FI104364B - Menetelmiä trombosyytien aggregaation inhibiittoreiden valmistamiseksi - Google Patents

Description

Menetelmiä tromboswttien aggregation inhibiittoreiden valmistamiseksi 104364 Tämä keksintö koskee menetelmiä peptidien valmistamiseksi, jotka ovat trombosyyttien aggregaatin inhibiittoreita tai näiden sukulaisyhdisteitä ja joita eristetään ja puhdistetaan eri-5 laisista käärmeiden myrkyistä. Nämä peptidit ovat käyttökelpoisia terapeuttisesti käytettäviä ^ aineita, joita voidaan käyttää erilaisten trombosyyttiperäisten iskeemisten tautitilojen hoitoon ja ennaltaehkäisyyn. Menetelmät koskevat erityisesti sellaisia peptidejä, jotka blokkaavat tietyt adhesiivisten proteiinien reseptorit, jotka proteiinit myötävaikuttavat trombosyyttien takertumiseen ja aggregaatioon.

10

Seuraavassa selitetään tämän keksinnön taustaa.

Sydän- ja verenkiertoelinten sairaus on primäärinen kuolinsyy useimmissa länsimaisissa yhteiskunnissa. Sydän- ja verenkiertoelinten sairaudesta johtuva kuolema aiheutuu usein trom-bosyyttiperäisistä iskeemisistä oireista, jotka saavat alkunsa ateroskleroosista ja arterioskle-15 roosista ja joihin kuuluvat esimerkiksi akuutti myokardiaalinen infarkti, krooninen epästabiili angina, lyhytaikaiset iskeemiset kohtaukset ja halvaukset, perifeerisen verenkiertoelimistön sairaudet, arteriaalinen tromboosi, pre-eklampsia, embolia, restenoosi ja/tai tromboosi an-gioplastian seurauksena, karotidisen endarterektomian seurauksena, verisuonisiirrännäisten anastomoosin, ja kroonisten kardiovaskulaaristen laitteiden (kuten esimerkiksi sisään jäävien 20 katetrien tai ohitusputkien, "kehon ulkopuolisten verenkiertoelinten") asentamisen seurauksena. Nämä edellä mainitut oireyhtymät käsittävät joukon erilaisia stenoottisia ja okklusiivisia .1 verisuonielimistön tautitiloja, joiden katsotaan yleisesti johtuvan trombosyyttien aktivoitumi sesta joko verisuonten seinämillä tai itse verisuonten sisäontelossa veren sisältämien välittäjien vaikutuksesta, mutta jotka ilmenevät verihiutaleiden muodostamina aggregaatteina, jotka <, 25 muodostavat trombeja, jotka estävät veren virtausta.

Lukuisat tutkimukset ovat itsekukin osaltaan lisänneet verihiutaleiden aggregaation ja trom bien muodostumisen mekanismien ymmärtämystä. Verihiutaleet reagoivat erilaisiin verisuoniin kohdistuviin vaurioihin, kuten esimerkiksi verisuonen sisäontelon kaventumi-30 seen/ahtautumiseen, seinämille muodostuviin kerrostumiin sekä vieraiden esineiden (esimerkiksi katetrien) läsnäoloon. Verihiutaleiden reaktio näihin mainittuihin vaurioihin • käsittää tapahtumasaijan, johon kuuluu verihiutaleiden takertumista toisiinsa ja niiden akti- 2 104364 voitumista, ja verihiutaleiden rakeisten komponenttien vapautumista, joihin mainittuihin komponentteihin kuuluu myös voimakkaita solujen mitogeenisiä tekijöitä. Nämä mainitut aktivoidut verihiutaleiden aggregaatit indusoivat fibriinin muodostumista, mikä edelleen stabiloi muodostuvaa trombia.

Näitä edellä esitettyjä reaktioita säätelevistä mekanismeista tiedetään entuudestaan paljon. J Vaikka stimuloimattomat verihiutaleet sisältävät reseptoreja useille adhesiivisille proteiineille, joihin kuuluvat esimerkiksi laminiini (VLA 2, VLA 6) ja kollageeni (VLA 2, GPIV sekä muita), verihiutaleiden kiinnittymisen subendoteeliin katsotaan yleisesti olevan aluksi veri-10 hiutaleiden membraanin glykoproteiinin (GP) Ib sitoutumisen immobilisoituun von Willeb-randin tekijään välittämää. Seurauksena oleva verihiutaleiden aktivoituminen voi saada alkunsa yhden tai useamman yleisesti tunnetun fysiologisen agonistin vaikutuksesta, joita mainittuja agonisteja ovat esimerkiksi ADP, epinefriini, trombiini, kollageeni ja trombok-saani A2.

15

Verihiutaleiden aggregaatio on verihiutaleen membraanin pinnalla olevan GP Ilb-IIIa-kompleksin välittämää. GP IIb-IIIa:ta esiintyy stimuloimattomien verihiutaleiden pinnalla aktiivisessa muodossaan. Kun verihiutaleet aktivoituvat adheesion ja fysiologisten agonistien vaikutuksesta, aktivoituu myös GP Ilb-IIIa siten, että se muodostaa reseptorin fibrinogeenille 20 (Fg), von Willebrandin faktorille (vWF) ja fibronestiinille (Fn) (katso Phillips et ai., Blood (1988) 71: 831-843). Kuitenkin katsotaan, että fibrinogeenin ja/tai von Willebrandin tekijän sitoutuminen ovat ensisijaisia aikaan saavia tekijöitä verihiutaleiden aggregaation ja trombien muodostumisen ollessa kyseessä in vivo. Tämän vuoksi sellaiset aineet, jotka inhiboivat spesifisesti fibrinogeenin tai von Willebrandin tekijän sitoutumista GP IIb-IIIa:n kanssa inhiboi-25 vat verihiutaleiden aggregaatiota ja voivat olla mahdollisia trombien muodostumisen inhibiit- ° toreita in vivo.

Verihiutaleiden GP IIb-IIIa:n tiedetään yleisesti kuuluvan rakenteensa perusteella toistensa kaltaisten adhesiivisten proteiinireseptorien pääiyhmään, jonka jäsenet tunnetaan kollektiivi-30 sesti nimellä "integriinit". Kuten on laita GP IIb-IIIa:n tapauksessakin, kaikki tähän mennessä yleisesti tunnetut integriinit ovat kahdesta alayksiköstä koostuvia molekyylejä, joissa on suurempi alfa-yksikkö (esimerkiksi GP Hb) ja pienempi beta-yksikkö (esimerkiksi GP ma). Eri ϊ 3 104364 integriiniyksiköiden tunnettujen sekvenssien välillä on huomattavassa määrin homologiaa, mikä osoittaa, että integriinit ovat saaneet alkunsa ja kehittyneet yhteisestä esimuodosta. In-tegriinit toimivat useissa erilaisissa solujen adheesioprosesseissa, ja niitä on löydetty leukosyyteistä, endoteelin soluista, sileän lihaskudoksen soluista ja muista verisuonistossa olevista 5 soluista. Koska integriinejä esiintyy laajalti, kun taasen GP IIb-IIIa:n läsnäolo rajoittuu vain * verihiutaleisiin , olisi edullisen aggregoitumisen estäjän selektiivisesti inhiboitava GP ITb- IIIa:ta eikä lainkaan muita integriinejä.

Entuudestaan tunnetaan useita luokkia sellaisia peptidejä, jotka blokkaavat adhesiivisten 10 proteiinien sitoutumisen aktivoituihin verihiutaleisiin ja inhiboivat verihiutaleiden aggregaa-tiota (katso Hawiger et ai., yhdysvaltalainen patentti No. 4661471, Rouslahti et ai., yhdysvaltalaiset patentit No:t 4614517, 4578079 ja 4792525 sekä Iso-Britanniassa tehty hakemus GB 2207922A). Eräässä luokassa peptidejä oleva sekvenssi RGD on kriittinen, ja tetrapeptidi-sekvenssejä RGDS, RGDT, ja RGDC on käytetty hyväksi spesifisesti. Aminohap-15 posekvenssiä RGDX esiintyy useissa erilaisissa adhesiivisissa proteiineissa mukaanlukien Fg, Vn, vWF ja Fn. Tällä mainitulla sekvenssillä on osoitettu olevan tärkeä rooli adhesiivisten proteiinien vuorovaikutuksissa adhesiivisten proteiinien reseptorien kanssa, koska sellaiset peptidit, jotka sisältävät tämän mainitun sekvenssin, estävät adhesiivisten proteiinien sitoutumisen. Katso esimerkiksi Pierschbacher, M.D., et ai., J. Biol. Chem. (1987) 262: 17294-20 17298, Ruggeri et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) (1986) 82: 5708-5712, sekä Rouslahti et ai, Cell (1986) M'· 517-518. Eurooppalaisessa patenttihakemuksessa (EP) 319506, joka on .· julkaistu 7. kesäkuuta 1989 on esitetty sellaisia tetrapeptidejä, joissa on tämä edellä mainittu sekvenssi. PCT-hakemuksessa W089/07609, joka on julkaistu 24. elokuuta 1989, on esitetty sellaisia lyhyitä peptidejä, joiden RGD-sekvenssit sisältävät arginiinin sijaan homoarginiinia.

€ 25

Pierschbacher (katso Pierschbacher, M.D. et ai., J. Biol. Chem. (edellä mainittu viite)) on I tutkinut RGD-sekvenssin sisältävien peptidien sallittuja rakenteellisia vaihteluja. Näissä tut kimuksissa havaittiin, että RGD-sekvenssin manipulointi ei vaikuttanut ainoastaan fibrones-tiinin tai vitronestriinin substraattiin sitoutumisen inhibiitioon vaan saattoi saada vaikuttaa 30 myös siten, että mainitun kahden ligandin sitoutuminen oli erilaista. Mallipeptidinä käytettiin peptidisekvenssiä GRGDSPC, joka saatiin solun fibronestiinin kiinnittymisalueelta. Tiettyjen substituutioiden, kuten esimerkiksi L-Arg:n korvaaminen D-Arg:lla, ollessa kyseessä ei ha- 4 104364 vaittu mitään kummankaan edellä mainitun ligandin sitoutumiseen liittyviä vaikutuksia, mutta korvaamalla D-Ala:lla Gly tai D-Asp:lla L-Asp hävitettiin inhiboiva vaikutus. Edelleen, kun korvaamalla L-Ser D-Ser:llä puolestaan pienennettiin vitronestiinin ja vitrones-tiinireseptorin välisen vuorovaikutuksen inhibitiota, ei tällä oli vain vähän vaikutusta fibro-5 nestiinin ja fibronestiinireseptorin väliseen vuorovaikutukseen. Korvaamalla Ser Asn:lla saatiin puolestaan aikaan sellainen peptidi, joka vahvisti fibronestiinin sitoutumisen inhibitio- » ta, ja pienentynyt vaikutus vitronestiinin sitoutumiseen. Muunlaiset Ser:n korvaamiset saivat aikaan toisenlaisia vaikutuksia. Ser:n korvaaminen treoniinillä sai aikaan sellaisen peptidin, jolla oli voimistunut vaikutus vitronestiinireseptoriin tapahtuvan sitoutumisen inhibiitioon.

10 Vastaavasti L-Pro:n käyttäminen substituenttina sai aikaan inaktiivisen peptidin. Edelleen, valmistettiin myös syklinen peptidi, joka käsitti sekvenssin Gly-Pen-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Cys-Ala, jossa "Pen" tarkoittaa penisillamiinia (muut jo aiemmin edellä käytetyt sekä jäljempänä käytetyt kolmikiijaimiset lyhenteet aminohapoille ovat alan asiantuntijoiden kirjallisuudessa yleisesti käyttämiä) ja jossa muodostui disulfidisilta Pen.n ja Cys:n välille. Tä-15 män keksinnön keksijöiden näkemyksen mukaan penisillamiini sai aikaan sen, että konfor-maatiosta johtuvat rajoitukset rengasrakenteessa tulivat huomattavammiksi, kun taas N-terminaalinen Gly ja karboksiterminaalinen Ala lisättiin, jotta vapaat amino- ja karboksyyli-ryhmät olisivat tulleet kauemmaksi itse renkaasta. Tämä edellä mainittu syklinen peptidi kykeni inhiboimaan vitronestiinin sitoutumista voimakkaammin kuin vastaava peptidi ennen 20 syklisointia, mutta se oli kuitenkin kykenemätön inhiboimaan fibronestiinin sitoutumista.

Taannoin kiijallisuudessa esitettiin antitromboottinen peptidi, joka sisälsi RGD-sekvenssin modifikaation, joka käsitti sellaisen ryhmän "R", joka oli alkyloitu, (katso Saamanen, J., et ai., J. Cell Biochem. (1990) Suppl 14A: A229). RGD:n sisältäviä peptidien rakenne-vaikutus-25 suhteita käsittelevä katsaus on niinikään julkaistu kiijallisuudessa (katso Ali, F.E., et * ai.teoksessa Proc. 11th Am. Peptide Symp.. toimittaneet Marshall et ai., ESCOM, Leiden, ; 1990.)

Eurooppalaisessa patenttihakemusjulkaisussa No. 341915, joka on julkaistu 15. marraskuuta 30 1989, on esitetty kaksi ryhmää peptidejä, joista yksi käsittää lineaarisia ja toinen syklisiä peptidejä ja joiden on esitetty sitoutuvan verihiutaleiden GP Ilb-IIIa-reseptoriin ja täten inhiboivan tämän kykyä sitoutua vWF:n, fibronestiinin ja fibrinogeeni-fibriinin kanssa. Mainitus- i

;S

5 104364 sa julkaisussa ei kuitenkaan ole esitetty mitään sellaisia tuloksia, jotka käsittelevät näiden mainittujen peptidien sitoutumisen spesifisyyttä. Edellä mainittu syklisten peptidien ryhmä käsittää RGD-sekvenssin modifikaatioita, joissa R on korvattu D- tai L-homoarginiinilla, dimetyyli- tai dietyyliarginiinilla, lysiinillä tai näiden mainitujen ryhmien alfa-alkyloiduilla 5 johdoksilla. Pienimmät kyseeseen tulevat sykliset rakenteet käsittävät yksinkertaisesti t- "R"GD-sekvenssin, joka on sitoutuneena niiden kahden ryhmän/aminohappotähteen väliin, jotka muodostavat disulfidisidoksen.

•'

Erillinen luokka inhibiittoreina toimivia peptidejä perustuu sellaisiin peptidisekvensseihin, 10 joiden esikuvana on karboksiterminaalinen sekvenssi, joka esiintyy fibrinogeenin gamma-ketjussa, eli dodekapeptidi HHLGGAQKAGDV (Kloczewiak et ai., Biochemistry (1989) 2& 2915-2919, Timmons et ai., (sama teos), 2919-2923, yhdysvaltalainen patentti No. 4661471 (kuten yllä) sekä EP-hakemus No. 298820). Vaikka tämä mainittu sekvenssi inhiboi Fg:n ja vWF:n sitoutumista GP IIb-IIIa:n kanssa ja tämän seurauksena myös verihiutaleiden aggre-15 gaatiota, kyseisen peptidin käyttökelpoisuus on rajoitettu, koska sen vuorovaikutusten affiniteetti verihiutalereseptorien kanssa on alhainen (IC50 = 10- 100 μΜ).

Hiljattain useat tutkimusryhmät ovat eristäneet ja karakterisoineet uuden ryhmän alhaisen molekyylipainon omaavia polypeptidifaktoreita käärmeiden myrkyistä, joilla mainituilla po-20 lypeptideillä on suuri affiniteetti GP Ilb-IIIa-kompleksiin. Huang, T.-F. et ai. (J. Biol. Chem. (1987) 262: 16157-16163, sekä Biochemistry (1989) 28: 661-666) ovat esittäneet primäärisen rakenteen trigramiinille, joka on 72:n aminohapon muodostama peptidi, joka sisältää RGD:n ja kuusi disulfidisiltaa ja joka on eristetty Trimeresurus gramineus'ista. Gan et ai. ovat kuvanneet (katso Gan, Z.-R., et ai., J.Biol.Chem. (1988) 261- 19827-19832) ominaisuudet ja raken-y 25 teen ekistatiinille, joka on 49 aminohapon muodostama peptidi, joka sisältää myös RGD:n ja otaksutusti neljä disulfidisiltaa ja joka on eristetty Echis carinatus'in myrkystä. Williams et ai. \ (katso Williams. J.A.. et ai.. FASEB Journal Π8981 3: A310. Abstr. No. 487ml ovat esittä- neet tuloksia koskien edellä mainittujen sukulaisyhdisteiksi katsottavien peptidien, elegantii-nin, albolabriinin ja flavoviridiinin, sekvenssejä ja ominaisuuksia. Lisäksi, Shebuski et ai. 30 ovat esittäneet bitistatiinin karakterisoinnin (katso Shebuski, R.J., et ai., J. Biol. Chem (1989) 264: 21550-21556). Edelleen, kiijallisuudessa on esitetty Agkistrodon piscivorus piscivorus'-ista peräisin oleva PAI (katso Chao, B.H., et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1989) M: 8050- 6 104364 8054. Kiijallisuudessa on niinikään käsitelty sellaisten GP nb-IIIa:n eri antagonistien suhdetta toisiinsa, joita mainittuja antagonisteja saadaan käärmeiden myrkyistä (katso Dennis, MS., et ai., Proc.Natl.Acad. Sei. USA (1989) SZ: 2471-2475).

5 Tähän edellä esitettyyn ryhmään inhibiittoripeptidejä, joita saadaan käärmeiden myrkyistä, kuuluvat alboabriini, jota saadaan Trimeresurus albolabris'ista. elegantiini, jota saadaan X* elegans'ista. flavoviridiini, jota saadaan L flavoviridis'istä. batroksostatiini, jota saadaan Bothrops atrox'ista. sekä bitistatiini, jota saadaan Bitis arietans'ista (katso Niewiarowski, S., et ai., Thromb. Haemostas. (1989) £2: 319 (abstr. SY-XIV-5). Lisäksi, applagiinia on puhdis-10 tettu Agkistrodon p, piscivorus'ista (katso Chao, B., et ai. Thromb. Haemostas (1989) £2: 50 (abstr. 120)) sekä halysiinia Agkistrodon halvs'ista (katso Huang, T.F., et ai., Thromb. Haemostas· (1989) £2: 48 (abstr. 112). Kaikilla näillä edellä mainituilla peptideillä ilmenee sekvenssien suhteen homologiaa huomattavassa määrin. Lisäksi, kaikki tähän päivään mennessä yleisesti tiedossa olevat käärmeiden myrkyistä saatavat peptidit, jotka inhiboivat adhesiivis-15 ten proteiinien sitoutumista integriinireseptoreihin, sisältävät aiemmin edellä mainitun RGD-sekvenssin.

Vaikka kaikki nämä edellä mainitut käärmeiden myrkyistä saatavat faktorit ovatkin voimakkaita verihiutaleiden aggregaation inhibiittoreita in vitro, nämä kyseiset peptidit sitoutuvat 20 suurella affiniteettilla myös muihin adhesiivisten proteiinien ryhmään kuuluviin reseptoreihin, kuten esimerkiksi vitronestiini-ja fibronestiinireseptoreihin (katso Knudsen, K.A., et ai.,

Exp. Cell Res. (1988) 179: 42-49, sekä Rucinski, B., et ai., Thromb. Haemostas. (1989) £2: 59 (abstr. 120). Tämä käärmeiden myrkkyjen faktorien spesifisyyden puute GP nb-IIIa:lle on epäedullinen ominaisuus niiden terapeuttisen käytön kannalta trombien muodostumisen in-25 hibiittoreina, koska ne voivat mahdollisesti vaikuttaa myös muiden solujen adhesiivisiin - ominaisuuksiin verisuonistossa, erityisesti sellaisiin adheesiovuorovaikutuksiin, jotka ovat ] integriinien välittämiä. *

Toinen lähestymistapa, joka on kehitetty verihiutaleperäisten trombien inhibiittorien aikaan 30 saamiseksi, on ollut hiiren anti-GP Hb-IIIa monoklonaalisia vasta-aineita, jotka blokkaavat adhesiivisten proteiinien sitoutumisen stimuloituihin verihiutaleisiin. Näitä mainittuja monoklonaalisia vasta-aineita on käytetty sepelvaltimon reokkluusion estämiseen kudoksen 7 104364 plasminogeenin aktivaattorin reperfuusion jälkeen koirilla (Yasuda, t., et ai., J. Clin. Invest. (1988) Si: 1284-1291) ja estämään syklistä virtauksen vähenemistä vaurioituneissa koiran sepelvaltimoissa vakavissa stenoositapauksissa. Tällaisten mainittujen monoklonaalisten vasta-aineiden mahdolliset sivuvaikutukset ihmisillä voivat johtua näiden mainittujen vasta-5 aineiden pitkäaikaisista vaikutuksista ja niiden mahdollisesta immunogeenisyydestä.

Γ

Jv

Selvästikin, tarvitaan lisää terapeuttisia hoitotapoja estämään tai ainakin lieventämään haitallisten trombien muodostumista. Erityisesti, sellaisia terapeuttisia aineita, jotka kykenisivät blokkaamaan tai inhiboimaan trombien muodostumista spesifisissä kohdissa ilman, että ne 10 häiritsevät hemostaasia, ja ilman, että ne vaikuttavat muihin solutason adheesioprosesseihin, käyttämällä saavutettaisiin huomattavia terapeuttisia etuja. Ideaalisesti nämä tällaiset mainitunlaiset terapeuttisesti vaikuttavat ainesosat olisivat vaikutukseltaan vahvoja, spesifisiä GP IIb-IIIa:lle ja ei-immunogeenisiä useimmille potilaille. Nämä mainitut ainesosat olisivat edelleen helposti annosteltavia ja annettavia, stabiileja sekä taloudellisesti edullisia valmistaa.

15 Edelleen, näiden mainittujen ainesosien vaikutuksen tulisi olla transientti ja niiden tulisi kyetä vaikuttamaan trombin muodostumisen aikaisimmissa vaiheissa ilman, että ne häiritsevät hemostaasia pitkällä aikavälillä. Tämän keksinnön mukailsella menetelmällä valmistetut PAI:t täyttävät tässä edellä esitetyt ja muut niihin liittyvät vaatimukset.

20 Seuraavassa selitetään tätä keksintöä lähemmin.

Keksinnön keskeisenä kohteena on menetelmä sellaisten peptidien tai peptidien tapaisten . · yhdisteiden valmistamiseksi, jotka yleensä ovat sellaisia verihiutaleiden aggregaation inhibiit- toreita, jotka kykenevät inhiboimaan Fg:n tai vWF:n sitoutumista GP nb-HIa:n kanssa huomattavasti tehokkaammin kuin, missä määrin ne inhiboivat vitronestiinin sitoutumista vitro-- * 25 nestiinireseptorin kanssa tai fibronestiinin sitoutumista fibronestiinireseprorin kanssa. Näille edellä mainituille peptideille on luonteenomaista se, että niissä sitoutuva sekvenssi K*GDX \ sitoutuvan RGDX-sekvenssin sijaan, joka taas esiintyy kaikissa entuudestaan tunnetuissa PAI-protehneissä. K* tarkoittaa tässä substituoitua tai substituoimatonta lysyylitähdettä, joka on yleiskaavan 30 R12N(CH2)4CHNHCO- mukainen, jossa yleiskaavassa kukin ryhmä R1 on erikseen joko H tai jokin substituentti, joka on riittävän suuressa määrin elektroneja luovuttava, ettei viereisen typpiatomin emäksisyys lakkaa, ja jossa esiintyvistä metyleeniryhmistä yksi tai kaksi voi olla 8 104364 vaihtoehtoisesti korvattuna joko O- tai S-atomeilla siten kuin jäljempänä on esitetty. £* mila-rus barbouri'sta eristetty barburiinin PAI on yksi esimerkki tähän mainittuun sarjaan kuuluvista peptideistä. Voidaan kuitenkin käyttää myös tämän mainitun peptidin lyhyempiä muotoja samoin kuin analogisia sekvenssejä, joissa on niinikään 1-10 aminohappotähdettä modifioi-5 tu jossain toisessa kohdassa peptidiketjua ja/tai muilla vaihtoehtoisilla sidoksilla korvautuneita peptidisidoksia. Muihin tätä keksintöä havainnollistaviin ja sen mukaisiin suoritustapoihin kuuluu sellaisten eristettyjen PAI-peptidien käyttö, joiden mainittujen peptidien sisältämä RGDX-sekvenssi on korvautunut K*GDX-sekvenssiIlä. Kuten barburiininkin tapauksessa, nämä mainitut eristetyt PAI:t voivat olla muutoin natiivissa muodossa, tai ne voivat olla kat-10 kaistuja ja/tai ne voivat sisältää 1-10 aminohappotähdettä, joiden kohdalla on suoritettu substituutio tai ne on poistettu, ja/tai ne voivat sisältää peptidisidoksia, jotka ovat korvautuneet sellaisilla sidoksilla, jotka eivät ole peptidisidoksia.

Edelleen eräs yhdisteryhmä, joka kuuluu tämän keksinnön menetelmän piiriin, on sellainen, 15 johon kuuluvat edellä kuvatut yhdisteet sellaisina, kuin en on kuvattu paitsi, että RGD- tai K*GD-sekvenssin sisältämä glysyylitähde on korvautunut sarkosyylitähteellä. Tähän mainittuun yhdisteryhmään kuuluvilla aineilla on vastaava teho ja spesifisyys kuin RGD- tai K*GD-pitoisillakin peptideillä.

