FI106206B - Menetelmä polypeptidin valmistamiseksi - Google Patents

Description

Menetelmä polypeptidin valmistamiseksi 106206 Förfarande för framställning av polypeptid Tämä keksintö koskee uutta, yhdistelmägeenitekniikan avulla s saatua polypeptidiä, jolla on samanlaisia aktiivisuuksia kuin ihmisen trombomoduliinilla kuten hyytymistä ehkäisevä (anti-koagulanttinen) aktiivisuus ja hyytymää hajottava (trombo-lyyttinen) aktiivisuus, deoksiribonukleiinihappo (jota tämän jälkeen nimitetään "DNA":ksi) fragmenttia, joka koodittaa to mainittua polypeptidiä ja menetelmää mainitun polypeptidin tuottamiseksi yhdistelmägeenitekniikan avulla. Tämä keksintö koskee myös vaikuttavaa ainetta, käytettäväksi yliherkkään hyytymiskykyyn (hyperkoagulabiliteettiin) liittyvien sairauksien ehkäisyyn ja/tai hoitoon, joka aine sisältää mainitun is polypeptidin aktiivisena aineosana.

Hepariinia, antitrombiini III:a ja vastaavia yhdisteitä käytetään tällä hetkellä antikoagulantteina. Mitä tulee trombolyyt-tisesti vaikuttaviin aineisiin, virtsasta tai viljellyistä 20 munuaissoluista eristetty urokinaasi, hemolyyttisestä streptokokista eristetty streptokinaasi ja vastaavat yhdisteet on sovellettu käytäntöön, samoin kuin äskettäin kehitetty kudos-plasminogeenin aktivaattori.

25 Näillä yhdisteillä on kuitenkin sivuvaikutuksia kuten veren-vuototaipumus, ja niissä esiintyy vain yhtä aktiivisuutta, antikoagulanttista aktiivisuutta tai trombolyyttistä aktiivisuutta .

30 Perustutkimuksen alueella N.L. Esmon et ai.. (J. Biol. Chem. 257, s.859, 1982) ovat havainneet kanin keuhkokudosuutteessa yhdisteen, jolla on inhiboiva vaikutus veren hyytymiseen ja tehostava vaikutus aktivoidun proteiini C:n muodostumiseen,, joka lisää fibrinolyysiä, ja joka on nimetty trombomodu-35 liiniksi. Maryama et ai.. ovat raportoineet,. että trombomoduliini on trombiinin reseptori, joka sijaitsee verisuonten endoteelisoluissa, ja että trombiinilta katoaa sen . verta hyydyttävä aktiivisuus sen tullessa sidotuksi trombo- moduliiniin, 2 106206 ja trombiini-trombomoduliinikompleksi aktivoi proteiini C:n toteuttamaan hyytymistä estävän vaikutuksen (J. Clin. Invest., 75, s. 987, 1985). Toisin sanoen on mahdollista, että trombomoduliini vaikuttaa sekä veren hyytymistä ehkäisevästi 5 että fibrinolyysiä lisäävästi, ja siitä johtuen sitä voidaan käyttää kliinisiin tarkoituksiin.

Seuraavassa luodaan katsaus esimerkkeihin, koskien tähän mennessä raportoitua, ihmisen trombomoduliinin eristämistä. 10 Tässä tapauksessa, ellei toisin ole mainittu, jäljempänä mainittavat molekyylipainoja koskevat tiedot ovat sellaisia, jotka on määritetty ei-pelkistävissä olosuhteissa natriurado-dekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesin (SDS-PAGE) avulla.

15 P.W. Majerus et ai., ovat puhdistaneet trombomoduliinin ihmisen istukasta ja raportoineet sen molekyylipainoksi 75 K (J. Biol. Chem. , 259, s. 12246, 1984), kun taas Aoki et ai., ovat puhdistaneet trombomoduliinin ihmisen istukasta ja raportoi-20 neet sen molekyylipainoksi 71 K (Thrombosis Res., 37, s.

353, 1985; ja JP-patenttihakemus Kokai n.o 60-199819). Maru-yama et ai., ovat puhdistaneet trombomoduliinin ihmisen keuhkoista, ja raportoineet, että sen ominaisuudet olivat samat kuin istukasta saadut ominaisuudet (J. Clin. Invest., 75, 25 s. 987, 1985). Suzuki et ai. ovat lisäksi puhdistaneet osittain trombomoduliinin ihmisen verihiutaleesta ja määrittäneet sen molekyylipainoksi 78 K, ja raportoineet, että verihiutaleesta, istukasta ja keuhkoverisuonen endoteelisoluista saaduilla trombomoduliinivalmisteilla oli samat ominaisuudet 30 ilmoitettaessa elektroforeettisen käyttäytymisen ja affiniteettien muodossa trombiinia ja proteiini C:tä kohtaan (J. Biochem., 104, s. 628, 1988).

Näiden ihmisen elimistä puhdistettujen trombomoduliinimole-35 kyylien lisäksi (viitaten tämän jälkeen ilmauksella "ihmisen trombomoduliini”), seuraavista yhdisteistä, joilla on samanlaisia ominaisuuksia, on raportoitu (viitaten tämän jälkeen ilmauksella "trombomoduliinin kaltainen yhdiste").

3 106206 P.W. Majerus et ai. ovat puhdistaneet osittain kaksi ihmisen trombomoduliinin kaltaista yhdistettä ihmisen plasmasta, joiden molekyylipainot ovat 63 K ja vastaavasti 54 K, ja 5 raportoineet, että samanlaisia yhdisteitä esiintyi myös virtsassa (J. Clin. Invest., 75, s. 2178, 1985). Ishii et ai. ovat lisäksi raportoineet, että samanlaisia yhdisteitä, joiden molekyylipainot olivat 105 K, 63 K, 60 K, 33 K, 31 K ja 28 K (ei kuvausta siitä, olivatko kysymyksessä pelkistä-10 vät tai ei-pelkistävät määritysolosuhteet), erittyi virtsaan (Abstracts of Papers, the 108th Meeting of Pharmaceutical Society of Japan, 6F05, 11-1, 1988). Muut virtsasta saadut esimerkit ihmisen trombomoduliinin kaltaisista yhdisteistä käsittävät yhdisteseoksen, joiden yhdisteiden molekyylipai-15 not ovat 200 K, 48 K ja 40 K (JP-patenttihakemus Kokai n:o 63-30423), ja yhdisteitä, joiden mlekyylipainot ovat 39 K ja 31 K (JP-patenttihakemus Kokai n:o 63-146898).

C.T. Esmon et ai. ovat valmistaneet kemiallisesti synteti-20 soidun peptidin, joka vastaa trombomoduliinimolekyylin osaa (JP-patenttihakemus Kokai n.-o 2-19399).

Toisaalta, Suzuki et ai. ovat kloonanneet ihmisen trombomo-duliinin prekursorin geenin, joka prekursori sisältää sig-25 naalipeptidin, ihmisen keuhkojen cDNA-kirjastosta, käyttäen hyväksi geenitekniikan menetelmiä, määrittäneet geenin koko rakenteen ja osoittaneet 557 aminohappotähdettä sisältävän aminohapposekvenssin, jonka vieressä on 18 aminohappoa sisältävä signaalipeptidi, päättelemällä, että ihmisen trombo-30 moduliinin N-terminaalinen aminohapposekvenssi oli Ala Pro Ala Glu Pro (EMBO Journal, 6, s. 1891, 1987). Suzuki et ai. ovat lisäksi raportoineet, että geenitekniikan menetelmin avulla valmistetun, ihmisen trombomoduliinin aktiivisuus oli sama kuin biologisista kudoksista puhdistetun, ihmisen 35 luonnollisen trombomoduliinin aktiivisuus (J. Biol. Chem., 264. s. 4872, 1989), ja että ihmisen trombomoduliinin kaltainen aktiivisuus oli rajoittunut aminohapposekvenssin osaan aminohappotähteiden paikasta 345 paikkaan 462, nume- 4 106206 roituna sen aminopäästä, ja aktiivisuus katosi, kun jokin aminohappo aktiivisesta osasta poistettiin (J. Biol. Chem., 264. s. 10351, 1989; ja Abstracts of Papers, the 12th Meeting of International Society of Thrombosis and Hemostasis, 5 s. 334, kappalenumero 1039, 1989). Myös R.W. Jackman et ai. ovat määrittäneet ihmisen trombomoduliinin prekursorigeenin täydellisen rakenteen ja osoittaneet 559 aminohappotähdettä sisältävän aminohapposekvenssin, 16 aminohappoa sisältävän signaalipeptidin ollessa sekvenssin vieressä, päätellen 10 ihmisen trombomoduliinin N-terminaaliseksi aminohapposekvenssiksi Phe Pro Ala Pro Ala Glu Pro {Proc. Natl. Acad.

Sei. USA, 84, s. 6425, 1987). Myös D. Wen et ai. ovat kloonanneet trombomoduliinin prekursorin geenin ihmisen napanuo-ralaskimon cDNA-kirjastosta, määrittäneet geenin koko raken-15 teen ja osoittaneet 554 aminohappotähdettä sisältävän aminohapposekvenssin, 21 aminohappoa sisältävän signaalipeptidin ollessa sekvenssin vieressä, päätellen ihmisen trombomoduliinin N-terminaaliseksi aminohapposekvenssiksi Glu Pro (Biochemistry, 26, s. 4350, 1987).

20

Myös Andersen et al^. ovat yrittäneet tuottaa ihmisen trombomoduliinin kaltaista yhdistettä, joka vastaa ihmisen trombomoduliinin kaltaisen molekyylin osaa, geenitekniikan menetelmien avulla (kansainvälinen patenttihakemus WO 88/09811). 25 * P.W. Majerus et ai. ovat lisäksi kehittäneet ihmisen trombo moduliinin cDNA-kloonin geeniteknisin menetelmin, ja onnistuneet ilmentämään proteiinimolekyylin, jolla on ihmisen trombomoduliinin täydellinen aminohapposekvenssi (JP-patent-30 tihakemus Kokai n:o 63-301791).

Tämän keksinnön mukaisesti on eristetty ihmisen trombomoduliinin prekursorin geeni ihmisen cDNA-kirjastosta, valmistettu erilaisia DNA-fragmentteja sen rakenneosista ja lii-35 tetty näitä fragmentteja mikro-organismeihin ja soluihin DNA-fragmenttien koodittamien polypeptidien biologisten aktiivisuuksien tutkimiseksi. Tämän keksinnön mukaisesti on toisen tutkimussarjan tuloksena eristetty trombomoduliinin 5 106206 kaltainen yhdiste ihmisen virtsasta, jonka yhdisteen molekyylipai-no on 72 K (EP patenttijulkaisu 376251), ja osoitettu, että sen rakenne ja aktiivisuus poikkeavat ihmisen trombomoduliinimolekyy-leille jo raportoiduista rakenteesta ja aktiivisuudesta. Tätä uut-s ta yhdistettä nimitetään tämän jälkeen "ihmisen virtsan trombomo-duliiniksi". Tämän keksinnön mukaisesti on valmistettu DNA-fragmentteja, yhden koodittaessa polypeptidiä, jolla on sama aminohapposekvenssi kuin tällä ihmisen virtsan trombomoduliinilla, ja toisten fragmenttien koodattaessa polypeptidin johdannaisia, jois-10 sa jotkut aminohapposekvenssin aminohapoista oli modifioitu sub stituution, deleetion ja vastaavien menettelyjen avulla, siten valmistetut DNA-fragmentit on liitetty mikroorganismeihin ja soluihin, isännässä ilmennettyjä polypeptidejä on otettu talteen ja niiden biologiset aktiivisuudet on tarkistettu, ja sen seurauksena 15 on onnistuttu saamaan uusia polypeptidejä, joista kullakin on trombiinia sitova kyky, antikoagulanttista aktiivisuutta ja trom-bolyyttistä aktiivisuutta, toteuttaen sillä tavalla tätä keksintöä. Näitä uusia polypeptidejä nimitetään tämän jälkeen ihmisen virtsan yhdistelmätrombomoduliiniksi (ruTM).

20 Tämä keksintö koskee patenttivaatimuksen 1 mukaista menetelmää uuden, yhdistelmä-DNAtekniikan avulla saadun polypeptidin valmistamiseksi, jolla polypeptidillä on samanlaisia aktiivisuuksia kuin ihmisen trombomoduliinilla kuten hyytymistä ehkäisevä (antikoagu-25 lanttinen) aktiivisuus ja hyytymää hajottava (trombolyyttinen) aktiivisuus, sekä patenttivaatimuksen 6 mukaista, mainittua polypeptidiä koodittavaa DNA-fragmenttia. Keksinnön mukaisesti valmistetulla polypeptidillä on trombiinia sitova kyky, veren hyytymistä estävä aktiivisuus ja trombolyyttinen aktiivisuus, ja polypeptidi 30 sisältää seuraavassa kaavassa esitettävän aminohapposekvenssin.

• ·« Tämän keksinnön mukaisesti kutakin aminohappoa kuvailtiin käyttäen kolmikirjainkoodia alkaen N-päästä. Tässä käytettävät aminohappo-' jen numerot 6 106206 pohjautuvat Suzukin et ai. ihmisen trombomoduliinille raportoimiin numeroihin (EMBO Journal, 6, s. 1891, 1987).

Polypeptidi, joka sisältää seuraavan kaavan mukaisesti esi-5 tettävän aminohapposekvenssin:

Xa Glu Pro Gin Pro Gly Gly Ser Gin Cys Vai Glu 5 10

His Asp Cys Phe Ala Leu Tyr Pro Gly Pro Ala Thr 10 15 20 25

Phe Leu Asn Ala Ser Gin Ile Cys Asp Gly Leu Arg 30 35

Gly His Leu Met Thr Vai Arg Ser Ser Vai Ala Ala 40 45 50 15 Asp Vai Ile Ser Leu Leu Leu Asn Gly Asp Gly Gly 55 60

Vai Gly Arg Arg Arg Leu Trp Ile Gly Leu Gin Leu 65 70

Pro Pro Gly Cys Gly Asp Pro Lys Arg Leu Gly Pro 20 75 80 85

Leu Arg Gly Phe Gin Trp Vai Thr Gly Asp Asn Asn 90 95

Thr Ser Tyr Ser Arg Trp Ala Arg Leu Asp Leu Asn 100 105 110 25 Gly Ala Pro Leu Cys Gly Pro Leu Cys Vai Ala Vai 115 120

Ser Ala Ala Glu Ala Thr Vai Pro Ser Glu Pro Ile 125 130

Trp Glu Glu Gin Gin Cys Glu Vai Lys Ala Asp Gly 30 135 140 145

Phe Leu Cys Glu Phe His Phe Pro Ala Thr Cys Arg 150 155

Pro Leu Ala Vai Glu Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala 160 165 170 35 Vai Ser Ile Thr Tyr Gly Thr Pro Phe Ala Ala Arg 175 180

Gly Ala Asp Phe Gin Ala Leu Pro Vai Gly Ser Ser - - 185 190 106206

Ala Ala Vai Ala Pro Leu Gly Leu Gin Leu Met Cys 195 200 205

Thr Ala Pro Pro Gly Ala Vai Gin Gly His Trp Ala 210 215 5 Arg Glu Ala Pro Gly Ala Trp Asp Cys Ser Vai Glu 220 225 230

Asn Gly Gly Cys Glu His Ala Cys Asn Ala Ile Pro 235 240

Gly Ala Pro Arg Cys Gin Cys Pro Ala Gly Ala Ala 10 245 250

Leu Gin Ala Asp Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala 255 260 265

Thr Gin Ser Cys Asn Asp Leu Cys Glu His Phe Cys 270 275 15 Vai Pro Asn Pro Asp Gin Pro Gly Ser Tyr Ser Cys 280 285 290

Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gin 295 300

His Arg Cys Glu Asp Vai Asp Asp Cys Ile Leu Glu 20 305 310

Pro Ser Pro Cys Pro Gin Arg Cys Vai Asn Thr Gin 315 320 325

Gly Gly Phe Glu Cys His Cys Tyr Pro Asn Tyr Asp 330 335 25 Leu Vai Asp Gly Glu Cys Vai Glu Pro Vai Asp Pro 340 345 350

Cys Phe Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gin Cys Gin Pro 355 360

Leu Asn Gin Thr Ser Tyr Leu Cys Vai Cys Ala Glu 30 365 370

Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu Pro His Arg Cys 375 380 385

Gin Met Phe Cys Asn Gin Thr Ala Cys Pro Ala Asp 390 395 35 Cys Asp Pro Asn Thr Gin Ala Ser Cys Glu Cys Pro 400 405 410

Glu Gly Tyr Ile Leu Asp Asp Gly ,Phe Ile Cys Thr ΐ 415 420 106206 . 8

Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe Cys Ser 425 430

Gly Vai Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys 435 440 445 5 Ya [tässä kaavassa, X» on sekvenssi, joka on seuraavan kaavan mukainen 10 Met Leu Gly Vai Leu Vai Leu Gly Ala Leu Ala Leu -15 -10

Ala Gly Leu Gly Phe Pro Ala Pro Ala -5 -1 1 15 tai sen muunnos, jossa valinnainen lukumäärä aminohappoja tai kaikki aminohapot on poistettu alkaen sekvenssin N-pääs-tä, ja Y» on seuraavan kaavan mukainen sekvenssi:

Ile Cys Gly Pro Asp Ser Ala Leu Z Arg His 20 450 455 [tässä tapauksessa Z on Vai tai Ala] tai sen muunnos, jossa valinnainen lukumäärä aminohappoja tai kaikki aminohapot on poistettu alkaen sekvenssin C-päas-tä], edullisesti polypeptidi, jolla on edellä oleva araino-25 happosekvenssi, jossa sekvenssissä X» seuraavan kaavan mu-. kainen sekvenssi:

Ala Pro Ala 1 30 ja Yi on seuraavan kaavan mukainen sekvenssi:

Ile Cys Gly Pro Asp Ser Ala Leu Z Arg 450 455 [tässä tapauksessa Z on Vai tai Ala] 35 tai sen muunnos, jossa valinnainen määrä aminohappoja tai kaikki aminohapot on poistettu alkaen sekvenssin C-päästä.

