FI106471B - Menetelmä polypeptidien valmistamiseksi, polypeptidejä koodaava DNA-sekvenssi, ilmentämisvektori ja isäntäsolu - Google Patents

Description

, 106471

Menetelmä polypeptidien valmistamiseksi, polypeptidejä koodaava DNA-sekvenssi, ilmentämisvektori ja isäntäsolu Tämä keksintö koskee menetelmää polypeptidin valmistamiseksi, jota 5 polypeptidiä on saatavissa ihmisen ihon psoriaattisesta hilseestä ja jolla on inhiboivaa aktiivisuutta ihmisen valkosoluelastaasia vastaan.

Keksintö koskee myös polypeptidiä koodaavaa DNA-sekvenssiä, sekä replikoituvaa plasmidista ilmentämisvektoria ja tällä transformoitua bakteeri- tai hiivaisäntäsolua.

10 Ihmisen valkosoluelastaasi (HLE) on proteolyyttinen entsyymi, jota esiintyy ihmisen monilohkotumaisten valkosolujen atsurofiilisissä jyväsissä. Normaaleissa olosuhteissa nämä jyväset yhdistyvät vierasta materiaalia, kuten bakteereja, sisältävien fagosomien kanssa, jolloin HLE:n ja muiden lysomaalisten entsyymien yhdistelmä metaboloi partikkelit. Kuitenkin tietyissä 15 sairaustiloissa monilohkotumaiset valkosolut kiinnittyvät isäntäproteiiniin, kuten elastiiniin ja kollageeniin, ja jyvästen sisältö HLE mukaanlukien voi vapautua suoraan kudokseen. Seurauksena olevan isäntäkudokseen kohdistuvan HLE:n hajottavan aktiivisuuden uskotaan johtavan kudosvaurioon, jolla saattaa olla osuutta sellaisissa sairauksissa kuin emfyseema (2), hengityksen vajaatoiminta 20 (ARDS), jota esiintyy vaikeiden sairauksien ja erityisesti vaikeiden keuhkotulehdusten yhteydessä (1), psoriaasi (3) sekä rakkulainen dermatoosi (4).

HLE:n voimakkaan proteolyyttisen aktiivisuuden tiedetään tasoittuvan 4 t t jossain määrin sellaisten inhibiittoreiden kuten arantitrypsiinin ja a2-makro-:Y; 25 globuliinin antiproteolyyttisen aktiivisuuden vaikutuksesta. Näitä inhibiittoreita on löydetty seerumista sekä myös useista kudoksista, orvaskesi mukaan luettuna • · ;\· (5, 10). Alhaisen molekyylipainon omaava ihmisen valkosoluproteaasien • ♦ .···. inhibiittori on lisäksi osoitettu siemennesteestä (11), kohdunkaulan limasta (12), .*·:*. keuhkoputkieritteestä (13) ja korvasylkirauhasen eritteestä (14) sekä myös • · fr 30 ihmisen seerumista (6). Immunoreaktiivisuuden (6, 15) tai aminohappo-sekvenssianalyysin (16, 17) avulla osoitettiin kaikista näistä lähteistä löydetyn • · inhibiittorin olevan identtinen antileukoproteaasin ja sen metaboliittien kanssa sekä myös olevan trypsiinin tehokas inhibiittori. Hochstrasser et ai. (21) ovat löytäneet alhaisen molekyylipainon omaavia inhibiittoreita myös keuhkoputki- • · · 35 limasta, ja niitä on löydetty myös psoriaattisesta ihosta. Kirjallisuudesta löytyy myös muita elastaasin inhibiittoreita (18, 19), jotka myös inhiboivat trypsiiniä.

• · * • · • · « · Ϊ o · • « 2 106471

Lisäksi elastaasi-inhibiittoreita on löydetty koirien, leijonien ja kissojen alaleuan alaisista rauhasista (20).

Keksinnön kohteena on menetelmä sellaisen polypeptidin valmistamiseksi, jota polypeptidiä on saatavissa ihmisen ihon psoriaattisesta 5 hilseestä ja jolla on inhiboivaa aktiivisuutta ihmisen valkosoluelastaasia vastaan ja i) joka polypeptidi sisältää aminohapposekvenssin a) -Ala-GIn-Glu-Pro-Val-Lys-Gly-Pro, b) -Ala-GIn-Glu-Pro-Val-Lys-Gly-Pro-Val-Ser-Thr-Lys-Pro-Gly-10 Ser-Cys-Pro-lle-lle-Leu, c) -Ala-GIn-Glu-Pro-Val-Lys-Gly-Pro-Val-Ser-Thr-Lys-Pro-Gly-Ser-

Cys, d) -Ala-GIn-Glu-Pro-Val-Lys-Gly-Pro-Val-Ser-Thr-Lys-Pro-Gly-Ser-Cys-Pro-lle-lle-Leu-lle-Arg-Cys-Ala-Met-Leu-Asn-Pro-Pro-Asn-Arg-Cys-Leu-Lys- 15 Asp-Thr, tai e) -Lys-Gly-Pro-Val-Ser-Thr-Lys-Pro-Gly-Ser-Cys-Pro-lle-lle-Leu-lle-Arg-Cys-Ala-Met-Leu-Asn-Pro-Pro-Asn, ii) tai aminohapposekvenssin

Asn-Gly-GIn-Asp-Pro-Val-Lys-Gly-GIn-Val-Ser-Val-Lys-GIy-GIn-Asp-20 Lys-Val-Lys-Ala-GIn-Glu-Pro-Val-Lys-Gly-Pro,

Gly/Ala-GIn/Val-Asp-Lys-Val-Lys-Ala-GIn-Glu-Pro-Val-Lys-Gly-Pro-

Val-Ser-Thr-Lys-Pro-GIy-Ser-Cys-Pro-lle-lle-Leu,

Asp-Lys-Val-Lys-Ala-GIn-Glu-Pro-Val-Lys-Gly-Pro-Val-Ser-Thr-Lys-' -..' Pro-Gly-Ser-Cys, tai • 4 :. v 25 GlyA/al-Lys-Ala-GIn-Glu-Pro-Val-Lys-Gly-Pro-Val-Ser-Thr-Lys-Pro-

Gly-Ser-Cys-Pro-I le-lle-Leu-l le-Arg-Cys-Ala-Met-Leu-Asn-Pro-Pro-Asn-Arg-Cys-Leu-Lys-Asp-Thr,

:***: iii) tai jolla polypeptidillä on kaava I

Ala-GIn-Glu-Pro-Val-Lys-Gly-Pro-Val-Ser-Thr-Lys-Pro-Gly-Ser-Cys-Pro-lle-lle-30 Leu-I le-Arg-Cys-Ala-Met-Leu-Asn-Pro-Pro-Asn-Arg-Cys-Leu-Lys-Asp-Thr-Asp- ft Cys-Pro-Gly-lle-Lys-Lys-Cys-Cys-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Met-Ala-Cys-Phe-Val-

Pro-GIn (kaava I), •; ·' iv) tai joka polypeptidi sisältää aminohapposekvenssin

Lys-Gly-Pro-Val-Ser-Thr-Lys-Pro-Gly-Ser-Cys-Pro-lle-lle-Leu-lle-Arg- ·:··: 35 Cys-Ala-Met-Leu-Asn-Pro-Pro-Asn-, « • · ·

» » I

• ♦ • · « « 3 106471

Edullisimmin polypeptidillä on kaavan I mukainen rakenne.

Tarkoituksenmukaisesti keksinnön mukaisesti saatavalla polypeptidillä on seriiniproteaaseille spesifistä inhiboivaa aktiivisuutta, niin että sillä on inhiboivaa aktiivisuutta sellaisia proteaaseja kuten ihmisen 5 valkosoluelastaasia ja sian haiman elastaasia vastaan, mutta ei merkittävää inhiboivaa aktiivisuutta trypsiiniä vastaan. Keksinnön mukaisesti saatavilla edullisilla peptideillä ei ole merkittävää inhiboivaa aktiivisuutta ihmisen katepsiini G:tä, α-kymotrypsiiniä ja plasmiinia vastaan.

Keksinnön mukaisesti saatavien polypeptidien isoelektrinen piste voi 10 olla noin pH:ssa 9,7 (määritetty isoelektrisellä fokusoinnilla).

Keksinnön mukaisesti saatavat edulliset polypeptidit voidaan valmistaa geeniteknologian menetelmiä käyttäen, ja ne voidaan myös saada ihmisen ihon psoriaattisesta hilseestä.

Keksinnön mukaisesti saadaan siten myös polypeptidi, jolla on 15 inhiboivaa aktiivisuutta ihmisen valkosoluelastaasia vastaan, joka on saatavissa ihmisen ihon psoriaattisesta hilseestä ja jolla on yksi tai useampi seuraavista ominaisuuksista: a) molekyylipaino noin 9 kD (määritetty SDSPAGE:lla), b) isoelektrinen piste noin pH:ssa 9,7 (määritetty isoelektrisellä 20 fokusoinnilla, c) inhiboivan aktiivisuuden ihmisen valkosoluelastaasia vastaan lisäksi inhiboivaa aktiivisuutta sian haiman elastaasia vastaan, d) ei merkittävää aktiivisuutta trypsiiniä, ihmisen katepsiini G:tä, -...: α-kymotrypsiiniä eikä plasmiinia vastaan.

« I

:.v 25 Kaavan I mukaisella polypeptidillä on myös inhiboivaa aktiivisuutta :V: proteinaasi 3:a vastaan.

Ihmisen iholta saataviin polypeptideihin kuuluvat sellaiset polypeptidit, • · .1·1: jotka saadaan suoraan eristys- ja puhdistusmenetelmiä käyttäen, sekä tällaisten «·· polypeptidien fragmentit.

30 Keksinnön mukaisesti saatavia polypeptidejä ja niiden fragmentteja on saatavissa biologisesti puhtaassa ia homogeenisessa muodossa. Keksintö antaa käyttöön myös tässä määritellyn mukaisen polypeptidin, jolla ei ole natiivia

- | I

·;·’ glykosylaatiota.

Keksinnön mukaisesti edellä kuvattuja polypeptidejä voidaan :··: 35 valmistaa tarkoituksenmukaisesti käyttäen geeniteknologian mukaisia menetelmiä.

« · · • · « 4 106471

Keksinnön mukaiselle menetelmälle edellä kuvatun polypeptidin valmistamiseksi on tunnusomaista, että viljellään bakteeri tai hiivaisäntäsolu, joka on transformoitu plasmidisella ilmentämisvektorilla, joka koodaa polypeptidiä, ja mahdollisesti puhdistetaan ilmennetty polypeptidi.

5 Tässä käytettynä käsitettä replikoituva plasmidinen ilmentymisvektori käytetään sen laajimmassa merkityksessä ja se sisältää esimerkiksi plasmidit, jotka kykenevät replikoitumaan solussa kromosomin ulkopuolella ja ne, jotka kykenevät replikoitumaan isäntäsolun geneettiseen materiaaliin integroitumisen kautta.

10 Edellä mainittu menetelmä voidaan toteuttaa käyttämällä mitä tahansa sopivaa isäntäsolua kuten E. colia tai hiivasolua. Käytetystä isännästä riippuen keksinnön mukaisesti saatavat polypeptidit voivat olla glykosyloituja eukaryoottisilla hiilihydraateilla tai ne voivat olla glykosyloimattomia.

Huomattakoon, että silloin kun haluttua metaboliittia ei saada solusta 15 ulos kaupallisesti käyttökelpoisella nopeudella, isäntää voidaan viljellä ja se voidaan ottaa talteen ehjänä soluna ja haluttu polypeptidi voidaan ottaa myöhemmin talteen soluista uuttamalla esimerkiksi kasvualustasta, joka sisältää isäntäsolun kasvulle välttämättömiä ravinteita, erottamisen jälkeen. Silloin kun metaboliitti pääsee isäntäsolusta sitä ympäröivään kasvuliemeen, polypeptidi 20 voidaan ottaa talteen uuttamalla tavalliseen tapaan.

Keksintö koskee siten myös bakteeri- tai hiivaisäntäsolua, jolle on tunnusomaista, että se on transformoitu plasmidisella ilmentämisvektorilla, joka koodaa jossakin edellä olevassa patenttivaatimuksessa määritellyn polypeptidin.

' · · ' Bakteeri- tai hiivaisäntäsolu voidaan valmistaa isännän « » :.v 25 transformaatiolla, jossa siihen insertoidaan replikoituva plasmidinen « 4' v.: ilmentymisvektori, joka käsittää edellä määritellyn mukaista polypeptidiä koodaavan geneettisen materiaalin.

Sopivat menetelmät vieraan geneettisen materiaalin saamiseksi • · · isäntään ovat yleisesti tunnettuja kirjallisuudesta. Tällaisiin menetelmiin kuuluvat « 30 replikoituvan ilmentymisvektorin muodostaminen, joka käsittää vektorin ja ..... vieraan geneettisen materiaalin, sekä ilmentymisvektorin viemisen isäntään.

4 4 I" Ilmentymisvektorin viemistä soluun voidaan helpottaa isännän sopivalla ’:** käsittelyllä, esimerkiksi E. colin tapauksessa käsittelemällä kalsiumkloridi- liuoksella.

« • · # 1 1 ♦ · · • · » « · - ^ 106471 5

Keksintö koskee edelleen replikoituvaa plasmidista ilmentymis-vektoria, joka kykenee ilmentämään edellä määritellyn mukaisen polypeptidin transformoidussa isännässä.

Replikoituva plasmidinen ilmentymisvektori voidaan valmistaa 5 insertoimalla määritellyn mukaista polypeptidiä koodaava geeni vektoriin sopivaan insertiokohtaan, niin että saadaan replikoituva plasmidinen ilmentymisvektori, joka kykenee ohjaamaan edellä mainitun mukaisen polypeptidin synteesiä.

Keksintö koskee lisäksi DNA-sekvenssiä, joka koodaa edellä 10 mainitun mukaista polypeptidiä.

Keksinnön mukaisiin DNA-sekvensseihin kuuluvat sekvenssit, jotka ovat käyttökelpoisia edellä määritellyn mukaisen polypeptidin ilmentymisen varmistamiseksi prokaryoottisissa tai eukaryoottisissa isäntäsoluissa. Keksinnön mukaiset DNA-sekvenssit käsittävät spesifisesti kuviossa 13 esitetyn 15 DNA-sekvenssin ja sen fragmentit, ja erityisesti kaavan I mukaista polypeptidiä koodaavan fragmentin tai sen komplementaarisen säikeen.

Edellä mainittuihin, kuviossa 13 esitettyjen sekvenssien fragmentteihin kuuluvat sellaiset fragmentit, jotka on tuotettu perättäisellä pilkkomisella restriktioentsyymeillä, kuten ECoRI:llä ja Sälillä sekä BspMkllä ja 20 BamHUIä, kuten myös kaavan I mukaista polypeptidiä koodaava fragmentti. Edellä mainitut, kuvioissa 14 ja 15 esitetyt sekvenssit ovat osittaisia cDNA-sekvenssejä kun taas kuviossa 16 on cDNA-sekvenssi kokonaan. Näin ollen keksinnön piiriin kuuluuu myös DNA-sekvenssi, joka käsittää suurimman osan kuviossa 14 tai 16 esitetystä DNA-sekvenssistä, tai sen I f v.: 25 komplementaarisen säikeen.

:'v Geneettisen koodin degeneraatio sallii huomattavaa vapautta sellaisten kodoneitten valinnassa, joita voidaan käyttää geenin konstruoimiseen ·***: kyseessä olevan keksinnön mukaisesti sopivan polypeptidin valmistamiseksi.

·*·

Kodonit valitaan tavallisesti niiden joukosta, jotka ovat isännälle edullisia.

30 Voidaan konstruoida polynukleotidikoettimia, jotka kykenevät ’ hybridisoitumaan mihin tahansa yllä mainittujen DNA-sekvenssien tai vastaavan RNA- tai cDNA-sekvenssin osaan. Huomattakoon, että nukleotidikoetin käsittää « · ·;·* nukleotidisekvenssin, joka kykenee hybridisoitumaan määritettävään : sekvenssiin riittävän pitkältä matkalta, jotta varmistuttaisiin koettimen ilmaisevan ♦:··: 35 halutun sekvenssin yksiselitteisesti. Yleensä koetin kykenee hybridisoitumaan ♦ ♦ · • · ♦ · • · 6 106471 ainakin 8:aan määritettävän sekvenssin peräkkäiseen nukleotidiin. Koettimessa voi mahdollisesti olla leima tai merkkikomponentti.

Polynukleotidikoettimet voidaan leimata tai merkitä alalla hyvin tunnettujen tekniikoiden mukaisesti, esimerkiksi radioleimata 32P:llä millä 5 tahansa tavanomaisella tavalla tai vaihtoehtoisesti radioleimata jollain muulla hybridisoinnin alalla hyvin tunnetulla menetelmällä, jolloin saadaan esimerkiksi 35S-radioleimattuja koettimia. Koettimilla voi olla esimerkiksi fluoresoivia merkkejä. Vaihtoehtoisesti ne voidaan leimata biotiinilla tai samankaltaisilla aineilla käyttäen menetelmää, jonka Ward, D.C. et ai. esittävät teoksessa 10 Proceedings of the 1981 ICN-UCLA Symposium on Development Biology using Purified Genes, held in Keystone, Colorado, March 15 - 20, 1981, Voi. XXIII 1981, s. 647 - 658, Academic Press, toim. Brown, Donald D. et ai. tai ne voidaan leimata jopa entsyymeillä menetelmän mukaisesti, joka esitetään teoksessa A.D.B. Malcomn et ai, Abstracts of the 604th Biochemical Society 15 Meeting, Cambridge, England (kokous 1.7.1983).