20 Tämä keksintö koskee menetelmiä valmistaa sellaisia kaavan [I] mukaisia peptidejä tai modifioituja peptidejä, joilla on spesifinen PAI-aktiivisuus 9 i : i Y1-X1- (AA-l^-K - (G/Sar)-D-(AA2)n2-(AA3)n3-(AA4)n4-X2-Y2 [I] 25 missä K* on joko substituoitu tai substituoimaton lysyylitähde, joka on kaavan . R12N(CH2)4CHNHCO- mukainen, kuten jo aiemmin edellä on esitetty, missä kukin ryhmä R1 on erikseen H, alkyyli (1-6 Q tai enintään yksi R1 on R2-C=NR3, missä R2 on H, alkyyli (1-6 C) tai substituoitu tai substituoimaton fenyyli- tai bentsyylitähde, tai sellainen NR42, jossa kukin R4 on erikseen H tai alkyyli (1-6 C), sekä missä 30 R3 on alkyyli (1-6 C), fenyyli- tai bentsyylitähde, tai R -C=NR on radikaali, joka on valittu ryhmästä, joka käsittää seuraavat yhdisteet: 9 104364 N\ X/N n'^'n n^n \-J w W j. \ / / \ {CHR5)m

M

R5 R5 t missä m on pieni kokonaisluku (2-3), ja kukin R5 on erikseen joko H tai alkyyli (1-6 C),

5 ja missä yksi tai kaksi (CH2):ta voidaan korvata 0:11a tai S:llä siten, että mainittu O tai S

ei ole toisen heteroatomin vieressä, AA, on pieni, neutraali (poolinen tai pooliton) aminohappoja nl on kokonaisluku välillä 0-3, AA2 on neutraali, pooliton suuri (aromaattinen tai ei-aromaattinen) tai poolinen aro-10 maattinen aminohappo ja n2 on kokonaisluku välillä 0-3, AA3 on proliinitähde tai modifioitu proliinitähde (määritelty jäljempänä) ja n3 on kokonaisluku välillä 0-1, AA4 on neutraali, pieni aminohappo tai sen N-alkyloitu johdos ja n4 on kokonaisluku välillä 0-3, 15 kumpikin X, ja X2 erikseen käsittää sellaisen tähteen, joka on kykenevä muodostamaan sidoksen X, ja X2 välille rengasrakenteisen yhdisteen aikaan saamiseksi siten kuin on esitetty, sekä kumpikin Y, ja Y2 ovat erikseen sellaisia substituentteja, jotka eivät vaikuta sitoutumi- * ’ . seen tai vaikutusmekanismiin, tai ne voivat myös puuttua, edelleen, 20 missä yksi tai useampia voi valinnaisesti olla korvautunut sellaisella sidoksella, joka on valittu ryhmästä, joka käsittää -CH2NH-, -CH2S-, -CH2S-. -CH=CH- (ds ja transh -COCHr, * * -CH(OH)CHr ja -CH2SO- ryhmät, sillä varauksella, että jos n3 on nolla, joko i * ’i 1) n2:n ja n4:n summan tulee olla vähintään kaksi, tai 25 2) K* :n on oltava jokin muu kuin Har tai K, tai 3) ainakin toisen X,:stä ja Xy.sta on oltava jokin muu kuin Cys (C), penisillamiini (Pen), tai 2-amino-3,3-syklopentaanimetyleeni-3-merkaptopropionihappo (APmp), tai 4) Y,:n ja Y2:n tulee käsittää ainakin yksi aminohappotähde, tai ίο 104364 5) yhden tai useamman peptidisidoksen tulee olla korvautunut jollakin toisella edellä mainitulla vaihtoehtoisella sidoksella.

Keksintö koskee menetelmiä näiden mainittujen yhdisteiden syntetisoimiseksi in vitro.

J

Seuraavassa on esitetty lyhyt kuvaus kaavakuvista. i

Kuviossa 1 on esitetty fibrinogeenin sitoutumisen GP IIb-IIIa:n kanssa inhibitio osittain puhdistettujen käärmeiden myrkkyjen vaikutuksesta.

w

Kuviossa 2 on esitetty annos-vaste adheesion inhibition suhteen puhdistamattomien käärmeiden myrkkyjen Centricon-10 ultrasuodoksista sekä fibrinogeeni/GP Ilb-IIIa- että vit-ronestiini/vitronestiinireseptorimäärityksissä.

15 Kuviossa 3 on esitetty HPLC-profiili puhdistamattomalle PAI:lle, joka on saatu Eristicophis macmahoni'n myrkystä. Vaijostettu alue käsittää biologisesti aktiiviset fraktiot.

Kuviossa 4 on esitetty HPLC-profiili kuvan 3 PAI-fraktioille. Vaqostettu alue käsittää bioaktiiviset fraktiot.

20

Kuviossa 5 on esitetty analyyttinen HPLC-profiili kuvan 4 PAI-fraktioille.

«

Kuviossa 6 on esitetty täydelliset aminohapposekvenssit eristikofiinille, barburiinille, ter-gemiinille, kerastiinille, ruberiinille, lakesiinille, kotiariinille, krotatroksiinille, horridiinille, 25 lutosiinille, viridiinille, molossiinille, basilisiinille, durissiinille, jararasiinille, sereberiinille ja oreganiinille, sekä entsymaattisesti hajoittamalla saadut fragmentit, jotka on määritetty auto-1. matisoidun Edman-degradaation avulla.

Kuviossa 7 on esitetty HPLC-profiili PALlle, joka on saatu G-50 fraktioista puhdistamatto-30 masta Si strums & tergeminus’in myrkystä.

* Kuviossa 8 on esitetty HPLC-profiili kuvan 7 PAI-fraktioille.

11 104364

Kuviossa 9 on esitetty kuvan 8 puhdistetun PAI:n määritetty aktiivisuus sitoutumisen inhibiittorina useiden eri reseptorien kohdalla.

5 Kuviossa 10 on esitetty HPLC-profiili sellaiselle verihiutaleiden aggregaation inhibiittorille, , joka on saatu puhdistamattoman Sistrurus m. barbouri'n myrkyn G-50 fraktioista. Vaijostetut alueet käsittävät bioaktiiviset fraktiot.

Kuviossa 11 on esitetty HPLC-profiili kuvan 10 aktiivisille PAI-fraktioille.

10

Kuviossa 12 on esitetty lukuisten eri PAI-aminohapposekvenssien vertailu barburiinin kanssa.

Kuviossa 13 on esitetty HPLC-profiili puhdistamattomalle PALlle, joka on saatu Lachesis 15 mutas'in myrkystä. Vaijostetut alueet käsittävät biologisesti aktiiviset fraktiot.

Kuviossa 14 on esitetty HPLC-profiili kuvan 13 PAI:n aktiivisille fraktioille. Vaijostetut alueet käsittävät biologisesti aktiiviset fraktiot.

20 Kuviossa 15 on esitetty analyyttinen HPLC-profiili kuvan 14 PAI-fraktioille, jotka on saatu Lachesis mutas'ista.

Kuviossa 16 on esitetty HPLC-profiili puhdistamattomalle PALlle, joka on peräisin Crotalus viridis viridis'in myrkystä. Vaijostetut alueet käsittävät biologisesti aktiiviset fraktiot.

- * 25

Kuviossa 17 on esitetty HPLC-profiili kuvan 16 fraktioille.

7 «

Kuviossa 18 on esitetty annos-vaste-vaikutuksia puhdistetuille käärmeiden myrkkyjen peptideille sitoutumisen fibrinogeeni/GP Ilb-IIIa ollessa kyseessä verrattuna ekistatiiniin.

30

Kuviossa 19 on esitetty annos-vaste-vaikutuksia puhdistettujen käärmeiden myrkkyjen sisäl-• tämien peptidien aikaan saamalle ADP (4uM) indusoidun humaanin verihiutaleiden aggregoi- 104364 12 tumisen inhibitiolle runsaasti verihiutaleita sisältävässä plasmassa (PRP, platelet rich plasma) verrattuna ekistatiiniin.

Kuviossa 20 on esitetty iL cerastes'in myrkyn HPLC-fraktionnilla aikaan saatu aktiivisuus 5 profiili.

.1

Kuviossa 21 on esitetty kuvan 20 aktiivisten fraktioiden HPLC-analyysin tulokset.

Kuviossa 22 on esitetty £L ruber ruber'in myrkystä saadun PAI:n HPLC-fraktioinnin avulla 10 saatu aktiivisuusprofiili.

Kuviossa 23 on esitetty analyyttisen C-18-kolonnin avulla aikaan saatu aktiivisuusprofiili homogeeniselle peptidille, joka on saatu atrox'ista.

15 Kuviossa 24 on esitetty analyyttinen HPLC-profiili homogeeniselle peptidille, joka on eristetty Bothrops cotiara'sta.

Kuviossa 25 on esitetty annos-vaste-vaikutuksia puhdistetulle kotiariinille fibrinogeenin sitoutumisen inhibition GP IIb-IIIa:n kanssa ollessa kyseessä sekä vitronestiinin sitoutumisen 20 inhibition vitronestiinireseptoriin ollessa kyseessä.

Kuviossa 26 on esitetty puhdistettujen käärmeiden myrkkyjen peptidien vaikutuksia fibrinogeenin sitoutumisen inhibitioon GP IIb-IIIa:n kanssa ja vitronestiinin sitoutumisen inhibiti-oon vitronestiinireseptorin kanssa.

25

Kuviossa 27 on esitetty sitoutumisaktiivisuutta koskevia tuloksia analogille #1, [E28L4IC64]barburiini(28-73), GP nb-IIIa:n ja vitronestiinireseptorin ollessa kyseessä.

Kuviossa 28 on havainnollisesti esitetty synteettisen eristikofiinianalogin kyky inhiboida fib-30 rinigeenin sitoutumista GP IIb-IIIa:n kanssa ja kykenemättömyys inhiboida vitronestiinin sitoutumista vitronestiinireseptorin kanssa.

,3 104364

Kuviossa 29 on esitetty lineaaristen ja syklisten RGDW-yhdisteiden kyky inhiboida fibrino-geenin sitoutumista GP IIb-IIIa:n kanssa.

Kuviossa 30 on esitetty useiden erilaisten KGDW-analogien kyky inhiboida fibrinogeenin 5 sitoutumista GP IIb-IIIa:n kanssa ja vitronestiinin sitoutumista vitronestiinireseptorin kanssa.

Kuviossa 31 on esitetty useiden erilaisten natiivien ja synteettisten verihiutaleiden aggregaa-' tion inhibiittorien kyky inhiboida M21 melanoomasolujen kiinnittymistä vitronestiiniin.

10 Kuviossa 32 on havainnollisesti esitetty RGDS:n ja syklisten RGD-yhdisteiden kyky inhiboida M21 melanoomasolujen kiinnittymistä vitronestiiniin ja syklisen KGDW-analogilta puuttuvaa kykyä inhiboida M21 melanoomasolujen kiinnittymistä vitronestiiniin.

Kuviossa 33 on esitetty analogin numero 60, Mpr-(Har)-G-D-W-P-C-NH2, aktiivisuus veri-15 hiutaleiden aggregaation ja solujen adheesion vitronestiiniin inhibitiossa.

Kuviossa 34 on esitetty Kuviossa 33 esitetyn mukaiset aktiivisuudet analogille numero 19, Mpr-K-G-D-W-P-C-NH2.

20 Kuviossa 35 on esitetty syklisten virtausten pienenemisten (CFR:t) initiaatio tromboosin avoimessa koiran rintakehän mallissa (Folts Model).

Kuviossa 36 on esitetty 10 mg:n annoksen vaikutus tromboosin avoimessa koiran rintakehä-mallissa initioituihin CFRriin (Folts Model).

v 25 Kuviossa 37 on esitetty 40 mg:n tabletin muodossa annetun annoksen vaikutus tromboosin avoimessa koiran rintakehämallissa initioituihin CFR:iin (Folfin malli).

• i * *

Kuviossa 38 on esitetty kokopitkä DNA-sekvenssi, joka sisältää barburiinin(l-73) aminohapposekvenssin koodin.

30

Kuviossa 39 on esietty DNA-sekvenssi, joka sisältää PhoA-esisekvenssiin kiinnittyneen [M-, 1L41 jbarburi ini( 1 -73) :n koodin.

14 104364

Kuviossa 40 on esitetty DNA-sekvenssi, joka sisältää PhoA-esisekvenssiin (leader sequence) kiinnittyneen analogin #1 koodin, kun kyseessä on bakteereissa ilmenevä ekspressio.

5 Kuviossa 41 on esitetty PCR-reaktiossa käytetyt oligonukleotidit, joiden avulla aikaan saadaan sellaista DNA:ta, joka sisältää analogin #1 koodin. Ne aminohapot, jotka sisältyvät itse « analogiin on esitetty lihavoiduin kiijasimin.

Kuviossa 42 on esitetty analogin #1 koodaavan DNA:n peräkkäisissä toistoissa (tandem re-70 peats) tarvittavan liitossekvenssin (junction sequence).

Kuviossa 43 on esitetty kaavakuva katkaistusta (truncated) barburiinin geenistä peräkkäistois-toina (tandem repeats).

15 Seuraavassa selitetään tämän keksinnön edullisia suoritustapoja.

Tämä keksintö saa edullisesti aikaan sellaisia verihiutaleiden aggregaation inhibiittoreita (PAI), joita voidaan eristää käärmeiden myrkyistä, jotka on todettu aktiivisiksi, ja yhdisteitä, joilla on saman tapainen rakenne kuin näillä edellä mainituilla inhibiittoreilla, ja joita mainit-20 tuja samantapaisia yhdisteitä voidaan syntetisoida käyttäen sellaisia tavanomaisia tekniikoita ja menetelmiä in vitro, kuten esimerkiksi kiinteän faasin peptidisynteesi. Jotkin näistä maini-. tuista inhibiittoreista ovat uniikilla tavalla spesifisiä verihiutaleiden aggregaation inhibitiolle eivätkä ne näin ollen inhiboi muiden vaihtoehtoisten integriinien ryhmään kuuluvien aineiden sitoutumista. Toisilla mainituista inhibiittoreista on toisenlaiset spesifisyysalueet. Jäljempänä 25 esitetyt kuvaukset käsittelevät luonnossa esiintyvien PAI:ien erottamista käärmeiden myrkyistä, sellaisten inhibiittorien suunnittelua, jotka mainitut inhibiittorit ovat huomattavasti voimakkaampia inhibiittoreita verihiutaleiden aggregaation suhteen kuin, esimerkiksi, vitro- 7 * nestiini/vitronestiinireseptorivuorovaikutuksen suhteen, ja jotka saadaan aikaan sisällyttämällä niihin K1GD-sekvenssi RGD-sekvenssin sijaan, menetelmiä näiden mainittujen peptidien 30 syntetisoimiseksi, rekombinanttien tuotanto menetelmiä, tämän keksinnön mukaisten peptidien vasta-aineita, sellaisia määritysmenetelmiä, jotka tekevät mahdolliseksi PAI-pitoisten 15 104364 käärmeiden myrkkyjen tunnistamisen, sekä tämän keksinnön mukaisen PAI:ien annostelua, antotapaa ja hyväksi käytettävyyttä.

Tässä PAI tarkoittaa sellaista faktoria, joka kykenee estämään stimuloitujen verihiutaleiden 5 aggregaation vakiomäärityksissä, kuten esimerkiksi niissä joita kiijallisuudessa ovat esittä-, neet Gan, Z.-R. et ai. sekä Huang, T.-F. et ai. (katso aiemmin edellä esitettyjä viitteitä). Näis sä mainituissa määrityksissä pestyt verihiutaleet saatettiin yhteen fibrinogeenin, Ca2+ ja testat- * tavan materiaalin kanssa. Tällöin verihiutaleita stimuloidaan ADP:n (tai jonkin muun entuudestaan yleisesti tiedossa olevan stimulantin tai stimulanttien yhdistelmän) ja aggregoitumi- 10 nen (tai sen puuttuminen) havaitaan esimerkiksi kaupallisesti saatavilla olevan aggregometrin avulla.

Jotkin tämän keksinnön mukaiset PAI-faktorit tunnistetaan spesifisiksi inhibiitoreiksi fibrinogeenin ja/tai vWF:n sitoutumiselle GP IIb-IIIa:n kanssa. Alan asiantuntija saattaa helposti 15 ymmärtää, että spesifisyyden suhteen on kyse aste-eroista, minkä vuoksi sellainen PAI, joka "on spesifinen inhibiittori Fg:n tai vWF:n sitoutumiselle GP nb-IIIa:n kanssa inhiboi tätä kyseistä sitoutumista huomattavasti suuremmassa määrin kuin, mitä se inhiboi Fn:n sitoutumista FnR:iin tai Vn:n sitoutumista VnR:n kanssa". Sanonnalla huomattavasti suuremmassa määrin tarkoitetaan joko, että inhibition prosenttiosuus on vähintään kaksi kertaa suurempi 20 kulloinkin kyseessä olevalla PAI:n konsentraatiotasolla, tai, että se PAI:n konsentraatio, joka saa aikaan 50 prosentin inhibition on ainakin kaksi kertaa pienempi, Fg:n tai vWF:n sitoutumisen inhibition GP Ilb-IIIam kanssa ollessa kyseessä kuin mitä se on muiden mahdollisten ligandi/reseptori-sitoutumisten ollessa kyseessä. 1 25 Seuraavassa selitetään eristetyn natiivin PAI:n ominaisuuksia ja menetelmiä sen puhdistami seksi.

* · Tämän keksinnön mukaisiin verihiutaleiden aggregaation inhibiittoreihin (PAI) kuuluu alhaisen suhteellisen moolimassan omaavia peptidejä, joita voidaan valmistaa eristetyssä muo-30 dossa siten, kuin jäljempänä on kuvattu, sellaisista käärmeiden myrkyistä, jotka on tunnistettu aktiivisiksi, mikä tarkoittaa, että niiden on havaittu tässä jäljempänä kuvatun tämän keksinnön mukaisen menetelmän avulla sisältävän PAI:a.

104364 Tässä kuvatu menetelmän avulla voidaan helposti identifioida ja karakterisoida vaikuttava PAI:n läsnäolo käärmeen myrkyssä, joka mainittu PAI inhiboi selektiivisesti sitoutumista GP IIb-IIIa:n kanssa toisin kuin on laita sellaisten muiden integriinien kyseessä ollen, kuten esi-5 merkiksi vitronestiinireseptorin tai fibronestiinireseptorin tapauksissa. Suoritettaessa mainitunlaista identifiointia sekä, vaihtoehtoisesti ja optimaalisessa tapauksessa, karakterisointia ' voidaan mainittu PAI eristää ja puhdistaa käyttämällä hyväksi useita erilaisia standarditeknii-koita, joita on havainnollistettu tässä keksinnössä ja joita tunnetaan jo entuudestaan yleisesti kirjallisuuden perusteella. Esimerkiksi voidaan käyttää sellaista eri erottamismenetelmien 10 yhdistelmää, joka perustuu suhteelliseen moolimassaan (tyypillisesti otetaan talteen aineet joilla tämä < 10 kd), ioninvaihtokromatografiaan ja käänteisfaasi-HPLC:aan. Edelleen, voidaan käyttää myös muita tekniikoita, mutta käyttökelpoinen menetelmä, jota voidaan soveltaa mistä tahansa aktiivisesta käärmeen myrkystä saataviin PAI-faktoreihin, on esitetty seuraa-vassa.

15

Noin 10-1000 mg myrkkyä liuotetaan laimeaan etikkahappoon ja lasketaan puhdistuskolon-nin (esikolonnin), kuten esimerkiksi Sephadex G-50 kolonnin, läpi ja eluoidaan samalla liuottimena. Kunkin fraktion aktiivisuus tutkitaan käyttäen Fg/GP IIb-IIIa:n sitoutumiseen perustuvaa tämän keksinnön mukaista määritysmenetelmää, standardi määritystä verihiutalei-20 den aggregaatiolle (PAA) tai mitä tahansa vastaavaa määritysmenetelmää, joka perustuu ad-hesiivisen proteiinin sitoutumisen aktiivisuuteen GP IIb-IIIa:n kanssa. Vaihtoehtoisesti, . myrkkyffaktion sisältämä <10 kd:n fraktio voidaan ottaa talteen käyttämällä ultrasuodatusta j a tutkia vastaavalla tavalla.

25 Kummalla tahansa mainituista menetelmistä saatu alhaisen suhteellisen moolimassan omaava «· fraktio syötetään preparatiiviseen C-18 HPLC-kolonniin, kuten esimerkiksi C-18 Delta Pak käänteisfaasi-HPLC-kolonniin, jota saa Watersin toimittamana, joka on stabiloitu etukäteen seoksella, joka sisältää 0,1 % trifluorietikkahappoa(TFA)/8 % asetonitriiliä. Tämän jälkeen adsorboitunut PAI eluoidaan käyttäen liuotingradienttia, joka saadaan aikaan 8-60 % ase-30 tonitriiliä 0,1 prosentissa TFA:ta. Gradientin jyrkkyys ja eluentin virtausnopeus optimoidaan käyttäen tavanomaisia menetelmiä. Aktiiviset fraktiot määritetään PAA:n avulla tai tämän keksinnön mukaisella sitoutumiseen reseptorien kanssa perustuvalla menetelmällä. Tämän a 17 104364 jälkeen aktiiviset fraktiot yhdistetään, väkevöidään ja niiden homogeenisyys tutkitaan käyttäen analyyttistä HPLC:tä tai SDS-PAGE:a. Lisäpuhdistuksia suoritetaan käänteisfaasi-HPLCrn avulla käyttäen hyväksi gradienttiajoa, kunnes talteen otettu PAI on homogeenista.

5 Tämän keksinnön mukaisiin PAI-faktoreihin, joita saadaan edellä selitetyllä tavalla menetel-< Ien tai muita puhdistusmenetelmiä hyväksi käyttäen, kuuluvat muunmuassa sellaiset, joita saadaan tyhmästä, joka käsittää Echis colorata'n. Eristicophis macmahonii'n. A, hvpnale'n. A* acutus'in, A, piscivorous leucostoma'n. A* piscivorus conanti'n, Bothrops asperin. Bothrops cotiara'n. B jararaca'n. B jararacussu'n. B lansbergi'n. B medusa'n. B nasuta'n. B neuwie-10 di'n, B pradoi'n, B schkgii'n, Crotalus attox'in, B basilicus'in. B cerastes cerastes'in. B durissus durissus'in, B durissus totonatacus'in. B horridus horridus'in. B molossus molos-sus'in, B ruber rubcr'in, B viridis cereberus'in. Crotalus v, helleri'in. Crotalus v, lutosus'in. Cralalus 3L oreganus'in, Crotalus v, viridis'in. Lachesis mulas'in, Sistrurus catenatus tergemi-nus'in sekä Sistrurus milarus barbouri'n.

15 Näistä mainituista edullisia ovat eristetyssä muodossa olevat PAI:t, joita valmistetaan tai joilla on vastaavat aminohapposekvenssit kuin niillä, joita saadaan Eristicophi macma-honii’sta (eristikofiini), Bothrops cotiara'sta (kotiariini), B jararacussu'sta. Crotalus atrox’ista (krotatroksiini), Crotalus basilicus'ista (basilisiini), B cerastes cerastes'ista (kerastiini), B 20 durissus totonatacus'ista (durissiini), Crotalus sL durissus’ista (durissiini), B L horridus'ista (horridiini), Crotalus m. molossus'ista (molossiini), B ruber ruber'ista (ruberiini), Crotalus ; viridis Iutosus'ista (lutosiini), B 5L viridis1 istä (viridiini), Crotalus v, oreganus (oreganiini),

Crotalus v, helleri'stä. Lachesis mutas (lakesiini), Sistrurus catenatus tergeminus'ista (ter-geminiini) sekä SL milarus harbouri'sta (barburiini). Erityisen edullisia ovat sellaiset PAI:t, 25 jotka kykenevät inhiboimaan spesifisesti Fg:n tai vWF:n sitoutumista GP IIb-IIIa:n kanssa, kuten esimerkiksi Sistrurus m. barbouri'sta saatava PAI.

» ·

Erittäin edullisia ovat eristikofiini, kotiariini, krotatroksiini, kerastiini, durissiini, horridiini, ruberiini, lakesiini, basilisiini, lutosiini, molossiini, oreganiini, viridiini, tergemiini ja barbu- 30 riini.

18 104364 Tämän keksinnön mukainen puhdistettu PAI voidaan sekvensoida tavanomaisin menetelmin, mikä täten tekee mahdolliseksi käyttää synteesissä vakiintuneita kiinteän faasin tekniikoita (erityisesti lyhyempien kulloinkin kyseessä olevan PAI:n muotojen kohdalla) tai rekombi-nanttien tuottamista. Esimerkiksi voidaan käyttää saatavilla olevia sekvenaattoreita 5 (esimerkiksi Applied Biosystems Sequenator) peptidin karboksiamidometyloinnin tai pyri-dyylietyloinnin jälkeen (katso Huang, et al.J. Biol. Chem. (1987) 262: 16157-16163), minkä jälkeen näytteestä poistetaan suola C-18 Delta Pak- kolonnin avulla käyttäen 0,1 % TFA:a ja asetonitriiliä eluenttina.

