FI115057B - Eristetty liukoinen CTL4A-proteiini, sitä sisältäviä fuusioproteiineja, sen ligandeja, sen tunnistavia monoklonaalisia vasta-aineita ja käyttötapoja - Google Patents
Eristetty liukoinen CTL4A-proteiini, sitä sisältäviä fuusioproteiineja, sen ligandeja, sen tunnistavia monoklonaalisia vasta-aineita ja käyttötapoja Download PDFInfo
- Publication number
- FI115057B FI115057B FI20022285A FI20022285A FI115057B FI 115057 B FI115057 B FI 115057B FI 20022285 A FI20022285 A FI 20022285A FI 20022285 A FI20022285 A FI 20022285A FI 115057 B FI115057 B FI 115057B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- ctla4
- amino acid
- acid sequence
- cells
- extracellular domain
- Prior art date
Links
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 81
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 79
- 239000003446 ligand Substances 0.000 title claims abstract description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 44
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 37
- 239000007788 liquid Substances 0.000 title 1
- 101000889276 Homo sapiens Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Proteins 0.000 claims abstract description 142
- 102100039498 Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Human genes 0.000 claims abstract description 127
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims abstract description 63
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims abstract description 61
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 49
- 102000005738 B7 Antigens Human genes 0.000 claims abstract description 35
- 108010045634 B7 Antigens Proteins 0.000 claims abstract description 35
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 32
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims abstract description 27
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims abstract description 22
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 129
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 claims description 64
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 claims description 64
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 63
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 48
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 39
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 36
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 35
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 23
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 13
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 13
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 13
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 12
- 102000008203 CTLA-4 Antigen Human genes 0.000 claims description 9
- 108010021064 CTLA-4 Antigen Proteins 0.000 claims description 9
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 8
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 7
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 4
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims description 3
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 3
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 claims description 2
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 claims description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 2
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims 13
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 claims 4
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N aspartic acid group Chemical group N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims 3
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 3
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims 2
- 150000001295 alanines Chemical class 0.000 claims 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 claims 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract description 55
- 230000028993 immune response Effects 0.000 abstract description 7
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 abstract description 7
- 230000008614 cellular interaction Effects 0.000 abstract description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 47
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 29
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 26
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 25
- 239000000047 product Substances 0.000 description 22
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 20
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 20
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 17
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 17
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 16
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 16
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 15
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 15
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 15
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 15
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 13
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 13
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 11
- 230000004044 response Effects 0.000 description 11
- 102000004140 Oncostatin M Human genes 0.000 description 10
- 108090000630 Oncostatin M Proteins 0.000 description 10
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 10
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 10
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 10
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 9
- 102000043321 human CTLA4 Human genes 0.000 description 9
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 9
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 8
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 8
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 8
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 8
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 8
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 8
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 102000003979 Mineralocorticoid Receptors Human genes 0.000 description 7
- 108090000375 Mineralocorticoid Receptors Proteins 0.000 description 7
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 7
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 7
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 7
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 7
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 6
- 101150091887 Ctla4 gene Proteins 0.000 description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 6
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 6
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 6
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 5
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 5
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 4
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 4
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 4
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 4
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 3
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 3
- 102000038504 B7-1 Antigen Human genes 0.000 description 3
- 108010035053 B7-1 Antigen Proteins 0.000 description 3
- 102000010910 CD28 Antigens Human genes 0.000 description 3
- 108010062433 CD28 Antigens Proteins 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 3
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 3
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000000211 autoradiogram Methods 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 3
- 230000002998 immunogenetic effect Effects 0.000 description 3
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 3
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BUDNAJYVCUHLSV-ZLUOBGJFSA-N Ala-Asp-Ser Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BUDNAJYVCUHLSV-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 2
- PEEYDECOOVQKRZ-DLOVCJGASA-N Ala-Ser-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O PEEYDECOOVQKRZ-DLOVCJGASA-N 0.000 description 2
- LSMDIAAALJJLRO-XQXXSGGOSA-N Ala-Thr-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O LSMDIAAALJJLRO-XQXXSGGOSA-N 0.000 description 2
- ICRHGPYYXMWHIE-LPEHRKFASA-N Arg-Ser-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)C(=O)O ICRHGPYYXMWHIE-LPEHRKFASA-N 0.000 description 2
- QLSRIZIDQXDQHK-RCWTZXSCSA-N Arg-Val-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O QLSRIZIDQXDQHK-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 2
- AHWRSSLYSGLBGD-CIUDSAMLSA-N Asp-Pro-Glu Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O AHWRSSLYSGLBGD-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- CUQDCPXNZPDYFQ-ZLUOBGJFSA-N Asp-Ser-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O CUQDCPXNZPDYFQ-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 2
- 241000713842 Avian sarcoma virus Species 0.000 description 2
- 108010084313 CD58 Antigens Proteins 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- TVYMKYUSZSVOAG-ZLUOBGJFSA-N Cys-Ala-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O TVYMKYUSZSVOAG-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 2
- ZXCAQANTQWBICD-DCAQKATOSA-N Cys-Lys-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CS)N ZXCAQANTQWBICD-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- ALNKNYKSZPSLBD-ZDLURKLDSA-N Cys-Thr-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O ALNKNYKSZPSLBD-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 2
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 2
- NJCALAAIGREHDR-WDCWCFNPSA-N Glu-Leu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O NJCALAAIGREHDR-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 2
- GGEJHJIXRBTJPD-BYPYZUCNSA-N Gly-Asn-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O GGEJHJIXRBTJPD-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102100022339 Integrin alpha-L Human genes 0.000 description 2
- 108010064593 Intercellular Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 2
- 102100037877 Intercellular adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 2
- 102100037872 Intercellular adhesion molecule 2 Human genes 0.000 description 2
- 101710148794 Intercellular adhesion molecule 2 Proteins 0.000 description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 2
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 2
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 2
- BQSLGJHIAGOZCD-CIUDSAMLSA-N Leu-Ala-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BQSLGJHIAGOZCD-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- LQUIENKUVKPNIC-ULQDDVLXSA-N Leu-Met-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O LQUIENKUVKPNIC-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 2
- ZJZNLRVCZWUONM-JXUBOQSCSA-N Leu-Thr-Ala Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O ZJZNLRVCZWUONM-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 2
- 108010064548 Lymphocyte Function-Associated Antigen-1 Proteins 0.000 description 2
- KVNLHIXLLZBAFQ-RWMBFGLXSA-N Lys-Met-Pro Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N KVNLHIXLLZBAFQ-RWMBFGLXSA-N 0.000 description 2
- WWWGMQHQSAUXBU-BQBZGAKWSA-N Met-Gly-Asn Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O WWWGMQHQSAUXBU-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-valine Natural products CC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YKUGPVXSDOOANW-KKUMJFAQSA-N Phe-Leu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O YKUGPVXSDOOANW-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- YTILBRIUASDGBL-BZSNNMDCSA-N Phe-Leu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 YTILBRIUASDGBL-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 2
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- TUYWCHPXKQTISF-LPEHRKFASA-N Pro-Cys-Pro Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)O TUYWCHPXKQTISF-LPEHRKFASA-N 0.000 description 2
- QCARZLHECSFOGG-CIUDSAMLSA-N Pro-Glu-Cys Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O QCARZLHECSFOGG-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- UIMCLYYSUCIUJM-UWVGGRQHSA-N Pro-Gly-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H]1CCCN1 UIMCLYYSUCIUJM-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- SBVPYBFMIGDIDX-SRVKXCTJSA-N Pro-Pro-Pro Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1N(C(=O)[C@H]2NCCC2)CCC1 SBVPYBFMIGDIDX-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- IURWWZYKYPEANQ-HJGDQZAQSA-N Pro-Thr-Glu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O IURWWZYKYPEANQ-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 2
- DYJTXTCEXMCPBF-UFYCRDLUSA-N Pro-Tyr-Phe Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CC2=CC=C(C=C2)O)C(=O)N[C@@H](CC3=CC=CC=C3)C(=O)O DYJTXTCEXMCPBF-UFYCRDLUSA-N 0.000 description 2
- HQTKVSCNCDLXSX-BQBZGAKWSA-N Ser-Arg-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O HQTKVSCNCDLXSX-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- OCWWJBZQXGYQCA-DCAQKATOSA-N Ser-Lys-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O OCWWJBZQXGYQCA-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- WPSKTVVMQCXPRO-BWBBJGPYSA-N Thr-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WPSKTVVMQCXPRO-BWBBJGPYSA-N 0.000 description 2
- UQCNIMDPYICBTR-KYNKHSRBSA-N Thr-Thr-Gly Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O UQCNIMDPYICBTR-KYNKHSRBSA-N 0.000 description 2
- VMSSYINFMOFLJM-KJEVXHAQSA-N Thr-Tyr-Met Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)N)O VMSSYINFMOFLJM-KJEVXHAQSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- LGEYOIQBBIPHQN-UWJYBYFXSA-N Tyr-Ala-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 LGEYOIQBBIPHQN-UWJYBYFXSA-N 0.000 description 2
- HZDQUVQEVVYDDA-ACRUOGEOSA-N Tyr-Tyr-Leu Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HZDQUVQEVVYDDA-ACRUOGEOSA-N 0.000 description 2
- LNYOXPDEIZJDEI-NHCYSSNCSA-N Val-Asn-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](C(C)C)N LNYOXPDEIZJDEI-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 2
- KOPBYUSPXBQIHD-NRPADANISA-N Val-Cys-Glu Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N KOPBYUSPXBQIHD-NRPADANISA-N 0.000 description 2
- OTJMMKPMLUNTQT-AVGNSLFASA-N Val-Leu-Arg Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N OTJMMKPMLUNTQT-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- VHIZXDZMTDVFGX-DCAQKATOSA-N Val-Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](C(C)C)N VHIZXDZMTDVFGX-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- UVHFONIHVHLDDQ-IFFSRLJSSA-N Val-Thr-Glu Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O UVHFONIHVHLDDQ-IFFSRLJSSA-N 0.000 description 2
- ZNGPROMGGGFOAA-JYJNAYRXSA-N Val-Tyr-Val Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 ZNGPROMGGGFOAA-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 230000000961 alloantigen Effects 0.000 description 2
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 2
- 108010040443 aspartyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 2
- 108010069205 aspartyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- WCIDIJQCEUODDY-UHFFFAOYSA-N chloro(dimethyl)sulfanium Chemical compound C[S+](C)Cl WCIDIJQCEUODDY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000002414 glycolytic effect Effects 0.000 description 2
- 108010019832 glycyl-asparaginyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 108010066198 glycyl-leucyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 2
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 2
- 230000008611 intercellular interaction Effects 0.000 description 2
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 108010085203 methionylmethionine Proteins 0.000 description 2
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 2
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 108010077112 prolyl-proline Proteins 0.000 description 2
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 2
- 108010026333 seryl-proline Proteins 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010020532 tyrosyl-proline Proteins 0.000 description 2
- 108010073969 valyllysine Proteins 0.000 description 2
- WHTVZRBIWZFKQO-AWEZNQCLSA-N (S)-chloroquine Chemical compound ClC1=CC=C2C(N[C@@H](C)CCCN(CC)CC)=CC=NC2=C1 WHTVZRBIWZFKQO-AWEZNQCLSA-N 0.000 description 1
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 3-phospho-D-glyceric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)COP(O)(O)=O OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- VHEVVUZDDUCAKU-FXQIFTODSA-N Ala-Met-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O VHEVVUZDDUCAKU-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- MAEQBGQTDWDSJQ-LSJOCFKGSA-N Ala-Met-His Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N MAEQBGQTDWDSJQ-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 1
- REWSWYIDQIELBE-FXQIFTODSA-N Ala-Val-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O REWSWYIDQIELBE-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 101710187573 Alcohol dehydrogenase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101710133776 Alcohol dehydrogenase class-3 Proteins 0.000 description 1
- 244000144725 Amygdalus communis Species 0.000 description 1
- 101100082447 Arabidopsis thaliana PBL1 gene Proteins 0.000 description 1
- VYSRNGOMGHOJCK-GUBZILKMSA-N Arg-Ala-Met Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N VYSRNGOMGHOJCK-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- JJQGZGOEDSSHTE-FOHZUACHSA-N Asp-Thr-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O JJQGZGOEDSSHTE-FOHZUACHSA-N 0.000 description 1
- BHELIUBJHYAEDK-OAIUPTLZSA-N Aspoxicillin Chemical compound C1([C@H](C(=O)N[C@@H]2C(N3[C@H](C(C)(C)S[C@@H]32)C(O)=O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC(=O)NC)=CC=C(O)C=C1 BHELIUBJHYAEDK-OAIUPTLZSA-N 0.000 description 1
- 241000713838 Avian myeloblastosis virus Species 0.000 description 1
- 208000004736 B-Cell Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 230000003844 B-cell-activation Effects 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 108010041397 CD4 Antigens Proteins 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 206010011968 Decreased immune responsiveness Diseases 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 101000867232 Escherichia coli Heat-stable enterotoxin II Proteins 0.000 description 1
- 241001288713 Escherichia coli MC1061 Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- NSTUFLGQJCOCDL-UWVGGRQHSA-N Gly-Leu-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N NSTUFLGQJCOCDL-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- TVUWMSBGMVAHSJ-KBPBESRZSA-N Gly-Leu-Phe Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 TVUWMSBGMVAHSJ-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- KFQDSSNYWKZFOO-LSJOCFKGSA-N His-Val-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O KFQDSSNYWKZFOO-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 1
- 101100061678 Homo sapiens CTLA4 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000598436 Human T-cell lymphotropic virus Species 0.000 description 1
- 241000714259 Human T-lymphotropic virus 2 Species 0.000 description 1
- 241000701109 Human adenovirus 2 Species 0.000 description 1
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WRDTXMBPHMBGIB-STECZYCISA-N Ile-Tyr-Val Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 WRDTXMBPHMBGIB-STECZYCISA-N 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 102100038609 Lactoperoxidase Human genes 0.000 description 1
- 108010023244 Lactoperoxidase Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- KPYAOIVPJKPIOU-KKUMJFAQSA-N Leu-Lys-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O KPYAOIVPJKPIOU-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 1
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 1
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 1
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 1
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 1
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 1
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 1
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 240000002853 Nelumbo nucifera Species 0.000 description 1
- 235000006508 Nelumbo nucifera Nutrition 0.000 description 1
- 235000006510 Nelumbo pentapetala Nutrition 0.000 description 1
- 101100205189 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) leu-5 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108010087702 Penicillinase Proteins 0.000 description 1
- DSXPMZMSJHOKKK-HJOGWXRNSA-N Phe-Phe-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O DSXPMZMSJHOKKK-HJOGWXRNSA-N 0.000 description 1
- APMXLWHMIVWLLR-BZSNNMDCSA-N Phe-Tyr-Ser Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 APMXLWHMIVWLLR-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- FELJDCNGZFDUNR-WDSKDSINSA-N Pro-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 FELJDCNGZFDUNR-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- OOLOTUZJUBOMAX-GUBZILKMSA-N Pro-Ala-Val Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O OOLOTUZJUBOMAX-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- GZFAWAQTEYDKII-YUMQZZPRSA-N Ser-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CO GZFAWAQTEYDKII-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- UPLYXVPQLJVWMM-KKUMJFAQSA-N Ser-Phe-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O UPLYXVPQLJVWMM-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 208000000389 T-cell leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000028530 T-cell lymphoblastic leukemia/lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 102100036049 T-complex protein 1 subunit gamma Human genes 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- QQWNRERCGGZOKG-WEDXCCLWSA-N Thr-Gly-Leu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O QQWNRERCGGZOKG-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PZTZYZUTCPZWJH-FXQIFTODSA-N Val-Ser-Ser Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N PZTZYZUTCPZWJH-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- -1 amino- Chemical class 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 210000003969 blast cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 1
- 235000014121 butter Nutrition 0.000 description 1
- 101150062912 cct3 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 1
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000035567 cellular accumulation Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960003677 chloroquine Drugs 0.000 description 1
- WHTVZRBIWZFKQO-UHFFFAOYSA-N chloroquine Natural products ClC1=CC=C2C(NC(C)CCCN(CC)CC)=CC=NC2=C1 WHTVZRBIWZFKQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 150000002019 disulfides Chemical class 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000012757 fluorescence staining Methods 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 1
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000005934 immune activation Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 239000012133 immunoprecipitate Substances 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 229940057428 lactoperoxidase Drugs 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 238000000464 low-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000007799 mixed lymphocyte reaction assay Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000035407 negative regulation of cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000012177 negative regulation of immune response Effects 0.000 description 1
- 230000031673 negative regulation of immunoglobulin secretion Effects 0.000 description 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 1
- 150000002829 nitrogen Chemical class 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 208000003154 papilloma Diseases 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 229950009506 penicillinase Drugs 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 238000013391 scatchard analysis Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008279 sol Substances 0.000 description 1
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 235000013616 tea Nutrition 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 150000003587 threonine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/70521—CD28, CD152
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
- C07K14/7155—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for interleukins [IL]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
- C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
- C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/32—Fusion polypeptide fusions with soluble part of a cell surface receptor, "decoy receptors"
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/866—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof involving immunoglobulin or antibody fragment, e.g. fab', fab, fv, fc, heavy chain or light chain
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/868—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof involving autoimmunity, allergy, immediate hypersensitivity, delayed hypersensitivity, immunosuppression, or immunotolerance
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Virology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Transplantation (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Microbiology (AREA)
Description
115057
Eristetty liukoinen CTL4A-proteiini, sitä sisältäviä fuusioproteiineja, sen ligandeja, sen tunnistavia monoklonaalisia vasta-aineita ja käyttötapoja 5 Keksinnön ala
Keksintö liittyy CTLA4-reseptorigeenin ilmentämiseen, tämän reseptorin ja B7-antigeenia ilmentävien solujen välisen vuorovaikutuksen tunnistamiseen ja menetelmiin sellaisten solujen välisten vuorovaikutusten säännöstele-10 miseksi, joihin liittyy CTLA4-reseptori.
Keksinnön tausta
Selkärankaisten immuunijärjestelmälle leimaa antavana piirteenä on kyky erottaa oma ("self") elimistö jostakin toisesta ("non-self") (vieraasta) elimistöstä. Tämä 15 ominaisuus on johtanut sellaisen järjestelmän kehittymiseen, jossa optimaalisen immuuniaktivaation saavuttamiseen tarvitaan useita signaaleja [Janeway, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 54 (1989) 1 - 14]. T-solujen ja B-solu-jen vuorovaikutukset ovat välttämättömiä immuunivasteelle.
20 T-solujen ja B-solujen pinnalla esiintyvien monien kohe- siivisten molekyylien pitoisuudet lisääntyvät immuunivasteen aikana [Springer, et ai., (1987), edellä, Shaw ja :.· · Shimuzu, Current Opinion in Immunology, Kindt ja Long (toim.) 1 (1988) 92 - 97; ja Hemler, Immunology Today 9 ,* 25 (1988) 109 - 113]. Näiden molekyylien pitoisuuksien li- ;\j sääntyminen voi osaltaan selittää sen, miksi aktivoidut B- • » .·, : solut stimuloivat antigeenispesifistä T-solujen lisäänty- I t .···, mistä lepotilassa olevia B-soluja tehokkaammin [Kaiuchi, et ai., J. Immunol. 131 (1983) 109 - 114; Kreiger, et ai., 30 J. Immunol. 135 (1985) 2 937 - 2 945; McKenzie, J.
*;;; Immunol. 141 (1988) 2 907 - 2 911; ja Hawrylowicz ja ’···' Unanue, J. Immunol. 141 (1988) 4 083 - 4 088] .
T-lymfosyytti ("T-solu") -immuunivasteen muodostu-·;··;' minen on monimutkainen ilmiö, johon liittyy solujen väli- , \ 35 siä vuorovaikutuksia [Springer, et ai., A. Rev. Immunol. 5 ·· ; (1987) 223 - 252], jotka tapahtuvat varsinkin T-solujen ja 1 1 5057 2 apusolujen, kuten B-solujen välillä, sekä immuunijärjestelmän liukoisten välittäjäaineiden (sytokiinien tai lym-fokiinien) muodostuminen [Dinarello ja Mier, New Engl. Jour. Med 317 (1987) 940 - 945] . Tätä vastetta säätelevät 5 useat T-solujen pinnalla olevat reseptorit, joihin kuuluu T-solureseptorikompleksi [Weiss, et ai., Ann. Rev. Immunol. 4 (1986) 593 - 619] ja muita solun pinnalla olevia "apu"molekyylejä [Springer, et ai., (1987) edellä]. Monet näistä apumolekyyleistä ovat luonnossa esiintyviä solun 10 pinnan erinlaistumis (CD) -antigeenejä, jotka voidaan erottaa toisistaan sen perusteella, miten ne reagoivat solujen pintaa vastaan suunnattujen monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa [McMichael, toim., Leukocyte Typing III, Oxford Univ. Press, Oxford, N.Y. (1987)].
15 Antigeenistä riippumattomat solujen väliset vuoro vaikutukset, joissa lymfosyyttien apumolekyylit ovat osallisina, ovat välttämättömiä immuunivasteelle [Springer, et ai., (1987), edellä]. Esimerkiksi T-soluun liittyvän proteiinin, CD2:n, sitoutuminen ligandiinsa LFA-3, joka on 20 laajalle levinnyt glykoproteiini [katsaus tähän on esitetty julkaisussa Shaw ja Shimuzu, edellä), on tärkeä T-solujen antigeenispesifisen aktivaation optimoimiselle · [Moingeon, et ai., Nature 339 (1988) 314]. Toiseen tär- • · keään adheesiojärjestelmään liittyy lymfosyyttien, makro- 25 fagien ja granulosyyttien pinnalla esiintyvän LFA-l-glyko- ;\j proteiinin [Springer, et ai., (1987), edellä; Shaw ja * · .·, ; Shimuzu (1988), edellä] sitoutuminen ligandeihinsa ICAM-1 * i · .···, (Makgoba, et ai., Nature 331 (1988) 86 - 88] ja ICAM-2 * i [Staunton, et ai., Nature 339 (1989) 61 - 64]. T-solujen , 30 apumolekyylit CD8 ja CD4 vahvistavat T-solujen adheesiota • » · vuorovaikutuksella MHC:n luokka I -molekyylien [Norment, et '*·*’ ai., Nature 336 (1988) 79 - 81] ja luokka II -molekyylien [Doyle ja Strominger, Nature 330 (1987) 256 - 259] kanssa, * · vastaavassa järjestyksessä mainittuna. "Solujen kulkeutu- , *, 35 mistä ohjaavat (homing) reseptorit" ovat tärkeitä lymfo- • * * • · · » * * » 3 115057 syyttien liikkumisen säännöstelyssä [Stoolman, Cell 56 (1989) 907 - 910] . VLA-glykoproteiinit ovat integriinejä, jotka vaikuttavat toimivan välittäjinä lymfosyyttien toiminnoissa, joissa tarvitaan adheesiota solunulkoisen mat-5 riksin komponentteihin (Hemler, edellä). CD2/LFA-3-, LFA-l/ICAM-1- ja ICAM-2- sekä VLA -adheesiojärjestelmät ovat jakaantuneina useisiin erilaisiin solutyyppeihin [Springer, et ai., (1987), edellä; Shaw ja Shimuzu (1988), edellä, ja Hemler, (1988), edellä).
10 Useita vuosia sitten tehtiin ehdotus, että B- lymfosyyttien aktivaatio vaatisi kahta signaalia [Bretscher ja Cohn, Science 169 (1970) 1 042 - 1 049], ja kaikkien lymfosyyttien arvellaan nykyisin tarvitsevan optimaaliseen aktivoitumiseen kahta signaalia, 15 antigeenille spesifistä eli klonaalista signaalia, sekä toista, antigeenin suhteen epäspesifistä signaalia (Janeway, edellä). Freeman, et ai. [J. Immunol. 143(8) (1989) 2 714 - 2 722] eristivät ja sekvenssoivat cDNA- kloonin, joka koodaa mAb-B7:n tunnistamaa B-solun 20 aktivaatioantigeenia [Freeman, et ai., J. Immunol. 138 (1987) 3 260]. Tällä cDNArlla transfektoitujen COS-solujen on osoitettu värjäytyvän sekä leimalla varustetulla mAb-*,· · B7:llä että mAb BB-l:llä [Clark, et ai., Human Immunol. 16 : ; : (1986) 100 - 113; Yokochi, et ai., J. Immunol. 128 (1981) 25 823; Freeman, et ai., (1989), edellä; ja Freedman, et ai., J (1987), edellä]. Lisäksi tämän antigeenin on havaittu • « .·, ; ilmentyvän muiden kehityslinjojen solujen, kuten t··/ monosyyttien, pinnalla (Freeman, et ai., edellä).
t ·
Auttaja-T-solun, (Thin) antigeenivasteeseen tarvit-30 tavia signaaleja muodostavat antigeeniä esittävät solut i » · ··*·' (APCrt). Ensimmäisen signaalin muodostuminen käynnistyy T- « · i solureseptorikompleksin [Weiss, J. Clin. Invest. 86 (1990)
;\j 1015] vuorovaikutuksesta antigeenin kanssa, jonka APC
• · ....: esittää MHC-kompleksin [major histocompatibility complex 35 (MHC)] luokka II -molekyylien yhteydessä APC:n pinnalla 4 115057 [Allen, Immunol. Today 8 (1987) 270]. Tämä antigeeni- spesifinen signaali ei ole riittävä täyden vasteen aikaansaamiseksi ja se voi toisen signaalin puuttuessa johtaa kloonin inaktivoitumiseen eli anergiaan [Schwartz, Science 5 248 (1990) 1 349]. Useissa kokeellisissa järjestelmissä on osoitettu tarvittavan toista, MHC:stä saatavaa "stimuloivaa rinnakkaissignaalia" [Schwartz, edellä; Weaver ja Unanue, Immunol. Today 11 (1990) 49] . Tämän (näiden) tois(t)en signaali(e)n molekulaarista luonnetta ei täysin 10 tunneta, vaikka joissakin tapauksissa on selvää, että "stimuloivina rinnakaissignaaleina" voivat toimia liukoiset molekyylit, kuten interleukiini (IL)-l (Weaver ja Unanue, edellä), ja solujen väliseen adheesioon liittyvät membraanireseptorit [Springer, Nature 346 (1990) 25] .