Kuten tässä kuvataan, voidaan myös käyttää vasta-ainetta, joka on tehokas sitomaan vähintään fragmentin edellä määritellyn mukaisesta poly-peptidistä. Tässä käytettynä, jollei asiayhteys osoita muuta, käsite vasta-aine on ymmärrettävä sisältämään ehjät vasta-aineet kuten polyklonaaliset ja 20 monoklonaaliset vasta-aineet ja fragmentit yhtä hyvin kuin kimeeriset vasta-aineet kuten GB-patenttihakemuksessa nro 2 188 638 on esitetty. Tässä käytettynä, jollei määritetty ilmaisemaan muuta, käsite "fragmentit" on ymmärrettävä viittaamaan vastaaineen sitomisalueen sisältäviin fragmentteihin. Tällaiset fragmentit voivat olla Fab-tyyppisiä fragmentteja, jotka määritellään • « v.: 25 fragmenteiksi, joilta puuttuu Fc-osa, esim. Fab-, Fab1- ja F(ab1)2-fragmentit, tai :V: ne voivat olla niin kutsuttuja "puolimolekyyli"-fragmentteja, jotka saadaan ehjän vasta-aineen raskaan ketjun komponentit yhteen liittävien disulfidisidosten pelkistyslohkeamisen seurauksena.

• · ·

Vasta-aineessa voi haluttaessa olla leima tai merkkikomponentti 30 esimerkiksi kuten edellä on esitetty suhteessa polynukleotidikoettimiin. Näin ... ollen vasta-aineessa voi olla esimerkiksi fluoresoivaa merkkiainetta. Kuitenkaan • · ’·.·.*.* ei ole välttämätöntä, että vasta-aineessa on leima tai merkkikomponentti.

• * ·;·' Vasta-aine voidaan myös havaita esimerkiksi toisen vasta-aineen avulla, joka on ensimmäisen vasta-aineen vasta-aine. Toisessa vasta-aineessa on leima tai • · t ·:··· 35 merkkikomponentti.

• * I

• · » • » • · « · 7 106471 Tällaisia vasta-aineita tai koettimia voidaan käyttää edellä määritellyn mukaisen polypeptidin tai, kun tarkoituksenmukaista, vastaavan DNA:n tai RNA:n läsnäolon havaitsemiseen tai puuttumisen ilmaisemiseen ja näin ollen inhiboivaa aktiivisuutta elastaasia vastaan omaavan materiaalin läsnäolon tai 5 puuttumisen ilmaisemiseen. Koettimia tai vasta-aineita voidaan näin käyttää osoittamaan johtuuko elastaasivälitteinen tila ainakin osittain elastaasia inhiboivan materiaalin puuttumisesta.

Keksinnön mukaisesti saatavien polypeptidien teho toimia elastaasi-inhibiittorina määritettiin yhdisteen kyvyllä inhiboida ihmisen valkoso-10 luelastaasin (HLE) vaikutusta alhaisen molekyylipainon omaavan peptidin substraattiin. Inhibiittorin teho arvioitiin suorittamalla inhibiittorin vuorovaikutuksessa HLE:n kanssa muodostuneen kompleksin dissosiaatiovakion Ki kineettinen määritys. Substraattina käytettiin anilidia metoksisukki-nyyli-alanyyli-alanyyli-prolyyli-valiini-pnitrQanilidi, joka on esitetty teoksissa 15 Nakajima, K. et ai., J. Biol. Chem.. 254: 4027 - 4032 (1979) ja Teshima, T. et ai., J. Biol. Chem.. 257: nro 9, 5085 - 5091 (1982). Näissä tutkimuksissa käytettyä HLE-entsyymiä voidaan saada Elastin Products of St. Louis -yritykseltä Missourista tai sitä voidaan puhdistaa seuraavan teoksen mukaisesti: Viscarello, B.R. et ai., Preparative Biochemistry. Voi. 13, s. 56 - 57 (1983).

20 Edellä määritellyn mukaisia polypeptidejä voidaan käyttää sellaisenaan tai puhdistettuina tunnetulla ja sopivalla tavalla ja formuloituina farmaseuttisiksi koostumuksiksi esimerkiksi sekoittamalla farmaseuttisesti hyväksyttävän laimentimen tai kantajan kanssa. Lääke voidaan antaa usealla *···1 alalla tunnetulla tavalla. Erityisesti lääkkeen antaminen voi tapahtua « « 25 ruoansulatuskanavan ulkopuolisesta esimerkiksi nenäontelon sisäisesti, ♦ ♦ v.: peräsuoleen, keuhkoihin sekä injektion avulla kuten injektoimalla lihaksen sisään tai ihon alle. Farmaseuttiset koostumukset formuloidaan käytettävän :***: lääkkeenantotavan mukaisesti. Esimerkiksi kun koostumus annetaan ·«· nenäontelon sisäisesti, koostumus voidaan formuloida hienonnetuksi aerosoliksi 30 ja kun koostumus annetaan injektion avulla, se voidaan formuloida steriiliksi liuokseksi tai suspensioksi. Sopivia laimentimia, joita ovat vesiliuokset ja • · I” lisäaineet kuten puskurit ja pinta-aktiiviset aineet, voidaan lisätä.

”1 Farmaseuttisiin koostumuksiin kuuluvat myös kontrolloidusti vapautuvat formulaatiot. Esimerkiksi voidaan keksinnön mukaisesti saatavat ·:··: 35 polypeptidit kapseloida biohajoavan polymeerin sisään tai ne voidaan dispergoida tällaisen polymeerin matriisiin, niin että polymeeriä vapautuu • · • · • · 8 106471 polymeerimatriisin hajoamisen edetessä. Sopivia biohajoavia polymeerejä käytettäviksi jatkuvasti vapauttavissa formulaatioissa ovat polyesterit, jotka hajoavat vähitellen hydrolyysin kautta fysiologisessa vesipitoisessa ympäristössä. EP-patentissa 58 481 esitetään erityinen farmaseuttinen 5 koostumus, joka tarjoaa polypeptidin pidennetyn vapautumisen. Tässä koostumuksessa käytetään polylaktidia ja kun se pannaan fysiologis-tyyppiseen vesipitoiseen liuokseen, koostumuksesta vapautuu polypeptidiä jatkuvasti, kunnes käytännöllisesti katsoen koko polypeptidi on vapautunut.

Keksinnön mukaisesti saatavat polypeptidit ovat mahdollisesti 10 käyttökelpoisia hoidettaessa tiloja, joissa esiintyy elastaasivälitteistä kudosproteolyysiä.

Polypeptidejä (kuten tässä on määritelty) voidaan antaa niiden tarpeessa olevalle lämminveriselle eläimelle, erityisesti ihmiselle, tulehdustilojen, keuhkoihin liittyvien tilojen, ihoon liittyvien tilojen ja limaneritykseen liittyvien 15 tilojen hoitamiseksi. Esimerkkejä tiloista, joissa polypeptideistä on mahdollista käyttöä, ovat ateroskleroosi, niveltulehdus, emfyseema, hengityksen vajaatoiminta (ARDS), kystinen fibroosi, keuhkoputken tulehdus, akuutti ei-lymfoblastinen leukemia ja psoriaasi.

Keksinnön mukaisesti saatavia polypeptidejä voidaan myös käyttää 20 tautien, kuten yllä mainittujen tautien, hoitamiseksi käytettävän lääkkeen valmistuksessa.

Keksintöä havainnollistetaan nyt lisää, pelkästään esimerkin vuoksi, seuraavien esimerkkien avulla sekä viittauksilla oheisiin piirroksiin, joista: <

'··' Kuvio 1 kuvaa psoriaattisista täplistä peräisin olevan kaavan I

• · v.: 25 mukaisen polypeptidin uutossa ja puhdistamisessa käytettyä kationinvaihto- • ♦ v.: kromatografista menetelmää,

Kuvio 2 kuvaa psoriaattisista täplistä peräisin olevan kaavan I

mukaisen polypeptidin uutossa ja puhdistamisessakäytettyä käänteisfaasi-C8- • · · kromatografista menetelmää,

30 Kuvio 3 kuvaa psoriaattisista täplistä peräisin olevan kaavan I

..... mukaisen polypeptidin uutossa ja puhdistamisessakäytettyä polysulfoetyyli- • · !!! aspartamidi-kromatografista menetelmää, ·;** Kuvio 4 kuvaa psoriaattisista täplistä peräisin olevan kaavan l mukaisen polypeptidin uutossa ja puhdistamisessa käytettyä käänteisfaasi-C18- ·:··: 35 kromatografista menetelmää, « • · ♦ » · · 0 · • · 1 > ·»· • · 9 106471

Kuvio 5 kuvaa analyyttistä geelikromatografista menetelmää, jota on käytetty kaavan I mukaisen polypeptidin molekyylipainon määrittämiseksi,

Kuvio 6 kuvaa isoelektrista fokusointimenetelmää, jota on käytetty kaavan I mukaisen polypeptidin isoelektrisen pisteen määrittämiseksi,

5 Kuvio 7 kuvaa ihmisen valkosoluelastaasin titraamista kaavan I

mukaisella polypeptidillä,

Kuvio 8 kuvaa kaavan I mukaisen polypeptidin sekvenssin ("merkittävin inhibiittori"),

Kuviot 9-12 kuvaavat merkittävimmän inhibiittorin (kaavan I 10 mukaisen polypeptidin) sekvensoimiseksi käytettyä menetelmää,

Kuvio 13 kuvaa kaavan I mukaisen polypeptidin ilmentämiseen käytettyä DNA-sekvenssiä,

Kuviot 14 ja 15 kuvaavat kaavan I mukaisen polypeptidin osittaisia cDNA-sekvenssejä, 15 Kuvio 16 kuvaa kaavan I mukaisen polypeptidin cDNA-sekvenssiä,

Kuvio 17 kuvaa plasmidia pUEX2,

Kuvio 18 kuvaa plasmidia pD258, jota käytetään menetelmässä kaavan I mukaisen valmiin polypeptidin ilmentämiseksi hiivassa, ja

Kuvio 19 kuvaa kaavan I mukaisen polypeptidin akkumuloitumista 20 hiivaan.

Ihmisen valkosoluelastaasi-inhibiittorin eristäminen

Psoriaasia tai atooppista ihotulehdusta sairastavien potilaiden ihon hilsettä kerättiin, yhdistettiin ja uutettiin 1 - 100 g:n erissä. Tavallista ihmisen kallusta sisältävä hilseaine suspendoitiin tislattuun veteen (10 200 ml), • · :.v 25 suspension pH säädettiin 2,8:aan käyttäen 1 % sitraattia ja muurahaishappoa, :V: laimennettiin 10 tilavuusprosenttisella etanolilla ja jäädytettiin (-80 °C). Sen jälkeen suoritettiin mekaaninen hajottaminen ultraturrax-laitteella (1 tunti ·***: jäähauteessa), ultraäänellä (15 minuuttia, 400 wattia), ultraturrax- laitteella (1 • · · tunti) ja sentrifugoimalla (10 minuuttia 5 000 * g:ssä). Saatu sakka uutettiin 30 uudelleen 50 % etanolissa ja 50 % sitraatti/formiaatissa (pH 3,0) ja kummankin .... uuton supernatantit yhdistettiin. Yhdistetyt uutteet konsentroitiin ultrasuodatta-

maila (Amicon YM5) ja raakauutteen saamiseksi suoritettiin diasuodatus 0,01 M

· ·;·’ ammoniumformiaattia (pH 4,0) vastaan.

• · I

« · « · « · * • » · * · • · » · · • · · • · • · I ) > I* • · 10 106471

Puhdistaminen

Yllä esitetyn eristysmenetelmän mukaisesti saatu raakauute puhdistettiin kromatografisesti (alla esitettyjen menetelmien mukaisesti), jotta saataisiin homogeeninen materiaalinäyte, jolla on inhiboivaa aktiivisuutta 5 ihmisen valkosoluelastaasia vastaan.

Aluksi raakauute puhdistettiin kationinvaihto-HPLC:llä inhiboivaa aktiivi-suutta ihmisen valkosoluelastaasia vastaan omaavan aineksen erottamiseksi sellaisesta aineksesta kuten ihmisen valkosoluelastaasista itsestään. Kuten kuviossa I on kuvattu, inhiboivaa aktiivisuutta HLE:tä vastaan 10 omaava aine eluoitiin leveänä piikkinä noin 26 ja 58 minuutin välillä. Merkittävimmän inhibiittorin sisältävät fraktiot puhdistettiin vielä C8-käänteisfaa-sipylväässä ja kromatografoitiin uudelleen kunnes havaittiin likimääräistä homogeenisuutta (kuvio 2).

Inhiboivaa aktiivisuutta HLE:tä vastaan omaavaa materiaalia 15 sisältävät fraktiot yhdistettiin ja ne kromatografoitiin Poly LC -pylväällä.

Erotuksen tuloksena saatiin ainesta, joka sisälsi merkittävimmäksi inhibiittoriksi osoittautunutta komponenttia. Tätä komponenttia puhdistettiin edelleen C18-käänteisfaasikromatografian avulla (kuvio 4). Joillekin valmisteille koon mukaan erottavalla HPLCillä ja käänteisfaasi-Poly F - HPLC.IIä suoritetut 20 lisäkromatografiavalheet olivat välttämättömiä yli 95-%:isen puhtauden saavuttamiseksi (osoitettu analyyttisillä ajoilla C18-käänteisfaasikroma-tografialla,

Poly LC:llä ja kontamlnanttien täydellisenä puuttumisena SDSPAGE:sta ja isoelektrisellä fokusoinnilla).

*···’ Kationinvaihto-HPLC

• · v.: 25 Pylväs: TSK CM 3-SW (7, 5 1 150 mm, LKB Bromma, Ruotsi) v.: Ajo: 20 minuuttia puskuria A virtausnopeudella 0, 5 - 1, 0 ml

minuutissa, 30 minuuttia lineaarista gradienttia 100 % puskuriksi B

:***: virtausnopeudella 1,0 ml minuutissa, 20 minuuttia puskuria B ja 50 minuuttia »·« puskuria C.

30 Puskuri A: 0,01 M ammoniumformiaatti, pH 4,0

Puskuri B : 0, 5 M ammoniumformiaatti, pH 4, O

» ·

ΪΛ' Puskuri C : 0, 5 M ammoniumformiaatti, pH 3, O

·;·’ Raakauute kromatoqrafoitiin yllä olevien olosuhteiden vallitessa, jokaisesta fraktiosta kerättiin automaattisesti 60 pisaraa ja W-määritys ·:**: 35 suoritettiin 280 mm: ssä. Gradientin eluoimat fraktiot, jotka sisälsivät inhiboivaa • · · • · ♦ 1 » 1 11 106471 aktiivisuutta omaavaa ainesta, yhdistettiin, konsentroitiin ja niille suoritettiin diasuodatus 0,1-%:ista TFA:ta vastaan.

Käänteisfaasi-Cg-HPLC

. Pylväs: Nucleosil 300-7 C8-HPLC-pylväs (250 1 14,7 mm, 5 Macherey-Nagel, Duren, Saksa )

Ajo: Virtausnopeus 3 ml minuutissa

20 ml 20 % puskuria B, 75 ml lineaarista gradienttia 60 % puskuriksi B, 15 ml lineaarista gradienttia 100 % puskuriksi B, 30 ml 100 96 puskuria B Puskuri A: 0,1 % TFA

10 Puskuri B: 0,1 % TFA asetonitriilissä Näytteet kromatografoitiin yllä olevissa olosuhteissa suorittamalla W-määritys 215 nm:ssä ja huippukohtaisella talteenkeräyksellä. Inhiboivaa ainesta omaavaa materiaalia sisältävät fraktiot, jotka eluoitiin puskurin B gradientissa 60 %:iin asti, yhdistettiin, lyofilisoitiin ja kromatografoitiin uudelleen 15 samalla pylväällä ja samoissa olosuhteissa.

PoIy-(2-sulfoetyyliaspartamidi)-HPLC

Pylväs: Poly LC -pylväs (200 2 4, 6 mm, Columbia, MD, USA)

Ajo: Virtausnopeus 1 ml minuutissa

10 ml puskuria A, 30 ml lineaarinen gradientti 50 % puskuriksi B, 10 ml 20 lineaarinen gradientti 100 % puskuriksi B, 10 ml puskuria B

Puskuri A: 5 mM KH2P04, pH 3,1, + 25 % asetonitriiliä Puskuri B: 5 mM KH2P04, 0,5 M KCI, pH 3,1, + 25 % asetonitriiliä Lyofilisoidut näytteet liuotettiin puskuriin A ja kromatografoitiin sen jälkeen yllä olevissa olosuhteissa määrittämällä W:lla 220 nm:ssä ja keräämällä • · 25 huippukohtaisesti talteen.

Käänteisfaasi-C,8-HPLC

Pylväs: Nucleosil 100-5 C,8 (250 1 4,6 mm, Bischoff, Leonberg, :***: Germany).

···

Ajo: Virtausnopeus 1 ml minuutissa 30 30 ml: n lineaarinen gradientti 10-40 % puskuria B, 10 ml: n lineaarinen

gradientti 100 %:iin puskuria B, 10 ml puskuria B Puskuri A: 0,1 % TFA

♦ · ♦;·1 Puskuri B: 0,1 % TFA asetonitriilissä Näytteet kromatografoitiin yllä olevien olosuhteiden vallitessa ·:>: 35 määrittämällä W: Ha 215 mm: ssä j a keräämällä huippukohtaisesti talteen.