10 On ymmärrettävää, että eristetyssä muodossa oleva PALa, jonka sisältämä aminohapposekvenssi on määritetty, voidaan silloin, kun se syntetisoidaan in vitro, modifioida mainittua sekvenssiä muuntamalla, mikä ei tuhoa sen aktiivisuutta. Yleisesti ottaen, nämä mainitut modifioidut muodot eroavat natiiveista muodoitsa 1-10:n, edullisesti l-4:n, aminohapon substituution suhteen tai ovat katkaistuja muotoja. Lisäksi, yksi tai useampia niiden sisältä-15 mistä voi olla korvautunut jollakin vaihtoehtoisella sidoksella siten, kuin tässä jäljempänä on selitetty. Erityisen edullinen substituutio on sellainen, jossa RGD on korvattu K*GD:llä, jotta saataisiin jäljempänä kuvatunlainen spesifisyys GP IIb-IIIa:lle.

Sistrurus m. barbouri'sta saatava PAI on puhdistettu homogeeniseksi ja sekvensoitu sekä ni-20 metty "barburiiniksi". Toisin kuin ne GP Ilb-IIIa: suhteen adhesiiviset proteiinit, jotka on tähän mennessä identifioitu, ja käärmeiden myrkyistä saatavat peptidit, jotka blokkaavat GP . IIb-IHa:n toiminnan, barburiini ei sisällä entuudestaan alan asiantuntijoiden tiedossa olevien adhesiivisten proteiinien vakiosekvenssiä Asp-Gly-Asp. Tämä mainittu ilmeinen sitoutuva sekvenssi on barburiinissa Lys-Gly-Asp-(Trp). KGD-sekvenssin läsnäolo tässä edellä maini-25 tussa peptidissä sillä alueella, joka ilmeisimmin osallistuu sitoutumiseen, on erittäin yllättä- « vää, kun otetaan huomioon, että Arg:n korvaaminen Lys:llä pienissä synteettisissä peptideis-sä, joiden rakenne perustuu RGDX-sekvenssiin, vähentää suuresti näiden viimeksi mainittujen peptidien kykyä sitoutua integriinireseptorien kanssa (katso Pierschbacher et ai., Proc.

Natl. Acad. Sei. (USA) (1984) 81: 5985-5988, Williams et ai., Thromb. Res. (1987) 4& 457-30 471 sekä Huang et ai., J.Biol. Chem. (1987) 262-' 16157-16163. Tämän keksinnön keksijöi den käsityksen mukaan tämä mainittu substituutio voi osaltaan saada aikaan barburiinipepti- 19 104364 din spesifisyyden inhiboida Fg:n ja vWF:n sitoutumista GP IIb-IIIa:n kanssa verrattuna esimerkiksi vitronestiinin ja vitronestiinireseptorin välisen sitoutumisen inhibitioon.

Seuraavassa selitetään lähemmin K*GDX:n sisältäviä peptidejä.

5 Edellä mainittu "barrburiinin" peptidi, joka on eristetty tämän keksinnön mukaista menetel-. mää hyväksi käyttäen, on osoittautunut sitoutuvan KGDX-sekvenssin sisältäväksi, kun taas aiemmin entuudestaan tunnetuissa ja yleisesti tiedossa olevissa vastaavissa yhdisteissä on ' sekvenssi RGDX. KGDX:n läsnäolo tässä mainitussa PAI-sekvensissä liittyy ilmeisesti nii den GP IIb-EIa:ta suosivaan affiniteettiin verrattuna vitronestiini- ja fibronestiinireseptorei-io hin. Edellä mainitun arginiinitähteen korvaamisen sekvenssissä mainitulla lysyylitähteellä aikaan saama vaikutus liittyy ilmeisesti sivuketjun kasvaneeseen pituuteen sekä typen emäksisen luonteen säilymiseen siten, kuin tässä jäljempänä on selitetty. Tämän keksinnön keksijät ovat tehneet sen yllättävän havainnon, että mainittu lysyylitähde itsessään ei saa aikaan vahvistunutta aktiivisuutta ja spesifisyyttä, vaan pikemminkin korvautuneen arginiinin suhteen 15 aikaan saadun homologisen pidentymisen aikaan saama uusi avaruudellinen etäisyys. Näin ollen sellaiset tämän keksinnön mukaiset peptidit, jotka sisältävät sekvenssin K*GDX sitoutuvassa sekvenssissään, ovat huomattavasti voimakkaammin vaikuttavia inhibiittoreita Fg:n tai vWF:n sitoutumiselle GP IIb-IIIa:n kanssa verrattuna niiden kykyyn inhiboida vitronestiinin sitoutumista vitronestiinireseptorin kanssa ja fibronestiinin sitoutumista fib-20 ronestiinireseptorin kanssa. Kuten edellä on mainittu, "huomattavasti voimakkaammin vaikuttava" halutun ja edullisemman sitoutumisen inhibiittori tarkoittaa, että kulloinkin kyseessä , oleva inhibitio on ainakin kaksi kertaa voimakkaanpaa tietyllä kulloinkin kyseessä olevan inhibiittorin pitoisuustasolla tai se PAI:n konsentraatio, joka saa aikaan 50-prosenttisen inhibition, on ainakin kaksi kertaa pienempi Fg:n tai vWF:n sitoutumiselle GP IIb-IIIa:n kanssa 25 kuin, mitä tulee kyseeseen vaihtoehtoisten ligandien sitoutuessa muiden integriinien kanssa.

:' Tässä mainittu K* viittaa sellaiseem lysyylitähteeseen, joka on substituoimaton tai joka sisäl- 4 tää korvautuneita vetyjä epsilon-aminohappotähteensä kohdalla. Substituenttien tulee olla riittävässä määrin elektroneja luovuttavia, jotta sen typpiatomin, johon ne ovat kiinnittyneet, 30 emäksisyys säilyisi. Näin ollen, K* määritellään sellaiseksi lysyylitähteeksi, joka on kaavan Ri2N(CH2)4CHNHCO- mukainen, missä kukin R1 on erikseen H, alkyyli (1-6 C), tai korkeintaan yksi R1 on R2-C=NR3, 20 104364 missä R on H, alkyyli (1-6 C), tai substituoitu tai substituoimaton fenyyli- tai bentsyyli-tähde, tai NR42, missä kukin R4 on erikseen H tai alkyyli (1 -6 C), ja R3 on H, alkyyli- (1-6 C), fenyyli- tai bentsyylitähde, tai R2-C=NR3 on radikaali, joka kuuluu seuraavassa lueteltuun ryhmään, joka käsittää 5 N\^/N N^/N n^n V—/ · v=/ y/ ja \ / / \ (CHR5)

M

R5 R5 missä m on kokonaisluku välillä 2-3, ja kukin R5 on erikseen H tai alkyyli (1 -6 C), ja missä yksi tai kaksi (CH2):ta voidaan korvata 0:11a tai S:llä siten, että mainitut O ja S 10 eivät tule toisen heteroatomin viereen.

"Alkyyli" on tavanomaisesti määritelty suoraksi tai haaroittuneeksi tai sykliseksi hiilivetytäh-teeksi, joka sisältää ilmaistun määrän hiiliatomeja ja joita ovat esimerkiksi metyyli, etyyli, isopropyyli, N-heksyyli, 2-metyylibutyyli ja sykloheksyyli.

15

Mainitut bentsyyli- ja fenyylitähteet, joita on merkitty R2:lla, voivat sisältää sellaisia substituentteja, jotka eivät häiritse tai vaikuta sitoutumiseen tai inhibitioon. Edullisia substituutio konfiguraatioita ovat sellaiset, joissa aromaattiseen renkaaseen on sitoutunut vai yksi § : substituentti, edullisesti 4-asemaan. Edullisesti käytettäviksi soveltuvia substituentteja ovat 20 elektroneja luovuttavat substituentit, kuten esimerkiksi alkyylitähteet, erittäin edullisesti esimerkiksi etyyli- tai metyyliryhmät, tai fenyylitähteet.

Edullisesti käytettäviksi soveltuvia ryhmiä K* ovat esimerkiksi lysiini-, homoarginiini-, for- « myylihomoarginiini-, omitiini-, asetamidyylilysiini-, IS^N0 etyleeni-homoarginiini- ja 25 fenyyli-imidyylilysiinitähteet. Esimerkiksi fenyyli-imidyylilysyylitähde on seuraavan kaavan mukainen:

Ph-C(=NH)-NH-(CH2)4CH(NH-)CO-.

i 2, 104364

Koska sitoutumisen edullisella inhibitiolla on ilmeisen olennaisena ominaisuutenaan se, että RGDX:n R on korvautunut K*:llä, erääs ryhmä tämän keksinnön mukaisia peptidejä tai peptidin tapaisia yhdisteitä käsittää luonnossa esiintyviä verihiutaleiden aggregaation inhibiitto-reita, jotka tavallisesti sisältävät RGDX:n sitoutumiseen osallistuvassa sekvensissään, joita 5 mainittuja yhdisteitä tai peptidejä on modifioitu korvaamalla K*:llä niiden tässä mainitussa sekvenssissä oleva R. Tämän keksinnön piiriin kuuluvat myös sellaiset natiivit peptidit, joilla tämä edellä esitetty substituutio on tapahtunut, samoin kuin näiden tällaisten peptidien sellaiset riittävän pitkät fragmentit, joilla on kyky selektiivisesti inhiboida adhesiivisten proteiinien sitoutumista GP IIb-IIIa:n kanssa, sekä sellaiset täyspitkien peptidit tai fragmentit, joi-10 den kohdalla on tapahtunut inhibition kannalta toisarvoisia substituenttien korvautumisia sellaisissa kohdissa peptidiä, etteivät nämä viimeksi mainitut korvautumiset tuhoa tätä mainittua kykyä toimia inhibiittorina. Useimmissa tapauksissa nämä manitut fragmentit käsittävät aminohappo- tai muita tähteitä ainakin vähintään mitoiltaan 7 aminohappotähdettä pitkää peptidiä vastaavan peptidiketjun verran, jos kulloinkin kyseessä olevan yhdisteen konfor-15 maation on esimerkiksi syklisoitumisen kontrolloimaa, ja nämä mainitut fragmentit ovat pituudeltaan suurempia, jos tällaista mainitunlaista konformationaalista kontrollia ei esiinny. Yleisesti vaadittavan K*GDX-sekvenssin lisäksi mainittujen peptidien muissa osissa, kuin K*GDX:sekvenssissä, voi olla 1-10, edullisesti 1-4 ja erittäin edullisesti 1-3, aminohappojen substituutiota.

20

Lisäksi, RGDX:n tai K*GDX:n sisältämä G voi olla korvautunut sarkosyylitähteellä.

Edelleen, yksi tai useampia peptidisidoksia voi olla valinnaisesti korvautunut muilla sidoksilla, kuten esimerkiksi sellaisilla, joita saadaan pelkistämällä tai eliminaation kautta. Näin ol-„ 25 Ien, yksi tai useampia -CONH- peptidisidoksista voi olla korvautuneena muun tyyppisillä sidoksilla, kuten esimerkiksi -CH2NH-, -CH2S-, CH2CH2-, -CH=CH- (cis ja transL -COCH2-, ' : -CH(OH)CH2- ja -CH2SO-, joita voidaan saada aikaan entuudestaan yleisesti tiedossa olevia menetelmiä hyväksi käyttäen. Seuraavassa mainituissa viitteissä on kuvattu erilaisten pepti-dianalogien valmistusta, joihin mainittuihin analogeihin kuuluvat myös tässä edellä mainittu-30 ja vaihtoehtoisia sidoksia sisältävät lajikkeet: Spatola, A.F., Vega Data (maaliskuu 1983), osa 1., numero 3, "Peptide Backbone Modifications" (yleiskatsaus), Spatola, A.F. teoksessa "Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins", toimittanut B. Wein- 22 104364 stein, Marcel Dekker, New York, s. 267 (1983) (yleiskatsaus), Morley, J.S., Trends Pharm.

Sci. (1980) ss. 463-468 (yleiskatsaus), Hudson, D., et ai., Int. J. Pept. Prot. Res. (1979) 14: 177-185 (-CH2NH-, CH2-CH2-), Spatola, A.F., et al., Life Sci. (1986) 1243-1249 (-CH2- S)„ Hann, M.M., J. Chem. Soc. Perkin Trans. I (1982) 307-314 (-CH-CH-, sis ja trans), 5 Almquist, R.G., et al., J. Med. Chem. (1980) 21: 1392-1398 (-COCH2-), Jennings-White, C., et al., Tetrahedron Lett. (1982) 21' 2533 (-COCH2-), Szelke, M., et al., eurooppalainen patenttihakemus EP 45665 (1982) CA: 22: 39405 (1982) (-CH(OH)CHr), Holladay, M.W., et al., Tetrahedron Lett. (1983) 24: 4401 -4404 (-C(OH)CHr), sekä Hruby, VJ., Life Sci (1982) 21: 189-199 (-CH2-S-). Näistä erityisen edullinen on -CH2-NH-.

10

Esimerkkeihin luonnossa esiintyvästä käärmeenmyrkystä saatavan PAI:n fragmenteista ja/tai modifioiduista muodoista kuuluu muunmuassa [E28,L41,C64]barburiini(28-73), jota vastaava sekvenssi on 15 1 46 ECADGLCCDQCRFLKKGTVCRVAKGDWNDDTCTGQSCDCPRNGLYG 28 73 ja [K29]eristikofiini(4-51), jota vastaava sekvenssi on 20 4 51 EEPCATGPCCRRCKFKRAGKVCRVAKGDWNNDYCTGKSCDCPRNPWNG.

4 51 25 Näitä edellä esitettyjä merkintöjä käyttäen fragmentin koko on esitetty suluissa nimen jälkeen fragmenttiin kuuluvien aminohappojen numeroiden avulla, ja hakasuluissa etuliitteenä olevat kirjaimet ja numerot ilmaisevat aminohappojen substituution natiivia täyspitkää peptidiketjua vastaavien kohtien numeroinnin mukaisesti esitettynä. Näin ollen, yllä esitetty barburiinif- , ragmentti käsittää natiivin sekvenssin sisältämät happotaähteen 28-73 ja alkuperäiset natiivin 30 sekvenssin kohdissa 28, 41 ja 64 olevat aminohapot on ovat korvautuneet vastaavasti seu-raavilla aminohapoilla Glu (E), Leu (L) ja Cys (C).

Lisäksi esimerkkeinä mainittakoon, että RGD-sekvenssin arginiini voidaan korvata K*-tähteellä trigramiinissa, elegantiinissa, albolabriinissa, krotatroksiinissa, flavoviridiinissä, 35 ekistatiinissa, bitistatiinissa, viridiinissä, molossiinissä, lutiinissä, basilisiinissä, applagiinissa, 23 104364 halysiinissä, horridiinissa, tergeminiinissä, lakesiinissa, kotiariinissa, sereberiinissä, jarara-siinissa, kistriinissä, eristikofiinissa, bitaani-a:ssa, ja ruberiini/oreganiinissa, jotta saataisiin aikaan spesifisesti aktiivinen PAI, jolla on preferentiaalinen affiniteetti GP IIb-IIIa:han. Edelleen, näiden edellä mainittujen peptidien lyhennettyjä muotoja, jotka käsittävät vähintään 5 20, edullisesti vähintään 30 ja vielä edullisemmin vähintään 40 aminohappotähdettä, voidaan . valmista natiivista peptidistä lähtien tai tässä mainitussa modifioidussa muodossa. Lisäksi, tai vaihtoehtoisesti, voidaan korvata tai modifioida 1-10, edullisesti 1-4, sellaista aminohappotähdettä, jotka eivät ole RGD/K*GD-sekvenssin kannalta ensiarvoisen tärkeitä, edullisesti konservatiivisia aminohappojen substituutioita hyväksi käyttäen. Tässä mainitulla konserva-10 tiivisella aminohappojen substituutiolla tarkoitetaan esimerkiksi happaman aminohappotähteen korvaamista happamalla aminohappotähteellä, neutraalin aminohappotähteen korvaamista neutraalilla aminohappotähteellä ja emäksisen korvaamista emäksisellä siten, kuin on seu-raavassa jäljempänä on tarkemmin selitetty.

15 Edelleen vielä lisäksi annettavien esimerkkien ryhmä käsittää tapaukset, joissa RGD:n tai K*GD:n glysyylitähde voidaan korvata sarkosyylitähteellä siten, että säilytetään kulloinkin kyseessä olevan yhdisteen aktiivisuus. Näin ollen, sellaisia aktiivisia PAI-faktoreita, jotka on eristetty ja/tai modifioitu muillakin tavoilla, voidaan, kuten aiemmin edellä on esitetty, edel-len modifioida tässä edellä mainittua korvautumista hyväksi käyttäen.

20

Samalla kun käärmeiden myrkyistä saadut fragmentit ja/tai modifioidut PAI-faktorit voidaan : ; lukea kuuluviksi tämän keksinnön mukaisiin Fg/vWF/GP nb-IIIa-sitoutumiselle spesifisiin yhdisteisiin korvaamalla RGD K*GD:llä, tämän keksinnön muissa edullisissa suoritustavoissa tulevat kysymykseen sellaiset spesifisesti aktiiviset peptidit, jotka perustuvat itse K*GD-λ- 25 sekvenssin yhteensopiviin ekstensioihin. Tässä suhteessa edullisesti käytettävä ryhmä tämän keksinnön mukaisia peptidejä tai peptidin tapaisia yhdisteitä käsittää sellaiset sykliset pepti-' dit, jotka ovat seuraavan yleiskaavan mukaisia:

i ; I

Y^X-L- (AA1)nl-K - (G/Sar) -D- (AA2)n2- (AA3)n3- (AA4) n4-X2-Y2 Π] missä K* on aiemmin edellä määritelty substituoitu tai substituoimaton lysyylitähde, 30 24 104364 AA, on pieni, neutraali (poolinen tai pooliton) aminohappo ja nl on kokonaisluku välillä 0-3, AA2 on neutraali, pooliton suuri (aromaattinen tai ei-aromaattinen) tai poolinen aromaattinen aminohappoja n2 on kokonaisluku välillä 0-3, 5 AA3 on proliinitähde tai modifioitu (jäljempänä määritelty) proliinitähde ja n3 on koko naisluku välillä 0-1, AA4 on neutraali, pieni aminohappo tai vastaava N-alkyloitu muoto ja n4 on kokonaisluku välillä 0-3, X, ja X2 ovat molemmat erikseen sellaisia tähteitä, jotka pystyvät muodostamaan sidok-10 sen X, :n ja X2:n välille, jotta saataisiin kaavassa esitetyn mukainen rengasrakenteinen yhdiste, ja Y, ja Y2 ovat kumpikin erikseen sellaisia substituentteja, jotka eivät vaikuta kulloinkin kyseessä olevan yhdisteen aktiivisuuteen inhibiittorina ja jotka voivat myös puuttua, missä yksi tai useampia peptidisidoksia voi olla valinnaisesti korvautunut sellaisella si-15 doksella, joka kuuluu ryhmään, joka käsittää seuraavat: -CH2NH- ,-CH2S-, CH2CH2-, -CH=CH- (ms ja transk -COCH2-, -CH(OH)CH2- ja -CH2SO-, sillä varauksella, että jos n3 on nolla, joko 1) n2:n ja n4:n summan on oltava vähintään 2, tai 2) K* on välttämättä jokin muu kuin Har tai K, tai 20 3) vähintään toinen X,:stä ja X2:sta on välttämättä jokin muu kuin Cys (C), penisilla- miini (Pen) tai 2-amino-3,3-syklopentaanimetyleeni-3-merkaptopropionihappo (APmp), tai : 4) Y, tai Y2 käsittää välttämättä vähintään yhden aminohappotähteen, tai 5) yksi tai useampia peptidisidoksista on korvautunut jollakin mainitulla vaihtoehtoisella sidoksella.

25 Y, ja Y2 voivat olla peptidiketjun jatkeita, jotka käsittävät 0-25 aminohappotähdettä, ja ne voivat esiintyä myös derivatisoidussa muodossa. Y,:n N-terminaalinen ketjun jatke voi olla asetyloitu tai Y, voi olla muulla tavoin asetyloitu. Y2:n C-terminaalinen pää voi olla amidoitu NH2:n tai primäärisen tai sekundäärisen kaavan R-NH2 tai R2-NH amiinin avulla, missä ku-30 kin R voi olla erikseen lyhytketjuinen alkyyli (1-4 C), kuten esimerkiksi metyyli, n-butyyli tai t-butyyi. Y, voi myös olla (H) tai asyyli. Y2 voi olla (OH), NH2 tai amiini kuten edellä. Silloin kun kaavan [ 1 ] mukainen yhdiste on yksinkertainen syklinen peptidi, puuttuvat Y, ja Y2.

25 104364 X, ja X2 ovat tyyppillisesti sellaisia aminohappotähteitä, jotka kykenevät osallistumaan sykli-saatioon ja joihin kuuluvat, esimerkiksi ja mitä edullisimmin, kysteiinitähteet, jotka kykenevät muodotamaan disulfidirenkaita. Kuitenkin voidaan käyttää myös muitakin sellaisia tähtei-5 tä, jotka kykenevät muodostamaan disulfidi- tai muita sidoksia, kuten esimerkiksi penisil-. lamiinitähteitä (Pen), jonka käyttöä ovat kuvanneet Pierschbacher et ai. (edellä mainittu vii te), tai merkaptopropionyyli- (Mpr) tai merkaptovaleryylitähteitä (Mvl). Muunlaisiin sykli-sointia varten suunnitellut kovalenttiset sidokset käsittävät peptidisidokset, joista mainittakoon esimerkiksi lysyylitähteen sivuketjun aminoryhmän ja glutamyylitähteen sivuketjuun 10 kuuluvan karboksyyliryhmän välille muodostunut amidi, ja esterisidokset, joita muodostuisi esimerkiksi treoniinitähteen sivuketjun alkoholisen hydroksyyliryhmän ja aspartyylitähteen sivuketjun karboksyyliryhmän välille. Mikä tahansa sellainen soveltuva tähde, joka kykenee muodostamaan peptidi sidoksen (tai modifioidun peptidisidoksen siten, kuin aiemmin edellä on esitetty) ketjun muun osan kanssa ja joka kykenee muodostamaan kovalenttisia sidoksia 15 siten, että saadaan aikaan syklisoituminen, on tässä suhteessa käyttökelpoinen. Tähän edellä esitettyyn ryhmään kuuluvat esimerkiksi yksinkertaiset sykliset peptidit, joissa peptidisidos muodostuu suoraan N-terminaalisessa päässä olevan NH2-ryhmän ja C-terminaalisessa päässä olevan COOH-ryhmän välille.

20 Kuten edellä on esitetty, yksi tai useampia osoitetuista peptidisidoksista voidaan korvata korvaavalla sidoksella, joka voi olla esimerkiksi -CH2NH-, -CH2S-, CH2CH2-, -CH=CH- icis ia : : Hans), -COCH2-, -CH(OH)CH2- ja -CH2SO-,

Aiemmin edellä esitetyssä aminohappotähteiden AA,-AA4 osoittamisessa on niiden kuvaa-v 25 minen suoritettu sellaisen luokittelumenetelmän perusteella, jossa mainitussa menetelmässä aminohappotähteet voidaan jakaa yleisesti neljään suureen alaluokkaan. Tätä mainittua menetelmää aminohappojen luokittelemiseksi on selitetty jäljempänä myös kaavakuvan avulla. Seuraavassa on selitetty näiden tässä edellä mainittujen neljän aminohappojen alaluokan jakoperusteita.

30 26 104364

Happamat aminohapot:

Aminohappotähteellä on negatiivinen varaus johtuen H-ionin menetyksestä fysiologisessa pH:ssa ja tämä mainittu tähde hakeutuu vesipitoiseen liuokseen siten, että se pääsisi kulloinkin kyseessä olevassa peptidin konformaatiossa pinta-asemaan, jossa se on silloin, kun ky-5 seessä oleva peptidi on vesipitoisessa väliaineessa fysiologisessa pH:ssa.

r

Emäksiset aminohapot:

Aminohappotähteellä on positiivinen varaus johtuen H-ionin assosioitumisesta fysiologisessa T pH:ssa ja kulloinkin kyseessä oleva tähde hakeutuu vesipitoiseen liuokseen siten, että se pää-10 see kulloinkin kyseessä olevassa peptidin konformaatiossa pinta-asemaan, jossa pysyy silloin, kun mainittu peptidi on vesipitoisessa väliaineessa fysiologisessa pH:ssa.

Neutraalit/poolittomat aminohapot:

Kulloinkin kyseessä oleva aminohappotähde ei ole varautunut fysiologisessa pH:ssa ja se 15 pakenee vesipitoisia liuoksia siten, että se hakeutuu kulloinkin kyseessä olevassa peptidin konformaatiossa ketjun sisällä olevaan asemaan, jossa se pysyy kun mainittu peptidi on vesipitoisessa väliaineessa. Näitä mainitun kaltaisia tähteitä kuvaamaan käytetään tämän kyseessä olevan luokittelu]- äij etelmän mukaisesti myös käsitettä "hydrofobinen".

20 Neutraalit/pooliset aminohapot:

Kulloinkin kyseessä oleva aminohappotähde on varaukseton fysiologisessa pH:ssa, mutta : mainittu tähde hakeutuu vesipitoiseen liuokseen siten, että se hakeutuu kulloinkin kyseessä olevassa peptidin konformaatiossa ulompiin asemiin, joissa se pysyy silloin, kun mainittu peptidi on vesipitoisessa väliaineessa.

