3-mikro

Materiaali kahdeksasta kahdeksan litran biore (yhteensä noin 64 litraa) koottiin talteen, sen tiin solujen ja mikrokantajien poistamiseksi, suo 0,22 mikrometrin selluloosa-asetaattimembraanisu 15 läpi ja konsentroitiin sitten noin 2 litran lopp teen käyttäen YM30-spiraalikasettia. YM30-kons

suodatetaan ennen hydrofobista kromatografiaa. T

minimoi kontaminoitumista poistamalla bakteereja partikkelimuotoisia materiaaleja. Voidaan käyttä 20 sellaisia suodattimia, joiden huokoskoko on 0, mikrometriä ja jotka eivät sido proteiinia, edul .V. kuitenkin 0,2 mikrometrin selluloosa-asetaattim * * · * \ suodatin.

• · » • ··

Hydrofobinen kromatografia I [li 25 Hydrofobisesta kromatograflasta saatiin I · · · * ;* nopea keino proteiinin siirtämiseksi suolapltois ’*:·* pieneen puskuriin, joka voitiin johtaa anion : kolonneihin. Lisäksi se tuotti 3 - 6-kertaisen pu sen. Ennen tätä vaihetta tai sen jälkeen ei myös 30 vittu puskurien vaihtoa. Käyttöön soveltuvat ui 31

Ultrasuodatuskonsentraattiin lisättiin määrä ammoniumsulfaattia, että tämän lopulliseksi raatioksi saatiin 0,2 M. Ultrasuodatuskonsentraat roitiin sellaisella määrällä 1 M HEFES:iä, jonh 5 noin 8,5, että tämän lopulliseksi konsentraatioks noin 20 mM. Konsentraatti pumpattiin Phenyl Si -CL4B -kolonniin ja tämä pestiin sitoutumattoman nin poistamiseksi seoksella, joka sisälsi 0,2 M sulfaattia ja 10 mM HEPES:iä, jonka pH oli noin 10 toutuneet proteiinit eluoltlin 10 mM HEPES:lla, oli noin 8,5. Eluoitu proteilnipilkki (tämä IL-15:ttä) j ohdettiin anioninvaihtokolonniin.

Anioninvaihtokromatografia

Puhdistus anioninvaihtokromatografiällä 1 15 dolliseksi lisäpuhdistuksen tarvitsematta dialj puskurien vaihtoa. Tämä valhe sisälsi edullisc että yhdistetyt Phenyl Sepharose* -proteiinifrakt teltiin kaksi kertaa anioninvaihtomediumia sis kolonneissa. Sitoutuneet proteiinit eluoitiin ki 20 sittelyn jälkeen HEPESiiin valmistetulla NaClilla kin käyttöön soveltuivat useat erilaiset anionin I diumit ja puskurijärjestelmät, joiden pH oli n< * * e·/· noin 9:ään. niin DEAE-Sephaoel*:n (Pharmacia) 1.* jälkeen käytetty Mono-Q mahdollistivat per 25 anioninvaihtovaiheiden käytön ilman puskurien va * * · : ·* dialyysiä. DEAE-Sephacel·:n avulla kyettiin p • « * '·*·* jonkin verran kontaminoivista proteiineista em **« : riaalin käsittelyä paremman erotuskapasiteetin nopeaan suoritukseen perustuvalla nestekromato 30 ("FPLC", Pharmacia). Mono-Q:ta käyttäen. Käytel * k K _ .

32

NaCl:a lisättiin Phenyl Sepharosesta saat (Pistettyihin fraktioihin edullisemmin sei laine että lopullinen johtokyky oli noin 1,2 milli senttimetriä kohti ("mS/cm") (alle noin 0,1 M 5 tämä pumpattiin DEAE-Sephacel·-kolonniin, joka < painotettu noin 0,1 M NaClzlla noin 10 mM HEPES: i ka pH oli noin 8,5* Sitoutuneet proteiinit eluoit aarisella gradientilla, jonka konsentraatio ne 0,1-M:isesta noin 0,3-M:iseen NaClziin noi 10 HEPESzissä, jonka pH oli noin 8,5. Eluoidut a proteiinifraktiot (nämä sisälsivät IL-15:ttä) yhd käsiteltäväksi Mono-Q-anioninvaihtokolonnissa.

Yhdistetyt aktiiviset DEAE-Sephacel*-frak

mennettiin sellasisella määrällä noin 10 mM HEPES

15 seoksen lopulliseksi johtokyvyksi tuli alle 1,6 n le 0,14 M NaCl). Laimennetut yhdistetyt fraktio tiin tämän jälkeen kolonniin, joka oli nopeaan pr nestekromatografiaan käytettävä Mono-Q-FPLC-ko joka oli tasapainotettu noin 0,14 M NaClzlla n 20 HEPESzissä, jonka pH oli noin 8,5. Sitoutuneet p eluoitiin gradientilla, jossa NaClzn konsentraat 0,14-Mzisesta noin 0,5 Mziseen konsentraatioon, r .·/: HEPES:issä, jonka pH oli noin 8,5. Aktiiviset ly (nämä sisälsivät IL-15:ttä) yhdistettiin niiden k .1 l 25 miseksi korkean suorituskyvyn käänteisfaasinest » * · : i grafiällä (RP-HPLC).

:···: RP-HPLC

« « * *** * Nisäkkäiden natiivi IL-15-polypeptidi on pH-arvosta noin 7 pH-arvoon noin 9 ja suunnille 30 vossa 2,5 asetonitriiliin ("AcN") valin n 1 O . J__J__j r*·.____j i_l__l________/. r- 33 C4-RP-HPLC-kolonne! 11a (Vydac1-, 0,46 x 25 cm, 5 käänteisfaasikolonnit (C8 tai C18) eivät toimin teiini eluoltul C4:stä suuressa AcN-konsentraati sitä saatu lainkaan talteen C8:sta tai C18:s 5 puskurijärjestelmät, joita yritettiin käyttää, t noen ammoniumasetaatti/metanoll, jonka pH oi pyridiiniasetaatti/propanoli, eivät tuottaneet tuloksia.