« • -1 · • · · • · • · I I J « 2 « · n 106471

Tarvittaessa inhiboivaa aktiivisuutta omaavaa ainesta sisältävät fraktiot kromatografoitiin uudelleen samalla tavalla kunnes homogeenisuus saavutettiin. Koon mukaan erottava HPLC

Pylväs: TSK 2000 -pylväs (600 * 7,5 mm, LKB, Bromma, Ruotsi)

5 Ajo: Virtausnopeus 1 ml minuutissa 0,1 % TFA

Näytteet kromatografoitiin yllä olevissa olosuhteissa ja määrittämällä W: Ha 215 mm: ssä ja keräten 20 pisaraa kustakin fraktiosta. Molekyylipainoalue kalibroitiin käyttäen peptidejä val-gly-ser-glu, insuliini, B-ketjufragmentti 22-36, aprotiniini, kananmunan albumiini ja härän seerumin albumiini.

10 Käänteisfaasi-POLY F -HPLC

Pylväs: Poly F -pylväs (80 * 6, 2 mm, Du Pont, Dreieich, Saksa)

Ajo: Virtausnopeus 1 ml minuutissa 30 ml lineaarinen gradients 10 % puskurista B 40 % puskuriin B, 2 ml lineaarinen gradientti 100 % puskuriksi B, 10 ml puskuria B.

15 Puskuri A: 1 % NH4

Puskuri B: 1 % NH4 asetonitriilissä

Lyofilisoidut näytteet liuotettiin puskuriin A ja kromatografoitiin yllä olevissa olosuhteissa määrittämällä UV:l!a 215 mm:ssä ja keräämällä huippukohtaisesti talteen.

20 Proteiinimääritys

Proteiinikonsentraatiot määritettiin integroimalla käänteisfaasi-C18-kromatografian absorbanssi 215 mm: ssä. Kalibrointiin käytettiin seuraavia: ubikitiiniä (Sigma) ja rekombinanttia egliini C:tä (Ciba-Geigy).

SDS-PAGE

• · v.: 25 Suoritettiin natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektro- foreesi (SDS-PAGE) käyttäen Pharmacia Phast Systemiä (Pharmacia, Freiburg,

Saksa) ja homogeenisia 20 % SDS-geelejä valmistajan ohjeiden mukaan.

:***: Näytteet lyofilisoitiin j a väkevöitiin keittämällä ( 5 minuuttia ) 0,01 M H3P04:ssa, • · · 8 M ureassa, 2,5 % SDS:ssa, 0,02 % bromifenolisinisessä, pH 6,8.

30 Standardeina käytettiin myoglobuliinifragmentteja (Pharmacia) tai hevosen ..... myoglobiinia (Serva) ja ubikitiiniä (Sigma). Hopeavärjäykset suoritettiin • * IV,' valmistajan ohjeiden mukaan (Sigma).

\··* Isoelektrinen fokusointi

Isoelektrinen fokusointi suoritettiin käyttäen Servalyt Precoates pH 3 -·:··: 35 10 ja Test-Mix 9 (Serva). Esifokusointi kesti 30 minuuttia 3 watin teholla ja hopeaväriä (Sigma) tai Coomassie blue R -väriainetta käytettiin Servan ohjeiden ♦ · • « « « 13 " 106471 mukaan. Esipäällysteet paloiteltiin ja eluoitiin rinnan inhiboivaa aktiivisuutta omaavien peptidien paikallistamiseksi. Noin 1 mm palaset eluoitiin 100 jal:lla asetonitriiliä. Eluaattien annettiin kuivua ja sen jälkeen ne liuotettiin 100 μΐιβθη puskuria (0,1 M HEPES, 0,5 M NaCI, 1 % BSA, pH 7,5), jossa oli 20 ng HLE:tä.

5 30 minuutin inkuboinnin jälkeen määritettiin HLE:n jäännösaktiivisuus .

Biologiset ominaisuudet

Merkittävimmän inhibiittorin inhiboiva vaikutus eräisiin proteaaseihin määritettiin alla esitettyjen menetelmien mukaisesti. Tulokset on esitetty taulukossa 1.

10

Taulukko 1

PROTEAASI DISSOSIAATIOVAKIO SUBSTRAATTI

(K() 15 _ ihmisen valkosolu-

elastaasi 3 1 1010 M 2 mM AAPVpNA

sian haiman elastaasi 1 1 10'9 M 0,1 mM AAPV-AFC

ihmisen katepsiini G e.i. 0,5 mM AAPFpNA

20 a-kymotrypsiini e.i. 0,5 mM AAPFpNA

trypsiini e.i. 0,1 mM TGPLpNA

plasmiini e.i. 0,1 mM TGPLpNA

(e.i: ei inhibointia) •V: 25

Ihmisen valkosoluelastaasin inhibointi • ·

Ihmisen valkosoluelastaasin (EC 3.4.21.37) aktiivisuus määritettiin • · .1·1. Nakajiman et ai. (7) menetelmän mukaisesti. HLE:n inhibointi määritettiin .·;·. käyttäen synteettistä peptidiä metoksi-sukkinyyli-alanyyli-alanyyli-prolyyli- 30 valyyli-p-n|troanilidia (AAPVpNA, Sigma).

... Näytettä (100 μΙ) ja 100 μΙ HLE:tä (200 ng/ml, Elastin Products • · *·“’ Corporation, Pacific, MO, USA) inkuboitiin huoneen lämpötilassa 30 minuutin ·;·1 ajan analyysipuskurissa (0,1 M HEPES, 0,5 M NaCI, 10 % DMSO, pH 7,5). Sen .

jälkeen siihen lisättiin analyysipuskurissa oleva substraatti (800 μΙ, 0,5 mM).

• t 1 35 Absorbanssimuutokset 405 nm:ssä seurattiin aina 1 tuntiin asti ja .,·. %-inhibointi laskettiin jäännösaktiivisuudesta ja kontrolleista. Dissosiaatiovakio * · · • · • · « 14 106471 (Ki) määritettiin Greenin ja Workin menetelmän mukaisesti samalla tavalla käyttäen 2 mM substraattia ja (1 pg/ml) HLE:tä (loppukonsentraatiot).

Sian haiman elastaasin inhibointi

Sian haiman elastaasin (E.C. 3.4.21.36) aktiivisuus määritettiin 5 käyttäen fluorogeenistä substraattia metoksisukkinyyli-alanyyli-alanyyli-prolyyli-valyyli-trifluorimetyylikumariinia (AAPV-AFC, Bachem, Bubendorf, Sveitsi).

Elastaasia (100 μΙ) ja inhibiittoria (100 μΙ) esiinkuboitiin 30 minuutin ajan. Sen jälkeen lisättiin substraattiliuos (1,8 ml 0,01 mM liuosta). Fluoresenssia, Ex 400 Em 505, seurattiin ja %-inhibointi laskettiin näytteiden ja 10 kontrollien alkuperäisestä aktiivisuudesta. Dissosiaatiovakio (KJ määritettiin Greenin ja Workin menetelmän mukaisesti (8).

Katepsiini G:n ia α-kymotrypsiinin inhibointi

Katepsiini G:n ja α-kymotrypsiinin aktiivisuus määritettiin Nakajiman et ai. (9) menetelmän mukaisesti käyttäen HLE - sukkinyyli-alanyyli-alanyyli-15 prolyyli-fenyylialanyyli-p-nitroanilidin (AAPFpNA, Sigma) analogia, lnhi-bointikokeissa inhibiittorin korkein konsentraatio oli 1 μΙ/ml, joka on kolminkertainen konsentraatio verrattuna katepsiini G:hen ja a-kymotrypsiiniin.

Trypsiinin ja plasmiinin inhibointi 10 μΙ inhibiittoria (1 μ9/ηιΙ) ja 100 μΙ trypsiiniä (1 pg/ml) tai plasmiinia 20 (1 pg/ml), tarkoituksenmukaisella tavalla, inkuboitiin 30 minuutin ajan ennen kuin lisättiin substraatti, 0,1 mM tosyyli-glysyyli-prolyyli-lysiini-pNA (Boehringer Mannheim, FRG) 0,05 M HEPES:ssä, 0,12 M NaCI:ssa, pH 7,5.

Proteinaasi 3:n inhibointi 4 · ·

Proteinaasi 3 puhdistettiin ihmisen monilohkotumaisista valkosoluista ’.V 25 käyttäen Ludemannin menetelmää, J. Exp. Med. 171, 357 - 362, 1990.

iV: Nakajiman (7) menetelmän mukaan proteinaasi 3 -valmisteen aktiivisuuden ·,*·.· puute substraateissa metoksi-sukkinyyli-ala-ala-pro-val-p-nitroanilidi (AAPVpNA) • · .*··. ja vastaavasti sukkinyyli-ala-ala-phe-pnitroanilidi varmisti ihmisen valkosolu- .··*. elastaasin ja katepsiini G:n puuttumisen.

• · · 30 Elastinolyyttinen aktiivisuus määritettiin härän niskasiteen elastiini- ... FITC:n (Elastin Products Corporation, USA) hydrolyysillä.

• · *··;* Proteinaasi 3 -valmistetta (1 μΙ) esi-inkuboitiin 37 °C:ssa 30 minuutin *.··: ajan kaavan I mukaisen elastaasiinhibiittorin (0-1 μΙ) kanssa

karbonaattipuskurissa (50 μΙ, 0,1 M), jossa NaN3 (0,02 %), Brij 35 (0,01 %), pH

4 » » 35 8,5. Elastiini-FITC (1 mg) karbonaattipuskurissa (100 μΙ, 0,1 M), jossa NaN3 (0,02 %), Brij 35 (0,01 %), pH 8,5. Seosta inkuboitiin 37 °C:ssa varovasti ♦ · · • · • · 1 1»·» « · 15 106471 sekoittaen 4 tunnin ajan ja sentrifugoitiin sen jälkeen 6 000 * g.ssä. Supernatantit laimennettiin suhteessa 1:20 ja liuenneen elastiini-FITC:n fluoresenssi määritettiin käyttäen Perkin Elmer LS 50 mikrotiitterilevylukijaa, Ex 489 nm, Em 513 nm. Fluoresenssi korjattiin entsyymittömien kontrollien avulla ja 5 inhibointi ilmaistiin prosentteina niistä kontrolleista, joissa ei ollut inhibiittoria.

Kaavan I mukaisen polypeptidin havaittiin olevan tehokas proteinaasi 3:n inhibiittori, sen aktiivisuus vastasi 9,5 * 10'9 M:sta IC50:tä.

Karakterisointi

Merkittävimmän inhibiittorin analyyttinen koon perusteella erottava 10 kromatografia (Tsk 2000) antoi näennäisen 5 10 kD:n molekyylimassan (kuvio 4). Inhibiittorin molekyylimassa SDS-PAGE:n mukaan oli noin 9 kD, siirtyen näin ubikitiinin (mp 8 500) läheisyyteen kuten kuviossa 5 esitetään.

Inhibiittorin isoelektrisen pisteen havaittiin olevan pH:ssa 9,7, mikä on osoitettu hopeavärjäyksellä ja inhibiittorin rinnakkaisella entsymaattiselia 15 havaitsemisella geelilevyissä (kuvio 6).

Merkittävimmän inhibiittorin havaittiin inhiboivan seriinin elastaasin HLE:tä ja sian haiman elastaasia. Kuitenkaan α-kymotrypsiini eikä trypsiini ja plasmiini inhiboituneet merkittävästi inhibiittorin vähintään kolminkertaisen ylimäärän vaikutuksesta. HLE:n inhiboinnin tasapainodissosiaatiovakio (K() 20 määritettiin Greenin ja Workin menetelmän (8) mukaisesti, kuten kuviossa 7 esitetään.

Inhibiittorin havaittiin olevan myös haponkestävä.

, ": HLE-inhibiittorin rakenteen määrittäminen «tl : *:': Suora sekvensointi « « 25 Noin 5 μ9:ΙΙβ puhdistettua merkittävintä inhibiittoria suoritettiin sekvenssianalyysi käyttäen Applied Biosystems Model 470A Gas Phase • · · 1··\ Sequencer -laitetta ja sen kanssa Model 120A:ta fenyylitiohydantoiinien linja-analyysissä. Tämä antoi kuviossa 8 esitetyn mukaisen kolmenkymmenen • · · tähteen sekvenssin mutta kysteiinien kanssa, päätellen tunnistettujen tähteiden 30 puuttumisesta. Aminohappotähteiden ensimmäinen saanto oli yhteen sopiva • · · molekyylikooltaan 6-8 kilodaltonin yksiketjuisen polypeptidin kanssa.

• * · *,..· Karboksamidometylaatio (CAM)

Puhdistettu merkittävin inhibiittori (10 μ9) liuotettiin veteen (50 μ!) ja • · /t": sekoitettiin 6 M guanidiinivetykloridin ja 0,1 M trisvetykloridin, pH 8,5, puskurin 35 kanssa. Putki typetettiin ja siihen pantiin ditiotreitolliuosta (5 μΙ 50 mg/ml:n •» · : V liuosta guanidiinipuskurissa). Putki typetettiin jälleen ja suljettiin ja sitä pidettiin • ·»« · » · 16 106471 37 °C:ssa 4 tunnin ajan. Lisättiin jodiasetamidia (5 mg) guanidiinipuskurissa (50 μΙ) ja typettämisen jälkeen putkea pidetiin pimeässä ympäristön lämpötilassa 1 tunnin ajan. Näyte laimennettiin 1 ml:ksi 0,1-%:isella trifluorietikkahappo-liuoksella ja se pantiin heti Vydac C18 -pylvääseen (25 * 0,46 cm). Pylvästä 5 kehitettiin 1 ml/min lineaarisella gradientilla 0,1 % trifluorietikkahaposta vedessä 0,1-%:iseen trifluorietikkahappoon asetonitriilissä 70 minuutin aikana. Näin saatiin kaksi piikkiä (kuvio 9), pienempi komponentti fraktioissa 33 - 34 ja suurempi (n. 67 %) fraktioissa 35 - 36. Kukin komponentti altistettiin vielä erikseen karboksamidometylaatio-olosuhteisiin, mutta lisäkromatografia osoitti 10 niiden olevan muuttumattomia ja osoitti näin ollen, että alkuperäinen reaktio oli mennyt loppuun.

Aminohappoanalyysi

Puolta karboksamidometylaation pienemmästä komponentista hydrolysoitiin 6 N vetykloridihapolla, jossa oli 1 % fenolia, tyhjiössä 110 °C:ssa 15 16 tunnin ajan. Hydrolysaatti analysoitiin käyttäen LKB Alpha plus -aminohappo- analysaattoria, joka antoi taulukossa 2 esitetyt suhteet. Taustakorjausta ei käytetty, vaikka analysoitu näyte oli hyvin pieni.

Taulukko 2 20 57 AA -peptidiin Sekvensoidusta pepti-

Aminohaopo perustuva suhde dista havaitut AA:t

Asp/Asn/Cys 8,8 4 + 8 cys

Thr 2,1 2

• I

25 Ser 4,5 3 * * *

Glu/GIn 5,5 4 • · · .···*. Pro 7,0 8

Giy 7,4 5 • · ·

Ala 3,0 3 30 Vai 3,0 3 • · ·

Met 1,6 2

Ile 2,8 4 .*··. Leu 3,4 3

Phe 1,1 1 • ♦ . 35 Lys 4,5 5

Arg 2,3 2 • ♦ »»♦ • · 17 106471

Hajottaminen kymotrypsiinillä C,: Otettiin CAM-johdannaisen toinen puoli fraktioista 33 - 34 0,1 M ammoniumbikarbonaattiin (50 μΙ) ja 0,2 M kalsiumkloridiin (1 μΙ) ja käsiteltiin kymotrypsiinillä (Worthington, 10 μΙ 20 μΙ/ml liuosta). Liuosta pidettiin 37 °C:ssa 5 1 tunnin ajan ja laimennettiin sen jälkeen 0,1-%:isen trifluorietikkahapon vesiliuoksella (200 μΙ) ja pakattiin suoraan Vydac C18 -pylvääseen. Lineaarinen gradientti 0,1-%:iseksi trifluorietikkahapoksi asetonitriilissä ajettiin 60 minuutissa nopeudella 1 ml/min. Näin saatiin kolme suurta piikkiä kuten kuviosta 10 ilmenee. Näistä jokainen sekvensoitiin niin pitkälle kuin mahdollista ja tulokset ovat 10 alla.

C2: Puolet fraktioiden 35 - 36 CAM-tuotteesta hajotettiin kymotrypsiinillä samoissa olosuhteissa. HPLC-profiili (kuvio 11) osoitti, että oli tapahtunut laajempaa hajoamista, vaikka piikit 1 ja 3 (kuvio 10) vaikuttavat esiintyvän samassa määrin kuin toisen hajotuksen piikit 1 ja 8. Toinen piikki, 15 kuvion 10 piikki 2, oli suhteellisesti paljon pienempi toisessa hajotuksessa eikä selvästi samassa paikassa kuin toiset kaksi olivat. Sekvensoitiin C2:n lisäpiikit, so. piikit 3, 4, 6, 7 ja 9. Ne ovat (kuvio 8) erillään piikistä 7, jolla osoittautuu olevan sama sekvenssi kuin piikillä 6 niin pitkälle kuin se otettiin.

Hajottaminen trypsiinillä 20 T: Suuremman CAM-johdannaisen, fraktioiden 35 - 36, loppuosa pantiin 0,1 M ammoniumbikarbonaattiin (50 μΙ) ja 0,2 M kalsiumkloridiin (1 μΙ) ja käsiteltiin trypsiinillä (200 ng 10 μΐιεεθ 0,1 M ammoniumbikarbonaattia). Liuosta . ‘ “: pidettiin 37 °C:ssa 30 minuutin ajan, laimennettiin 0,1-%:isen trifluorietikkahapon vesiliuoksella ja pakattiin välittömästi C18-pylvääseen, joka kehitettiin kuten ;y« 25 toinenkin entsyymihajotus (kuvio 5). Tämä osoitti kaksi määriteltävissä olevaa tuotepiikkiä sekä sen, ettei lähtöainetta ollut yhtään jäljellä. Merkitykselliset • · · '..S sekvenssitiedot on esitetty (kuvio 1).