25

On luonnollisesti selvää, että tilastollisessa otoksessa yksittäisiä tähdemolekyylejä jotkin mainituista molekyyleistä ovat varautuneita ja toiset taas eivät ja että kulloinkin kyseessä olevan molekyylin ja vesiliuoksen välillä vallitsee jonkin asteinen repulsio tai attraktio. Jotta jotakin molekyyliä voitaisiin kuvata sanomalla, että se on varautunut tai että sillä on varaus, 30 tulee huomattavan osuuden (vähintään noin 25 %) kulloinkin kyseessä olevista yksittäisistä molekyyleistä olla varauksellisia fysiologisella pH-alueella. Jonkin molekyylin luokitteluun poolittomaksi tai pooliseksi vaadittava repulsion tai attraktion määrä on jossain määrin epä- 27 104364 eksakti ja mielivaltainen, ja tämän vuoksi erityisesti tämän keksinnön mukaiset aminohapot on luokiteltu spesifisesti kuuluviksi jompaankumpaan luokkaan. Useimmat aminohapot, joita ei ole tässä spesifisesti yksilöity, voidaan luokitella niiden tunnetun kemiallisen käyttäytymisen perusteella.

5

Aminohappotähteet voidaan luokitella edelleen kuuluviksi syklisiin tai ei-syklisiin, ja aromaattisiin tai ei-aromaattisiin, jotka luokittelut ovat sinänsä itsestään selviä ja itsensä selittäviä sen suhteen, mitä tulee kulloinkin kyseessä olevien tähteiden sivuketjujen sisältämiin ryhmiin, sekä suuriin ja pieniin. Jonkin aminohappotähteen voidaan katsoa olevan pieni, jos 10 sen sisältämien hiiliatomien kokonaismäärä on 4 tai vähemmän, mukaanlukien karboksyy-lihiili. Pienet tähteet ovat luonnollisesti aina ei-aromaattisia.

Luonnossa esiintyvien proteiinien sisältämien aminohappojen edellä esitetyn luokittelukaa-van mukainen jako on eri luokkiin on esitetty seuraavassa.

15

Happamat: aspartaamihappo ja glutaamiinihappo.

Emäksiset/ei-svkliset: arginiini ja lysiini.

Emäksiset/svkliset: histidiini.

Neutraalit/pooliset/pienet: glysiini, seriini ja kysteiini.

20 Neutraalit/pooliset/suuret/ei-aromaattiset: freoniini asparagiini ja glutamiini.

Neutraali/pooliset/suuret/aromaattiset: tyrosiini.

Neutraalit/poolittomat/suuret/ei-aromaattiset: . 25 väliini, isoleusiini, leusiini ja metioniini.

Neutraalit/poolittomat/suuret/aromaattiset: fenyylialaniini ja tryptofaani.

Geenikoodattu aminohappo proliini on, vaikka se teknisesti kuuluisikin ryhmään neutraa-30 lit/poolittomat/suuret/sykliset ja ei-aromaattiset, erikoistapaus johtuen sen tunnetuista vaikutuksista peptidiketjujen sekundääriseen konformaatioon, ja tämän vuoksi sitä ei ole lueteltu • tässä edellä määritellyssä luokassa, vaan se luokitellaan erikseen erikoistapauksena. AA3 on 28 104364 määritelty proliinitähteeksi tai "modifioiduksi proliinitähteeksi". Kuten hyvin tiedetään, pro-liini muodostuu typpiheterosyklisestä viisirenkaasta, joka sisältää karboksyyliiyhmän 2-asemassa. Modifioidulla proliinitähteellä tarkoitetaan kaikkia typpiheterosyklisiä viisi- tai kuusirenkaita, joissa oleva karboksyyliryhmä on alfa-asemassa typpeen nähden. Lisäksi itse 5 renkaaseen voi sisältyä muita heterosyklisiä atomeja. Näin ollen, modifioituihin proliinitäh-teisiin kuuluvat pipekolihapon (2-karboksipiperidiini) tähteet (lyhennettynä Pip) ja tiatsoli-diini (Thz). Täten proliini- tai modifioitu proliinitähde on seuraavan yleiskaavan mukainen

Rn—CHCOOH

10 missä yksi tai kaksi mainituista metyleeniiyhmistä voi olla korvautunut NR:llä, S:llä tai 0:11a, ja missä mikä tahansa rengastyppi voi olla valinnaisesti ja vaihtoehtoisesti korvautunut jollakin sellaisella substituentilla, kuten alkyyliryhmällä, joka ei vaikuta yhdisteen inhibiitto-riominaisuuksiin, 15

Tiettyihin yleisesti esiintyviin aminohappoihin, jotka eivät ole koodattuina geneettiseen koodiin, kuuluvat esimerkiksi beta-alaniini (beta-ala) tai muita omega-aminohappoja, kuten esimerkiksi 3-aminopropionihappo ja 4-aminovoihappo sekä näiden homologit, alfa- aminoisovoihappo (Aib), sarkosiini (Sar), omitiini (Om), sitrulliini (Cit), homoarginiini 20 (Har), t-butyylialaniini (r-BuA), t-butyyliglysiini (t-BuG), N-metyyli-isoleusiini (N-Melle), fenyyliglysiini (Phg), ja sykloheksyylialaniini (Cha), norleusiini (Nle), kysteiinihappo (Cya), pipekolihappo (Pip), tiatsolidiini (Thz), 2-naftyylialaniini (2-Nal) sekä metioniinisulfoksidi (MSO). Kaikki nämä edellä mainitut voidaan helposti luokitella tiettyihin kategorioihin.

Edellä esitetyn määritelmän mukaisesti ’ 25 Sarja beta-ala ovat neutraaleja/poolittomia/pieniä, « . v 1 t-BuA, t-BuG, N-Melle, Nle ja Cha ovat neutraaleja/poolittomia/ei-aromaattisia,

Harja Om ovat emäksisiä/ei-syklisiä,

Cya on hapan,

Cit, Acetyl Lys ja MSO ovat neutraaleja/poolisia/suuria/ei-aromaattisia, 30 2-Nal j a Phg ovat neutraalej a/poolittomia/suuria/aromaattisia, ja

Pip ja Thz ovat modifioituja proliini tähteitä.

29 104364

Edellä esitetty voidaan esittää kaavakuvan avulla seuraavasti:

Aminohappojen luokittelukaavio 5 Happamat: Glu (E), Aap (D); Cysteic (Cya) , Ei-sykliset Ly* (K)/ Arg (R); omit iin i (Orn); jS homoarginiini (Har) * Emäksiset IQ Sykliset: His (H)

Neutraalit J5 ^^P^iset^^ ^^^littom^t^

Pienet Suuret Pienet Suuret ,| \ /\

Ei-aromaattiset Aromaattiset Ei-aromaattiset Aromaattiset

Gly (G) Thr (T) Tyr (T) Ala (A) Vai (V) Ph· (F)

Ser (S) Aan (M) Lau (L) Trp (W)

Cya (C) Gin (Q) II· (I)

Cit Sar tBuA

- MSO Beta-ala tBuG Phg

Acetyl Lya Aib Ν-Μ·Ι1· Ν1·

Cha 30 104364

Erilaiset omega-aminohapot luokitellaan kokonsa mukaan neut-raaleiksi/poolittomiksi/pieniksi (beta-ala eli 2-aminopropionihappo, 4-aminovoihappo) tai suuriin (kaikki muut).

5 Muutkin mahdolliset aminohappojen korvautumiset niiden suhteen, jotka on koodattu kussakin tapauksessa kyseeseen tulevaan geeniin, katsotaan kuuluviksi tämän keksinnön piiriin ja voidaan luokitella edellä esitetyn yleisen luokittelusysteemin puitteissa.

Kaavoissa, jotka kuvaavat tämän keksinnön valikoituja spesifisiä suoritustapoja, olevat ter-10 minaalisten amino- ja terminaalisten karboksiryhmien siitä huolimatta, ettei tätä ole useinkaan erikseen osoitettu, ymmärretään olevan siinä muodossa, jossa ne ovat fysiologista pH:ta vastaavissa olosuhteissa, ellei erikseen ole toisin osoitettu. Näin ollen, N-terminaalinen H+2 ja C-terminaalinen 0' ymmärretään läsnäoleviksi lajikkeiksi fysiologisessa pH:ssa, vaikkei niitä ole välttämättä erikseen sepsifioitu ja osoitettu joko erityisten esimerkkien tai geneeristen 15 kaavojen avulla. Luonnollisesti tämän keksintö käsittää myös emäksiset ja happamat addi-tiosuolat, joihin kuuluvat myös sellaiset suolat, jotka muodostuvat ei-fysiologista pH:ta vastaavissa olosuhteissa. Ellei erikseen ole ilmaistu, kaikki molekyylitähteet ovat L-muodossa. Geneerisissä kaavoissa erikseen spesifioidut tähteet voivat olla joko L- tai D-muodossa. Yleisesti ottaen tämän keksinnön mukaiset peptidit käsittävät 0,1 tai 2 D-muotoista tähdettä, 20 edullisesti 0 tai 1 ja erittäin edullisesti 0. Esitetyissä peptideissä jokainen koodattu tähde on aina, kun se on asian mukaista, esitetty yksikiijainlyhenteellä, joka vastaa kulloinkin kyseessä ; ; olevan aminohapon triviaalinimeä seuraavan tavanomaiseen nimistöön perustuvan listan mu kaisesti: aminohappo yksikitjainlvhenne 25 alaniini A, arginiini R, ·' asparagiini N, aspartaamihappo D, kysteiini C, 30 glutamiini Q, glutamiinihappo E, glysiini G, 31 104364 histidiini H, isoleusiini I, leusiini L, lysiini K, 5 metioniini M, fenyylialaniini F, proliini P, * seriini S, treoniini T, 10 tryptofaani W, tyrosiini Y, väliini V ja pyroglutamiinihappo Z.

15 Sellaiset aminohapot, jotka eivät ole geneettisesti koodattuja, lyhennetään siten kuin jo aiemmin edellä on esitetty.

Tämän keksinnön mukaisesti esitettyjen yksittäisten peptidien kohdalla on tarkoitettu L- muotoa kaikkien niiden aminohappojen kohdalla, joilla esiintyy optista isomeriaa, ellei eri- 20 tyisesti muuta ole esitetty tikarimaisella yläviitteellä (*). Kun tämän keksinnön mukaisissa peptideissä on tavallisesti kyseessä luonnossa esiintyvä optisen isomeerin L-muoto, yksi tai ; ; kaksi, edullisesti yksi, aminohappo voi olla korvautunut vastaavan optisen isomeerin D- » muodolla.

’ 25 Vapaita funktionaalisia ryhmiä, mukaan lukien terminaaliset karboksi- ja aminoryhmät, voi daan modifioida amidoimalla, asyloimalla tai muulla tavoin substituoimalla, mikä voi esi- * ’·' merkiksi muuttaa kulloinkin kyseessä olevien yhdisteiden liukoisuutta vaikuttamatta kuiten- kaan niiden aktiivisuuteen.

30 Kun muodostetaan amidoituja peptidejä tämän keksinnön mukaisesti, vastaavia analogisia yhdisteitä voidaan syntetisoida suoraan, esimerkiksi käyttämällä Boc-AAx-pMBHA-hartsia *. tai Boc-AAx-BHA-hartsia, missä AAX on kulloinkin kyseessä oleva valittu karboksitermi- 32 104364 naalinen halutun peptidin aminohappo siten, kuin seuraavassa yksityiskohtaisemmin selitetään. Vaihtoehtoisesti, tämän keksinnön mukaisia peptidejä voidaan amidoida kemiallisesti tai entsymaattisesti peptidisynteesin jälkeen, joka peptidisynteesi on saatu aikaan käyttämällä hyväksi alan asiantuntijoiden entudestaan hyvin tuntemia menetelmiä tai tavanomaisia liuos-5 faasissa tapahtuvan peptidisynteesin suoritustapoja.

Tietyt muodot tämän keksinnön mukaisten d£ novo peptidien kodalla ovat edullisia ja suositeltavia. K*(G/Sar)D-sekvenssissä G/Sar on edullisesti G. AA) ja AA4 ovat edullisesti Gly, Ala tai Ser. nl on edullisesti 0-2, ja n4 on edullisesti 1-2. AA2:n kohdalla ovat edullisia neut-10 raalit/poolittomat/aromaattiset aminohapot, erityisesti tryptofaani ja fenyylialaniini, erittäin edullisesti tryptofaani, n2 on edullisesti 1. X, ja X2 ovat edullisesti Cys-, Mpr- tai Pen- (peni-sillamiini-) tähteitä. Yj on edullisesti H. asetyyli tai Gly. Y2 on edullisesti -NH2 tai -A-NH2. Samoin yleisesti ottaen edullisia ovat C-terminaalisesti amidoidut muodot Y2:ta.

15 Näin ollen tämän edullisesti käyttökelpoisiin PAI-analogeihin kuuluvat seuraavien kaavojen mukaiset peptidit. Vaikka kaikki näistä ovat kykeneviä muodostamaan syklisen rakenteen disulfidisiltojen muodostumisen kautta, näitä mainittuja siltoja ei ole yleensä tässä esitetty. Muunlaiset sykliset muodot on osoitettu merkinnällä "syklo".

20 Edullisesti käyttökelpoisia peptidejä PAI 1: E-C-A-D-G-L-C-C-D-Q-C-R-F-L-K-K-G-T-V-C-R-V-A-K-G-D-W-N-D-

D-T-C-T-T-G-Q-S-C-D-C-P-R-N-G-L-Y-G

m m • PAI 2: E-E-P-C-A-T-G-P-C-C-R-R-C-K-F-K-R-A-G-K-V-C-R-V-A-K-G-D-W-

25 N

-N-D-Y-C-T-G-K-S-C-D-C-P-R-N-P-W-N-G PAI 3: G-C-G-K-G-D-W-P-C-A-NH2 30 PAI 4: G-C-K-G-D-W-P-C-A-NH2 • < < PAI 5: C-G-K-G-D-W-P-C-NH2 PAI 7: G-C-K-G-D-W-C-A-NH2 35 PAI 9: Mpr-K-G-D-Pen-NH2 PAI 10: C-K-G-D-W-P-C-NH2 P AI 12: C-K-G-D-Y-P-C-NH2 33 104364 PAI13: C-K-G-D-F-P-C-NH2 5 PAI 14: C-K-G-D-L-P-C-NH2 PAI 15: C-K-G-D-V-P-C-NH2 W PAI 16: C-K-G-D-Y(OMe)-P-C-NH2 PAI 17: C-K-G-D-(2-Nal)-P-C-NH2 PAI 18: C-K-G-D-(Cha)-P-C-NH2 15 PAI 19: Mpr-K-G-D-W-P-C-NH2 PAI 20: Mpr-K-G-D-Y-P-C-NH2 20 PAI 21: Mpr-K-G-D-F-P-C-NH2 PAI 22: Mpr-K-G-D-L-P-C-NH2 PAI 23: Mpr-K-G-D-V-P-C-NH2 25 PAI 24: Mpr-K-G-D-Y (OMe)-P-C-NH2 PAI 25: Mpr-K-G-D-(2-Nal)-P-C-NH2 30 PAI 26: Mpr-K-G-D-(Cha)-P-C-NH2 PAI 27: syklo(G-K-G-D-W-P) PAI 28: syklo(A-K-G-D-W-P) 35 PAI 29: syklo(D-Ala-K-G-D-W-P) PAI 30: syklo(F-K-G-D-W-P) * *. 40 PAI 31: syklo(beta-Ala-K-G-D-W-P) PAI 32: syklo(gamma-Abu-K-G-D-W-P) PAI 33: syklo(R-K-G-D-W-P) 45 PAI 34: C-K-G-D-W-G-C-NH2 PAI 37: C-K-A-D-W-P-C-NH2 PAI39: C-K-G-D-W-(Sar)-C-NH2 34 mui P AI41: C-K-G-D-I-P-C-NH2 5 PAI 42: C-K-G-D-(4-Cl-Phe)-P-NH2 PAI 43: C-K-(Sar)-D-W-P-C-NH2 10 PAI 44: C-K-G-D-(4-N02-Phe)-P-C-NH2 PAI 47: Asetyyli-C-K-G-D-W-P-C-NH2 PAI 48: Mpr-K-G-D-W(Formyyli)-P-C-NH2 15 PAI 49: Mvl-K-G-D-W-P-C-NH2 PAI 51: Mpr-K-G-D-W-P-Pen-NH2 20 PAI 52: Mpr-K-G-D-W-P-Pen-NH2 PAI 54: Mpr-K-G-D-W-P-Pen-NH2 PAI 55: Mpr-K-G-D-W-(Thz)-C-NH2 PAI 56: Mpr-K-G-D-H(2,4-DNP)-P-C-NH2 PAI 57: Mpr-K-G-D-(2-Nal)-P-Pen-NH2 30 PAI 58: Mvl-K-G-D-W-P-Pen-NH2 PAI 59: Mpr-K-G-D-W-(Pip)-Pen-NH2 * PAI 60: Mpr-(Har)-G-D-W-P-C-NH2 35 PAI 61: Mpr-K-G-D-W-P-C-NH2 ▼ PAI 62: Mpr-K-G-D-W-P-Pen-NH2 v 40 PAI 63: Mpr-(Har)-G-D-W-P-Pen-NH2 PAI 64: Mpr-(Asetimidyyli-Lys)-G-D-W-P-C-NH2 PAI 65: Mpr-(Asetimidyyli-Lys)-G-D-W-P-Pen-NH2 45 PAI 66: Mpr-CN0,!^3 -etyleeni-Har)-G-D-W-P-C-NH2 ‘ PAI 67: Mpr-(N°,NG-etyleeni-Har)-G-D-W-P-Pen-NH2 35 104364 PAI68: Mpr-Har-Sar-D-W-P-C-NH2 PAI69: Mpr-(Asetimidyyli-Lys)-G-D-W-P-Pen-NH2

J

PAI 70: Mpr-(Fenyyli-imidyyli-Lys)-G-D-W-P-C-NH2 PAI 71: Mpr-Har-Sar-D-W-P-PenNH2 a 10 PAI 72: Mpr-(Fenyyli-imidyyli-Lys)-G-D-W-P-PenNH2 a PAI 73: Mpr-Har-G-D-W-(3,4-dehydro-Pro)-C-NH2 PAI 74: Mpr-Har-G-D-Pen-NH2 15 PAI 75: Mpr-(Fenyyli-imidyyli-Lys)-G-D-Pen-NH2

Erityisen edullisia ovat seuraavien kaavojen mukaiset peptidit: 20 PAI 3: G-C-G-K-G-D-W-P-C-A-NH2 PAI 4: G-C-K-G-D-W-P-C-A-NH2 PAI 5: C-G-K-G-D-W-P-C-NH2 25 PAI 9: Mpr-K-G-D-Pen-NH2 PAI 10: C-K-G-D-W-P-C-NH2 30 PAI 12: C-K-G-D-Y-P-C-NH2 PAI 13: C-K-G-D-F-P-C-NH2 t PAI 19: Mpr-K-G-D-W-P-C-NH2 35 PAI 25: Mpr-K-G-D-(2-NaI)-P-C-NH2 PAI 34: C-K-G-D-W-G-C-NH2 1 V 40 PAI 39: C-K-G-D-W-(Sar)-C-NH2 « PAI 42: C-K-G-D-(4-Cl-Phe)-P-NH2 PAI 43: C-K-(Sar)-D-W-P-C-NH2 45 PAI 44: C-K-G-D-(4-N02-Phe)-P-C-NH2 PAI 47: Asetyyli-C-K-G-D-W-P-C-NH2 PAI48: Mpr-K-G-D-W(Formyyli)-P-C-NH2 36 104 564 PAI49: Mvl-K-G-D-W-P-C-NH2 5 PAI 51: Mpr-K-G-D-W-P-Pen-NH2 PAI 52: Mpr-K-G-D-W-P-Pen-NH2 10 PAI 55: Mpr-K-G-D-W-(Thz)-C-NH2 PAI 56: Mpr-K-G-D-H(2,4-DNP)-P-C-NH2 PAI 57: Mpr-K-G-D-(2-Nal)-P-Pen-NH2 15 PAI 58: Mvl-K-G-D-W-P-Pen-NH2 PAI 59: Mpr-K-G-D-W-(Pip)-Pen-NH2 20 PAI 60: Mpr-(Har)-G-D-W-P-C-NH2 PAI 61: Mpr-K-G-D-W-P-C-NH2 PAI 62: Mpr-K-G-D-W-P-Pen-NH2 25 PAI 63: Mpr-(Har)-G-D-W-P-Pen-NH2 PAI 64: Mpr-(Asetimidyyli-Lys)-G-D-W-P-C-NH2 30 PAI 65: Mpr-(Asetimidyyli-Lys)-G-D-W-P-Pen-NH2 PAI 66: Mpr-fN^N0 -etyleeni-Har)-G-D-W-P-C-NH2 PAI 67: Mpr-fN^.N0 -etyleeni-Har)-G-D-W-P-Pen-NH2 35 PAI 68: Mpr-Har-Sar-D-W-P-C-NH2 PAI 69: Mpr-(Asetimidyyli-Lys)-G-D-W-P-Pen-NH2 40 PAI 70: Mpr-(Fenyyli-imidyyli-Lys)-G-D-W-P-C-NH2 PAI 71: Mpr-Har-Sar-D-W-P-PenNH2 PAI 72: Mpr-(Fenyyli-imidyyli-Lys)-G-D-W-P-PenNH2 PAI 73: Mpr-Har-G-D-W-(3,4-dehydro-Pro)-C-NH2 45 37 104364

Seuraavassa selitetään peptidien tämän keksinnön mukaista kemiallista synteesiä. Tämän keksinnön piiriin kuuluvia yhdisteitä voidaan syntetisoida kemiallisesti käyttämällä hyväksi sellaisia menetelmiä, jotka ovat alan asiantuntijoiden entuudestaan hyvin tuntemia, kuten esimerkiksi kiinteän faasin peptidisynteesiä. Tämä mainittu synteesi aloitetaan karboksiter-5 minaalisesta päästä peptidimolekyyliä käyttämällä sellaista aminohappoa, jonka alfa-, aminoryhmä on suojattu. t-Butyloksikarbonyyliä (Boc) voidaan käyttää suojaavana ryhmänä kaikille aminohapoille, vaikka muutkin suojaavat ryhmät, kuten esimerkiksi fluorenyylime-' tyylioksikarbonyyli (Fmoc), ovat käyttökelpoisia. Esimerkiksi, Boc-Gly-OH, Boc-Ala-OH ja

Boc-His (Tos)-OH (eli joukko valikoituja karboksiterminaalisia aminohappoja)) voidaan 10 esteröidä kloorimetyloituihin polystyreenihartsikantajiin, p-metyylibentshydryyliamiini-(pMBHA) tai PAM-hartseihin. Mainittu polystyreenihartsikantaja on edullisesti kopolymeeri, joka koostuu styreenistä ja sisältää 0,5 - 2 prosenttia divinyylibentseeniä ristisidoksia aikaan saavana ainesosana, mikä saa aikaan sen, että mainittu polystyreenipolymeeri on kokonaan liukenematon tiettyihin orgaanisiin liuottimiin. Katso Stewart, et ai., Solid-Phase Peptide 15 Synthesis (1969) W.H.Freeman Co., San Fransisco, ja Merrifield, J. Am. Chem. Soc. (1963) Si: 2149-2154. Näitä mainittuja sekä muita menetelmiä peptidien syntetisoimiseksi on esitetty myös yhdysvaltalaisissa patenteissa No:t 3862925,3842067, 3972859 ja 4105602.

Peptidien synteeseissä voidan käyttää hyväksi manuaalisia synteesitekniikoita tai automaattiko siä syntetisaattoreita, esimerkiksi Applied BioSystems 430A tai 43IA Peptide Synthesizer -laitteita (Foster City, California) siten, että seurataan valmistajan laitteen mukana toimittamassa käyttöohjekiijassa olevia ohjeita. Peptidien irrottamiseen mainituista hartseista voidaan käyttää Lun kuvaamaa erityistä menetelmää ("low-high HF deprotection protocol) (katso Lu, G.-S., et ai., Int. J. Peptide & Protein Res. (1987) 22:545-557. Käärmeiden myrkyistä saata-i 25 vien PAI-faktorien analogien uudelleen kokoaminen voidaan suorittaa käyttäen Garskyn tut kimusryhmän kuvaamaa menetelmää (katso Garsky, V., et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA ' . · (1989) M: 4022-4026), jossa on lähemmin kuvattu ekistatiinin kiinteässä faasissa tapahtuvaa synteesiä.

30 Tämän keksinnön mukaisesti käytettävät peptidit, joissa ei esiinny disulfidisidoksia, voidaan kätevästi ja edullisesti valmistaa yhdistämällä kiinteässä faasissa tapahtuva synteesi ja syklisen rengasrakenteen muodostuminen liuoksessa käyttämällä hyväksi yleisesti käytössä olevia 38 104364 menetelmiä, jotka on kuvattu Nutt'in nimissä olevassa yhdysvaltalaisessa patentissa No. 4612366. Tällöin lineaarisia peptidejä valmistetaan tavanomaisen Merrifieldin hartsin avulla ja ne voidaan irrottaa hartsista hydratsiinin avulla, mitä seuraa vastaavan atsidimuodon sykli-sointi syklisten peptidien aikaan saamiseksi.

5

Jokainen, jolla on peptidien syntetiikan alalla vaadittavat taidot ja tiedot, havaitsee helposti, että sellaiset intermediaatit, jotka rakentuvat tässä hakemuksessa esitetyllä tavalla tässä esitettyjen analogiyhdisteiden syntetisoinnin aikana, ovat itsessään uusia ja edullisesti käyttökelpoisia yhdisteitä ja kuuluvat täten niinikään tämän keksinnön kohteen piiriin.