15 CD28-antigeeni, joka on immunoglobuliinien ylä- ryhmään kuuluva homodimeerinen glykoproteiini [Aruffo ja Seed, Proc. Natl. Acad. Sei. 84 (1987) 8 573 - 8 577], on useimmissa kypsissä humaani-T-soluissa esiintyvä apumole-kyyli [Damle, et ai., J. Immunol. 131 (1983) 2 296 - 20 2 300]. Nykyiset todisteet viittaavat siihen, että tämä molekyyli toimii T-solujen vaihtoehtoisessa aktivoitumis-reaktiotiessä, joka poikkeaa T-solureseptorikompleksin · ; : käynnistämästä reaktiosarjasta (June, et ai., Mol. Cell.
:V; Biol. 7 (1987) 4 472 - 4 481]. Monoklonaaliset vasta-ai- 25 neet (mAb:t), jotka kykenevät reagoimaan CD28-antigeenin .·, : kanssa, voivat tehostaa T-soluvasteita, jotka ovat käyn- .·, ; nistyneet useiden erilaisten polyklonaalisten stimulusten vaikutuksesta (katsaus tähän on esitetty julkaisussa June, ' ' et ai., edellä). Nämä stimuloivat vaikutukset voivat joh- 30 tua mAb:n käynnistämästä sytokiinien muodostumisesta [Thompson, et ai., Proc. Natl. Acad. Sei 86 (1989) 1 333 - • * » 1337; ja Lindsten, et ai., Science 244 (1989) 339 - 343], ;*·,· mikä johtuu mRNA:n pysyvyyden parantumisesta [Lindsten, et ai., (1989), edellä]. Anti-CD28-mAb-molekyyleillä voi myös 35 olla inhiboivia vaikutuksia, ne voivat toisin sanoen eh- I I t 5 115057 käistä autologisia lymfosyyttityyppien yhteisreaktioita (mixed lymphocyte reaction) [Damle, et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. 78 (1981) 5 096 - 6 001] ja antigeenispesifis-ten T-solukloonien aktivoitumista [Lesslauer, et ai., Eur.
5 J. Immunol. 16 (1986) 1 289 - 1 296].
Tutkimuksissa on osoitettu, että CD28 on B-solun aktivaatioantigeenin, B7/BB-l:n, vastinreseptori [Linsley, et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87 (1990) 5 031 - 5 035]. Käytännöllisyyssyistä käytetään B7/BB-l-antigee-10 nista tuonnempana nimitystä "B7-antigeeni". CD28:n ja B7-antigeenin välisiä vuorovaikutuksia on luonnehdittu B7-antigeenin ja CD28-reseptorin solunulkoisten osien sekä immunoglobuliinin (Ig) Cyl:n (muuttumattoman alueen raskaat ketjut) geneettisiä fuusioita käyttäen [Linsley, et 15 ai., J. Exp. Med. 173 (1991) 721 - 730]. Immobilisoidun B7Ig-fuusioproteiinin sekä B7-positiivisten CHO-solujen on osoitettu toimivan T-solujen lisääntymisen rinnakkaisina stimuloijina. T-solun stimuloiminen B7-positiivisilla CHO-soluilla stimuloi myös spesifisesti IL-2:n transkriptio-20 tuotteiden määrän lisääntymistä. Muut tutkimukset ovat osoittaneet, että anti-CD28-mAb inhiboi sellaista IL-2:n muodostumista, joka oli käynnistynyt tietyissä T-solu-l i : leukemiasolulinjoissa solujen välisistä vuorovaikutuksista :Y; B-soluleukemia-solulinjan kanssa [Kohno, et ai., Cell.
* 1 25 Immunol. 131 (1990) 1 - 10].
: CD28:lla on yksi solunulkoista vaihtelevaa aluetta • · .·, ; (V) muistuttava domeeni (Aruffo ja Seed, edellä) . Homolo- ginen molekyyli, CTLA4, on tunnistettu sytolyyttisen mu- • · riini-T-solu-cDNA-kirjaston erotteluseulonnan avulla 30 (Brunet, et ai., Nature 328 (1987) 267 - 270]. Tämän mole- ··2 kyylin transkriptiotuotteita on havaittu T-solupopulaati- # » · *...· oissa, joilla on sytotoksista aktiivisuutta, mikä viittaa siihen, että CTLA4 saattaisi toimia sytolyyttisessä reak-tiossa (Brunet, et ai., edellä; ja Brunet, et ai., Immu- • · 35 nol. Rev. 103 (1988) 21 - 36]. Tutkijat ovat julkaisseet 1 · i » 2 ♦ · 6 115057 tutkimusraportteja CTLA4:ää vastaavan ihmisen geenin kloonauksesta ja kartoittamisesta [Dariavach, et ai., Eur. J. Immunol. 18 (1988) 1 901 - 1 905] samaan kromosomi- alueeseen (2q33 - 34) kuin CD28 [Lafage-Pochitaloff, et 5 ai., Immunogenetics 31 (1990) 198 - 201]. Tämän humaani- CTLA4-DNA:n ja CD28-proteiineja kodaavan DNA:n jaksojen vertaaminen keskenään on paljastanut merkittävää jaksojen homologiaa, jossa homologisuusaste on suurin jukstamem-braanisilla ja sytoplasmisilla alueilla (Brunet, et ai., 10 1986, edellä; Dariavach, et ai., 1988, edellä).
CD28:n ja CTLA4:n välinen korkeanasteinen homologia sekä niiden geenien paikantuminen samaan paikkaan nostaa esiin kysymyksen siitä, muistuttavatko nämä molekyylit myös toiminnallisesti toisiaan. Koska 15 CTLA4:n proteiinituotetta ei ole vielä onnistuttu ilmentämään, niin nämä kysymykset jäävät kuitenkin vastausta vaille.
Immunoglobuliinien yläryhmään kuuluvien solun pinnan glykoproteiinien liukoisia johdannaisia, jotka ovat 20 HIV-l:n reseptorina toimiva CD4-reseptori ja CD28- ja B7-reseptorit, on ilmennetty käyttäen sellaisista DNA-jaksoista koostuvia hybridifuusiomolekyylejä, jotka koodaavat • « : CD4-reseptorin solunulkoisen domeenin osia vastaavia aminohappoja ja jotka on yhdistettu vasta-aineen domee- ;\j 25 neihin {immunoglobuliinin γΐ [Capon, et ai., Nature 337 .·. .1 (1989) 525 - 531] (CD4) ja Linsley, et ai., J. Exp. Med., • < · .·, j edellä (CD28 ja B7) } .
* t e
Olisi käyttökelpoista kyetä ilmentämään CTLA4-gee- • · nin liukoista proteiinituotetta, jota ei ole vielä kyetty 30 ilmentämään, ja tunnistaa CTLA4:n luonnollinen ligandi, » 1 · ··· joka osallistuu toiminnallisiin T-soluvasteisiin.
* » · * » • ·
• I
» t 0 * · · • mm * · • · 1 > ♦ » » I t | 1 7 115057
Keksinnön yhteenveto
Edellä sanotun perusteella tästä keksinnöstä, joka on esitetty tässä hakemuksessa ja tämän hakemuksen kanta-hakemuksessa FI 935795, saadaan käyttöön täydellinen ja 5 virheetön DNA-jakso, joka koodaa CTLA4-reseptoriproteiinia vastaavaa aminohappojaksoa, ja B7-antigeenin on tässä keksinnössä määritetty olevan CTLA4:n luonnollinen ligandi. Tästä keksinnöstä saadaan myös käyttöön menetelmä tämän DNA:n ilmentämiseksi CTLA4:n ja immunoglobuliinin 10 (Ig) fuusioproteiini tuotteena. Tämän keksinnön mukaisiin sovellutusmuotoihin kuuluvat CTLA4lg-fuusioproteiini ja hybridifuusioproteiinit, joihin kuuluvat CD28Ig/CTLA4Ig-fuusioproteiinit. Siitä saadaan myös käyttöön menetelmiä CTLA4-fuusioproteiinin, B7Ig-fuusioproteiinin, hybridifuu-15 sioproteiinien ja näiden fragmenttien ja/tai johdannaisten, kuten CTLA4:n ja B7-antigeenin kanssa reaktioky-kyisten monoklonaalisten vasta-aineiden, käyttämiseksi sään-nöstelemään solujen vuorovaikutuksia ja immuunivasteita.
Esillä olevan keksinnön kohteena on se, mitä 20 esitetään patenttivaatimuksissa.
Tämän keksinnön mukaista humaani-CTLA-reseptori- proteiinia koodaa 187 aminohappoa ja siihen sisältyy : äskettäin tunnistettu N-välitteisen glykosylaation kohta.
;V: Tämän keksinnön mukainen CTLA4Ig-fuusioproteiini * · : 25 sitoo B7-antigeenia, joka ilmentyy aktivoitujen B-solujen • » .·. : ja muiden kehityslinjojen solujen pinnalla ja joka on T- ^ | solujen pinnalla olevan CD28-reseptorin ligandi. CTLA4Ig • 1 · sitoo B7-antigeenia merkittävästi suuremmalla affinitee- • · ·** tiliä kuin millä B7:n sitoutuminen CD28-reseptoriin tapah- 30 tuu. CTLA4Ig-konstruktio sisältää ensimmäisen aminohappo-jakson, joka vastaa CTLA4:n reseptorin solunulkoista do- • s · ·...· meenia ja joka on fuusioitu toiseen aminohappo jaksoon, .·. : joka vastaa humaani-Ig:n Cyl-domeenia. Ensimmäinen amino- • · happo jakso sisältää aminohapporyhmät, jotka ulottuvat • » • · 35 CTLA4:n solunulkoista domeenia vastaavan aminohappojakson 8 115057 aseman 1 kohdalta aseman 125 kohdalle ja jotka on liitetty toiseen aminohappojaksoon, joka sisältää humaani-Ig:n
Cyl:n sarana-, CH2- ja CH3-alueita vastaavat aminohappo-ryhmät. Fuusioproteiinia tuotetaan edullisesti dimeerises-5 sä muodossa. Liukoinen CTLA4Ig on voimakas T- ja B-lymfo-syyttivasteiden inhibiittori in vitro -olosuhteissa.
Tähän keksintöön ajatellaan myös kuuluvan hybridi-fuusioproteiinit, kuten CD28Ig/CTLA4Ig-fuusioproteiinit, jotka sitoutuvat B7-antigeeniin ja joissa on ensimmäinen 10 aminohappojakso, joka vastaa CD28:n solunulkoisen domeenin fragmentteja ja joka on liitetty toiseen aminohappojaksoon, joka vastaa CTLA4Ig:n solunulkoista domeenia vastaavia fragmentteja, ja kolmas aminohappojakso, joka vastaa humaani-IgCyl:n sarana-, CH2- ja CH3-alueita. Hybridi-15 fuusioproteiinien yksi sovellutusmuoto on CD28Ig/CTLA4Ig-fuusiokonstruktio, jossa on ensimmäinen aminohappojakso, joka sisältää CD28:n solunulkoista domeenia vastaavan aminohappojakson aminohapporyhmät aseman 1 kohdalta aseman 94 kohdalle ja joka on liitetty toiseen aminohappojaksoon, 20 joka sisältää CTLA4:n solunulkoista domeenia vastaavan aminohappojakson aminohapporyhmät aseman 94 kohdalta aseman 125 kohdalle, jotka jaksot on liitetty kolmanteen .1.· : aminohappojaksoon, joka sisältää sarana-, CH2- ja CH3- :V: alueita vastaavat humaani-Ig:n Cyl:n aminohapporyhmät.
: 25 Keksintöön sisältyy myös in vitro -menetelmä T-so- .·. : lujen ja muiden solujen vuorovaikutusten säännöstelemi- j seksi inhiboimalla CTLA4-positiivisten T-solujen ja B7- * 1 · positiivisten solujen välistä vuorovaikutusta siten, että • · • 1 ’·1 T-solut saatetaan reagoimaan CTLA4-reseptorin ligandien 30 kanssa. Näihin ligandeihin kuuluvat CTLA4-reseptorin
I M
kanssa reagoimaan kykenevä monoklonaalinen vasta-aine ja *...· vasta-ainefragmentit.
: Tässä keksinnössä on kuvattu CTLA4Ig-fuusio- • · proteiinin kanssa reagoimaan kykenevä monoklonaalinen vas- • · 35 ta-aine ja CD28Ig/CTLA4Ig-fuusioproteiinin kanssa reagoi- • 1 » i · • · 1 »tl · 9 115057 maan kykenevä monoklonaalinen vasta-aine, joita käytetään solujen vuorovaikutusten säännöstelemiseen in vitro.
Keksinnössä on myös kuvattu uusi kiinanhamsterin munasarjasolulinja, joka ilmentää pysyvästi CTLA4Ig- 5 fuusioproteiinia.
Piirustusten kuvaus
Kuvio 1 on kaavio CTLA4Ig-fuusiokonstruktioista, jotka on kuvattu tuonnempana esimerkissä 2.
Kuvio 2 on valokuva geelistä, joka on saatu 10 CTLA4lg:n kromatografisesta puhdistuksesta SDS-PAGE:lla tuonnempana esimerkissä 2 kuvatulla tavalla.
Kuvio 3 on humaani-CTLA4-reseptoria koodaava täydellinen aminohappojakso (jaksotunnisteet nro 13 ja 14), joka on fuusioitu onkostatiini M:n signaalipeptidiin (ase-15 masta -25 asemaan -1) ja johon sisältyy äskettäin tunnistettu N-välitteisen glykosylaation kohta (asemat 109 -111), tuonnempana esimerkissä 3 kuvatulla tavalla.
Kuvio 4 esittää FACSR-analyysituloksia, jotka on saatu B7Ig-fuusioproteiinin sitoutumisesta CD28:lla ja 20 CTLA4:llä transfektoituihin COS-soluihin tuonnempana esi merkissä 4 kuvatulla tavalla.
Kuvio 5 esittää FACSR-analyysituloksia, jotka on : : : saatu puhdistetun CTLA4Ig:n sitoutumisesta B7-antigeeni- :V: positiivisten (B7+) CHO-solujen pintaan ja lymfoblastoidi- ;: 25 sen solulinjan (PM LCL) pintaan tuonnempana esimerkissä 4 • · .·. : kuvatulla tavalla.
#·# _1 Kuvio 6 on graafinen esitys, joka kuvaa kompetitii- * · "1 125 vista sitoutumisanalyysia, jossa on tutkittu I-leimalla
• I
·" varustetun B7Ig:n sitoutumista immobilisoituun CTLA4Ig:hen 30 tuonnempana esimerkissä 4 kuvatulla tavalla.
·.: Kuvio 7 on graafinen esitys, jossa on esitetty of
Scatchard-analyysin tulokset 125I-leimalla varustetun : B7Ig.1n sitoutumisesta immobilisoituun CTLA4Ig:hen tuonnempana esimerkissä 4 kuvatulla tavalla.
35 t
1 » 1 I
10 115057
Kuvio 8 on valokuva, joka esittää geeliä B7-posi- 1 o e tiivisten CHO-solujen ja pinnastaan I-leimalla varustettujen PM LCL -solujen immunosaostusanalyysin SDS-PAGE-kromatografiästä, joka suoritettiin tuonnempana esimerkis-5 sä 4 kuvatulla tavalla.
Kuvio 9 on graafinen esitys CTLA4Ig:n vaikutuksista T-solujen lisääntymiseen määritettynä [3H]-tymidiinin kerääntymisestä soluihin tuonnempana esimerkissä 4 kuvatulla tavalla.
10 Kuvio 10 on pylväskaavio, joka kuvaa CTLA4Ig:n vai kutuksia auttaja-T-solujen (Th-solut) käynnistämään humaa-ni-B-solujen immunoglobuliinien eritykseen määritettynä entsyymi-immunomäärityksellä (ELISA) tuonnempana esimerkissä 4 kuvatulla tavalla.
15 Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus
Seuraava selitys on esitetty syventämään kuvatun keksinnön ymmärtämistä.
Keksintö käsittää sellaisen T-solujen pinnalla esiintyvän humaani-CTLA4-reseptorin eristämisen ja ilmen- 20 tämisen, joka sitoutuu aktivoitujen B-solujen ja muiden kehityslinjojen solujen pinnalla ilmentyvään B7-antigee- niin, sekä CTLA4-reseptorigeenin liukoisten fuusioproteii- : nituotteiden ilmentämisen. Keksinnöstä saadaan myös käyt- ♦ * · · töön menetelmiä ilmennetyn CTLA4-reseptorin käyttöön solu- • * .·. : 25 jen vuorovaikutusten säännöstelemiseksi, mukaan lukien T- • * · .·. J solujen ja B7-positiivisten solujen vuorovaikutukset.
« · · I Edullisessa sovellutusmuodossa humaani-CTLA4- • * · • *« reseptoriproteiinia vastaavaa aminohappo jaksoa koodaava • · *···’ täydellinen ja virheetön DNA-jakso kloonataan PCR:ää 30 käyttäen. CTLA4:n täydellisen ennustetun koodaavan jakson sisältävä cDNA koottiin kahdesta PCR-fragmentista, jotka » f | !it>: oli amplifioitu H38-RNA:sta, ja se liitettiin CDM8- ,·. ,· ilmentämisvektoriin tuonnempana esimerkeissä yksityis- 1 » · ! kohtaisesti kuvatulla tavalla. Isolaatiot transfektoitiin » > * « · • · . 35 COS-soluihin ja niistä tutkittiin kyky sitoa B7Ig:tä, joka * » · * * * » i » »
i M I I
11 115057 on liukoinen fuusioproteiini, jonka aminohappojakso vastaa B7:n solunulkoista domeenia ja humaani-immunoglobuliinin (Ig) Cyl-aluetta, ja joka on kuvattu julkaisussa Linsley, et ai., J. Exp. Med. 173 (1991) 721 - 730.
5 Tämän jälkeen määritettiin yhden isolaation, jolle annettiin nimitys OMCTLA4, DNA-jakso ja sen havaittiin vastaavan tarkalleen humaani-CTLA4:n ennustettua jaksoa, joka oli fuusioitu onkostatiini M:stä peräisin olevan signaalipeptidin N-terminaaliseen päähän. CTLA4:n resepto-10 ria koodaa 187 aminohappoa (signaalipeptidiä ja lopetus-kodoneja lukuunottamatta) ja se sisältää äskettäin tunnistetun N-välitteisen glykosylaation kohdan aminohappoase-missa 109 - 111 (katso tuonnempana oleva kuvio 3). CTLA4-reseptoria ilmennetään käyttäen onkostatiini M:n signaali-15 peptidiä.
Toisessa edullisessa sovellutusmuodossa valmistetaan CTLA4-reseptorigeenin proteiinituotteen (CTLA4Ig) liukoisia muotoja käyttäen fuusioproteiineja, joissa on ensimmäinen aminohappojakso, joka vastaa CTLA4:n solun-20 ulkoista domeenia ja toinen aminohappojakso, joka vastaa humaani-Ig:n Cyl-domeenia. Konstruoitiin kloonaus- ja ilrnentämisplasmidit (CDM8 ja nLN), jotka sisälsivät cDNA-.· .·, molekyylejä, jotka koodasivat tässä keksinnössä kuvattuun S.,·' cDNA:han perustuvaa humaani-CTLA4-reseptoria vastaavan * · 25 aminohappo jakson osia, jossa CTLA4-reseptorigeenin solun- ’ ] ulkoisen domeenin fragmenttia vastaavaa ensimmäistä amino- • * · ’· ’· happo jaksoa koodaava cDNA on liitetty DNA: hän, joka koodaa * · · ’· ‘ί toista aminohappojaksoa, joka vastaa Ig:n C-aluetta, joka mahdollistaa CTLA4-reseptorigeenin ilmentymisen muuttamal-30 la ilmennetyn CTLA4-proteiinin liukoisuutta. Liukoista :· CTLA4Ig-fuusioproteiinia koodaa siten ensimmäinen amino- happojakso, joka sisältää CTLA4:n solunulkoisen domeenin , aminohappojaksoa vastaavat aminohapporyhmät aseman 1 koh- » * i • j dalta aseman 125 kohdalle ja joka on liitetty toiseen 35 aminohappojaksoon, joka sisältää humaani-Ig:n Cyl:n sara- 12 115057 na-, CH2- ja CH3-alueita vastaavat aminohapporyhmät. Fuu-sioproteiinia tuotetaan edullisesti dimeerisessä muodossa. Konstruktio transfektoitiin sitten COS- tai CHO-soluihin ja CTLA41g puhdistettiin ja sen tunnistettiin olevan di-5 meeri.
CTLA4Ig-fuusioproteiinia vastaavaa aminohappojaksoa koodaava DNA on talletettu 31.5.1991 Budapestin sopimuksen ehtojen mukaisesti talletuslaitokseen American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland, ja sille 10 on annettu ATCC:n hakunumero 68 629.
Tästä keksinnöstä saadaan ensimmäistä kertaa käyttöön liukoisen fuusioproteiinin muodossa oleva CTLA4-transkriptiotuotteiden tuottama proteiini. CTLA4lg-pro-teiini muodostaa disulfidin yhdistämän dimeerin, jonka 15 alayksikköjen Mr on noin 50 000, mikä viittaa siihen, että natiivi CTLA4 on todennäköisesti T-solun pinnalla di-sul-fidin yhdistämänä homodimeerinä.
B7-antigeenin on osoitettu olevan T solujen pinnalla olevan CD28-reseptorin ligandi (Linsley, et ai., Proc.
20 Natl. Acad. Sei. USA, edellä). CTLA4-reseptorimolekyyli näyttää muistuttavan toiminnallisesti ja rakenteellisesti CD28- reseptoria; kummatkin ovat B-solun aktivaatioanti-·,· | geenin, B7:n, reseptoreita, samalla kun CTLA4:n affini- : : i teetti B7:ää kohtaan vaikuttaa olevan suurempi, ja se on 25 lymfoidisten adheesio jär jestelmien joukossa suurin tähän • » .*· : mennessä raportoitu affiniteetti. CTLA4Ig:n onkin osoi- • * + .·. : tettu sitoutuvan B7-positiivisiin (B7 ) solulinjoihin • » · .·.·] CD28lg:tä voimakkaammin. Muut kokeet ovat osoittaneet, että CTLA4 on B7-antigeenin reseptori, jonka affiniteetti 30 CD28-reseptorin affiniteettia suurempi. CTLA4Ig:n on osoi-tettu lisäksi sitoutuvan lymfoblastoidisten solujen pin- • * nalla olevaan yhteen proteiiniin, joka on kooltaan saman-:*·,· lainen kuin B7-antigeeni. CTLA4Ig inhiboi T-solujen li- sääntymistä ja se inhiboi Th:n käynnistämää IgM:n muodos-35 tumista.
( · > 13 115057
Toisessa edullisessa sovellutusmuodossa konstruoitiin hybridifuusioproteiineja, joissa oli erilaisten re-septoriproteiinien fragmentteja vastaavia aminohappo-jaksoja. Esimerkiksi CD28:n ja CTLA4:n solunulkoisten do-5 meenien valikoituja fragmentteja vastaavat aminohappo-jaksot liitettiin yhteen CD28Ig/CTLA4Ig-hybridifuusio-proteiinien valmistamiseksi. Siten saatiin CD28Ig:n ja CTLA4Ig:n fuusioproteiini, jossa oli ensimmäinen amino-happojakso, joka sisälsi CD28:n solunulkoisen domeenin 10 fragmenttia vastaavat aminohapporyhmät ja joka oli liitetty toiseen aminohappojaksoon, joka vastasi CTLA4Ig:n solunulkoisen domeenin fragmenttia ja jotka jaksot oli liitetty kolmanteen aminohappojaksoon, joka vastasi humaani-Ig:n Cyl:n sarana-, CH2- ja CH3-alueita. Hybridifuusio-15 proteiinien yksi sovellutusmuoto on CD28lg:n ja CTLA4Ig:n fuusiokonstruktio, jossa on ensimmäinen aminohappojakso, joka sisältää CD28:n solunulkoista domeenia vastaavassa aminohappojaksossa olevat aminohapporyhmät aseman 1 kohdalta aseman 94 kohdalle ja joka on liitetty toiseen 20 aminohappojaksoon, joka sisältää CTLA4:nsolunulkoista domeenia vastaavassa aminohappojaksossa olevat aminohappo-ryhmät aseman 94 kohdalta aseman 125 kohdalle, jotka jak- • sot on liitetty kolmanteen aminohappo jaksoon, joka vastaa humaani-IgCyl: n sarana-, CH2- ja CH3-alueita.