Edullisemmin polypeptidi, joka sisältää edellä olevan amino- 9 106206 happosekvenssin, jossa XÄ on seuraavan kaavan mukainen sekvenssi :

Ala Pro Ala 5 1 ja Y» on seuraavan kaavan mukainen sekvenssi:

Ile Cys Gly Pro Asp Ser Ala Leu Z Arg 450 455 10 [tässä tapauksessa Z on Vai tai Ala] tai polypeptidi, joka sisältää edellä olevan aminohapposekvenssin, jossa Xi on seuraavan kaavan mukainen sekvenssi:

Ala Pro Ala 15 1 ja kaikki Yi:n aminohapot on poistettu.

Tämän keksinnön mukaisessa polypeptidissä vähintään yhdessä edellä olevassa aminohapposekvenssissä olevassa aminohapos-20 sa voi lisäksi olla tai ei voi olla sokeriketju. Tässä yhteydessä käytettäessä, ilmaus "sokeriketju" tarkoittaa yhtä sokeria tai usean sokerin käsittämää suoraa ketjua tai haarautunutta ketjua, joka voi olla niin sanotun N-glykosidisen sidostyypin muodossa tai O-glykosidisen sidostyypin muodos-25 sa. On tunnettua, että trombomoduliinin aktiivisuus muuttuu riippuen sokeriketjujen sidostyypistä. O-glykosidisen sidos-tyypin esimerkiksi ollessa kysymyksessä, Parkinson, J.F. et ai. ovat raportoineet äskettäin, että geeniteknisin menetelmin valmistetussa ihmisen trombomoduliinissa oli kondroi-30 tiinisulfaatti-tyyppinen sokeriketju (J. Biol. Chem., 265, s. 12602, 1990). Sellainen sokeriketjun sisältävä polypeptidi luetaan myös tämän keksinnön piiriin kuuluvaksi.

Viime vuosina saavutetuista korkeista teknisistä tasoista 35 johtuen, osa polypeptidin kemiallisesta rakenteesta voidaan helposti muuttaa, muuttamatta sen aktiivisuutta. Mikä tahansa polypeptidi, joka sisältää aminohapposekvenssin, joka on saatu modifioimalla osittain edellä mainittua aminohapposek- 1° 106206 venssiä substituution, deleetion, addition tai vastaan toiminnan avulla, luetaan niin muodoin myös tämän keksinnön piiriin kuuluvaksi.

5 Tämän keksinnön mukaisesti annetaan käyttöön DNA-fragmentti, joka koodittaa edellä mainittua keksinnön mukaista polypep-tidiä. Tämän keksinnön mukainen DNA-fragmentti sisältää myös minkä tahansa fragmentin, joka sisältää nukleotidisekvens-sin, joka koodittaa edellä mainittua, keksinnön mukaisen 10 polypeptidin modifioitua polypeptidiä, joka on saatu substituution, deleetion, addition tai vastaavan toiminnan avulla.

Tämän keksinnön mukainen DNA-fragmentti voi olla mikä tahansa fragmentti edellyttäen, että se sisältää nukleotidisek-15 venssin, joka koodittaa keksinnön mukaista polypeptidiä, mutta se voi edullisesti sisältää seuraavan kaavan mukaisesti esitettävän nukleotidisekvenssin. Tässä tapauksessa DNA-fragmentin nukleotidisekvenssi esitetään alkaen sen 5’-päästä . Tässä tauksessa myöskin A, G, C ja T ilmaisevat deok-20 siadenyylihappoa, deoksiguanyylihappoa, deoksisytidyylihap-poa ja vastaavasti -tymidyylihappoa.

Xa GAGCCGC AGCCGGGTGG CAGCCAGTGC GTCGAGCACG 100 ACTGCTTCGC GCTCTACCCG GGCCCCGCGA CCTTCCTCAA 140 25 TGCCAGTCAG ATCTGCGACG GACTGCGGGG CCACCTAATG 180 . ACAGTGCGCT CCTCGGTGGC TGCCGATGTC ATTTCCTTGC 220 TACTGAACGG CGACGGCGGC GTTGGCCGCC GGCGCCTCTG 260 GATCGGCCTG CAGCTGCCAC CCGGCTGCGG CGACCCCAAG 300 CGCCTCGGGC CCCTGCGCGG CTTCCAGTGG GTTACGGGAG 340 30 ACAACAACAC CAGCTATAGC AGGTGGGCAC GGCTCGACCT 380 CAATGGGGCT CCCCTCTGCG GCCCGTTGTG CGTCGCTGTC 420 TCCGCTGCTG AGGCCACTGT GCCCAGCGAG CCGATCTGGG 460 AGGAGCAGCA GTGCGAAGTG AAGGCCGATG GCTTCCTCTG 500 CGAGTTCCAC TTCCCAGCCA CCTGCAGGCC ACTGGCTGTG 540 35 GAGCCCGGCG CCGCGGCTGC CGCCGTCTCG ATCACCTACG 580 GCACCCCGTT CGCGGCCCGC GGAGCGGACT TCCAGGCGCT 620 GCCGGTGGGC AGCTCCGCCG CGGTGGCTCC CCTCGGCTTA 660 CAGCTAATGT GCACCGCGCC GCCCGGAGCG GTCCAGGGGC 700 11 106206 ACTGGGCCAG GGAGGCGCCG GGCGCTTGGG ACTGCAGCGT 740 GGAGAACGGC GGCTGCGAGC ACGCGTGCAA TGCGATCCCT 780 GGGGCTCCCC GCTGCCAGTG CCCAGCCGGC GCCGCCCTGC 820 AGGCAGACGG GCGCTCCTGC ACCGCATCCG CGACGCAGTC 860 5 CTGCAACGAC CTCTGCGAGC ACTTCTGCGT TCCCAACCCC 900 GACCAGCCGG GCTCCTACTC GTGCATGTGC GAGACCGGCT 940 ACCGGCTGGC GGCCGACCAA CACCGGTGCG AGGACGTGGA 980 TGACTGCATA CTGGAGCCCA GTCCGTGTCC GCAGCGCTGT 1020 GTCAACACAC AGGGTGGCTT CGAGTGCCAC TGCTACCCTA 1060 10 ACTACGACCT GGTGGACGGC GAGTGTGTSG AGCCCGTGGA 1100 CCCGTGCTTC AGAGCCAACT GCGAGTACCA GTGCCAGCCC 1140 CTGAACCAAA CTAGCTACCT CTGCGTCTGC GCCGAGGGCT 1180 TCGCGCCCAT TCCCCACGAG CCGCACAGGT GCCAGATGTT 1220 TTGCAACCAG ACTGCCTGTC CAGCCGACTG CGACCCCAAC 1260 15 ACCCAGGCTA GCTGTGAGTG CCCTGAAGGC TACATCCTGG 1300 ACGACGGTTT CATCTGCACG GACATCGACG AGTGCGAAAA 1340 CGGCGGCTTC TGCTCCGGGG TGTGCCACAA CCTCCCCGGT 1380 ACCTTCGAGT GC Y* 1392 20 [tässä kaavassa S on G tai C; X* on oheisen kaavan mukaisesti esitetty sekvenssi: ATGCTTGGGG TCCTGGTCCT TGGCGCGCTG GCCCTGGCCG 40 GCCTGGGGTT CCCCGCWCCC GCA 63 25 . [edellyttäen, että W on T tai A] tai sen muunnos, jossa valinnainen määrä tai kaikki nukleotidit on poistettu tripletteinä, alkaen sekvenssin 5’-pääs-30 tä; ja Ya on oheisen kaavan mukaisesti esitetty sekvenssi: ACTTGCGGGC CCGACTCGGC CCTTGYCCGC CAC 1425 [edellyttäen, että Y on T tai C] tai sen muunnos, jossa valinnainen määrä tai kaikki nukleotidit on poistettu tripletteinä, alkaen sekvenssin 3'-päästä] .

35 106206

Edellä olevan nukleotidisekvenssin lisäksi, tämän keksinnön mukainen DNA-fragmentti voi sisältää sopivan promoottorin ja SD-sekvenssin (tai sopivan ribosomin sitoutumiskohdan) 5 sitoutuneena sen 5'-päähän, ja tarvittaessa nukleotidisekvenssin, joka sisältää luennan aloituskodonin sitoutuneena sen 5'-päähän, ja nukleotidisekvenssin, joka sisältää lope-tuskodonin, sitoutuneena 3'-päähän.

10 DNA-fragmentin sisältämässä nukleotidisekvenssissä XÄ on edullisemmin oheisen kaavan mukaisesti esitetty sekvenssi ATCTGCGGGC CCGACTCGGC CCTTGYCCGC 1422 [tässä tapauksessa Y on T tai C]; 15 tai XÄ on oheisen kaavan mukaisesti esitetty sekvenssi: GCWCCCGCA 63 [tässä kaavassa W on T tai A] 20 ja kaikki YÄ:n nukleotidit on poistettu.

Kuten hyvin tiedetään, vähintään yksi nukleotidi geenissä voidaan korvata toisella nukleotidillä kodonin degeneraation 25 mukaisesti, muuttamatta geenin koodittaman polypeptidin . aminohapposekvenssiä. Tämän keksinnön mukainen DNA-fragment ti voi siis sisältää nukleotidisekvenssin, joka on peräisin edellä olevasta keksinnöllisestä nukleotidisekvenssistä, jossa vähintään yksi nukleotidi on korvattu toisella nukle-30 otidillä kodonin degeneraation mukaisesti, erityisesti nukleotidisekvenssin, jossa vähintään yksi nukleotidi on korvattu toisella nukleotidillä sillä tavalla, että tuloksena olevalla kodonilla esiintyy korkea käyttöfrekvenssi tietyssä isäntäsolussa, kun tämän keksinnön mukaista polypeptidiä 35 tuotetaan käyttäen hyväksi geenitekniikan menetelmiä.

Tämän keksinnön mukainen DNA-fragmentti voidaan valmistaa luonnollisesta lähteestä tai syntetisoida kemiallisesti.

13 106206

Seuraavassa kuvaillaan esimerkkejä sellaisista prosesseista.

Siinä tapauksessa, että käytetään luonnollista lähdettä, tämän keksinnön mukainen DNA-fragmentti voidaan saada val-5 mistamalla DNA-fragmentti, joka koodittaa keksinnöllistä nukleotidisekvenssiä, käyttämällä luonnollista lähdettä kuten cDNA-kirjastoa, joka on valmistettu soluista tai kudoksista, jotka sisältävät trombomoduliinin mRNA:ta, kaupallisesti saatavaa cDNA-kirjastoa tai kromosomaalista geeniä, 10 ja sen jälkeen muuntamalla siten valmistettu fragmentti keksinnön mukaiseksi fragmentiksi.

Kun tarkoituksena on valmistaa cDNA-kirjasto, mRNA:ta uutetaan ihmisen kudoksista tai ihmisen soluista, jotka sisältä-15 vät ihmisen trombomoduliinin mRNA:ta, tunnetun menetelmän mukaisesti (esimerkiksi, Molecular Cloning, a laboratory manual, T. Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). Seuraavaksi valmistetaan yksijuosteista cDNA:ta, käyttäen saatua mRNA:ta templaattina, jota seuraa kaksijuos-20 teisen cDNA;n synteesi yksijuosteisesta cDNA.-sta (vrt. Molecular Cloning, a laboratory manual, mainittu edellä; Land'in menetelmä julkaisussa Nucleic Acids Research, 9, ss. 2251-2266, 1981,- Okayama-Berg'in menetelmä julkaisussa Mol. Cell. Biol., 2, ss. 161-170, 1982; ja Gubler-Hoffman’in menetelmä 25 julkaisussa Gene, 25, s. 263, 1983). Siten saadut kaksijuos-. teiset cDNA-fragmentit kloonataan plasmidivektoriin kuten pBR322:een, pUC18:ta tai vastaavaan vektoriin, tai faagivektoriin kuten lambda gtl0:een, lambda gtll:ta tai vastaavaan faagivektoriin, ja transformoidaan sen jälkeen E. coliin 30 tai vastaavaan cDNA-kirjaston saamiseksi.

Kun kromosomaalista geeniä käytetään DNA-lähteenä, kromoso-maalinen DNA uutetaan ihmisen kudoksista tai ihmisen soluista, uutettu DNA pilkotaan sopivilla restriktioentsyymeillä 35 tai fysikaalisin keinoin, pilkotut fragmentit kloonataan plasmidi- tai faagivektoriin, ja sen jälkeen tuloksena oleva vektori transformoidaan E. coliin tai vastaavaan DNA-kirjas-ton saamiseksi.

14 106206

Keksinnön mukaista nukleotidisekvenssiä koodittava DNA-frag-mentti ilmaistaan sen jälkeen ja eristetään siten saadusta DNA-kirjastosta. Se tarkoittaa, että tämän keksinnön mukai-5 sesti koodittava plasraidi- tai faagi-DNA ilmaistaan tavallisesti käytettyjen menetelmien avulla kuten hybridisaatiome-netelmän avulla (Wallace et ai., Nucleic Acids Research, 9, s.879, 1981), ja mainittu DNA eristetään sen jälkeen siten ilmaistusta plasmidista tai faagista. DNA- tai RNA-fragment-10 ti, joka on syntetisoitu sillä tavalla, että se koodittaa tämän keksinnön mukaisen polypeptidin koko aminohapposekvenssiä tai sen osaa, kuten tässä on tuotu esille, voidaan radioleimata sopivan koettimen saamiseksi. Radioleimaus voidaan yleensä saada aikaan leimaamalla DNA-fragmentti tai 15 RNA-fragmentti 3ÄP:n avulla, käyttäen hyväksi kinaatiota, katkoluentaa, sattumanvaraista synteesin aloitusta tai vastaavaa menetelmää.