Suoritettiin yksi aminohappoanalyysi, joka antoi ennemmin • · · likimääräistä kuin tarkkaa indikaatiota aminosisällöstä, joka auttoi pienempiin 30 fragmentteihin hajottavien entsyymien valinnassa.

• · ·

Suoralla sekvensoinnilla saatiin 30 ensimmäistä tähdettä ja tämä *...: varmistettiin käyttäen suurta tryptistä fragmenttia T10. Trypsiiniolosuhteet .···. sallivat päätuotteissa suuret fragmentit, so. kaikki lysiinisidokset eivät kat- ///.: kenneet, ja koko rakenteen käsittävät fragmentit esitetään kuviossa 8.

. 35 Katkeamiskohdat rajoittuivat emästähteisiin.

• * * « · 18 106471

Kymotrypsiini ei päinvastoin katkaissut yhden aromaattisen tähteen jälkeen mutta katkaisi kahden metioniinin jälkeen sekä myös leusiini -33:n jälkeen. Lisäksi katkeaminen tapahtui leusiini -20:n jälkeen.

C-terminaalinen glutamiini osoitettiin hyvin pienen mutta havaittavan 5 tähteen perusteella, joka löydettiin voimakkaita proliinipiikkejä seuraavista T9- ja C2-3-peptideistä. Tämä voidaan kuitenkin aavistaa tällaisesta C-terminaalisesta tähteestä. Useat muut kymotryptiset peptidit, joita ei ole sisällytetty kuvioon 8, antoivat lisävarmistusta rakenteen osalta.

Pienemmän CAM-johdannaisen kymotryptinen hajottaminen 10 sekvensoitiin niin pitkälle kuin mahdollista, jolloin saatiin seuraavat tiedot: C,.., (cf CjY Ile-Arg-Cys-Ala-Met C,.3 (cfC2.8) Ala-GIn-Glu-Pro-Val-Lys-Gly-Pro-Val-Gly/ Ser-Xaa-Lys-Pro-Gly-

Ci ,2 Leu-Asn-Pro-Pro-Asn-Arg-Cys-Leu-Lys-Asp- 15 Thr-Asp-Cys-Pro-Gly-lle-Lys-Lys-Cys-Gly/

Glu-Gly-Ser-Cys-

Saatavilla olevien tietojen perusteella suuremman ja pienemmän CAM-johdannaisen välisiä eroja ei voitu havaita. Se ei johtunut N-pään pidennyksestä tai deleetiosta siinä.

20 Osoitettu rakenne (kuvio 8) on pienen pääasiassa emäksisen polypeptidin rakenne. Tällaiseksi molekyyliksi se sisältää poikkeuksellisen paljon proliinia, myös glysiini ja kysteiini indikoivat tiivistä häkkimäistä molekyyliä.

57 tähdettä käsittävän merkittävimmän inhibiittoripeptidin lisäksi Y; eristettiin vielä lisäksi ainetta, jolla on inhiboivaa aktiivisuutta ihmisen ;v. 25 valkosoluelastaasia vastaan ja sen polypeptidit sekvensoitiin osittain. Saatiin seuraavat tulokset: • ·*

I./ Piikki II - Suurempi komponentti E

- Pienempi komponentti D

• I ·

’·* * Piikki III - Suurempi komponentti D

30 - Pienempi komponentti E

• · ·

Piikki IV - Suurempi komponentti B

• · ·

*,,, · - Pienempi komponentti C

.···. Piikki V - Suurempi komponentti A

Pienempi komponentti alkaa samasta paikasta kuin pääelas- • · . 35 taasi-inhibiittori.

• · · • · · • · « « I» « » f · • · 19 106471 A-komponentti:

Asn-Gly-GIn-Asp-Pro-Val-Lys-Gly-GIn-Val-Ser-Val-Lys-Gly-GIn-Asp-

Lys-Val-Lys-Ala-GIn-Glu-Pro-Val-Lys-GlyPro.

B-komponentti: 5 Gly/Ala-GInA/al-Asp-Lys-Val-Lys-Ala-GIn-Glu-Pro-Val-Lys-Gly-Pro-

Val-Ser-Thr-Lys-Pro-Gly-Ser-Cys-Pro-llelle-Leu.

C-komponentti:

Asp-Lys-Val-Lys-Ala-GIn-Glu-Pro-Val-Lys-Gly-Pro-Val-Ser-Thr-Lys-

Pro-Gly-Ser-Cys.

10 D-komponentti:

GlyA/al-Lys-Ala-GIn-Glu-Pro-Val-Lys-Gly-Pro-Val-Ser-Thr-Lys-Pro-

Gly-Ser-Cys-Pro-lle-lle-Leu-lle-Arg-Cys-Ala-Met-Leu-Asn-Pro-Pro-Asn-Arg-Cys-

Leu-Lys-Asp-Thr.

E-komponentti: 15 Lys-Gly-Pro-Val-Ser-Thr-Lys-Pro-Gly-Ser-Cys-Pro-lle-lle-Leu-lle-

Arg-Cys-Ala-Met-Leu-Asn-Pro-Pro-Asn.

Yllä olevien N-pään sekvenssien A-, B- ja Ckomponenttien sekvenssit 1 - 19, 1 - 6 ja 1 - 4, vastaavasti, määritettiin pienemmällä varmuudella kuin sekvenssin muu osa.

20 Eristetyillä lisäkomponenteilla havaittiin olevan samanlaisia ominaisuuksia kuin merkittävimmällä inhibiittorilla, esimerkiksi samanlaisia biologisia ominaisuuksia.

': Inhiboivaa aktiivisuutta ihmisen valkosoluelastaasia vastaan . v. omaavan materiaalin havaittiin näin ollen käsittävän merkittävimmän inhibiittorin, ,v; 25 joka käsittää haponkestävän polypeptidin, jonka uskotaan sitovan ihmisen • valkosoluelastaasia moolisuhteessa 1:1. Tämän inhibiittorin uskotaan olevan • · · • · · sitoutuneena häkkimäiseksi rakenteeksi, jossa muutamat disulfidisidokset "f pitävät peptidiä tässä muodossa. Hyvä affiniteetti ja spesifisyys elastaaseihin ja • # · erityisesti HLE:hen tekevät inhibiittorin käyttökelpoiseksi hoidettaessa tiloja, 30 joissa elastaasivälitteinen proteolyysi on osallisena, esimerkiksi psoriaasia ja « · · emfyseemaa. Myös muita peptidejä eristettiin, jotka indikoivat poly- peptidiperhettä, jolla on samanlaisia ominaisuuksia merkittävimmän inhibiittorin .···. kanssa, ja sukulaispeptidien osittainen sekvensointi osoitti tosiaankin, että niillä • · *’]. oli ainakin osa merkittävimmän inhibiittorin aminohapposekvenssistä.

35 Proteinaasi 3 on kolmas elastiinia hajottava seriiniproteaasi ihmisen « · • V valkosoluelastaasin ja sian haiman elastaasin rinnalla, jota merkittävin inhibiittori • * · > · • « 20 106471 (kaavan I mukainen polypeptidi) inhiboi tehokkaasti. Koska tämä inhibiittori vaikuttaa olevan ihmisen valkosoluelastaasivälitteisen ihon ja mahdollisesti muiden elinten kudosproteolyysin fysiologinen säätelijä, vaikuttaa kiintoisalta, että tämä inhibiittori inhiboi proteinaasi 3:a. Molemmat ihmisen 5 valkosolueastaasientsyymit ovat neutrofiilien atsurofiilisten jyvästen aineosia ja molemmat kykenevät indusoimaan emfyseemankaltaista kudostuhoa hamstereissa entsyymin tiputuksen ilmateihin jälkeen (Kao, R.C., Wehner, N.G., Skubitz, K.M., Gray, B.H., Huidal, J.R., Proteinase 3 A Distinct Human Polymorphonuclear Leucocyte Proteinase that produces Emphysema in 10 Hamsters, J. Clin. Invest. 82,1963 - 1973,1988). Koska inhibiittori kykenee inhiboimaan kumpaakin entsyymiä sen jälkeen kun se on esiadsorboitunut entsyymiin, tällä inhibiittorilla on mahdollisesti terapeuttista arvoa keuhkotaudeissa, joihin liittyy elastaasi- ja proteinaasi 3 -välitteistä kudostuhoa.

Ihmisen valkosoluelastaasi-inhibiittorin synteesi 15 Kaavan I mukainen polypeptidi ("merkittävin inhibiittori") syntetisoitiin seuraavassa esitetyllä tavalla:

Suunniteltiin kaavan I mukaisen polypeptidin aminohapposekvenssiä koodaava DNA-sekvenssi seuraavien näkökohtien mukaisesti: 1) Yksisäikeinen kohesiivinen pää, joka sallii liittymisen sopivista 20 kohdista plasmidiin.

2) Restriktioendonukleaasijakso 5'-päässä seuraavan geneettisen manipulaation helpottamiseksi.

.''': 3) Translaation lopetuskodonit.

4) Koodausalueen 5-pään kodonit valittiin tavallisesti siten, että

I I

25 niissä oli paljon A/T:tä. Muut kodonit valittiin tavallisesti niiden joukosta, jotka olivat edullisia hiivassa ja/tai E. colissa ilmentymisen kannalta.

• · ·

Geeni koottiin taulukossa 6 esitetyistä 6 oligonukleotidistä.

« · • · · • ·· • · · • · · • · · • · • · ··· ··· • · « · · • · • · * • · · • · • · • « 21 106471

Taulukko 3

Koko Sekvenssi (5 -> 3) Koko (emästen)

ELI1 AAT TCG AGC TCG GTA CCA TAC CTG

5 CAT ATG CTC AAG AAC CAG TTA AAG

GTC CTG TGT CTA CTA A 64

ELI2 CCT GGC TTA GTA GAC ACA GGA CCT

TTA ACT GGT TCT TGA GCA TAT GCA 10 GGT ATG GTA CCG AGC TCG 66

ELI3 GCC AGG TTC TTG TCC TAT TAT CTT

GAT TCG TTG CGC TAT GTT AAA COC

ACC TAA CCG TTG TTT GAA GG 68 15

ELI4 TCA GTG TCC TTC AAA CAA CGG TTA

GGT GGG TTT AAC ATA GCG CAA CGA

ATC AAG ATA ATA GGA CAA GAA 69

20 ELI5 ACA CTG ATT GTC CAG GTA TCA AAA

AGT GCT GTG AAG GTT CCT GCG GTA

TGG CTT GTT TCG TTC CAC AAT AAT

• < · AG 74 • · • * · « · · « ·

:Y: 25 ELI6 GAT CCT ATT ATT GTG GAA CGA AAC

• ·

AAG CCA TAC CGC AGG AAC CTT CAC

• * AGC ACT TTT TGA TAC CTG GAC AA 71 • · · • · · • · ·

Oligonukleotidien valmistus 30 Taulukossa 3 esitetyn mukaiset oligonukleotidit valmistettiin Applied • · ·

Biosystems 380A DNA -syntetisaattorilla 5'-dimetoksitrityyli-emässuojatusta • · · nukleosidi-2syaanietyyli-N,N-di-isopropyylifosforiamidiitista ja suojatuista nukleo- .··. sideistä, jotka ovat liittyneitä kontrolloidun huokoskoon omaaviin lasikantajiin 0,2 mikromoolin mittakaavassa Applied Biosystems lnc.:n toimittamien ohjekirjojen . 35 mukaisesti.

• · · • · · • · • · «IMI • · 22 106471

Kiinteältä kantajalta lohkaisun ja kaikkien suojaryhmien poistamisen jälkeen kukin oligonukleotidi liuotettiin veteen (1 ml). Oligonukleotidiliuoksiin (400 μΙ) lisättiin 3 M natriumasetaattiliuosta (pH 5,6, 40 μΙ) ja etanolia (1 ml) ja seoksia pidettiin -70 °C:ssa 20 tunnin ajan. Näin saadut saostumat kerättiin talteen 5 sentrifugoimalla (13 000 kierr./min 10 minuutin ajan) ja pelletit pestiin etanoli:vesiseoksella (7:3) (200 μΙ) ja kuivattiin sen jälkeen pikaisesti in vacuo ia liuotettiin veteen (15 μΙ) ja 10 pilaan formamidi/väriaineseosta (10 mM NaOH:a, 0,5 mM EDTA:a, 0,01 % bromifenolisinistä, 0,01 % ksyleenisyanolia, 80 % formamidia).

10 Oligonukleotidit puhdistettiin 10 % polyakryyliamidigeelillä 50 mM

Tris-boraatissa (pH 8,3), joka sisälsi 8,3 M ureaa. Oikean pituiset oligonukleotidit tunnistettiin W-varjostuksella (Narang et ai., Methods in Enzymology Voi 68, 90 -98 1979) - tavallisesti kaikkein huomattavin vyöhyke - poistettiin geelistä ja elektroeluoitiin 5 mM Tris-boraatissa (pH 8,3) 300 mV:n jännitteellä 3 - 4 tunnin 15 ajan. Vesiliuos konsentroitiin noin 200 piiksi n-butanolikäsittetyllä (sekoitus, pyöritys ja ylemmän orgaanisen kerroksen poisto). Puhdistettu oligonukleotidi saostettiin -70 °C:sta 20 tunnissa 0,3 M natriumasetaattiliuoksesta lisäämällä etanolia (2,5 * tilavuus).

Geenin kokoonpano 20 Oligonukleotidit ELI2 - ELI5 (kukin 200 pM) fosforyloitiin T4-polynukleotidikinaasilla (3,6 yksikköä) 2 tunnin ajan 37 °C:ssa 25 piissä liuosta, joka sisälsi ATP:tä (800 pM, jossa 25 pM gamma-32P-ATP:tä), 100 μΜ spermidiiniä, 20 mM DDT:tä, 10 mM MgCI2:a, 50 mM TrisHCIia (pH 9,0) ja 0,1 mM EDTA:a. Liuoksia kuumennettiin 100 °C:ssa 5 minuutin ajan reaktioiden • · 25 saattamiseksi loppuun, sen jälkeen ne sekoitettiin pareittain kuten taulukossa 2 on esitetty, jotta saatiin kaksoissäikeet I - lii. (Oligonukleotidejä ELI1 ja ELI6 • »k

l..\ (200 mM 25 piissä) käytettiin fosforyloimattomina.) Lisättiin 0,3 M

**.*.*.* natriumasetaattia (pH 5,6, 200 ,ul) ja etanolia (850 μ1) ja kaksoissäikeet • ♦ · saostuivat -20 °C:ssa 20 tunnissa. Näin saadut saostumat kerättiin talteen 30 sentrifugoimalla ja pestiin etanoliivesiseoksella (7:3) ja sen jälkeen ne liuotettiin • · · veteen (50 μΙ). Oligonukleotidiparit saatiin yhteen lämpökäsittelyn avulla, ensin *,*.♦ liuoksia kuumennettiin 100 °C:seen 2 minuuttia kiehuvassa vesihauteessa. Sen .···, jälkeen hauteen annettiin jäähtyä hitaasti (noin 4 tuntia) 40 °C:seen.

Kaksoissäikeitä sisältävät seokset I ja II yhdistettiin, lyofilisoitiin ja liuotettiin 30 ♦ ·

. 35 pilaan liuosta, joka sisälsi T4 DNA -ligaasia (1 yksikkö, BRL), 50 mM Trisiä (pH

: V 7,6), 10 mM magnesiumkloridia, 5 % (w/v) PEG 8000:a, 1 mm ATPitä, 1 mm « • « ..-vj 23 106471 DTT:tä (BRL, Focus Vol 8 nro 1, Winter 1986) ja DNA:ta sidottiin 30 °C:ssa 5 minuuttia ja sen jälkeen 20 tuntia 16 °C:ssa. Lisättiin 3 M natriumasetaattia (20 μΙ) ia vettä (150 μΙ) ja tuote saostettiin lisäämällä etanolia (750 μΙ) ja jäähdyttämällä -20 °C:seen 20 tunnin ajaksi. Saostuma kerättiin talteen 5 sentrifugoimalla ja pestiin etanolilla (1 ml) ja liuotettiin sen jälkeen veteen (15 μΙ) ja formamidi/väriaineseokseen (10 μΙ) ja puhdistettiin 10 % polyakryyli-amidigeelillä 50 mM Tris-boraatissa (pH 8,3), 1 mM EDTA:ssa ja 8,3 M ureassa. 132 emäksen ja 135 emäksen pituisten säikeiden vyöhykkeet tunnistettiin autoradiografian avulla ja eristettiin yhdessä elektroeluusiolla yhdestä 10 geelipalasesta kuten yllä on kuvattu yksittäisten oligonukleotidisekvenssien kyseessä ollessa. DNA-säikeitä lämpökäsiteltiin kuumentamalla ensin vesiliuoksessa (50 μΙ) 100 °C:ssa 2 minuutin ajan ja antamalla niiden jäähtyä 40 °C:seen 4 tunnin aikana.