RP-HPLC-puhdistukseen sisältyi edullises 10 Mono-Q:sta saatujen yhdistettyjen aktiivisten fr käsittelyä Vydac™-C4-matriksissa. Ensimmäisessä lyssä aktiiviset Mono-Q:sta saadut yhdistetyt pumpattiin C4-HPLC-kolonniin virtausnopeudel 1 ml/min ja ne eluoitlin gradientilla, joka alku

15 sisälsi seoksen, jonka koostumus oli 0,1 % TF

loppuvaiheessa seoksen, jonka koostumus o] TFA/100 % AcN ja sitä käytettiin muodostamalla g seuraavalla tavalla: 0 - 45 % AcN, 1 % AcN:ää minuutissa 20 45 - 60 % AcN, 0,5 % AcN:ää minuutissa 60 - 100 % AcN, 2 % AcN:ää minuutissa | Aktiivisen piikin fraktiot (nämä s .·/: IL-15:ttä), eluoituvat noin 48 - noin 51-%:isells * «·

Biologisella määrityksellä määritetyt aktiiviset ,11 25 yhdistettiin, laimennettiin 0,l-%:isen TFA:n ja H; : ;* sei la AcN-konsentraation pienentämiseksi ja niitä * · ***** tiin samassa C4-kolonnissa.

* * · ’·* * C4-TFA/AcN-ajosta valmistetut aktiiviset tut yhdistetyt fraktiot pumpattiin takaisin C4-k 5.:«: 30 pestiin 0,l-%:isen TFA:n ja H20:n seoksella ja » · » * « πα1 1 aaI 1 e 14 ba! 1 a 4 am^4 11a 4 aaIva a 1 34 ritys IL-15:ttä sisältävien fraktioiden tunnisti IL-15:ttä sisältävät fraktiot yhdistettiin.

SDS-PAGE

Puhdistettu IL-15 voidaan visualisoidi 5 värjätyllä SDS-PAGE:11a. SDS-PAGE:11a eristetyin tetuille nisäkkäiden IL-15-proteiinivyöhykkeill€ suorittaa elektroblottaus ja analysoida niiden te: set N-terminaaliset aminohapposekvenssit. 1L-15- voidaan tunnistaa biologisella määrityksellä.

10 C4-TFA/n-propanoli-HPLC-ajosta peräisin oi distetut IL-15-protelinifraktiot kuivattiin vakuumikuivauksella kuivaksi, suspendoitiin uudel kistävään SDS-näytepuskuriin ja ajettiin SDS-pol amidigeelissä. HPLC:llä puhdistetulle 1L-I5:lle 15 tiin SDS-PAGE-ajo (Phastgel· 8 - 25 %, Pharmacia sesti kahdessa vierekkäisessä kanavassa.

Phastgel9-kanavasta leikattiin ennen kiinnitystä jäystä 1 mm:n suuruisia geeliviipaleita ja ne suoraan biologisiin määrityksiin. Loppuosa geeli 20 tettiin ja hopealla värjäytyneet vyöhykkeet so yhteen biologisiin märityksiin käytettyjen lelkke .V. teen. IL-15-aktiivisuus vastasi 15 - 17 kDa:n ko * · · ,·/: distettu IL-15 suspendoitiin uudelleen pel * · 1/ SDS-näytepuskuriin ominaisaktiivisuuden määritt l 25 ajettiin 14-%:isessa SDS-polyakryyliamidigeeliss : ;* ja värjättiin hopeavärjäyksellä. 15 - 17 kDa:n s # * * **"’ sIL-15-polypeptidien puhtausaste oli noin 220 00

Ml : nen CVl/EBNA:n kasvatukseen käytetyissä mediumeis sIL-15-polypeptidin puhtausaste puhdistuskaavic :.:.J 30 (taulukko 2). Taulukossa 2 on puhtaus- ja protei • * * 35 PVDF-bXotti 14-%:inen SDS-polyakryyliamidigeeli b PVDF-membraanille (ProBlot·, hankittu yhtiöstä

Biosystems) käyttäen vakiovirtaa noin 60 V jän 5 noin yhden tunnin ajan. Proteiini vyöhykkeet visua värjäämällä PVDF-membraani koomassiesinellä (0 liuos 10-%:isen etikkahapon ja 50-%:isen metano: sessa). Väri voidaan proteiinivyöhykkeiden esil! seksi poistaa membraanista käyttäen samaa liuos 10 koomassiesiniväri on jätetty pois. IL-15-akti vastaava proteiini vyöhyke leikattiin irti ja N-te nen proteiinisekvenssi määritettiin suoraan PVDF nista.

« » • t » * i i • « * φ ♦ · « • · • · « I · • ♦ ♦ • « ·· <

« · I

• « « 9 9

» · V

f 1 · *·· «M • · » • · 9 9 9 •99 • 99 • 99 99 9 9 36

Oi m dj · · o (Ö -HJi s· σ> 2 2 o 5 S «-S h h co tn w ω ° φ £58 w s

H dt Ή M

O

G

•H 1 I

W M M · · "" •H -H > i O) 2 2 m Μβ (i ‘H ^ ä ^ ^

M G *H « Tl \ O ^ σ\ CO ω W O

<U ·Η f> 3 M «0 * v vk a 3ΛΟ h h CO * in Λ O (B « >*X w CS) ^ *2 i o o o ^ h mitt o o o -s* o o o

S ·Η ·Η --0 O O O S< O O O

g a* > JS <n o o o 3 G -H 2 o o o

li O Ή M *H O O in O CO (S

7, +» 3 co f-i σ\\οσ\ co co <s g Oä 3Λ σ> co co es B M nj n >i m h h *- ta +J _ w i o o o s< uo o o o

a *H« O O O'-θ'* O O O

5 > I H H O fHVDin o o o 0 >r| g v

ij -H M -H \ CO in [> O O O (N

£ +J 3 » ad CN -«φ CN

3 i 3ΛΟ es ** es § 2 w >.Ji ^ 1 » w ietjiD) e — —

Ml Ή *H Ö> LO · · D> O

2 a) *h es e io 2 2 a G

M βφνκ k** 2 0+»C0C0C0iOWWvO^i s- .iti O fv n v- L> OM ^ h φ ^ a ^ \ ,, e ·· - -H I (5 H ' y ·* 5 m G μ g O o o 2 ^ : S +>ομ \ i o o h · J co • · S OJiGOOl ·“I CO CO W W 00 .\\ Sm-ho-hao w