.·.: 25 CTLA4-reseptoriproteiinia, liukoisia fuusioproteii- · neja ja hybridifuusioproteiine ja vastaavia aminohappo jak- .* ! so ja koodaavien DNA-jaksojen kloonaamiseen ja ilmentämi- • * · I.,* seen käytetyt menetelmät, esimerkiksi oligonukleotidien synteesi, PCR, solujen transformointi, vektorien, ilmentä-30 misjärjestelmien ja muiden näitä vastaavien järjestelmien » konstruktiot ovat tällä alalla tunnettuja ja useimmat nii- i * t den käyttäjät tuntevat ne tavalliset lähtömateriaalit, : jotka vastaavat tiettyjä olosuhteita ja menetelmiä. Seu- * I · | raavat kappaleet on kuitenkin esitetty helpottamaan käsi- * * . 35 teltävien asioiden seuraamista ja selvittämään tarpeelli- 14 115057 set muutokset minkä lisäksi ne voivat toimia suuntaviivana .
Reseptoreja ja fuusioproteiineja koodaavien jaksojen kloonaus ja ilmentäminen 5 CD28IgCyl:tä ja B7IgCYl:tä vastaavat fuusio- proteiinikonstruktiot tämän keksinnön mukaisen CTLA4Ig:n luonnehtimiseksi ja CD28lg:n ja CTLA4Ig:n fuusiohybridien muodostaamiseksi valmistettiin julkaisussa Linsley, et ai., J. Exp. Med. 173 (1991) 721 - 730, esitetyllä taval-10 la, joka julkaisu on liitetty tähän keksintöön siihen oikeuttavien säädösten nojalla. cDNA-kloonit voidaan vaihtoehtoisesti valmistaa vakiomenetelmiä käyttäen RNA:sta, joka on saatu B7-antigeenia ja CD28-reseptoria ilmentävistä soluista, näiden proteiinien julkaistuja jaksoja kos-15 kevan tiedon perusteella (Aruffo ja Seed, sekä Freeman, edellä).
CTLA4Ig-fuusiot, jotka koostuivat CTLA4:n solun-ulkoista domeenia vastaavia aminohappojaksoja koodaavasta DNA:sta ja humaani-IgCyl:n sarana-, CH2- ja CH3-alueita 20 koodaavasta DNA:sta, konstruoitiin ligatoimalla PCR-frag-mentteja. Aminohappojaksoja koodaava cDNA amplifioitiin käyttäen polymeraasiketjureaktio ("PCR") -menetelmää [tätä « · jj j on käsitelty julkaisuissa US-patentti nro 4 683 195 ja US- :Y: patentti nro 4 683 202, Mullis, et ai.; ja Mullis & • · :**,· 25 Faloona, Methods Enzymol. 154 (1987) 335 - 350] . Hankit- : tiin käyttöön CTLA4lg-fuusiopolypeptidejä menetellen niin, • · .·, ; että hankittiin DNA:ta, joka koodasi aminohappojaksoja, • ► · jotka sisälsivät aminohapporyhmät CTLA4:n solunulkoista t · domeenia vastaavan aminohappojakson aseman 1 kohdalta ase-30 man 125 kohdalle, ja DNA:ta, joka koodasi Ig:n Cyl:n sara- « » 1 ··.·' na-, CH2- ja CH3-alueita vastaavia aminohappojaksoja.
• 1 1 *...· Koska CTLA4-reseptoriproteiinin ilmentämistä .·. : humaanilymfoidisoluissa ei ole aiemmin raportoitu, oli tarpeellista paikantaa CTLA4-mRNA:n lähtömateriaali. Seu- • . 35 lottiin PCR cDNA:ta, joka oli valmistettu useiden humaani- • · · * · > * · · » · 15 115057 leukemiasolulinjojen solujen kokonais-RNA:sta käyttäen alukkeina CTLA4-geenin julkaistusta jaksosta peräisin olevia oligonukleotideja (Dariavach, et ai., edellä). Paras odotettua kokoa olevien PCR-tuotteiden saanto tutkituista 5 cDNA-molekyyleistä saatiin H38-soluista (HTLV II:een liittyvä leukemiasolulinja). Koska CTLA4-geenistä ei tunnistettu CTLA4:n signaalipeptidiä, fuusioitiin CTLA4:n ennustetun jakson N-terminaalinen pää kahdessa vaiheessa onko-statiini M:n signaalipeptidiin [Malik, et ai., Molec. and 10 Cell. Biol. 9 (1989) 2847] käyttäen tuonnempana esimer keissä kuvattuja oligonukleotidejä. PCR-reaktion tuote ligatoitiin yhdessä Ig:n Cyl:n sarana-, CH2- ja CH3-aluei-ta vastaavia aminohappojaksoja koodaavan cDNA:n kanssa ilmentämisvektoriin, kuten CDMS:ään tai nLNrään.
15 Täysimittaista humaani-CTLA4:ää koodaavan DNA: n aikaansaamiseksi hankittiin H38-soluista käyttöön PCR:n avulla tuonnempana esimerkeissä kuvattuja oligonukleotidi-alukkeita käyttäen CTLA4:n transmembraani- ja sytoplasmi-sia domeeneja koodaava cDNA-molekyyli, joka liitettiin 20 CTLA4lg:stä peräisin olevaan fragmenttiin, joka oli saatu edellä kuvatulla tavalla ja joka koodasi CTLA4:n N-termi-naaliseen päähän fuusioitua onkostatiini M:n signaalipep-: tidiä. PCR-fragmentit ligatoitiin plasmidiin CDM8, josta saatiin tulokseksi täysimittaista CTLA4-geeniä koodaava .\ j 25 ilmentämisplasmidi, jolle annettiin nimitys OMCTLA4.
.·. : Hybridifuusioproteiineja vastaavaa aminohappojaksoa | koodaavan DNA:n konstruoimiseksi liitetään DNA, joka koo- daa yhden reseptorigeenin solunulkoisen domeenin osia vas- * · ··· taavia aminohappoja, DNA:hän, joka koodaa toisen resepto- 30 rigeenin solunulkoisen domeenin osia vastaavia aminohappo-ja sekä DNA:han, joka koodaa humaani-IgCyl:n sarana-, CH2- • · 1 ja CH3-alueita vastaavia aminohappojaksoja käyttäen edellä : B7Ig:n, CD28lg:n ja CTLA4Ig:n konstruktioita koskevia edellä kuvattuja valmistusmenetelmiä. Siten esimerkiksi . 35 DNA, joka koodaa aminohapporyhmiä, jotka vastaavat CD28- ♦ · » » · · · 16 115057 reseptorin solunulkoisen domeenin aminohappojaksoa aseman 1 kohdalta aseman 94 kohdalle, liitetään DNA:hän, joka koodaa aminohapporyhmiä, jotka vastaavat CTLA4-reseptorin solunulkoisen domeenin aminohappojaksoa aseman 94 kohdalta 5 aseman 125 kohdalle, sekä DNA:hän, joka koodaa humaani-Ig:n Cyl:n sarana-, CH2- ja CH3-alueita vastaavia amino-happojaksoja.
Jotta saataisiin valmistettua suuria määriä kloonattua DNA:ta, transformoidaan tämän keksinnön mukaisia 10 fuusiokonstruktioita koodaavan DNA:n sisältävät vektorit sopiviin isäntäsoluihin, kuten E. coli -bakteerisolulinjan MC1061/p3-kantaan (Invitrogen Corp., San Diego, CA) käyttäen vakiomenetelmiä ja pesäkkeistä seulotaan asianmukaiset plasmidit.
15 Kloonit, jotka sisältävät fuusiokonstruktioita koo- daavaa DNA:ta ja jotka on saatu edellä kuvatulla tavalla, transfektoidaan sitten sopiviin isäntäsoluihin niiden ilmentämistä varten. Transfektio suoritetaan käytetyn isäntäsolun mukaan näille soluille soveltuvia vakiomene-20 telmiä käyttäen. Esimerkiksi transfektio nisäkässoluihin suoritetaan käyttäen DEAE-dekstraanin avulla suoritettua transfektiota, saostamista yhdessä CaPCuin kanssa, lipofek-: tiota, elektroporaatiota tai protoplastifuusiota ja muita tällä alalla tunnettuja menetelmiä, joihin kuuluvat lysot- j 25 syymifuusio tai erytrosyyttifuusio, kaapiminen (scraping), • · .·, : suora soluihin kerääntyminen, osmoottinen tai sakkaroosi- » * · S' | sokki, suora mikroinjektio, epäsuora mikroinjektio, kuten • · · erytrosyytin välityksellä käytettävät menetelmät ja/tai • · ”* isäntäsolujen käsittely sähkövirralla. Edellä olevan luet- 30 telon transfektiomenetelmistä ei katsota olevan tyhjentä- ··.: vä, koska muita menetelmiä geneettisen informaation tuomi- * · · *...· seksi soluihin tullaan epäilemättä kehittämään.
: Ilmentäminen on edullista suorittaa monisoluisista organismeista peräisin olevissa eukaryoottisissa isäntä- • 35 soluviljelmissä [näitä on käsitelty teoksessa Tissue * · · » · · • · · a • i 115057 π
Cultures, Academic Press, Cruz ja Patterson, toim. (1973)]. Näillä järjestelmillä on lisäksi se etu, että ne kykenevät irrottamaan introneja ja niitä voidaan siten käyttää suoraan genomista peräisin olevien fragmenttien 5 ilmentämiseen. Käyttökelpoisiin isäntäsolulinjoihin kuuluvat kiinanhamsterin munasarja- (CHO), apinan munuais-(COS) , VERO- ja HeLa-solut. Tässä keksinnössä ovat edullisia solulinjat, joissa fuusiokonstruktioiden ilmentyminen on pysyvää.
10 Näille soluille soveltuviin ilmentämisvektoreihin sisältyy tavallisesti nisäkässolujen suhteen yhteensopivia promoottoreita ja ilmentymistä ohjaavia jaksoja, kuten esimerkiksi CMV:n promoottori (CDM8-vektori) ja avian sarcoma -virus (ASV) (nLN-vektori). Muihin tavallisesti 15 käytettyihin varhaisiin ja myöhäisiin promoottoreihin kuuluvat Simian Virus 40:stä (SV 40) peräisin olevat promoottorit [Fiers, et ai., Nature 273 (1973) 113] tai muista viruksista, kuten polyomasta, adenovirus 2:sta ja bovine papilloma -viruksesta peräisin olevat promoottorit. Voi-20 daan myös käyttää säännösteltävissä olevaa promoottoria, hMTIIrtä [Karin, et ai., Nature 299 (1982) 797 - 802].
Nisäkässoluisäntäjärjestelmien transformaatioiden yleisiä : :': näkökohtia on kuvannut Axel (julkaisu US-patentti nro • » * 1 4 399 216, joka on myönnetty 16.8.1983). Vaikuttaa nykyi-.·. ; 25 sin siltä, että "enhancer"-alueet ovat tärkeitä ilmentymi- t · .·. ; sen optimoimisessa; nämä ovat tavallisesti jaksoja, jotka * · * ! esiintyvät koodaamattomilla DNA-alueilla promoottorialuee- • · · seen nähden vastasuunnassa tai myötäsuunnassa. Replikaati- ·** on alkukohdat voidaan tarvittaessa saada käyttöön viruk- 30 sista. Liittyminen kromosomiin on kuitenkin yleinen meka- ...i nismi DNA-replikaation aikaansaamiseksi eukaryooteissa.
Vaikka fuusiokonstruktioiden ilmentämiseen soveltu- : viin edullisiin isäntäsoluihin kuuluvatkin eukaryoottiset • * · #>ti; solut, kuten COS- tai CHO-solut, voidaan isäntinä käyttää . 35 muitakin eukaryoottisia mikrobeja. Useimmin käytettyjä • * · ♦ » » » # # · » » 18 115057 ovat Saccharomyces cerevisiaen, leivontahiivan, laborato-riokannat, vaikka muidenkin kantojen, kuten Schizosacchar-omyces pomben, käyttö on mahdollista. Voidaan käyttää vektoreita, joissa käytetään esimerkiksi 2p-plasmidin repli-5 kaation alkukohtaa, Broach, Meth. Enz. 101 (1983) 307, tai muita hiivan suhteen yhteensopivia replikaation alkukohtia [tätä kysymystä on käsitelty esimerkiksi julkaisuissa Stinchcomb, et ai., Nature 282 (1979) 39; Tschempe, et ai., Gene 10 (1980) 157; ja Clarke, et ai., Meth. Enz. 101 10 (1983) 300] . Hiivavektoreiden transkriptiota ohjaaviin jaksoihin kuuluvat glykolyyttisten entsyymien synteesin promoottorit [Hess, et ai., J. Adv. Enzyme Reg. 7 (1968) 149; ja Holland, et ai., Biochemistry 17 (1978) 4900].
Muihin tällä alalla tunnettuihin promoottoreihin kuuluvat 15 CMV:n promoottori, joka saadaan käyttöön CDM8-vektorissa (Toyama ja Okayama, FEBS 268 (1990) 217 - 221; 3-fosfogly-seraattikinaasin promoottori [Hitzeman, et ai., J. Biol. Chem. 255 (1980) 2073] ja muiden glykolyyttisten entsyymien promoottorit. Muita promoottoreja, joilla on lisäksi se 20 etu, että transkriptio tapahtuu kasvuolosuhteiden säännös-telemänä, ovat alkoholidehydrogenaasi 2: n, isosytokromi C:n, happamen fosfataasin, typpimetaboliaan liittyvien * hajottavien entsyymien ja maltoosin ja galaktoosin hyväksy · sikäytöstä vastaavien entsyymien promoottorialueet. Arvel- .·. : 25 laan myös, että koodaavien jaksojen 3'-päässä olevat ter- .·, ; minaattorijaksot ovat haluttuja. Tällaisia terminaattori- • 1 · ! ! jaksoja esiintyy translaatioon osallistumattomalla 3'-puo- t t · leisella alueella, joka sijaitsee hiivasta peräisin ole- • 1 '···' vien geenien koodaavien jaksojen jälkeen.
30 Ilmentämiseen soveltuvina isäntinä voidaan vaihto- ehtoisesti käyttää prokaryoottisia soluja. Prokaryootteja • > » y·’ edustavat useimmin useat erilaiset E. coli -kannat; voi- .·, ; daan kuitenkin myös käyttää muita mikrobikantoja. Tavalli- ! sesti käytettyihin prokaryoottisiin transkriptiota ohjaa- . 35 viin jaksoihin, jotka tässä keksinnössä rajoitetaan niihin > i 1 > 19 115057 jaksoihin, joihin sisältyvät transkription aloittamiseen soveltuvat promoottorit, joissa on vaihtoehtoisesti operaattori sekä ribosomin sitoutumiskohdan jakso, kuuluvat sellaiset tavallisesti käytetyt promoottorit, kuten 5 beeta-laktamaasi- (penisillinaasi-) ja laktoosi- (lac) promoottorijärjestelmät [Chang, et ai., Nature 198 (1977) 1056], tryptofaani (trp) -promoottorijärjestelmä [Goeddel, et ai., Nucleic Acids Res. 8 (1980) 4057] ja lambdasta peräisin oleva PL-promoottori ja N-geenin ribosomin-10 sitoutumiskohta [Shimatake, et ai., Nature 292 (1981) 128] .
Nukleotidijaksoja, jotka koodaavat CD28Ig- ja CTLA4lg-proteiineja ja fuusiohybridiproteiineja, kuten CD28Ig:n ja CTLA4Ig:n yhdistelmää, voidaan ilmentää useis-15 sa erilaisissa edellä kuvatun tyyppisissä järjestelmissä. cDNA voidaan irrottaa sopivilla restriktioentsyymeillä ja ligatoida sopiviin prokaryoottisiin tai eukaryoottisiin ilmentämisvektoreihin tällaista ilmentämistä varten. Koska CD28- ja CTLA4-reseptoriproteiinit esiintyvät luonnossa 20 dimeereinä, arvellaan, että näiden proteiinien ilmentäminen vaatii ilmentämisjärjestelmää, jossa näiden proteiinien on mahdollista muodostua dimeereinä, ennen kuin on ; mahdollista saavuttaa suotuisa lopputulos. Näiden proteii- nien typistetyt muodot (toisin sanoen muodot, jotka ovat « · .·. : 25 muodostuneet lopetuskodonin lisäämisestä proteiinin trans- • « » #·# | membraanialuetta edeltävässä jaksossa olevaan asemaan) ‘ ! eivät näytä ilmentyvän. CD28:n ja CTLA4:n reseptorien il-
» I I
mentäminen fuusioproteiineina mahdollistaa näiden proteii-’···* nien dimeerien muodostumisen. CTLA4-proteiinin ilmentämä- 30 nen fuusiotuotteena on edullista tässä keksinnössä.
Tämän keksinnön mukainen pysyvä CHO-solulinja, joi-
I | I
le annettiin nimitys kiinanhamsterin munasar jasolulinja ,·’ : CTLA4Ig-24, on edullinen CTLA4Ig:n ilmentämiseen ja se on • · * talletettu 31.5.1991 Budapestin sopimuksen mukaisesti . 35 ATCC:hen ja sille on annettu ATCC:n hakunumero 10 762.
* i * t I « • I I · 20 115057 Tämän keksinnön mukaista CTLA4-reseptoria ilmennetään transfektoimalla solulinja, kuten COS-solut, ja ilmentyminen havaitaan sillä perusteella, että CTLA4:llä transfektoidut solut sitoutuvat CTLA4-reseptorin ligan-5 diin, esimerkiksi tutkimalla soluista niiden sitoutuminen B7Ig-fuusioproteiiniin.
Tulokseksi saatujen konstruktioiden jaksot varmistetaan DNA:n sekvenssoinnilla käyttäen tunnettuja menetelmiä, esimerkiksi julkaisussa Sanger, et ai., Proc. Natl. 10 Acad. Sei. USA 74 (1977) 5463, kuvattua menetelmää, jota on kuvattu tarkemmin vielä julkaisussa Messing, et ai., Nucleic Acids Res. 9 (1981) 309, tai käyttäen Maxam, et al.':n menetelmää, Methods Enzymol. 65 (1980) 499.
Proteiinituotteiden talteenotto 15 Kuten edellä mainittiin, CD28- ja CTLA4-reseptori- geenit eivät ilmenny helposti kypsinä proteiineina ilmentämällä suoraan typistettyä proteiinia koodaavaa DNA:ta. Jotta olisi mahdollista muodostaa homodimeeri, yhdistettiin asianmukaisella tavalla proteiineja muokkaamaan kyke-20 nevissä soluissa CD28:n ja CTLA4:n solunulkoisia domeeneja vastaavaa aminohappojaksoa koodaava DNA, joka sisältää signaalijakson kodonit, kuten onkostatiini M:n signaali- : jakson kodonit, luontaisesti dimeerisen proteiinin Fc-do- meenia vastaavaa aminohappo jaksoa koodaavaan DNA: hän. Näi-: 25 den fuusioproteiinituotteiden puhdistuksessa niiden eri- * · t .·, ; tyttyä soluista ovat avuksi vasta-aineet, jotka reagoivat f.‘ ! fuusioproteiinien anti-immunoglobuliiniosan kanssa. Kun fuusioproteiinituote on erittynyt mediumiin, se otetaan talteen tavallisten proteiinien puhdistusmenetelmien avul-30 la, esimerkiksi käsittelemällä se proteiini A -pylväissä.
Käyttö * t » CTLA4Ig:n on tässä keksinnössä osoitettu olevan in .*. : vitro -olosuhteissa sellaisten lymfosyyttien toimintojen * » · ,)1(; voimakas inhibiittori, joissa tarvitaan T- ja B-solujen . 35 vuorovaikutusta. Tämä viittaa B7-antigeenin ja sen vastin- * · » * t 21 115057 reseptorien, CTLA4:n ja/tai CD28:n välisten vuorovaikutusten tärkeyteen. Muriini- ja humaani-CTLA4-molekyylien sytoplasmiset domeenit ovat samanlaiset (Dariavach, et ai., edellä, 1988), mikä viittaa siihen, että tällä 5 alueella on tärkeitä toiminnallisia ominaisuuksia. CD28:n ja CTLA4:n sytoplasmisilla domeeneilla on myös homologiaa keskenään.
CTLA4 on in vitro -olosuhteissa voimakkaampi lymfo-syyttivasteiden inhibiittori kuin kumpikaan anti-BBl- tai 10 anti-CD28-mAb-molekyyleistä. CTLA4Ig:llä ei ole sellaisia suoria stimuloivia vaikutuksia T-solujen lisääntymiseen, joiden vaikutukset olisivat vastakkaisia sen inhibitori-sille vaikutuksille.
Tämän keksinnön mukaisessa sovellutusmuodossa käy-15 tetään T-solujen vuorovaikutusten säännöstelemiseksi muita reagensseja, joihin kuuluvat CTLA4Ig-fuusioproteiinin tai CTLA4-reseptorin kanssa reagoimaan kykenevät johdannaiset. Voidaan esimerkiksi seuloa esiin vasta-aineita ja/tai vasta-ainefragmentteja, jotka kykenevät reagoimaan CTLA4-20 reseptorin kanssa, sellaisten muotojen tunnistamiseksi, jotka kykenevät inhiboimaan CTLA4Ig-fuusioproteiinin sitoutumista B7-antigeeniin.
: Keksinnön mukaisia monoklonaalisia vasta-aineita, * » » * jotka kykenevät reagoimaan CTLA4-reseptorin kanssa, voi-: 25 daan valmistaa hybridoomien avulla, jotka on tehty tunne- ; tuilla menetelmillä, kuten Kohler'in ja Milstein'in * tm I käyttöön tuomilla menetelmillä [tätä on käsitelty julkai- h.· sussa Kohler ja Milstein, Nature, 256 (1975) 495 - 97], ja • · *···* näiden modifikaatioilla solujen vuorovaikutusten säännös- 30 telemiseksi.
...*·* Näihin menetelmiin liittyy sellaisen eläimen käyt-
* * I
ί,,,·’ tö, joka on herkistetty (primed) valmistamaan tiettyä .·, ; nimenomaista vasta-ainetta. Eläin voidaan herkistää ruis- • s · I kuttamalla siihen immunogeeniä (esimerkiksi B7Ig-fuusio- . 35 proteiinia, CTLA4Ig-fuusioproteiinia tai CD28lg/CTLA4Ig- * » · • » · · 22 115057 hybridifuusioproteiinia) halutun immuunivasteen aikaansaamiseksi, toisin sanoen vasta-aineiden tuottamiseksi herkistetystä eläimestä. Herkistetty eläin on myös sellainen, jossa sairaus ilmenee. Tiettyä nimenomaista vasta-5 ainetta voidaan hakea käyttäen lymfosyyttejä, jotka ovat peräisin herkistettyjen sairaiden eläinten imusolmukkeista, pernoista tai periferaalisesta verestä. Haluttuja immunoglobuliineja koodaavien lymfosyyttien kromosomit tehdään kuolemattomiksi fuusioimalla lymfosyytit myelooma-10 soluihin tavallisesti fuusioitumisen aikaansaavan aineen, kuten polyetyleeniglykolin (PEG) läsnä ollessa. Fuusio-partnerina voidaan vakiomenetelmiä noudattaen käyttää mitä tahansa useista myeloomasolulinjoista, esimerkiksi P3-NSl/l-Ag4-l-, P3-x63- Ag8.653-, Sp2/0-Agl4- tai HL1-653- 15 myeloomasolulinjoja. Nämä myeloomalinjat ovat saatavilla talletuslaitoksesta ATCC, Rockville, Maryland.
Tulokseksi saatuja soluja, joihin halutut hybri-doomat sisältyvät, kasvatetaan sitten selektiomediumissa, kuten HAT-mediumissa, jossa fuusioitumattomat parentaali-20 set myelooma- tai lymfosyyttisolut lopulta kuolevat. Ainoastaan hybridoomasolut jäävät eloon ja niitä voidaan kasvattaa rajalaimennusolosuhteissa erillisten kloonien ai-: kaansaamiseksi. Näiden hybridoomien supernatanteista seu- lotaan esiin ne, joiden spesifisyys on halutunlaista, esi- ; 25 merkiksi immunisointiin käytetyn CTLA4Ig-proteiinin avulla • » * tehtävillä immunomääritysmenetelmillä. Positiiviset kloo- » · · ; j nit voidaan sitten jatkokloonata rajalaimennusolosuhteissa • · » ’· ” ja eristää niiden tuottama monoklonaalinen vasta-aine.
Monoklonaalisten vasta-aineiden eristämiseen ja 30 puhdistamiseen voidaan käyttää useita erilaisia tavanomai-siä menetelmiä, joilla ne on tarkoitus puhdistaa muista proteiineista ja kontaminanteista. Monoklonaalisten vasta- * t # .* . aineiden puhdistamiseen tavallisesti käytettyihin menetel- • · · ; miin kuuluvat ammoniumsulfaattisaostus, ioninvaihtokroma- • ft·» 35 tografia ja affiniteettikromatografia [tätä on käsitelty * t · • · # » 23 115057 julkaisussa Zola, et ai., teoksessa Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, Hurell, toim., s.
51 - 52 (CRC Press, 1982)]. Näiden menetelmien mukaisesti valmistettuja hybridoomia voidaan kasvattaa in vitro- tai 5 in vivo -olosuhteissa (askites-nesteessä) käyttäen tällä alalla tunnettuja menetelmiä [näitä on käsitelty yleisesti julkaisussa Fink, et ai., Prog. Clin. Pathol., 9 (1984) 121 - 33, kuva 6-1 sivulla 123].
Yhtä yksittäistä solulinjaa voidaan tavallisesti 10 kasvattaa in vitro -olosuhteissa esimerkiksi laboratorio-kudosviljelypulloissa ja kudosviljelymedium, joka sisältää suuria konsentraatioita yhtä spesifistä monoklonaalista vasta-ainetta, voidaan ottaa talteen dekantoimalla, suodattamalla tai sentrifugoimalla.