Kaksoissäie III yhdistettiin yllä esitetyn ligaatiotuotteen (I ja II) kanssa 15 pääasiassa samoin kuin mainittu tuotekin valmistettiin, paitsi että seos kuumennettiin 40 °C:seen ennen kohesiivisten päiden yhteen liittämistä. Tuote eli kuviossa 13 esitetty geenisekvenssi puhdistettiin 8-%:isella polyakryyliamidigeelillä ja eristettiin elektroeluutiolla geelipalasesta kuten yllä on esitetty. Saostamisen jälkeen geeni fosforyloitiin T4 polynukleotidikinaasilla 20 kuten yllä on esitetty yksittäisten oligonukleotidien kyseessä ollessa, jonka jälkeen ne liuotettiin veteen (20 μΙ).

Taulukko 4 • · · « · « 4 4 « · « • · 25 Emäksen lukum. säikeissä • · ·

Kaksois- Oligonukleotidit Ylempi säie Alempi säie • ·· I./ säie i elm + eli2 64 66 ** Il ELI3 + ELI4 68 69 30 111 ELI5 + ELI6 74 71 • · · - · · t · • · · ***,: Ihmisen elastaasi-inhibiittorin synteettisen geenin .···, kloonaus • · '**. Yllä esitetyn mukainen synteettinen geeni kloonattiin 35 plasmidivektoriin pUC18 (exBRL 520-5363SA), joka sisältää multikloonaavan • > · : V sekvenssin.

* · »> · « » 24 106471

Vektorin valmistamiseksi 10 μΙ pUC18:aa liuotettiin veteen (42 μΙ) ja 10 * B restriktiopuskuriin (BCL). Restriktioendonukleaasi BamHI (3 μΐ) (BCL, 8/yksikköä/pl) lisättiin ja seosta inkuboitiin 37 °C:ssa 1 tunnin ajan kunnes linearisoitu plasmidi oli vallitsevana kaksoiskierteisiin ja aukon sisältäviin 5 rengasmuotoihin verrattuna. DNA saostettiin etanolin avulla 4 °C:ssa 30 minuutin aikana, pestiin etanoli:vesiseoksella (7:3) ja liuotettiin sen jälkeen veteen (44 μΙ) ja 10 * suolapitoiseen puskuriin (BCL). Restriktioendonukleaasi EcoRI (1 μΙ) (BCL, 90 yksikköä/ml) lisättiin ja seosta inkuboitiin 37 °C:ssa 1 tunnin ajan kunnes suuri EcoRI - BamHI -fragmentti oli vallitsevana. DNA 10 saostettiin -20 °C:ssa 20 tunnin aikana, pestiin etanoli:vesiseoksella (7:3) ja liuotettiin sen jälkeen veteen (20 μΙ).

Suuri EcoRI-BamHI -fragmentti puhdistettiin preparatiivisessa 1-%:isessa agaroosigeelissä ja elektroeluoitiin ja saostettiin edellä esitetyn mukaisesti ja liuotettiin sen jälkeen veteen (20 μΙ). Synteettisen geenin 15 sitomiseksi vektori-DNA-seosta (2 μΙ EcoRI-BamHI -fragmenttiliuosta), synteettistä geeniä (5 μΙ edellä esitettyä vesiliuosta), 5 * ligaasipuskuria (6 μΙ -250 mM Tris, pH 7,6, 50 mM MgCI2, 25 % w/v PEG 8000, 5 mM ATP, 5mM DTT exBRL), vettä (15 μΙ) ja T4 DNA-ligaasia (2 μΙ, 1 yksikkö/1 μΙ) inkuboitiin 16 °C:ssa 4 tunnin ajan. DNA-seos käytettiin välittömästi (joko 1 μΙ 20 laimentamatonta ligaatioseosta tai 2 μΙ ligaatioseosta, joka on laimennettu 5 * veteen) E. coli -kannan HB101 transformoimiseksi. DNA-seos (1 tai 2 μΙ) lisättiin jäissä oleviin kompetentteihin E. coli HB101 -soluihin (20 μΙ, BRL) ja seosta inkuboitiin jäähauteessa 45 minuutin ajan ja sen jälkeen seokselle •«« /.·. annettiin 45 sekuntia kestävä 42 °C:n lämpöshokki. 2 minuutin jäähauteessa 25 olemisen jälkeen seokseen lisättiin 100 μΙ SOC-puskuria (Bactotryptone 2 %, hiivauute 0,5 %, NaCI 10 mM, KCI 2,5 mM, MgCI2, MgS04 20 mM (10 mM kumpaakin), glukoosia 20 mM) ja seosta inkuboitiin 37 °C:ssa 1 tunnin ajan.

• ·

Pienet määrät suspensioita pantiin L-Ievyille, joilla oli 50 μΙ/ml ampisilliinia.

• · · *·’ * Transformantit seulottiin kloonatun synteettisen geenin havaitsemiseksi 30 pesäkehybridisaatioanalyysillä käyttäen standardimenetelmiä, jotka on esitetty ··· teoksessa Maniatis et ai.. Molecular Cloning; A Laboratory Manual (Cold **’*: Spring Harbor) sekä GB-patenttihakemuksessa 8,502,605. 160 pesäkettä .·*·. siveltiin suodattimille (Schleicher & Schuell), kasvatettiin 37 °C:ssa 20 tunnin « · *’*. ajan, liuotettiin ja kuivattiin. Suodatinta hybridisoitiin 65 °C:ssa 20 tunnin ajan 35 radioaktiivisen koettimen kanssa, joka oli valmistettu oligonukleotidisek- I V venssistä ELI 3 (taulukko 1) käyttäen "random-label kit"iä (Pharmacia). Kuutta ♦ ► » » · • * λιϊ «m 106471 25 positiivisen hybridisaatiosignaalin antanutta pesäkettä (34, 40, 42, 106, 109 ja 156) kasvatettiin L-kasvatusliuoksessa 37 °C:ssa 20 tunnin ajan pienessä mittakaavassa (100 ml) ja plasmidi-DNA valmistettiin sentrifugoimalla cesiumkloridigradientissa pääasiassa seuraavan teoksen mukaisesti: Maniatis 5 et ai.. Molecular Cloning; A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor).

DNA sekvensoitiin ketjunlopetusstandardimenetelmällä, joka on esitetty teoksessa Sanger et ai.. Proc. Nat. Acad. Sei., USA 74, 5463 - 5467 (1977), jossa käytetään Sequenase-pakkausta (tavaramerkki) (United States Biochemical Corporation). Oligonukleotidejä ELS1 ja ELS2 (taulukko 5) 10 käytettiin sekvensointialukkeina.

Taulukko 5

Koodi (Sekvenssi 5'->3”) Aloituskohta (kuvio 1) 15 ELS 1 AGCTCGGTACCATACCTGCATATGC 7-32 (ylempi säie) ELS 2 CTTCACAGCACTTTTTGATACCTGG 144-168 (alempi säie)

Kloonin 156 plasmidin DNA sisälsi kuviossa 13 esitetyn mukaisen sekvenssin ja plasmidia merkittiin koodilla pAG76. Plasmidia pAG76 käytettiin 20 seuraavien E. coli -kantojen kompetenttien solujen transformoimiseen standardimenetelmillä: HB101 . *t];: MSD462 (W3110 Delta lac) :Y: MSD522 (CGSC 6300) 25 DH5 • · · /·. : β-galaktosidaasin ja ihmisen elastaasi-inhibiittorin välisen • ·· /...‘ fuusioproteiinin ilmentäminen • · Y.'. Ihmisen elastaasi-inhibiittorin synteettinen geenisekvenssi • · · kloonattiin kaupallisesti saatavilla olevaan vektoriin pUEX2 (Amersham 30 International Plc - säilytetään myös Budapestin sopimuksen mukaisesti). Vektori sisältää β-galaktosidaasia koodaavan geenin bakteriofaagi lambdan • · · PR-promoottorin transkriptionaalisen säätelyn alaisena. Plasmidi sisältää myös .···, beeta-laktamaasigeenin, joka tekee plasmidia sisältävät transformantit .

///.: resistentiksi ampisilliinille, ja PR-promoottorin lämpötilaherkän repressorin . 35 (CI857) geenin.

• · · • · · • · • · »* t ►« * · 26 106471

Geeni eristettiin pAG76:sta (valmistettu MSD522:sta), jota seurasivat perättäiset pilkkomiset EcoRkllä ja Sällillä ja näin saadun 222 emäsparin fragmentin puhdistaminen elektroforeesilla 1 % agaroosigeelissä.

DNA-fragmentti eristettiin geelistä ensin elektroeluoimalla DNA 5 DEAE NA45 -paperille ja sen jälkeen eluoimalla DNA NA45-paperista 1 M NaCI-liuoksella. Menetelmä on lyhyesti seuraava:

Pieni pala NA45-paperia, joka on leikattu DNAin levyiseksi kaistaksi ja geelin syvyiseksi, kostutetaan ΓΤΕ-puskurilla (10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA, pH 8,0). Kostutettu NA45-paperi pannaan geelissä olevaan reikään, joka on 10 leikattu eluoituvan vyöhykkeen eteen. Elektroforeesin annetaan kestää 5 minuuttia, kunnes DNA-vyöhyke absorboidaan NA45-paperiin. DNAin sisältävä paperi pestään ensin ΓΤΕ-puskurilla ja sen jälkeen se käsitellään kahdesti 1 M NaClilla (200 μΙ) 70 °C:ssa 10 minuutin ajan ajoittain ravistamalla. NaCI-liuokset yhdistettiin ja DNA saostettiin etanolin (1 ml) avulla 15 4 °C:ssa 10 minuutin aikana. DNA kerättiin talteen sentrifugoimalla, pestiin etanoli: vesiseoksella (7:3) kuivattiin ja liuotettiin veteen (20 μΙ).

Vektorin valmistamiseksi 5 μg pUEX2:ta pilkottiin EcoRkllä ja Sällillä suolaisessa puskurissa (BCL, 50 μΙ) 1 tunnin ajan 37 °C:ssa. DNA saostettiin etanolin avulla ja puhdistettiin 1 % agaroosigeelillä. 6,7 20 kiloemäksen vektorifraqmentti eristettiin elektroeluutiolla NA45-paperille yllä kuvatulla tavalla, saostettiin ja liuotettiin veteen (20 μΙ).

Sitomista varten 5 μΙ vektori-DNA:ta (1 μ9) lisättiin elastaasi-inhibiittorin geenifragmenttiin (10 μΐ, 1 μg), 5 * ligaasipuskuriin (BRL, 6 μΙ), veteen (8 μΙ) ja T4 DNA-ligaasiin (1 μ1, 1 u/μΙ). Sitomisen annettin tapah-25 tua 20 tuntia 16 °C:ssa. DNA-seosta käytettiin joko suoraan tai 5 * « i * laimennuksen vedellä jälkeen E. colin MSD462- ja MSD522-solujen • · · transformoimiseksi edellä esitetyn mukaisesti synteettisen geenin ’l“* kloonaamiseksi. MSD462:11e saatiin 8 pesäkettä ja MSD522:11e 75. Kuusi • i « MSD462:n ja 3 MSD522:n pesäkettä tutkittiin hybridisaatioanalyysillä edellä 30 esitetyllä tavalla. Kaikki osoittautuivat positiivisiksi ja niitä analysoitiin vielä • · · kasvattamalla pienessä mittakaavassa ilmentyneiden proteiinien tutkimiseksi **.**: 37 °C:ssa ja 42 °C:ssa. Nämä pienen mittakaavan kasvatukset suoritettiin .···, seuraavalla tavalla: * » /*’. Viljelmiä kasvatettiin 75 ml:ssa M9-väliainetta, joka sisälsi 0,02 % . 35 kaseiinihydrolysaattia; glukoosia (2,0 g/l), MgS04 7H20 (1 mM), CaCI2 2H20 j V (0,1 mM), ampisilliiniä (50 pg/ml) ja tiamiinia (4 pg/ml), 20 tunnin ajan 37 « • 1 * I * • « 27 106471 °C:ssa ravistelukasvatuskaapissa (250 kierr./min). Solut siirrettiin uuteen väliaineeseen (75 ml), jotta OD550:ksi saataisiin 0,1 ja inkuboitiin 37 °C:ssa, kunnes OD550 saavutti arvon 0,4 - 0,5, ja sen jälkeen vielä 42 °C:ssa 3 tunnin ajan. Solut kerättiin talteen sentrifugoimalla ja pieni määrä liuotettiin 5 keittämällä (100 °C, 15 min) laemmli-puskurissa (0,125 mM Tris-HCI, pH 6,8), SDS:ssä (2 % w/v), glyserolissa (20 % w/v), bromifenolisinisessä (hiven), joka sisälsi juuri lisättyä B-merkaptoetanolia (2 % w/v). Proteiineja tutkittiin suorittamalla elektroforeesi 20 % polyakryyliamidigeelissä ja värjäämällä Coomassie Brilliant Blue -väriaineella. Kaikki MSD522:n kolme kloonia ja 10 MSD462:n viisi kloonia tuottivat uutta proteiinia, ionka molekyylipaino oli korkeampi kuin β-galaktosidaasimarkkerin ja emovektorin pUEX2 tuottaman β-galaktosidaasiproteiinin. Yhtä MSD522:n kloonia merkittiin pAG77:11ä.

β-galaktosidaasin ja ihmisen elastaasi-inhibiittorin välisen fuusioproteiinin valmistus 15 β-galaktosidaasi-elastaasi-inhibiittori -fuusioproteiinia (pAG77) ilmentävä E. coli MSD522:n rekombinanttikanta saatiin varastosta, siveltiin L-agarlevylle, johon oli lisätty ampisilliinia (50 μg/ml) ja inkuboitiin 37 °C:ssa 20 tunnin ajan. Tältä levyltä siirrettiin silmukallinen soluja neljään 250 ml:n Erlenmeyerpulloon, jotka sisälsivät 75 ml M9-väliainetta, jota oli täydennetty 20 yllä kuvatulla tavalla. Näitä pulloja inkuboitiin ravistellen 300 kierr./min orbitaalikasvatuskaapissa 37 °C 20 tunnin ajan ja sen jälkeen 42 °C:ssa 4 tunnin ajan.

. : β-galaktosidaasin ja ihmisen elastaasi-inhibiittorin välisen «41 • Y: fuusioproteiinin puhdistus % « 25 E. coli -solut otettiin talteen ja suspendoitiin liuotuspuskuriin (15 % sakkaroosia, 50 mM EDTA:a, 50 mM Tris-vetykloridia, pH 8,0) ja liuotettiin • ♦♦ lysotsyymi/LDS:n (0,5 mg/ml ja 0,05 %, vastaavasti) avulla, jonka jälkeen sonikoitiin (4 * 45 sekuntia käyttäen MSE-sonikaattoria) 4 °C:ssa.

• · · Näin saatu suspensio sentrifugoitiin ja pellettifraktio suspendoitiin 30 uudelleen veteen minkä, jälkeen sentrifugoitiin.

Pesty pelletti liuotettiin 6 M guanidiinivetykloridiin fosfaattipuskuroi- • * · dussa suolaliuoksessa, joka sisälsi 50 mM β-merkaptoetanolia.

.···. Tämä liuos dialysoitiin kunnolla fosfaattipuskuroitua suolaliuosta vastaan ja näin saatu saostuma kerättiin talteen sentrifugoimalla.

I « m * · • « · • « • · 1 » > » ♦ • · 28 106471

Saostuma liuotettiin SDS-polyakryyliamidigeelin pakkauspuskuriin ja suoritettiin polyakryyliamidigeelielektroforeesi käyttäen 10 % redusoivaa geelisysteemiä.

Geeli värjättiin Coomassie blue -väriaineella ja fuusioproteiinia 5 vastaava proteiinivyöhyke leikattiin irti. Sitä käytettiin sen jälkeen immunogeeninä antiseerumien kehittämiseksi jäniksissä. Elastaasi-inhibiittorin valmistus hiivassa Hiivan eritysvektori pDP258

Hiivan eritysvektori esitetään kuviossa 18 ja se on talletettu 10 Budapestin sopimuksen mukaisesti. Tämä vektori mahdollistaa koodaavan sekvenssin fuusion STE13-prosessointisignaaliin MF a 1 -preproalueella. On olemassa useita raportteja, jotka kuvaavat kuinka proteiinia koodaavan sekvenssien fuusio STE13-signaaliin voi johtaa koodatun proteiinin erittymiseen, vaikkakin myös osittain prosessoitujen tai kokonaan 15 prosessoimattomien fuusioproteiinien erittymistä tai solunsisäistä akkumuloitumista on havaittu. Tämä ongelma voidaan välttää käyttämällä hyödyksi muita MF a 1 -preproalueen prosessointikohtia. Katso esimerkiksi Bitter, G.A. et ai., P.N.A.S. 81, 5330 - 5334 (1984); Brake, A.J. et ai., P.N.A.S. 81, 4642 - 4646 (1984); Zsebo, K.M. et ai., J. Biol. Chem. 261, 5858 -20 5865-(1986); Loison, G. et ai., Bio/Technology 6, 72 - 77 (1988); Ernst, J.F., DNA 7, 355-360 (1988).

Kuviossa 18 esitetyn pDP258:n rakenne esitetään pääpiirteissään alla. Restriktioentsyymikohtien paikka on likimääräinen.

I < I

. MF a 1 -promoottori ja prepro:n koodaava sekvenssi EcoRI-Hindlll 25 -fragmentti EcoRI:n kohdasta -959 (Flessel, M.C. et ai., Genetics 121. 223 -.·/· 236, 1989) Hindlllin kohtaan 263 (Kurjan, J.J. ja Herskowitz, Cell 30, 933 - φ · · 943, 1982). Tämä fragmentti voidaan saada plasmidista p69A (Kurjan ja *”;* Herskowitz, Cell 30, 933 - 943, 1982).

Alue Sall(1606)-Espl/Aatll saatiin pBR328:n 2 550 emäsparin 30 fragmentista Sall-Aatll (Covarrubias, L. et ai., Gene 13, 25 - 35, 1981).