10

Seuraavassa selitetään tämän keksinnön mukaisten inhibiittorien antoa, annostelua ja käyttökelpoisuutta.

Tämän keksinnön mukaiset PAI-faktorit ovat terapeuttisesti käyttökelpoisia estämään trom-15 hien muodostumista. Tämän mainitunlaisen annettavan hoidon indikaatioihin kuuluvat esimerkiksi ateroskleroosi ja arterioskleroosi, akuutti myokardiaalinen infarkti, krooninen epästabiili angina pectoris, hetkelliset iskeemiset kohtaukset ja halvaukset, ääreis-verenkiertoelimistön sairaudet, arteriaalinen tromboosi, pre-eklampsia, embolia, restenoosi ja/tai angioplastian jälkeinen tromboosi, karotidinen endarterektomia, verisuonisiirännäisten 20 anastomoosi sekä krooniset kardiovaskulaariset laitteet (kuten esimerkiksi sisään jäävät katetrit tai putket, "kehon ulkopuoliset verenkiertoelimistön osat"). Nämä mainitut oireyhtymät edustavat erilaisia stenoottisia ja okklusiivisia verenkiertoelimistön sairaustiloja, joiden katsotaan johtuvan verihiutaleiden aktivoitumisesta verisuonten seinämillä.

25 Mainitut PAI-faktorit soveltuvat käytettäviksi arteriaalisen trombin muodostumisen estoon ja ^ pysyäyttämiseen, samoin epästabiilin angina pectoriksen ja arteriaalisen ambolian tai trom-. boosin, sekä myokardiaalisten infarktien (MI) ennalta ja muraalisten MI:n jälkeisten trombien ; ehkäisyyn ja hoitoon. Aivojen tautitiloista voidaan hoitaa tai ennalta ehkäistä esimerkiksi hetkellisiä iskeemisiä kohtauksia ja tromboottisia halvauksia tai kehittymässä olevia hal-30 vaustiloja.

39 104364

Edelleen mainittuja PAI-faktoreita voidaan käyttää ennalta ehkäisemään verhiutaleiden aggregaattia, embolisaatiota tai kulutusta kehon ulkopuolisessa verenkierrossa, mukaanlukien renaalisen dialyysin edesauttaminen, sepelvaltimoiden ohitukset, hemoperfuusiot sekä plas-mafereesi.

5 - Mainitut PAI-faktorit estävät verihiutaleiden aggregaatiota, embolisaatiota tai intravaskulaa- risiin laitteisiin liittyvää kulutusta, ja niiden antaminen saa aikaan intra-aortisten pallopump-pujen, vnetrikulaaristen apulaitteiden ja arteriaalisten katetrien toiminnan tehostumisen.

10 Edelleen, mainitut PAI-faktorit ovat edullisesti käyttökelpoisia esimerkiksi venöösisen trom-boosin sekä syvän venöösisen tromboosin, renaalilaskimon tai porttaalilaskimon tromboosin sekä sydänlaskimoiden tromboosin hoidossa ja ennalta ehkäisyssä.

Samoin esimerkiksi useat erilaiset tautitilat, joihin liittyy verihiutaleiden kulutusta, kuten 15 esimerkiksi trombosytopeeninen pilkkutauti, ovat myös hoidettavissa edellä mainittuja faktoreita hyväksi käyttäen.

Lisäksi, tämän keksinnön mukaisia PAI-faktoreita voidaan käyttää myös lukuisissa ei-terapeuttisissa sovelluksissa, joissa verihiutaleiden inhibitio on eduksi. Esimerkiksi, verihiutale leiden ja kokoveren säilyvyyttä voidaan parantaa lisäämällä riittävän suuria määriä peptidejä, joka mainittu määrä riippuu esimerkiksi kyseeseen tulevasta säilytysajasta, säilytysolosuhteista ja varastoidun materiaalin aiotusta käytöstä.

Mainittujen PAI-yhdisteiden kulloinkin käytetyn annoksen suuruus voi vaihdella suuresti * 25 riippuen niistä vaikutuksista, jotka halutaan saada aikaan sekä terapeuttisista vaatimuksista.

Tyypillisesti on edullista annosten suuruus voi vaihdella välillä 0,01 - 10 mg/kg, edullisesti 0,01-0,1 mg/kg kehon painon mukaan. Mainitut PAT.t annetaan edullisesti parenteraalisesti, kuten muunmuassa intravenöösisesti, päivittäin aina viikon mittaisen jakson aikana, tai jopa kuukauden tai kahden kuukauden ajan, mikä kaikki riippuu kulloinkin käytetyn peptidin 30 koosta. Jos annattavat peptidit ovat liitävän pieniä (esimerkiksi ne sisältävät vähemmän kun 8-10 aminohappotähdettä) voidaan käyttää muitakin antoteitä, kuten esimerkiksi intranasaa-. lista ja sublinguaalista antotietä.

40 104364

Tavanomaisissa muodoissa olevia ruiskeita, kuten esimerkiksi nestemäisinä liuoksina tai suspensioina, liuotettaviksi soveltuvissa kiinteissä muodoissa tai nesteessä ennen injektointia suspensioina olevissa muodoissa tai emulsioiden muodossa, voidaan valmistaa. Edullisesti 5 käytettäviksi soveltuvia kantaja-aineita ovat esimerkiksi vesi, suolaliuokset, dekstroosi, mannitoli, laktoosi, lesitiini, albumiini, natriumglutamaatti, kysteiinihydrokloridi sekä muut näitä vastaavat aineet. Lisäksi, haluttaessa voidaan injektoitaviin farmaseuttisiin kompositioihin sisällyttää pieniä määriä ei-myrkyllisiä apuaineita, kuten esimerkiksi pinta-aktiivisia aineita ja pH:n puskurointiin tarkoitettuja aineita. Haluttaessa voidaan käyttää myös ab-10 sorptiota lisääviä valmisteita (esimerkiksi liposomeja).

Esimerkki 1 A. Määritysmenetelmien kuvaus - levvmääritvkset

Puhdistettja verihiutaleiden GP Ilb-IIIa-resptoreja valmistettiin siten kuin Fitzgerald on esit-15 tänyt (katso Fitzgerald, L.A., et ai., Anal. Biochem. (1985) 151: 169-177). Vitrones-tiinireseptoreita valmistettiin vastaavasti siten, kuin Smith on esittänyt (katso Smith, J.W., L Biol. Chem. (1988) 263: 18726-18731). Puhdistuksen jälkeen mainitut reseptorit varastoitiin 0,1 % Triton X-100:aan pitoisuuden ollessa 0,1 -1,0 mg/ml.

20 Mainituilla reseptoreilla päällystettiin 96-maljaisten tasapohjaisten ELISA-levyjen maljoja (Linbro EIA-Plus mikrotiitterilevy, Flow Laboratories) sen jälkeen, kun nämä reseptorit oli laimennettu 1:200 sellaisella liuoksella, joka sisälsi 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl ja 1 mM CaC12 ja jonka pH oli 7,4, jotta olis voitu pienentää Triton X-100:n konsentraatiota alle sen kriittisen misellarisen konsentraation, ja lisäämällä 10 mikrolitran eriä kuhunkin mainituista 25 maljoista. Näiden mainittujen maljojen annettiin inkuboitua yli yön 4 asteen (°C) lämpötilas- ▼ sa, ja tämän jälkee niitä aspiroitiin, kunnes ne olivat kuivia.

Muut kuin tämän keksinnön mukaisesti kyseeseen tulevat sitoutumiskohdat Mokattiin lisäämällä boviinia seerumin albumiinia (BSA) sen pitoisuuden ollessa 35 mg/ml edellä esitetyssä 30 puskuriliuoksessa ja pitämällä tätä 2 tuntia 30 asteen (°C) lämpötilassa, jotta olisi estetty epäspesifinen sitoutuminen. Tässä edellä esitetyn jälkeen mainitut maljat pestiin kerran epäs- 4i 104364 pesifisen sitoutumispuskurilla (50 nM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 1 mg/ml BSA).

Vastaavia ligandeja (fibrinogeeniä, von Willebrandin faktoria tai vitronestiiniä) leimattiin 5 I:n tai konjugoidun biotiinin avulla siten, että käytettiin hyväksi kaupallisesti saatavilla olevia reagensseja ja standardimenetelmiä. Mainitut leimatut ligandit lisättiin reseptoreilla päällystettyihin maljoihin sellaisena pitoisuutena, joka vastasi 10 nM (100 mikrolitraa/malja), ja näitä inkuboitiin 3 tunnin ajan 30 asteen (°C) tutkittavan materiaalin läsnä ollessa tai ilman tutkittavaa materiaalia. Inkuboinnin jälkeen mainittuja maljoja aspiroitiin, kunnes ne olivat 10 kuivia, ja sitoutuneen ligandin määrä kvantitoitiin.

125I:n avulla leimattujen ligandien tapauksessa proteiini liuotettiin 250 mikrolitran SDS:ää avulla. Biotinyloitujen ligandien tapauksessa sitoutunut proteiini detektoitiin lisäämällä anti-biotiinistä vasta-ainetta, joka oli konjugoitu emäksisen fosfataasin kanssa, mitä seurasi 15 substraatin (p-nitrofenyylifosfaatti) lisäys ja optisen absorbanssin mittaus aallonpituuden ollessa 405 nm. Vähentynyt värinkehittyminen tai vähentynyt l25I:n pitoisuus havaittiin sellaisen tutkittavan materiaalin, joka inhiboi ligandin sitoutumista reseptoriin, kanssa inkuboiduis-ta maljoista.

20 B. Adheesion inhibition määritys puhdistamattomasta myrkystä

Kuusikymmentäkahdeksan puhdistamatonta lyofilisoitua käärmeenmyrkkynäytettä, jotka oli toimittanut joko Sigma Chemical Company (St. Louis, MO) tai Miami Serpentarium Labs (Salt Lake City, UT), liuotettiin puskuriin pitoisuuden ollessa 1 mg/ml (50 mM Tris, 100 MmNaCl, 0,02 % atsidia, 2 mM CaCl2). Yhden millilitran eriä näin saaduista liuoksista ultra-- 25 suodatettiin Centrocon-10 (YM membraani) mikrokonsentraattoreiden (Amicon, Danvers, MA) läpi. Näin saatuja suodoksia käyytettiin tutkittavina näytteinä resepto-ri/ligandimäärityksessä, joka on edellä kuvattu kohdassa A., käyttämällä mainittua GP Ilb-nia/fibrinogeenisysteemiä hyväksi, ja mittaamalla sitoutuminen biotinyloidun fibrinogeenin avulla. Tulokset on esitetty taulukossa 1.

30 • ·

Voidaan havaita, että joissakin, muttei kuitenkaan kaikissa, tutkituista näytteistä, jotka ovat peräisin eri Viperinae-lajeista. on läsnä aktiivisuutta, mutta ettei yhdessäkään Elapidae-lajin myrkyssä ole aktiivisuutta.

42 104354 5 Kuviossa 1 on esitetty eri laimennoksilla aikaan saadut tulokset neljän eri lajin myrkkyjen suodosten ollessa kyseessä. Jopa suurimmalla laimennoksella, 25 ul/0,5 ml, mainituista kolme aktiivista myrkkyä sai aikaan maksimaalisen inhibition.

C. Peptidien aktiivisuuden määritys in vivo tromboosimallissa 10 Tutkittiin puhdistettujen peptidien kykyä estää trombien mudostumista koiran sepelvaltimoissa sellaisessa mallissa, jonka on kuvannut Folts (katso Folts, J.D., et ai., Circulation (1976) 54: 365). Tässä mainitussa mallissa virtauksen pienenemisen ahtautuneessa sepelvaltimossa on osoitettu johtuvan verihiutaleaggregaattien muodostumisesta, ja sellaisten agens-sien, jotka estävät fibrinogeenin sitoutumisen GP IIb-IIIa:n kanssa, on osoitettu estävän näitä 15 mainittuja virtauksen pienenemisiä (katso Coller, B.S., et ai., Blood (1986) ££: 783). Nämä mainitut peptidit olivat liuotettuina tavanomaiseen suolaliuokseen ja ne annettiin periferaali-seen laskimoon yhtenä annoksena.

Taulukko 1, 20

Centricon-10:n avulla puhdistetut myrkyt, jotka on seulottu GP Ilb-IIIa-levymäärityksen avulla

Elapidae Aktiivisuus 25

Austrelaps superba (australian kuparipääkäärme, Australian copperhead) * 30 Acanthopis antarcticus (kuoleman kyy, death adder)

Dendroaspis j amesonii (Jamesonin mamba, Jameson's mamba) 35

Notachis scutatus (Mainland tiger) : * Pseudechis colleti guttatus 43 104364 (Blue-bellied)

Pseudechis textillis textillis (Common brown) 5

Oxyuranus scutellatus (Papuan taipaani, Papuan taipan) 10 Viperinae (Kyyt) Aktiivisuus

Athens squamigera (vihreä pensas kyy, green bush viper) 15 Bitis nasicomus (jokikyy, riveijack)

Causus rhombeatus (rhombic night adder) 20

Cerastes cerastes (aavikon sarvikyy, desert homed viper)

Cerastes vipera 25 (Saharan sarvikyy, Sahara homed viper)

Echis carinatus + (saw-scaled viper) 30 Echis colorata + (mattokyy, carpet viper)

Eristicophis macmahonii ++ (Macmahonin kyy, Macmahons viper) 35

Pseudocerastes fieldi (Persian sarvikyy, Persian homed viper)

Vipera xanthina xanthina 40 (ottomaanikyy, Ottomans viper)

Vipera ammodytes (pitkäkuonoinen kyy, long-nosed viper) 45 Vipera r. russelli (Russellin kyy, Russells viper) ' ’ Vipera r. siamensis 44 10 4 c £ 4 (Siamin kyy)

Vipera palaestinae (Palestiinan kyy, Palestine viper)

Crotalinae (luolakyyt) Aktiivisuus

Agkistrodon rhodostoma + (Malajin luolakyy, Malayan pit viper) ίο

Agkistrodon halys blomhoffi + (mamushi)

Agkistrodon hypnale + 15 (kyhmykuonokyy, hump-nosed viper)

Agkistrodon acutus ++ (teräväkuonoinen kyy, sharp-nosed viper) 20 Agkistrodon bilineatus (Meksikon mokkasiinikäärme, Mexican moccasin)

Agkistrodon contortrix contortrix 25 Agkistrodon c. laticinctus

Agkistrodon c. pictigaster

Agkistrodon contortrix mokasen 30 (pohjoisen kuparipääkäärme, northern copperhead)

Agkistrodon piscivorous piscivorous (Floridan vesimokkasiinikäärme, eastern cottonmouth) 35 Agkistrodon piscivorus leucostoma + (Texasin vesimokkasiinikäärme, western cottonmouth)

Agkistrodon piscivorous conanti + *: 40 Bothrops asper + ’ (Keski-Amerikan keihäskäärme)

Bothrops nummifer (jumping viper)

Bothrops cotiara + (cotiara) 45 „ 104364 45

Bothropsjararacussu +

Bothrops j araraca + (jararaca) 5

Bothrops lansbergi +

Bothrops altemata (urutu) 10 , Bothrops medusa +

Bothrops neuwiedi + 15 Bothrops nasuta +

Bothrops pradoi +

Bothrops schlegli 20 (Schlegelin kyy, Schlegels viper)

Trimeresurus gramineus (Formosan vihreä bambukäärme, Formosan green habu) 25 Trimeresurus flavoviridis (Okinawan bambukäärme, Okinawa habu)

Trimeresurus wagleri (Waglerin bambukäärme) 30

Lachesis mutas (pensaskyy, bushmaster)

Crotalus durissus terrificus 35 (trooppinen kalkkarokäärme, tropical rattlesnake) ^ Crotalus durissus totonatacus

Crotalus durissus durissus ' 40 ' ’ Crotalus scutalatus (Mojaven kalkkarokäärme, Mojave rattlesnake)

Crotalus horridus horridus 45 (puukalkkarokäärme, timber rattlesnake) . Crotalus horridus atricaudatus * (Canebrake rattlesnake) 46 104364

Crotalus atrox (Texasin kalkkarokäärme, western diamondback) 5 Crotalus adamanteus (Floridan kalkkarokäärme, Eastern diamondback)

Crotalus basilicus + (Meksikon länsirannikon kalkkarokäärme, Mexican West-coast rattlesnake) 10

Crotalus molossus molossus + (mustahäntäkalkkarokäärme, black-tailed rattlesnake)

Crotalus ruber ruber + 15 (punainen kalkkarokäärme, red diamondback rattlesnake)

Crotalus cerastes cerastes + (Mojaven juoksijakäärme, Mojave sidewinder) 20 Crotalus viridis viridis + (preeriakalkkarokäärme, prairie rattlesnake)

Crotalus v. helleri + (Kalifornian kalkkarokäärme, Southern Pacific rattlesnake) 25

Crotalus v. oreganus + (Northem Pacific rattlesnake)

Crotalus v. cereberus + 30 (Arizonan musta kalkkarokäärme, Arizona black rattlesnake)

Crotalus v. lutosus + * (Suuren Ylängön kalkkarokäärme, Great Basin rattlesnake) 35 Crotalus v. concolor (kääpiökalkkarokäärme, midget-faded rattlesnake)

Sistrurus catenatus tergeminus + (Missisaugan kalkkarokäärme, western massasauga) 40

Sistrurus milarius barbouri + (Carolinan kääpiökalkkarokäärme, southeastern pigmy rattlesnake) 45 D. Puhdistettujen käärmeiden myrkkvpeptidien vaikutukset solujen kiinnittymiseen adhesii-\ visiin proteiineihin 47 104364 M21-melanoomasoluja, joissa esiintyi runsaasti vitronestiinireseptoreita, leimattiin metaboli-sesti 35S-metioniinillä, minkä jälkeen ne lisättiin 24:n maljan kudosviljelylevyille, jotka oli päällystetty vitronestiinillä.

Solujen kiinnittämiseksi käytettiin 1 tunnin inkubointiaikaa 37 °C lämpötilassa, ja tätä seu-5 rasi pesu kiinnittymättömien solujen poistamiseksi. Pesun jälkeen kiinnittyneet solut saatettiin liuokseen, ja supematantit siirrettiin nestetuikelaskuriin. Kiinnittyneiksi jääneiden solujen osuus laskettiin jakamalla cpm-lukema kuhunkin yksittäiseen maljaan lisättyjen kokonais-' määrällä. Käärmeiden myrkyistä saatujen puhdistettujen peptidien ja synteettisten syklisten peptidien vaikutus solujen kiinnittymiseen määritettiin siten, että niitä lisättiin yhdessä M21-io solujen kanssa inkubointijakson ajaksi.

E. Adheesion inhibition spesifisyys

Kolmesta lajista, Sistrurus hl barbouri. Crotalus ruber ruber ja Crotalus basilicus. saatujen käärmeiden myrkkyjen ultrasuodoksia tutkittiin sekä fibrinogeeni/GP Ilb-IIIa- että vitrones-15 tiini/vitronestiinireseptorimäärityksissä A.-kohdan mukaisesti. Tulokset määritettiin useilla eri pitoisuustasoilla. Kuten kuvasta 2 käy ilmi, Sistrurus m. barbouri’sta saatava myrkky inhiboi ensisijaisesti fibrinogeenin sitoutumista GP IIb-IIIa:n kanssa, Crotalus ruber ruber’ista saatava taas inhiboi molempia mainittuja systeemejä suunnilleen yhtä voimakkaasti ja Crota-lus basilicus’ista saatava myrkky taas inhiboi ensisijaisesti vitronstiinin sitoutumista vitrones-20 tiinireseptorin kanssa.

Esimerkeissä 2-6 ja 8-12 selitetyille puhdistetuille näytteille määritettiin PAI-aktiivisuus käyttämällä suoraa verihiutaleiden aggregaation inhibitioita. Runsaasti verihiutaleita sisältävää plasmaa (PRP) saatiin terveestä vapaaehtoisesta koehenkilöstä. Aggregaatio indusoitiin « 25 lisäämällä 4 uM ADP:a 0,5 millilitraan PRP:aa aggregometrissä (Chrono-log Corp.).

’ v Esimerkeissä 2-6 saadut tulokset puhdistettujen PAI-faktorien aminohappokomposition määrityksestä on esitetty jäljempämnä esimerkin yhteydessä olevassa taulukossa. Vastaava-taulukko esimerkkien 8-11 kohdalla on esitetty esimerkin 8 yhteydessä.

Tämä mainittu määritys saatiin aikaan hydrolysoimalla kyseisiä peptidejä 6 N HCl:n avulla ja analysoimalla hydrolysaatti käyttäen Beckman 121 HC -analysaattoria, joka oli varustettu 30 48 104364

Model 126 -tiedonkeruujäijestelmällä. Kysteiinihappo määritettiin Mooren kehittämällä me netelmällä (katso Moore, J. Biol. Chem. (1969) 230: 235-237. Tryptofaania ei määritetty.

Esimerkki 2 5 Eristocophis macmahoni'n myrkkyä (Miami Serpentarium Labs, Lot No. EM23SZ) 45 mg 1,0 mkssa 0,5 % trifluorietikkahappoa (TFA) sisältävää liuosta jäähdytettiin jäissä 20 minuutin ajan, sentrifugoitiin 3 minuuttia kierrosnopeudella 14000 rpm liukenemattoman materiaalin poistamiseksi ja syötettiin 3,9 mm x 30 cm C-l 8 Delta Pak käänteisfaasi-HPLC-kolonniin (Waters, Milford, MA), joka oli stabiloitu 5 % asetonitriilillä, joka sisälsi 1 % TFA. Käyttäen 10 sellaista kromatografista gradienttiajoa, jossa käytettiin liuotinohjelmaa, jossa eluentti sisälsi 5 % asetonitriiliä aluksi ja 15 % 5 minuutin kuluttua (2 %/minuutti) ja jota seurasi toinen gradienttiajo 15 - 30 % asetonitriiliä 35 minuutin aikana, ja tämän jälkeen ajoa 50 % asetonitriilillä 20 minuutin ajan, ja jossa laitteena oli Waters 600E -nestekromatografi. Koko gra-dienttiajon ajan virtausnopeutena pidettiin 1,5 ml/min ja kolonnin effluentista kerättiin 2 mi-15 nuutin fraktioita polypropyleeniputkiin.

Kolonnista poistuvaa effluenttia mitattiin jatkuvatoimisesti 220nm/2,5 absorbanssiyksikköä vastaavalla asteikolla (AUFS).

20 Kerätyt fraktiot konsentroitiin puoleen alkuperäisesti tilavuudetaan käyttämällä Speed-Vac -haihdutinta (Savant), mitä seurasi lyofilisointi. Näytteet rekonstituoitiin 1 millilitraan vettä, ja . tästä otettuista näyte-eristä (10-50 mikrolitraa) analysoitiin niiden kyky inhiboida 20 uM

ADP:lla indusoitua humaanien verihiutaleiden aggregaatiota runsaasti verihiutaleita sisältävässä plasmassa käyttämällä kokoverelle tarkoitettua aggregometriä (Chrono-log Corp., Ha-25 verton, PA).

' Kuten Kuviossa 3 on esitetty, fraktiot, jotka eluoituivat 21-25 % asetonitriiliä, sisälsivät ak tiivisuutta. Nämä mainitut fraktiot lyofilisoitiin seuraavaksi ja niille suoritettiin uusi HPLC-ajo käyttäen C-l8 HPLC-kolonnia ja loivempaa liuotingradienttia seuraavassa esitetyllä taval-30 la. Alussa ajo-olosuhteet olivat sellaiset, että asetonitriiliä oli 8 %, mitä seurasi gradientti 25-prosenttiseen asetonitriiliin 68 minuutin aikana (0,25 %/min), minkö jälkeen tuli uusi gra-\ dientti 60-prosenttiseen asetonitriiliin 10 minuutin aikana. Talteen otettiin yhden minuutin 49 104364 aikana kerättyjä fraktioita, jotka kuivattiin ja analysoitiin uudelleen humaanien verihiutaleiden aggregaation inhibiittoriaktiivisuuden suhteen kuten edellä.

Kuten kuvasta 4 käy ilmi, aktiivisuus eluoitui 24-prosenttisella asetonitriilillä. Seuraavaksi 5 aktiiviset fraktiot ajettiin analyyttisen HPLC-kolonninläpi käyttäen mittausaallonpituutena 220 nm, jolloin nämä mainitut fraktiot eluoituivat yhtenä symmetrisenä bioaktiivisena komponenttina siten, kuin Kuviossa 5 on esitetty. HPLC:n avulla puhdistetun materiaalin amino-happoanalyysi osoitti, että kyseinen peptidi sisältää 49 aminohappotähdettä, joihin kuuluu 7-8 kysteiiniä siten, kuin taulukossa 2 on esitetty.