15 Voidaan lisäksi valmistaa näiden vasta-aineiden aktiivisen sitovan alueen sisältäviä fragmentteja, kuten Fab-, F(ab')2_ ja Fv-fragmentteja, jotka sisältävät aktiivisen sitovan alueen, jotka kykenevät reagoimaan CTLA4-reseptorin solunulkoisen domeenin kanssa. Näitä fragment-20 teja voidaan valmistaa käyttäen tällä alalla hyväksyttyjä menetelmiä (näitä on käsitelty esimerkiksi julkaisussa Rousseaux, et ai., teoksessa Methods Enzymol. 121 (1986) ; 663 - 69, Academic Press) .
Monoklonaalisia anti-CTLA4-vasta-aineita voidaan » · ,: 25 käyttää in vitro niin, että ne saatetaan sitoutumaan ^ CTLA4-reseptoriin CTLA4-positiivisten T-solujen ja muiden ! [ solujen kesken tapahtuvien vuorovaikutusten inhiboimisek- * 0 | • » · si.
* ·
Toisessa sovellutusmuodossa voidaan CTLA4Ig- 30 fuusioproteiinia käyttää muiden sellaisten yhdisteiden » tunnistamiseen, joilla CTLA4:n ja B7-antigeenin välistä
I I I
vuorovaikutusta kyetään säännöstelemään. Näihin ,·’ : yhdisteisiin voi kuulua pieniä luonnossa esiintyviä * t · ! molekyylejä, joita voidaan käyttää siten, että ne . 35 saatetaan reagoimaan B-solujen ja/tai T-solujen kanssa.
I | * » · 24 115057
Fermentaatioliuoksista voidaan esimerkiksi tutkia niiden kykyä inhiboida CTLA4:n ja B7:n välisiä vuorovaikutuksia.
Seuraavat esimerkit on esitetty tämän keksinnön kuvaamiseksi ja olemaan alan ammattimiehen tukena sen so-5 veltamisessa ja käytössä. Esimerkkien tarkoituksena ei ole millään muulla tavoin rajoittaa tämän keksinnön suojapii-riä.
Esimerkki 1 B7Ig- ja CD28Ig-fuusioprote±±n±en valmistus 10 Reseptorin ja immunoglobuliinin C-gamma (Ig:n Cy) fuusioproteiinit B7Ig ja CD28Ig valmistettiin julkaisussa Linsley, et ai., J. Exp. Med. 173 (1991) 721 - 730, kuvatulla tavalla, joka julkaisu on liitetty tähän keksintöön siihen oikeuttavien säädösten nojalla. Valmistus tapahtui 15 pääpiirteittäin siten, että reseptoriproteiinia (esimerkiksi B7:ää) vastaavia aminohappojaksoja koodaava DNA liitettiin humaani-Ig:n Cyl:n sarana-, CH2- ja CH3-alueita vastaavia aminohappojaksoja koodaavaan DNA:han. Suoritukseen käytetyt vaiheet olivat seuraavat.
20 Polymeraasiketjureaktio (PCR) PCR:n ollessa kyseessä amplifioitiin DNA-fragmentit tuonnempana kuvattuja kullekin fuusioproteiinille soveltu-·,· · via alukepareja käyttäen. PCR-reaktiot (lopullinen tila- :: : vuus 0,1 ml) suoritettiin julkaisussa Kawasaki, teoksessa 25 PCR Protocols, Academic Press, s. 21 - 27 (1990) kuvatulla • · tavalla, joka julkaisu on liitetty tähän keksintöön siihen • · .·. : oikeuttavien säädösten nojalla), Taq-polymeraasipuskurissa • * · .···[ (Stratagene, La Jolla, CA) , joka sisälsi 20 mikromoolia • » kutakin dNTP-molekyyliä; 50 - 100 pikomoolia mainittuja 30 alukkeita; templaatin (1 ng plasmidia tai cDNArta, joka I I » ··;· oli syntetisoitu < 1 pg:sta kokonais-RNA: ta käyttäen sa- • » tunnaista heksameeristä aluketta ja Taq-polymeraasia :*·,» (Stratagene) . Reaktiot suoritettiin lämpökäsittelyn ....: jaksotuslaitteessa (thermocycler) (Perkin Elmer Corp., 35 Norwalk, CT) 16 - 30 syklin ajan (tyypillinen sykli koos- 25 115057 tui vaiheista, jotka olivat 1 min 94 °C:ssa, 1-2 min 50 °C:ssa ja 1 - 3 min 72 °C:ssa).
Plasmidien konstruktio
Ilmentämisplasmidit, jotka sisälsivät CD28:aa koo-5 daavaa cDNA:ta ja jotka on kuvattu julkaisussa Aruffo ja Seed, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84 (1987) 8573, saatiin
Dr. Aruffolta ja Dr. Seed'iltä (Mass General Hospital, Boston, MA) . Plasmidit, jotka sisälsivät CD5:ttä koodaavaa cDNArta ja jotka on kuvattu julkaisussa Aruffo, Cell 61 10 (1990) 1303, saatiin Dr. Aruffolta. Plasmidit, jotka si sältävät B7:ää koodaavaa cDNArta ja jotka on kuvattu julkaisussa Freeman, et ai., J. Immunol. 143 (1989) 2 714, saatiin Dr. Freeman'ilta (Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA). Ensimmäisiin yrityksiin CD28:n ja B7:n liu-15 koisten muotojen ilmentämiseksi tehtiin julkaisussa
Linsley, et ai., J. Exp. Med., edellä, kuvatulla tavalla konstruktiot (OMCD28 ja 0MB7), joihin lisättiin transmem-braanisten domeenien suhteen vastasuuntaan sijaitsevat lopetuskodonit ja joissa natiivit signaalipeptidit kor-20 vattiin onkostatiini Mrstä saadulla signaalipeptidillä [Malik, et ai., Mol. Cell Biol. 9 (1989) 2847]. Nämä valmistettiin käyttäen synteettisiä oligonukleotidejä uudel-: i i leenkonstruktiota varten (OMCD28) tai alukkeina (OMB7) » ♦ f ! PCRrää varten. OMCD28 on CD28-cDNA, jota on sen tehokkaam-25 man ilmentymisen aikaansaamiseksi modifioitu korvaamalla • .·. : signaalipeptidi onkostatiini Mrstä peräisin olevalla ana- | logisella alueella. CD28Ig- ja B7Ig-fuusiokonstruktiot valmistettiin kahdessa osassa. 5'-puoleiset osat valmis-·* tettiin käyttäen templaatteina OMCD28raa ja OMB7rää ja 30 eteenpäin suuntautuvana alukkeena oligonukleotidiä
:: CTAGCCACTGAAGCTTCACCATGGGTGTACTGCTCACAC
• · (jaksotunniste nro 1) (tämä koodaa aminohappojaksoa, joka . 35 vastaa onkostatiini Mm signaalipeptidiä) ja näitä vas- • · • » « » · · * 26 115057 taavina käänteisiä alukkeina joko oligonukloetidiä
TGGCATGGGCTCCTGATCAGGCTTAGAAGGTCCGGGAAA
5 (jaksotunniste nro 2) tai oligonukleotidiä
TTTGGGCTCCTGATCAGGAAAATGCTCTTGCTTGGTTGT
(jaksotunniste nro 3). PCR-reaktioiden tuotteet pilkottiin 10 restriktioendonukleaaseilla (Hind III ja Bel I), katkaisukohtien kohdalta, jotka oli valmistettu PCR-alukkeisiin, ja ne puhdistettiin geelissä.
Fuusiokonstruktioiden humaani-Ig:n Cyl-jaksoja vastaava 3'-puoleinen osa valmistettiin yhdistetyllä kään-15 teistranskriptaasi (peräisin avian myeloblastosis -viruksesta; Life Sciences Associates, Bayport, NY) -PCR-reak-tiolla käyttäen templaattina RNA:ta, jota oli peräisin myeloomasolulinjasta, joka tuotti kimeeristä humaani-mu-riini-mAb-L6:tta (tämä saatiin Dr. P. Fell'iltä ja M.
20 Gaylelta, Bristol-Myers Squibb Company, Pharmaceutical Research Institute, Seattle, WA) . Eteenpäin suuntautuvana alukkeena käytettiin oligonukleotidiä
: V. AAGCAAGAGCATTTTCCTGATCAGGAGCCCAAATCTTCTGACAAAACTCACACATCCC
: 25 CACCGTCCCCAGCACCTGAACTCCTG
» · · • · • · • · * • i » ! (jaksotunniste nro 4) ja käänteisenä alukkeena • ti oligonukleotidiä
30 CTTCGACCAGTCTAGAAGCATCCTCGTGCGACCGCGAGAGC
Ml (jaksotunniste nro 5). Reaktiotuotteet pilkottiin Bcllrllä : ja Xbalrllä ja ne puhdistettiin geelissä. Lopulliset » · konstruktiot koottiin ligatoimalla Hindlllrlla ja Bell:11a . 35 pilkotut fragmentit, jotka sisälsivät CD28- tai B7-jakso-
I I I
11 5057 27 ja, sekä Bcllrllä ja Xbalrllä pilkottu fragmentti, joka sisälsi IgCyl-jaksot, HindIII:lla ja Xbalrllä pilkottuun CDM8:aan. Ligaatiotuotteet transformoitiin MC1061/p3-E. coli -soluihin ja pesäkkeistä seulottiin esiin asianmu-5 kaisia plasmideja sisältävät pesäkkeet. Tulokseksi saatujen konstruktioiden jaksot varmistettiin sekvenssoimalla niiden DNA.
B7:ää koodaava konstruktio sisälsi sellaisia aminohappoja koodaavaa DNA:ta, jotka vastaavat B7:n solunulkoi- 10 sen domeenin aseman 1 kohdalta aseman 215 kohdalle ulottuvia aminohapporyhmiä. CD28:aa koodaava konstruktio sisälsi sellaisia aminohappoja koodaavaa DNA:ta, jotka vastaavat CD28:n solunulkoisen domeenin aseman 1 kohdalta aseman 134 kohdalle ulottuvia aminohapporyhmiä.
15 CD5Ig konstruoitiin samalla tavalla käyttäen eteenpäin suuntautuvana alukkeena oligonukleotidia
CATTGCACAGTCAAGCTTCCATGCCCATGGGTTCTCTGGCCACCTTG
20 (jaksotunniste nro 6) , ja käänteisenä alukkeena oligo nukleotidia
ATCCACAGTGCAGTGATCATTTGGATCCTGGCATGTGAC
25 (jaksotunniste nro 7) . PCR-tuote pilkottiin restriktio- .·. : endonukleaaseilla ja ligatoitiin Ig:n Cylrn fragmenttiin ,·, ; edellä kuvatulla tavalla. Tulokseksi saatu konstruktio !..* (CD5lg) koodasi kypsää proteiinia, jonka aminohappo jakso oli sellainen, että se sisälsi CD5:ttä vastaavan jakson 30 aminohapporyhmät asemasta 1 asemaan 347, kaksi amino- · happoa, jotka olivat syntyneet konstruktion suoritukseen käytetyistä vaiheista (aminohapot DQ), joiden jälkeen tulee Igrn Cylrn sarana-aluetta vastaavia aminohappoja koodaava DNA.
35 28 115057
Soluviljely ja transfektiot COS-solut (apinan munuaissolut) transfektoitiin CD28:aa ja B7:ää ilmentävillä ilmentämisplasmideilla käyttäen Seed'in ja Aruffo'n [Proc. Natl. Acad. Sei. 84 (1987) 5 3365] menetelmän muunnosta, joka julkaisu on liitetty tä hän keksintöön siihen oikeuttavien säädösten nojalla. Soluja lisättiin 18 - 24 h ennen transfektiota niiden kasvattamiseksi käyttäen solumääränä 106 solua halkaisijaltaan 10 cm:n suuruista solunviljelymaljaa kohti. Plasmidi-DNA 10 lisättiin (noin 15 pg/malja) 5 ml:n tilavuudessa seerumi-tonta DMEMrää, joka sisälsi 0,1 mM klorokiiniä ja 600 pg/ ml DEAE-Dextrania, ja soluja inkuboitiin 3 - 3,5 h 37 °C:ssa. Transfektoidut solut käsiteltiin sitten lyhyen aikaa (noin 2 minuuttia) 10-prosenttisella dimetyylisulf-15 oksidilla PBS:ssä ja niitä inkuboitiin 37 °C:ssa 16 - 24 h DMEMissä, jotka sisälsi 10 % FCS:ää. 24 h transfektion jälkeen viljelymedium poistettiin ja korvattiin seerumit-tomalla DMEMrllä (6 ml/malja). Inkubointia jatkettiin 3 päivää 37 °C:ssa, jona ajankohtana kasvatukseen käytetty 20 medium koottiin talteen ja maljoihin lisättiin tuoretta seerumitonta mediumia. 3 päivän jatkoikuboinnin jälkeen 37 °C:ssa solujen kasvatukseen käytetty medium koottiin * : : uudelleen talteen ja solut heitettiin pois.
CD28:aa, CD5:ttä tai B7: ää ilmentävät CHO-solut 25 eristettiin julkaisussa Linsley, et ai., (1991), edellä, • · .·. : kuvatulla tavalla seuraavasti: suoritus tapahtui pääpiir- • · · ,·, . teittäin siten, että CD28:aa, CD5:ttä tai B7:ää ilmentävät • < · transfektantit eristettiin sellaisen yhteistransfektion • «
• I
“* jälkeen, jossa dihydrofolaattireduktaasin suhteen vailli- 30 naiset kiinanhamsterin munasarja (dhfr- CHO) -solut oli * · · ····’ transfektoitu asiaankuuluvan ilmentämisplasmidin ja selek- • « · ·...* tiomarkkerin, pSV2dhfr:n, yhdistelmällä [Linsley, et ai.,
Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87 (1990) 5031], joka julkaisu on liitetty tähän keksintöön siihen oikeuttavien säädösten 35 nojalla. Transfektantit kasvatettiin sitten nousevien me- 29 115057 totreksaattikonsentraatioiden läsnä ollessa siten, että lopulliseksi pitoisuudeksi tuli 1 μΜ, ja niitä kasvatettiin DMEMrssä, jota oli täydennetty 10-prosenttisella fet-aalisella naudanseerumilla (FBS), 0,2-millimolaarisella 5 proliinilla ja 1-mikromolaarisella metotreksaatilla. CHO- solulinjat, jotka ilmensivät suuria CD28- (CD28+ CHO) tai B7- (B7+ CHO) pitoisuuksia, eristettiin käyttäen useita kierroksia fluoresenssilla aktivoituvaa solulajittelua (FACSR) , jonka jälkeen käytettiin 9.3- tai BB-l-mAb-mole-10 kyyleillä tehtyä epäsuoraa immunovärjäystä. CD28:lla transfektoiduista populaatioista eristettiin FACSR:llä myös amplifioituja CHO-soluja, jotka olivat negatiivisia solujen pinnalla ilmentyvien CD28:n tai B7:n (dhfr+ CHO) suhteen.
15 Immunovärjäys ja EACSR-analyysi
Transfektoidut CHO- tai COS-solut tai aktivoidut T-solut analysoitiin epäsuoralla immunovärjäyksellä. CHO-solut poistettiin viljelypulloistaan ennen värjäystä inku-boimalla niitä PBSrssä, joka sisälsi 10 mM EDTAra. Soluja 20 inkuboitiin ensin muriini-mAb-molekyylien 9.3 [Hansen, et ai., Immunogenetics 10 (1980) 247) tai BB-1 (Yokochi, et ai., J. Immunol. 128 (1981) 823] kanssa tai Ig-fuusio- :: : proteiinien kanssa (näiden kaikkien konsentraatio oli :Y; 10 pg/ml DMEMrssä, joka sisälsi 10-prosenttista FCS:ää) 25 1 - 2 h 4 °C:ssa. Tämän jälkeen solut pestiin ja niitä • » .·. ; inkuboitiin vielä 0,5 - 2 h 4 °C:ssa FITCrllä konjugoidun • * 1 t’t l toisen vaiheen reagenssin kanssa [vuohessa tehty anti-mu- riini-Ig-seerumi muriini-mAb-molekyylien kyseessä ollessa • » • t *·· tai vuohessa tehty anti-humaani-Ig Cy -seerumi fuusio- 30 proteiinien kyseessä ollessa (Tago, Inc., Burlingame, CA) ] . Fluoresenssi analysoitiin FACS IVR -solulajittelijal- * « « ·...· la (Becton Dickinson and Co., Mountain View, CA), joka oli .·. : varustettu neljän dekadin logaritmisella vahvistimella.
• · » » * » i * · t · · 30 115057
Ig-fuusioproteiinien puhdistus
Ensimmäistä, toista ja kolmatta koottua erää solujen kasvatukseen käytetystä seerumittomasta kasvatusmedi-umista, joka oli peräisin transfektoiduista COS-soluista, 5 käytettiin lähtömateriaalina Ig-fuusioproteiinien puhdistamiseen. Pienellä nopeudella sentrifugoimalla suoritetun solujätteiden poiston jälkeen medium johdettiin immobili-soitua proteiini A:ta sisältävään pylvääseen (Repligen Corp., Cambridge, MA) (noin 200 - 400 ml mediumia kutakin 10 pakatun geelitilavuuden millilitraa kohti), joka oli tasapainotettu 0,05 M natriumsitraatilla, jonka pH oli 8,0. Mediumin pylvääseen lisäämisen jälkeen pylväs pestiin 1 M kalieumfosfaatilla, jonka pH oli 8, ja sitoutunut proteiini eluoitiin 0,05 M natriumsitraatilla, jonka pH oli 3.
15 Pylväästä koottiin fraktioita, jotka neutraloitiin välittömästi lisäämällä 1/10 niiden tilavuudesta 2 M Tris'iä, jonka pH oli 8. A28o:ssa absorboivan materiaalin huipun sisältävät fraktiot yhdistettiin ja dialysoitiin PBSrää vastaan ennen käyttöä. CD28Ig:n ja B7Ig:n molaariset absorp-20 tiokertoimet olivat 2,4 ja 2,8 ml/mg, vastaavassa järjestyksessä mainittuna, määritettynä absorbanssiltaan tunnettujen liuosten aminohappoanalyysin perusteella. Puhdiste-i tun CD28lg:n ja B7Ig:n sitoutumisaktiivisuuksien saannot i » · * olivat lähes kvantitatiiviset arvioituna B7+- ja CD28+- • · : 25 CHO-solujen epäsuoran fluoresenssivärjäyksen jälkeen tehdyn • * o .·. : FACS -analyysin perusteella.
* · *
Esimerkki 2 • # · • · * !.. ‘ CTLA4Ig-fuusioproteiinin valmistus • * ·"' CTLA4lg:tä koodaava liukoinen geneettinen fuusio 30 CTLA4:n solunulkoisen domeenin ja IgCyl-domeenin välillä
« t I
konstruoitiin samoin kuin edellä kuvattu CD28Ig:n konst- i « » ·,,,· ruktio. CTLA4-geenin solunulkoinen domeeni kloonattiin .·. : PCR:llä käyttäen synteettisiä oligonukleotideja, jotka • * · • | vastasivat julkaistua jaksoa [Dariavach, et ai., Eur.
• · . 35 Jour. Immunol. 18 (1988) 1 901 - 1 905].
i · I · · I · I · · · » * * 31 115057
Koska CTLA4-geenistä ei tunnistettu CTLA4:n signaalipeptidiä, liitettiin CTLA4:n ennustetun jakson N-terminaalinen pää onkostatiini M:n signaalipeptidiin [Malik, et ai., Mol. and Cell. Biol. 9 (1989) 2847] kah-5 dessa vaiheessa käyttäen limittäisiä oligonukleotideja.
Ensimmäisen vaiheen ollessa kyseessä käytettiin eteenpäin suuntautuvana alukkeena oligonukleotidia
CTCAGTCTGGTCCTTGCACTCCTGTTTCCAACCATGGCGAGCATGGCAATGCACGTG-10 GCCCAGCC
(jaksotunniste nro 8) (joka koodasi CTLA4:n 7 N-terminaa-liseen aminohappoon liitettyjä onkostatiini M:stä peräsin olevan signaalipeptidin 15 C-terminaalista aminohappoa), 15 ja käänteisenä alukkeena oligonukleotidia
TTTGGGCTCCTGATCAGAATCTGGGCACGGTTG
(jaksotunniste nro 9) (joka koodasi aminohapporyhmiä 119 - 125 20 CTLA4-reseptoria koodaavasta aminohappojaksosta ja joka sisältää Bel I -restriktioentsyymikohdan). Tämän vaiheen templaatti oli cDNA, joka oli syntetisoitu 1 pg:sta H38 ' ; soluista peräisin olevaa kokonais-RNA:ta (HTLV-II:lla ;Y; infektoitu T-soluleukemiasolulinja, joka oli saatu Dr.
*.J 25 Salahudin'ilta ja Dr. Gallo'lta, NCI, Bethesda, MD). Osa ·.: ensimmäisestä vaiheesta peräisin olevasta PCR-tuotteesta ·.; amplifioitiin uudelleen käyttäen limittäistä eteenpäin suuntautuvaa aluketta, joka koodaa onkostatiini M: n *’* signaalipeptidin N-terminaalista osaa ja joka sisältää 30 Hind III -restriktioendonukleaasikohdan, > · · »
:: CTAGCCACTGAAGCTTCACCAATGGGTGTACTGCTCACACAGAGGACGCTGCTCAGTC
: TGGTCCTTGCACTC
» · ·
t I t * I
32 115057 (jaksotunniste nro 10) ja samaa käänteistä aluketta. PCR-reaktiotuote pilkottiin Hind 111:11a ja Bcl I:llä ja ligatoitiin yhdessä Bcl Irllä ja Xba I:llä pilkotun ja Ig:n Cyl:n sarana-, CH2- ja CH3-alueita vastaavia amino-5 happojaksoja koodaavan cDNA-fragmentin kanssa Hind 111:11a ja Xba I:llä pilkottuun CDM8-ilmentämisvektoriin tai Hind III :11a ja Xba I:llä pilkottuun nLN-ilmentämisvektoriin (tämä oli saatu Dr. Aruffo'lta).
Tulokseksi saadun CTLA4Ig-fuusiokonstruktion kartta 10 on esitetty kuviossa 1. Tässä kuviossa olevat jaksot esittävät CTLA4:n (isot kirjaimet, varjostamattomat alueet) ja onkostatiini M:n signaalipeptidin, SP, (tummat varjostetut alueet) sekä Ig:n Cyl:n sarana-alueen (H) (pilkutetut alueet) toisiinsa liitettyjä jaksoja. Suluissa oleva amino-15 happo muodostu konstruktiota tehtäessä. Asteriskit (*) osoittavat mutaatioita kysteiinistä seriiniksi, jotka muodostettiin Ig:n Cy:n sarana-alueeseen. Kuvioon on merkitty CTLA4:ssä oleva immunoglobuliiniyläryhmän V:tä muistuttava domeeni, sekä Ig:n Cyl:n CH2- ja CH3-domeenit.
20 CTLA4Ig:n sisältävät CDM8-ilmentämisplasmidit transfektoitiin sitten COS-soluihin DEAE/dekstraani-transfektiolla, joka oli suoritettu Seed'in ja Aruffo'n, • 1987, edellä, kuvaaman suoritusohjeen modifikaatiota : (Linsley, et ai., 1991, edellä) käyttäen.
,· 25 Ilmentämisplasmidikonstruktiot (nLN tai CDMS) , jot- : ka sisälsivät CTLA4Ig:n aminohappo jaksoa koodaavan cDNA:n, .·. : transfektoitiin lipofektiolla vakiomenetelmiä käyttäen • t · dhfr~ CHO-solulinjoihin sellaisten uusien solulinjojen aikaansaamiseksi, jotka ilmensivät pysyvästi CTLA4Ig:tä.
30 CTLA4Ig:tä vastaavaa aminohappojaksoa koodaava DNA
on talletettiin 31.5.1991 Budapestin sopimuksen mukaisesti ATCC:hen ja sille annettiin ATCC:n hakunumero 68 629.
Edullinen CTLA4Ig:tä ilmentävä pysyvä transfektant-ti, jolle annettiin nimitys kiinanhamsterin munasarjasolu-35 linja CTLA4Ig-24, tehtiin seulomalla immunovärjäyksen I I t I | 33 115057 avulla B7-positiivisista CHO-solulinjoista mediumissa olevaa B7:ää sitovaa aktiivisuutta. Transfektantteja kasvatettiin DMEMtssä, jota oli täydennetty 10-prosenttisella fetaalisella naudanseerumilla (FBS), 0,2-millimolaarisella 5 proliinilla ja 1-mikromolaarisella metotreksaatilla.
CHO-solulinja CTLA4Ig-24 talletettiin 31.5.1991 Budapestin sopimuksen mukaisesti ATCC:hen ja sille on annettiin ATCC:n hakunumero 10 762.
CTLA4Ig puhdistettiin proteiini A -kromatografiällä 10 seerumittomista solujen kasvatukseen käytetyistä superna-tanteista (kuvio 2). CTLA4Ig:n konsentraatiot määritettiin olettaen molaarisen aabsorptiokertoimen 280 nm:n kohdalla olevan 1,6 (määritetty kokeellisesti absorbanssiltaan tunnetun liuoksen aminohappoanalyysillä). Moolimassastandar-15 deille (kanavat 1 ja 3, kuvio 2) ja CTLA4Ig-näytteille (1 pg) (kanavat 2 ja 4) tehtiin SDS-PAGE (4 - 12 % akryy-liamidigradientti) pelkistämättömissä olosuhteissa (-βΜΕ, kanavat 1 ja 2) tai pelkistävissä olosuhteissa (+βΜΕ, kanavat 3 ja 4) . Proteiinit visualisoitiin värjäämällä ne 20 Coomassie Brilliant Blue -väriaaineella.