···

Geenin LEU2 sisältävä alue Esp-EcoR1(1) saatiin YEpl3S:stä (Broach, J.R., Methods in Enzymol. 101. 307 325, 1983 ja Sherman F. et ai., .♦*·. Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor 1986, s. 95). Sekvenssissä 2u • · oleva kohta Hindlll tuhottiin HindiIMeikkauksella, täyttämällä Klenow- • * . 35 polymeraasilla ja sitomalla uudelleen.

• » 4 • · « • « I » « i » » ♦ • · 29 106471

Plasmidista pAAH5 saadun ADC1-terminaattorin (Ammerer, G., Methods in Enzymol. 101, 192 - 201) sisältävää fragmenttia Hindlll-Sphl käsiteltiin T4-polymeraasilla tasapäisen DNA:n saamiseksi. Kohta Sali (esitetty kohdassa 1606 kuviossa 18) leikattiin ja täytettiin käyttäen T4polymeraasia.

5 AD C1-fragmentti liitettiin plasmidifragmentin kanssa rekombinantin generoimiseksi, joka sisältää oikeassa asennossa olevan ADC1-terminaattorin jotta se pystyy päättämään MF a 1 -promoottorista lähtöisin olevat kopiot. Tämä kloonaaminen regeneroi myös Sali-kohdan (esitetty) ja Hindill-kohdan (suluissa)..

10 Kartassa esitetyt kohdat sisältävä polylinkkeri kloonattiin

Hindlll-kohtaan, joka oli regeneroitu ADCIterminaattorin kloonauksella. Tämä polylinkkeri suunniteltiin niin, että kloonauksessa säilytettiin vain yksi Hindlll-kohta. pDP258 sisältää polylinkkerin kuviossa 18 esitetyssä asennossa. Suluissa esitetty Hindlll-kohta tuhoutuu polylinkkerin 15 kloonauksessa.

Hiivan eritysvektorin muuntelu

Kuviossa 18 esitettyä plasmidia muunnettiin vielä restriktiokohtien lisäämiseksi, Sphl signaalipeptidaasin kohdalla ja Stul MF a 1 -preproalueen KEX2-prosessointikohdissa, DNA-sekvenssejä näihin prosessointisignaaleihin 20 koodaavan proteiinin fuusion mahdollistamiseksi, jotta helpotettaisiin koodatun proteiinin erittymistä solun ulkopuoliseen aineeseen. Suoritettiin in vitro -mutageneesi, joka esitetään yksityiskohtaisesti teoksessa Amersham In-ternational pic, "Oligonucleotide-directed in vitro mutagenesis system version I I · ,y. 2" (koodi RPN.1523). Muut tässä työssä käytetyt menetelmät ovat alan 25 asiantuntijoiden tuntemia ja niitä kuvataan esimerkiksi teoksessa "Molecular • · ·

Cloning - A Laboratory Manual", 2. painos, Sambrook, J., Fritsch, E.F. sekä *:./ Maniatis, T., C.S.H. 1989.

• · *;··/ Sphl-kohdan lisääminen signaalipeptidaasin prosessointi- • · « *·1 1 kohtaan 30 Elastaasi-inhibiittoria koodaavan sekvenssin fuusion MF a 1 -"pre"erityspäähän mahdollistamiseksi suunniteltiin Sphl-restriktioentsyymi-·1": kohta niin, että restriktiota ja T4-polymeraasikäsittelyä seuraa tasaisen pään tuottaminen, joka päättyy MF a 1 -signaalisekvenssin viimeisen kodonin (aminohappo 19) kolmannen emäksen kohdalla (katso esimerkiksi Ernst, J.F., 35 DNA 7, 355 - 360, 1988). Suunniteltiin ja syntetisoitiin mutageeninen • 1 ♦ • · · • · • « ) 1 > Ί • · 30 106471 oligonukleotidialuke välttämättömien sekvenssimuutosten aiheuttamiseksi MF a 1 -signaalisekvenssissä.

Kuvio IA

® Aluke, joka on komplementaarinen tälle alueelle k ----—G CAT GC----— Uusi sekvenssi III! 10 ----—T GCT C—---— Alkuperäinen ala leu ala 17 18 19 Aminohappotähde (Kurjan ja 10

Herskowitz, 1982)

Sphl-kohta alleviivattu * = katso tekstiä | identifioi mutageneesissä muuttuneita emäksiä 20 pDP158:n pieni fragmentti Sstl:stä Hindllkseen (katso kuvio 18) kloonattiin Sstl + Hindlll -leikattuun RF M13mpl8 DNA.han (BRL 520-8227SA). Mahdollisesti rekombinantit täplät (valkoisia X-gal + IPTG:IIä) karakterisoitiin valmistamalla RF-DNA:ta pienessä mittakaavassa koon mittaamiseksi sekä restriktioentsyymianalyysillä agaroosigeelielektroforeesilla. Kehitettiin suuren • « · 25 mittakaavan yksisäikeinen malli-DNA-preparaatti tämän fragmentin si- sältävästä kloonista in vitro -mutageneesikokeissa käytettäväksi V·: oligonukleotidialuketta käyttäen kuten kuviossa IA esitetään. Mutagenisoidun ·1« populaation transformaation seurauksena saatiin 15 täplää ja valmistettiin :T: yksisäikeistä malli-DNA:ta. Agaroosigeelielektroforeesilla tehdyn koon 30 määrityksen jälkeen 11 mallia tutkittiin ketjunlopetusstandardisekvensoinnilla .··1. ylimääräisen T-tähteen havaitsemiseksi (kuviossa IA tähdellä merkitylle "A":lle • · · .···. komplementaarinen). Sen jälkeen klooni #6 valittiin lisä- '·’ sekvensointitutkimuksiin, jotka osoittivat, että tunnetussa MF a 1 -promoottorissa tai koodaavassa sekvenssissä ei ollut havaittavissa 35 lisämuutoksia. Sen jälkeen kompetenttiin TG1 transformoitiin 1 μΙ kloonin #6 malli-DNApreparaatin l/100-laimennosta. Täplät otettiin talteen ja siirrostettiin 1 • · · si 106471 m!:n 21TY-viljelmiin, joihin oli aiemmin ympätty TGI-soluja (kuten Amershamin pakkauksessa on kuvattu). Näitä viljelmiä kasvatettiin ravistellen 37 °C:ssa 5 tunnin ajan ja siirrostettiin sen jälkeen 100 ml:n 21TYväliaineeseen. Vielä 5 tunnin ravisteluinkuboinnin jälkeen valmistettiin kaksisäikeistä RF-DNA:ta 5 plasmidinvalmistuksen standardimenetelmillä. Restriktioentsyymillä leikkaamalla tuotettiin kloonin #6 pieni Sstl-Hindlll -fragmentti (preparaatti A) ja fragmentti puhdistettiin erottamalla agaroosigeelielektroforeesilla. Puhdistettu fragmentti kloonattiin suureen Hindlll-Sstl pDP258 -fragmenttiin (katso kuvio 18) pDP294:n generoimiseksi, so. pDP258:n, joka sisältää SpHI-kohdan 10 oletetussa signaalipeptidaasin halkaisukohdassa ("SIGPEP'-vektori).

Stul-kohdan lisääminen KEX2-prosessointikohtaan Stul-kohta lisättiin PCR-mutageneesillä elastaasiinhibiittoria koodaavan sekvenssin fuusion mahdollistamiseksi KEX-prosessointikohtaan.

15 Kuvio 2A

PCR-aluke, joka on komplementaarinen tälle alueelle Stul Hindlll -— ------AGG CCT----AA GCT T— - Uusi sekvenssi

20 IMI

—---------—A GAG ---------- Alkuperäinen ser leu asp lys arg

I I I

81 82 83 84 85 _ . . ' , , Aminohappotähde

4 I I

• 1 25 (Kurjan ja • · · '·1·’ Herskowitz, 1982) • · • · · • ·♦ • · | identifioi emäksiä, jotka ovat muuttuneet käytettäessä :T: PCR-mutageneesiä Stul-kohdan lisäämiseksi (alleviivattu).

30 Generoitiin kaksi PCR-aluketta. Ensimmäinen (33-meeri) oli .···. homologinen MF a 1 -sekvenssin kanssa (Kurjan, J. ja Herskowitz, I., Cell 30, .·1·. 933-943, 1982) erillään yllä kuviossa 2A esitetyistä emäksistä. Tämän alukkeen suunniteltiin sisältävän uuden Stul-kohdan ja olemassa olevan Hind- * φ » lll-kohdan PCR-tuotteessa. Toinen 33-meerin oligonukleotidialuke oli *·1'· 35 homologinen MF a l:n alueen -211 - -241 kanssa (Flessel et ai., Genetics 121:223 - 236, 1989), joka sisälsi Nsil-restriktiokohdan -227:ssä. Käyttäen • · · 32 106471 näitä kahta oligoa alukkeina sekä plasmidia (esim. pDP258) mallina PCR-monistusreaktiossa voidaan tuottaa noin 490 emäsparin fragmentti. Uuttamalla 1 tilavuudella fenoli:kloroformi: isoamyylialkoholia (25:14:1) ja saostamalla etanolilla PCR-DNA -tuote saatiin 1 tilavuudessa vettä.

5 DNA-leikattiin Nsil- ja Hindlll-restriktioentsyymeillä. Tämän reaktion tuote ajettiin agaroosigeelissä ja 490 emäsparin (noin) vyöhyke puhdistettiin standarditekniikoita käyttäen.

Tuotettiin pDP258:n Xbal:stä Hindlll:seen ulottuvan alueen sisältävä pUC18 (BRL520-5363SA) -rekombinantti. Tässä plasmidissa oli 10 ainutlaatuinen Nsil-kohta (-227, Flessel et ai.). Tämän plasmidin

Nsil-Hindlll-fragmentti korvattiin PCR:n avulla tuotetulla uuden Stul-kohdan sisältävällä fragmentilla käyttäen kloonauksen standarditekniikoita. Kuusi Stul-kohtaa sisältävää kloonia tunnistettiin. Kloonin #6 karakterisoinnin dideoksisekvensoinnin avulla havaittiin, että se sisältävää oikeassa asemassa 15 olevan uuden Stul-kohdan ja ettei siinä ole lisämutaatioita verrattuna julkaistuihin sekvensseihin. Tätä plasmidia kutsuttiin nimellä pDP273.

Sen jälkeen valmistettiin pDP258:n suuri XbaHindlll -fragmentti ja pDP273:n "Stul" Xbal-Hindlll -fragmentti restriktioentsyymillä leikaten ja erottaen agaroosigeeleissä. Agaroosigeelistä puhdistamisen jälkeen nämä 20 fragmentit liitettiin ja transformoitiin kompetenttiin E coliin (HB101). Pienen mittakaavan DNA-preperaatteja tuotettiin 36 pesäkkeestä. DNA pilkottiin Stul-ja Sstl-restriktioentsyymeillä. Kloonin #9 tunnistettiin omaavan oikean ... restriktioentsyymirakenteen, mikä havainnollistettiin agaroosigeelielektro- foreesilla (pDP274). Sen jälkeen pDP274-DNA leikattiin Xbal:n avulla ja I · · 25 liitettiin pDP258:n pienen Xbal-fragmentin puhdistettuun preparaattiin. Tällä ligaatioseoksella transformoiduista 36 E. coli -pesäkkeestä tehtiin pienen mittakaavan DNA-preparaatteja. EcoRI + Stukllä pilkkomisen jälkeen ·«« tunnistettiin kaksi pesäkettä, jotka sisälsivät pienen Xbal-fragmentin, joka oli :T: oikeassa alkuperäisessä luontaisessa asemassa. Lisätöitä varten valmistettiin 30 yksi klooni (pDP289), so. pDP258, jolla on Stul-kohta KEX2-prosessointi- .***. kohdassa.

• · .···, Elastaasi-inhibiittorigeenin kloonaus hiivan eritysvektorisig- « naaleista alaspäin pAG76 leikattiin restriktioentsyymillä BspMI (katso kuvio 13), 35 käsiteltiin sen jälkeen T4-polymeraasilla täyttämään ulkoneman 5':ssa :*.·. tasapäisen DNA:n tuottamiseksi. Fenoli:kloroformi:isoamyylialkoholilla 33 106471 uuttamisen ja etanolilla saostamisen jälkeen DNA liuotettiin veteen ja pilkottiin BamHI-restriktioentsyymillä. Elastaasi-inhibiittoria koodaava pieni fragmentti eristettiin puhdistamalla agaroosigeelistä. Kukin kolmesta vektorista pilkottiin sen jälkeen alla kuvatulla tavalla ja suuret fragmentit eristettiin 5 agaroosigeeleistä.

pDP258 - leikattiin Hindllklla, käsiteltiin T4-polymeraasil!a 5'-ulkoneman tasoittamiseksi, leikattiin BamHkllä pDP289 - leikattiin StuLllä ja BamHI:llä 10 pDP294 - leikattiin Sphkllä, käsiteltiin T4-polymeraasilla 3-ulkoneman poistamiseksi, leikattiin BamHkllä

Kukin kolmesta puhdistetusta vektorifragmentista liitettiin elastaasi-inhibiittorifragmenttiin. Kunkin ligaatioseoksen näytteet transfor-15 moitiin kompetenttiin HBI01 E. coliin. Kustakin kolmesta ligaatioseoksesta saaduista pesäkkeistä valmistettiin 20 - 40 pienen mittakaavan DNAnäytettä. Rekombinantit tunnistettiin pilkkomalla restriktioentsyymeillä BamHI + Pstl ja erottamalla fragmentit agaroosigeeleissä. MF a 1 -signaalin ja elastaasi-inhibiittoria koodaavan sekvenssin välisessä fuusiossa oikean sekvenssin 20 omaavat kloonit varmistettiin DNA-sekvensoinnilla. Seuraavat kloonit valittiin lisäanalysointia varten: pDP280 STE13/elastaasi-inhibiittorifuusio so. saatu pDP258:sta ;*; pDP298 SIGPEP/elastaasi-inhibiittorifuusio so. saatu pDP294:stä I « t

Yf 25 pDP299 KEX2/elastaasi-inhibiittorifuusio so. saatu pDP289:stä « · · • · · • · • · \*·: Nämä rakenteet transformoitiin (Sherman et ai.) JRY188:aan (Brake et ai., P.N.A.S. 81, 4642 - 4646, 1984). Kloonit siirrostettiin ja niitä kasvatettiin :T: 30 °C:ssa stationaarifaasin saavuttamiseksi nestemäisellä YPAD:lla (Sherman 30 et ai., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor, s. 164, 165, 1986) tai .···. -LEU "drop-out"-väliaineessa (Sherman et al., Synthetic Complete Medium .·*·. minus leucine, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor, s. 164, 165, 1986). Aktiivista elastaasi-inhibiittoria voitiin havaita pDP280:n kloonien viljelmien supernatanteissa (katso kuvio 19). Ainesaannot klooneista pDP298 35 ja pDP299 olivat alhaisempia.

34 106471

Rakenteet transformoitiin myös hiivakantaan XS956C (Yeast Genetic Stock Center, University of California, Berkely, CA 94720). 72 tunnin ravisteluinkuboinnin (250 kierr./min) 30 °C:ssa jälkeen, kun viljelmä on saavuttanut stationaarifaasin (normaalisti OD600 = 4 - 6), viljelmien 5 supernatantit otettiin talteen pelletoimalla kokonaisia soluja. Alla esitetyn mukaista entsyymianalyysiä käyttäen viljelmien supernatanttien aktiivisuus määritettiin. Standardikäyrien, joissa on käytetty natiivia elastaasi-inhibiittoria, mukaan (ks. alla) pDP298-kloonit erittivät kasvatusliemeen jopa 3,5 pg/ml aktiivista elastaasi-inhibiittoria.

10 Rekombinantin ihmisen elastaasi-inhibiittoriproteiinin puhdistus

Nestemäisessä -LEU "drop out"-väliaineissa kasvanutta JRY188-isäntää ja STE13-prosessointikohtaa (pDP280) käyttäen saatu materiaali puhdistettiin seuraavalla tavalla.

15 Viljelmäsupernatantit (korkeintaan 2 litraa ravistelupulloissa kasvanutta) suodatettiin käyttäen 0,22 μ suodatinta. Suodos konsentroitiin arviolta kymmenkertaiseksi käyttäen molekyylipainoalueen 3000 erotuskykyistä suodatinta Amiconin spiraalikonsentrointilaitteessa. Sen jälkeen konsentraatti dialysoitiin 3 * 20 tilavuutta 10 mM ammoniumformiaattia vastaan 20 (pH 4). Dialysoitu aine pakattiin etukäteen tasapainotettuun sulfopropyylisefaroosipylvääseen ja eluoitiin ammoniumformiaattigradientilla. Aktiiviset fraktiot yhdistettiin, konsentroitiin ja pakattiin koon mukaan ... erottavaan pylvääseen (Pharmacia HR100) ja eluoitiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella.

I I « 25 Saatiin mikroheterogeeninen tuote, josta saatiin N-

*·*·* päätesekvensoinnilla kaavan I mukainen valmis polypeptidi (60 %) ja kaavan I

• · mukainen valmis polypeptidi sekä joko yksi tai kaksi glu-ala-aminohappopään • · » pidennystä. Pidennysten oletettiin johtuvan hiivakannan epätäydellisestä :T: prosessoitumisesta ja päätepidennykset omaava polypeptidi erotettiin

30 valmiista kaavan I mukaisesta polypeptidistä MonoS HPLC:llä 50 mM

.···. natriumasetaatissa (pH 4,5) käyttäen 0 - 0,5 M natriumkloridigradienttia eluent- .···. tina. Mikroheterogeenisen tuotteen havaittiin omaavan saman spesifisen « *·* aktiivisuuden kuin psoriaattisista täplistä eristetyn polypeptidin aktiivisuus.