·.·.* 3 SU G CO V ^ -S' CS *H

• · * t! • * *0 »

• * s CO

* « 3

• * · (rt p rHHHHHH

$ g H e 6 ε 6 6 e *·» g

S *H UO «H VO .H .H

n H (0 es

G

• r-( : : : o 2 ·*· cfl I S' O 2 ··· I fll ιΛ ^ ίΛ 37 1 Suluissa esitetyt arvot ovat arvioita ] jätystä SDS-PAGE:sta. Muut proteiiniarvot mää: Biorad Microprotein Assay (BSA-standardi)-määrit: 2 Aktiivisuus määritettiin biologisella CT! 5 rityksellä 3 E.M. * ei määritetty sIL-15-polypeptidin sekvensointi

Edellä olevasta RP-HPLC-vaiheesta tuloksi 10 IL-15-preparaatti analysoitiin SDS-PAGE:lla. KuJ

värjättiin hopeavärjäyksellä proteiinivyöhykkeide nin näkyviin saattamiseksi. Näkyviä vyöhykkeitä v ta vär jäämät tömistä geeliviipaleista suoritetut b määritykset osoittivat, että IL-15-aktiivisuus as 15 proteiineihin, joiden suhteelliset moolimassat < 17 kDa. PVDF-membraanille blotatun 15 - 17 kDa:n polypeptidin N-terminaalinen pää sekvensoitiin Edi tuksella Applied Biosystems -yhtiön proteiinier sointilaitteessa. Tuloksista kävi ilmi SEKVENS 20 NO:3 esitettyjen ensimmäisten 33 aminohapon ide Kun apinakirjastosta saatu cDNA-klooni myöhemmii .V. soitiin, niin tästä saatiin sekvenssi, joka koo< VENSSIN ID NO:2 mukaista polypeptidiä. SEKVENSSI: * *· β*β·] mukainen polypeptidi sisältää suhteellisen lyhye: * 4 4 ,1 ! 25 nohapon mittaisen johtosekvenssin ja kypsän poly : ;* jota edustaa SEKVENSSI ID NO:3.

Esimerkki 2 '* 1 Biologinen määritys CTLL2-soluista saadaan käyttöön nopea j m 30 biologinen raäritys IL-15-polypeptidien havaitsi 38 (Avanzi et ai., Br. J. Haematol. 69 (1988) 355 (Kitamura, et ai., J. Cell. Physiol. 140 (1989) CTLL-2-soluja kasvatettiin edullisesti glukoosipitoisuuden sisältävässä DMEM: ssa, jonka 5 misen oli käytetty noin 30 ng/ml IL-2:ta, 5 % f naudanseerumia (FBS) 5 x 10-5 M 2-merkaptoetanolia penisilliiniä, 50pg/ml streptomysiiniä ja 3 - 4, tamiinia 37 *C:ssa 10-%:isessa C02:ssa ja 97-%:is teudessa. CTLL-2 on tekijästä riippuvainen solui! 10 tarvitsee kasvaakseen lL-2:ta. Tästä syystä CT pestiin määritystä varten IL-2:n poistamiseksi suuren glukoosipitoisuuden sisältävällä DMEM:1] täydentämiseen oli käytetty 5 % FBS:ää, 5 x 10"5 kaptoetanolia, 50 u/ml penisilliiniä, 50 pg/ml 15 mysiiniä ja 3 - 4,0 mM glutamiinia. Määritettäv näytteet titrattiin DMEM:ssä, joka sisälsi 5 ‘ 96-kuoppaisissa tasapohjaisissa mikrotiitteri Pestyjä CTLL-2-soluja lisättiin kuoppiin (1 määritystilavuus 100 μΐ), 2000 solua/kuoppa ja 1 20 kuboitiin noin 24 tuntia 37 *C:ssa ja 10-%:isessi Levyjä käsiteltiin 3H-tymidiinipulssilla (25 μ .V. annoksella 0,5 pCi kuoppaa kohti noin 5 tunnin aj « * 4 J/· jälkeen ne koottiin talteen (96-kuoppainen Inotec * »· 1/ lujen talteenottolaite) ja cpm-arvot määritettiir .*I 25 Matrix 96 kaasutäytteinen verrannollisuuslasken * « * • telmä). Yksiköt laskettiin cpm-arvojen perust "···* näissä yksi yksikkö vastaa sitä mikrolitramääri *.* * saadaan 50 % maksimaalisesta stimulaatiosta.

Esimerkki 3

Jj/ 30 sIL-15:n cDNA-kloonin valmistus _ j _ __ . Λ 39 aminohappoa (Asn-Trp-VaX-Asn-Val-Ile) käytetti alukkeen suunnittelemiseen, joka oli degener seos, joka koodasi kaikkia mahdollisia kuuden en aminohapporyhmän kodonien käyttötapoja ja joka a 5 5'-AAYTGGGTNAAYGTNATH -3r sellaisena kuin tämä on esitetty SEKVENSSISSÄ jossa Y on T tai C? B on A, T tai C; ja N on A, 10 T. Apinan kypsän proteiinin N-terminaalisen päi happosekvenssejä 26 - 31 (Tyr-Thr-Glu-Ser-Asp-Val ti in sellaisen toisen alukkeen suunnitteluun, degeneratiivinen seos, joka koodasi aseman 3 s Vai:a lukuun ottamatta kaikkien aminohappojen 26 15 donien käyttötapojen komplementaarista muotoa ja 5?-ACRTCNGAYTCNGTRTA-3f j a 5'-ACRTCRCTYTCNGTRTA-3' 20 sellaisena kuin se on esitetty SEKVENSSEISSÄ ID 11, mainitussa järjestyksessä ilmoitettuna, joss ovat edellä olevan määritelmän mukaiset ja R on 1 · * · l *. Polyadenyloituja RNA-molekyylejä, jotka o ! / räisin 24 tuntia, 37 tuntia ja 72 tuntia forboli * · » ·’ 25 staatti-13-asetaatilla (PMA) stimuloiduista CV-1 • · · : ·’ luista, käytettiin erillisinä templaatteina en juos teen cDNA:n synteesiin. Osa ensimmäisen juost • * · : tioseoksesta lisättiin kaupallisesti saataville reaktioseoksiin, jotka sisälsivät oligonukleotid : 30 ta. Tälle seokselle suoritettiin 31 PCR-monis

«M

Ma «t **** i i . - i , _ > 40 55 °C:ssa, 53 *C:ssa ja 51 *C:ssa, käytettiin 2 joissa yhteenliittymislämpötila oli 49 °C.