CTLA4Ig liikkui pelkistämättömissä olosuhteissa molekyylityyppinä, jonka Mr oli noin 100 000 ja pelkistä-vissä olosuhteissa molekyylityyppinä, jonka Mr oli noin Y: 50 000 (kuvio 2). Koska Ig:n Cy:n saranan disulfidit pois- γ: 25 tettiin konstruktioiden aikana, on CTLA4Ig CD28Ig:n tavoin ·. : dimeeri, joka otaksuttavasti on liittynyt yhteen natiivin | disulfidisidoksen välityksellä.
Esimerkki 3 CTLA4-reseptori 30 Täysimittaista humaani-CTLA4-geeniä vastaavaa ami- nohappojaksoa koodaavan DNA:n uudelleenkonstruoimiseksi » · · ·...· kloonattiin PCR:n avulla cDNA, joka koodaa CTLA4:n trans- .·. : membraanisen ja sytoplasmisen domeenin fragmenttia vastaa- • · via aminohappoja, joka sitten yhdistettiin cDNA:han, joka . 35 koodasi aminohappoja, jotka vastasivat CTLA4Ig:stä peräi- 34 115057 sin olevaa fragmenttia, joka vastasi CTLA4:n N-terminaali-seen päähän liitetyn onkostatiini M: n signaalipeptidiä. Menetelmät PCR:n, solujen viljelyn ja transfektioiden suorittamiseksi olivat samoja kuin mitä oli kuvattu edellä 5 olevassa esimerkissä 1 ja niissä käytettiin COS-soluja ja DEAE-dekstraanitransfektiota.
Koska CTLA4-reseptoriproteiinin ilmentämistä lym-foidisissa humaanisoluissa ei ole aiemmin raportoitu, oli tarpeellista paikallistaa lähtömateriaali, josta CTLA4-10 mRNArta saataisiin. PCR-kloonaukseen käytettiin edellä mainittua H38-solujen kokonais-RNA:sta käänteistranskrip-toitua PCR-cDNA:ta. Tähän tarkoitukseen käytettiin eteenpäin suuntautuvana alukkeena oligonukleotidia
15 GCAATGCACGTGGCCCAGCCTGCTGTGGTAGTG
(jaksotunniste nro 11) (tämä koodaa ennustetussa koodaa-vassa jaksossa olevaa 11 ensimmäistä aminohappoa) ja käänteisenä alukkeena oligonukleotidia 20
TGATGTAACATGTCTAGATCAATTGATGGGAATAAAATAAGGCTG
• I
·_ j (jaksotunniste nro 12) (tämä on homologinen CTLA4:ssä :V: olevien viimeisten 8 aminohapon suhteen ja se sisältää Xba • · 25 I -kohdan) . Templaattina oli edelleen cDNA, joka oli • « : syntetisoitu 1 pg:sta H38-soluista peräisin olevaa RNA:ta.
• · ,·, : PCR-reaktion tuotteet pilkottiin restriktioendonukle- • * · !..* aaseilla Neo I ja Xba I ja tulokseksi saatu 316 ep:n • · ”* suuruinen tuote puhdistettiin geelissä. Edellä kuvatusta 30 CTLAIg-fuusiosta peräisin oleva 340 ep:n suuruinen Hind
• I I
···! III/Nco I -fragmentti puhdistettiin myös geelissä ja molemmat restriktiofragmentit ligatoitiin Hind 111:11a ja ;\j Xba I:llä pilkottuun CDM8:aan OMCTLA:n muodostamiseksi.
» I
Tulokseksi saatu konstruktio vastasi täysimittais- • · 35 ta CTLA4:ää (jaksotunnisteet nro 13 ja 14) ja onkostatiini * ♦ » » » » t $ 35 115057 M:n signaalipeptidiä. Konstruktio on esitetty kuviossa 3 ja sille annettiin nimitys OMCTLA4. Kuviossa 3 esitetty CTLA4:n jakso eroaa ennustetusta humaani-CTLA4-DNA-jaksosta (Dariavach, et ai., edellä) sellaisella emäsmuutoksel-5 la, ettäesitetyn aminohappojakson aminohappoasemassa 111 aiemmin raportoitu alaniini koodaa treoniinia. Tämä treo-niini on osa äskettäin tunnistettua N-välitteisen glyko-sylaation kohtaa, jolla saattaa olla tärkeä merkitys sille, että fuusioproteiinin ilmentämisessä päästään suotui-10 saan lopputulokseen.
Ligaatiotuotteet transformoitiin E. coli MC1061/ p3-soluihin ja pesäkkeistä seulottiin esiin asianmukaisia plasmideja sisältävät pesäkkeet. Tulokseksi saatujen konstruktioiden jaksot varmistettiin DNA-jakson analyysillä.
15 Esimerkki 4 CTLA4Ig:n luonnehtiminen CTLA4Ig-konstruktioiden luonnehtimiseksi valmistettiin edellä kuvatulla tavalla useita isolaatioita, isolaa-tiot CD28Ig, B7Ig ja CD5Ig, ja ne transfektoitiin COS-so-20 luihin esimerkeissä 2 ja 3 kuvatulla tavalla ja niiden kyky sitoa B7Ig:tä tutkittiin FACSR-analyysillä. Edellä mainittujen konstruktioiden lisäksi käytettiin myös CDM8- ; plasmideja, jotka sisälsivät CD7: ää koodaavia cDNA-mole- • · · * .V. kyylejä ja jotka on kuvattu julkaisussa Aruffo ja Seed, .·. : 25 [EMBO Jour. 6 (1987) 3 313 - 3 316], joka julkaisu on lii- ,·, ; tetty tähän keksintöön siihen oikeuttavien säädösten no- \ ", jalla.
’.. mAb-molekyylit ’·*·’ Monoklonaaliset muriinivasta-aineet (mAb-molekyy- 30 lit) 9.3 (anti-CD28) ja G19-4 (anti-CD3), G3-7 (anti-CD7), » BB-l (anti-B7-antigeeni) ja rotan mAb 187.1 (hiiren κ-ket- i * · ί,,,ί jua vastaan suunnattu mAb) on kuvattu aiemmin [Ledbetter, .·. : et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. 84 (1987) 1384 - 1388; Led- » i · >[i<j better, et ai., Blood 75 (1990) 1531; Yokochi, et ai., . 35 edellä] ja ne puhdistettiin askites-nesteestä ennen käyt- » > i · · 1 1 5057 36 töä. OKT8-mAb:tä tuottava hybridooma hankittiin ATCC:stä, Rockville, MD, ja mAb puhdistettiin samoin askites-nes-teestä ennen käyttöä. mAb 4G9 (anti-CD19) saatiin Dr. E. Engleman'ilta, Stanford University, Palo Alto, CA) . Puh-5 distettu kimeerinen humaani-muriini-mAb LG (tällä on hu-maani-Cylrn Fc-osa) oli saatu lahjaksi Dr. P. Fell'iltä ja M. Gayle'lta (Bristol-Myers Squibb Pharmaceutical Research Institute, Seattle, WA).
Immunovärjäys ja FACSR-analyysi 10 Ennen värjäystä COS- tai CHO-solut poistettiin kasvatuspulloistaan inkuboimalla niitä PBSrssä, joka sisälsi 10 mM EDTA:aa. Soluja inkuboitiin ensin 1 - 2 h 4 °C:ssa mAb-molekyylien tai Ig-fuusioproteiinien kanssa, joiden konsentraatio oli 10 pg/ml, DMEM:ssä, joka sisälsi 15 10-prosenttista FBSrää. Tämän jälkeen solut pestiin ja niitä inkuboitiin vielä 0,5 - 2 h 4 °C:ssa FITC:llä konju-goidun vuohessa tehdyn anti-hiiri-immunoglobuliinin tai FITCrllä konjugoidun vuohessa tehdyn anti-humaani Ig-Cy-seerumin kanssa (molemmat yhtiöstä Tago, Burlingame, CA).
20 Kun samassa kokeessa määritettiin sekä mAb-molekyylien että Ig-fuusioproteiinien sitoutuminen, sekoitettiin toisen vaiheen FITC:llä konjugoidut anti-hiiri- ja anti-hu-: maanireagenssit keskenään ennen käyttöä. Yhteensä 10 000 solun fluoresenssi tutkittiin sitten FACSR:llä.
» 25 Periferaalisen veren lymfosyyttien erottaminen ja • · : stimulointi • I · .·, ; Periferaalisen veren lymfosyytit (PBL-solut) eris- • i t tettiin sentrifugoimalla käyttäen Lymphocyte Separation • ·
Medium'ia (Litton Bionetics, Kensington, MD). Alloreagoi-30 vat T-solut eristettiin PBL-solujen stimuloinnilla primaa- • · ··· risessa lymfosyyttityyppien yhteisreaktiossa (MLR) . PBL- i « * soluja viljeltiin käyttäen säteilytettyjä (5 000 radia) :\j T51 LCL-soluja, joiden solutiheys oli 106/ml. EBVtllä • · transformoituja lymfoblastoidisolulinjoja (LCL) PM (Bris- a a 35 tol-Myers Squibb Co.) ja T51 (Bristol-Myers Squibb Co.) » » · * * · * » * » » i • » 37 115057 kasvatettiin RPMI:ssä, jota oli täydennetty 10-prosentti-sella FBS:llä. Alloreagoivat "blasti"solut pakastettiin kuuden päivän kuluttua niiden säilyttämiseksi. Sekundaariset MLR:t suoritettiin viljelemällä sulatettuja allorea-5 goivia blasteja ja tuoreita säteilytettyjä T51 LCL-soluja mAb-molekyylien ja Ig-fuusioproteiinien läsnä ollessa ja ilman näiden lisäystä. Soluja viljeltiin 96-kuoppaisissa tasapohjaisissa levyissä (4 X 104 alloreagoivaa blastia ja 1 X 104 säteilytettyä T51 LCL solua kuoppaa kohti 0,2 ml:n 10 tilavuudessa) RPMI:ssä, joka sisälsi 10-prosenttista FBS:ää. Solujen lisääntyminen neljästä rinnakkaisesta viljelmästä määritettiin [3H]-tymidiinin kerääntymisestä soluihin 6 viimeisen tunnin aikana 2-3 päivän ikäisessä viljelmässä.
15 PHA:lla aktivoidut T-solut valmistettiin viljele mällä PBL-soluja, joihin oli lisätty 1 pg/ml PHA:ta (Wellcome, Charlotte, NC) , viiden päivän ajan ja viljelemällä niitä yhden päivän aajan mediumissa, josta PHA oli jätetty pois. Elinkykyiset solut koottiin talteen sedimentoimalla 20 ne Lymphocyte Separation Mediumin läpi ennen käyttöä. Soluja stimuloitiin mAb-molekyyleillä tai transfektoiduilla CHO-soluilla 4 - 6 h 37 °C:ssa, ne koottiin talteen sent- • ; rifugoimalla ja niistä valmistettiin RNA.
• · · = CD4+-T-solut eristettiin PBL-soluista erotelemalla • 1
.·, ; 25 terveiltä verenluovuttajilta saadut PBL-solut T- ja ei-T
# 1 ; \ l soluihin käyttäen lampaan erytrosyyttien rosetinmuodostus- ! ) menetelmää ja erottelemalla T-solut edelleen maljakäsitte- * · « lyllä CD4+-soluihin julkaisussa Damle, et ai., J. Immunol.
*···’ 139 (1987) 1501 kuvatulla tavalla, joka julkaisu on lii- 30 tetty tähän keksintöön siihen oikeuttavien säädösten no-jalla.
ϊ>(>: B-soluja puhdistettiin myös periferaalisesta veres- .·, : tä maljakäsittelyllä, joka on kuvattu julkaisussa Wysocki
» « I
ja Sato, Proc. Natl. Acad. Sei. 75 (1978) 2 844, joka jul- » » . 35 kaisu on liitetty tähän keksintöön siihen oikeuttavien • · ti» I » 1 1 • > 38 115057 säädösten nojalla, käyttäen anti-CD19-mAb-4G9:ää. Th:n aikaansaaman Ig:n muodostumisen määrittämiseksi sekoitettiin keskenään 106 CD4+ T-solua ja 106 CD19+ B-solua 1 ml:ssa RPMIrtä, joka sisälsi 10-prosenttista FBS:ää.
5 Kuuden päivän mittaisen viljelyn jälkeen 37 °C:ssa määritettiin humaani-IgM:n muodostuminen viljelmäsupernatan-teissa käyttäen kiinteän faasin ELISA:aa julkaisussa Volk-man, et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78 (1981) 2 528 kuvatulla tavalla, joka julkaisu on liitetty tähän keksin-10 töön siihen oikeuttavien säädösten nojalla. Suoritus tapahtui pääpiirteittäin siten, että 96-kuoppaiset tasapohjaiset mikrotiitteri-ELISA-levyt (Corning, Corning, NY) päällystettiin käyttäen kuoppa kohti 200 μΐ natriumkarbo-naattipuskuria (pH 9,6), joka sisälsi 10 pg/ml vuohessa 15 tehtyä affinitettipuhdistettua anti-humaani IgG- tai IgM-vasta-ainetta (Tago, Burlingame, CA), inkuboitiin yön yli 4 °C:ssa, ja pestiin sitten PBS:llä ja kuopat tehtiin vielä reagoimattomiksi 2-prosenttisella BSArlla PBSrssä (BSA-PBS) . Määritettävät näytteet lisättiin näihin kuoppiin 20 sopivana laimennoksena ja niitä inkuboitiin käyttäen kuoppaa kohti 200 μΐ vuohessa tehdyn affiniteettipuhdistetun anti-humaani IgG- tai IgM-vasta-aineen (Tago) pipar-| ( : juuriperoksidaasilla (HRP) konjugoidun F (ab')2-fraktion :V: suhteessa 1:1 000 tehtyä laimennosta. Tämän jälkeen levyt 25 pestiin ja niihin lisättiin kuoppaa kohti 100 μΐ o-fenyy- • · .·, : leenidiamiinin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) -liuos- • I · • » ,·, ; ta (liuos sisälsi tätä 0,6 mg/ml sitraatti-fosfaattipusku- • < · rissa, jonka pH oli 5,5 ja jossa oli 0,045 % vetyperoksi- • · "* dia) . Värin kehittyminen pysäytettiin 2 N rikkihapolla.
30 Absorbanssi 490 nm:n kohdalta määritettiin automaattisella t i « ••G ELISA-levyjen lukulaitteella. Tutkittavat ja kontrolli-
• I I
näytteet tutkittiin kolmena rinnakkaisena näytteenä ja : absorbanssiarvoja verrattiin sellaisiin absorbanssiarvoi- • · hin, jotka oli saatu tunnettuja IgG- tai IgM-standardeja • » • 35 käyttäen ja jotka oli tutkittu samanaikaisesti superna- i i t 4 I » I I • · 39 115057 tanttinäytteiden kanssa sellaisen standardikäyrän valmistamiseksi, jota käyttäen viljelmäsupernatanteissa olevat Ig-konsentraatiot kvantitoitiin. Koetulokset on ilmoitettu yksiköissä ng/ml Ig:tä ± SEM joko kolmesta tai neljästä 5 rinnakkaisesta viljelmästä määritettynä.
Immunosaostusanalyysi ja SDS PAGE
Solut varustettiin pinnastaan 125I-leimalla ja niille suoritettiin immunosaostusanalyysi. Suoritus tapahtui pääpiirteittäin siten, että PHA:lla aktivoitujen T-solujen 10 pinta varustettiin I-leimalla käyttäen laktoperoksidaasia ja foC^ita julkaisussa Vitetta, et ai., J. Exp. Med. 134 (1971) 242, kuvatulla tavalla, joka julkaisu on liitetty tähän keksintöön siihen oikeuttavien säädösten nojalla. SDS-PAGE-kromatografia suoritettiin lineaarisissa akryyli-15 amidigradienttigeeleissä, joissa pinoutumisgeelinä oli 5- prosenttinen akryyliamidi. Geelit värjättiin Coomassie Blue -väriaineella, niistä poistettiin ylimääräinen väri ja ne valokuvattiin tai kuivattiin ja valotettiin röntgenfilmillä (Kodak XAR-5).
2 0 Sitoutumismääritykset B7Ig varustettiin 125I-leimalla ominaisaktiivisuu-teen, joka oli suuruudeltaan noin 2 X 106 cpm pikomoolia • kohti. 96-kuoppaiset muovilevyt päällystettiin 16 - 24 h • V. ajan liuoksella, joka sisälsi CTLA4Ig:tä (0,5 pg 0,05 ml:n .·.: 25 tilavuudessa 10-millimolaarista Tris'iä, jonka pH oli 8).
• · ,·, : Kuopat tehtiin reagoimattomiksi sitoutumispuskurilla (DMEM, ! ! joka sisälsi 50-millimolaarista BES:ää (Sigma Chemical Co.), • t · I,,1 jonka pH oli 6,8, 0,1-prosenttista BAS:ää ja 10-pro- • t senttistä FCS:ää), jonka jälkeen niihin lisättiin kilpai-30 levän yhdisteen läsnä ollessa tai tämän puuttuessa liuos » (0,09 ml), joka sisälsi 125I-B7Ig:tä (noin 5 x 105 cpm).
i » « :i>t· 2 - 3 h pituisen inkuboinnin jälkeen 23 °C:ssa kuopat .·. : pestiin kerran sitoutumispuskurilla ja neljä kertaa [.j PBSrllä. Tämään jälkeen sitoutunut radioaktiivisuus solu- 35 ♦ » > » 40 115057 bilisoitiin lisäämällä kuoppiin 0,5-normaalista NaOHrta ja se kvantitoitiin gammalaskennalla.
Sitoutuminen B7lg:hen
Kuviossa 4 esitetty koe osoittaa, että täydellistä 5 humaani-CTLA4-DNA-geeniä koodaava OMCTLA4-konstruktio on toiminnallisesti aktiivinen. COS-solut transfektoitiin ilmentämisplasmideilla CD7, OMCD28 ja OMCTLA4 edellä kuvatulla tavalla. 48 tuntia transfektion jälkeen solut koottiin talteen ja niitä inkuboitiin pelkällä mediumilla (ei 10 lisäyksiä) tai käyttäen 9.3-, B7Ig-, CD5Ig- tai G3-7-mAb-molekyylejä. Tämän jälkeen solut pestiin ja sitoutuminen havaittiin seoksella, joka sisälsi toisen vaiheen reagens-sit, jotka olivat vuohessa tehty FITC:llä konjugoitu anti-muriini Ig ja vuohessa tehty FITC:llä konjugoitu 15 anti-humaani Ig. Transfektoiduista soluista tutkittiin asianmukaisten solun pinnan markkerien ilmentyminen epäsuoralla immunovärjäyksellä ja fluoresenssi määritettiin käyttäen FACSR-analyysiä edellä kuvatulla tavalla.
Kuten kuviossa 4 on esitetty, sitoutui mAb 9.3 20 CD28:lla transfektoituihin COS-soluihin mutta ei CTLA4:llä transfektoituihin soluihin. B7Ig-fuusioproteiini sitoutui sekä CD28:lla että CTLA4:llä transfektoituihin soluihin · (mutta näin ei käynyt kontrollina ollutta CD5Ig-fuusiopro- teiinia käytettäessä). CD7:llä transfektoidut COS-solut 25 eivät sitoneet mAb 9.3 eivätkä kumpaakaan fuusioproteii- .·, : neista. Tämä viittaa siihen, että CD28 ja CTLA4 sitoutuvat • i · • · : kumpikin B-solujen aktivaatioantigeeniin, B7:ään. Lisäksi • * · mAb 9.3 ei havaittavissa määrin sitonut CTLA4:ää.
• · • · CTLA4Ig:n sitoutuminen B7-positiivisiin CHO-solui- 30 hin ···* CTLA4Ig ja B7:n sitoutumisen tarkempaa luonnehti- ·...· mistä varten määritettiin puhdistetun CTLA4Ig:n sitoutu- : misaktiivisuus B7+-CHO-soluilla ja lymfoblastoidisolulin- jalla (PM LCL) kuviossa 5 esitetyssä kokeessa. Amplifioi- • · • 35 tuja transfektoituja CHO-solulinjoja ja PM LCL -soluja » · · » » * » 41 115057 inkuboitiin käyttäen pelkkää mediumia (ei lisäyksiä) tai vastaavaa konsentraatiota humaani-Ig:n Cyl:tä sisältäviä CD5Ig-, CD28Ig- tai CTLA4Ig-proteiineja (10 pg/ml). Sitoutuminen havaittiin FACSR:llä sen jälkeen, kun näytteisiin 5 oli lisätty vuohessa tehtyjä FITCrllä konjugoituja toisen vaiheen anti-humaani Ig-reagensseja. Yhteensä 10 000 värjättyä solua analysoitiin FACSR:llä.
Kuten kuviossa 5 on esitetty, sitoutui CD28lg B7+-CHO-soluihin mutta ei PM LCL -soluihin, joka solulinja on 10 suhteellisen pieniä B7-antigeenimääriä ilmentävä solulinja (Linsley, et ai., edellä, 1990). CTLA4Ig sitoutui molempiin solulinjoihin voimakkaammin kuin CD28lg, mikä viittaa siihen, että se sitoutuu suuremmalla affiniteetillä. Ei CD28Ig eikä CTLA4Ig sitoutunut CD28+-CHO-soluihin.
15 CTLA4Ig:n ja B7Ig:n sitoutumisaffinifceetti CTLA4Ig:n ja B7Ig:n välisen vuorovaikutuksen näennäinen affiniteetti määritettiin tämän jälkeen käyttäen kiinteän faasin kompetitiivista sitoutumismääritystä. 96- kuoppaiset muovilevyt päällystettiin CTLA4Ig:llä edellä 20 kuvatulla tavalla. B7Ig varustettiin radioaktiivisella 125I-leimalla (5 X 105 cpm, 2 X 106 cpm pikomoolia kohti) , ja sitä lisättiin 4-nanomolaarisessa konsentraatiossa • seokseen, jossa oli osoitetut konsentraatiot (katso kuvio 6) • · · · leimalla varustamatonta kimeeristä mAb L6:tta, mAb 9.3, .·. ; 25 mAb BB-l:tä tai B7Ig:tä. Levyihin sitoutuneen radioaktii- • * · t«> . visuuden määrä määritettiin ja se ilmoitettiin prosenttei- i na sellaisiin kuoppiin sitoutuneen radioaktiivisuuden mää- |tt’ rästä, jotka oli käsitelty ilman kompetitiivista molekyy- '···' liä (28 300 cpm) . Kukin piste edustaa kahden rinnakkaisen 30 määrityksen keskiarvoa, rinnakkaisten määritysten poikkea-ma keskiarvosta oli tavallisesti < 20 %. Konsentraatiot laskettiin sillä perusteella, että Mr yhden mAb-molekyylin .·, ; sitoutumiskohdan osalta oli 75 000 ja yhden B7Ig:n sitou- [ ! tumiskohdan osalta 51 000.
35 > ♦ » f i · > 42 115057
Kuten kuviossa 6 on esitetty ainoastaan mAb BB-1 ja leimalla varustamaton B7Ig kilpailivat merkittävästi 125IB7Ig:n sitoutumisesta (näiden kummankin puolimaksimaa-liset vaikutukset tapahtuivat arvojen noin 22 nM ja noin 5 175 nM kohdalla). Tutkituissa konsentraatioissa ei kimee- risellä mAb L6:lla eikä mAb 9.3:11a ollut tehokasta kom-petitiota. Muissa kokeissa käytetyt mAb 9.3:n konsentraa-tiot olivat riittävän suuria estämään I-B7Ig:n sitoutumisen immobilisoituun CD28Ig:hen tai solun pinnalla il-10 mentyneeseen CD28:aan > 90 %.
Kun kompetitiokoetulokset kuviosta 6 esitettiin Scatchardin kuvaajassa, laskettiin 125I-B7:n sitoutumista immobilisoituun CTLA4Ig:hen kuvaavan dissosiaatiovakion, Kd:n, arvoksi noin 12 nM (kuvio 7). Tämä arvo on noin 15 20 kertaa pienempi kuin 125I-B7Ig:n ja CD28:n väliselle sitoutumiselle aikaisemmin määritetty Kd (noin 200 nM) [Linsley, et ai, (1991), edellä] mikä viittaa siihen, että CTLA4 on B7-antigeenille CD28-reseptoria suurempi affini-teettinen reseptori.
20 CTLA4Ig:tä sitovien lymfoblastoidisten solujen pin nalla olevan(ien) molekyyli(e)n tunnistamiseksi (kuvio 7) analysoitiin pinnastaan 125I-leimalla varustetut solut : immunosaostusta käyttäen (kuvio 8) . B7+-CHO ja PM LCL -so- : : : lut varustettiin pinnastaan I:llä ja ne uutettiin ionit- ;1.J 25 tumattomalla detergenttiliuoksella edellä kuvatulla taval- • ·
.·. : la. Uutteista otetut näytteet, jotka sisälsivät noin 1,5 X
• · » ,·. · 107 cpm:ää 0,1 ml:n tilavuudessa, analysoitiin immunosaos- • 1 · tusanalyysilla edellä kuvatulla tavalla ilman mitään lisä- • · yksiä tai käyttämällä 2 pg kutakin molekyyleistä CD28Ig, 30 CTLA4Ig tai CD5Ig. Pestyt immunosaostumat analysoitiin >1d sitten SDS-PAGE:lla (10 - 20 % akryyliamidigradientti) ...· pelkistävissä olosuhteissa. Tämä jälkeen geeli kuivattiin j ja sille suoritettiin autoradiografia. Kuvion 8 vasen osa- kuvio esittää autoradiogrammia, joka saatiin 1 päivän va-35 lotuksen jälkeen. Kuvion 8 oikeanpuoleinen osakuvio esit- 1 · » 1 • · 43 115057 tää samasta geelistä valmistettua autoradiogrammia 10 päivän valotuksen jälkeen. Kuvion 8 keskellä olevassa osaku-viossa olevaa autoradiogrammia valotettiin myös 10 päivää. Tässä kuvassa on myös esitetty moolimassastandardien pai-5 kat.