Edellä mainitun menetelmän avulla DNA-kirjastosta siten 20 eristetty DNA-fragmentti voidaan muuntaa tämän keksinnön mukaiseksi DNA-fragmentiksi seuraavalla tavalla. Edullisena esimerkkinä, DNA-kirjastosta siten saatu DNA-fragmentti voidaan esimerkiksi pilkkoa restriktioentsyymien avulla, jolloin saadaan haluttuja DNA-fragmentteja. Tästä erillään 25 syntetisoidaan kemiallisesti jäljempänä kuvailtavan menetelmän avulla nukleotidisekvenssi, joka koodittaa tämän keksinnön mukaisen polypeptidin N-terminaalista ja C-terminaalista aluetta sekä lopetuskodoni, restriktioentsyymin tunnistus-kohta, luennan aloituskodoni ja vastaavia kohtia. Sopivan 30 synteettisen linkkerin liittämisen jälkeen siten syntetisoituihin sekvensseihin ja kodoneihin, ne liitetään edellä saatuihin DNA-fragmentteihin, ja liitetään sen jälkeen plas-midi- tai faagivektoriin kiinnostuksen kohteena olevana DNA-fragmenttina. Kun oligonukleotidejä syntetisoidaan kemialli-35 sesti, on mahdollista sopiva vaihto nukleotidisekvenssissä.

Polymeraasiketjureaktiota (tämän jälkeen nimitetty : "PCR’^ksi) voidaan myös käyttää toisena edullisena menetel- 15 106206 mänä. Se tarkoittaa sitä, että oligonukleotidit, jotka sisältävät nukleotidisekvenssejä, jotka koodittavat tämän keksinnön mukaisen polypeptidin N-terminaalista aluetta, C-terminaalista aluetta ja välissä olevaa aluetta, syntetisoi-5 daan kemiallisesti, tai näiden oligonukleotidien sisältäessä tarvittaessa lopetuskodonin, sopivia restriktiokohtia, luennan aloituskodonin ja vastaavia osia. Käyttämällä siten syntetisoituja oligonukleotidejä alukkeina, DNA-kirjastosta edellä mainitulla menetelmällä eristetty DNA-fragmentti 10 saatetaan PCR:ään, ja saadaan tämän keksinnön mukainen DNA-fragmentti. Alukkeisiin voidaan liittää myös sopiva nukle-otidikorvaus. Edellä mainittu DNA-kirjasto voidaan vaihtoehtoisesti saattaa suoraan PCRrään, käyttäen hyväksi näitä alukkeita tämän keksinnön mukaisen DNA-fragmentin monistami-15 seksi ja eristämiseksi, jotka fragmentit kloonataan sen jälkeen sopivaan plasmidi- tai faagivektoriin. PCR-menetelmä voidaan suorittaa viitejulkaisujen tai kirjan mukaisesti (PCR Protocols, A Guide to methods and applications, Michael, A.I. et ai., Academic Press, 1990).

20

Edellä mainittujen menetelmien lisäksi saatavilla voi olla muita yleisesti käytettyjä menetelmiä kuten Kramer W. et ai.'in menetelmä (Nucleic Acids Res., 12, ss. 9441-9465, 1984), ja paikkakohdennettu mutatointi (Methods in Enzymolo-25 gy, 154, ss. 350-367, 1988).

Toisaalta, kun keksinnön mukainen fragmentti valmistetaan kemiallisen synteesin avulla, kiinnostuksen kohteena oleva nukleotidisekvenssi konstruoidaan ja tarvittaessa jaetaan 30 sopivan pituisiksi fragmenteiksi, ja sen jälkeen vastaavat oligomeerit syntetisoidaan kemiallisesti, käyttäen täysauto-maattista DNA m synteesilaitetta (esimerkiksi Model 381A, valmistajana Applied Biosystems, Inc.). Siten saatu DNA-oligomeeri voidaan tarvittaessa fosforyloida DNA:n 5'-pääs-35 tä, käyttäen T4 polynukleotidikinaasia, jota seuraa tekeminen kaksijuosteiseksi. Lisäksi on mahdollista tarvittaessa kloonata tuloksena oleva DNA-fragmentti sopivaan vektoriin ‘ käyttäen T4 DNA -ligaasia.

16 106206 Tämän keksinnön mukaisesti annetaan käyttöön menetelmä tämän keksinnön mukaisen polypeptidin valmistamiseksi, joka menetelmä käsittää vähintään yhden vaiheen suorittamisen seuraa-5 vista vaiheista: a) valmistetaan DNA-fragmentti, joka sisältää nukleotidisek-venssin, joka koodittaa mainittua polypeptidiä, 10 b) liitetään mainittu DNA-fragmentti ekspressiovektoriin yhdistelmä-DNA-fragmentin saamiseksi, joka sisältää mainitun DNA-fragmentin ja kykenee replikoituinaan, c) transformoidaan isäntäsolu mainitulla yhdistelmä-DNA-15 fragmentilla transformantin eristämistä varten, joka voi ilmentää mainitun polypeptidin, ja d) viljellään mainittua transformanttia mainitun polypeptidin tuottamiseksi, ja otetaan mainittu polypeptidi talteen 20 tuloksena olevasta viljelyseoksesta.

DNA-fragmentti, joka sisältää tämän keksinnön mukaista polypeptidiä koodittavan nukleotidisekvenssin, voidaan saada aikaan edellä mainituin keinoin.

25 ’ Mitä tahansa vektorisysteemejä voidaan käyttää tämän mene telmän mukaisena ekspressiovektorina edellyttäen, että vektori kykenee replikoitumaan käytettävässä isännässä, mutta edullisesti voidaan käyttää vektoria, joka sisältää promoot-30 torin, joka on välttämätön polypeptidin ilmenemiselle isännässä, ja tarvittaessa SD-sekvenssin (tai sopivan ribosomin sitoutumisalueen) ja/tai DNA-sekvenssin, joka koodittaa signaalipeptidiä. Kaikkia promoottoreja, SD-sekvenssejä (tai sopivia ribosomin sitoutumisalueita) ja nukleotidisekvensse-35 jä, jotka koodittavat signaalipeptidiä, jotka toimivat isännässä, voidaan käyttää, ja jotka voidaan saada aikaan kemiallisen synteesin avulla tai saada käytettävistä isännistä, viruksista, plasmideista, faageista ja niiden kaltaisis- 17 106206 ta.

Koskien isäntäsoluja, joita on tarkoitus käyttää siten saadun yhdistelmä-DNA-fraginentin siirtämiseksi, sopivia isäntiä 5 tämän keksinnön mukaisen polypeptidin ilmentämiseksi voidaan valikoida joko eukaryoottisista soluista kuten COS-solut, CHO-solut, hiivat ja vastaavat solut, tai prokaryoottisista soluista kuten E. coli. Bacillus subtilis ja vastaavat solut, joista COS-solut ja CHO-solut ovat erityisen edullisia. 10 On tehokasta käyttää isäntää ja ekspressiovektoria sellaisena yhdistelmänä, että ne voivat ilmentää tehokkaasti DNA-fragmenttia, joka koodittaa keksinnön mukaista polypeptidiä. Edullisia esimerkkejä isäntäsolujen ja ekspressiovektoreiden yhdistelmästä ovat: COS-7-solut tai CHO-solut, jotka sisäl-15 tävät ekspressiovektorin, joka sisältää ihmisapinan virus 40:n (SV40) aikaisen promoottorin, pHBAPr-neo:n, joka sisältää ihraisen β-aktiinin promoottorin tai nisäkkään ekspres-sioventorin, joka on saatu pCDL-SRa296:sta, joka sisältää SRa-promoottorin; ja E. coli HB101, joka sisältää ekspres-20 siovektorin, joka sisältää DNA-fragmentin, joka koodittaa tryptofaanipromoottoria ja tryptofäänin SD-sekvenssin.

Ekspressiovektorilla siten transformoitua isäntää voidaan viljellä mikro-organismien tai eläinsolujen viljelyyn ylei-25 sesti käytetyillä menetelmillä, menetelmän mukaisesti, joka on esitetty esimerkiksi julkaisussa Seibutsu Kagaku Kogaku (tai Biochemical Engineering; S. Aiba et ai.., 1976, Tokyo University Press) tai Soshiki Baiyo (tai Tissue Culture; J. Nakai et ai., 1976, Asakura Shoten). Transformoitujen isän-30 täsolujen avulla siten tuotettu polypeptidi otetaan talteen eristämällä ja puhdistamalla se viljelyseoksesta. Polypeptidin puhdistaminen voidaan suorittaa usean erilaisen yleisesti käytetyn menetelmän mukaisesti, joita on tuotu esille monissa selostuksissa ja kirjoissa kuten Seigaku Jikken Koza 35 (tai Biochemical Experiments; voi. I, Protein Chemistry, 1976, editorina The Japanese Biochemical Society, Tokyo Kagaku Dojin), käyttäen esimerkiksi sopivaa puhdistamismene-telmien yhdistelmää valikoituna ryhmästä dialyysi, poisto- 18 106206 suolaus, geelisuodatus, happosaostus, ioninvaihtokromatogra-fia, affiniteettikromatografia, suuren erotuskyvyn kromato-grafia, elektroforeesi ja vastaavat puhdistusmenetelmät. Tämän keksinnön mukainen polypeptidi voidaan edullisesti S ottaa talteen viljelyalustasta, käyttäen hyväksi vähintään yhtä menetelmää valikoituna ryhmästä ioninvaihtokromatogra-fia, affiniteettikromatografia, jossa trombiinia käytetään ligandina, ja geelikromatografia.

10 Esimerkiksi, viljelty seos, joka sisältää tämän keksinnön mukaisen polypeptidin, poistosuolataan ja väkevöidään ensin, käyttäen hyväksi esimerkiksi ultrasuodatusmembraania, jonka rajamolekyylipaino on 30 000. Seuraavaksi, siten väkevöity viljelyseos säädetään pH-arvoon 5-10, edullisesti pH-arvoon 15 7,3 ± 0,2, sitä käsitellään 50-70eC:ssa 5-45 minuutin ajan, edullisesti 60 ± 5eC:ssa 15 ± 5 minuuttia, proteaasien inaktivoimiseksi, ja sijoitetaan sen jälkeen kolonniin, joka on pakattu anioninvaihtohartsilla, jota on tasapainotettu pH-arvoon 5,5-7,5, edullisesti pH-arvoon 6,5 ± 0,2. Siten 20 adsorboitu aktiivinen fraktio eluoidaan eluentin avulla, jonka pH-arvo on 2-4,5, edullisesti 4,0 ± 0,05. Tuloksena oleva eluaatti poistosuolataan ja väkevöidään, käyttäen ultrasuodatusmembraania, jonka rajamolekyylipaino on 30 000. Kun pH on säädetty arvoon 7,5, siten väkevöity eluaatti 25 affiniteettikolonnikromatografoidaan, jossa trombiinia käytetään ligandina, tuloksena saatu kolonni pestään puskuriliuoksella, joka sisältää 0,05-0,3 M NaCl:a, edullisesti 0,1 ± 0,05 M NaCl.a, aktiivinen fraktio eluoidaan eluentin avulla, joka sisältää 0,9-2,0 M NaCl:a, edullisesti 1,0 ± 0,05 30 M NaCl:a. Poistosuolauksen ja väkevöinnin jälkeen, siten väkevöity eluaatti affiniteettikolonnikromatografoidaan jälleen, jossa kolonnissa trombiinia käytetään ligandina, tuloksena saatu kolonni pestään puskuriliuoksella, joka sisältää 0,3-0,8 M NaCl.-a, edullisesti 0,7 ± 0,1 M NaCl: a, 35 ja sen jälkeen aktiivinen fraktio eluoidaan eluentin kanssa, joka sisältää 0,9-2,0 M NaCl:a, edullisesti 1,0 ± 0,05 M NaCl:a. Tämän jälkeen siten eluoitu polypeptidi poistosuolataan ja väkevöidään, ja kolonnikroraatografoidaan geelisuo- 19 106206 dattaen, jolloin saadaan aktiivinen fraktio, joka vastaa tämän keksinnön mukaista polypeptidiä, josta keksinnöllinen polypeptidi voidaan saada puhdistetussa muodossa. Tämän keksinnön mukainen polypeptidi voidaan vaihtoehtoisesti S saada puhdistetussa muodossa poistosuolaamalla ja väkevöi-mällä edellä mainitusta affiniteettikolonnista eluoitu fraktio, ja sijoittamalla sen jälkeen väkevöity fraktio SDS-PAGEreen ei-pelkistävissä olosuhteissa. Siten saatu tämän keksinnön mukainen polypeptidi voidaan valmistaa farmakolo-10 gisesti-hyväksyttävään muotoon inaktivoimalla virukset lämpökäsittelyllä 60 ± 2°C:SBa 10 tunnin ajan.

Esimerkkejä edellä mainittuun puhdistusprosessiin sopivista anioninvaihtohartseista lukeutuvat DEAE-selluloosa, DEAE-15 Sepharose, DEAE-Cellulofine ja vastaavat hartsit, kun taas edellä mainittu affiniteettikolonni, jossa trombiinia käytetään ligandina, voidaan valmistaa sitomalla trombiini kantajaan kuten selluloosaan, agaroosiin, dekstraaniin tai vastaavaan kantajaan, käyttäen syanogeenibromidia, ja käsitte-20 lemällä tuloksena saatavaa hartsia di-isopropyylifluorifos-faatilla (DIP), fenyylimetaanisulfonyylifluoridilla tai vastaavasti. Geelisuodatuksessa käytettävänä hartsina Seph-acryl S-200, Sephacryl S-300, Sephadex G150 tai vastaava hartsi voi olla tehokas.

25 Käyttämällä edellä kuvailtua menettelyä, tämän keksinnön mukainen polypeptidi voidaan saada puhtaassa muodossa. Samaa menettelyä käyttämällä voidaan saada myös erilaista yhdistettä, jolla on samankaltaiset ominaisuudet.

30

Seuraavassa kuvaillaan tämän keksinnön mukaisen polypeptidin toimintoja ja ominaisuuksia.

(Kokeellinen esimerkki 1) Affiniteetti trombiiniin (antit-35 rombiinivaikutus) a) Kun pKCR-TM-Val-alkuperäistä, esimerkin 3 mukaisesti valmistettua ihmisen virtsan yhdistelmätrorabomoduliinia 106206 20 (tämän jälkeen viitataan tunnuksella "ruTM-Val") ja toista, esimerkissä 6-(2) valmistettua ihmisen virtsan yhdistelmä-trombomoduliinia (tämän jälkeen viitataan tunnuksella "ruTM-Ala") käsitellään kromatografisesti, käyttäen DIP-trombiini-5 agaroosia, ne adsorboituvat trombiinin vaikutuksesta lähes 100 %:n tarkkuudella.

b) 100 μ1:η erä naudan trombiiniliuosta (1 U/ml, valmistajana Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.) sekoitetaan 100 μ1:η 10 kanssa liuosta, joka sisältää ruTM-Val:ia tai ruTM-Ala:aa, siten sekoitettua liuosta inkuboidaan 37°C:ssa 30 minuutin ajan, ja tuloksena olevaan liuokseen sekoitetaan sen jälkeen 100 μΐ ihmisen fibrinogeeniliuosta (2 mg/ml, valmistajana Sigma Chemical Co.) hyytymisajan mittaamiseksi, käyttäen 15 hyytymisraittaria (valmistajana Amelung Co. Ltd.).

Tulokset esitetään taulukossa 1.

Taulukko 1 20 Lääkeaineet Pitoisuus (ΟΡ28ο) Hyytymisaika (sekuntia) Kontrolli — 37,8 ruTM-Val 0,01 > 500 ruTM-Ala 0,01 > 500 25

Kuten näistä tuloksista käy ilmi, ruTM-Val:11a ja ruTM-Ala:-11a on toimintoja, joilla sitoutua trombiiniin ja ehkäistä voimakkaasti sen hyytymisaktiivisuutta.

30 Taulukossa 2 esitetään tuloksia, jotka on esitetty JP-pa- tenttihakemuksessa Kokai n:o 62-169728, koskien hyytymisai-kaa, joka on mitattu käyttäen trombomoduliinin kaltaista yhdistettä, joka on puhdistettu ihmisen istukasta.