Monistuksen jälkeen näytteet puhdistettiir le suoritettiin agaroosigeelielektroforeesi. Täst 5 92 emäsparin suuruinen DNA-fragmentti, joka ir CV-1/EBNA-soluihin liittyneestä kahdesta erillise tiosta peräisin olevasta geelikanavasta. 92 emäsp ruinen DNA-fragmentti puhdistettiin käyttäen Elu lonnia (Schleicher & Schuell, Keene, NH), kl 10 pBluescript SK":iin (Stratagene, La Jolla) ja k DNA:n sekvensointiin dideoksimenetelmällä.

Hybridisaatiokoetin valmistettiin var jatkokloonattu 92 emäsparin suuruinen DNA-fragme maila satunnaisalukkeita käyttäen. Hybrldisaati 15 käytettiin seulomaan osa plasmidikirjastosta, jok polyadenyloidusta CV-l/EBNA:n RNA:sta valmistett insertiosekvenssejä. Tämän tuloksena saatiin e klooni C85.SXL-15, joka sisältää SEKVENSSISSÄ ID tetyn nukleotidisekvenssin sisältävän avoimen 1 20 sen.

slL-15:n polypeptidiä koodaavan alueen nu sekvenssi on kuvattu SEKVENSSISSÄ ID N0:1. Tämä a · 4 oli peräisin siitä C85.sIL-15-insertiosekvenssii 1/ oli yhdistetty Sal I -kytkijällä ilmentämisvektoi ;.V 25 [McMahan, C. J., et ai., EMBO J. 10(10) (199: • f 2832] Sal I -kohtaan. CV-l/EBNA-solulinjasta valm polyadenyloitua mRNA:ta ja cDNA-molekyylejä valm * ** : vakiomenetelmiä käyttäen. CV-l/EBNA-solulinja on tuotantolinja. cDNA:n päihin kiinnitettiin Sal I ; 30 rit [Haymerle, et ai., Nucleic Acid Res. 1 • ti a ^ d ^ m 41 (SEKVENSSIT ID NO:7 ja 8, vastaavassa järjestyi moitettuna) ja nämä kloonattiin pDC406-vektoriin, tyt isolaatit, jotka sisälsivät noin 500 plasmid tävää yksittäistä isolaattia, maljättiin ja nämj 5 tiin käyttämällä hybridisaatiota DNA-koetinfrag DNA-koetinfragmentti valmistettiin käyttäen C solulinjan cDNA:n sIL-15-sekvenssien monistus avulla.

Esimerkki 4 10 Humaani-IL-15:n kloonaus sIL-15-koetin valmistettiin varustamalla s la satunnaisalukkeita käyttäen sIL-15:n cDNA:ta västä eristetystä, puhdistetusta ja radioaktiivia maila varustetusta Sal I -fragmentista (noin 15 Koettimen ominaisaktiivisuus oli noin 1 x 106 cpm tin hybridisoitiin Northern-bloteissa useista er materiaalilähteistä, joihin kuului IMTLH-solulinj sin oleviin humaani-mRNA-molekyyleihin. IMTLH-oli peräisin humaaniluuytimen stroomasoluviljeli 20 västä transformaatiosta pSVNeo:lla. Koetin hybri humaani-RNA-molekyyleihin noin 42 *C:ssa noin 40 formamidissa noin 18 tunnin ajan. Hybridisaatio) » » * e·/· materiaali pestiin 6 x SSC:ssa noin 10 * » 1 .* 22 eC:ssa, minkä jälkeen se pestiin 2 x SSC:ssa 25 noin 30 minuutin ajan. Autoradiografia paljasti p • ft 4 * ·* sen signaalin IMTLH-kanavassa.

Tässä esimerkissä käsiteltiin IMTLH-cDNA- ·.· * Sai Isllä pilkottujen yhdistettyjen prep

Southern-blotteja koettimilla humaani-IL-15-cDNA: :j*: 30 tävän yhdistelmän tunnistamiseksi. IMTLH-kirjas A A A · . . _ & A A ^ .A . .. 4 . . . . .. _ _ _ - __ 42 Tämän jälkeen maljättiin noin 4 000 "141":n pes niitä käsiteltiin koettimilla tavanomaisia pesäk saatiomenetelmiä käyttäen humaani-lL-15~cDNA:ta s kloonin tunnistamiseksi. Ainoastaan yhden

5 I41.hETF:n, osoitettiin koodaavan humaani-I

Identtisyysaste ihmisen ja apinan IL-15:n avoin kehysten nukleotidisekvenssien välillä on noin ja aminohapposekvenssien välillä noin 96-%sinen ja 5).

10 Esimerkki 5 CTLL-2:n lisääntymisen stimulaatio rIL-15 IL15:n kypsiä muotoja koodaavia cDNA-mo (nukleotidit 145 - 489, rajakohdat mukaan luett VENSSISSÄ ID N0:1 ja 4, liitettiin myötäsuuntaan 15 den heterologisen erityssignaalin suhteen sIL-' hIL-15:ttä vastaavien rIL-15-ilmentämisplasmidi] saamiseksi. Erityssignaali on suureksi osaksi yh nen hydrofobinen aminohappoalue (tämä sijaitsee sesti polypeptidin N-terminaalisessa päässä ja o 20 naalipeptidin N-terminaalisen pään ja kypsän e proteiinin N-terminaalisen pään välisen polypeptl tyrnistä ja pilkkoutumista [von Heijne, Eur. J.

• i ύ 116 (1981) 419]. Käytetty erityssignaali sekvenssi 1/ ren lL-7:n signaalisekvenssi. Valmistetut plasmid * 25 fektoitiin C0S-7-soluihin. Transfektoituneiden so # # · : ;* mien supematantlt stimuloivat CTLL-2:n lisää * * #

Lisäksi hIL-15:n prekursorimuotoa koodaava alue ( * * * V * ID NO:3) liitettiin pDC406:een ja transfektod EBNA-soluihin. pDC406:hIL-15:lla (esimerkiksi hET : 30 transfektoiduista soluista peräisin olevat super «1« — . . u , * j U 1 ^ li 1 , . ^ . , _ . . , _ .