Kuten kuviossa 8 on esitetty, CTLA4Ig:llä suoritetussa immunosaostuksessa saostui radioaktiivisella leimalla varustettu diffuusisti liikkuva proteiini (Mr noin 50 000 - 75 000; keskiosa noin 60 000:n kohdalla), joka ei 10 saostunut CD28Ig:llä eikä CD5Ig:llä. Tämä molekyyli liikkui samalla tavoin kuin B7, joka oli immunosaostettu B7+-CHO-soluista CTLA4Ig:llä ja jota saostui paljon heikommin CD28lg:lla. Nämä havainnot viittaavat siihen, että CTLA4Ig sitoo yhden proteiinin lymfoblastoidisissa soluissa, joka 15 on kooltaan samansuuruinen kuin B7-antigeeni.
Immuunivasteiden inhibitio in vitro -olosuhteissa CTLA4Ig:llä
Solujen lisääntymisen inhibitio
Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että 20 anti-CD28-mAb, 9.3, ja anti-B7-mAb, BB-1, inhiboivat allo-antigeenispesifisten Th- solujen lisääntymistä, sekä allo-antigeenia esittävien B-solujen immunoglobuliinin eritystä • (Damle, et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. 78 (1981) 5096; • · · ·
Lesslauer, et ai., Eur. J. Immunol. 16 (1986) 1 289]. Kos- .·, : 25 ka CTLA4 on B7-antigeenin korkea-affiniteettinen resepto- ,·, ; ri, kuten tässä keksinnössä on osoitettu olevan asian- • · » ! laita, tutkittiin liukoisesta CTLA4Ig:stä sen kyky inhi- boida näitä vasteita. CTLA4Ig:n vaikutuksia T-solujen li-*··* sääntymiseen tutkittiin kuviossa 9 esitetyssä kokeessa.
30 Primaarisesta lymfosyyttityypien yhteisreaktiosta (MLR) saatuja blastisoluja stimuloitiin säteilytetyillä I ♦ · T51-lymfoblastoidisoluilla (LC) siten, että seoksessa oli .*. : samanaikaisesti, tai siihen ei lisätty, muriini-mAb-9.3 :n iiit; Fab-fragmentteja tai B7Ig-, CD28Ig- tai CTLA4Ig-immuno- . 35 globuliini-Cy-fuusioproteiineja. Solujen lisääntyminen i » » » 1 1 5057 44 määritettiin [3H]-tymidiinin kerääntymisestä soluihin 4 päivän kuluttua ja se on ilmoitettu prosentteina radioaktiivisuuden kerääntymisestä käsittelemättömiin viljelmiin (21 000 cpm). Kuviossa 9 on esitetty keskiarvo neljä-5 nä rinnakkaiskokeena suoritetuista määrityksistä. (SEM < 10 %) .
Kuten kuviosta 9 käy ilmi, CTLA4Ig inhiboi MLR-reaktiota annoksesta riippuvaisella tavalla enimmillään > 90 % ja puolimaksimaalinen vaste saatiin konsentraatiossa 10 noin 30 ng/ml (noin 0,8 nM) . mAb 9.3:n Fab-fragmentti, jonka on aiemmin osoitettu olevan voimakkaampi MRL:n inhibiittori kuin kokonainen mAb 9.3 [Damle, et ai., J. Immunol. 140 (1988) 1 753 - 1 761], inhiboi myös MLR:ää, mutta tämä tapahtui korkeammissa konsentraatioissa (noin 15 800 ng/ml tai noin 30 nM puolimaksimaalisen vasteen olles sa kyseessä) . B7Ig ja CD28Ig eivät merkittävästi inhiboineet MLR:ää edes korkeammissa konsentraatioissa. Toisessa kokeessa B7Ig:n lisäys yhdessä CTLA4Ig:n kanssa esti osittain MLR:n inhiboitumisen CTLA4Ig:llä, mikä viittaa sii-20 hen, että inhibitio johtui spesifisesti vuorovaikutuksista B7-antigeenin kanssa.
Immunoglobuliinin erittymisen inhibitio ; Tutkittiin myös CTLA4Ig:n vaikutuksia auttaja-T- , solun (Th) aikaansaamaan immunoglobuliinin erittymiseen 25 (kuvio 10) . CD4+-T-soluja ja allogeenisiä CD19+-B-soluja | yhdistettiin keskenään mainittujen edellä kuvattujen ; ! immunoglobuliinimolekyylien läsnä ollessa ja niiden puutie' tuessa. Muriini-mAb-molekyylit OKT8, 9.3 ja BB-1 lisättiin '··* pitoisuuteen 20 pg/ml ja Ig-fuusioproteiinit pitoisuuteen 30 10 pg/ml. Kuusi päivää kestäneen viljelyn jälkeen määri- tettiin humaani-IgM:n (SEM < 5%) konsentraatio viljelmä- • · · supernatanteissa entsyymi-immunomäärityksellä (ELISA) ,·, ; edellä kuvatulla tavalla. CD4+-T-solujen puuttuessa oli
I « I
* j viljeltyjen B-solujen tuottaman IgM:n konsentraatio . 35 11 ng/ml.
• · > » 45 115057
Kuten kuviossa 10 on esitetty, CD4+-T-solut stimuloivat allogeenisten CD19+-B-solujen IgM:n tuottoa (CD4+-T-solujen puuttuessa IgM-pitoisuudet pienenivät 93 %). mAb-molekyylit 9.3 ja BB-1 inhiboivat merkittävästi Th:n ai-5 kaansaamaa IgM:n tuottoa (nämä saivat aikaan vastaavasti 63-prosenttisen ja 65-prosenttisen inhibition). CTLA4Ig oli inhibiittorina jopa näitä mAb-molekyylejä tehokkaampi (89-prosenttinen inhibitio). Kontrolli-Ig-molekyylien, mAb OKT8:n ja CD5Ig:n, inhibitio oli paljon pienempi (< 30-10 prosenttinen inhibitio). Mikään näistä molekyyleistä ei inhiboinut merkittävästi Ig:n muodostumista Staphylococcus aureuksen enterotoksiini B:n läsnä ollessa määritettynä. Samanlaisia tuloksia saatiin CD4+-T-soluilla ja B-soluilla, jotka olivat peräisin muilta verenluovuttajilta. Nämä tu-15 lokset viittaavat siihen, että CTLA4Ig:n inhibitio on spesifinen.
Edellä olevat koetulokset osoittavat myös, että CTLA4- ja CD28-reseptorit muistuttavat toisiaan sekä toiminnallisesti että rakenteellisesti. CD28:n tavoin on 20 CTLA4 myös B-solujen aktivaatioantigeenin, B7:n reseptori. CTLA4Ig sitoi i25I-B7:ää ja sitoutumisen affiniteeettivakio,
Kd, oli noin 12 nM, joka arvo on noin 20 kertaa suurempi t · ·.· · kuin CD28:n ja B7Ig:n välinen affiniteetti (noin 200 nM) .
CTLA4:n ja CD28:n voidaan siten ajatella olevan saman li-: 25 gandin, B7-antigeenin suuri- ja pieniaffiniteettisia re- '.j septoreja.
,·, ; CD28:n ja B7:n välinen näennäinen affiniteetti on « » * · *··. samanlainen kuin affiniteetti, joka on raportoitu liukoi sen alloantigeenin sitoutumiselle muriini-T-soluhybridoo-. 30 man T-solureseptoriin [noin 100 nM; Schnek, et ai., Cell ;;· 56 (1989) 47], ja se on suurempi affiniteetti kuin CD2:n ja LFA3:n välisissä vuorovaikutuksissa [Recny, et ai., J.
Biol. Chem. 265 (1990) 8542] tai CD4:n ja MHC class II
» t -molekyylien välisissä vuorovaikutuksissa [Clayton, et . ·, 35 ai., Nature 339 (1989) 548] esiintyvä affiniteetti.
* * * ♦ » » ♦ » » » I » » · 46 115057 CTLA4:n ja B7:n välinen näennäinen affiniteettivakio, Kd, on vielä suurempi ja se on verrattavissa odotuksiin sopivalla tavalla affiniteetiltaan suurempiin mAb-molekyyleihin [Kd-arvo 2-10 000 nM; Alzari, et ai., Ann. Rev. Immu-5 no. 6 (1988) 555]. CTLA4:n ja B7:n välinen Kd on samansuuruinen tai suurempi kuin integriinireseptorien ja niiden ligandien väliset Kd-arvot (10 - 2 000 nM; Hautanen, et ai., J. Biol. Chem. 264 (1989) 1 437 - 1 442; Di Minno, et ai., Blood 61 (1983) 140 - 148; Thiagarajan ja Kelley, J.
10 Biol. Chem. 263 (1988) 035 - 3 038]. CTLA4:n ja B7:n vuorovaikutusten affiniteetti on siten suurimpia lymfoidisil-le adheesiojärjestelmille tähän mennessä raportoiduista affiniteeteista.
Nämä tulokset ovat osoituksena ensimmäistä kertaa 15 suoritetusta CTLA4:n transkriptiotuotteen toiminnallisen proteiinituotteen ilmentämisestä. CTLA4Ig, fuusiokonstruk-tio, joka sisältää IgCyl-domeeniin fuusioidun CTLA4:n solunulkoisen domeenin, muodostaa disulfidin välityksellä liittyvän dimeerin, joka sisältää alayksiköt, joiden Mr on 20 noin 50 000 (kuvio 1). Koska tämän fuusion Ig-osassa ei voida ennustaa muodostuvan ketjujen välisiä disulfideja, vaikuttaa todennäköiseltä, että CTLA4:stä peräisin olevat » · f kysteiinit liittyvät disulfidisidoksen muodostumiseen.
• ·
Analoginen CD28lg-fuusioproteiini (Linsley, et ai, edellä, :*·,.· 25 1991) sisältää myös ketjujen välisen (iä) disulfidisidok- sen (ia). Nämä tulokset viittaavat siihen, että CTLA4-re- • · : septori esiintyy CD28:n [Hansen, et ai., Immunogenetics .·*·, 10 (1980) 247 - 260], tavoin T-solujen pinnalla disulfidi sidoksen yhdistämänä homodimeerinä. Vaikka CD28 ja CTLA4 , 30 ovat erittäin homologisia proteiineja, ne poikkeavat toi- ♦ * · •;*j sistaan immunologisesti, koska anti-CD28-mAb, 9.3, ei tun- nista CTLA4:ää (kuviot 4 ja 5) .
Ei tiedetä, voiko CTLA4 aktivoida T-soluja signaa- • · lireaktiotiellä, joka on analoginen CD28:n suhteen. Murii- , f 35 ni- ja humaani-CTLA4:n sytoplasmiset domeenit ovat ident- ► * | • * t · » · 47 115057 tisiä (Dariavach, et ai., edellä 1988), mikä viittaa siihen, että tällä alueella on tärkeitä toiminnallisia ominaisuuksia. CD28:n ja CTLA4:n sytoplasmisilla domeeneilla on myös homologiaa keskenään, vaikka onkin epäselvää, 5 riittääkö tämä tekemään näiden kahden molekyylin signaalia muodostavat ominaisuudet samanlaisiksi.
CTLA4Ig on in vitro -olosuhteissa sellaisten lymfosyyttien toimintojen voimakas inhibiittori, joissa tarvitaan T-solujen ja B-solujen yhteistoimintaa (kuviot 9 ja 10).
10 Nämä havainnot yhdessä aikaisempien tutkimusten kanssa viittaavat B7-antigeenin ja sen vastinreseptorien, CD28:n ja/tai CTLA4:n, välisten vuorovaikutusten perimmäiseen tärkeyteen sekä T- että B-lymfosyyttien vasteiden säännöstelyssä. CTLA4Ig tulisi olemaan käyttökelpoinen reagenssi tule-15 via tutkimuksia varten, jotka koskevat näiden vuorovaikutusten osuutta immuunivasteiden aikana. CTLA4Ig on voimakkaampi lym-fosyyttivasteiden inhibiittori in vitro -olosuhteissa kuin joko mAb BB-1 tai mAb 9.3 (kuviot 9 ja 10). CTLA4Ig:n suurempi tehokkuus mAb BB-l:een verrattuna johtuu todennäköisimmin 20 näiden molekyylien affiniteettieroista B7:ää kohtaan (kuvio 6). CTLA4Ig on myös mAb 9.3:a voimakkaampi todennäköisesti siksi, että sillä ei mAb:stä poiketen myöskään ole T-solujen :.·- lisääntymiseen kohdistuvia suoria stimuloivia vaikutuksia (June, et ai., Immunology Today 11 (1989) 211), joilla olisi 25 sen sen inhibitorisia vaikutuksia kumoavaa vaikutusta, j Kuten sen alan ammattimiehille on selvää, johon .·. : tämä keksintö liittyy, voi tällä keksinnöllä olla muita • I 1 t.’./ sovellutusmuotoja kuin edellä nimenomaisesti tarkastellut t · muodot tämän keksinnön hengestä tai sen olennaisista piir-30 teistä poikkeamatta. Niiden tämän keksinnön nimenomaisten ··>·’ sovellutusmuotojen, joita edellä on kuvattu, on siten kat- • r · » · sottava olevan kuvaavia eikä rajoittavia. Tämän keksinnön ;\j suojapiiri on sellainen, millaisena se on esitetty oheen » · liitetyissä patenttivaatimuksissa eikä se siten rajoitu 35 edellä olevan patenttiselityksen sisältämiin esimerkkeihin.
· ! 48 115057
SEQUENCE LISTING
(1) GENERAL INFORMATION: 5
(i) APPLICANT: Linsley, Peter S
Ledbetter, Jeffrey A Damle, Nitin K Brady, William 10
(ii) TITLE OF INVENTION: CTLA4 RECEPTOR AND METHODS FOR ITS USE
(iii) NUMBER OF SEQUENCES: 14 15 (iv) CORRESPONDENCE ADDRESS: (A) ADDRESSEE: Sheldon & Mak (B) STREET: 201 South Lake Avenue, Suite 800 (C) CITY: Pasadena 20 (D) STATE: California (E) COUNTRY: United States f.f’f (F) ZIP: 91101 • · » (V) COMPUTER READABLE FORM: j 25 (A) MEDIUM TYPE: Floppy disk (B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.25 30
) t I
' (Vi) CURRENT APPLICATION DATA: (A) APPLICATION NUMBER: ·:··; (B) FILING DATE: (C) CLASSIFICATION: :.: : 35 (viii) ATTORNEY/AGENT INFORMATION: (A) NAME: Mandel, SaraLynn (B) REGISTRATION NUMBER: 31,853 (C) REFERENCE/DOCKET NUMBER: 7848 49 115057 (ix) TELECOMMUNICATION INFORMATION: (A) TELEPHONE: (818) 796-4000 (B) TELEFAX: (818) 795-6321 5 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NOil: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 39 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) 15
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(iv) ANTI-SENSE: NO
20 (vi) ORIGINAL SOURCE: (A) ORGANISM: Homo sapiens V (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:l: 25 :/,: CTAGCCACTG AAGCTTCACC ATGGGTGTAC TGCTCACAC 39 /·*; (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:2: .:. 3Q (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: '·* (A) LENGTH: 39 base pairs (B) TYPE: nucleic acid * · (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear .·. 35 (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(iv) ANTI-SENSE: NO
50 115057 (vi) ORIGINAL SOURCE: (A) ORGANISM: Homo sapiens (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:2:
5 TGGCATGGGC TCCTGATCAG GCTTAGAAGG TCCGGGAAA
39 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:3: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: 10 (A) LENGTH: 39 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear 15 (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO (iv) ANTI-SENSE: NO
20 (Vi) ORIGINAL SOURCE: :.: : (A) ORGANISM: Homo sapiens * * · ' * 25 : ·.· (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:3:
.*··.’ TTTGGGCTCC TGATCAGGAA AATGCTCTTG CTTGGTTGT
39 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:4: 30 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: .: (A) LENGTH: 84 base pairs ;·· (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single : ; 1 (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
51 115057
(iv) ANTI-SENSE: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE: 5 (A) ORGANISM: Homo sapiens (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:4: AAGCAAGAGC ATTTTCCTGA TCAGGAGCCC AAATCTTCTG ACAAAACTCA CACATCCCCA 60 CCGTCCCCAG CACCTGAACT CCTG 84 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:5: 15 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 41 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear 20 (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO ; 25 (iv) ANTI-SENSE: NO
.’·· (vi) ORIGINAL SOURCE: i i * (A) ORGANISM: Homo sapiens (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:5: ,, 30 CTTCGACCAG TCTAGAAGCA TCCTCGTGCG ACCGCGAGAG C 41 ’ (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:6: • * » * * 1 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: •j (A) LENGTH: 47 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear 52 115057 (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
5 (iv) ANTI-SENSE: NO
(Vi) ORIGINAL SOURCE: (A) ORGANISM: Homo sapiens 10 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:6: CATTGCACAG TCAAGCTTCC ATGCCCATGG GTTCTCTGGC CACCTTG 47 15 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:7: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 39 base pairs (B) TYPE: nucleic acid 20 (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
Ί 25 (iii) HYPOTHETICAL: NO
: (iv) ANTI-SENSE: NO
:···: (vi) ORIGINAL SOURCE: (A) ORGANISM: Homo sapiens ..'S 30 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:7: * * ’ I ATCCACAGTG CAGTGATCAT TTGGATCCTG GCATGTGAC 39 • 35 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:8: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 65 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single 53 115057 (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO (XV) ANTI-SENSE: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE: (A) ORGANISM: Homo sapiens (XX) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:8: CTCAGTCTGG TCCTTGCACT CCTGTTTCCA AGCATGGCGA GCATGGCAAT GCACGTGGCC 60 CAGCC 65 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:9: (X) SEQUENCE CHARACTERISTICS: 2Q (A) LENGTH: 33 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single · (D) TOPOLOGY: linear • f · * · 25 (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) * * · » ·
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(iv) ANTI-SENSE: NO
·:· 30 ··'. (vi) ORIGINAL SOURCE: (A) ORGANISM: Homo sapiens 4 * * t (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:9: : ! 35 TTTGGGCTCC TGATCAGAAT CTGGGCACGG TTG 33 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:10: (X) SEQUENCE CHARACTERISTICS: 54 115057 (A) LENGTH: 72 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear 5 (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
10 (iv) ANTI-SENSE: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE: (A) ORGANISM: Homo sapiens 15 (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:10: CTAGCCACTG AAGCTTCACC AATGGGTGTA CTGCTCACAC AGAGGACGCT GCTCAGTCTG 60 GTCCTTGCAC TC 72 20 (.2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 11: : (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 33 base pairs (B) TYPE: nucleic acid *; 25 (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
:j* 30 (iii) HYPOTHETICAL: NO
; . (iv) ANTI-SENSE: NO
* * (Vi) ORIGINAL SOURCE: ; · 35 (A) ORGANISM: Homo sapiens (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:11: 55 115057 GCAATGCACG TGGCCCAGCC TGCTGTGGTA GTG 33 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:12: 5 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 45 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear 10 (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO 15 (iv) ANTI-SENSE: NO
(Vi) ORIGINAL SOURCE: (A) ORGANISM: Homo sapiens 20 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 12: . TGATGTAACA TGTCTAGATC AATTGATGGG AATAAAATAA GGCTG 45 i » · (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:13: : ! 25 .*·: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: • « ,'·* (A) LENGTH: 561 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single 30 (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) I * IT *
(iii) HYPOTHETICAL: NO
; : 35
; (iv) ANTI-SENSE: NO
(Vi) ORIGINAL SOURCE: (A) ORGANISM: Homo sapiens (ix) FEATURE: 56 115057 (λ) ΝΑΜΕ/ΚΕΥ: CDS (Β) LOCATIONS 1..561 5 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 13: GCA ATG CAC GTG GCC CAG CCT GCT GTG GTA CTG GCC AGC AGC CGA GGC 48
Ala Net His Val Ala Gin Pro Ala Vai Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly 15 10 15 10 ATC GCC AGC TTT GTG TGT GAG TAT GCA TCT CCA GGC AAA GCC ACT GAG 96
He Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu 20 25 30 GTC CGG GTG ACA GTG CTT CGG CAG GCT GAC AGC CAG GTG ACT GAA GTC 144 15 Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gin Ala Asp Ser Gin Val Thr Glu Val 35 40 45 TGT GCG GCA ACC TAC ATG ATG GGG AAT GAG TTG ACC TTC CTA GAT GAT 192
Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp 50 55 60 20 TCC ATC TGC ACG GGC ACC TCC AGT GGA AAT CAA GTG AAC CTC ACT ATC 240 : .·. Ser He Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gin Val Asn Leu Thr He 65 70 75 60 * * ♦ * · » · · • # · ,·. · 25 CAA GGA CTG AGG GCC ATG GAC ACG GGA CTC TAC ATC TGC AAG GTG GAG 288 ; j Gin Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr He Cys Lys Val Glu 85 90 95 CTC ATG TAC CCA CCG CCA TAC TAC CTG GGC ATA GGC AAC GGA ACC CAG 336
Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly He Gly Asn Gly Thr Gin 30 100 105 110 * » I » · ” ‘ ATT TAT GTA ATT GAT CCA GAA CCG TGC CCA GAT TCT GAC TTC CTC CTC 38 4 : He Tyr Val He Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp Phe Leu Leu ....: 115 120 125 35 57 115057 TGG ATC CTT GCA GCA GTT AGT TCG GGG TTG TTT TTT TAT AGC TTT CTC 432
Trp lie Leu Ala Alt Val Ser Ser Gly Leu Phe Phe Tyr Ser Phe Leu 5 130 135 140 CTC ACA GCT GTT TCT TTG AGC AAA ATG CTA AAG AAA AGA AGC CCT CTT 480
Leu Thr Ala Val Ser Leu Ser Lys Met Leu Lye Lye Arg Ser Pro Leu 145 150 155 160 20 ACA ACA GGG GTC TAT GTG AAA ATG CCC CCA ACA GAG CCA GAA TGT GAA 528
Thr Thr Gly Val Tyr Val Lys Met Pro Pro Thr Glu Pro Glu Cys Glu 165 170 175 AAG CAA TTT CAG CCT TAT TTT ATT CCC ATC AAT 561
Lys Gin Phe Gin Pro Tyr Phe He Pro He Asn 15 180 185 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:14: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 187 amino acids (B) TYPE: amino acid 2q (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein > (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:14:
Ala Met His Val Ala Gin Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly '· «' 1 5 10 15 ' : 25 ; · · He Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu ! 20 25 30 1 I ·
Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gin Ala Asp Ser Gin Val Thr Glu Val 35 40 45 >>·: 30 Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp I .* 50 55 60 » » * ♦ t
Ser He Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gin Val Asn Leu Thr He 65 70 75 80 t 3Ϊ) Gin g 1 y Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr He Cys Lys Val Glu 58 115057 85 90 95
Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Giy He Gly Asn Gly Thr Gin
5 100 105 HO
Ile Tyr Val lie Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp Phe Leu Leu 115 120 125
Trp lie Leu Ala Ala Val Ser Ser Gly Leu Phe Phe Tyr Ser Phe Leu 130 135 140 10
Leu Thr Ala Val Ser Leu Ser Lys Met Leu Lys Lys Arg Ser Pro Leu 145 150 155 160
Thr Thr Gly Val Tyr Val Lys Met Pro Pro Thr Glu Pro Glu Cys Glu 165 170 175 15 Lys Gin Phe Gin Pro Tyr Phe lie Pro lie ASn 180 185 • > I · * I ·
* ' * I
» · » » ·
It· > · • · * · I * I I « » t · * · · 4 t · • It » · » * · III* I » I ♦ » * » *
lilt « I
Claims (27)
1. Monoklonaalinen vasta-aine tai sen fragmentti tai johdannainen, tunnettu siitä, että se tunnis- 5 taa sekvenssillä tunnusnumero 14 esitetyn CTLA4:n solunul-koisen domeenin tai sen fragmentin tai johdannaisen ja sitoutuu siihen, jolloin mainittu sitoutuminen estää CTLA4:n sitoutumisen B7-antigeeniin.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen monoklonaalinen 10 vasta-aine, tunnettu siitä, että CTLA4 käsittää sek venssissä tunnusnumero 14 esitetyt aminohapot alkaen ala-niinista asemassa 1 ja päättyen asparagiinin asemassa 187.
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen monoklonaalinen vasta-aine, tunnettu siitä, että CTLA4:n solunulkoinen 15 domeeni käsittää sekvenssissä tunnusnumero 14 esitetyt aminohapot alkaen alaniinista asemassa 1 ja päättyen aspa-ragiinihappoon asemassa 125.
4 I CD28-reseptorin solunulkoisesta domeenista tai sen frag- i · mentista tai johdannaisesta, fuusioituna toiseen aminohap-: 35 posekvenssiin, joka vastaa osaa sekvenssillä tunnusnumero * * f t I • » 63 115057 14 esitetyn CTLA4-reseptorin solunulkoisesta domeenista tai sen fragmentista tai johdannaisesta, ja kolmannen aminohapposekvenssin, joka vastaa ihmisen immunoglobuliini Cyl sarana-aluetta sekä CH2- ja CH3-alueita.