35 21 106206

Taulukko 2 Lääkeaine Pitoisuus Hyytymisaika (ODzeo) (sekuntia) 5 Kontrolli — 35,8

Ihmisen istukka 0,42 62,3

Trombomoduliinin kaltainen yhdiste 0,84 109,9 10

Lisäksi, juuri esimerkkinä mainitun julkaisun mukaisesti kuvaillaan sitä, että tällä ihmisen istukan trombomoduliinin kaltaisella yhdisteellä on kaksi kertaa tai enemmän korkeampi aktiivisuus kuin olemassa olevalla ihmisen trombomodu-15 liinilla, mikä siten johtaa päätelmään, että taulukoissa 1 ja 2 esitettyjen tulosten vertailusta ilmenee, että ruTM-Val:lla ja ruTM-Ala:lla ort voimakkaampi antitrombiiniaktii-visuus kuin olemassa olevalla ihmisen trombomoduliinilla.

20 (Kokeellinen esimerkki 2) Proteiini C:tä aktivoiva kyky

Proteiini C.-tä aktivoiva kyky määritetään trombiinin läsnä ollessa, käyttäen synteettistä substraattia Boc-Leu-Ser-Thr-Arg-MCA (valmistajana Peptide Research Institute, Protein 25 Research Foundation). Se tarkoittaa, että 60 μΐ.-aan 0,1 M

Tris-HCl-puskuria (pH 7,5) sekoitetaan 20 μΐ naudan 10 U/ml trombiiniliuosta (valmistajana Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.), 10 μΐ liuosta, joka sisältää esimerkissä 6—(2) saatua ruTM-Ala.-aa, ja ihmisen virtsan mutaatiotyyppistä yhdistel-30 mä-trombomoduliinia (nimitettynä tämän jälkeen tunnuksella "DEL 10"), josta 10 aminohappotähdettä on poistettu ihmisen virtsan trombomoduliinin C-päästä (0,1- 10 μβ/πιΐ kaikkiaan), ja 10 μΐ ihmisen 500 μδ/πιΐ proteiini C-liuosta (American Diagnostics, Inc.), tässä järjestyksessä. Inkuboinnin jäl-35 keen 37^0:388 30 minuutin ajan, tuloksena olevaan reaktio-seokseen sekoitetaan 150 μΐ liuosseosta, joka sisältää samassa tilavuudessa ihmisen 1 U/ral antitrombiinia (valmistajana The Green Cross Corporation) ja 10 U/ml hepariinia 22 106206 (valmistajana Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.), jota seuraa inkubointi 37eC:Ssa vielä 15 minuutin ajan. Seuraavaksi, tuloksena olevaan reaktioseokseen sekoitetaan 250 ui 0,1 mM liuosta edellä mainittua synteettistä substraattia ja inku-5 boidaan 37eC:ssa 10 minuutin ajan reaktion saattamiseksi loppuun, joka sen jälkeen pysäytetään lisäämällä 500 μΐ 20 %.-ista etikkahappoliuosta. Reaktioliuoksesta mitataan sen jälkeen fluoresenssin voimakkuus käyttäen fluorofotometriä (Hitachi, Ltd.) viritysaallonpituudessa 380 nm ja emissio-10 aallonpituudessa 460 nm. Tässä tapauksessa positiivisena kontrollina käytettiin ihmisen istukasta viite-esimerkin mukaisesti puhdistettua ihmisen istukan trombomoduliinia. Taulukossa 3 esitetyn mukaisesti, fluoresenssin intensiteetistä lasketut ruTM-Ala:n ja DEL 10:n proteiini C:tä akti-15 voivat kyvyt ovat selvästi korkeampia trombiinin läsnä ollessa, verrattuna ihmisen istukan trombomoduliinin vastaavaan kykyyn.

Taulukko 3 20 Aktiivisuus 11 ruTM-Ala 3,8 DEL 10 4,1

Ihmisen istukan trombomoduliini 1,0 25 _ 1: Suhteellinen aktiivisuus, kun ihmisen istukan trombomoduliinin aktiivisuudeksi määritellään 1.

30 (Kokeellinen esimerkki 3) Hyytymistä estävä aktiivisuus 100 μ1.·η erään sitruunahappoa sisältävää, terveestä henkilöstä saatua plasmanäytettä, jonka verihiutalemäärä on vähäinen, sekoitetaan 10 μΐ liuosta, joka sisältää ruTM-Val:ia 35 tai ruTM-Ala:aa (10-100 pg/ml), siten valmistettua seosta inkuboidaan 37°C:ssa 2 minuutin ajan, ja sen jälkeen reak-tioliuokseen sekoitetaan 100 μΐ ihmisen trombiinia (valmistajana Green Cross Corporation, 2 U/ml) hyytymisajan mittaa- 23 106206 miseksi ja ruTM-Val:n ja ruTM-Alam voimakkaan funktion selville saamiseksi pitkittää veren hyytymisaikaa.

(Kokeellinen esimerkki 4) Akuutti toksisuus hiirissä 5

Kun ruTM-Val:ia tai ruTM-Ala:aa annettiin intravenoosisesti ruiskuttamalla 5:lie ddY-uroshiiriyksilölle ja tehtiin havaintoja 7 päivän ajan, yhtään merkittävää toksisuustapausta tai kuolemaa ei havaittu tehokkaan annoksen puitteissa.

10 (Kokeellinen esimerkki 5) Liukoisuus ruTM-Val ja ruTM-Ala liukenivat huoneen lämpötilassa tislattuun veteen vähintään pitoisuuteen 30 mg/ml.

15

Lisäksi, annettaessa intravenoosisesti in vivo, vesiliukoisella ruTMrllä esiintyy erinomainen DIC:tä parantava funktio, verrattuna heikosti liukoiseen istukan trombomodulii-niin, jolla on fosfolipidiä sitova kyky.

20

Koska tämän keksinnön mukaisella polypeptidillä siis on voimakkaasti trombiinia sitova kyky, hyytymistä ehkäisevä aktiivisuus ja trombolyyttinen aktiivisuus, ja koska sen toksisuus on alhainen, mikä ilmenee edellä olevasta kuvauk-25 sesta ja kokeista, keksinnöllistä polypeptidiä voidaan tehokkaasti käyttää yliherkkään hyytymiskykyyn liittyvien sairauksien kuten DIC.-n, erityyppisten tromboosien, perifeerisen suonitukoksen, sydänlihaskuolion, aivokudoskuolion, isoaivoperäisen iskeemisen kohtauksen, raskausmyrkytyksen, 30 maksan vajaatoiminnan, munuaisten vajaatoiminnan ja vastaavien sairauksien ehkäisemiseen ja hoitoon.

Tämän keksinnön mukainen polypeptidi voidaan valmistaa farmaseuttisiksi valmisteiksi, edullisesti ruiskeiksi, jotka 35 sopivat tehokkaaseen antamiseen potilaille, sekoittamalla sitä sopivan kantajan tai alustan kanssa kuten steriilin veden, fysiologisen saliinin, kasviöljyn, myrkyttömän orgaanisen liuottimen tai vastaavan kantajan tai alustan kans- 2i 106206 sa, joita käytetään yleisesti lääkeaineina, ja tarvittaessa lisäksi täyteaineen, väriaineen, emulgoivan aineen, suspen-doivan aineen, stabiloivan aineen, säilöntäaineen tai vastaavan aineen kanssa. Kun tämän keksinnön mukaista polypep-S tidiä käytetään ruiskeena, se voidaan antaa kullekin potilaalle yhdellä kertaa tai jatkuvina annoksina, jakamalla sen päivittäisannos 1-6 kerta-annokseen. Tämän keksinnön mukaisen polypeptidin päiväannos voi olla potenssialueella 0,05-500 mg, edullisesti 10 mg:n väkevyydessä, laskettuna 10 arvona, ilmaistuna kanin keuhkojen trombomoduliinin potenssin avulla, vaikka annosta voidaan muuttaa, riippuen kunkin potilaan iästä, painosta, oireista ja vastaavista tekijöistä .

15 Tämän keksinnön mukaista polypeptidiä voidaan lisäksi käyttää sitomalla tai adsorboimalla se lääketieteellisten välineiden pintaan kuten keinotekoisten verisuonten, keinotekoisten elinten, katetrien ja vastaavien välineiden pintaan, käyttäen hyväksi silloittavaa ainetta tai vastaavaa. Sellai-20 sella käsittelyllä voidaan estää veren hyytyminen lääketieteellisen välineen pinnalla.

Tämän keksinnön mukaisia esimerkkejä esitetään jäljempänä keksinnön valaisemiseksi eikä sen rajoittamiseksi. Tässä 25 yhteydessä käytettävät lyhenteet perustuvat tällä tieteen alalla käytettyihin idiomaattisiin ilmaisuihin.

Geneettisiin yhdistelmä-DNA-tekniikoihin liittyviä kokeita suoritettiin, ellei toisin ole mainittu, seuraavien kirjojen 30 mukaisesti, "Maniatis T. et ai.. Molecular Cloning, Cold

Spring Harbor Laboratory, 1982" ja "S. Kobayashi, Handbook for Gene Manipulation Experiments, JATEC Publishers, 1985", ja ohjeiden mukaisesti, jotka oli liitetty ostettuihin rea-gensseihin ja laitteisiin. Niin ikään, ellei toisin ole 35 mainittu, restriktioentsyymit, joita seuraavissa kokeissa käytettiin, ostettiin Takara Shuzo Co., Ltd*Itä tai New England Biolabs, Inc.'lta.

25 106206 ruTM-Ala:aa runsaasti ilmentävä kanta, TMM-B1C, jota on käytetty seuraavissa esimerkeissä, on talletettu 25. kesäkuuta 1991 Fermentation Research Institute'een, Agency of Industrial Science and Technology, ja sille on annettu tun-5 nus FERM BP-3463.

Esimerkki 1

Trombomoduliinin cDNA:n kloonaus ja ekspressioplasmidin 10 konstruointi 1) Trombomoduliinin cDNArn kloonaus

Kuviossa 1 esitettävä oligonukleotidikoetin valmistettiin 15 käyttämällä DNA:n synteesilaitetta (mainittu edellä), joka pohjautui aminohapposekvenssiin

Glu His Asp Cys Phe Ala, 15 20 joka on osa ihmisen virtsan trombomoduliinin N-terminaali-sesta aminohapposekvenssistä, joka trombomoduliini on eristetty ihmisen virtsasta. Siten syntetisoitu oligonukleotidi puhdistettiin käyttäen OPC-kolonnia (Applied Biosystems, 25 Inc.), ja sen 5*-pää leimattiin käyttäen T4 polynukleotidi - ..... kinaasia (Takara Shuzo Co., Ltd.) ja £γ-®ζΡ] ATP:tä (Amers- ham). Tämän jälkeen tuloksena oleva reaktioliuos sijoitettiin Sephadex G-25-kolonniin (Pharmacia) leimatun oligonule-otidikoettimen erottamiseksi [γ-33ίΡ] ATP:stä, käytettäväksi 30 seuraavassa menetelmässä koettimena.

RNA-kokonaisuus valmistettiin noin 20 g.*n erästä ihmisen istukkaa guanidiini-isotiosyanaattiuuton avulla. 10 mg siten uutettua kokonais-RNA:ta kromatografoitiin kahdesti oligo 35 (dT)-selluloosalla· (tyyppi 7, Pharmacia), jolloin saatiin noin 90 ug puhdistettua poly A* RNArta, jota seurasi cDNAm konstruointi käyttäen siten saatua poly A·*· RNA.-ta. Se tarkoittaa sitä, että kaksijuosteista cDNA:ta valmistettiin 26 106206

(käyttämällä cDNA:n syntetisointisysteemiä, Amershara) 20 Ug:sta poly A* RNA.-ta käyttäen oligo dT:tä alukkeena Guble-rin ja Hoffmanin menetelmällä (Gubler, U. ja Hoffman, B.J., Gene, 25, s. 263, 1983). Siten saatu cDNA metyloitiin käyt-5 täen EcoRI-metylaasia. ja sen jälkeen liitettiin EcoRI-link-kerit. Pilkkomisen jälkeen EcoRI:llä, vapaa linkkeri ja DNA-fragmentit, jotka sisälsivät vähemmän kuin 500 emäsparia (ep), poistettiin geelisuodatuksen avulla (BioGel ASOm, Bio-Rad Laboratories). Tuloksena saatu DNA-fragmentti kloonat-10 tiin faagivektoriin lambda gtll (Amersham) cDNA-kirjaston valmistamiseksi, noin 90 %:n tehokkuudella, ja sisältäen 2 x 10® itsenäistä kloonia. Siten valmistetun lambda gtll-kirjaston sisältämät faagipartikkelit maljattiin E. coli-isäntäkantaan Y1090 tavanomaiseen tapaan, siirroksen koon 15 ollessa sellainen, että plakkeja muodostui noin 5 x 10® maljaa kohti, joiden maljojen halkaisja oli 9 cm. Siten muodostuneet plakit siirrettiin nailonsuotimille (Hybond-N, Amersham), ja tuloksena saadut suotimet asetettiin suodinpa-perin päälle, joka oli kastettu 1,5 M NaCl/0,5 M NaOH-liuok-20 sessa 5 minuutin ajaksi, ja tämän jälkeen 1,5 M NaCl/0,5 M

Tris-HCl-puskurissa (pH 8,0) 5 minuutin ajaksi DNA:n denatu-roimiseksi. Siten käsitellyt nailonsuotimet pestiin tämän jälkeen 0,36 M NaCl/20 mM natriumfosfaatti (pH 7,4)/2 mM EDTA (pH 7,4)-liuoksella ja ilmakuivattiin sen jälkeen.

25 Suotimilla olevan DNA .-n kiinnittämisen jälkeen ultraviolet-tisäteilytyksen avulla, tuloksena olevat suotimet pestiin 0,1 % SDS/x 0,1 SSC-liuoksella (SSC: xl-pitoisuus; 150 mM NaCl/15 mM natriumsitraatti, pH 7,0) 65*»C:ssa yhden tunnin ajan. Sillä tavalla DNA-fiksoituja suotimia esihybridisoi-30 tiin SS^C.-ssa 6-24 tuntia liuoksessa, joka sisälsi x6 SSC:tä/50 mM natriumfosfaattipuskuria (pH 6,8)/xl Denhardt’-in liuosta/100 ug/ml denaturoitua lohen sperman DNA:ta, jota seurasi yli yön kestänyt hybridisointi 37^0:ssa samassa liuoksessa, johon oli lisätty noin 10® cpm/ml edellä mainit-35 tua 5’-päästä leimattua oligonukleotidiä. Suotimia pestiin x6 SSC:llä 5-30 minuutin ajan 4°C:ssa, 37®C:ssa ja 42°C:ssa siinä järjestyksessä, ilmakuivattiin ja sen jälkeen autora-diografoitiin.

27 106206

Tarkistamalla edellä mainitun menetelmän avulla noin 3 x 10«· plakkia, kaikkiaan 23 positiivisen reaktion koettimen kanssa osoittavaa kloonia eristettiin. Kun jokainen siten 5 eristetyistä faagiklooneista oli muodostettu plakeiksi, edellä oleva hybridisaatiomenettely toistettiin, jolloin saatiin 9 kloonia, jotka jälleen osoittivat positiivisen signaalin, ja joista faagi-DNA-näytteet otettiin talteen. Pilkottaessa restriktioentsyymi EcoRI:llä. lambda gtll:ssa 10 havaittiin 0,7-2,5 kiloemästä (ke) sisältävää liittynyttä DNA:ta. Suurimman 2,5 ke liittyneen DNA:n restriktiokartta esitetään kuviossa 2. Kaksi DNA-fragmenttia, jotka oli saatu katkaisemalla EcoRI:llä ja PstI:llä 2,5 ke liittynyt DNA, eristettiin ja subkloonattiin M13-faagiin, mpl8:ta tai 15 mpl9:ta, EcoRI- ja Pstl-kloonauskohtien väliin tavanomaiseen tapaan yksijuosteisen faagi-DNA:n valmistamiseksi, ja sek-vensoitiin DNA:n sekvensointilaitteella {370A, Applied Bio-systems, Inc.). Sen seurauksena havaittiin sekvenssi, joka vastaa ihmisen trombomoduliinin N-terminaalista sekvenssiä, 20 aminohapposekvenssissä, joka oli johdettu noin 0,4 ke EcoRI /PstI-DNA-fragmentin nukleotidisekvenssistä, mikä varmisti sen, että kloonattu cDNA on ihmisen virtsan trombomoduliinin. Kuvioissa 3(a) - 3(m) esitetään tulokset 2,5 ke DNA-fragmentin nukleotidisekvenssistä.