43

Esimerkki 6 CTLL-2:n lisääntymisen indusointi rIL-15:!

Apinan yhdistelmä-IL-15 (apinan rIL-15) pi tiin sIL-15-cDNA:ta ilmentävän hiivan super™ 5 edellä esimerkissä 1 kuvatun puhdistusmenetelmän sella, josta ultrasuodatus- ja ioninvaihtovaihee-tetty pois. Apinan puhdistetun rIL-15:n biologis visuutta verrattiin puhdistetun yhdistelmä-II IL-4:n biologiseen aktiivisuuteen. Kaikkien kolnu 10 iinin puhtaus varmistettiin aminohappoanalyysilli kolmen puhdistetun proteiinin biologinen aktiivi; ritettiin in vitro -olosuhteissa käyttäen CTLL-: CTLL-2-viljelmät, jotka oli valmistettu 100 pl:aa nettyä kudosviljelymediumia, sisälsivät mainittua 15 nia ja niissä oli 2 000 solua viljelmää kohti. CT jelmiä käsiteltiin lyhytaikaisesti 0,5 pCi:llä [ diiniä viljelmää kohti 24 tunnin viimeisen 4 tun: na, solut koottiin talteen lasikuitusuodattimel] dioaktiivisuus määritettiin kaasuvyöryionisaatiot 20 en. CTLL-2-solujen lisääntymisvaste in vitro -olo määritettiin käyttäen nousevia konsentraatioita ; mä-sytokiinia (ilmoitettu yksiköissä ng/ml). Ko : kuviossa 6 on ilmoitettu soluihin kertyneen 3H-t * »i / cpm-arvoina (x 10*3).

!;*:* 25 Esimerkki 7 i * * * f CTL-solujen, LAK-solujen ja NK-solujen aktiivisuuden indusointi rIL-15:lla '·* * Antigeenispesifisiä sytolyyttisiä T-lymf< (CTL) valmistettiin in vitro -olosuhteissa. Yhdel * 30 luovuttajalta peräisin olevia periferaalisen vej .*··. ____, , y___* ... - .........

44 sytokiinia. Viljelmiä viljeltiin Widmer, M.B., 1 julkaisussa J. Exp. Med. 166 (1987) 1447 kuvaamal la, ne koottiin talteen 7 päivän kuluttua ja niis tettiin sytolyyttinen aktiivisuus stimulointiin a 5 käytetyltä verenluovuttajalta peräisin olevia 51Cr varustettuja kohdesoluja kohtaan. Solujen hajotus: seos sisälsi useita eri määriä reagoivia PBL-solu viljeltiin 1 000 leimalla varustetun kohdesolu 200 pl:ssa mediumia v-pohjaisissa kuopissa ja su 10 tit koottiin talteen neljän tunnin inkuboinnin Myyttiset yksiköt laskettiin sinä reagoivan vilje käänteisarvona, joka tarvittiin saamaan aikaan 50 maalisesta spesifisestä 51Cr:n vapautumisesta. Syt lä käsiteltyjä CTL-soluja koskevat koetulokset on 15 yhteenvetona kuviossa 7.

Lymfokiinien aktivoimia tappajasoluja (LAK tettiin edellä kuvattujen CTL-solujen suhteen ide viljelyolosuhteissa lukuun ottamatta sitä, että PBL-solu ja ei stimuloitu allogeeniseltä verenluov 20 peräisin olevilla säteilytetyillä PBL-soluilla sijaan käytettiin säteilytettyjä autologisia PBL-I ,v. sytolyyttinen aktiivisuus määritettiin lymfobla I · · 1 .·/· Daudi-soluiinjaa vastaan. Lyyttiset yksiköt 1 • »« J.1 LAK-määrityksen kyseessä ollessa sinä reagoivan 25 osan käänteisarvona, joka tarvittiin tuottamaan • · 1 * ;1 simaalisesta spesifisestä slCr:n vapautumisesta.

neillä käsiteltyjä soluja koskevat koetulokset on · yhteenvetona taulukossa 8.

Luonnollisia tappajasoluja eristettiin ero ϊβίβ2 30 tornista humaani-PBL-soluista, jotka oli eristetty Λ Λ.

45 tiin K562-erytroleukemiasolulinjaa vastaan. NK-mä kyseessä ollessa laskettiin lyyttiset yksiköt sin van viljelmän osan käänteisarvoja, joka tarvittu aikaan 30 % maksimaalisesta spesifisestä 51Cr:n v 5 sesta. Sytokiinlllä käsiteltyjä NK-soluja koskev lokset on esitetty yhteenvetona kuviossa 9.

Koska IL-2 ja IL-15 olivat aktiivisuudel-merkeissä 6 ja 7, olisi alan ammattikokemuksen pe odotettavissa, että IL-15 stimuloisi CTL-solujen 10 lujen ja NK-solujen aktiivisuutta ja saisi sen populaation suurenemaan, joka kykenee tuhoamaan soluja ja viruksen infektoimia soluja. Kuten edel leessa IL-15-polypeptidin antaminen on kuvattu, tehokas määrä sopivaan laimentimeen tai kantaja-15 valmistettua IL-15;ttä antaa potilaille, joilla noomla, melanoomia, sarkoomla, leukemiaa tai 1 tai potilaille, Jotka ovat Herpesviridae-viruste lukien sytomegaloviruksen, Polyoraaviridae-viruste viridae-virusten, mukaan lukien HIV:n, influenssa 20 Hepadnaviridae-virusten, hepatiitti A, hepatiitti tiitti C, hepatiitti delta tai hepatiitti D -vir .V. fektoimia.

ft i i • a • · • · «

• M

• a a · ft a · • a « • * »a · • · * • · a m ft • ft a • ft » ft*· « ft« ft ft · ft · a a • ft · · ft « ft • · · ft ft* • · 46