10

Yritykset kyseisen peptidin karboksiamidometyloidun muodon automaattisen Edman-degradaation suorittamiseksi eivät johtaneet havaittavien sekvenssien aikaan saamiseen. Tämän vuoksi, tämän mainitun materiaalin hajottaminen suoritettiin käyttämällä Lys-C- ja Asp-n-endoproteinaaseja, joiden avulla saatiin aikaan Kuviossa 6 esitetyt fragmentit, jotka sek-15 vensoitiin ja jotka on esitetty Kuviossa 6. Tämän mainitun analyysin mukaisesti todettiin 48 aminohappotähdettä pitkä sekvenssi. Koska tämän sekvensointiin perustuvan analyysin perusteella on ilmeistä, että kyseinen peptidi sisältää myös kaksi tryptofaanitähdettä, joita ei tutkittu aminohappokompositiota määritettäessä, koko kyseinen peptidi käsittää 51 aminohappotähdettä. Näin ollen, kaksi Glx- ja yksi Arg-tähde, jotka puuttuvat edellä määritetystä 20 sekvenssistä, ovat ilmeisesti läsnä kyseisen peptdin suojautuneessa aminoterminaalisessa päässä. Koska on hyvinkin mahdollista, että yksi mainituista Glx-tähteistä oli pyrogluta-; myylitähde, joka sijaitsi aminoterminaalisessa päässä siten, että se sai aikaan koko kyseisen peptidin suojatun luonteen, tämän keksinnön keksijät poistivat mainitun tähteen alkuperäisen peptidin karboksiamidometyloidusta muodosta pyroglutamyyliaminopeptidaasientsyymin (L-* 25 pyroglutamyylipeptidin hydrolaasin, EC 3.4.11.8) avulla (Boehringer Mannheim Biochemi- cals, Indianapolis, IN). Tähän käytettiin Podellin ja Abrahamin kuvaamia menetelmiä (Podell ’ ja Abraham, Biochem. Biophys. Res. Commun. (1978) M: 176-185). 100 mikrogrammaa kyseistä peptidiä käsiteltiin peptidaasin avulla substraatti-entsyymi-suhteen ollessa 100:1, minkä jälkeen seurasi käänteisfaasi-HPLC:n avulla tapahtuva puhdistus seokselle Watersib 30 valmistaman C-18 kolonnin avulla, mikä sai aikaan materiaalia, joka soveltui käytettäväksi Edman-degradaatiossa. Analyysin tulokset ja koko kyseeseen tulevan peptidin, joka nimettiin ’ · "eristikofiiniksi" ("eristicophin"!. sekvenssin määrittäminen on esitetty Kuviossa 6.

5 50 104364 Tämän mainitun PAI-faktorin koko aminohapposekvenssi on esitetty Kuviossa 6. Tämä mainittu peptidi käsittää RGD:n sitoutumiseen osallistuvalla alueellaan ja sillä ilmenee huomattavassa määrin homologiaa ekistatiinin kanssa.

Esimerkki 3

Sistrurus catenatus tergeminus'in mvrkvn sisältämän PAI-faktorin puhdistaminen Kolmesataakuusikymmentä mg Sistrurus sl. tergeminus'in myrkkyä (Miami Seipentarium Labs, Lot No. ST6SZ) liuotettiin 7,0 ml:aan 0,5 M etikkahappoa ja ajettiin hienojakoisella 10 täytteellä pakatun stabiloidun Sephadex G-50 -kolonnin (Pharmacia, 2,5 c 100 cm) läpi käyttäen eluenttina 0,5 M etikkahappoa. Virtausnopeus mainitun kolonnin läpi oli noin 25 ml/tunti, ja kerättiin 5 ml:n fraktioita. Kaksikymmentäviisi mikrolitraa kutakin fraktiota yhdistettiin 10 fraktiota vastaaviksi eriksi (siis fraktiot 1-10, 11-20 ja niin edelleen) ja lyofili-soitiin analyysiä varten. Kuivatut veteen uudelleen liuotetut yhdistetyt fraktiot ja näyte-eriä 15 näistä tutkittiin ADP-stimuloidun humaanien verihiutaleiden aggregaation inhi-biittoriaktii visuuden suhteen. Aktiiviset fraktiot (31-40) yhdistettiin ja lyofilisoitiin.

Tämä mainittu materiaali liuotettiin 2 ml:aan 0,5 % TFA:ta ja syötettiin 19 mm x 30 cm C-18 Delta Pak -käänteisfaasi-HPLC-kolonniin (Waters), joka oli stabiloitu 8-prosenttisella ase-20 tonitriilillä, joka sisälsi 0,1 % TFA:ta. Kromatografisessa ajossa käytettiin gradienttia, joka vastasi 8-30 % asetonitriiliä 30 minuutin aikanajqa jota seurasi 60 % asetonitriili kahden-; kymmenen minuutin ajan virtausnopeuden ollessa 18 ml/minuutti. Kolonnista poistuva efflu- entti otettiin talteen polypropyleeniputkiin 0,2 minuutin aikana kerättyinä fraktioina, ja mainittua effluenttia monitoroitiin laiteasetukisilla 220 nm/2,2 AUFS. Fraktiot konsentroitiin 25 Speed-Vac -väkevöimislaitteella (Savant), lyofilisoitiin ja niiden antiaggregaatioaktiivisuus humaanien verihiutaleiden suhteen tutkittiin aiemmin edellä kuvatulla tavalla menetellen.

* r

Kuviossa 7 on esitetty, että PAI-pitoiset fraktiot eluoituvat käyttämällä 24-25 % asetonitriiliä.

Näiden mainittujen aktiivisten fraktioiden HPLC-analyysi (220 nm) osoitti yhden symmetri-30 sen bioaktiivisen komponentin läsnäolon, kuten käy ilmi kuvasta 8. Tämän mainitun materiaalin aminohappoanalyysi osoitti, että se sisältää peptidin, joka koostuu 71-72 amino-’ · happotähteestä, joihin kuuluu 12 kysteiinitähdettä, kuten käy ilmi taulukosta 2.

104364 51

Osa puhdistetusta peptidistä pelkistettiin ja alkyloitiin jodiasetamidilla sekä puhdistettiin ΟΙ 8 käänteisfaasi-HPLC-kolonnin avulla. Tämän materiaalin N-terminaalisen sekvenssin 5 analyysi osoitti seuraavanlaisen sekvenssin olemassa olon 23 Edman-degradaation syklin j älkeen: Glu- Ala-Gly-Glu-Glu-Cys- Asp-Cys-Gly-Ser-Pro- Ala- Asn-Pro-Cys-Cys- Asp- Ala-

Ala-Thr-Cys-Lys-Leu.

ψ Tämän kyseisen PAI:n täydellinen aminohapposekvenssi, joka nimettiin "tergeminiiniksi" 10 rtergeminin”! on esitetty Kuviossa 6.

Mainittu puhdistettu peptidi tutkittiin käyttäen reseptoreihin perustuvia määritysmenetelmiä siten, kuin edellä esimerkin 1 A.-kohdassa on esitetty. Puhtaan peptidin pitoisuudet, jotka olivat alle 100 nM, inhiboivat Fg:n ja vWF:n sitoutumista GP IIb-IIIa:n kanssa sekä Vn:n ja 15 vWF :n sitoutumista vitronestiinireseptorin kanssa, kuten Kuviossa 9 on esitetty.

Esimerkki 4

Verihiutaleiden aggregaation inhibiittorin puhdistaminen Sitrurus milarus barbouri'n mvrkvs-lä 20 Kaksisataa mg Sistrurus milarus barbouri'sta saatua myrkkyä (Miami Serpentarium Labs, Lot No. SM13SZ) liuotettiin 7,0 ml:aan 0,5 M etikkahappoa ja syötettiin hienojakoisella pakka-: , usmateriaalilla täytettyyn Sephadex G-50 kolonniin (Pharmacia, 2,5 x 100 cm), joka oli stabi loitu, ja eluoitiin 0,5 M etikkahapon avulla. Virtausnopeus kolonnissa oli 26 ml/tunti, kerättiin 5 ml:n fraktioita, jotka analysoitiin verihiutaleiden aggregaation inhibiittoriaktiivisuuden - 25 suhteen siten, kuin aiemmin edellä on kuvattu. Aktiiviset fraktiot (41-50) yhdistettiin ja lyo- filisoitiin. Näin saatu materiaali liuotettiin uudelleen 2,0 ml:aan 0,5 % TFA:ta ja syötettiin preparatiiviseen C-18-HPLC-koIonniin samoin, kuin esimerkissä 3 edellä, ja eluoitiin käyttäen samoja gradienttiajon olosuhteita. Kolonnin päästä kerättiin 0,2 minuutin fraktioita po-lypropyleeniputkiin, jotka konsentroitiin, lyofilisoitiin ja tutkittiin verihiutaleiden aggregaati-30 on inhibiittoriaktiivisuuden suhteen.

52 104364

Kuviossa 10 on esitetty edellä HPLC:n avulla aikaan saatu aktiivisuusprofiili. Aktiivisista fraktioita suoritettiin analyyttiset HPLC-ajot, jotka osoittivat useiden sellaisten fraktioiden (45-47), jotka olivat yli 90-prsenttisesti homogeenisiä, läsnäolon. Peptidifraktio 46 (150 ug) puhdistettiin homogeeniseksi analyyttisen C-18-kolonnin avulla käyttäen manuaalista frakti-5 on keräysmenetelmää symmetrisen signaalin kohdalla, kuten on esitetty Kuviossa 11. Tämän mainitun materiaalin aminohappoanalyysi osoitti kyseessä olevan 71-72 aminihappotähdettä sisältävän peptidin, joka sisälsi 12 kysteiinitähdettä, kuten on esitetty taulukossa 2.

Mainittu puhdistettu peptidi (150 ug) liuotettiin 300 ul:aan reaktiopuskuria (6 M guanidiini-10 hydrokloridia, 0,25 M Tris-HCl, 20 mM EDTA, 20 mM ditiolitreitolia (DTT), pH 7,5) ja annettiin olla sen kanssa kosketuksissa 1,5 tunnin ajan huoneen lämpötilassa peptidin pelkistämiseksi. Tätä suoritusvaihetta seurasi reaktio 3 ul:n 4-vinyylipyridiiniä kanssa (Aldrich) huoneen lämpötilassa vielä tunnin ajan. Reaktio pysäytettiin lisäämällä 200 ui 1 % TFA:ta ja seos syötettiin analyyttiseen C-18 HPLC-kolonniin ja eluoitiin asetonitriilin vesiliuoksella, 15 joka sisälsi myös 0,1 % TFA, gradienttiajoa hyväksi käyttäen siten, että alussa asetonitriiliä oli 8 % ja kahdenkymmenen minuutin aikana sen osuus nostettiin 25 %:iin, ja tämän jälkeen 60 %:iin 10 minuutin aikana.

Osa tästä pyridyylietyloidusta materiaalista tutkittiin N-terminaalista sekvenssianalyysiä hy-20 väksi käyttäen siten, kuin jo aiemmin edellä on esitetty, ja pelkistetylle ja alkyloidulle peptidille suoritettiin täydellinen proteolyyttinen hajottaminen käyttäen hyväksi endoprotein-saasi-Lys-C:tä ja endoproteinaasi-Asp-N:ää siten, että peptidin fragmentit eristettiin joko C-3 tai C-18 käänteisfaasi-HPLC-kolonnien avulla käyttämällä asetonitriili/vesi/TFA-gradienttiajoa eluointiin. Alkuperäisen peptidin N-terminaalisen pään ja eristettyjen proteo-25 lyyttisten fragmenttien aminohapposekvenssit määritettiin käyttäen menetelmiä, jotka on esittänyt Yarden (katso Yarden, Y., et ai., Nature (1986) 222- 226), automaattista Edman- .· degradaatioita varten kaasufaasisekvensoijalle.

• · Tämän mainitun eristetyn peptidin täydellinen aminohapposekvenssi, joka on nimetty 30 "harburiiniksi" ('"harhourin"! on esitetty Kuviossa 6, yhdessä proteolyyttisten fragmenttien sekvenssien kanssa. Tämän mainitun sekvenssin vertailu muista käärmeiden myrkyistä saatujen inhibi ittoreiden kanssa on esitetty Kuviossa 12.

53 104364

Esimerkki 5 PAI-tekjjän puhdistaminen Lachesis mutas'in mvrkvstä 99 mg Lachesis mutas'in myrkkyä (Miami Serpentarium Labs, Lot No. LM15FZ) liuotettiin 5 2,0 ml:aan 0,5 % trifluorietikkahappoa ja jäähdytettiin jäissä 20 minuutin ajan, sentrifugoitiin kierrosnopeuden ollessa 14000 ipm 3 minuutin ajan liukenemattoman materiaalin poistamiseksi ja syötettiin 3,9 mm x 30 cm C-18 Delta Pak käänteisfaasi-HPLC-kolonniin (Waters), joka oli stabiloitu 5 % asetonitriilillä, joka sisälsi 0,1 % TFA:ta. Käytetty liuotingradientti oli sellainen, että asetonitriilin pitoisuus muuttui viiden minuutin aikana 5 %:sta 15 %:iin ja tä-io män jälkeen 30 %:iin 35 minuutin aikana (2 %/min) ja edelleen 60 %:iin asetonitriiliä 20 minuutin aikana. Virtausnopeus pidettiin 1,5 ml:ssa minuutissa ja kolonnista poistuvaa efflu-enttia monitoroitiin 220nm/3,0 AUFS. Kerättiin fraktioita kahden minuutin ajanjaksoissa, ja ne väkevöitiin Speed-Vac-laitteella ja lyofilisoitiin. Mainituista fraktioista tutkittiin verihiutaleiden aggregaation inhibiittorien aktiivisuus.

15

Kuviossa 13 on esitetty aktiiviset fraktiot, jotka eluoituivat 18-prosenttisella asetonitriilillä. Näille mainituille fraktioille suoritettiin uusi kromatografinen ajo käyttäen C-18-kolonnia ja loivempaa liuotingradienttia kuin edellä, joka mainittu gradientti käsitti asetonitriilin osuuden nostamisen 5 %:sta 28 %:iin 40 minuutin aikana. Fraktioiden keräysaika oli yksi minuutti, ja 20 mainitut fraktiot väkevöitiin, lyofilisoitiin ja tutkittiin verihiutaleiden aggregaation inhi-biittoriaktiivisuuden suhteen, joiden kokeiden tulokset on esitetty Kuviossa 14. Tässä edellä ; mainituille aktiivisille fraktioille suoritettiin analyyttinen kromatografinen ajo C-18 kolonnia käyttäen, ja eluoidut fraktiot kerättiin käsin signaalin huippua vastaavalta kohdalta. Näin kerätty eluoitunut materiaali, joka käsittää yhden symmetrisen signaalin, on esitetty Kuviossa i 25 15, ja sille suoritettiin aminohappoanalyysi, joka osoitti sen koostuvan 72-73 aminohappotäh teestä ja sisältävän 12 kysteiinitähdettä, kuten on esitetty taulukossa 2.

9 · Tämän esimerkin mukaisen PAI-faktorin täydellinen aminohapposekvenssi, joka on nimetty 30 "lakesiiniksi" f"lachesin"l. on esitetty Kuviossa 6.

54 104364

Esimerkki 6

Crotalus viridis viridis'in mvrkvstä saadun PAI-tekiiän puhdistaminen 47 mg Crotalus viridis viridis'in myrkkyä (Sigma Chemical Co., Lot No. 24F-0534) liuotet-5 tiin 1 ml:aan 0,5 % trifluorietikkahappoa, jäähdytettiin jäissä 20 minuutin ajan, sentrifugoitiin kierrosnopeudella 14000 rpm 3 minuutin ajan liukenemattoman materiaaline poistamiseksi ja syötettiin 3,9 mm x 30 cm C-18 Delta Pak käänteisfaasikolonniin, joka oli stabiloitu 5 % asetonitriililiuoksella, joka sisälsi 0,1 % trifluorietikkahappoa, (Waters) HPLC-ajoa varten. Ajossa käytettiin sellaista liuotingradienttia, jossa asetonitriilin osuus kasvoi 5 %:sta 15 %:iin 10 5 minuutin aikana (2 %/min), minkä jälkeen käytetyssä gradientissa tämä osuus kasvoi vasta- vasti 15 %:sta 30 %:iin 35 minuutin aikana ja edelleen 60 %:iin 60 minuutin aikana. Koko ajon ajan virtausnopeudeksi oli säädetty 1,5 ml/min, ja kolonnista poistuva effluentti kerättiin polypropyleenia oleviiin putkiin siten, että kunkin fraktion keräysaika oli 2 minuuttia. Efflu-enttia monitoroitiin laiteasetuksien ollessa 220 nm/3,0 AUFS. Kerätyt fraktiot väkevöitiin, 15 lyofilisoitiin ja tutkittiin verihiutaleiden aggregaation inhibiittorin aktiivisuuden suhteen.

Kuviossa 16 esitetyt aktiiviset fraktiot eluoituivat 18-19-prosenttiselIa asetonitriiIillä, ja niille suoritettiin kromatografinen ajo käyttäen C-18-HPLC-kolonnia sekä liuotin gradienttia, jossa asetonitriilin osuus kasvoi 8 %:sta 20 %:iin 48 minuutin aikana (0,25 %/min). Tästä ajosta 20 kerätyt fraktiot väkevöitiin ja lyofilisoitiin ja niiden aktiivisuus tutkittiin. Aktiivisille fraktioille suoritettiin uusi kromatografinen ajo (C-18-kolonni, 8-16 % asetonitriiliä/10 minuuttia, : 16-20 % asetonitriiliä/15 minuuttia sekä -60 % asetonitriiliä/10 minuuttia). Kolonnista pois tuvaa effluenttia monitoroitiin aallonpituudella 220 nm ja yksittäisten signaalien kohdalta kerättiin fraktioita käsin polypropyleeniä oleviin putkiin. Edellä saadun aktiivisen fraktion 25 uudelleen analysointi analyyttisen HPLC:n avulla antoi Kuviossa 17 esitetyt tulokset. Tälle mainitulle näytteelle suoritettu aminohappoanalyysi osoitti, että 72-73 aminohappotähteestä ’ [ koostuvan ja 12 kysteiinitähdettä sisältävän peptidin läsnäolon, kuten on esitetty taulukossa 2.

« Tämän mainitun PAI-tekijän täydellinen aminohapposekvenssi, joka on nimetty "viridiiniksi" ("viridin"), on esitetty Kuviossa 6, ja sitä on verrattu muihin PAI-faktoreihin kuviossa 12.

‘9 30 55 104364 laulukin 2,

Puhdistettujen peptidien aminohappokompositiot.

Aminohappo A. B. C. D. E.

Lys 4 3 4 3-4 4

His 0 0 0-1 1 0

Arg 4 5 7 5 7

Asx 11 11 10 11 7

Thr 4 4 2 4 2

Ser 2 2 12 1

Glx 6-7 5-6 7 6 4

Pro 4 4 5 6 5

Gly 9 9 9 10 5

Ala 7 8 9 7 3

Cys 12 12 12 12 7

Vai 2 2 0 1 2

Met 110 0 0

Ile 0 0 2 1 0

Leu 3 3 2 3 0

Tyr 11111

Phe 11111 71-72 71-72 72-73 74-75 49 5 A. = Sistrarus m. barbouri D. = Crotalus v. viridis B. = Sistrurus c. tergeminus E. = Eristicophis macmahoni C. = Lachesis mutas 9 · r

Esimerkki 7 10 Puhdistetun PAI-tekiiän vertailu ekistatiinin kanssa

Esimerkeissä 2 ja 4 kuvatulla tavalla menetellen puhdistettuja peptidejä, eristikofiinia ja bar-buriinia, vertailtiin 49 happotähdettä sisältävään peptidiin, ekistatiiniin, fibrinogeenin GP Ilb-IIIa:han tapahtuvan sitoutumisen inhibition suhteen siten, kuin on kuvattu esimerkin 1 koh- 56 104364 dassa A. Kuva 18 osoittaa, että nämä mainitut puhdistetut PAI-tekijät ovat 2-3 kertaa vahvempia tämän mainitun määrityksen mukaisesti kuin standardiekistatiini.

Echis carinatus’in. Sistrurus el barbouri'sta ja Eristicophis macmahoni'sta saatujen myrkky-5 jen sisältämille homogeenisiksi puhdistetuille peptideille suoritettiin vertailu ekistatiinin kanssa edellä kuvatussa ADP-stimuloidun verihiutaleiden aggregaation määrityksessä. Mainittujen käärmeiden myrkyistä puhdistettuja peptidejä lisättiin kasvavina konsentraatioina (ilman edeltä käyvää inkubointia) osoitetuilla pitoisuustasoilla (kuva 19). Käärmeiden myrkkyjen sisältämät peptidit Eristicophis macmahoni'sta ja Sistrurus dl barbouri'sta olivat vähin-10 tään kaksi kertaa niin potentteja kuin ekistatiini, mikä on yhteensopiva tieto sen aiemmin tehdyn havainnon kanssa, joka koskee niiden vaikutuksen inhibiittorivoimakkuuden jäijestys-tä fibrinogeenin sitoutumisen GP IIb-IIIa:n kanssa suhteen.

Esimerkki 8 15 PAI-tekiiän puhdistaminen Crotalus cerastes cerastes'in mvrkvstä

Yksi gramma Crotalus £* cerastes'in myrkkyä (Miami Serpentarium Labs, Lot No. CE4SZ) liuotettiin 7,0 ml:aan 0,5 M etikkahappoa ja syötettiin hienojakoisella täyteaineella pakattuun Sephadex G-50 kolonniin (Pharmacia, 2,5 x 100 cm), joka oli stabiloitu, ja eluoitiin 0,5 M etikkahapolla. Ajon aikana virtausnopeus oli 25 ml/tunti ja kerättiin 5 ml:n fraktioita po-20 lypropyleenia oleviin putkiin. Näyte-eriä näistä mainituista fraktioista tutkittiin niiden aggregaation aktiivisuuden inhibiittoriaktiivisuuden suhteen siten, kuin jo aiemmin edellä on esitet-: ; ty. Aktiiviset fraktiot (71-80) yhdistettiin jalyofilisoitiin. Kuivattu materiaali resuspendoitiin 2,0 ml:aan 0,5 % TFA:ta, liukenematon materiaali poistettiin sentrifugoimalla, ja mainittu suspendoitu materiaali syötettiin preparatiiviseen C-18 Waters HPLC-kolonniin siten, kuin 25 esimerkissä 3 on selitetty ja eluoitiin käyttäen esimerkissä 3 esitettyjä gradienttiajon olosuhteita. Kolonnista poistuvasta effluentista kerättiin fraktioita polypropyleeniputkiin, ja nämä fraktiot väkevöitiin ja niistä analysoitiin verihiutaleiden aggregaation inhibiittoriaktiivisuus. Kuviossa 20 on esitetty tämän mainitun HPLC-fraktioinnin aktiivisuusprofiili.

30 Aktiiviset fraktiot, joissa ilmeni verihiutaleiden aggregaation inhibiittoriaktiivisuutta, yhdistettiin lyofilisoitiin, ja niille suoritettiin uusi kromatografinen ajo preparatiivisella C-18 HPLC-kolonnilla, josta ne eluoitiin aiemmin mainittua gradienttia hyväksi käyttäen. Fraktiot 57 104364 kerättiin käsin polypropyleenia oleviin putkiin ja niistä määritettiin jälleen verihiutaleiden aggregaation inhibiittoriaktiivisuus samalla tavalla menetellen kuin, mitä jo aiemmin edellä on selitetty. Aktiiviset fraktiot analysoitiin analyyttistä C-18 kolonnia käyttäen esimerkin 4 mukaisissa ajo-olosuhteissa, ja saadut homogeeniset fraktiot yhdistettiin ja lyofilisoitiin. Tä-5 män mainitun materiaalin analyyttinen HPLC-analyysi on esitetty Kuviossa 21.

Tämän esimerkin mukaisesti puhdistetuille peptideille suoritettiin aminohappoanalyysi, joka osoitti, että kyseessä oleva peptidi käsitti 73-74 aminohappotähdettä ja sisältää 12 kysteiini-tähdettä, kuten on esitetty taulukossa 3.

10

Mainittu puhdistettu peptidi (450 ug) liuotettiin 750 ul:aan reaktiivista puskuria (6 M guani-diini-HCl, 0,25 M Tris-HCl, 20 mM EDTA, 20 mM ditiotreitolia (DTT), pH 7,50), jonka kanssa sen annettiin olla kosketuksissa 1,5 tuntia huoneen lämpötilassa mainitun peptidin pelkistämiseksi täydellisesti, minkä jälkeen seurasi huoneenlämpötilassa yhden tunnin ajan 15 tapahtuva reaktio ylimäärän jodiasetamidia kanssa (Fluka, 16 mg). Tämä mainittu reaktio pysäytettiin lisäämällä 500 ui 1 % TFA:ta, ja seos syötettiin analyyttiseen C-18 HPLC-kolon-niin ja eluoitiin asetonitriiligradientilla (8 - 25 %/20 minuuttia, -60 %/10 minuuttia). UV-absorptiosignaalin maksimin kohdalta kerättiin käsin fraktio 1,5 ml:n eppendorf-putkiin ja kuivattiin.

20

Osa tästä karboksiamidometyloidusta peptidistä käytettiin N-terminaaliseen sekvenssianalyysiin. Mainitun karboksiamidometyloidun peptidin täydellinen proteolyyttinen katkaisu suoritettiin käyttämällä hyväksi endoproteisaasi-Lys-C:tä ja endoproteinaasi-Asp-N:ää. Näistä mainituista katkaisuista saadut peptidifragmentit eristettiin joko C-3 tai C-18 kään-25 teisfaasi HPLC-kolonnien avulla käyttäen asetonitriili/vesi/TFA-gradienttia ajoliuoksena. Kyseisen peptidin aminohapposekvenssi määritettiin samaan tapaan menetellen kuin, mitä on ' , selitetty esimerkissä 4. Kuviossa 6 on esitetty "kerastiinin" ("cerastin") täydellinen amino happosekvenssi, ja sitä on verrattu muihin PAI-faktoreihin kuviossa 12.