25 (2) Ihmisen virtsan yhdistelraätrombomoduliinin ekspressio-vektorin konstruointi

Ekspressioplasmidin konstruointi nisäkässoluissa käyttöä 30 varten (Kuviot 4(a) - 4(b))

Trombomoduliinin 2,5 ke cDNA pilkottiin EcoRI .-llä ja saatettiin agaroosigeelielektroforeesiin, ja geelistä eristetyt DNA-fragmentit subkloonattiin plasmidiin pUC118. Siten val-35 mistettu plasmidi-DNA pilkottiin EcoRI:llä. ja sen jälkeen 3’-pään eripituiset päät täytetään käyttäen T4 DNA -polyme-raasia (Takara Shuzo Co., Ltd.). BamHI-linkkerit (kytkijät) (Takara Shuzo Co., Ltd.) yhdistettiin tasapituisiksi tehtyi- 28 106206 hin päihin käyttäen ligaatioreagenssipakkausta (Takara Shuzo Co., Ltd.), ja tuloksena saatu DNA-fragmentti kaksoispilkot-tiin BamHI:llä ja Kpnl:llä. jota seurasi elektroforesointi noin 1,5 ke DNA-fragmentin eristämiseksi geelistä.

5

Edellä mainittua DNA:n synteesilaitetta käyttämällä saatiin kaksi synteettistä oligonukleotidilinkkeriä {kukin linkkeri valmistettiin ryhmästä, joka sisälsi komplementaarisen 49-meerisen ja 53-meerisen oligonukleotidin) kuten kuviossa 10 5(a) esitetään, jokaisen linkkerin alkaessa ihmisen virtsan trombomoduliinin cDNA:n Kpnl-kohdasta. joka koodittaa ihmisen virtsan trombomoduliinin C-terminaalista aminohapposekvenssiä (Leu Ala Arg), ja päättyessä juuri terminaalisen sekvenssin jälkeen terminaalisen kodonin ja BamHI-kohdan 15 luona. Tässä tapauksessa, jokaisen yksijuosteisen oligonukleotidin puhdistaminen suoritettiin käyttäen käänteisfaasi-HPLC:tä (C8-kolonni, AQUAPORE RP-30, Applied Biosystems, Inc.). 49-meerioligonukleotidi fosforyloitiin 5’-päästä käyttäen T4 polynukleotidikinaasia (mainittu edellä), ja 20 tehtiin sen jälkeen kaksijuosteiseksi 53-meerisen oligonukleotidin kanssa.

Linkkeri ligoitiin tämän jälkeen noin 1,5 ke sisältävän, trombomoduliinin cDNA.-n aikaisemmin valmistetun BamHI/Kpnl -25 fragmentin kanssa (mainittu edellä), ja pilkottiin BamHI:-llä, ja sen jälkeen pilkotut DNA-fragmentit agaroosigeeli-elektroforesoitiin 1,6 ke DNA-fragmentin eristämiseksi. Toisaalta, nisäkässoluissa oleva ekspressiovektori, pKCR (O'Hara, K. et ad . , Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 78, s. 1527, 30 1981), pilkottiin BamHI .-llä ja käsiteltiin sen jälkeen fos- fataasin kanssa (Takara Shuzo Co., Ltd.), jolloin saatiin : lineaarinen DNA-fragmentti, joka sen jälkeen ligoitiin (mai nittu edellä) 1,6 ke DNA-fragmentin kanssa, ihmisen virtsan trombomoduliinin ekspressioplasmidien, pKCR-TM-Ala ja pKCR-35 TM-Val, valmistamiseksi nisäkässoluissa.

Ekspressioplasmidin konstruointi E. colissa (kuviot 6(a) -- : 6(b)) 29 106206

Kumpikin edellä mainituista plasmideista, pKCR-TM-Ala ja pKCR-TM-Val, kaksoispilkottiin BamHI .-llä ja Smal: llä, ja tuloksena saatu 1,3 ke DNA-fragmentti eristettiin agaroosi-5 geelielektroforeesin avulla. Tämän jälkeen valmistettiin samalla tavalla kuin edellä on kuvailtu oligonukleotidilink-keri, joka sisälsi 69-meerisen ja 67-meerisen synteettisen oligonukleotidin kuten kuviossa 5(b) on esitetty. 67-meeri-nen oligonukleotidi fosforyloitiin käyttäen nukleotidikinaa-10 siä ja tehtiin sen jälkeen kaksijuosteiseksi 69-meerisen oligonukleotidin kanssa, tuloksena oleva linkkeri ligoitiin edellä mainitun 1,3 ke DNA-fragmentin kanssa ja kaksoispilkottiin Smal:llä ja BamHI:llä. Toisaalta, plasmidi pM450 (Kanamori, T. et ai.., Gene, 66, ss. 295-300, 1988) kaksois-15 pilkottiin BamHI:llä ja Ndel:llä ja agaroosigeelielektrofo-resoitiin noin 3,2 ke DNA-fragmentin eristämiseksi. Siten valmistettu, 3,2 ke DNA-fragmentti ligoitiin kummankin kahden, edellä saadun linkkerikytkeisen trombomoduliinin cDNA-fragmentin kanssa plasmidien pM450-TM-Ala ja pM450-TM-Val 20 valmistamiseksi ihmisen virtsan yhdistelmätrombomoduliinin ilmentämiseksi E. colissa.

Esimerkki 2 25 Trombomoduliinin cDNA:n kloonaus ja ekspressioplasmidin konstruointi (1) Trombomoduliinin cDNA:n kloonaus 30 Yksijuosteista cDNArta valmistettiin 10 ug:sta poly A"· RNA: -. ta, joka oli peräisin esimerkissä 1—(1) saadusta ihmisen istukasta, käyttäen oligo-dT-aluketta ja käänteistä tran-skriptaasia (Takara Shuzo Co., Ltd.) tavalliseen tapaan.

35 Tästä erillään valmistettiin kaikkiaan 6 oligonukleotidiä (kuvio 7), käyttäen DNA:n synteesiisitetta (mainittu edellä), joista jokainen vastasi nukleotidisekvenssiä, joka kooditti osaa ihmisen virtsan trombomoduliinin cDNA-fragmen- 106206 tista, joka saatiin esimerkissä 1-(1), sen 5’-pään sisältäessä tunnistuskohdan restriktioentsyymille ryhmästä Sali, ' BamHI. EcoRI. HindiII tai PstI. Tässä tapauksessa, kukin SI-, S2- ja S3-oligonukleotideistä vastaa osaa ihmisen virt-5 san tromboraoduliinin "+"-juosteesta, kun taas kukin AI-, A2- ja A3-oligonukleotideistä vastaa osaa "-"-juosteesta. Myös tässä tapauksessa Xhol-kohta liitettiin S3-oligonukle-otidiin hiljaisen mutaation avulla. Myös A3-oligonukleotidi sisältää DNA-sekvenssin, joka vastaa lopetuskodonia. Siten 10 syntetisoidut trombomoduliinille spesifiset oligonukleoti-dialukkeet puhdistettiin käyttäen OPC-kolonnia (mainittu edellä).

Tämän jälkeen suoritettiin PCR (polymeraasiketjureaktio) 15 käyttäen yksijuosteista cDNA.-ta templaattina ja kemiallisesti syntetisoituja oligonukleotidejä alukkeina, jolloin saatiin ihmisen virtsan trombomoduliinin cDNA:ta, jakamalla se kolmeen osaan. Se tarkoittaa sitä, että 100 μΐ reaktioliuos-ta, joka sisälsi 10 mM Tris-HCl:ää (pH 8,3)/50 mM 20 KCl:ää/l,5 mM MgCl»:ta/0,01 % gelatiiniliuosta, joka sisälsi noin 50 ng yksijuosteista cDNA:ta, 0,8 ug kutakin aluket-ta (SI ja AI) ja 2,5 yksikköä lämpökestoista DNA-polymeraa-sia (Perkin-Elmer Cetus), sijoitettiin Thermal Cycler-lait-teeseen (Perkin-Elmer Cetus), ja PCR suoritettiin olosuh-25 teissä: kaksi ruosteiseksi tekeminen, 55*»c 2 minuutin ajan; komplementaarisen juosteen synteesi, 72^0 3 minuutin ajan; lämpödenaturaatio, 94^0 1 minuutin ajan; ja syklien määrä 30. Puhdistamisen jälkeen fenoli/kloroformiuutolla ja eta-nolisaostuksella, saatiin monistettua DNA-fragmentti I:tä, 30 jonka koko oli noin 450 emäsparia (ep). PCR-menettely toistettiin samaan tapaan, paitsi että S2:ta ja A2:ta tai S3:a - : ja A3:a käytettiin alukkeina noin 650 ep DNA-fragmentti II:n saamiseksi ja noin 350 ep DNA-fragmentti III:n saamiseksi. Siten valmistetut fragmentit I, II ja III pilkottiin Sall/-35 BamHI:llä. HindiII/Seal:llä ja vastaavasti PstI/BamHI:llä, ja subkloonattiin plasmidiin pUC118 tavanomaiseen tapaan, jolloin saatiin pUC118-FI, pUC118-FII ja pUC118-FIII.

3i 106206

Siten PCR:n avulla saatujen, ihmisen virtsan trombomodulii-nin cDNA:n kolme DNA-fragmenttia yhdistettiin toisiinsa seuraavalla tavalla cDNA-fragmentin konstruoimiseksi, joka koodittaa signaalipeptidiä ja kokonaista valmista proteii-5 nia, täydennettynä lopetuskodonilla 3’-päässä.

PUC118-FI pilkottiin ensin Hindlll:11a ja BamHI:llä. ja pilkontatuotteet agaroosigeelielektroforesoitiin tavanomaisella tavalla DNA-fragmentin eristämiseksi, jonka koko on 10 noin 450 ep. Siten eristetty DNA-fragmentti pilkottiin edelleen Ddel:llä, ja pilkontatuotteet puhdistettiin DNA-fragmentin FI eristämiseksi, jonka 5’- ja 3'-päässä on kohesii-viset Hindlll- ja Ddel-päät. Samalla tavalla saatiin toinen DNA-fragmentti FII, jonka koko on noin 650 ep, ja jonka 5’-15 ja 3’-päässä on kohesiiviset Ddel- ja Sali-päät, pilkkomalla pUC118-FII Hindlll:11a ja Sali:llä, erottamalla tuloksena saadut pilkontatuotteet, pilkkomalla Ddel:llä ja puhdistamalla kiinnostuksen kohteena oleva fragmentti. Samoin saatiin vielä myös toinen DNA-fragmentti Fill, jonka koko on 20 noin 350 ep, ja jonka 5’- ja 3'-päässä on kohesiiviset XhoI-ja EcoRI-päät. pilkkomalla pUCH8-FIII Xholrllä ja EcoRI:-llä, erottamalla tuloksena saadut pilkontatuotteet ja puhdistamalla kiinnostuksen kohteena oleva fragmentti. Tämän jälkeen fragmentit FI, FII ja Fill liitettiin pUC118:n Hin-25 dlll/EcoRI-kloonauskohtaan. jolloin saatiin plasmidi pUC- TM. (Konstruointiprosessi esitetään kuviossa 8). Kiinnostuksen kohteena oleva cDNA subkloonattiin tavanomaisella tavalla M13-faagiin, mpl8.-ta tai mpl9:ta, yksijuosteinen DNA-fragmentti valmistettiin oligonukleotidisekvenssin määrittä-30 miseksi DNA:n sekvensointilaitteella (mainittu edellä), varmistettiin, että tämä cDNA kooditti ihmisen virtsan trom-bomoduliinia. Tulokset nukleotidisekvenssimäärityksestä esitettiin kuvioissa 9(a) - 9(b).

35 (2) Ihmisen virtsan yhdistelmätrombomoduliinin ekspressio- vektorin konstruointi

Esimerkissä 2-(l) valmistetun, ihmisen virtsan trombomodu- 32 106206 liinin cDNA:n sisältävä plasmidi pUC-TM pilkottiin Sali:llä js BamHI.-llä, ja noin 1,4 ke DNA-fragmentti eristettiin ja puhdistettiin tavanomaisella tavalla käyttäen hyväksi aga-roosigeelielektroforeesia. Siten saatu fragmentti liitettiin 5 nisäkässoluille tarkoitetun pH|3APr-l~neo-ekspressiovektorin Sall-BamHI-kloonauskohtaan (P. Gunning et ai.., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 84, s. 4831, 1987), vektorin LK444-TM konstruoimiseksi yhdistelmätrombomoduliinin ilmentämistä varten. Tämän jälkeen plasmidi pAdD26SV (A) (R. Kaufman et ai.., Mol. 10 Cell. Biol., 2, s. 1304, 1982), joka sisältää geenin, joka koodittaa dihydrofolaattireduktaasia (tämän jälkeen viite-tunnuksella "DHFR"), pilkottiin Bgll:llä ja eripituiset päät täytettiin käyttäen T4 DNA -polymeraasia (mainittu edellä), ja fragmentti pilkottiin EcoRI:llä ja elektroforesoitiin 15 sen jälkeen agaroosigeelillä tavanomaisella tavalla DHFR-geenin sisältävän, noin 3 ke DNA-fragmentin eristämiseksi ja puhdistamiseksi. Tämän jälkeen edellä saatu ekspressio-vektori LK444-TM pilkottiin Aatl.-llä ja eripituiset päät täytettiin käyttäen T4 DNA -polymeraasia (mainittu edellä), 20 ja fragmentti pilkottiin EcoRI:llä ja elektroforesoitiin agaroosigeelillä tavanomaiseen tapaan noin 9 ke DNA-fragraen-tin eristämiseksi ja puhdistamiseksi. Sen jälkeen sillä tavalla valmistettu DNA-fragmentti ligoitiin aikaisemmin valmistetun, DHFR-geenin sisältävän DNA-fragmentin kanssa 25 tavanomaisella tavalla LK444-TM-DHFR.-n konstruoimiseksi. (Kuviot 10(a) - 10(b)).

Tämän jälkeen pUC-TM pilkottiin Sali:llä ja EcoRI:llä ja elektroforesoitiin agaroosigeelillä tavanomaisella tavalla 30 noin 1,4 ke pitkän DNA-fragmentin eristämiseksi ja puhdistamiseksi. Siten saatu DNA-fragmentti liitettiin yhdessä Pstl-. Sall-linkkerin kanssa (5’-TCGATGCA-3'), joka on valmistettu DNA:n synteesilaitteella (mainittu edellä) ja puhdistettu OPC-kolonnin avulla (mainittu edellä), Pstl/EcoRI-kloonaus-35 koh'taan ekspressiovektorissa pCDL-SRa296 nisäkässoluja varten (Y. Takabe et ai,., Mol. Cell. Biol., 8, s. 466, 1988), ihmisen virtsan trombomoduliinin ekspressiovektorin pCDSRa-TM konstruoimiseksi. Tämän jälkeen siten konstruoitu vektori 33 106206 pilkottiin Sali .· llä ja Clal:llä, katkaistut eripituiset päät täytettiin T4 DNA -polymeraasin avulla (mainittu edellä) ja elektroforesoitiin agaroosigeelillä tavanomaisella tavalla DNA-fragmentin eristämiseksi ja puhdistamiseksi, joka sisäl-5 tää ihmisen virtsan trombomoduliinin cDNA:n. Toisaalta, edellä mainittu LK444-TM-DHFR pilkottiin EcoRI.-llä ja Ndel: -llä, katkaistut eripituiset päät täytettiin T4 DNA -polymeraasin avulla (mainittu edellä) ja elektroforesoitiin agaroosigeelillä tavanomaisella tavalla DNA-fragmentin eristä-10 miseksi ja puhdistamiseksi, joka sisältää DHFR-geenin. Siten valmistettu DNA-fragraentti ligoitiin sen jälkeen aikaisemmin valmistetun DNA-fragmentin kanssa, joka sisältää ihmisen virtsan trombomoduliinin cDNAm, tavanomaisella tavalla pCDSRa-TM-DHFR:n konstruoimiseksi. (Kuviot 11(a) - 11(b)).