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen monoklonaalinen vasta-aine, tunnettu siitä, että mainittu vasta-aine 20 tunnistaa CTLA4:n solunulkoisen domeenin ja sitoutuu siihen, joka domeeni on eristetyssä CTLA4-reseptoripro-; | teiinissa, jolla on kuviossa 3 esitetty aminohappo- , sekvenssi (sekvenssi tunnusnumero 14), tai sen osassa tai : ,· fragmentissa, joista kukin sitoo B7-antigeeniä. : 25
5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen monoklonaalinen .·, ; vasta-aine, tunnettu siitä, että mainittu vasta-aine tunnistaa CTLA4:n solunulkoisen domeenin ja sitoutuu six- » · ’ * hen, joka domeeni on puhdistettussa, liukoisessa CTLA4- proteiinissa, joka käsittää sekvenssissä tunnusnumero 14 * i · ··· 30 esitetyt 125 aminohappoa alkaen CTLA4-proteiinin solunul- koisen domeenin aminohapposekvenssin alaniinista asemassa .j 1 ja päättyen asparagiinihappoon asemassa 125.
6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen monoklonaalinen • vasta-aine, tunnettu siitä, että mainittu vasta- 60 115057 aine tunnistaa CTLA4:n solunulkoisen domeenin, joka sisältää muutoksen aminohapoissa 1-94.
7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen monoklonaalinen vasta-aine, tunnettu siitä, että mainittu vasta-aine 5 tunnistaa CTLA4:n solunulkoisen domeenin ja sitoutuu siihen, joka domeeni on CTLA4-molekyylissä, joka on liitettynä ei-CTLA4-proteiinisekvenssiin.
8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen monoklonaalinen vasta-aine, tunnettu siitä, että mainittu ei-CTLA4- 10 proteiini on vähintään osa immunoglobuliinimolekyyliä.
9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen monoklonaalinen vasta-aine, tunnettu siitä, että mainittu vasta-aine tunnistaa CTLA4:n solunulkoisen domeenin ja sitoutuu siihen, joka domeeni on CTLA4-fuusioproteiinissa, joka käsit- 15 tää aminohapposekvenssin, joka käsittää CTLA4-fuusioprote-iinin solunulkoisen domeenin fragmentin, joka estää Τ'-solujen jakaantumista.
10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen monoklonaalinen vasta-aine, tunnettu siitä, että mainittu CTLA4-fuu- 20 sioproteiini on CTLA4lg-fuusioproteiini tai CD28Ig/CTLA4Ig-fuusioproteiinihybridi.
11. Patenttivaatimuksen 9 mukainen monoklonaalinen • · r*: vasta-aine, tunnettu siitä, että mainittu CTLA4- fuusioproteiini on CTLA4Ig-fuusioproteiini, joka sitoutuu . : 25 B7-antigeeniin ja jonka ensimmäinen aminohapposekvenssi koostuu sekvenssillä tunnusnumero 14 esitetystä CTLA4:n • · solunulkoisesta domeenista tai sen osasta tai fragmentista "* ja toinen aminohapposekvenssi koostuu ihmisen immunoglobu- liinimolekyylin sarana-alueesta sekä CH2- ja CH3-alueista.
12. Patenttivaatimuksen 10 mukainen monoklonaali- '...· nen vasta-aine, tunnettu siitä, että mainitulla CTLA4Ig-fuusioproteiinilla on (a) ensimmäinen aminohapposekvenssi alkaen CTLA4:n > » solunulkoista domeenia esittävän sekvenssin tunnusnumero » · 61 115057 14 alaniinista aminohappoasemassa 1 ja päättyen aspara-giinihappoon aminohappoasemassa 125, ja (b) toinen aminohapposekvenssi, joka koostuu ihmisen immunoglobuliinimolekyylin sarana-alueesta sekä CH2-5 ja CH3-alueista.
13. Patenttivaatimuksen 10 mukainen monoklonaali-nen vasta-aine, tunnettu siitä, että mainittu CTLA4-fuusioproteiini on CD28Ig/CTLA4Ig-fuusioproteiinihybridi, joka sitoutuu B7-antigeeniin ja käsittää ensimmäisen ami- 10 nohapposekvenssin, joka vastaa osaa CD28-reseptorin so-lunulkoisesta domeenista tai sen fragmentista tai johdannaisesta fuusioituna toiseen aminohapposekvenssiin, joka vastaa osaa sekvenssillä tunnusnumero 14 esitetyn CTLA4-re-septorin solunulkoisesta domeenista tai sen fragmentista 15 tai johdannaisesta ja kolmannen aminohapposekvenssin, joka vastaa ihmisen immunoglobuliini Cyl sarana-aluetta sekä CH2- ja CH3-alueita.
14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen monoklonaali-nen vasta-aine, tunnettu siitä, että mainitun fuusio- 20 proteiinin ensimmäinen aminohapposekvenssi vastaa osaa CD28-reseptorin solunulkoisesta domeenista ja toinen ami-ll nohapposekvenssi vastaa CTLA4:n solunulkoisen domeenin aminohappoja 94 - 125.
15. Patenttivaatimuksen 13 mukainen monoklonaali- : 25 nen vasta-aine, tunnettu siitä, että mainitun fuusio- : proteiinin ensimmäinen aminohapposekvenssi vastaa CD28- reseptorin solunulkoisen domeenin aminohappoja 1-94 ja toinen aminohapposekvenssi vastaa CTLA4:n solunulkoisen domeenin aminohappoja 94 - 125.
16. Patenttivaatimuksen 1 mukainen monoklonaalisen '··.* vasta-aineen fragmentti, tunnettu siitä, että se on :’·· Fab- tai F(ab)2~ tai Fv-fragmentti. ► ·
17. Eristetty CTLA4-reseptoriproteiini tai sen osa \ tai fragmentti, joista kukin sitoutuu B7-antigeeniin, 62 115057 tunnettu siitä, että sillä on kuviossa 3 esitetty aminohapposekvenssi (sekvenssi tunnusnumero 14).
18. Puhdistettu, liukoinen CTLA4-proteiini, tunnettu siitä, että se käsittää sekvenssissä tunnusnumero 5 14 esitetyt 125 aminohappoa alkaen CTLA4-proteiinin so- lunulkoisen domeenin aminohapposekvenssin alaniinista asemassa 1 ja päättyen asparagiinihappoon asemassa 125.
19. Puhdistettu liukoinen CTLA4-proteiini, joka sitoutuu aktivoiduilla B-soluilla ilmentyvään B7-antigee- 10 niin, tunnettu siitä, että se käsittää sekvenssissä tunnusnumero 14 esitetyt 187 aminohappoa alkaen alaniinista asemassa 1 ja päättyen asparagiiniin asemassa 187.
20. CTLA4Ig-fuusioproteiini, joka sitoutuu B7-an-tigeeniin, tunnettu siitä, että sillä on ensimmäinen amino- 15 happosekvenssi, joka koostuu sekvenssillä tunnusnumero 14 esitetystä CTLA4:n solunulkoisesta domeenista tai sen osasta tai fragmentista, ja toinen aminohapposekvenssi, joka koostuu ihmisen immunoglobuliinimolekyylin sarana-alueesta sekä CH2- ja CH3-alueista.
21. Patenttivaatimuksen 20 mukainen CTLA4Ig-fuu- sioproteiini, joka sitoutuu B7-antigeeniin, tunnettu : : siitä, että sillä on (a) ensimmäinen aminohapposekvenssi alkaen CTLA4:n ·*. j solunulkoista domeenia esittävän sekvenssin tunnusnumero .·. : 25 14 alaniinista aminohappoasemassa 1 ja päättyen aspara- * « * ,·. | giinihappoon aminohappoasemassa 125, ja * t · (b) toinen aminohapposekvenssi, joka koostuu ihmi- '*· sen immunoglobuliinimolekyylin sarana-alueesta sekä CH2- ja CH3-alueista. ··.: 30
22. CD28Ig/CTLA4Ig-fuusioproteiinihybridi, joka ’...· sitoutuu B7-antigeeniin, tunnettu siitä, että se kä- sittää ensimmäisen aminohapposekvenssin, joka vastaa osaa
23. Patenttivaatimuksen 22 mukainen CD28Ig/ CTLA4Ig-fuusioproteiinihybridi, tunnettu siitä, että ensimmäinen aminohapposekvenssi vastaa osaa CD28-resepto-rin solunulkoisesta domeenista ja toinen aminohapposekvenssi vastaa CTLA4:n solunulkoisen domeenin aminohappoja 10 94 - 125.
24. Patenttivaatimuksen 23 mukainen CD28Ig/ CTLA4Ig-fuusioproteiinihybridi, tunnettu siitä, että ensimmäinen aminohapposekvenssi vastaa CD28-reseptorin solunulkoisen domeenin aminohappoja 1-94 ja toinen amino- 15 happosekvenssi vastaa CTLA4:n solunulkoisen domeenin aminohappoja 94 - 125.
25. In vitro -menetelmä CTLA4-positiivisten T-solujen vuorovaikutusten B7-positiivisten solujen kanssa säätelemiseksi, tunnettu siitä, että CTLA4- 20 positiiviset T-solut saatetaan kosketukseen ligandin kanssa, joka reagoi CTLA4:n kanssa, jolloin ligandi on jonkin ; j patenttivaatimuksen 1-13 mukainen monoklonaalinen vasta- aine.
·,· 26. Patenttivaatimuksen 25 mukainen menetelmä, 25 tunnettu siitä, että B7-positiiviset solut ovat B- , ; soluja.
27. Patenttivaatimuksen 26 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että CTLA4-positiivisten T-solujen vuorovaikutus B7-positiivisten B-solujen kanssa estetään, t · · -d 30 jolloin CTLA4-positiivisten T-solujen vuorovaikutusta B7- ...· positiivisten B-solujen kanssa säädellään. » · • · 64 115057
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US72361791A | 1991-06-27 | 1991-06-27 | |
| US72361791 | 1991-06-27 | ||
| US9205202 | 1992-06-16 | ||
| PCT/US1992/005202 WO1993000431A1 (en) | 1991-06-27 | 1992-06-16 | Ctl4a receptor, fusion proteins containing it and uses thereof |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI20022285L FI20022285L (fi) | 2002-12-30 |
| FI115057B true FI115057B (fi) | 2005-02-28 |
Family
ID=24907003
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI935795A FI112082B (fi) | 1991-06-27 | 1993-12-22 | Menetelmiä eristetyn CTLA4-reseptorin ja sen johdannaisten, niitä sisältävien tuotteiden ja CTLA-reseptorin tunnistavien vasta-aineiden valmistamiseksi, menetelmissä käyttökelpoisia nukleiinihapposekvenssejä, plasmideja ja isäntäsoluja sekä niiden käyttötapoja |
| FI20022285A FI115057B (fi) | 1991-06-27 | 2002-12-30 | Eristetty liukoinen CTL4A-proteiini, sitä sisältäviä fuusioproteiineja, sen ligandeja, sen tunnistavia monoklonaalisia vasta-aineita ja käyttötapoja |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI935795A FI112082B (fi) | 1991-06-27 | 1993-12-22 | Menetelmiä eristetyn CTLA4-reseptorin ja sen johdannaisten, niitä sisältävien tuotteiden ja CTLA-reseptorin tunnistavien vasta-aineiden valmistamiseksi, menetelmissä käyttökelpoisia nukleiinihapposekvenssejä, plasmideja ja isäntäsoluja sekä niiden käyttötapoja |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5434131A (fi) |
| EP (1) | EP0606217B2 (fi) |
| JP (6) | JP3722375B2 (fi) |
| KR (1) | KR100238712B1 (fi) |
| AT (1) | ATE170562T1 (fi) |
| AU (1) | AU661854B2 (fi) |
| CA (2) | CA2110518C (fi) |
| DE (2) | DE122007000078I2 (fi) |
| DK (1) | DK0606217T4 (fi) |
| ES (1) | ES2123001T5 (fi) |
| FI (2) | FI112082B (fi) |
| IE (2) | IE922111A1 (fi) |
| IL (4) | IL102294A (fi) |
| LU (1) | LU91375I2 (fi) |
| MX (1) | MX9203605A (fi) |
| NL (1) | NL300303I1 (fi) |
| NO (4) | NO312465B1 (fi) |
| NZ (2) | NZ243286A (fi) |
| PT (1) | PT100637B (fi) |
| WO (1) | WO1993000431A1 (fi) |
| ZA (1) | ZA924782B (fi) |
Families Citing this family (201)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2003455C (en) * | 1988-11-23 | 2000-02-22 | Craig B. Thompson | Immunotherapy involving cd28 stimulation |
| US6685941B1 (en) * | 1988-11-23 | 2004-02-03 | The Regents Of The University Of Michigan | Methods of treating autoimmune disease via CTLA-4Ig |
| CA2071478A1 (en) * | 1989-10-27 | 1991-04-28 | Jeffery A. Bluestone | Methods and compositions for promoting immunopotentiation |
| US6406696B1 (en) | 1989-10-27 | 2002-06-18 | Tolerance Therapeutics, Inc. | Methods of stimulating the immune system with anti-CD3 antibodies |
| US6090914A (en) * | 1991-06-27 | 2000-07-18 | Bristol-Myers Squibb Company | CTLA4/CD28Ig hybrid fusion proteins and uses thereof |
| US5851795A (en) * | 1991-06-27 | 1998-12-22 | Bristol-Myers Squibb Company | Soluble CTLA4 molecules and uses thereof |
| US6887471B1 (en) * | 1991-06-27 | 2005-05-03 | Bristol-Myers Squibb Company | Method to inhibit T cell interactions with soluble B7 |
| US5637481A (en) | 1993-02-01 | 1997-06-10 | Bristol-Myers Squibb Company | Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell |
| US5770197A (en) * | 1991-06-27 | 1998-06-23 | Bristol-Myers Squibb Company | Methods for regulating the immune response using B7 binding molecules and IL4-binding molecules |
| US5962406A (en) * | 1991-10-25 | 1999-10-05 | Immunex Corporation | Recombinant soluble CD40 ligand polypeptide and pharmaceutical composition containing the same |
| CA2089229C (en) * | 1992-02-14 | 2010-04-13 | Alejandro A. Aruffo | Cd40cr receptor and ligands therefor |
| US6472510B1 (en) * | 1992-02-14 | 2002-10-29 | Bristol-Myers Squibb Company | CD40 receptor ligands |
| AU684461B2 (en) * | 1992-04-07 | 1997-12-18 | Regents Of The University Of Michigan, The | CD28 pathway immunoregulation |
| US5747034A (en) * | 1992-07-09 | 1998-05-05 | Chiron Corporation | Methods and materials for the induction of T cell anergy |
| US5397703A (en) * | 1992-07-09 | 1995-03-14 | Cetus Oncology Corporation | Method for generation of antibodies to cell surface molecules |
| US5773253A (en) * | 1993-01-22 | 1998-06-30 | Bristol-Myers Squibb Company | MYPPPY variants of CTL A4 and uses thereof |
| US6491916B1 (en) | 1994-06-01 | 2002-12-10 | Tolerance Therapeutics, Inc. | Methods and materials for modulation of the immunosuppresive activity and toxicity of monoclonal antibodies |
| US6024957A (en) * | 1993-06-02 | 2000-02-15 | Research Corporation Technologies, Inc. | Immunomodulators and methods for the prevention and reversal of organ transplant rejection using same |
| US6106834A (en) * | 1993-06-02 | 2000-08-22 | Research Corporation Technologies, Inc. | Use of anti-CD45 leukocyte antigen antibodies for immunomodulation |
| CA2144319A1 (en) * | 1993-07-09 | 1995-01-19 | George N. Cox | Recombinant ctla4 polypeptides and methods for making the same |
| AU7405294A (en) | 1993-07-26 | 1995-02-20 | Dana-Farber Cancer Institute | B7-2: ctl a4/cd 28 counter receptor |
| US20050129670A1 (en) * | 1993-07-26 | 2005-06-16 | Genetics Institute, Llc. | Tumor cells modified to express B7-2 with increased immunogenicity and uses therefor |
| US6723705B1 (en) | 1993-08-19 | 2004-04-20 | Gentics Institute, Inc. | Tumor cells modified to express B7-2 with increased immunogenicity and uses therefor |
| US6824779B1 (en) | 1993-07-26 | 2004-11-30 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Methods for inhibiting the interaction of B7-2 with its natural ligand |
| US6130316A (en) * | 1993-07-26 | 2000-10-10 | Dana Farber Cancer Institute | Fusion proteins of novel CTLA4/CD28 ligands and uses therefore |
| US5861310A (en) * | 1993-11-03 | 1999-01-19 | Dana-Farber Cancer Institute | Tumor cells modified to express B7-2 with increased immunogenicity and uses therefor |
| US6084067A (en) | 1993-07-26 | 2000-07-04 | Dana-Farber Cancer Institute | CTLA4/CD28 ligands and uses therefor |
| AU7526894A (en) * | 1993-08-16 | 1995-03-14 | Arch Development Corporation | B7-2: ctla4/cd28 counter receptor |
| WO1995006738A1 (en) * | 1993-09-03 | 1995-03-09 | Schering Corporation | B70(b7-2):ctla-4 bonding protein |
| JPH09510211A (ja) * | 1994-03-08 | 1997-10-14 | ダナ−ファーバー・キャンサー・インスティテュート | Ｔ細胞の不応答性を調節する方法 |
| AU784510B2 (en) * | 1994-03-08 | 2006-04-13 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Methods for modulating T cell unresponsiveness |
| US6719972B1 (en) | 1994-06-03 | 2004-04-13 | Repligen Corporation | Methods of inhibiting T cell proliferation or IL-2 accumulation with CTLA4- specific antibodies |
| US6083751A (en) * | 1994-11-01 | 2000-07-04 | Targeted Genetics Corporation | Chimeric receptors for the generation of selectively-activatable TH-independent cytotoxic T cells |
| US5576423A (en) | 1994-12-02 | 1996-11-19 | Schering Corporation | Antibodies to the slam protein expressed on activated T cells |
| AU4365196A (en) * | 1994-12-02 | 1996-06-19 | Schering Corporation | Purified genes encoding mammalian cell surface antigens; proteins and antibodies |
| US6372208B1 (en) | 1999-09-28 | 2002-04-16 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Method of reducing an immune response to a recombinant virus |
| US5652224A (en) * | 1995-02-24 | 1997-07-29 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Methods and compositions for gene therapy for the treatment of defects in lipoprotein metabolism |
| US6251957B1 (en) | 1995-02-24 | 2001-06-26 | Trustees Of The University Of Pennsylvania | Method of reducing an immune response to a recombinant virus |
| US5872154A (en) * | 1995-02-24 | 1999-02-16 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Method of reducing an immune response to a recombinant adenovirus |
| WO1996031229A1 (en) * | 1995-04-05 | 1996-10-10 | Beth Israel Hospital Association | Inhibiting rejection of a graft |
| US7175847B1 (en) * | 1995-06-07 | 2007-02-13 | Biogen Idec Inc. | Treating intestinal inflammation with anti-CD80 antibodies that do not inhibit CD80 binding to CTLA-4 |
| US6113898A (en) * | 1995-06-07 | 2000-09-05 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Human B7.1-specific primatized antibodies and transfectomas expressing said antibodies |
| US7153508B2 (en) * | 1995-06-07 | 2006-12-26 | Biogen Idec Inc. | Treatment of B cell lymphoma using anti-CD80 antibodies that do not inhibit the binding of CD80 to CTLA-4 |
| US5811097A (en) * | 1995-07-25 | 1998-09-22 | The Regents Of The University Of California | Blockade of T lymphocyte down-regulation associated with CTLA-4 signaling |
| US5855887A (en) * | 1995-07-25 | 1999-01-05 | The Regents Of The University Of California | Blockade of lymphocyte down-regulation associated with CTLA-4 signaling |
| US6051227A (en) | 1995-07-25 | 2000-04-18 | The Regents Of The University Of California, Office Of Technology Transfer | Blockade of T lymphocyte down-regulation associated with CTLA-4 signaling |
| US7041634B2 (en) | 1995-09-27 | 2006-05-09 | Emory University | Method of inhibiting immune system destruction of transplanted viable cells |
| US6750334B1 (en) * | 1996-02-02 | 2004-06-15 | Repligen Corporation | CTLA4-immunoglobulin fusion proteins having modified effector functions and uses therefor |
| US6107056A (en) * | 1996-02-22 | 2000-08-22 | Oaks; Martin K. | SCTLA-4 gene and product |
| WO1997034633A1 (en) * | 1996-03-20 | 1997-09-25 | Bristol-Myers Squibb Company | Methods for inhibiting an immune response by blocking the gp39/cd40 and ctla4/cd28/b7 pathways and compositions for use therewith |
| US5786152A (en) * | 1996-04-26 | 1998-07-28 | Amgen Inc. | Methods of inhibiting syp binding to a CTLA-4 receptor |
| JP4048294B2 (ja) * | 1996-11-08 | 2008-02-20 | バイオジェン・アイデック・インコーポレイテッド | ある種の抗体とヒトｂ７．１およびｂ７．２コスティミュラトリー抗原との間の独特の結合相互作用の同定 |
| US20060034844A1 (en) * | 1996-12-04 | 2006-02-16 | The Regents Of The University Of California | Stimulation of T cells against self antigens using CTLA-4 blocking agents |
| US7235653B2 (en) * | 1996-12-31 | 2007-06-26 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotide compositions and methods for the modulation of the expression of B7 protein |
| US20040023917A1 (en) * | 1996-12-31 | 2004-02-05 | Bennett C. Frank | Oligonucleotide compositions and methods for the modulation of the expression of B7 protein |
| US6077833A (en) * | 1996-12-31 | 2000-06-20 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotide compositions and methods for the modulation of the expression of B7 protein |
| US6319906B1 (en) | 1996-12-31 | 2001-11-20 | Isis Pharmaceuticals | Oligonucleotide compositions and methods for the modulation of the expression of B7 protein |
| KR19980066046A (ko) * | 1997-01-18 | 1998-10-15 | 정용훈 | 고역가의 CTLA4-Ig 융합단백질 |
| US20030219863A1 (en) * | 1997-01-31 | 2003-11-27 | Bristol-Myers Squibb Company | Soluble CTLA4 mutant molecules and uses thereof |
| ZA98533B (en) * | 1997-01-31 | 1999-07-22 | Bristol Myers Squibb Co | Soluble CTLA4 mutant molecules and uses thereof. |
| WO1998042752A1 (en) | 1997-03-21 | 1998-10-01 | Brigham And Women's Hospital Inc. | Immunotherapeutic ctla-4 binding peptides |
| SE9701127D0 (sv) * | 1997-03-26 | 1997-03-26 | Karolinska Innovations Ab | Antigenic fusionprotein carrying GALal, 3GAL epitopes |
| CA2285692C (en) * | 1997-03-27 | 2013-05-28 | The Council Of The Queensland Institute Of Medical Research | Enhancement of immune response using targeting molecules |
| ATE505543T1 (de) | 1997-04-16 | 2011-04-15 | Millennium Pharm Inc | Zusammensetzung, umfassend einen antikörper, der selektiv an ein cysteinreiches sekretiertes protein (crsp) bindet |
| AU743939B2 (en) * | 1997-06-12 | 2002-02-07 | Laboratoires Serono Sa | CD28/CTLA-4 inhibiting peptidomimetics, pharmaceutical compositions thereof, and method of using same |
| WO1999015552A1 (en) * | 1997-09-19 | 1999-04-01 | Yoshitomi Pharmaceutical Industries, Ltd. | Oligopeptide compounds |
| US6955811B2 (en) * | 1997-11-07 | 2005-10-18 | Trillium Therapeutics Inc. | Methods of inhibiting immune response suppression by administering antibodies to OX-2 |
| US7223729B2 (en) * | 1997-11-07 | 2007-05-29 | Trillium Therapeutics Inc. | Methods of treating allergy by administering a CD200 protein |
| CA2308765C (en) | 1997-11-07 | 2010-10-12 | Transplantation Technologies Inc. | The use of an ox-2 protein or nucleic acid in immunomodulation |
| AUPP221098A0 (en) | 1998-03-06 | 1998-04-02 | Diatech Pty Ltd | V-like domain binding molecules |
| JP4843138B2 (ja) * | 1998-04-15 | 2011-12-21 | ザ・ブリガーム・アンド・ウーメンズ・ホスピタル・インコーポレーテッド | Ｔ細胞阻害性受容体組成物およびその使用 |
| KR100869861B1 (ko) * | 1998-05-01 | 2008-11-24 | 쉐링-프라우 리미티드 | 고양이 ｃｄ80, 고양이 ｃｄ86, 고양이 ｃｄ28, 및 고양이ｃｔｌａ4 핵산과 폴리펩티드 |
| US7279168B2 (en) | 1998-05-01 | 2007-10-09 | Texas A & M University System | Recombinant virus expressing foreign DNA encoding feline CD86 and uses thereof |
| US7078512B2 (en) | 1998-05-01 | 2006-07-18 | Schering-Plough Animal Health Corporation | Nucleic acid encoding feline CD86 |
| US20050031611A1 (en) * | 1998-05-08 | 2005-02-10 | Beth Israel Deaconess Medical Center | Transplant tolerance by costimulation blockade and T-cell activation-induced apoptosis |
| US6682741B1 (en) * | 1998-06-10 | 2004-01-27 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | β2 microglobulin fusion proteins and high affinity variants |
| US20050181482A1 (en) * | 2004-02-12 | 2005-08-18 | Meade Harry M. | Method for the production of an erythropoietin analog-human IgG fusion proteins in transgenic mammal milk |