Sekvensai1istaus (1) YLEISET TIEDOT: (i) HAKIJA: Grabstein, Kenneth Anderson, Dirk Eisenman, June Fung, Victor Rauch, Charles (ii) KEKSINNÖN NIMITYS: Interleukiini-15 (iii) SEKVENSSIEN LUKUMÄÄRÄ: 12 (iv) KIRJEENVAIHTO-OSOITE: (A) VASTAANOTTAJA: Immunex Corporatio (B) KATU: 51 University Street (C) KAUPUNKI: Seattle (D) OSAVALTIO TAI LÄÄNI: Washington

(E) MAA: USA

(F) POSTINUMERO TAI -KOODI: 98101 (v) KONEKOODIMUOTO: (A) VÄLINETYYPPI: Levyke (B) TIETOKONE: IBM PC -yhteensopiva

(C) KÄYTTÖJÄRJESTELMÄ: PC-DOS/MS-DOS

(D) OHJELMISTO: Patentin Release #1.0, #1.25 (vi) NYKYISEN HAKEMUKSEN TIEDOT: (A) HAKEMUSNUMERO: (B) JÄTTÖPÄIVÄMÄÄRÄ: ;V; (C) LUOKITUS: « · l/A (Viii) ASIAMIEHEN TIEDOT: ,v[ (A) NIMI: Launer, Charlene *.V (B) REKISTERINUMERO: 33 035 (C) VIITE/LUETTELONUMERO: 2811 * « :.,0 ( ix ) TIETOL1IKENNEYHTEYSTIEDOT: (A) PUHELIN: 206-587-0430 • t i 9 (2) SEKVENSSIN NRO 1 TIEDOT: \j.: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: ··· / & ^ DTi*rnrc« aqq a 47 1 (ix) OMINAISPIIHTEET;

(A) NIMI/SELITYS: CDS

(B) ASEMA: 1..489 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 1:

ATG AGA ATT TCG AAA CCA CAT TTG AGA AGT ATT TCC ATC CAG TGC TAC

Met Arg Ile Sei Lys Pro His Leu Arg Sei Ile See Ile Gin Cys Tyr 15 10 15

CTG TGT TTA CTT CTA AAG AGT CAT TTT CTA ACT GAA GCT GGC ATT CAT

Leu Cys Leu Leu Leu Lys Ser His Phe Leu Thr Glu Ala Gly Ile His 20 25 30

GTC TTC ATT TTG GGC TGT TTC AGT GCA GGG CTC CCT AAA ACA GAA GCC

Vai Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro Lys Thr Glu Ala 35 40 45

AAC TGG GTG AAT GTA ATA AGT GAT TTG AAA AAA ATT GAA GAT CTT ATT

Asn Trp Vai Asn Vai Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile 50 55 60

CAA TCT ATG CAT ATT GAT GCT ACT TTA TAT ACA GAA AGT GAT GTT CAC

Gin Ser Het His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Vai His 65 70 75 80

CCC AGT TGC AAG GTA ACA GCA ATG AAG TGC TTT CTC TTG GAG TTG CAA

Pro Ser Cys Lys Vai Thr Ala Met Lys Cys Phe Leii Leu Glu Leu Gin 85 90 95

GTT ATT TCA CAT GAG TCC GGA GAT ACA GAT ATT CAT GAT ACA GTA GAA

Vai Ile Ser His Glu Ser Gly Asp Thr Asp Ile His Asp Thr Vai Glu 100 105 110

AAT CTT ATC ATC CTA GCA AAC AAC ATC TTG TCT TCT AAT GGG AAT ATA

Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ile Leu Ser Ser Asn Gly Asn Ile 115 120 125 • · e » *

:\j ACA GAA TCT GGA TGC AAA GAA TGT GAG GAA CTA GAG GAA AAA AAT ATT

* *· Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile JY: 130 135 140 * ·

:*·*: AAA GAA TTT TTG CAG AGT TTT GTA CAT ATT GTC CAA ATG TTC ATC AAC

* Lys Glu Phe Leu Gin Ser Phe Vai His Ile Vai Gin Met Phe Ile Asn 145 150 155 160 ««·

Y i ACT TCT TGA

Thr Ser . (2) SEKVENSSIN NRO 2 TIEDOT: : : : «««

mi f 4 \ CI2IA7DMCC TfcJ ΑΜΤΜλ TCDT TDOIDPOI

48

Het Arg Ile Sec Lye Pro His Leu Arg Ser Ile Ser He Gin Cys Ty r 1 5 10 15

Leu Cys Leu Leu Leu Lys Ser His Phe Leu Thr Glu Ala Gly He His 20 2S 30

Vai Phe He Leu Gly Cys Phe Ser Ala Glv Leu Pro Lvs Thr Glu Ala 35 40 45

Asn Trp Vai Asn Val He Ser Asp Leu Lys Lys He Glu Asp Leu He 50 55 60

Gin Ser Met His He Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His 65 70 75 80

Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gin 85 90 95

Val He Ser His Glu Ser Gly Asp Thr Asp He His Asp Thr Val Glu 100 105 110

Asn Leu Ile He Leu Ala Asn Asn He Leu $er Ser Asn Gly Asn He 115 120 125

Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn lie 130 13S 140

Lys Glu Phe Leu Gin Ser Phe Val His lie Val Gin Met Phe lie Asn 145 150 155 160

Thr Ser ¢2) SEKVENSSIN NRO 3 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 114 aminohappoa 1 (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini

:V: (iii) HYPOTEETTINEN (kyllä/ei): EI

« « I · ·

• »I

jV. (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 3: * · *8 · • « * * · \ Asn Trp Vai Asn Vai Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Le 1 -5 10 15 *88 8 8 » V · Gin Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Va 20 25 30 : Ser Cys Lys Vai Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Le ·*: 35 40 45 .(2) SEKVENSSIN NRO 4 TIEDOT: 49 (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET; (A) PITUUS: 489 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(ix) OMINAISPIIRTEET:

(A) NIMI/SELITYS; CDS

(B) ASEMA: 1* *489 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 4:

ATG AGA ATT TCG AAA CCA CAT TTG AGA AGT ATT TCC ATC CAG TGC T

Met Arg Ile Ser Lys Pro His Leu Arg Ser Ile Ser Ile Gin Cys T

15 10 15

TTG TGT TTA CTT CTA AAC AGT CAT TTT CTA ACT GAA GCT GGC ATT C

Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu Ala Gly Ile H

20 25 30

GTC TTC ATT TTG GGC TGT TTC AGT GCA GGG CTT CCT AAA ACA GAA G

Vai Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro Lys Thr Glu A

35 40 45

AAC TGG GTG AAT GTA ATA AGT GAT TTG AAA AAA ATT GAA GAT CTT A

Asn Trp Vai Asn Vai Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu I

50 55 60

β·β·β CAA TCT ATG CAT ATT GAT GCT ACT TTA TAT ACG GAA AGT GAT GTT C

·,·** Gin Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Vai H

: 65 70 75 -

• M

• ♦

• V. CCC AGT TGC AAA GTA ACA GCA ATG AAG TGC TTT CTC TTG GAG TTA C

*·'·* Pro Ser Cys Lys Vai Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu G

85 90 95 • e

I ; GTT ATT TCA CTT GAG TCC GGA GAT GCA AGT ATT CAT GAT ACA GTA G

*** Vai Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Vai G

: : : 100 105 no

AAT CTG ATC ATC CTA GCA AAC AAC AGT TTG TCT TCT AAT GGG AAT G

Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn V

:.i.: 115 120 125 (2) SEKVENSSIN NRO 5 TIEDOT: 50 (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 162 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 5:

Met Arg Ile Ser Lys Pro His Leu Arg Ser Ile Ser Ile Gin Cy 15 10 1

Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu Ala Gly II 20 25 30

Vai Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro Lys Thr G1 '35 40 45

Asn Trp Vai Asn Vai Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Le 50 55 60

Gin Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Va 65 70 75

Pro Ser Cys Lys Vai Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Le 85 90 9

Vai Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Va 100 105 110

Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly As 115 120 125 •V; Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys As ; \ 130 135 140 • · · •

l .* Lys Glu Phe Leu Gin Ser Phe Vil His Ile Vai Gin Met Phe II

V.: 145 150 155 f V Thr Ser • · * • « « ··» ··· 5.J : (2) SEKVENSSIN NRO 6 TIEDOT: . (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: :.·.ί (A) PITUUS: 114 aminohappoa ! ··· ίΒΊ TYYPPI: aminohaDDo 51

Asn Trp Vai Asn Vai Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Le 1 5 10 1£

Gin Ser Met His lie Asp Ala Thr Leu Tvr Thr Glu Ser Asp Vc 20 25 30

Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Le 35 40 “ 45

Vai He Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser He His Asp Thr V< 50 55 60

Asn Leu Ile He Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly A* 65 70 75

Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Αί Θ5 90 9i

Lys Glu Phe Leu Gin Ser Phe Val His He Val Gin Met Phe I] 100 105 110

Thr Ser (2) SEKVENSSIN NRO 7 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 24 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS; yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA :V: (iii) HYPOTEETTINEN (kyllä/ei); EI

• e

:Λ: (iv) ANTI-SENSE: EI

• · • · e • e · • « (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 7: • · ψ • · e

TCGACTGGAA CGAGACGACC TGCT

• e ♦ • * » ♦ (2) SEKVENSSIN NRO 8 TIEDOT: :·<:·! (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: /»\ DTfPTirrC· ΟΠ ^ 52 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 8: agcaggtcgt ctcgttccag (2) SEKVENSSIN NRO 9 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 18 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikelnen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(11) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA (lii) HYPOTEETTINEN (kyllä/ei): EI (lv) ANTI-SENSE: EI

(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 9: AAYTGGGTNA AYGTNATH

(2) SEKVENSSIN NRO 10 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 17 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikelnen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA :V; (lii) HYPOTEETTINEN (kyllä/ei): EI

9 9

V·! (iv) ANTI-SENSE: KYLLX

• ψ 9 9 · • · 9 9 9 :v: (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 10: • * • · · • · ·

!!! ACRTCNGAYT CNGTRTA

« · * · · (2) SEKVENSSIN NRO 11 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET; (A) PITUUS: 17 emäsparia (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO II: 53

ACRTCRCTYT CNGTRTA

(2) SEKVENSSIN NRO 12 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 114 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini

(iii) HYPOTEETTINEN (kyllä/ei): EI

(xl) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 12: Α5Π Trp Vai Asn Vai Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp L< 15 10 1;

Gin Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Vi 20 25 30

Pro Ser Cys Lys Vai Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu L· 35 40 45

Vai Ile Ser Xaa Glu Ser Gly Asp Xaa Xaa Ile His Asp Thr V 50 55 60

Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Xaa Leu Ser Ser Asn Gly A ; % 65 70 75 * t 4 • #· I ,1 2 3 Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys A, 85 90 9 • e »

: Lys Glu Phe Leu Gin Ser Phe Vai His Ile Vai Gin Met Phe I

100 105 110 • » • i 1

Thr Ser • 4 f · » 2 • · # 3 444 • e

Claims (15)

1. Eristetty DNA-sekvenssi, joka koodaa r den IL-15:n biologista aktiivisuutta osoittavaa pc 5 dia, tunnettu siitä, että DNA-sekvenssi on: (a) DNA-sekvenssi, joka koodaa sellaista r IL-15-polypeptidiä, joka käsittää sekvenssin: Asn Trp Vai Asn Vai Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Le 15 10 15 Gin Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Va 20 25 30 Pro Ser Cys Lys Vai Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Le 35 40 45 Vai Ile Ser Xaa Glu Ser Gly Asp Xaa Xaa Ile His Asp Thr Va 50 55 60 Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Xaa Leu Ser Ser Asn Gly As 65 70 75 Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys As 85 ‘ 90 95 Lys Glu Phe Leu Gin Ser Phe Vai His Ile Vai Gin Met Phe II 100 105 110 • · Thr Ser • · ♦ * 4 4 • « * 10 jossa aminohappo 52 on Leu tai His, aminohappo 5 tai Thr, aminohappo 58 on Ser tai Asp, aminohap] :*·*; Ser tai Ile ja aminohappo 80 on Vai tai Ile; tai • · • ;*· (b) jokin DNA-sekvenssi, joka hybridisoitui *·« tavalla tavalla kohdan (a) mukaisiin DNA-sekvensse * 15 niiden komplementaarisiin juonteisiin erittäin voi ti rajoittavissa olosuhteissa ja koodaa ilmentyes • : · Hl säkkäiden IL-15:n biologista aktiivisuutta omaav • · «A (a) SEKVENSSIN ID N0:1 mukaisen DNA-sekvens leotidit 145 - 489; {b) jokin DNA-sekvensseistä, joka hybri havaittavalla tavalla kohdan (a) mukaisiin DNA-5 seihin tai niiden komplementaarisiin juosteisiin kaasti rajoittavissa olosuhteissa ja koodaa ilmen nisäkkäiden IL-15:n biologista aktiivisuutta omaav peptidiä; tai (c) jokin DNA-sekvensseistä, joka geneetti 10 din degeneratiivisuuden johdosta koodaa minkä edellä olevan DNA-sekvenssin koodaamaa polypeptidi,