15

Esimerkki 3

Trombomoduliinin ilmentäminen 20 Kumpikin esimerkissä 1 valmistetuista plasmideista pKCR-TM-Ala ja pKCR-TN-Val transfektoitiin COS-7-soluihin (ATCC n.-o CRL1651) DEAE-dekstraanimenetelmän avulla yhdistelmätrombo-moduliinin ilmentämistä varten. Se tarkoittaa, että ennalta valmistetut, puoliksi yhteen kasvaneet COS-7-solut transfek-25 toitiin plasmidi-DNA:11a, suhteen ollessa noin 1 ug DNA:ta noin 2 x 10e solua kohti Lauren’in et el. menetelmän mukaisesti (Lauren, M., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 78, s. 7575, 1981). Siten käsiteltyjä soluja viljeltiin 3 päivän ajan käyttäen Dulbecco’n modifioimaa Eagle’n alustaa (tämän jäl-30 keen viitetunnuksella "D-ME-alusta"), johon on lisätty 0,01 % albumiinia, jota seurasi kasvuston supernatantin talteenotto, jolloin saatiin raaka ihmisen virtsan trombomoduliini-liuos. Transfektointi suoritettiin samalla tavalla, ja 10 l:n erä tuloksena saadusta kasvuston suodoksesta poistosuo-35 lättiin ja väkevöitiin, käyttäen hyväksi ultrasuodatusmem-braania, jonka rajaraolekyylipaino oli 30 000.

- * pH:n säätämisen jälkeen pH 7,3:ksi, kasvuston väkevöityä 34 106206 suodosta käsiteltiin eO^Cissa 15 minuutin ajan. Tuloksena saatu näyte sijoitettiin kolonniin, johon oli pakattu 300 ml DEAE-selluloosaa (Whatman), jota on tasapainotettu fosfaattipuskurissa etukäteen, kolonni pestiin 750 ml:11a samaa 5 puskuria, jota käytettiin tasapainotukseen, ja siten adsorboitu aktiivinen fraktio eluoitiin asetaattipuskurilla (pH 4,0).

Eluaatti väkevöitiin käyttäen ultrasuodatusmembraania, jonka 10 rajamolekyylipaino oli 30 000, sen pH säädettiin pH 7,5:ksi 2 M NaOH:n avulla ja se sijoitettiin sen jälkeen 2,5 ml:n DIP-trombiini-agaroosi-kolonniin, jota oli tasapainotettu 0,02 M Tris-HCl-puskurissa (pH 7,5), joka sisälsi 0,1 M NaCl:a, 1 mM bentsamidiinihydrokloridia ja 0,5 mM CaCl^a, 15 adsorboiden sillä tavalla aktiivinen fraktio. Kolonni pestiin tämän jälkeen 25 ml :11a samaa puskuria, jota käytettiin tasapainotukseen, ja aktiivinen fraktio eluoitiin sitten 0,02 M Tris-HCl-puskurilla (pH 7,5), joka sisälsi 1 M NaClra, 1 mM bentsamidiinihydrokloridia ja 0,5 mM EDTA:aa.

20 Eluaattia dialysoitiin samaa puskuria vastaan, jota käytettiin tasapainotukseen, ja se puhdistettiin DIP-trombiini-agaroosikolonnikromatografiän avulla samalla tavalla kuin edellä on kuvailtu.

25 Tuloksena saatu eluaatti väkevöitiin käyttäen ultrasuodatusmembraania, jonka rajamolekyylipaino oli 30 000, ja geeli-suodatettiin sen jälkeen käyttäen kolonnia, johon oli pakattu 500 ml Sephacryl S-300:aa (Pharmacia Fine Chemicals), jota oli tasapainotettu etukäteen 0,01 M fosfaattipuskurissa 30 (pH 7,0), joka sisälsi 0,14 M NaCl.-a, ottaen sillä tavalla kiinnostuksen kohteena oleva aktiivinen fraktio talteen.

j

Edellä olevan tuotantoprosessin toteutuksella saatiin noin 0,5 mg puhdistettua ihmisen virtsan yhdistelmätrombomodulii-35 nia kunkin viljelmän suodoksista, jotka olivat peräisin pKCR-TM-Ala:sta ja pKCR-TM-Val.sta. Kullakin siten puhdistetulla ihmisen virtsan yhdistelmätrombomoduliinilla esiintyi ' yksi ainoa vyöhyke ei-pelkistävän SDS-PAGE:n yhteydessä.

35 106206

Kummallakin esiintyi tarkastelun yhteydessä korkeita aktiivisuuksia .

Kun 300 pg kustakin tämän keksinnön mukaisesta polypeptidis-5 tä oli saatettu pelkistävään karboksimetylaatioon C.H.

Hirs'in et ai. menetelmän mukaisesti (Methods in Enzymol., 11. s. 199, 1967) ja sen jälkeen poistosuolaukseen, siten käsiteltyjen näytteiden N-terminaaliset aminohapposekvenssit määritettiin käyttäen kaasufaasista proteiinien sekvensoin-10 tilaitetta (Applied Biosystems, Inc., malli 470A), ja niiden C-terminaaliset aminohapposekvenssit analysoitiin karboksi-peptidaasimenetelmän avulla (Biochem. Biophys. Acta, 397, s. 443, 1975). Tulokseksi saatiin, että näiden kahden poly-peptidin N-terminaaliset ja C-terminaaliset aminohapposek-15 venssit olivat yhteneviä ihmisen virtsqan 72 K trorabomodu-liinin sekvenssien kanssa. Toisin sanoen, pKCR-TM-Ala-alku-peräisestä kasvusuodoksesta saadun polypeptidin aminohapposekvenssi oli, 20 N-terminaalinen: Ala Pro Ala Glu Pro Gin 1 5 C-terminaalinen: Leu Ala Arg 455 25 ja pKCR-TM-Val-peräisestä kasvusuodoksesta saadun polypeptidin aminohapposekvenssi oli seuraava.

N-terminaalinen: Ala Pro Ala Glu Pro Gin 30 15 ; C-terminaalinen: Leu Vai Arg 455 35 Esimerkki 4

Ihmisen virtsan trombomoduliinin ilmentäminen ♦ ♦ 36 106206

Esimerkissä 2 konstruoitu plasmidi pCDSRa-TM-DHFR transfek-toitiin CHO-soluihin elektroporaation avulla (Zerdifa’in et ai. julkaisussa Biochem. Biophys. Res. Comm., 129, s. 611, 1985, esittämää menetelmää modifioitiin hieman) seuraavalla 5 tavalla ihmisen virtsan yhdistelmätrombomoduliinin ilmentämistä varten.

Se tarkoittaa sitä, että CHO DXB11 -soluja (Urlaub, G. ja Chasin, L.A., Proc. Natl. Acad. Sei., 77, s. 4216, 1980) 10 viljeltiin 37°C:ssa 2 päivän ajan 5 % CO*:ta - 95 % ilmaa sisältävässä atmosfäärissä käyttäen Ham*in Fl2-alustaa (Flow Laboratories, Inc.), joka sisälsi 10 % naudan sikiön seerumia (Nippon Bio-supply Center Co., Ltd.) (tämänjälkeen vii-tetunnuksella "alusta-d)*), dispergoitiin trypsiini-EDTA-15 käsittelyllä ja suspendoitiin sitten 50 ml:aan tuoretta alusta-l.-tä. Siten valmistettua solususpensiota sentrifugoi-tiin nopeudessa 1000 rpm 5 minuutin ajan, käyttäen jäähdytettävää sentrifugia (Kokusan Enshinki Co., Ltd.). Superna-tantin hylkäämisen jälkeen tuloksena saadut solut suspendoi-20 tiin 50 ml:aan sakkaroosia sisältävää fosfaattipuskuria (540 mM sakkaroosia/7,0 mM natriumdivetyfosfaattixl2 HaO/4,2 mM magnesiumkloridia, pH 7,4) ja sentrifugoitiin 1000 rpm 5 minuutin ajan. Kun edellä oleva suspensiovaihe sakkaroosia sisältävässä fosfaattipuskurissa ja sitä seuraava sentrifu-25 gointivaihe oli toistettu, tuloksena saadut solut suspendoitiin sakkaroosia sisältävään fosfaattipuskuriin solutihey-teen 1 x 10solua/ml, ja 0,4 ml siten valmistettua solususpensiota siirrettiin elektroporaatiolaitteen kyvettiin, Gene-Pulser TM (BIO-RAD). Kyvettiin lisättiin lisäksi 0,4 30 ml plasmidia pCDSRa-TM-DHFR, joka oli valmistettu pitoisuuteen 50 ug/ml sakkaroosia sisältävää fosfaattipuskuria.

I Kyvetissä tuloksena saadun seoksen annettiin seistä 15 mi nuutin ajan jäähauteessa, ja saatettiin sen jälkeen elektro-poraatioon käyttäen Gene Pulser-laitetta. Siten käsiteltyjen 35 solujen annettiin sen jälkeen seistä kyvetissä 10 minuutin ajan jäähauteessa, ja sen jälkeen niistä valmistettiin 1 x 10^ solua/ml käsittävä solususpensio käyttäen alusta-l:tä.

: 10 ml siten valmistettua solususpensiota siirrettiin 10 cm 37 106206 halkaisijaltaan olevaan viljelymainaan ja viljeltiin 370C:-ssa 5 7c COa:ta - 95 % ilmaa sisältävässä atmosfäärissä. Kahden päivän viljelyn jälkeen viljelymaljän alusta poistettiin ja viljelyä jatkettiin lisäämällä maljaan 10 ml MEM 5 a(-) -alustaa (ei sisällä ribonukleosidejä eikä deoksiri- bonukleosidejä, valmistajana GIBCO), joka sisälsi 10 % läm-pöinaktivoitua ja dialysoitua naudan sikiön seerumia (mainittu edellä) (tämän jälkeen viitetunnuksella "alusta-®'). Viljelyä jatkettiin korvaamalla alusta-® tuoreella alustalla 10 joka 2-4. päivä, ja erillisiä pesäkkeitä, jotka sisälsivät 100-200 solua, eristettiin 16-19 päivän viljelyn jälkeen penisilliinikuppimenetelmän avulla. Talteen otetut solut siirrettiin 96-kaivoiselle levylle (A/S Nunc) ja viljeltiin käyttäen alusta-®ta. Jokaista siten saaduista klooneista, 15 kasvettuaan sopivaan tasoon, viljeltiin uudelleen vaihtamalla viljelylevyä. Viljelyprosessin aikana osaa soluista viljeltiin seerumivapaassa alustassa, ja yhdistelmätrombomodu-liinin määrä tuloksena saadussa viljelmän supernatantissa määritettiin seuraavalla tavalla jokaisen kloonin yhdistel-20 mätrombomoduliinin tuotannon arvioimiseksi. Se tarkoittaa, että 3 ml solususpensiota, säädettynä tiheyteen 4,2 x 10** solua/ml alusta-®ta käyttämällä, kaadettiin halkaisijaltaan 35 mm:seen viljelymaljaan ja viljeltiin 37^0:558 3 päivän ajan 5 % COÄ:ta - 95 % ilmaa sisältävässä atmosfäärissä.

25 Tämän jälkeen, viljelyalustan poistamisen jälkeen, kasvatetut solut pestiin PBS-Tween:illä ja viljeltiin uudelleen käyttäen 3 ml MEMa(-)-alustaa, joka sisälsi 5 KIU/ml apro-tiniinia (Repulson, Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.) 37β0:-ssa 2 päivän ajan 5 % C03:ta -95 % ilmaa sisältävässä at-30 mosfäärissä, biologisen aktiivisuuden määrittämiseksi saadussa kasvusupernatantissa. Tällä tavalla valikoitiin yksi ‘ klooni, jonka aktiivisuus oli korkea, yhdistelmätrombomodu- liinia runsaasti ilmentäväksi kannaksi. Siten valikoitu, yhdistelmätrombomoduliinia runsaasti ilmentävä kanta säädet-35 tiin solutiheyteen 1 x ΙΟ** solua/ml käyttäen alusta-®ta, johon oli lisätty 20 nM metotreksaattia (Lederle Japan) (tämän jälkeen viitetunnuksella "MTX"), ja 10 ml siten valmistettua solususpensiota kaadettiin halkaisijaltaan 10 cm 38 106206 olevalle maljalle ja viljeltiin 37*»C:ssa 5 % CO*:ta - 95 % ilmaa sisältävässä atmosfäärissä. Siten saadut 20 nM MTX:lle resistentit solut kloonattiin käyttäen hyväksi penisilliini-kuppimenetelmää, ja jokaisen kloonin yhdistelmätrombomodu-5 liinin tuotantokyky määritettiin, yhdistelmätrombomoduliinia runsaasti ilmentävän kannan valikoimiseksi. Siten saadun runsaasti ilmentävän kannan, TMM-B1C:n, ilmentämispitoisuus oli 1,3 ug/ml. Kasvusupernatantin sisältämä yhdistelraätrom-bomoduliini otettiin talteen ja puhdistettiin esimerkin 3 10 mukaisen menettelyn mukaisesti, ja sen N-terminaaliset ja C-terminaaliset aminohapposekvenssit määritettiin myös esimerkin 3 mukaisen menettelyn mukaisesti. Tämän tuloksena varmistettiin oheiset sekvenssit seuraaviksi.

15 N-terminaalinen: Ala Pro Ala Glu Pro Gin 1 5 C-terminaalinen: Leu Ala Arg 455 20

Esimerkki 5

Ilmentäminen E. colissa 25 E. colin kantaa HB101, joka oli transformoitu esimerkissä 1 valmistetulla plasmidi pM450-TM-Ala:11a tai pM450-TM-Val:-11a, viljeltiin yli yön 5 ml.-ssa L-lientä, joka sisälsi 100 Ug/ml ampisilliiniä (tämän jälkeen viitetunnuksella "Ap"). Tuloksena saatu kasvustoliemi siirrostettiin 50 tilavuuteen 30 M9CA-alustaa, joka sisälsi 100 ug/ml Ap:tä ja 50 ug/ml tryp-tofaania, ja viljeltiin 37öC:ssa noin 3 tunnin ajan, kunnes solukasvu saavutti myöhäislogaritmisen vaiheen, jota seurasi 3B-indoliakryylihapon lisäys (Hako Pure Chemical Industries, Ltd.) loppupitoisuuteen 10 ug/ml ja sen jälkeinen viljely 35 3-5 tunnin ajan. Siten kasvatetut solut otettiin talteen käyttäen sentrifugia (MR-15, Tomy Seiko Co., Ltd.) ja pestiin fysiologisella saliinilla, ja tuloksena saatu solusakka suspendoitiin 2 % natriumdodekyylisulfaattia/1 mM EDTA:aa/10 39 106206 mM Tris-HCl:a (pH 7,4) sisältävään liuokseen, mikä vastasi määrällisesti 1/10 kasvuliemen tilavuutta, solujen disper-goimiseksi, ja solut hajotettiin sen jälkeen lämpökäsittelyn avulla 90*=*C:ssa 5 minuutin aikana. Lysaatin sisältämät liu-5 kenemattomat aineet poistettiin sen jälkeen sentrifugin avulla (mainittu edellä) nopeudessa 15 000 rpm 10 minuutin ajan, ja tuloksena olevaa supernatanttia dialysoitiin P8S:ää vastaan, jolloin saatiin lysaattinäyte.