| WO1999066054A2 (en) * | 1998-06-15 | 1999-12-23 | Genzyme Transgenics Corp. | Erythropoietin analog-human serum albumin fusion protein |
| US6593133B1 (en) | 1998-07-06 | 2003-07-15 | Nsgene A/S | Neurotrophic factors |
| CA2343916A1 (en) | 1998-09-21 | 2000-03-30 | Genetics Institute, Inc. | Methods of downmodulating the immune response to therapeutic proteins |
| US6521419B1 (en) | 1998-09-22 | 2003-02-18 | Kanakaraju Koduri | Expression vectors containing hot spot for increased recombinant protein expression in transfected cells |
| US6800457B2 (en) | 1998-09-22 | 2004-10-05 | Bristol-Myers Squibb Company | Expression vectors containing hot spot for increased recombinant protein expression in transfected cells |
| US7109003B2 (en) | 1998-12-23 | 2006-09-19 | Abgenix, Inc. | Methods for expressing and recovering human monoclonal antibodies to CTLA-4 |
| HRP20010551B1 (hr) * | 1998-12-23 | 2013-05-31 | Pfizer Inc. | Humana monoklonalna antitijela za ctla-4 |
| US6682736B1 (en) | 1998-12-23 | 2004-01-27 | Abgenix, Inc. | Human monoclonal antibodies to CTLA-4 |
| US7011833B1 (en) | 1999-05-06 | 2006-03-14 | Genetics Institute, Inc. | Enhancing immune responses with B7-1 or B7-2 in the absence of a crosslinking agent |
| WO2001008700A1 (en) * | 1999-07-28 | 2001-02-08 | Genetics Institute, Inc. | Preventing immune-mediated abortion by inhibiting costimulation |
| CA2589418A1 (en) | 1999-08-24 | 2001-03-01 | Medarex, Inc. | Human ctla-4 antibodies and their uses |
| US7605238B2 (en) | 1999-08-24 | 2009-10-20 | Medarex, Inc. | Human CTLA-4 antibodies and their uses |
| IL150571A0 (en) * | 2000-01-03 | 2003-02-12 | Tr Associates L L C | Novel chimeric proteins and methods for using the same |
| US7541184B2 (en) | 2000-02-24 | 2009-06-02 | Invitrogen Corporation | Activation and expansion of cells |
| US7572631B2 (en) * | 2000-02-24 | 2009-08-11 | Invitrogen Corporation | Activation and expansion of T cells |
| TWI314933B (en) * | 2000-05-26 | 2009-09-21 | Bristol Myers Squibb Compan | Soluble ctla4 mutant molecules and uses thereof |
| US7094874B2 (en) | 2000-05-26 | 2006-08-22 | Bristol-Myers Squibb Co. | Soluble CTLA4 mutant molecules |
| CA2411962A1 (en) * | 2000-06-09 | 2001-12-20 | Bristol-Myers Squibb Company | Methods for regulating a cell-mediated immune response by blockinglymphocytic signals and by blocking lfa-1 mediated adhesion |
| US20050048614A1 (en) * | 2000-06-13 | 2005-03-03 | Children's Medical Center Corporation | Biosynthetic oncolytic molecules and uses therefor |
| US20040034193A1 (en) * | 2001-06-13 | 2004-02-19 | Samy Ashkar | Biosynthetic oncolytic molecules and uses therefor |
| SK287940B6 (sk) | 2000-07-03 | 2012-05-03 | Bristol-Myers Squibb Company | Soluble CTLA4 fusion molecule, pharmaceutical composition comprising thereof and its use |
| US20040022787A1 (en) * | 2000-07-03 | 2004-02-05 | Robert Cohen | Methods for treating an autoimmune disease using a soluble CTLA4 molecule and a DMARD or NSAID |
| US6875904B2 (en) * | 2000-09-20 | 2005-04-05 | The Ohio State University Research Foundation | Animal model for identifying agents that inhibit or enhance CTLA4 signaling |
| US7014998B2 (en) * | 2000-09-30 | 2006-03-21 | Yale University | Screening immunomodulatory agents by CTLA-4 upregulation |
| US20060057651A1 (en) * | 2000-12-08 | 2006-03-16 | Bowdish Katherine S | Polypeptides and antibodies derived from chronic lymphocytic leukemia cells and uses thereof |
| US9249229B2 (en) * | 2000-12-08 | 2016-02-02 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Polypeptides and antibodies derived from chronic lymphocytic leukemia cells and uses thereof |
| US20040198661A1 (en) * | 2000-12-08 | 2004-10-07 | Bowdish Katherine S. | Polypeptides and antibodies derived from chronic lymphocytic leukemia cells and uses thereof |
| US7408041B2 (en) * | 2000-12-08 | 2008-08-05 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Polypeptides and antibodies derived from chronic lymphocytic leukemia cells and uses thereof |
| AU2002246632B2 (en) * | 2000-12-08 | 2007-04-05 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Chronic lymphocytic leukemia cell line and its use for producing an antibody |
| US20030133939A1 (en) * | 2001-01-17 | 2003-07-17 | Genecraft, Inc. | Binding domain-immunoglobulin fusion proteins |
| US7829084B2 (en) | 2001-01-17 | 2010-11-09 | Trubion Pharmaceuticals, Inc. | Binding constructs and methods for use thereof |
| US7754208B2 (en) | 2001-01-17 | 2010-07-13 | Trubion Pharmaceuticals, Inc. | Binding domain-immunoglobulin fusion proteins |
| AU2002243905B2 (en) * | 2001-01-26 | 2007-11-08 | Emory University | Methods of inducing organ transplant tolerance and correcting hemoglobinopathies |
| TWI329129B (en) * | 2001-02-08 | 2010-08-21 | Wyeth Corp | Modified and stabilized gdf propeptides and uses thereof |
| WO2002078730A2 (en) | 2001-03-28 | 2002-10-10 | Biogen, Inc. | Use of neublastin polypeptides for treating neuropathic pain |
| US20040058445A1 (en) * | 2001-04-26 | 2004-03-25 | Ledbetter Jeffrey Alan | Activation of tumor-reactive lymphocytes via antibodies or genes recognizing CD3 or 4-1BB |
| MXPA03010568A (es) | 2001-05-23 | 2005-03-07 | Squibb Bristol Myers Co | Metodos para proteger trasplantes alogenicos de celulas de isletas usando moleculas mutantes ctla4 solubles. |
| KR100453877B1 (ko) | 2001-07-26 | 2004-10-20 | 메덱스젠 주식회사 | 연쇄체화에 의한 면역 글로블린 융합 단백질의 제조 방법 및 이 방법에 의해 제조된 ＴＮＦＲ/Ｆｃ 융합 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 ＤＮＡ, 상기 ＤＮＡ를 포함하는벡터, 및 상기 벡터에 의한 형질전환체 |
| US20030086940A1 (en) * | 2001-08-10 | 2003-05-08 | Cristina Costa | Engineered recombinant molecule that regulates humoral and cellular effector functions of the immune system |
| US20040116675A1 (en) * | 2001-12-14 | 2004-06-17 | Tso J. Jun | Silenced anti-cd28 antibodies and use thereof |
| US7858297B2 (en) * | 2001-12-18 | 2010-12-28 | Centre National De La Recherche Scientifique Cnrs | Chemokine-binding protein and methods of use |
| WO2003051917A2 (en) * | 2001-12-18 | 2003-06-26 | Endocube Sas | Novel death associated proteins of the thap family and related par4 pathways involved in apoptosis control |
| US6578724B1 (en) * | 2001-12-29 | 2003-06-17 | United States Can Company | Connector for use in packaging aerosol containers |
| EP2138575B8 (en) | 2002-02-20 | 2013-07-24 | Mersana Therapeutics, Inc. | Conjugates comprising a biodegradable polymer and uses therefor |
| US20030219436A1 (en) * | 2002-03-15 | 2003-11-27 | Ledbetter Jeffrey A. | Compositions and methods to regulate an immune response using CD83 gene expressed in tumors and using soluble CD83-Ig fusion protein |
| SI1503794T1 (sl) | 2002-04-12 | 2012-09-28 | Medarex Inc | Postopek zdravljenja z uporabo ctla-4 antiteles |
| KR20050007375A (ko) * | 2002-05-02 | 2005-01-17 | 유니버시티 오브 코네티컷 헬스 센터 | 항체 치료의 효능을 개선하기 위한 열 충격 단백질의 사용 |
| US20040247578A1 (en) * | 2002-10-15 | 2004-12-09 | University Of Pittsburgh Of Commonwealth System Of Higher Education | Methods and reagents for inducing immunity |
| JP4541157B2 (ja) * | 2002-12-23 | 2010-09-08 | ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニー | タンパク質を製造するための哺乳類細胞培養法 |
| PT1576182E (pt) * | 2002-12-23 | 2011-01-21 | Bristol Myers Squibb Co | Optimizador da qualidade do produto em processos de cultura celular de mamíferos destinados à produção de proteínas |
| JP4742025B2 (ja) | 2003-01-31 | 2011-08-10 | バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド | 変異ニューブラスチンのポリマー結合体 |
| GB0303663D0 (en) * | 2003-02-18 | 2003-03-19 | Lorantis Ltd | Assays and medical treatments |
| US7897582B2 (en) * | 2003-05-23 | 2011-03-01 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotide compositions and methods for the modulation of the expression of B7 protein |
| US7960355B2 (en) * | 2003-05-23 | 2011-06-14 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for the modulation of the expression of B7 protein |
| US6971600B2 (en) * | 2003-06-30 | 2005-12-06 | Heligear Engineering (H.K.) Co., Ltd. | Oscillation mechanism for fishing reel |
| US7754209B2 (en) | 2003-07-26 | 2010-07-13 | Trubion Pharmaceuticals | Binding constructs and methods for use thereof |
| NZ545314A (en) * | 2003-08-04 | 2009-03-31 | Bristol Myers Squibb Co | Methods for treating cardiovascular disease using a soluble CTLA4 molecule |
| WO2005044188A2 (en) * | 2003-10-27 | 2005-05-19 | Amgen Inc. | Compositions and methods to modulate an immune response to an immunogenic therapeutic agent |
| EP1793858A4 (en) * | 2004-09-08 | 2008-12-10 | Univ Ohio State Res Found | HUMAN MONOCLONAL ANTI-CTLA4 ANTIBODIES FOR CANCER TREATMENT |
| WO2006029220A2 (en) * | 2004-09-08 | 2006-03-16 | Ohio State University Research Foundation | Combination therapy with anti-ctla4 and anti-4-1bb antibodies |
| GB0421465D0 (en) * | 2004-09-27 | 2004-10-27 | Chiron Srl | Group A streptococcus protein |
| KR101235484B1 (ko) * | 2005-04-06 | 2013-02-22 | 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 | 가용성 ｃｔｌａ4 돌연변이체 분자를 이용하여 이식편이식과 연관된 면역 장애를 치료하는 방법 |
| EP1904105A4 (en) | 2005-07-11 | 2010-02-17 | Macrogenics Inc | METHOD FOR THE TREATMENT OF AUTOIMMUNE DISEASES WITH IMMUNOSUPPRESSIVE MONOCLONAL ANTIBODIES WITH REDUCED TOXICITY |
| UA97469C2 (uk) | 2005-07-25 | 2012-02-27 | Емерджент Продакт Дівелопмент Сіетл, Елелсі | Гуманізована специфічна до cd37 зв'язувальна молекула імуноглобуліну |
| JP4899083B2 (ja) * | 2005-08-29 | 2012-03-21 | Ｓｍｃ株式会社 | 減速比自動切換装置 |
| WO2007056466A2 (en) * | 2005-11-08 | 2007-05-18 | Avi Biopharma, Inc. | Immunosuppression compound and treatment method |
| US8501704B2 (en) | 2005-11-08 | 2013-08-06 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Immunosuppression compound and treatment method |
| AU2013202533B2 (en) * | 2005-11-08 | 2015-11-12 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Immunosuppression Compound and Treatment Method |
| NZ568016A (en) | 2005-12-07 | 2011-12-22 | Medarex Inc | CTLA-4 antibody dosage escalation regimens |
| KR101398713B1 (ko) | 2005-12-20 | 2014-06-12 | 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 | 조성물 및 조성물의 제조 방법 |
| NZ599035A (en) | 2006-01-12 | 2013-12-20 | Alexion Pharma Inc | Antibodies to ox-2/cd200 and uses thereof |
| CA2646329C (en) | 2006-03-20 | 2018-07-03 | The Regents Of The University Of California | Engineered anti-prostate stem cell antigen (psca) antibodies for cancer targeting |
| US7528111B2 (en) * | 2006-05-12 | 2009-05-05 | Bristol-Myers Squibb Company | Method of vaccinating subjects receiving immune modulating therapy |
| MX363905B (es) | 2006-06-12 | 2019-04-08 | Aptevo Res & Development Llc | Proteinas de union multivalentes monocatenarias con funcion efectora. |
| AU2007260687B2 (en) | 2006-06-14 | 2013-12-12 | Provention Bio, Inc. | Methods for the treatment of autoimmune disorders using monoclonal antibodies with reduced toxicity |
| KR20100036362A (ko) * | 2007-07-25 | 2010-04-07 | 알렉시온 파마슈티칼스, 인코포레이티드 | 자가면역 질환 치료 방법 및 조성물 |
| JP6126773B2 (ja) | 2007-09-04 | 2017-05-10 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | 癌のターゲッティングおよび検出のための高親和性抗前立腺幹細胞抗原（ｐｓｃａ）抗体 |
| EP2222697B1 (en) | 2007-11-01 | 2012-12-05 | Perseid Therapeutics LLC | Immunosuppressive polypeptides and nucleic acids |
| NZ621443A (en) | 2008-04-11 | 2015-09-25 | Emergent Product Dev Seattle | Cd37 immunotherapeutic and combination with bifunctional chemotherapeutic thereof |
| US7915222B2 (en) * | 2008-05-05 | 2011-03-29 | Bristol-Myers Squibb Company | Method of preventing the development of rheumatoid arthritis in subjects with undifferentiated arthritis |
| AU2009298131B2 (en) | 2008-10-02 | 2016-07-14 | Aptevo Research And Development Llc | CD86 antagonist multi-target binding proteins |
| EP2358390A1 (en) * | 2008-11-13 | 2011-08-24 | Emergent Product Development Seattle, LLC | Cd37 immunotherapeutic combination therapies and uses thereof |
| EP3381937A3 (en) * | 2009-08-13 | 2018-10-31 | The Johns Hopkins University | Methods of modulating immune function |
| US9540426B2 (en) | 2009-10-06 | 2017-01-10 | Bristol-Myers Squibb Company | Mammalian cell culture processes for protein production |
| BR112012008665A2 (pt) | 2009-10-12 | 2016-11-22 | Pfizer | tratamento de câncer |
| KR20130049775A (ko) | 2010-03-12 | 2013-05-14 | 애브비 바이오테라퓨틱스 인크. | Ｃｔｌａ４ 단백질 및 이의 용도 |
| EP3372617B1 (en) | 2010-04-02 | 2024-07-24 | Amunix Pharmaceuticals, Inc. | Binding fusion proteins, binding fusion protein-drug conjugates, xten-drug conjugates and methods of making and using same |
| AU2011309689B2 (en) | 2010-09-28 | 2015-01-15 | Hadasit Medical Research Services & Development Ltd. | Compositions and methods for treatment of hematological malignancies |
| WO2013010537A1 (en) | 2011-07-20 | 2013-01-24 | Aarhus Universitet | Method of treating morphea |
| WO2013148049A1 (en) | 2012-03-29 | 2013-10-03 | The General Hospital Corporation | Recombinant cytotoxic t-lymphocyte-associated protein 4 (ctla4) |
| WO2013169971A1 (en) | 2012-05-10 | 2013-11-14 | Bristol-Myers Squibb Company | Anti-tumor antibodies as predictive or prognostic biomarkers of efficacy and survival in ipilimumab-treated patients |
| CN107540742B (zh) | 2012-05-11 | 2021-06-29 | 米迪缪尼有限公司 | Ctla-4变体 |
| US8735359B2 (en) | 2012-05-24 | 2014-05-27 | Orban Biotech Llc | Combinations of modalities for the treatment of diabetes |
| CN113138279A (zh) | 2012-06-27 | 2021-07-20 | 法姆制药有限责任公司 | 融合蛋白组合物的应用 |
| US20140112958A1 (en) | 2012-10-24 | 2014-04-24 | Mwm Biomodels Gmbh | Pancreatic islets of transgenic LEA29Y animals for treating diabetes |
| US9944689B2 (en) | 2013-03-07 | 2018-04-17 | The General Hospital Corporation | Human CTLA4 mutants and use thereof |
| US10570204B2 (en) | 2013-09-26 | 2020-02-25 | The Medical College Of Wisconsin, Inc. | Methods for treating hematologic cancers |
| EP2883883A1 (en) | 2013-12-16 | 2015-06-17 | Cardio3 Biosciences S.A. | Therapeutic targets and agents useful in treating ischemia reperfusion injury |
| JOP20200094A1 (ar) | 2014-01-24 | 2017-06-16 | Dana Farber Cancer Inst Inc | جزيئات جسم مضاد لـ pd-1 واستخداماتها |
| JOP20200096A1 (ar) | 2014-01-31 | 2017-06-16 | Children’S Medical Center Corp | جزيئات جسم مضاد لـ tim-3 واستخداماتها |
| GB2523399B (en) | 2014-02-25 | 2019-03-13 | Orban Tihamer | A composition comprising ten overlapping peptide fragments of the entire preproinsulin sequence |
| PH12016501545B1 (en) | 2014-03-14 | 2023-12-06 | Immutep Sas | Antibody molecules to lag-3 and uses thereof |
| CN107206071A (zh) | 2014-09-13 | 2017-09-26 | 诺华股份有限公司 | Alk抑制剂的联合疗法 |
| JP6885867B2 (ja) | 2014-12-31 | 2021-06-16 | チェックメイト ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド | 組合せ腫瘍免疫療法 |
| JP2018512856A (ja) | 2015-04-17 | 2018-05-24 | アルパイン イミューン サイエンシズ インコーポレイテッド | 調整可能な親和性を有する免疫調節タンパク質 |
| CN108367004B (zh) | 2015-09-21 | 2022-09-13 | 阿帕特夫研究和发展有限公司 | Cd3结合多肽 |
| EP3192805A1 (en) | 2016-01-15 | 2017-07-19 | Humanitas Mirasole S.p.A. | Inhibitors of t cell activation or stimulation and uses thereof |
| CN116440257A (zh) | 2017-02-28 | 2023-07-18 | 百时美施贵宝公司 | 具有增强的adcc的抗ctla-4抗体增强对疫苗的免疫应答的用途 |
| AU2018249493A1 (en) | 2017-04-03 | 2019-09-19 | Oncxerna Therapeutics, Inc. | Methods for treating cancer using PS-targeting antibodies with immuno-oncology agents |
| US11761963B2 (en) | 2017-09-27 | 2023-09-19 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Biomarker signature for predicting tumor response to anti-CD200 therapy |
| KR20250020681A (ko) | 2017-10-10 | 2025-02-11 | 알파인 이뮨 사이언시즈, 인코포레이티드 | Ctla-4 변이체 면역조절 단백질 및 이의 용도 |
| SG11202006148UA (en) | 2018-01-03 | 2020-07-29 | Alpine Immune Sciences Inc | Multi-domain immunomodulatory proteins and methods of use thereof |
| US12246031B2 (en) | 2018-02-13 | 2025-03-11 | Checkmate Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for tumor immunotherapy |
| US12084655B2 (en) | 2018-04-09 | 2024-09-10 | Checkmate Pharmaceuticals | Packaging oligonucleotides into virus-like particles |
| EP3617230A1 (en) | 2018-09-03 | 2020-03-04 | BioInvent International AB | Novel antibodies and nucleotide sequences, and uses thereof |
| CA3120576A1 (en) | 2018-11-26 | 2020-06-04 | Massachusetts Institute Of Technology | Compositions and methods for immune tolerance |
| KR20220101167A (ko) | 2019-11-21 | 2022-07-19 | 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 | 무표지 n-글리칸 정량화 방법 |
| EP4294827A1 (en) | 2021-02-19 | 2023-12-27 | Theripion, Inc. | Paraoxonase fusion polypeptides and related compositions and methods |
| GB202115803D0 (en) | 2021-11-03 | 2021-12-15 | Ducentis Biotherapeutics Ltd | Novel proteins |
| WO2023214388A1 (en) | 2022-05-06 | 2023-11-09 | Ducentis Biotherapeutics Limited | Novel cd200 fusion proteins |
| CN119365483A (zh) | 2022-05-06 | 2025-01-24 | 杜森蒂斯生物治疗有限公司 | 新型cd200融合蛋白 |
| CN114686427B (zh) * | 2022-05-23 | 2022-07-29 | 中国人民解放军总医院第一医学中心 | 一种脾脏调节型b淋巴细胞及其制备方法与应用 |
| GB202306711D0 (en) | 2023-05-05 | 2023-06-21 | Ducentis Biotherapeutics Ltd | Novel proteins |
| WO2024259220A1 (en) | 2023-06-15 | 2024-12-19 | Theripion, Inc. | Pon3 and evolved pon1 fusion polypeptides |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4399216A (en) * | 1980-02-25 | 1983-08-16 | The Trustees Of Columbia University | Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials |
| US4683195A (en) * | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
| US4683202A (en) * | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
-
1992
- 1992-06-16 DE DE122007000078C patent/DE122007000078I2/de active Active
- 1992-06-16 DE DE69226871T patent/DE69226871T3/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-06-16 JP JP50156993A patent/JP3722375B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1992-06-16 KR KR1019930703876A patent/KR100238712B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 1992-06-16 CA CA002110518A patent/CA2110518C/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-06-16 CA CA002580812A patent/CA2580812A1/en not_active Abandoned
- 1992-06-16 EP EP92914009A patent/EP0606217B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-06-16 DK DK92914009T patent/DK0606217T4/da active
- 1992-06-16 WO PCT/US1992/005202 patent/WO1993000431A1/en not_active Ceased
- 1992-06-16 AT AT92914009T patent/ATE170562T1/de active
- 1992-06-16 ES ES92914009T patent/ES2123001T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-06-16 AU AU22400/92A patent/AU661854B2/en not_active Expired
- 1992-06-24 NZ NZ243286A patent/NZ243286A/en not_active IP Right Cessation
- 1992-06-24 IL IL10229492A patent/IL102294A/en not_active IP Right Cessation
- 1992-06-24 IL IL15936492A patent/IL159364A/xx not_active IP Right Cessation
- 1992-06-24 NZ NZ264712A patent/NZ264712A/en not_active IP Right Cessation
- 1992-06-26 PT PT100637A patent/PT100637B/pt not_active IP Right Cessation
- 1992-06-26 MX MX9203605A patent/MX9203605A/es active IP Right Grant
- 1992-06-26 ZA ZA924782A patent/ZA924782B/xx unknown
- 1992-07-01 IE IE211192A patent/IE922111A1/en not_active IP Right Cessation
- 1992-07-01 IE IE20010097A patent/IE20010097A1/en not_active IP Right Cessation
-
1993
- 1993-05-26 US US08/067,684 patent/US5434131A/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-12-22 FI FI935795A patent/FI112082B/fi not_active IP Right Cessation
- 1993-12-23 NO NO19934801A patent/NO312465B1/no not_active IP Right Cessation
-
2001
- 2001-05-07 JP JP2001136657A patent/JP4159266B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2001-05-07 JP JP2001136664A patent/JP2002003399A/ja not_active Withdrawn
-
2002
- 2002-01-30 NO NO20020491A patent/NO318806B1/no not_active IP Right Cessation
- 2002-04-11 JP JP2002109829A patent/JP2003012546A/ja not_active Withdrawn
- 2002-07-22 JP JP2002213195A patent/JP2003096097A/ja not_active Withdrawn
- 2002-10-01 JP JP2002289290A patent/JP2003174872A/ja active Pending
- 2002-12-30 FI FI20022285A patent/FI115057B/fi not_active IP Right Cessation
-
2003
- 2003-12-15 IL IL15936403A patent/IL159364A0/xx unknown
-
2004
- 2004-06-10 IL IL16243004A patent/IL162430A0/xx unknown
-
2007
- 2007-11-02 NL NL300303C patent/NL300303I1/nl unknown
- 2007-11-07 LU LU91375C patent/LU91375I2/fr unknown
- 2007-11-14 NO NO2007013C patent/NO2007013I2/no unknown
-
2012
- 2012-01-09 NO NO2012001C patent/NO2012001I2/no not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI115057B (fi) | Eristetty liukoinen CTL4A-proteiini, sitä sisältäviä fuusioproteiineja, sen ligandeja, sen tunnistavia monoklonaalisia vasta-aineita ja käyttötapoja | |
| AU701310B2 (en) | CTLA4 molecules and IL4-binding molecules and uses thereof | |
| US5977318A (en) | CTLA4 receptor and uses thereof | |
| CA2113744C (en) | Methods for regulating the immune response using ctla4-binding molecules and il4-binding molecules | |
| US5844095A (en) | CTLA4 Ig fusion proteins | |
| US7311910B2 (en) | Methods for treating cancer and infectious disease by blocking CTLA4-B7 interactions | |
| MXPA95001794A (en) | Ctla4 molecules and il-4 link molecules and uses of mis |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG | Patent granted |
Ref document number: 115057 Country of ref document: FI |
|
| MA | Patent expired |