58

Taulukko 3. Aminohappokoostumuksia 104364

Amino- A B C D E F

happo

Lys 3 3 3 3 4 3

His 0 0 0 0 0-1 0

Arg 5 5 5 5 4 8

Asx 11 10 12 12 10 10

Thr 5 4 4 4 3 2

Ser 1 2 2 2 2 1

Glx 7 6 5-6 5-6 6 8

Pro 5 6-7 4-5 5 7 6

Gly 9 8 10 10 8 8

Ala 7 6 8 8 8 9

Cys 12 12 12 12 10 12

Vai 2 2 113 0

Met 1 0 0 0 1 0

Ile 0 1110 1

Leu 3 3 3 3 2-3 2

Tyr 111110

Phe 111112

TrP ------ 73-74 70-71 72-74 73-74 70-72 72 - = ei määritetty 5 A. = Crotalus c. cerastes D. = Crotalus d. totonatacus ‘ B. = Crotalus atrox E. = Crotalus h. horridus C. = Crotalus d. durissus F. = Bothrops cotiara 59 104364

Esimerkki 9 PAI-tekijän puhdistaminen Crotalus ruber ruber'in mvrkvstä

Yksi gramma Cptalus ruber ruber'ista saatua myrkkyä (Miamin Seipentarium Labs, Lot No. CF17SZ) liuotettiin 8 mkaan 0,5 M etikkahappoa ja tämä syötettiin hienojakoisella täytteellä 5 pakattuun Sephadex G-50 kolonniin (Pharmacia, 2,5 x 100 cm), joka oli stabiloitu, huoneen . lämpötilassa ja eluoitiin 0,5 M etikkahapolla. Virtausnopeus kolonnissa oli 25 ml/min ja 5 ml:n fraktiot kerättiin polypropyleenia oleviin putkiin. Näyte-eriä näistä mainituista fraktiois-' ta tutkittiin verihiutaleiden aggregaation inhibiittorin aktiivisuuden suhteen menetellen taval la, joka on jo aiemmin edellä kuvattu. Aktiivisiksi havaitut fraktiot (61-70) yhdistettiin ja 10 lyofilisoitiin. Kuivattu materiaali suspendoitiin uudelleen 2,0 ml:aan 0,5 % TFA:ta. Liukenematon aines poistettiin sentrifugoimalla ja syötettiin preparatiiviseen C-18 HPLC-kolonniin (Waters) aiemmin edellä selitetyllä tavalla ja eluoitiin käyttäen esimerkin 3 mukaisia olosuhteita gradienttiajossa. Fraktiot kerättiin polypropyleeniä oleviin putkiin ja väkevöi-tiin Speed-Vac -väkevöimislaitteella sekä analysoitiin verihiutaleiden aggregaation inhibiit-15 torin aktiivisuuden suhteen.

Kuviossa 22 on esitetty tämän edellä mainitun HPLC-fraktioinnin avulla saatu aktiivisuus-profiili. Yksittäiset aktiiviset fraktiot lyofilisoitiin. Fraktiot 49 ja 50 yhdistettiin ja syötettiin analyyttiseen C-18 käänteisfaasikolonniin ja eluoitiin käyttäen hyväksi esimerkissä 4 esitetty-20 jä ajo-olosuhteita, jotka käsittivät asetonitriiligradientin, joka alkoi 8 prosenttisesta asetonit-riilistä siten, että tämä mainittu osuus nostettiin 25 prosenttiin kahdenkymmenen minuutin aikana, minkä jälkeen asetonitriilin osuus nostettiin 69 prosenttiin kymmenen minuutin kuluessa, minkä seurauksena saatiin homogeeninen peptidi, jonka tämän keksinnön keksijät ovat nimenneet "ruberiiniksi'* ("ruberin"!. Karboksiamidometyloidun peptidin automaattisen Ed-s 25 man-degradaation avulla saatiin Kuviossa 6 esitetty sekvenssi.

:* Esimerkki 10 PAI-tekijän puhdistaminen Crotalus atrox’in mvrkvstä

Yksi gramma Crotalus atrox'in myrkkyä (Miami Seipentarium Labs, Lot No. CX16AZ) liuo-30 tettiin 10 ml:aan 0,5 M etikkahappoa ja syötettiin hienojakoisella täyteaineella pakattuun Sephadex G-50 kolonniin (Pharmacia, 2,5 x 110 cm), joka oli stabiloitu, ja eluoitiin huoneen lämpötilassa 0,5 M etikkahapolla. Virtausnopeus kolonnissa pidettiin 25 ml:na tunnissa ja 5 60 104364 ml:n fraktiot kerättiin polypropyleeniä oleviin putkiin. Näyte-eriä näistä mainituista fraktioista tutkittiin verihiutaleiden aggregaation inhibiittorin aktiivisuuden suhteen menetellen siten, kuin jo aiemmin edellä on selitetty. Aktiiviset fraktiot (81-100) yhdistettiin ja lyö Alisoihin.

Kuivattu materiaali liuotettiin uudelleen 2,0 ml:aan 0,5 % TFA:ta ja syötettiin preparatiivi-5 seen C-18 HPLC-kolonniin, ja kromatografinen ajo suoritettiin siten kuin jo aiemmin edellä esimerkissä 3 on selitetty. Kolonnin läpi tulleesta effluentista kerättiin fraktioita polypro-pyleenia oleviin putkiin, jotka mainitut fraktiot väkevöitiin Speed-Vac -väkevöimislaitteella ja ne tutkittiin verihiutaleiden aggregoitumisen inhibiittorin aktiivisuuden suhteen samalla tavalla menetellen kuin, mitä jo aiemmin edellä on selitetty. Aktiivisille fraktioille suoritettiin 10 uusi kromatografinen ajo analyyttistä C-18 kolonnia käyttäen, jotta olisi saatu homogeeninen peptidi (kuva 23). Tämän mainitun materiaalin aminohappoanalyysi osoitti, että kyseessä oleva peptidi käsittää 72 aminohappotähdettä ja sisältää 12 kysteiinitähdettä, kuten käy ilmi taulukosta 3. Mainitun eristetyn peptidin aminohapposekvenssi, krotatroksiini (crotatroxin). on esitetty Kuviossa 6.

15

Esimerkki 11 P AI-teki iän puhdistaminen Bothrops cotiara'n mvrkvstä

Kuusisataakahdeksankymmentä milligrammaa Bothrops cotiara'n myrkkyä (Miami Serpen-20 tarium Labs, Lot No. B05SZ) liuotettiin 10 ml:aan 0,5 M etikkahappoa ja syötettiin hienojakoisella täytemateriaalilla pakattuun Sephadex G-50 kolonniin (Pharmacia, 2,5 x 110 cm ), ; joka oli stabiloituja eluoitiin 0,5 M etikkahapon avulla. Virtausnopeus kolonnissa ajon aika- na oli 25 ml/tunti, ja kerätyt 5 ml:n fraktiot otettiin talteen polypropyleeniä oleviin putkiin. Näyte-eriä näistä mainituista fraktioista tutkittiin verihiutaleiden aggregaation inhibiittorien 25 aktiivisuuden suhteen samalla tavalla menetellen kuin, mitä jo aiemmin edellä on selitetty. *

Aktiiviset fraktiot (71-90) yhdistettiin ja lyofilisoitiin. Kuivattuna mainittu materiaali suspen-doitiin uudelleen 2,0 ml:aan 0,5 % TFA:ta ja syötettiin Watersin preparatiiviseen C-18 käänteisfaasikolonniin. Kolonnin eluointi tapahtui käyttäen hyväksi edellä esimerkissä 3 esitettyjä olosuhteita. Fraktiot kerättiin polypropyleenistä valmistettuihin putkiin, väkevöitiin 30 Speed-Vac -väkevöimislaitteen avulla ja niistä tutkittiin verihiutaleiden aggregaation inhibiittorin aktiivisuus. Aktiiviset fraktiot lyofilisoitiin erikseen. Useille signaalin antaneille frak-. 1 tioille suoritettiin uusi kromatografinen ajo analyyttistä C-18 kolonnia käyttäen siten, kuin 61 104364 aiemmin esimerkin 4 mukaisesti toimittaessa on selitetty. Näin saatu analyyttinen HPLC-profiili homogeeniselle peptidille on esitetty Kuviossa 24. Tämän mainitun materiaalin ami-nohappoanalyysi osoitti kyseisen peptidin sisältävän 72 aminohappoa, joihin kuului myös 12 kysteiinitähdettä, kuten on esitetty taulukossa 3. Tämän edellä esitetyn peptidin täydellinen 5 aminohapposekvenssi, jota tämän keksinnön keksijät kustuvat "kotiariiniksi'' ("cotiarin"L on . esitetty Kuviossa 6 ja Kuviossa 12.

’ Kyseistä puhdistettua peptidiä tutkittiin aiemmin edellä esimerkissä 1 esitettyjen reseptori- määritysten mukaisesti. Alustavat määritykset osoittivat, että alhaisina pitoisuuksina (1-4 io nM) kotiariini inhiboi selektiivisesti vironestiinin sitoutumista vitronestiinireseptoriin, kun taas vastaavilla pitoisuuksilla oli huomattavasti pienempi inhiboiva vaikutus fibrinogeenin sitoutumiseen GP nb-IIIa:n kanssa, kuten käy ilmi kuvasta 25. Myöhemmät kokeet eivät kuitenkaan vahvistaneet tätä mainittua tulosta.

15 Esimerkki 12 PAI-tekijän puhdistaminen Crotalus viridis lutosus'in myrkystä A. Yksi gramma Crotalus viridis lutosus'in myrkkyä (Miami Serpentarium Labs, Lot No. CL18SZ) liuotettiin 8 ml:aan 0,5 M etikkahappoa, ja tämä syötettiin hienojaoisella täyteaineella pakattuun Sephadex G-50 kolonniin (Pharmacia, 2,5 x 110 cm), joka oli stabiloitu, ja 20 eluoitiin 0,5 M etikkahapolla. Virtausnopeus kolonnissa ajon aikana oli 25 ml/tunti ja 5 ml:n fraktiot kerättiin polypropyleenistä valmistettuihin putkiin. Näyte-eriä näistä mainituista fraktioista tutkittiin verihiutaleiden aggregaation inhibiittorien aktiivisuuden suhteen. Fraktiot (71-100) yhdistettiin ja lyofilisoitiin. Mainittu materiaali suspendoitiin uudelleen kuivana 2,0 ml:aan 0,5 % TFA:ta. Liukenematon materiaali erotettiin sentrifugoimalla ja syötettiin prepa-? 25 ratiiviseen Watersin C-18 käänteisfaasikolonniin ja eluoitiin käyttäen gradienttiajossa sellai sia olosuhteita, jotka on jo aiemmin esitetty esimerkin 3 yhteydessä. Kolonnin effluentista ' .· kerätyt fraktiot otettiin talteen polypropyleenistä valmistettuihin putkiin, väkevöitiin Speed-

Vac -väkevöimislaitteella ja tutkittiin verihiutaleiden aggregaation inhibiittorien aktiivisuuden suhteen. Aktiiviset fraktiot lysofilisoitiin ja niille suoritettiin uusi kromatografinen ajo 30 Watersin analyyttisessä C-18 kolonnissa käyttämällä hyväksi vastaavaa asetonitriiligradient-tia kuin, mitä esimerkin 4 yhteydessä on esitetty. Fraktiot kerättiin käsin 1,5 ml:n Eppendorf-, putkiin. Homogeeniset fraktiot yhdistettiin ja lyofilisoitiin. Analyyttinen HPLC-analyysi tästä 62 104364 mainitusta materiaalista antoi yhden symmetrisen signaalin. Tämän kyseessä olevan peptidin täydellinen aminohapposekvenssi, jota tämän keksinnön keksijät ovat nimittäneet "lutosiiniksi" ("lutosin"), on esitetty Kuviossa 6 ja Kuviossa 12.

5 B. Menetellen samalla tavalla kuin, mitä A.-kohdan osalta on selitetty, eristettiin ja puhdistettiin P AI-faktorit Bx jararacussu'n. £L basilicus'in. durissus durissus'in. Y* oreganus'in. Q, 11 horridus'in. £L γ* helleri'n. £x durissus totonactus'in ja £χ HL molossus’in myrkyistä. Taulukossa 3 on esitetty aminohappokompositiot useille näistä mainituista peptideistä. £L L horridus'ista. £L. basilicus’ista. (1 m* molossus'ista. Υχ oreganus'ista ja £L ± durissus'ista 10 peräisin olevien PAI-faktorien aminohapposekvenssit, jotka on nimetty vastaavasti horridii-niksi, basilisiiniksi, molossiiniksi, oreganiiniksi ja durissiiniksi, on esitetty Kuviossa 6. Näille mainituille esimerkeissä 1-12 esitetyille puhdistetuille peptideille on esitetty reseptoriin sitoutumista kuvaavia tuloksia Kuviossa 26.

15 Tässä jäjempänä esimerkeissä 13-16 syntetisoitiin peptidejä kiinteänfaasin tekniikoilla käyttämällä Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer -peptidisyntetisaattoria käyttäen hyväksi t-Boc-aminohappoja aktivoituina HOBt:n aktiivisiksi estereiksi laitevalmistajan toimittamien ohjeiden mukaisesti, jotka ovat lyhyesti pääpiirteissään seuraavanlaiset, kun kyseessä on Boc-AAl.......AA(n- l)-AA(n)-0-PAM-polystyreenihartsin valimstus.

20

Puoli millimoolia valittua Boc-AA(n)-0-PAM-polystyreenihartsia käsitellään seuraavalla : tavalla menetellen mainitun Boc-AA(n-l)-OH:n lisäämiseksi: 1) TFA:lla suojauksen poisto: 30 % TFA DCM:ssä, 3 minuuttia, 50 % TFA DCM:ssä, 16 minuuttia, 25 2) pesut ja neutraloinnit: DCM-pesut (5X), 3 minuuttia, 5 % DIEA DCM:ssä, 2 minuut tia, 5 % DIEA NMP:ssä, 2 minuuttia, NMP-pesut (6X), 5 minuuttia, 3) kytkentä: 4 ekvivalenttia Boc-AA-HOBt-esteri NMP.ssä (esiaktivointi 55 minuuttia), * 38 minuuttia, DMSO:a, jotta saataisiin 15 %DMSO/85 % NMP, 16 minuuttia, 3,8 ekvivalenttia DIEA, 5 minuuttia, 30 4) pesu ja hartsinäyte: NMP-pesu, 3 minuuttia, 5) päättäminen: 10 % etikkahapon anhydridiä, 5 % DIEA NMP:ssä, 8 minuuttia, 6) pesut: DCM-pesut (6X) 4 minuuttia.

63 104364

Esimerkki 13

Analogin No. 1. fE^L^(^]barburiini(28-73kn valmistaminen: E-C-A-D-G-L-C-C-D-0-C-R-F-L-K-K-G-T-V-C-R-V-A-K-G-D-W-N-D-D-T-C-T-G-Q-S-5 C-D-C-P-R-N-G-L-Y-G

„ Puoli moolia PAM-Gly-hartsia (0,6 mekv/g, Applied Biosystems, Foster City, CA) käsiteltiin tässä edellä esitetyn A.-kohdan menetelmän mukaisesti tarvittavilla aminohapoilla, jotka li-" sättiin jäijestyksessä. Boc-suojatuilla aminohapoilla oli seuraavanlaiset sivuketjujen suojauk set: Arg(Tos), Asp(OcHex), Cys(4-MeBzl), Glu(OcHex), Lys(Cl-Z), Thr(OBzl), Trp(CHO) 10 ja Tyr(Br-Z). Sen jälkeen, kun koko suojattu peptidihartsiketju oli saatu valmiiksi, mainittu aminoterminaalinen Boc-ryhmä poistettiin TFA:n avulla ja mainittu hartsi kuivattiin TFA-suolan muodossa. Edellä mainittu hartsi (1,3 g) käsiteltiin aiemmin edellä mainitulla erityisellä menetelmällä ("low-high" HF) suojausten poistamiseksi, mitä seurasi HF:n poisto in vacuo. Kuivattu peptidi-hartsiseos siirrettiin sintterillä (karkea) varustettuun suppiloon etyyli-15 eetterin avulla ja sitä pestiin useita kertoja vuorotellen eetterillä ja kloroformilla, jotta olisi saatu poistetuksi useimmat orgaaniset suojaavat ryhmät ja niiden poistoon käytetyt reagens-sit.

Edellä mainittu peptidiseos siirrettiin kahden litran määrään 0,4-prosenttista etikkahapon liu-20 ostaja pH säädettiin arvoon 7,99 väkevän NH4OH:n avulla. Edellä mainittu hartsi suodatettiin tästä mainitusta liuoksesta ja itse liuoksen annettiin seisoa olla 4 °C lämpötilassa sekoit-: ; tamatta 20 tunnin ajan. Tätä seurasi mainitun liuoksen lämmittäminen huoneen lämpötilaan ja seisotus kolmen päivän ajan jälleen ilman sekoitusta. Saostunut materiaali poistettiin suodattamalla ja supematantin pH säädettiin arvoon 3,0 etikkahapon avulla ja lyofilisoitiin.

25

Saatu materiaali liuotettiin puhdistamattomana 8,0 ml:aan 0,5 M etikkahappoa ja syötettiin ' ; ‘ hienojakoisella täytemateriaalilla pakattuun Sephadex G-50 kolonniin (2,5 x 100 cm), joka oli stabiloitu 0,5 M etikkahapon avulla. Kolonnista laskettiin läpi eluenttia virtausnopeudella 20 ml/tunti ja kerätyt fraktiot (4 ml) otettiin talteen polypropyleenistä valmistettuihin putkiin. 30 Näyte-eriä mainitulta fraktioista kuivattiin, suspendoitiin uudelleen veteen ja niistä tutkittiin verihiutaleiden aggregaation inhibiitorien aktiivisuus menetellen siten, kuin jo aiemmin • edellä on selitetty. Aktiiviset fraktiot (71 -90) yhdistettiin ja lyofilisoitiin.

«4 104364

Kuivattu materiaali (66 mg) liuotettiin uudelleen 2,0 ml:aan 0,1 M etikkahappoa ja syötettiin Watersin valmistamaan preparatiiviseen C-18 kolonniin, joka oli stabiloitu 8 % asetonitriilin liuoksella, joka sisälsi 0,1 % TFA:ta. Kromatografiseen ajoon käytettiin liuotingradienttia, 5 joka alussa käsitti asetonitriilin 8-prosenttisen liuoksen, joka mainittu pitoisuus nostettiin 10 minuutin aikana 20 %:iin, mitä seurasi hidas gradientti 30 %:iin asetonitriiliä 40 minuutin aikana. Kolonnin eluoinnissa käytettiin virtausnopeutena 18 ml/minuutti ja kerätyt fraktiot (12 sekuntia) otettiin talteen polypropyleenistä valmistettuihin putkiin. Edellä mainitut frak-tiotväkevöitiin Speed-Vac -väkevöimislaittetta hyväksi käyttäen 1,0 ml:n tilavuuteen ja 10 ui 10 näyte-eriä käytettiin aiemmin edellä kuvatulla tavalla verihiutaleiden aggregaation perustuvassa määrityksessä.

Aktiiviset fraktiot (29-32) lyofilisoitiin yksittäin erikseen ja analysoitiin analyyttisen C-18 HPLC-kolonnin avulla käyttäen 8-30 %:n asetonitriiligradienttia. Fraktiot 29 ja 30 yhdistet-15 tiin ja syötettiin mainittuun analyyttiseen kolonniin 1,0 ml:ssa 0,5 % TFA-liuosta. Voimakkainta signaalia vastaava fraktio kerättiin manuaalisesti talteen ja lyofilisoitiin, jolloin saatiin 1,6 mg puhdistettua peptidiä.

Tämän mainitun materiaalin aminohappoanalyysi vahvisti kyseisen peptidin identifioinnin. 20 Tämän mainitun materiaalin kyky inhiboida fibrinogeenin sitoutumista GP IIb-IIIa:n kanssa ja vitronestiinin sitoutumista VnR:n kanssa on esitetty Kuviossa 26 ja Kuviossa 27. Nämä . mainitut tulokset osoittavat, että tämän kyseisen analogiyhdisteen affiniteetti GP nb-IIIa:n kanssa on suuri ja että sen affiniteetti VriR:n kanssa on aina pitoisuustasolle 1 nM saakka verrattain olematon.

25

Esimerkki 14 : Analogin No. 2. [K2£]eristikofiinin(4-511 valmistaminen: • « E-E-P-C-A-T-G-P-C-C-R-R-C-K-F-K-R-A-G-K-V-C-R-V-A-K-G-D-W-N-N-D-Y-C-T-G-

K-S-C-D-C-P-R-N-P-W-N-G

30 Puoli millimoolia PAM-Gly-hartsia (0,6 mekv/g, Applied Biosystems, Foster City, CA) käsiteltiin edellä esitetyn menetelmän A mukaisesti tarvittavilla aminohapoilla (asianomaisessa järjestyksessä). Kyseiset Boc-suojatut aminohapot sisälsivät seuravanlaisia sivuketjujen suo- 65 104364 jaukseen käytettyjä ryhmiä: Arg(Tos), Asp(OcHex), Cys(4-MeBzl), Glu(O-cHex), Lys(Cl-Z), Ser(OBzl), Thr(OBzl), Trp(CHO) ja Tyr(Br-Z). Tämän esimerkin mukaisen peptidin katkaisut, uudelleen järjestäytyminen ja puhdistus olivat identtisiä edellisten esimerkkien mukaisten peptidien kanssa. Reseptorin sitoutumiseen liittyvät tulokset tälle mainitulle analogiyhdisteel-5 le on esitetty kuvissa 26 ja 28.

*

Esimerkki 15

Analogin No. 3 valmistaminen: G-C-G-K-G-D-W-P-C-A_-NH2 10 Puoli millimoolia pMBHA-hartsia (0,72 mekv/g, Applied Biosystems, Foster City, CA) käsiteltiin edellä esitetyn menetelmän A mukaisesti tässä esimerkissä tarvittavilla aminohapoilla (asianomaisessa järjestyksessä). Mainitut Boc-suojatut aminohapot sisälsivät seuraavat sivu-ketjujen suojaukseen käytetyt ryhmät: Asp(O-cHex), Cys(4-MeBzl) ja Lys(Cl-Z). Suojatun peptidihartsin tultua valmiiksi poistettiin aminoterminaalinen Boc-ryhmä TFA:n avulla ja 15 mainittu hartsi kuivattiin TFA-suolansa muodossa. Tämä mainittu hartsi (1,54 g) käsiteltiin vedettömällä vetyfluoridilla (HF), joka sisälsi 10 % anisolia, sekä 2 % etyylimetyylisulfidia 30 minuutin ajan -10 asteen (°C) lämpötilassa, ja vielä lisäksi 30 minuutin ajan lämpötilassa 0 °C. Käytetty HF poistettiin in vacuo ja mainittu peptidi/hartsiseos suspendoitiin dietyylieette-riin, mitä seurasivat vuorottaiset pesut kloroformilla ja eetterillä kolmeen kertaan. Viimeisen 20 eetterillä suoritetun pesun jälkeen mainittu peptidi uutettiin hartsista 2,0 M etikkahapon avulla, laimennettiin tislatulla vedellä ja lyofiIisoihin.

«

Raakaa peptidiä (370 mg) liuotettiin 10 mM NH4OAc:n liuokseen, josta oli poistettu siihen liuennut happi ja jonka pH oli 8, 0,5 mg/ml ja sen annettiin hapettua pisaroittain lisätyn pie-25 nen ylimäärän 0,01 M kaliumferrisyanidiliuosta (K3Fe(CN)6) avulla, minkä jälkeen sekoitusta jatkettiin vielä 20 minuutin ajan, ja pH säädettiin arvoon 5 etikkahapon avulla. Tätä edellä saatua peptidin liuosta käsiteltiin DOWEX AG3x4 anioninvaihtohartsilla 15 minuutin ajan samalla sekoittaen, minkä jälkeen hartsi suodatettiin, liuos laimennettiin vedellä ja lyofili-soitiin siten, että saatiin rakaa syklisoitua peptidiä. Mainittu raaka peptidi (392 mg) puhdis-30 lettiin poistamalla siitä suolat Sephadex G-25F:n avulla käyttämällä 0,5 M etikkahappoa elu-enttina, mitä seurasi ioninvaihtokromatografinen ajo CM-sefaroosi:n (Pharmacia) avulla ' käyttäen sellaista eluenttigradienttia, joka saatiin aikaan lisäämällä 100 mM NH4OAc:ia 10 104364 66 mM NH4OAc:iin pH:n ollessa 4,5. Sellaiset edellä kuvatulla tavalla menetellen saadut fraktiot joiden puhtausaste oli HPLC-analyysin perusteella vähintään 90 %, yhdistettiin ja lyofili-soitiin vedestä useita kertoja, jolloin saatiin tuotetta 175 mg. Lopullinen puhdistusvaihe käsitti preparatiivisen HPLC-puhdistuksen Watersin valmistaman C-18 käänteisfaasikolonnin 5 avulla siten, että eluenttisysteemi käsitti asetonitriili/vesi/TFA-gradientin, jolloin tuotteeksi saatiin puhdasta peptidiä. Sitoutumisesta reseptorien kanssa saadut tulokset tämän esimerkin mukaiselle analogille on esitetty kuvissa 26,29 ja 30.