10 Kahdesta tällä tavalla saadusta lysaattinäytteestä tarkistettiin niiden reaktiivisuus anti-ihmisen virtsan trombomo-duliinin vasta-aineen kanssa. Se tarkoittaa, että litteäpoh-jaisen 96-kaivoisen mikrotitrauslevyn (Immulom-600, Greiner, Inc.) kuhunkin kaivoon lisättiin 100 μΐ anti-ihmisen virtsan 15 trombomoduliinin vasta-ainetta (saatu herkistämällä kani ihmisen virtsan 72 K trombomoduliinilla, joka on valmistettu virtsasta, ja puhdistamalla tuloksena saatu seerumi ammoni-umsulfaattisaostuksella ja DEAE-Sepharose-kolonnilla), joka on säädetty pitoisuuteen 10 ug/ml, käyttäen 0,1 M natrium-20 karbonaattipuskuria, pH 9,6. Seisottamisen jälkeen 4°C:ssa 16 tunnin ajan, siten käsitellyt kaivot pestiin kolme kertaa 10 mM fosfaattipuskurilla, pH 7,4, joka sisälsi 0,05 % Tween-20:tä (Bio-Rad Laboratories, Inc.) (tämän jälkeen viitetunnuksella "PBS-Tween"). Kuhunkin siten käsiteltyyn 25 kaivoon panostettiin 300 μΐ Block Ace (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) -liuosta, joka oli laimennettu neljä kertaa vedellä, inkuboitiin 37°c;ssa 1 tunnin ajan adsorboitumat-toman osan estämiseksi, ja pestiin sen jälkeen kolme kertaa PBS-Tween:illä. Sen jälkeen kun oli lisätty 100 μΐ lysaattia 30 ja inkuboitu 37eC:ssa 1,5 tunnin ajan, jokainen kaivo pestiin kolme kertaa PBS-Tween:illä, panostettiin 100 pl:lla 10 . ug/ml-pitoista biotiinilla käsiteltyä anti-ihmisen virtsan trombomoduliinin vasta-aineliuosta ja inkuboitiin sen jälkeen 37**C:ssa 1 tunnin ajan. Pesun jälkeen kolmesti PBS-35 Tween:illä, 100 μΐ piparjuuren peroksidaasilla leimattua streptavidiini (Zymed Laboratories, Inc.) -liuosta lisättiin ja inkuboitiin sen jälkeen 37~C:ssa l tunnin ajan.

Pesun jälkeen kolmesti PBS-Tween:illä jokainen kaivo pestiin 40 106206 kerran sitraatti-fosfaattipuskurilla, pH 4,0, ja panostettiin sen jälkeen 200 pl:lla väriä kehittävää ainetta (ABTS: (2,2-atsinobis(3-etyylibentstiatsoliinisulfonihappojdiam-moniumsuola), joka oli liuotettu pitoisuuteen 1 mg/ml sit-5 raatti-fosfaattipuskuriin, pH 4,0, joka sisälsi 0,003 % vetyperoksidia. Värinmuodostusreaktiota jatkettiin kunnes riittävä absorbanssi saavutettiin ja pysäytettiin sen jälkeen lisäämällä 50 μΐ 21 mg/ml fluorivetyliuosta kuhunkin kaivoon. Absorbanssi mitattiin sen jälkeen 405 nm:n aallon-10 pituudessa käyttäen mikrotitrauslevylukulaitetta.

Tulokseksi satiin, että värinkehittymistä havaittiin sen kannan lysaatissa, joka sisälsi pM450-TM-Ala:n tai pM450-TM-Val.-n, kun taas värinkehitystä ei havaittu lainkaan E.

15 coli -kannan HB101 lysaatissa, joka sisälsi plasmidin pM450, joka oli saatu samoilla viljely- ja valmistusmenetelmillä.

Esimerkki 6 20 Deleetiomutantin konstruointi ja ilmentäminen (1) Deleetiomutantin ekspressiovektorin konstruointi DEL 10:n ilmentämisessä käytettävä vektori konstruoitiin 25 seuraavalla tavalla. Oligonukleotidejä (D5-16U ja D5-24L) valmistettiin, jotka sisälsivät 10-meerin ja 24-meerin kuten kuviossa 12(a) on esitetty, käyttäen DNA:n synteesilaitetta (mainittu edellä), puhdistettiin OPC-kolonnin avulla (mainittu edellä) ja tehtiin sen jälkeen kaksijuosteisiksi ta-30 vanomaisella tavalla, jolloin saatiin DNA-fragmentti, joka sisälsi kohesiiviset Kpnl- ja EcoRI-päät. Tämä fragmentti • ligoitiin tavanomaisella tavalla noin 4,5 ke DNA-fragmentin kanssa, joka oli valmistettu esimerkissä 2-(1) saadun pUC-TM.-n Kpnl/EcoRI-pilkontatuotteesta, plasmidin pUC-DEL10 35 konstruoimiseksi, joka koodittaa ihmisen trombomoduliinin signaalipeptidiä ja DEL 10:ta, täydennettynä terminaalisella kodonilla 3'-päässä. Siten konstruoitu plasmidi pilkottiin EcoRI/MluI:llä. pilkontatuotteet elektroforesoitiin agaroo- 41 106206 sigeelillä tavanomaisella tavalla noin 650 ep DNA-fragmentin eristämiseksi, ja sen jälkeen siten saatu fragmentti ligoi-tiin tavanomaisella tavalla noin 4,5 ke DNA-fragmentin kanssa, joka oli valmistettu esimerkissä 2-(2) saadun pCDSRa-5 TM:n EcoRI/MluI-pilkonnasta, plasmidin pCDSRa-DELlO konstruoimiseksi {kuviot 13(a) - 13(b)).

Toisaalta, seuraavalla tavalla konstruoitiin vektori käytettäväksi mutatoidun, ihmisen virtsan yhdistelmätrombomodulii-10 nin ilmentämisessä, josta 49 C-terminaalista aminohappoa on poistettu (tämän jälkeen viitetunnuksella "DEL 49").

Oligonukleotidit (D10-14U ja D10-14L), kummankin sisältäessä 14-meerin kuten kuviossa 12(b) on esitetty, valmistettiin 15 käyttäen DNA:n synteesilaitetta (mainittu eellä), puhdistettiin käyttäen OPC-kolonnia (mainittu edellä) ja tehtiin sen jälkeen kaksijuosteisiksi tavanomaisella tavalla, jolloin saatiin DNA-fragmentti, joka sisälsi kohesiiviset Nhel- ja EcoRI-päät. Tämä fragmentti ligoitiin tavanomaisella tavalla 20 noin 5 ke DNA-fragmentin kanssa, joka oli valmistettu esimerkissä 1-(2) saadun pCDSRa-TM.-n EcoRI/Nhel-pilkontatuot-teesta, plasmidin pCDSEa-DEL49 konstruoimiseksi, joka sisältää kiinnostuksen kohteena olevan cDNA:n. (Kuviot 13(a) -13(b)).

25 (2) Ilmentäminen eläinsoluissa

Esimerkissä 2-(2) valmistettu pCDSRa-TM ja esimerkissä 6-(1) valmistetut pCDSRa-DEL 10 ja pCDSRa-DEL49 siirettiin COS 30 I -soluihin ruTM-Ala:n, DELlO.-n ja vastaavasti DEL 49:n ilmentämistä varten. Se tarkoittaa, että 0,5 ug pCDSRa-• : TM:ää, pCDSRa-DELlO:tä tai pCDSRa-DEL49:ää liuotettiin 5 ui:aan TE-puskuria, ja tuloksena oleva liuos sekoitettiin 700 μΐ.-aan D-ME-alustaa, joka sisälsi 0,2 mg/ml DEAE-dekst-35 raania ja 50 mM Tris-HCl:ia (pH 7,4) liuoksen valmistamiseksi, joka sisälsi DNA-DEAE-dekstraaniseoksen. Siten valmistettua DNA-DEAE-dekstraaniseosliuosta lisättiin pisaroittain ‘ COS I -soluihin, joita oli viljelty puolittain yhteenkasva- 42 106206 neeseen tilaan halkaisijaltaan 35 mm:n viljelymaljalla, ja siten käsiteltyjä soluja viljeltiin 37eC:ssa 4 tunnin ajan 5 % COz.-ta - 95 % ilmaa sisältävässä atmosfäärissä. Viljely-maljaan lisättiin D-ME-alustaa, joka sisälsi 1 % naudan 5 sikiön seerumia (mainittu edellä) sen jälkeen, kun DNA-DEAE-dekstraaniseosliuos oli poistettu. Viljelyn jälkeen 37^0:ssa 48-96 tunnin ajan 5 % COÄ:ta - 95 % ilmaa sisältävässä atmosfäärissä, tuloksena olevan kasvuston supernatantti otettiin talteen ja supernatantin proteiini C:tä aktivoiva kyky 10 määritettiin kokeellisen esimerkki 2:n mukaisella menettelyllä. Tulokseksi saatiin, että biologista aktiivisuutta havaittiin ruTM-Ala:ssa ja DEL lOrssä, mutta ei riittävästi DEL 49:ssä. Tulokset esitetään taulukossa 4.

15 Taulukko 4

Aktiivisuus *1 ruTM-Ala 3,8 DEL 10 4,1 20 Ihmisen napanuoran trombomoduliini 1,0 *1: Suhteellinen aktiivisuus, kun ihmisen istukan trombomo- duliinin aktiivisuus määritellään l.ksi.

25

Seuraavassa kuvaillaan esimerkkejä farmaseuttisista valmisteista, jotka sisältävät tämän keksinnön mukaisen polypepti-din.

30 Esimerkki 7 : ruTM-Ala 20,0 mg

Puhdistettu gelatiini 50,0 mg

Natriumfosfaatti 34,8 mg 35 Natriumkloridi 81,8 mg

Mannitoli 25,0 mg - Edellä olevien komponenttien liuottamisen jälkeen 10 ml:aan- 43 106206 tislattua vettä ruiskeena käyttöä varten, tuloksena oleva liuos steriloitiin suodattamalla, annosteltiin 1,0 ml:n erissä steriileihin ampulleihin ja pakastekuivattiin sen jälkeen ruiskeiden valmistamiseksi.

5

Esimerkki 8 ruTM-Ala 40,0 mg

Albumiini 20,0 mg 10 Natriumfosfaatti 34,8 mg

Natriumkloridi 81,8 mg

Mannitoli 25,0 mg

Jokaisen edellä mainitun komponentin punnitsemisen jälkeen 15 valmistettiin samalla tavalla kuin esimerkissä 7 pakaste-kuivattu farmaseuttinen valmiste.

Esimerkki 9 20 DE1 10 20,0 mg

Puhdistettu gelatiini 50,0 mg

Natriumfosfaatti 34,8 mg

Natriumkloridi 81,8 mg

Mannitoli 25,0 mg 25

Jokaisen edellä olevan komponentin punnitsemisen jälkeen valmistettiin pakastekuivattu farmaseuttinen valmiste samalla tavalla kuin esimerkissä 7.

30 (Viite-esimerkki) : Esimerkki ihmisen istukan trombomoduliinin valmistamisesta

Trombomoduliini puhdistettiin ihmisen istukasta JP-patentti-35 hakemuksessa Kokai n:o 60-199819 esille tuodun menetelmän mukaisesti. Se tarkoittaa, että 12 kg ihmisen istukkanäyt-teitä (30 istukkaa) pestiin 0,02 M Tris-HCl-puskurilla, pH

7,5, joka sisälsi 0,25 M sakkaroosia ja 1 mM bentsamidiinia, 44 106206

ja homogenoitiin sen jälkeen käyttäen lihamyllyä. Siten homogenisoidun suspension sentrifugoinnin jälkeen nopeudessa 3000 rpm AO minuutin ajan, tuloksena oleva saostuma suspen-doitiin edellä mainittuun puskuriliuokseen, sekoitettiin 10 5 minuuttia ja sentrifugoitiin sen jälkeen saostuman saamiseksi. Edellä mainittu vaihe toistettiin kolme kertaa käyttäen 20 litraa puskuriliuosta yhtä jaksoa kohti, ja lopuksi saatu saostuma uutettiin 60 litralla 0,02 M Tris-HCl-puskuria, pH

7,S, joka sisälsi 0,25 M sakkaroosia, l mM bentsamidiinihyd-10 rokloridia ja 0,5 % (tilavuus/tilavuus) Triton X-100:aa (Sigma Chemical Co.). Kokonaisproteiinin määrän siten uutetussa liuoksessa todettiin olevan 46,7 g (määritettynä Low-ry’n menetelmällä, sama pätee tämän jälkeen). 60 litraa raakaa uutetta sijoitettiin DIP-trombiini-agaroosi-kolonniin 15 (4 cm:n halkaisija, pituus 16 cm), jota oli tasapainotettu etukäteen 0,02 M Tris-HCl-puskurilla, pH 7,5, joka sisälsi 0,1 M NaCl:a, 0,5 mM CaClÄ:a, 0,1 mM bentsamidiinihydroklo-ridia ja 0,5 % (tilavuus/tilavuus) Triton X-100:aa, ja sen jälkeen siten proteiini-adsorboitu kolonni pestiin 2 litral-20 la samaa puskuriliuosta, jota käytettiin tasapainotukseen. Tämän jälkeen suoritettiin eluointi käyttäen 0,02 M Tris-HCl-puskuria, pH 7,5, joka sisälsi 1 M NaCl.-a, 0,1 mM EDTA:-aa, 1 mM bentsamidiinihydrokloridia ja 0,5 % (tilavuus/tilavuus) Triton X-lOO.-aa. Tällä tavalla saatiin 650 ml eluaat-25 tia, joka sisälsi 1,7 g proteiinia. Eluaatti poistosuolat- tiin ja väkevöitiin käyttäen ultrasuodatuslaitetta (Millipo-re Corp., nimellinen rajamolekyylipaino 30 000), ja adsorboitiin sen jälkeen DIP-trombiini-agaroosi-kolonniin, joka on vakioitu samalla tavalla kuin edellä on kuvailtu. Seuraa-30 vaksi, pesun jälkeen 150 ml :11a 0,02 M Tris-HCl-puskuria, pH 7,5, joka sisälsi 0,4 M NaCl.- a, 0,5 mM CaClz:a, 0,1 mM : bentsamidiinihydrokloridia ja 0,5 % (tilavuus/tilavuus)

Triton X-100:aa, suoritettiin eluointi tiheysgradientin avulla, käyttäen 0,02 M Tris-HCl-puskuria, pH 7,5, joka 35 sisälsi 0,1 M EDTA:aa, 1 mM bentsamidiinihydrokloridia, 0,5 % (tilavuus/tilavuus) Triton X-100:aa ja NaCl:a (0,4-1 M). Kun eluaatti kerättiin talteen 30 ml:n fraktioissa, saatiin kaikkiaan 1290 ml kiinnostuksen kohteena olevia 45 106206 fraktioita, jotka sisälsivät 68 mg proteiinia. Eluaatti poistosuolattiin ja väkevöitiin käyttäen ultrasuodatuslai-tetta (Millipore Corp., nimellisrajamolekyylipaino 30 000) ja sen jälkeen geelisuodatettiin kiinnostuksen kohteena 5 olevan fraktion keräämiseksi talteen, käyttäen S-300 (Pharmacia) -kolonnia (halkaisija 2,6 cm, pituus 90 cm), jota oli vakioitu etukäteen 0,01 M Tris-HCl-puskurilla, pH 7,0, joka sisälsi 0,05 % Triton X-100:aä ja 0,14 M NaCl:a. Siten saatu ihmisen istukan trombomoduliinivalmiste sisälsi 3,1 10 mg proteiinia.

Piirrosten lyhyt kuvailu

Kuviossa 1 on kaava, joka esittää tässä keksinnössä käytet-15 tavaksi tarkoitetun koettimen oligonukleotidisekvenssiä.

Kuvio 2 on restriktiokartta 2,5 ke cDNA-fragmentista, joka sisältää DNA-fragmentin, joka koodittaa tämän keksinnön mukaista polypeptidiä.

20

Kuviot 3(a) - 3(m) sisältävät kaaviomaisesti esitettynä 2,5 ke cDNA-fragmentin oligonukleotidisekvenssin, joka sisältää DNA-fragmentin, joka koodittaa tämän keksinnön mukaista polypeptidiä, ja polypeptidistä johdetun aminohapposekvens-25 sin.

Kuviot 4(a) ja 4(b) sisältävät kaaviomaisena esityksenä menettelyn tämän keksinnön mukaisten ekspressioplasmidien pKCR-TM-Ala ja pKCR-TM-Val konstruoimiseksi nisäkässoluissa 30 käyttöä varten.