Proteiinin, joka oli tuotettu SIGPEP- ja KEX2-prosessointikohtia 35 käyttäen saatuja rakenteita viljelemällä, puhdistamiseksi käytettiin samanlaista • * · • · » · Γ:'· 106471 35 menetelmää. Näiden rakenteiden kanssa saatiin homogeeninen tuote, jolla oli kaavan I mukaisen valmiin polypeptidin oikea N-pään sekvenssi.

Muissa isännissä kasvaneiden rakenteiden puhdistusmenetelmä oli pääasiassa yllä kuvatun kaltainen. Esimerkiksi signaalipeptidaasin 5 pilkkoutumiskohtaa käyttäen saatua rakennetta kasvatettiin hiivakannassa XS 956C ja se puhdistettiin yllä olevan mukaisesti, jonka tuloksena saatiin 4 mg kaavan I mukaista valmista polypeptidiä yhtenä yhdisteenä, jolla polypeptidillä oli samaa spesifistä aktiivisuutta kuin psoriaattisista täplistä eristetty polypepti-Analyysi elastaasi-inhibiittorin esiintymisen määrittämiseksi 10 Kaavan I mukaisen polypeptidin esiintymistä ja määrää esimerkiksi sen yhdistelmä-DNA-tekniikan avulla tuottamisen aikana tarkkailtiin seuraavaa menetelmää käyttäen. Tässä analyysissä aineen aktiivisuus määritettiin sian haiman elastaasin (Sigma) inhibitiolla käyttäen substraattina N- metoksisukkinyyli-ala-ala-pro-val-p-nitroanilidia (AAPV, Sigma).

15 Näyte, esimerkiksi hiivafermentoinnin supernatantti (100 μΙ), sekoitettiin sian elastaasin (10 μg/ml) kanssa analyysipuskurissa (0,1 M Hepes/0,5 M NaCI/pH 7,5 sisältäen 1 % RIA-laatuista härän seerumin albumiinia). Seosta inkuboitiin 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, analyysipuskurissa oleva substraatti (800 μΙ, 2,5 mM) lisättiin ja seosta inkuboitiin 2 20 minuutin ajan huoneen lämpötilassa. Absorbanssin muutoksen nopeus aallonpituudella 405 nm mitattiin 2 minuutin aikana ja aktiivisuus laskettiin standardikäyrältä, joka saatiin käyttämällä psoriaattisista täplistä eristettyä ,., kaavan I mukaista polypeptidiä (käytetty standardi oli välillä 0 - 2,5 pg/ml).

Rekombinantin elastaasi-inhibiittorin inhiboiva aktiivisuus 25 H LE :tä vastaan • · v.: Yllä kuvattujen menetelmien mukaisesti tuotetun rekombinantin • · elastaasi-inhibiittorin inhiboiva aktiivisuus ihmisen valkosoluelastaasia vastaan ί.,.ί testattiin käyttäen yllä kuvatun mukaista menetelmää. Rekombinantilla :T: polypeptidillä havaittiin olevan psoriaattisesta ihosta saatuun materiaaliin 30 verrannollista inhiboivaa aktiivisuutta.

.···. Raa’an rekombinantti-elastaasi-inhibiittorin Poly LC-HPLC

· ,···. 100 μg raakaa rekombinanttia elastaasi-inhibiittoria kromatogra- *** foitiin Poly LC -pylväässä ja näkyviin saatiin ihmisen valkosoluelastaasin • 1 · inhibointipiikkejä. Tarkasteltiin kahta suurinta (I ja II) piikkiä. Piikki I sisälsi 23 35 pg proteiinia perustuen integroituun absorbanssiin 215 nm:n aallonpituudella ja 19,4 pg aktiivista inhibiittoria (mp 7017, titrattu HLE:llä). Piikki II sisälsi 8,4 • · $ · 1 1 > · » · se 106471 pg proteiinia ja 6,9 pg aktiivista inhibiittoria. Näin ollen ilmeni, että nämä kaksi piikkiä ovat erittäin puhtaita inhibiittoreita. Yhteiseluutiokoe, jossa oli 1 pg piikkiä I ja 1 pg psoriaattisesta ihosta saatua kaavan I mukaista polypeptidiä, osoitti piikin I ja ihosta saadun materiaalin olevan identtisiä tässä systeemissä.

5 Tämä vahvistettiin vielä yhteiseluutiokokeella RP|8 -HPLC:llä, joka antoi myös yhden piikin.

Poly LC-HPLC:n piikki l titrattiin HLE.tä vastaan Ki:n määrittämiseksi Greenin ja Workin menetelmän mukaisesti. Piikin I mukaiseksi Kjiksi saatiin 8,0 1 10'10 M, kun taas ihmisen ihon inhibiittorin K| oli 3,3 10~10 M.

10 Greenin ja Workin menetelmän tarkkuus huomioiden piikin I aine vaikuttaa omaavan ihmisen psoriaattisesta ihosta saatuun polypeptidiin verrattavissa olevaa aktiivisuutta.

Vaikuttaa siltä, että tämä raaka rekombinantti elastaasi-inhibiittori koostuu noin 75-%:isesti inaktiivisesta proteiinista, 5-%:isesti HLE-inhibiitto-15 rista, joka eroaa ihmisen ihosta peräisin olevasta kaavan I mukaisesta polypeptidistä retentioajan Poly LC-HPLC:llä suhteen (johtuu ilmeisesti N-päässä tapahtuneesta pidentymisestä tai deleetiosta) ja 20-%:isesti HLE-inhibiittorista (Poly LCHPLC.n piikki I), joka on identtinen ihmisen psoriaattisesta ihosta peräisin olevan polypeptidin kanssa retentioaikojen 20 suhteen TSK 2000 koon mukaan erottavalla HPLC:llä, RPl8-HPLC:llä, Poly LC -HPLC:llä ja inhibiittoriaktiivisuuden suhteen.

Ihmisen valkosoluelastaasi-inhibiittorin cDNA-sekvenssi

Tiettyä polypeptidiä koodaavat DNA-sekvenssit voidaan saada aikaan standarditekniikoita käyttämällä. Tällaisia tekniikoita ovat '·1·1 25 seulontatekniikat, so. yhdistelmäcDNA-kokoelmien hybridisaatioseulonta • · erilaisten oligonukleotidien kanssa edustaen mahdollisia DNA-sekvenssi- • · kombinaatioita, sekä monistamistekniikat, kuten PCR-ketjureaktiona (polymeraasiketjureaktio) tunnettu tekniikka.

Molempien yllä mainittujen menetelmien cDNA-kokoelmien 30 seulontakoeohjeet esitetään teoksessa "Molecular Cloning", Sambrook, J., .···. Fritsch, E.F. ja Maniatis, T., 2. painos, Cold Spring Harbor Laboratory Press ’"t. 1989.

*V Yllä mainittuja hyvin tunnettuja tekniikoita käyttäen cDNA

määritettiin "merkittävimmäksi inhibiittoriksi" (so. kaavan I mukaiseksi 35 polypeptidiksi). Käytettiin keuhkon cDNA lambda gtll -kokoelmaa ja saatiin :v. kuviossa 14 esitetty sekvenssi. Sekvenssin uskottiin jatkuvan siten kuin • · · 106471 jlr.l'··:£· «••fräifer - 37 kuviossa 15 on esitetty. Translaation lopetuskodoni on koodaavan sekvenssin jälkeen ja polyadenylaatiosignaalin uskotaan olevan 153 ep:n etäisyydellä 3-päästä. Myös 250 ep:n intronin oletetaan esiintyvän geenin 3'-päässä.

Työtä jatkettaessa ne cDNA-kloonit eristettiin, jotka koodaavat 5 ihmisen keuhkojen cDNA-kokoelmasta peräisin olevien elastaasi-inhi-biittoripreparaattien suuren aktiivisen komponentin (ja pienten aktiivisten komponenttien) kokonaista aminohapposekvenssiä. Kuviossa 16 esitetään erään tällaisen kloonin (EI4) koko DNA-sekvenssi. Tätä sekvenssiä verrattiin myös muihin riippumattomiin cDNA-klooneihin ja samasta cDNA-kokoelmasta 10 PCR:n avulla eristettyihin DNA-fragmentteihin. Tämä sekvenssi osoittaa YlemPänä "in-frame" proteiinia koodaavan sekvenssin läsnäolon elastaasi-inhibiittoria koodaavan alueen läsnäolon lisäksi. Tällä ylemmällä sekvenssillä on seuraavat piirteet: a) Välittömästielastaasi-inhibiittoriproteiinisekvenssistä ylöspäin 15 olevat 19 aminohappokodonia vastaavat proteiinisekvenssidataa, joka on peräisin proteiinisekvenssianalyysissä identifioidusta pienestä proteiinifraktiosta (piikki V, komponentti A).

b) Elastaasi-inhibiittoria koodaavan sekvenssin tähteistä -26 - +10 alusta lähtien olevan toistuvan peptidialueen (nimellisesti Val-Lys-Gly-GIn-X-Y, 20 jossa X on joko Asp, Vai, Glu, Pro, Ser tai Lys) kuusi kopiota. Elastaasi-inhibiittoripreparaattien useiden pienten komponenttien Npäät eivät vastaa tätä aluetta, joka on spesifisen proteolyyttisen hajoamisen kohta.

..t< c) Tämän kloonin koodaama N-pää on erittäin hydrofobinen (13 18:sta tähteestä), mikä voi olla osana signaalisekvenssiä tai transmembraani- I I c v,‘ 25 domeenia.

• » *·*.· Tällä kloonilla ei ole tunnistettavissa olevaa translaation • · aloituskodonia konventionaalisten käsitysten mukaan (so. AUG). Alukkeen • ♦ · laajennustutkimusten tulokset osoittivat, että pääkopion alku on noin 80 :T: emästä ennen cDNA-sekvenssin alkua, joka on identifioitu viljeltyjen ihmisen 30 keratinosyyttien (HEK 78) mRNA:ssa. Tämän tekniikan avulla ei osoitettu .**·. samanlaista viestiä olevan monissa muissa mRNA-lajeissa (sisältäen ihmisen ··· .···. keuhkojen koko RNA:n).

Haiman adenokarsinooman koko RNA:n Northern blot -analyysi osoitti noin 750 emäksen pituisen homologisen kopion läsnäolon. Tämä ei ole 35 ristiriidassa yllä olevan cDNA-sekvenssin alukkeen pidennysdatan mukaan • · · • · • · «Ml* • · 38 106471 ennustetun koon kanssa (olettaen polyadenylaation pituudeksi noin 190 emästä).

Elastaasi-inhibiittorin vasta-aineita

Kaavan I mukaiselle polypeptidille kehitettiin vasta-aineita käyttäen 5 uusiseelantilaisia valkoisia kaneja. Käytettiin seuraavia rokotteita.

1. Substraatti (A), joka käsitti kaavan I mukaisen polypeptidin 16 N-pään aminohappotähdettä härän seerumin albumiiniin pariutuneena maleimidobentsoyyli-n-hydroksisukkinimidiesterin vaikutuksesta Lerner et al:n menetelmän (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78: 3403 - 3407) mukaisesti, 10 2. Substraatti (A) härän tyroglobuliiniin kohdassa 1 esitetyllä tavalla liittyneenä, 3. Substraatti (A) sekoitettuna metyyli - härän seerumin albumiinin kanssa, ja 4. β-galaktosidaasin ja kaavan 1 mukaisen polypeptidin 15 fuusioproteiini.

Yllä lueteltujen peptidien 1, 2 ja 3 rokotusaikataulu on esitetty seuraavassa: 1. päivä - 250 pg Freundin täydellisessä apuaineessa olevaa peptidiä annettiin ihonalaisesti, 20 39. päivä - 250 μg Freundin epätäydellisessä apuaineessa olevaa peptidiä annettiin ihonalaisesti, 66. päivä - 250 pg Freundin epätäydellisessä apuaineessa olevaa ... peptidiä annettiin ihonalaisesti, 107. päivä - 1 mg peptidiä annettiin suonensisäisesti ilman < « < '·*·' 25 apuainetta, :.v 120. päivä - verinäyte.

\*·: Yllä luetellun peptidin 4 rokotusaikataulu on esitetty seuraavassa: 1. päivä - 200 pg Freundin täydellisessä apuaineessa olevaa :T: proteiinirokotetta annettiin ihonalaisesti, 30 22. päivä - 100 pg Freundin epätäydellisessä apuaineessa olevaa .···. proteiinirokotetta annettiin ihonalaisesti, 61. päivä - 200 pg Freundin epätäydellisessä apuaineessa olevaa proteiinirokotetta annettiin ihonalaisesti, 94. päivä -130 pg proteiinirokotetta annettiin suonensisäisesti ilman 35 apuainetta, : V. 107. päivä - verinäyte.

• · 0 0 0 0 » » 0 0 0 · 39 106471

Tuotetun antiseerumin ristireaktiivisuus testattiin SDS-PAGE:a ja Western blotting -menetelmää käyttämällä. Fuusioproteiinia (4, yllä) käyttäen tuotetun antiseerumin havaittiin olevan ristireaktiivinen psoriaattisista täplistä eristetyn kaavan I mukaisen polypeptidin sekä myös kaavan I mukaisen 5 rekombinanttipolypeptidin (laimennuksella 1:2 000 havaittiin 1 pg) ja α-,-antitrypsiinin kanssa. arantitrypsiinin ristireaktiivisuus poistettiin (90 %) panemalla (3*) antiseerumi immobilisoitua al:stä sisältävän pylvään läpi (25 mg arantitrypsiiniä, joka on sidottu 5 ml:lla syaanibromidia aktivoituun sefaroosi 4B -pylvääseen - Pharmacia). Lueteltujen peptidien 1, 2 ja 3 10 havaittiin myös ristireagoivan kaavan I mukaisen rekombinanttipolypeptidin kanssa.

Useita ruumiinkudoksia käsiteltiin antiseerumilla käyttäen 1:50 tiitteriä ja standardi-immunoperoksidaasitekniikkaa. Maksa-sappijärjestelmän maksasoluilla havaittiin-voimakasta reaktiivisuutta, vatsan limakalvon lihas-15 kerroksessa havaittiin vähäistä reaktiivisuutta, nielun limakalvon imukudoksen laskimon sileissä lihassoluissa ja lamina spinosassa havaittiin vähäistä reaktiivisuutta ja ihon sarveiskerroksessa, ihon jyväiskerroksessa, väkäsolu-kerroksessa ja ihon orvaskeden tyvisolukerroksessa havaittiin voimakasta reaktiivisuutta.

20 Lyhenteitä AAPFpNA sukkinyyli-alanyyli-prolyyli-fenyyliala-nyyli-p-nitroanilidi.

AAPV-AFC metoksi-sukkinyyli-alanyyli-alanyyli-prolyyli-valyyli- ... < trifluorimetyylikumariini.

';';' AAPVpNA metoksi-sukkinyyli-alanyyli-prolyyli-valyyli-p-nitroanilidi.

'·*·' 25 TGPLpNA tosyy I i-g lysyy li-pro lyy I i-ly s i i n i-p-n itroa n i lid i.

HLE ihmisen valkosoluelastaasi.

» · TFA trifluorietikkahappo.

'·,]/· DMS0 dimetyylisulfoksidi.

:T: PCR Polymeraasiketjureaktio-menetelmähalutun 30 DNA-sekvenssin monistamiseksi, katso esi- .···. merkiksi K. Kleppe et ai., J. Mol. Biol. (1971), 56, 341 - 361 ja EP-patenttihakemus 0 201 184 sekä "Molecular Cloning - A Laboratory Manual", 2. painos, Sambrook, J., Fritsch, E.F. ja Maniatis, T., CSH 1989.

• · • * · « · · • · • · 1 • 1 Ϊ > · 4 4 40 106471

Aminohappojen merkitsemistapa G tai Gly: Glysiini A tai Ala: Alaniini S tai Ser: Seriini 5 T tai Thr: Treoniini C tai Cys: Kysteiini N tai Asn: Asparagiini Q tai Gin: Glutamiini L tai Leu: Leusiini 10 I tai Ile: Isoleusiini V tai Vai: Väliini M tai Met: Metioniini F tai Phe: Fenyylialaniini Y tai Tyr: Tyrosiini 15 Wtai Trp: Tryptofaani P tai Pro: Proliini D tai Asp: Asparagiinihappo E tai Glu: Glutamiinihappo H tai His: Histidiini 20 K tai Lys: Lysiini R tai Arg: Arginiini DNA-sekvenssien merkitsemiseen käytetään standardimerkitsemis- ...( tapaa.

Kuvioiden 1-8 kuvaaminen • · < 25 Kuviossa 1 kuvataan 50 g:sta psoriaattista hilsettä saadun happamoidun uutteen kationinvaihtokromatografiaa (TSK CM 3 SE-HPLC).

• · :.**i Pylväsfraktiot kerättiin automaattisesti (60 pisaraa/fraktio) ja proteiinipitoisuutta tarkkailtiin (280 nm). Fraktioiden HLE-inhibiittoriaktiivisuus (HLE-I) analysoitiin. :T: Synteettisen tetrapeptidisubstraatin metoksi-sukkinyyli- alanyyli-alanyyli-prolyyli- 30 valyyli-p-nitroanilidin HLE-välitteistä proteolyysiä inhiboiva aktiivisuus analysoitiin .·*·. kustakin fraktiosta otetusta 5 μΙ:η näytteestä. Inhiboivaa aktiivisuutta omaavat .·*·, fraktiot (varjostettu alue) yhdistettiin lisäpuhdistamista varten.