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen eristel sekvenssi, tunnettu siitä, että mainittu DNA-se joka koodaa nisäkkäiden IL-15:n aktiivisuutta os 15 polypeptidiä, käsittää DNA-sekvenssin, joka on: (a) SEKVENSSIN ID NO: 4 mukaisen DNA-se nukleotidit 145 - 489; (b) jokin DNA-sekvensseistä, joka hybri havaittavalla tavalla kohdan (a) mukaisiin DNA- 20 seihin tai niiden komplementaarisiin juosteisiin kaasti rajoittavissa olosuhteissa ja koodaa ilmen nisäkkäiden IL-15:n biologista aktiivisuutta omaav • » * l \ peptidiä; tai • ·· l / (c) jokin DNA-sekvensseistä, joka geneetti * · * [il 25 din degeneratiivisuuden johdosta koodaa minkä • · · : ·* edellä olevan DNA-sekvenssin koodaamaa polypeptidi; « i * M-* 4, Yhdistelmäilmentämisvektori, tunnetti • · · | *.· : että se käsittää patenttivaatimuksen 1 mukaista n den IL-15:n biologista aktiivisuutta osoittavaa po : 30 diä koodaavan DNA-sekvenssin. • · « _ * * * ^ t D ^ 4- Λ 1Λ, 4- ^ Ί TT-> ^ ^ A TV\t Ί Ιλ ΡΊ Λ Vi A VAi llj-A -i IA f\v% t tU #-J -! n 4· iA 1 (b) SEKVENSSIN ID NO:4 mukaisen DNA-se nukleotidit 145 - 489; (c) jokin DNA-sekvensseistä, joka havai määrin hybridisoituu kohtien (a) tai (b) mukais: 5 sekvensseihin tai näiden komplementaarisiin juo voimakkaasti rajoittavissa olosuhteissa ja koodaa essään nisäkkäiden IL-15:n biologista aktiivisuut vaa polypeptidiä; tai (d) jokin DNA-sekvensseistär joka geneetti 10 din degeneratiivisuuden johdosta koodaa minkä edellä olevan DNA-sekvenssin koodaamaa polypeptidi

6. Isäntäsolu, joka on transformoitu tai t toitu patenttivaatimuksen 4 mukaisella ilmentämisv la.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen isä tunnettu siitä, että isäntäsolu on E. coli, monas, Bacillus, Streptomyces, hiiva, jokin sien: hyönteissolu tai jokin nisäkässolu.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen isä 20 tunnettu siitä, että isäntäsolu on E. coli.

9. Patenttivaatimuksen 7 mukainen isä tunnettu siitä, että isäntäsolu on Saccharomyc • · * * *. visiae. • · · • ·· l / 10. Patenttivaatimuksen 7 mukainen isä • * · [il 25 tunnettu siitä, että isäntäsolu on nisäkässolu. * · · : ·* 11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen isä * tunnettu siitä, että isäntäsolu on kiinanhamst V * nasarjasolu.

12. Isäntäsolu, joka on transformoitu ta: ; 30 fektoitu patenttivaatimuksen 5 mukaisella ilmentäm .·*·. rilla.

14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen isc tunnettu siitä, että isäntäsolu on E. coli.

15. Patenttivaatimuksen 13 mukainen isä tunnettu siitä, että isäntäsolu on Saccharomyc 5 visiae.

16. Patenttivaatimuksen 13 mukainen isc tunnettu siitä, että isäntäsolu on nisäkässolu.

17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen isä tunnettu siitä, että isäntäsolu on kiinanhamst 10 nasarjasolu.

18. Menetelmä IL-15-polypeptidin valmiste tunnettu siitä, että menetelmä käsittää patent muksen 6 mukaisen isäntäsolun viljelemisen ilme edistävissä olosuhteissa ja IL-15:n biologista 15 suutta osoittavan polypeptidin ottamisen talteen mästä.

19. Menetelmä IL-15-polypeptidin valmista tunnettu siitä, että menetelmä käsittää patent muksen 7 mukaisen isäntäsolun viljelemisen ilme 20 edistävissä olosuhteissa ja IL-15:n biologista suutta osoittavan polypeptidin ottamisen talteen .V, mästä. * * · * \ 20. Patenttivaatimuksen 18 tai 19 mukain • * « * M ; / telmä, tunnettu siitä, että IL-15-polypeptidi * * » 25 patenttivaatimuksen 1 mukaisen eristetyn DNA-se : koodaamaa polypeptidiä, SEKVENSSIN ID NO: 3 kuvaam peptidiä, SEKVENSSIN ID NO:2 kuvaamaa polypeptid IM V* VENSSIN ID NO: 6 kuvaamaa polypeptidiä tai SEKVEI NO:5 kuvaamaa polypeptidiä. I : 30 21. Eristetty DNA-sekvenssi, joka koodaa ··* • ·« . _ _ J ' _ !_J 1 * Ϊ _ -TT ΊΓ- - Π _ _ J_ _1 * _ 1 _ I

22. Patenttivaatimuksen 21 mukainen eriste sekvenssi, tunnettu siitä, että mainittu biol aktiivisen IL-15:n polypeptidin prekursoripoly koodaava DNA-sekvenssi on:

5 SEKVENSSIN ID N0:1 mukainen DNA-sekvenssi; SEKVENSSIN ID NO:4 mukainen DNA-sekvenssi. * · • * * « i · • · • » • ♦ i • ♦♦ • · • » • 9 m • * 9 • m ·· « • · m • · « « » • · 9 • * Ψ Ml « *» • · « I · * • · · • I « • · « *·« » » • «