; Kuviot 5(a) ja 5(b) esittävät kaaviomaisesti oligonukleoti- dejä, joita käytetään tämän keksinnön mukaisten plasmidien konstruointiin.

35

Kuviot 6(a) ja 6(b) sisältävät kaaviomaisen esityksen menettelystä tämän keksinnön mukaisten ekspressioplasmidien - pM450-TM-Ala ja pM450-TM-Val konstruoimiseksi E. colissa 46 106206 käyttöä varten.

Kuvio 7 on kaavioesitys oligonukleotidistä, jota käytetään tämän keksinnön mukaisen plasmidin konstruointiin.

5

Kuvio 8 on kaavioesitys menettelystä plasmidin pUC-TM konstruoimiseksi, joka sisältää DNA-fragmentin, joka koodittaa tämän keksinnön mukaista polypeptidiä.

10 Kuviot 9(a) ja 9(b) sisältävät kaavioesityksen DNA-fragmentin oligonukleotidisekvenssistä, joka koodittaa tämän keksinnön mukaista polypeptidi ruTM-Ala:aa.

Kuviot 10(a) ja 10(b) sisältävät kaavioesityksen menettelys-15 tä tämän keksinnön mukaisen ekspressioplasmidin LK-444-TM-DHFR konstruoimiseksi nisäkässoluissa käyttöä varten.

Kuviot 11(a) ja 11(b) sisältävät kaavioesityksen tämän keksinnön mukaisen ekspressioplasmidin pCDSRa-TM-DHFR konstru-20 oimiseksi nisäkässoluissa käyttöä varten.

Kuvio 12 on kaavioesitys oligonukleotideistä. joita käytetään tämän keksinnön mukaisten deleetiomutanttiekspressiop-lasmidien pCDSRa-DELlO ja pCDSRa-DEL49 konstruoimiseksi.

25

Kuviot 13(a) ja 13(b) sisältävät kaavioesityksen menettelystä tämän keksinnön mukaisten ekspressioplasmidien pCDSRa-DEL10 ja pCDSRa-DEL49 konstruoimiseksi nisäkässoluissa käyttöä varten.

30

Teollinen käyttökelpoisuus e Tämän keksinnön mukainen polypeptidi vaikuttaa sekä veren hyytymiseen että verihiutaleiden kasautumiseen, johtuen sen 35 trombiinia sitovasta ja sen aktiivisuutta inaktivoivasta toiminnasta, ja ilmentää samanaikaisesti hyytymistä estäviä ja trombolyyttisiä aktiivisuuksia aktivoimalla proteiini ‘ C:tä. Sellaisista vaikutuksista johtuen polypeptidiä on 106206 mahdollista käyttää liian herkkään hyytymiskykyyn liittyvien sairauksien laajan valikoiman hoitamiseen, mikä perustuu polypeptidin trombin muodostusta ehkäisevään aktiivisuuteen, trombolyyttiseen aktiivisuuteen, anti-DIC-aktiivisuuteen ja 5 vastaaviin aktiivisuuksiin. Erityisesti voidaan odottaa sivuvaikutusten vähenemistä, johtuen sen erinomaisesta funktiosta aktivoida proteiini C:tä.

Tämän keksinnön mukaista polypeptidiä on lisäksi tuotettu 10 ensimmäistä kertaa geenitekniikan menetelmien avulla. Niin muodoin, kun sitä käytetään farmaseuttisessa lääkeaineessa vaikuttavana aineena liian herkkään hyytymiskykyyn liittyvien sairauksien kuten tromboosin, DIC:n ja vastaavien sairauksien hoitoon tai ehkäisyyn, voidaan odottaa voimakkaam-15 paa tehoa kuin aikaisemmalla vastineella, tai samanlaista tehoa pienemmällä annoksella, mikä tekee mahdolliseksi lääkeaineen taloudellisen käytön, johon liittyy pienempi vaara sivuvaikutusten muodostumiselle. On myös mahdollista löytää kokonaan uusi vaikutus kuten sairauden hoitaminen, jota on 20 vaikea hoitaa nykyisessä tilanteessa.

Tämän keksinnön mukaista polypeptidiä voidaan käyttää myös turvallisemmin farmaseuttisena lääkeaineena, koska ei ole välttämätöntä käyttää pinta-aktiivista ainetta, joka on 25 välttämätön ihmisen aikaisemman trombomoduliinin liuotetta-vuuden kannalta, joka on uutettu istukkakudoksista, keuhkoista ja vastaavista kohdista.

Farmaseuttisena lääkeaineena käyttämisen lisäksi, jota edel-30 lä on kuvailtu, tämän keksinnön mukaista polypeptidiä voidaan käyttää myös veren hyytymisen estämistarkoituksessa, . sitomalla ja adsorboimalla se keinotekoisen verisuonen, keinotekoisen elimen, katetrin tai vastaavan välineen pintaan, käyttäen hyväksi silloittavaa ainetta tai vastaavaa 35 ainetta.

Claims (9)

48 1062C6

1. Menetelmä seuraavan kaavan mukaisen polypeptidin valmistamiseksi, 5 Xi Glu Pro Gin Pro Gly Gly Ser Gin Cys Vai Glu 5 10 His Asp Cys Phe Ala Leu Tyr Pro Gly Pro Ala Thr 15 20 25

10 Phe Leu Asn Ala Ser Gin Ile Cys Asp Gly Leu Arg 30 35 Gly His Leu Met Thr Vai Arg Ser Ser Vai Ala Ala 40 45 50 Asp Vai Ile Ser Leu Leu Leu Asn Gly Asp Gly Gly 15 55 60 Vai Gly Arg Arg Arg Leu Trp Ile Gly Leu Gin Leu 65 70 Pro Pro Gly Cys Gly Asp Pro Lys Arg Leu Gly Pro 75 80 85

20 Leu Arg Gly Phe Gin Trp Vai Thr Gly Asp Asn Asn 90 95 Thr Ser Tyr Ser Arg Trp Ala Arg Leu Asp Leu Asn 100 105 110 Gly Ala Pro Leu Cys Gly Pro Leu Cys Vai Ala Vai 25 115 120 Ser Ala Ala Glu Ala Thr Vai Pro Ser' Glu Pro Ile 125 130 Trp Glu Glu Gin Gin Cys Glu Vai Lys Ala Asp Gly 135 140 145 ... 30 Phe Leu Cys Glu Phe His Phe Pro Ala Thr Cys Arg 150 155 Pro Leu Ala Vai Glu Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala 160 165 170 Vai Ser Ile Thr Tyr Gly Thr Pro Phe Ala Ala Arg 35 175 180 ♦ 49 106206 Gly Ala Asp Phe Gin Ala Leu Pro Vai Gly Ser. Ser 185 190 Ala Ala Vai Ala Pro Leu Gly Leu Gin Leu Met Cys 195 200 205

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä polypeptidin val-5 mistamiseksi, tunnettu siitä, että isäntäsolu on eukaryootti- nen solu.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä polypeptidin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että isäntäsolu on prokaryoot-tinen solu. 10

4. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä polypeptidin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että Xi on seuraavan kaavan mukainen aminohapposekvenssi: Ala Pro Ala IS 1 ja Yi on seuraavan kaavan mukainen aminohapposekvenssi: Ile Cys Gly Pro Asp Ser Ala Leu Z Arg 450 455 jossa Z on Vai tai Ala. 20

5 GATCGGCCTG CAGCTGCCAC CCGGCTGCGG CGACCCCAAG 300 CGCCTCGGGC CCCTGCGCGG CTTCCAGTGG GTTACGGGAG 340 ACAACAACAC CAGCTATAGC AGGTGGGCAC GGCTCGACCT 380 CAATGGGGCT CCCCTCTGCG GCCCGTTGTG CGTCGCTGTC 420 TCCGCTGCTG AGGCCACTGT GCCCAGCGAG CCGATCTGGG 460

10 AGGAGCAGCA GTGCGAAGTG AAGGCCGATG GCTTCCTCTG 500 CGAGTTCCAC TTCCCAGCCA CCTGCAGGCC ACTGGCTGTG 540 GAGCCCGGCG CCGCGGCTGC CGCCGTCTCG ATCACCTACG 580 GCACCCCGTT CGCGGCCCGC GGAGCGGACT TCCAGGCGCT 620 GCCGGTGGGC AGCTCCGCCG CGGTGGCTCC CCTCGGCTTA 660

15 CAGCTAATGT GCACCGCGCC GCCCGGAGCG GTCCAGGGGC 700 ACTGGGCCAG GGAGGCGCCG GGCGCTTGGG ACTGCAGCGT 740 GGAGAACGGC GGCTGCGAGC ACGCGTGCAA TGCGATCCCT 780 GGGGCTCCCC GCTGCCAGTG CCCAGCCGGC GCCGCCCTGC 820 AGGCAGACGG GCGCTCCTGC ACCGCATCCG CGACGCAGTC 860

20 CTGCAACGAC CTCTGCGAGC ACTTCTGCGT TCCCAACCCC 900 GACCAGCCGG GCTCCTACTC GTGCATGTGC GAGACCGGCT 940 ACCGGCTGGC GGCCGACCAA CACCGGTGCG AGGACGTGGA 980 TGACTGCATA CTGGAGCCCA GTCCGTGTCC GCAGCGCTGT 1020 GTCAACACAC AGGGTGGCTT CGAGTGCCAC TGCTACCCTA 1060 25 ÄCTACGACCT GGTGGACGGC GAGTGTGTSG AGCCCGTGGA 1100 CCCGTGCTTC AGAGCCAACT GCGAGTACCA GTGCCAGCCC 1140 CTGAACCAAA CTAGCTACCT CTGCGTCTGC GCCGAGGGCT 1180 TCGCGCCCAT TCCCCACGAG CCGCACAGGT GCCAGATGTT 1220 TTGCAACCAG ÄCTGCCTGTC CAGCCGACTG CGACCCCAAC 1260

30 ACCCAGGCTA GCTGTGAGTG CCCTGAAGGC TACATCCTGG 1300 • ♦ ·-· ACGACGGTTT CATCTGCACG GACATCGACG AGTGCGAAAA 1340 CGGCGGCTTC TGCTCCGGGG TGTGCCACAA CCTCCCCGGT 1380 ACCTTCGAGT GC Y2 1392 35 missä S on G tai C; X2 on sekvenssi: ATGCTTGGGG TCCTGGTCCT TGGCGCGCTG GCCCTGGCCG 40 53 106206 GCCTGGGGTT CCCCGCWCCC GCA 63 edellyttäen, että W on T tai A; tai sen muunnos, jossa valinnainen määrä tai kaikki nukleotidit on poistettu tripletteinä, alkaen sekvenssin 5'-päästä; S ja Y2 on oheisen kaavan mukainen sekvenssi: ACTTGCGGGC CCGACTCGGC CCTTGYCCGC CAC 1425 edellyttäen, että Y on T tai C; tai sen muunnos, jossa valinnainen määrä tai kaikki nukleotidit on poistettu tripletteinä, alkaen sekvenssin 3'-päästä. 10

5. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä polypeptidin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että Χχ on seuraavan kaavan mukainen aminohapposekvenssi: Ala Pro Ala 25 1 ja Υχ:η kaikki aminohapot on poistettu.

5 Asp lie Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe Cys Ser 425 430 Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys 435 440 445 Yi 10 jossa Xi on seuraavan kaavan mukainen sekvenssi: Met Leu Gly Val Leu Val Leu Gly Ala Leu Ala Leu -15 -10 Ala Gly Leu Gly Phe Pro Ala Pro Ala 15 -5 -1 1 tai sen muunnos, jossa valinnainen lukumäärä aminohappoja tai kaikki aminohapot on poistettu alkaen sekvenssin N-päästä; ja Yi on seuraavan kaavan mukainen sekvenssi: Ile Cys Gly Pro Asp Ser Ala Leu Z Arg His 20 450 455 jossa Z on Vai tai Ala; tai sen muunnos, jossa valinnainen lukumäärä aminohappoja tai kaikki aminohapot on poistettu alkaen sekvenssin C-päästä, jossa ainakin yksi aminohappo mainitussa sekvenssissä voi valinnaisesti sisältää sokeriketjun, 25 tunnettu siitä, että se käsittää vähintään yhden seuraavista vaiheista: a) valmistetaan DNA-fragmentti, joka sisältää mainittua poly-peptidiä koodaavan nukleotidisekvenssin, v b) liitetään mainittu DNA-fragmentti ekspressiovektoriin yh- 30 distelmä-DNA-fragmentin saamiseksi, joka sisältää mainitun DNA-fragmentin ja kykenee replikoitumaan, c) transformoidaan isäntäsolu mainitulla yhdistelmä-DNA-fragmentilla transformantin eristämistä varten, joka voi il-mentää mainitun polypeptidin, ja 51 106206 d) viljellään mainittua transformanttia mainitun polypeptidin tuottamiseksi, ja otetaan mainittu polypeptidi talteen tuloksena olevasta viljelyseoksesta.

5 Thr Ala Pro Pro Gly Ala Vai Gin Gly His Trp Ala 210 215 Arg Glu Ala Pro Gly Ala Trp Asp Cys Ser Vai Glu 220 225 230 Asn Gly Gly Cys Glu His Ala Cys Asn Ala Ile Pro 10 235 240 Gly Ala Pro Arg Cys Gin Cys Pro Ala Gly Ala Ala 245 250 Leu Gin Ala Asp Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala 255 260 265

15 Thr Gin Ser Cys Asn Asp Leu Cys Glu His Phe Cys 270 275 Vai Pro Asn Pro Asp Gin Pro Gly Ser Tyr Ser Cys 280 285 290 Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gin 20 295 300 His Arg Cys Glu Asp Vai Asp Asp Cys Ile Leu Glu 305 310 Pro Ser Pro Cys Pro Gin Arg Cys Vai Asn Thr Gin 315 320 325

25 Gly Gly Phe Glu Cys His Cys Tyr Pro Asn Tyr Asp 330 335' Leu Vai Asp Gly Glu Cys Vai Glu Pro Vai Asp Pro 340 345 350 Cys Phe Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gin Cys Gin Pro 30 355 360 Leu Asn Gin Thr Ser Tyr Leu Cys Vai Cys Ala Glu 365 370 Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu Pro His Arg Cys 375 380 385

35 Gin Met Phe Cys Asn Gin Thr Ala Cys Pro Ala Asp ·.' . 390 395 so 106206 Cys Asp Pro Asn Thr Gin Ala Ser Cys Glu Cys. Pro 400 405 410 Glu Gly Tyr lie Leu Asp Asp Gly Phe lie Cys Thr 415 420

6. DNA-fragmentti, tunnettu siitä, että se koodittaa patenttivaatimusten 1, 4 ja 5 mukaista polypeptidiä. 30

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen DNA-fragmentti, tunnettu siitä, että mainittu fragmentti sisältää seuraavan nukleoti-disekvenssin:

35 X2 GAGCCGC AGCCGGGTGG CAGCCAGTGC GTCGAGCACG 100 106206 ÄCTGCTTCGC GCTCTACCCG GGCCCCGCGA CCTTCCTCAA 140 TGCCAGTCAG ATCTGCGACG GACTGCGGGG CCACCTAATG 180 ACAGTGCGCT CCTCGGTGGC TGCCGATGTC ATTTCCTTGC 220 'TACTGAACGG CGACGGCGGC GTTGGCCGCC GGCGCCTCTG 260

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen DNA-fragmentti, tunnettu siitä, että X2 on seuraavan kaavan mukainen nukleotidise-kvenssi: GCWCCCGCA 63 15 jossa kaavassa W on T tai A, ja Y2 on seuraavan kaavan mukainen nukleotidisekvenssi: ATCTGCGGGC CCGACTCGGC CCTTGYCCGC 1422 jossa Y on T tai C.

9. Patenttivaatimuksen 7 mukainen DNA-fragmentti, tunnettu 20 siitä, että X2 on seuraavan kaavan mukainen nukleotidisekvenssi : GCWCCCGCA 63 jossa W on T tai A, ja kaikki Y2:n nukleotidit on poistettu. 25 ' « « ·>>* * « « 54 106206