]·] Kuviossa 2 kuvataan kationinvaihtokromatografiasta saatuja fraktioita sisältävän elastaasi-inhibiittorin toista kromatografiaa, käänteisfaasi-C8-kroma-35 tografiaa (Nucleosil 300 C8-HPLC). Proteiinipitoisuutta rekisteröitiin jatkuvasti ♦ ·> # • · · • · • » «

• t t J O

ΛΛ 106471 41 aallonpituudella 215 nm. Elastaasi-inhibiittoria sisältävät fraktiot yhdistettiin (varjostettu alue) ja suoritettiin Poly LC -kromatografia.

Kuviossa 3 kuvataan käänteisfaasi-C8-kromatografiasta saatuja fraktioita sisältävän elastaasi-inhibiittorin polysulfoetyyliaspartamidikromato-5 grafiaa (Poly LCHPLC). Proteiinipitoisuutta rekisteröitiin aallonpituudella 215 nm. Proteiinipitoisuuden ja inhibiittorikapasiteetin (n. 20 % kokonaismäärästä) suhteen korkein piikki V kerättiin ja puhdistettiin edelleen käänteis-faasi-C18-kromatografialla.

Kuviossa 4 kuvataan Poly LC -HPLC:ltä saadun elastaasiinhibiittorin 10 pääkomponentin toista kromatografiaa käänteisfaasi-C18 -kromatografialla (Nucleosil 5 C1S-HPLC) . Varjostettu alue esittää puhdistettua merkittävintä inhibiittoria. Tätä preparaattia käytettiin edelleen karakterisointiin.

Kuviossa 5 kuvataan kaavan I mukaisen polypeptidin näennäisen molekyylimassan määrittämistä analyyttisellä geelikromatografialla TSK 2000 15 HPLC:llä käyttäen eluenttina 0,1 % TFA:ta. Proteiinipitoisuutta tarkkailtiin aallonpituudella 215 nm. Käytetyt Mr-merkit olivat: Val-GlySer-Glu, mp 390, insuliinin beetaketjufragmentti 22 - 30, mp 6512, soijapapu-trypsiini-inhibiittori, mp 22 000, ovomukoiditrypsiini-inhibiittori, mp 27 000, härän seerumin albumiini, mp 67 000.

20 Kuviossa 6 esitetään kaavan I mukaisen polypeptidin isoelektrinen fokusointi ServalytR-esipäällysteillä pH 3 -10. Standardeina käytettiin Serva Test Mix 9:ää, joka koostui sytokromi C:stä (Cy-c), ribonukleaasi A:sta (Rib A), valaan ,.. myoglobuliinista (Myo I) ja hevosen myoglobuliinista (Myo II). Geelit joko värjättiin hopealla (kuviossa ylhäällä) tai pilkottiin, eluoitiin asetonitriilillä ja niiden « · · *··’ 25 elastaasia inhiboiva aktiivisuus (HLE-I) analysoitiin (kuviossa alhaalla).

v.: Kuviossa esitetään 7 ihmisen valkosoluelastaasin titraus $ · merkittävimmällä elastaasi-inhibiittorilla (kaavan I mukainen polypeptidi). Puhdistettu HLE (tiirattu 1 μg/ml:ksi rekombinantilla egliini Cillä) tiirattiin merkittävintä inhibiittoria vastaan 0,05 - 0,8 pg (käänteisfaasi-C18 -HPLC:lla t 30 aallonpituudella 215 nm saatuun integroituun absorbanssiin perustuva .···. proteiinipitoisuus). Entsyymiä ja merkittävintä inhibiittoria esi-inkuboitiin 30 • · Ϊ.Ι' minuutin ajan 21 °C:ssa ja E 1 min jäännösaktiivisuus määritettiin käyttäen 2 *!’ mM AAPVpNA:ta substraattina. Kj oli 3 1 10'10 M Greenin ja Workin menetelmän • ·« :: mukaisesti laskettuna (8).

* ” ’ i 35 Kuviossa 8 esitetään merkittävimmän elastaasi-inhibiittorin sekvenssi, :v. so. kaavan I mukaista polypeptidiä.

• · • · » »> · • · 42 106471

Budapestin sopimuksen mukaisen talletuksen yksityiskohdat

Seuraavat plasmidit on talletettu Budapestin sopimuksen mukaisesti talletuslaitokseen The National Collection of Industrial and Marine Bacteria 5 Limited, 23 St Machar Drive, Aberdeen AB2 IRY, Skotlanti, UK.

pUC18 E coli -isäntäkannassa CGSC 6300 (MSD 1208) pUEX2 E coli -isäntäkannassa CGSC 6300 (MSD 1209) pDP258(HB101) E coli-kannassa HB101 (pDP258 HB-101) « «· • · III « 4 • * « • « « « · • · • · · • · · • · • · • · · * * · ·♦« • ♦ • · ·«· • · · • · · ··« • · • ♦

• M

Ml β « «

IM

« « · · « · « ·

Ml * · « « ·

• I I

• · • · « · * < »

• I

43 106471 Lähdeluettelo I. Lee CT, Fein AM, Lippmann M, Holzman H, Kimbel P, Weinbaum G. Elastolytic Activity in Pulmonary Lavage Fluid from Patients with Adult Respiratory-Distress Syndrome. (1981) New Engl J Med 304: 192 - 196.

5 2. Janoff A. Emphysema: Proteinase-Antiproteinase Imbalance.

Teoksessa Gallin Jl, Goldstein I, Snyderman R (toim.), Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates. Raven Press, NY, 1988.

3. Glinski W, Zarebska Z, Jablonska S, Imiela J, Norsarzewski J. The activity of polymorphonuclear leukocyte neutral proteinases and their inhibitors 10 in patients with psoriasis treated with continuous peritoneal dialysis. (1980) J Invest Dermatol 75: 481 - 487.

4. Briggman RA, Schechter NM, Fraki J, Lazarus GS. Degradation of the Epidermal-Dermal Junction by Proteolytic Enzymes from Human Skin and Human Polymorphonuclear Leukocytes. (1984). J Exp Med 160: 1027 -1042.

15 5. Fraki JE, Hopsu-Havu VK, Human Skin Proteases. Partial

Purification and Characterization of a Protease Inhibitor. (1972). Arch Derm Forsch 243: 153-163.

6. Fryksmark U, Ohlsson K, Rosengren M, Tegner H. A Radioimmuno assay for Measurement and Characterization of Human 20 Antileukoprotease in Serum. (1981) Hoppe Seyler's Z Physiol Chem 362: 1273 -1277.

... 7. Nakajima K, Powers JC, Ashe BM, Zimmerman M. Mapping the

Extended Substrate Binding Site of Cathepsin G and Human Leukocyte :: V' Elastase. (1979) J Biol Chem 254:4027 - 4032.

25 8. Green NM, Work E. Pancreatic Trypsin Inhibitor. 2. Reaction with \*·: Trypsin. (1953) Biochem J 54: 347 - 352.

9. Braun NJ, Bodmer JL, Vireä GD, Metz-Virca G, Maschler R, Bieth :T: JG, Schnebli HP. Kinetic Studies on the Interaction of Eglin C with Human

Leukocyte Elastase and Cathepsin G. (1987) Biol Chem Hoppe-Seyler 368: 30 299 - 308.

• · .···. 10. Kramer MD, Justus C. The antiproteolytic compound )·* a2-macroglobulin in human skin. (1988) Arch Dermatol Res 280: 93 - 96.

II. Fink E, Jaumann E, Fritz H, Ingrisch H, Werle E. Protease-lnhibitoren im menschlichen Spermalplasma. Isolierung durch 35 Affinitatschromatographie und Hemmverhalten. (1971) Hoppe-Seyler's Z Physiol Chem 352: 1591 1594.

« · 44 106471 12. Wallner 0, Fritz H. Characterisation of an Acid-Stable Proteinase Inhibitor in Human Cervical Mucus. (1974) Hoppe-Seyler's Z Physiol Chem 355: 709-715.

13. Ohlsson K, Tegner H, Akesson U. Isolation and Partial 5 Characterisation of a Low Molecular Weight Acid Stable Protease Inhibitor From

Human Bronchial Secretion. (1977) Hoppe-Seyler's Z Physiol Chem 358: 583 - 589.

14. Ohlsson M, Rosengren M, Tegner H, Ohlsson K. Quantification of Granulocyte Elastase Inhibitors in Human Mixed Saliva and in Pure Parotid 10 Secretion. (1983). HoppeSeyler's Z Physiol Chem 364:1323 -1328.

15. Ohlsson K, Tegner H, Fritz H, Schiessler M. Immunological Similarity between Low Molecular Weight Trypsin-Chymotrypsin Inhibitors from Human Bronchial Secretion and Seminal Plasma. (1976). Hoppe Seyler's Z Physiol Chem 357: 1241 -1244.

15 16. Thompson RC, Ohlsson K. Isolation, properties and complete amino acid sequence of human secretory leukocyte protese inhibitor, a potent inhibitor or leukocyte elstase. (1986) Proc Natl Acad Sci USA 83: 6692 - 6696.

17. Seemuller U, Arnhold M, Fritz H, Wiedenmann K, Machleidt W, Heizel R, Appelhans H, Gassen H-G, Lottspeich F. The acid-stable proteinase 20 inhibitor of human mucous secretions (HUSI-I, antileukoprotease). (1986).

18. Albrecht GJ, Hochstrasser K, Salier J-P. Elastase Inhibition by the Inter-Alpha-Trypsin Inhibitor and Derived Inhibitors of Man and Cattle. (1983) * i HoppeSeyler's Z Physiol Chem 364: 1703 -1708.

19. Fioretti E, Angeletti M, Citro G, Barra D, Ascoli F. Kunitztype « « € 25 Inhibitors in Human Serum. Identification and Characterisation. (1987) J Biol V*: Chem 262: 3586 - 3589.

20. Reisinger PWM, Hochstrasser K, Gottlicher I, Eulitz M, Wachter E. The Amino-Acid Sequences of the Double-Headed Proteinase Inhibitors from Cat, Lion and Dog Submandibular Glands. (1987) Biol Chem Hoppe-Seyler 368: 30 717-726.

.···. 21. Schalwijk J, Lammers AM, Chang A, van der Kerkhof PCM, Mier ’·’ PD. An Epidermal Elastase Inhibitor Induced by Spontaneous or Experimental *···’ Inflammation. (Abstract) (1988) J Invest Dermatol 91: 376.

22. Hochstrasser K, Albrecht GJ, Schonberger OL, Rasche B, 35 Lempart K. An Elastase-Specific Inhibitor from Human Bronchial Mucus. (1981) ....: Hoppe-Seyler's Z Physiol Chem 362:1369 -1375.

» ·

Claims (10)

106471

1. Menetelmä polypeptidin valmistamiseksi, jota polypeptidiä on saatavissa ihmisen ihon psoriaattisesta hilseestä ja jolla on inhiboivaa 5 aktiivisuutta ihmisen valkosoluelastaasia vastaan ja i) joka polypeptidi sisältää aminohapposekvenssin a) -Ala-GIn-Glu-Pro-Val-Lys-Gly-Pro, b) -Ala-GIn-Glu-Pro-Val-Lys-Gly-Pro-Val-Ser-Thr-Lys-Pro-Gly-Ser-Cys-Pro-lle-lie-Leu, 10 c) -Ala-GIn-Glu-Pro-Val-Lys-Gly-Pro-Val-Ser-Thr-Lys-Pro-Gly-Ser- Cys, d) -Ala-GIn-Glu-Pro-Val-Lys-Gly-Pro-Val-Ser-Thr-Lys-Pro-Gly-Ser- Cys-Pro-lle-lle-Leu-lle-Arg-Cys-Ala-Met-Leu-Asn-Pro-Pro-Asn-Arg-Cys-Leu-Lys-Asp-Thr, tai 15 e) -Lys-Gly-Pro-Val-Ser-Thr-Lys-Pro-Gly-Ser-Cys-Pro-lle-lle-Leu-lle- Arg-Cys-Ala-Met-Leu-Asn-Pro-Pro-Asn, ii) tai aminohapposekvenssin Asn-Gly-GIn-Asp-Pro-Val-Lys-Gly-GIn-Val-Ser-Val-Lys-Gly-GIn-Asp- Lys-Val-Lys-Ala-GIn-Glu-Pro-Val-Lys-Gly-Pro,

20 Gly/Ala-GIn/Val-Asp-Lys-Val-Lys-Ala-GIn-Glu-Pro-Val-Lys-Gly-Pro- Val-Ser-Thr-Lys-Pro-Gly-Ser-Cys-Pro-lle-lle-Leu, Asp-Lys-Val-Lys-Ala-GIn-Glu-Pro-Val-Lys-Gly-Pro-Val-Ser-Thr-Lys-*: 1:' Pro-Gly-Ser-Cys, tai * I 4 ';';' GlyA/al-Lys-Ala-GIn-Glu-Pro-Val-Lys-Gly-Pro-Val-Ser-Thr-Lys-Pro- Y < ‘ 25 Gly-Ser-Cys-Pro-lle-lle-Leu-lle-Arg-Cys-Ala-Met-Leu-Asn-Pro-Pro-Asn-Arg- Cys-Leu-Lys-Asp-Thr, • · · iii) tai jolla polypeptidillä on kaava I Ala-GIn-Glu-Pro-Val-Lys-Gly-Pro-Val-Ser-Thr-Lys-Pro-Gly-Ser-Cys-Pro-lle-lle- Leu-lle-Arg-Cys-Ala-Met-Leu-Asn-Pro-Pro-Asn-Arg-Cys-Leu-Lys-Asp-Thr-Asp- . 1 · ·. 30 Cys-Pro-Gly-lle-Lys-Lys-Cys-Cys-Glu-GIy-Ser-Cys-Gly-Met-Ala-Cys-Phe-Val- • · · .···. Pro-GIn (kaava I), *·1 iv) tai joka polypeptidi sisältää aminohapposekvenssin ‘ · · ·: Lys-Gly-Pro-Val-Ser-Thr-Lys-Pro-Gly-Ser-Cys-Pro-lle-lle-Leu-lle-Arg- ':: Cys-Ala-Met-Leu-Asn-Pro-Pro-Asn-, « « · · • « « « · 106471 tunnettu siitä, että viljellään bakteeri tai hiivaisäntäsolu, joka on transformoitu plasmidisella ilmentämisvektorilla, joka koodaa polypeptidiä, ja mahdollisesti puhdistetaan ilmennetty polypeptidi.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, 5 että ilmennetään kaavan I mukainen polypeptidi Ala-GIn-Glu-Pro-Val-Lys-Gly- Pro-Val-Ser-Thr-Lys-Pro-Gly-Ser-Cys-Pro-lle-lle-Leu-lle-Arg-Cys-Ala-Met-Leu-Asn-Pro-Pro-Asn-Arg-Cys-Leu-Lys-Asp-Thr-Asp-Cys-Pro-Gly-lle-Lys-Lys-Cys-Cys-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Met-Ala-Cys-Phe-Val-Pro-GIn (kaava I).

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu 10 siitä, että polypeptidi puhdistetaan johonkin seuraavista asteista: i) polypeptidiksi, joka analysoitaessa sitä C18-käänteisfaasi-kromatografialla johtaa oleellisesti yhteen ainoaan piikkiin, ii) polypeptidiksi, joka on vähintään 70-prosenttisesti puhdas tai iii) polypeptidiksi, joka on vähintään 95-prosenttisesti puhdas.

4. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan polypeptidi, jolla on inhiboivaa aktiivisuutta sian haiman elastaasia vastaan ja jolla ei ole merkittävää aktiivisuutta trypsiiniä, ihmisen katepsiini G:tä, alfa-kymotrypsiiniä ja plasmiinia vastaan.

5. DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että se koodaa jossakin edellä 20 olevassa patenttivaatimuksessa määritellyn polypeptidin.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että se koodaa polypeptidin Ala-GIn-Glu-Pro-Val-Lys-Gly-Pro-Val-Ser-Thr- ;'; Lys-Pro-Gly-Ser-Cys-Pro-lle-lle-Leu-lle-Arg-Cys-Ala-Met-Leu-Asn-Pro-ProAsn- '; Arg-Cys-Leu-Lys-Asp-Thr-Asp-Cys-Pro-Gly-lle-Lys-LysCys-Cys-Glu-Gly-Ser- v 25 Cys-Gly-Met-Ala-Cys-Phe-Val-Pro-Gln (kaava I).

• · \*·: 7. Patenttivaatimuksen 5 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu • · · siitä, että :T: i) se on kuviossa 13 esitetty DNA-sekvenssi tai ii) se sisältää kuviossa 13 esitetyn DNA-sekvenssin sen osan, joka .··*. 30 koodaa kaavan I mukaisen polypeptidin.

.···. 8. Patenttivaatimuksen 5 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu *" siitä, että se sisältää merkittävän osan kuviossa 14 tai 16 esitetystä :: DNA-sekvenssistä, tai sen komplementaarisen säikeen.

*: “: 9. Replikoituva plasmidinen ilmentämisvektori, tunnettu siitä, 35 että se kykenee ilmentämään transformoidussa bakteeri- tai hiivaisännässä jossakin edellä olevassa patenttivaatimuksessa määritellyn polypeptidin. 106471

10. Bakteeri- tai hiivaisäntäsolu, tunnettu siitä, että se on transformoitu plasmidisella ilmentämisvektorilla, joka koodaa jossakin edellä olevassa patenttivaatimuksessa määritellyn polypeptidin. I · I • « · • « « « « · · « « < • · • · · • · · • · • · · • · • · «·· • 1 1 • · · • · · • · • · * 1 1 • · · • · ··· < < « • · 1 · • · • · 106471