Esimerkki 16 10 Muiden haluttujen analogien valmistaminen

Seuraavassa esitetyt analogit syntetisoitiin. Useimmissa tapauksissa samalla tavalla menetellen kuin, mitä on selitetty edellä esimerkin 15 tapauksessa. Analogi 60, joka on esitetty jäljempänä, valmistettiin kuitenkin liuoksessa guanidoimalla analogin No. 19 lysiinitähteen sivuketju siten, että käytettiin hyväksi Bajuszin esittämää menetelmää (katso Bajusz, S., et 15 ah. FEBS Letts Π9801 110: 85-87.

Yhden milligramman analogia No. 19 annettiin reagoida 1 mg:n kanssa l-amidino-3,5-dimetyylipyratsolinitraattia (Aldrich) 1 mhssa absoluuttista etanolia di-isopropyylietyyliamiinin (DIEA) läsnäollessa huoneen lämpötilassa 4 päivän ajan. Tuotteeksi 20 saatu analogi 60 puhdistettiin reagenssiylimäärästä ja lähtöaineista käänteisfaasi-HPLC:n avulla käyttäen C-18 kolonnia ja liuotingradienttia, joka saatiin aikaan asetonitriilin, joka : sisälsi 0,1 % TFA:ta, avulla. Yhdeksänsataa ug tätä mainittua materiaalia eristettiin puhdiste tussa muodossa.

25

No. 4 G-C-K-G-D-W-P-C-A-NH2

No. 5 C-G-K-G-D-W-P-C-NH2 « 30 No. 7 G-C-K-G-D-W-C-A-NH2

No. 8 Asetyyli-C-K-G-D-C-NH2

No. 9 Mpr-K-G-D-Pen-NH2 35 i : No. 10 C-K-G-D-W-P-C-NH2 67 104364

No. 11 Asetyyli-C-R-G-D-Pen-NH2

No. 12 C-K-G-D-Y-P-C-NH2 5 No. 13 C-K-G-D-F-P-C-NH2

No. 19 Mpr-K-G-D-W-P-C-NH2

No. 34 C-K-G-D-W-G-C-NH2 10

No. 35 C-K-G-E-W-P-C-NH2

No. 36 C-Om-G-D-W-P-C-NH2 15 No. 37 C-K-A-D-W-P-C-NH2

No. 38 C-K-A'-D-W-P-C-NH2

No. 39 C-K-G-D-W-(Sar)-C-NH2 20

No. 40 C-K(Formyyli)-G-D-W-P-C-NH2

No. 41 C-K-G-D-I-P-C-NH2 25 No. 42 C-K-G-D-(4-Cl-Phe)-P-NH2

No. 43 C-K-(Sar)-D-W-P-C-NH2

No. 44 C-K-G-D-(4-N02-Phe)-P-C-NH2 30

No. 45 C-K-G-D-(NMePhe)-P-C-NH2

No. 46 C-H-G-D-W-P-C-NH2 35 No. 47 Asetyyli-C-K-G-D-W-P-C-NH2

No. 48 Mpr-K-G-D-W(Formyyli)-P-C-NH2

No. 49 Mvl-K-G-D-W-P-C-NH2 ' V 40 ; No. 50 Mpr-K-G-D-W-P-Pen-NH2

No. 51 Mpr-K-G-D-W-P-Pen-NH2 45 No. 52 Mpr-K-G-D-W-P-Pen-NH2 , , No. 53 Mpr-K-G-D-W-P'-Pen-NH2 , 68 104364

No. 54 Mpr-K-G-D-W-P-Pen-NH2

No. 55 Mpr-K-G-D-W-(Thz)-C-NH2 5 No. 56 Mpr-K-G-D-H(2,4-DNP)-P-C-NH2

No. 57 Mpr-K-G-D-(2-Nal)-P-Pen-NH2

No. 58 Mvl-K-G-D-W-P-Pen-NH2 10

No. 59 Mpr-K-G-D-W-(Pip)-Pen-NH2

No. 60 Mpr-(Har)-G-D-W-P-C-NH2 15 No. 61 Mpr-K-G-D-W-P-C-NH2

No. 62 Mpr-(D-Lys)-G-D-W-P-Pen-NH2

No. 63 Mpr-(Har)-G-D-W-P-Pen-NH2 20

No. 64 Mpr-(Asetimidyyli-Lys)-G-D-W-P-C-NH2

No. 65 Mpr-(Asetimidyyli-Lys)-G-D-W-P-Pen-NH2 25 No. 66 Mpr-(NG,NG'-etyleeni-Har)-G-D-W-P-C-NH2

No. 67 ΜρΓ-(Ν°,Ν° -etyleeni-Har)-G-D-W-P-Pen-NH2

No. 68 Mpr-Har-Sar-D-W-P-C-NH2 30

No. 69 Mpr-(Asetimidyyli-Lys)-G-D-W-P-Pen-NH2

No. 70 Mpr-(Fenyyli-imidyyli-Lys)-G-D-W-P-C-NH2 35 No. 71 Mpr-Har-Sar-D-W-P-PenNH2

No. 72 Mpr-(Fenyyli-imidyyli-Lys)-G-D-W-P-PenNH2

No. 73 Mpr-Har-G-D-W-(3,4-dehydro-Pro)-C-NH2 4o 9

Esimerkki 17 PAI-aktiivisuus peptideissä

Kun analogeja No:t 3-5 tutkittiin aiemmin edellä aggregaation inhibiittoriaktiivisuudelle esi-45 tettyjen standardimääritysmenetelmien mukaisesti, näillä mainituilla analogeilla oli IC50-arvoinaan 5 uM ADP-indusoidun humaanin verihiutaleiden aggregaation inhibiition aktiivi- 104364 69 suuden suhteen. Analogilla No.6 oli kuitenkin IC50-arvo, joka oli yli 200 uM ja analogilla No.

7 tämä arvo oli vastaavasti 100 uM. Tämän keksinnön mukaisilla analogeilla on tämän esimerkin määrityksen perusteella seuraavanlaiset IC50-arvot: analogi N& sekvenssi likimääräinen IC™ 5 (uM)

No. 3 G-C-G-K-G-D-W-P-C-A-NH2 5

No. 4 G-C-K-G-D-W-P-C-A-NH2 5 10 No. 5 C-G-K-G-D-W-P-C-NH2 5

No. 6 G-C-G-K-G-D-W-C-A-NH2 >200

No. 7 G-C-K-G-D-W-C-A-NH2 100 15

No. 8 Asetyyli-C-K-G-D-C-NH2 200

No. 9 Mpr-K-G-D-Pen-NH2 25 20 No. 10 C-K-G-D-W-P-C-NH2 5

No. 11 Asetyyli-C-R-G-D-Pen-NH2 5

No. 12 C-K-G-D-Y-P-C-NH2 12 25

No. 13 C-K-G-D-F-P-C-NH2 20

No. 19 Mpr-K-G-D-W-P-C-NH2 1 30 No. 34 C-K-G-D-W-G-C-NH2 100

No. 35 C-K-G-E-W-P-C-NH2 >300

No. 36 C-Om-G-D-W-P-C-NH2 150-200 35

No. 37 C-K-A-D-W-P-C-NH2 100 »

No. 38 C-K-A!-D-W-P-C-NH2 >200 40 No. 39 C-K-G-D-W-(Sar)-C-NH2 5

No. 40 C-K(Formyyli)-G-D-W-P-C-NH2 >200

No. 41 C-K-G-D-I-P-C-NH2 100

No. 42 C-K-G-D-(4-Cl-Phe)-P-NH2 20 45 70 104364

No. 43 C-K-(Sar)-D-W-P-C-NH2 50

No. 44 C-K-G-D-(4-N02-Phe)-P-C-NH2 75 5

No. 45 C-K-G-D-(NMePhe)-P-C-NH2 >200

No. 46 C-H-G-D-W-P-C-NH2 200 10 No. 47 Asetyyli-C-K-G-D-W-P-C-NH2 2,5

No. 48 Mpr-K-G-D-W(Formyyli)-P-C-NH2 1

No. 49 Mvl-K-G-D-W-P-C-NH2 1,5 15

No. 50 Mpr-K-G-D-Wl-P-Pen-NH2 >200

No. 51 Mpr-K-G-D-W-P-Pen-NH2 0,75 20 No. 52 Mpr-K-G-D-W-P-Pen'-NH2 5

No. 53 Mpr-K-G-D-W-P-Pen-NH2 >200

No. 54 Mpr-K-G-D-W-P-Pen-NH2 >100 25

No. 55 Mpr-K-G-D-W-(Thz)-C-NH2 2

No. 56 Mpr-K-G-D-H(2,4-DNP)-P-C-NH2 5 30 No. 57 Mpr-K-G-D-(2-Nal)-P-Pen-NH2 1

No. 58 Mvl-K-G-D-W-P-Pen-NH2 1

No. 59 Mpr-K-G-D-W-(Pip)-Pen-NH2 1 35

No. 60 Mpr-(Har)-G-D-W-P-C-NH2 0,15 »

No. 61 Mpr-K-G-D-W-P-C-NH2 15 40 No. 62 Mpr-(K*)-G-D-W-P-Pen-NH2 2,5

No. 63 Mpr-(Har)-G-D-W-P-Pen-NH2 0,10

No. 64 Mpr-(Asetimidyyli-Lys)- 45 G-D-W-P-C-NH2 0,25

No. 68 Mpr-Har-Sar-D-W-P-C-NH2 3,0 7i 104364

No. 69 Mpr-(Asetimidyyli-Lys)- G-D-W-P-Pen-NH2 0,5

No. 70 Mpr-(Fenyyli-imidyyli-Lys)- 5 G-D-W-P-C-NH2 0,5

No. 71 Mpr-Har-Sar-D-W-P-PenNH2 2,5 • No. 72 Mpr-(Fenyyli-imidyyli-Lys)- 10 G-D-W-P-PenNH2 0,5

Esimerkki 18

Lineaaristen ia syklisten peptidien aktiivisuuden vertailu

Tutkittaessa fibrinogeenin GP IIb-IIIa:han tapahtuvan sitoutumisen inhibitiota aiemmin 15 edellä kuvatun levymäärityksen avulla, lineaarinen RGDW-NH2 oli aktiivisuudeltaan hyvin samankaltainen sylkliseen GCGRGDWPCA-NH2:een verrattuna (kuva 29). Lineaarisen KGDW-NH2 oli taas edellä esitetystä poiketen huomattavan paljon vähemmän potentti kuin syklinen GCGKGDWPCA-NH2 (kuva 29). KGDW-yhdisteiden kohdalla, muttei kuitenkaan RGDW-yhdisteiden kohdalla, syklisointi sai aikaan huomattavan kasvun peptidin kyvyssä 20 inhiboida fibrinogeenin sitoutumista GP IIb-IIIa:n kanssa.

Esimerkki 19

Verihiutaleiden sitoutumismääritvksissä synteettisille peptideille saatuja tuloksia Esimerkin 17 mukaisesti menetellen syntetisoituja peptidejä, sen lisäksi, että tutkittiin niiden 25 kykyä inhiboida verihiutaleiden aggregaatiota suoraan, tutkittiin tämän keksinnön mukaisten aiemmin edellä esitettyjen levymääritysten avulla. Näin saadut tulokset analogeille No:t 4-8 on esitetty Kuviossa 30. Kuten tässä mainitussa Kuviossa on esitetty, nämä edellä mainitt analogit ovat vaihtelevasti kykeneviä inhiboimaan eri määrin fibrinogeenin sitoutumista GP IIb-nia:n kanssa verrattuna vitronestiinin sitoutumiseen vitronestiinireseptoriin. Analogi No.

30 4 on mitä ilmeisimmin tähän mainittuun ryhmään kuuluvista analogeista se, jonka kohdalla * kyseeseen tulevat suurimmat vaihtelut. Analogi No. 7 ja analogi No. 5 ovat toisaalta myös hyvin spesifisiä, ja niillä on erinomainen verihiutaleiden aggregaation inhibiittoriaktiivisuus.

72 104364

Esimerkki 20

Puhdistettujen peptidien vaikutuksia solujen adheesioon M21-melanoomasoluja leimattiin 35S-metioiniinillä, ja tämän jälkeen ne lisättiin vitronestii-nillä päälystetyille levyille siten, että läsnä oli osoitettu konsentraatio puhdistettuja käärmei-5 den myrkkyjen peptidejä. Solujen kiinnittyminen mitattiin saattamalla inkuboinnin jälkeen kiinnittymättä jääneet solut liuokseen ja pesemällä ne pois siten, kuin aiemmin edellä on esitetty kohdassa C sivulla 67. Kuten Kuviossa 31 on esitetty, ei sen enempää barburiini kuin peptidi 1 :kään (katkaistu barburiini) omannut merkittävää vaikutusta solujen adheesioon vit-ronestiiniin, vaikka molemmat mainitut aineet ovat potentteja verihiutaleiden aggregaation 10 inhibiittoreita, kuten on esitetty esimerkeissä 2 ja 3. Toisaalta, puolestaan kotiariini, joka on potentti inhibiittori vitronestiinin sitoutumiselle vitronestiinireseptoriin, oli erittäin potentti inhibiittori solujen kiinnittymiselle vitronestiiniin. Vastaavanlaisessa kokeessa petidi No.3, sellainen peptidi No.3, jossa K oli korvattu R:llä (GCGRGDWPCA-NH2) ja RGDS testattiin M21-solujen kiinnittymisen vitronestiiniin suhteen. Kuten käy ilmi kuvasta 32, RGDS ja 15 GCGRGDWPCA-NH2 ovat voimakkaita inhibiittoreita solujen kiinnittymiselle, kun taas GCGKGDWPCA-NH2 ei ollut efektiivinen vielä edes vielä pitoisuustasolla 60 μΜ.

Esimerkki 21

Analogien 60 ia 19 vertailu 20 Analogit 60 ja 19, jotka on esitetty jo aiemmin edellä, ovat tämän keksinnön mukaisia peptidejä, jotka sisältävät sekvenssin K1GDX ja ne ovat identtisiä lukuunottamatta K1-tähdettä. ·. Analogi 60 on seuraavan kaavan mukainen:

Mpr-(Har)-G-D-W-P-C-NH2, ja analogi 19 on seuraavan kaavan mukainen: 25 Mpr-K-G-D-W-P-C-NH2.

Nämä mainitut analogit tutkittiin verihiutaleiden aggregaation inhibition standardikokeiden avulla sekä käyttäen hyväksi edellä esimerkissä 20 esitettyä solujen adheesioon perustuvaa määritystä. Näiden kokeiden tulokset on esitetty kuvissa 33 ja 34. Kuten kuvasta 33 käy ilmi, 30 analogi No. 60 on tehokas häviävän pieninäkin pitoisuuksina käytettynä verihiutaleiden aggregaation inhibitiossa, ja se on suhteellisesti vähemmän tehokas estämään solujen adheesiota * vitronestiinin kanssa. Kuvasta 34 käy ilmi, että analogi No. 19:llä on hyvä verihiutaleiden 73 104364 aggregaation inhibiittoriaktiivisuus samoin kuin hyvä spesifisyys. Kuitenkin tämä viimeksi mainittu analogi on vähemmän aktiivinen verihiutaleiden aggregaation inhibitiomäärityksissä kuin tässä esimerkissä sen vertailukohtana oleva analogi No. 60. Analogilla No. 60 on verihiutaleiden aggregaation suhteen IC5o-arvo, joka on noin 0,15 nM. Vastaavasti analogi nume-5 ro 19:llä on IC50-arvo noin lnM.

Esimerkki 22

Folt’in malli koiran sepelvaltimon tromboosille A. Syklisten virtausten vähenemisen (CFR:t) initiaatio avorintakehäisellä koiralla. 20-10 kiloisen koiran vasempaan anteriooriseen laskevaan (LAD) sepelvaltimoon sijoitettiin tukos siten, kuin aiemmin edellä on selitetty. Jaksottainen ja keskimääräinen veren virtaama mitattiin elektromagneettisen (EM) virtausanturin avulla sekä Dopplerin virtausanturin avulla, mikä on esitetty Kuviossa 35.

15 B. Syklisen GCGKGDWPCA-ΝΗ,.η (analogi No.3t vaikutus CFR.iin avorintakehäisellä koiralla. 10 mg:n annos tätä mainittua peptidiä infusoitiin mainitun koiran ääreisverenkierron laskimoon. Kuviossa 36 on esitetty verenvirtausmallit edellä mainitussa LAD:ssa. erityisesti on huomattava CFR:ien osittainen ablaatio, joka voidaan havaita virtauksen pienentymisten vähentyneestä jyrkkyydestä. Lisäksi on huomattava, että virtaus ei vähene yhtä suuressa 20 määrin kuin kontrollikokeessa (A). 1

Ci Toinen 40 mg:n infuusio analogia No.3 annettiin periferaaliseen laskimoon. Kuten kuvasta 37 käy ilmi, CFR:ien täydellinen ablaatio indikoi, että LAD:ssä on virtaama palautunut alkuperäiseen arvoonsa.

25

Esimerkki 23 ' ·: Barburiinipeptidien ekspressiovektorien konstruoiminen

Geeni, joka koodaa koko [L41]barburiinipeptidin(l-73), koottiin synteettisistä oligonukleoti-deistä siten, kuin Kuviossa 38 on esitetty, jotka mainitut oligonukleotidit käsiteltiin kinaasil-30 la, kytkettiin toisiinsa ja liitettiin EcoRI-Hindlll-käsiteltyyn M13mpl8:sta käyttäen hyväksi standardimenetelmiä. Bakteriaalisen alkalisen fosfataasin geenin (phoA) signaalisekvenssi (Watson, M.E.E., Nucleic Acids Research (1983) 12: 5145) lisättiin barburiinikonstruktioon 74 104364 liittämällä synteettisiä oligonukleotidejä mainittuihin EcoRJ/NcoI-kohtiin mainittua [L41]barburiini(l-73)-konstruktiota siten, kuin Kuviossa 39 on esitetty. Mainitut nukleotidi-sekvenssit kaikissa konstruktioissa varmistettiin käyttämällä Sangerin dideoksiketjun termi-nointi menetelmää.

5

Katkaistu muoto tästä edellä mainitusta peptidistä konstruoitiin samoin lähtien synteettisistä oligonukleotideistä, jotka kykenivät koodaamaan vain aminohapot 28-73 koko peptidiketjun sijaan. Valmistettiin myös kaksi muunnosta, Q E :aan ja A C .ään, käyttämällä paikkas-pesifistä mutageneesiä, jonka ovat kuvannut Kunkel et ai. (katso Kunkel, et ai., Meth. Enzv-10 mol. (1987) IM: 367). Mainittu phoA-signaalisekvenssi lisättiin edellä mainittuun katkaistuun versioon siten, kuin edellä on kuvattu (kuva 40). Lisäksi, lisättiin signaalisekvenssi K colin lämpöstabiilia anterotoksiini H:ta (katso Picken, R.W., et ai., Infect. Immunol. (1983) 42: 269) varten mainittuun katkaistuun versioon käyttämällä hyväksi synteettisiä oligonukleotidejä yhdessä EcoRLn ja Ncolrn yhteensopivien päiden kanssa. Kaikki bakteriaaliset 15 sekretiokonstruktiotsubkloonattiinbakteriaaliseenekspressiovektoriinpPROK-1 (Brosius, J., Gene (1984) 22l 151, mainittu viite: 161), joka on kaupallisesti saatavilla (valmistaja CLON-TECH Lab, Inc.), käyttämällä hyväksi EcoRLn ja HindllLn restriktioendonukleaaseja.

Valmistettiin sellainen geeni, joka koodaa tämän esimerkin mukaisen halutun peptidin peräk-20 käisiä toistoja (tandem repeats), käyttämällä polymeraasiketjureaktiota (PCR) tuottamaan multimerointiyksikkö täyspitkästä barburiinipeptidistä 1-73, joka sisälsi L41 :n ja C64:.

Kuviossa 41 on esitetty mainitussa PCR-synteesissä käytetyt oligonukleotidit. Mainittu PCR-reaktio suoritettiin saikin kuvaaman menetelmän mukaisesti (katso Saiki, R.K., et ai., Science 25 (1988) 222: 487). Näin menetellen aikaan saatu polymeeriliitos sisältää metioniimolekyylejä kummassakin päässä sekvenssiä, kuten käy ilmi kuvasta 42, ja se saa aikaan halutut restrik-tiokohdat mainittua konstruktiota varten.

Mainitut tandem-toistot suoritettiin yksittäisistä multimeerejä muodostavista komponenteista, 30 esimerkiksi, liittämällä EcoRI/BamHI-fragmentti Bgffi/Hindlll-fragmenttiin M13mpl8-vektorin katkaisussa EcoRI/HindllLn avulla dimeerin aikaan saamiseksi. Edellä kuvatulla tavalla menetellen aikaan saatu dimeeri leikattiin EcoRLn ja BamHLn avulla ja religoitiin 75 104364

Bgll/Hindlll-fragmenttiin trimeerin aikaan saamiseksi. Tätä edellä kuvattua suoritusvaiheiden saijaa jatkettiin, kunnes oli saavutettu haluttu koko. Tämä edellä mainittu konstruktio on esitetty kaavamaisesti Kuviossa 43.

5 Edellä mainittu multimeeri liitettiin IL coli'n vektoriin pKK233-2 (katso Amann, E., et ai., . Gene (1985) 4Q: 183), joka on kaupallisesti saatavilla (valmistaja Clontech), käsittelemällä mainittua vektoria NcoI/HindIII:n avulla ja liittämällä monomeerinen NcoI/BamHI:n subf-ragmentti j a multimeerisia Bgll/Hindlll :n subfragmentteja.

/ o Jotta olisi saatu aikaan ekspressio fuusioituneena polymeerinä, edellä esitetyllä tavalla käsitel-täy vektoria käytettiin yhdessä NcoI-EcoRI-subfragmentin, joka sisälsi vähäisesti modifioidun aminoterminaalisen osan (aminohapot 1-72) kloo- riamfenikoliasetyylitransferaasigeenissä (katso Chang, C.N., et ai., Gene (1987) 56: 189), ja multimeerikonstruktioiden EcoRI-Hindlll-subfragmenttien kanssa.

15

Esimerkki 24

Rekombinanttigeenien ekspressio

Kaikkien edellä kuvattujen rekombinanttiplasmidien proteiiniekspressio indusoidaan Kana-marin esittämällä menetelmällä (katso Kanamari, et ai., Gene (1988) 66: 295) soveltuviin E» 20 coli-isäntäkantoihin tapahtuneen transfektion jälkeen. Tuotteet voidaan karakterisoida nat- riumdodekyylisulfaattipolyakryyliamidigeelielektroforeesin avulla ja niiden kyvyn inhiboida • ADP-indusoitua verihiutaleiden aggregaatiota runsaasti verihiutaleita sisältävässä plasmassa perusteella. Puhdistuksen jälkeen multimeeriset proteiinit muunnetaan monomeerisiksi yksiköiksi syanogeenibromidikatkaisun avulla, ja näin saadut tuotteet tutkitaan, kuten edellä on » 25 esitetty.

Claims (23)

1. 76 104364
2. 1. Analogiamenetelmä spesifisen verihiutaleiden aggregaation inhibiittorin (PAI) valmistamiseksi, joka inhibiittori kykenee inhiboimaan Fg:n tai vWF:n sitoutumista GP IIb-IIIa:n kanssa 5 oleellisesti voimakkaammin mikä tarkoittaa, että joko prosenttuaalinen inhibitio on tietyssä PAI-pitoisuudessa ainakin kaksi kertaa suurempi tai että 50 % inhibition aieuttava PAI-pitoisuus on ainakin kaksi kertaa pienempi Fg:n tai vWF:n sitoutuessa GPIIb-IIIa:han verrattuna vaihtoehtoiseen li-gandi/reseptorisitoutumiseen; 10 kuin inhiboimaan vitronektiinin sitoutumista vitronektiinireseptoriin tai fibronektiinin sitoutumista fibronektiinireseptoriin, joka mainittu PAI on seuraavan kaavan mukainen I ; i Y1-X1-(AA1)nl-K -(G/Sar)-D-(AA2)n2-(AA3)n3-(AA4)n4-X2-Y2 O) missä K* on lysyylitähde, joka on seuraavan kaavan mukainen 15 R'2N(CH2)4CHNHCO-, missä kukin R1 on erikseen H, alkyyli (1-6 C) tai enintään yksi R1 on R2-C=NR3, missä R2 on H, alkyyli (1-6 C) tai substituoitu tai substituoimaton fenyyli- tai bentsyyli-tähde, tai on NR42, missä kukin R4 on erikseen H tai alkyyli (1 -6 C), ja R3 on H, alkyyli (1-6 C), fenyyli tai bentsyyli, tai 20 R2-C=NR3 on radikaali, joka on valittu seuravassa esitettyjen joukosta: N^N N^N N^N N^N W - W ' \ J ja \ / / \ (CHR5)m M R5 R5 missä m on kokonaisluku välillä 2-3, ja kukin R5 on erikseen H tai alkyyli (1-6 C), 25 ja missä yksi tai kaksi (CH2):ta voi olla korvautunut 0:11a tai S:llä sillä edellytyksellä, ettei mainittu O tai S ole toisen heteroatomin vieressä, AA, on pieni, neutraali (poolinen tai pooliton) aminohappo ja nl on kokonaisluku välillä 0-3, 77 104364 AA2 on neutraali, pooliton suuri (aromaattinen tai ei-aromaattinen) tai poolinen aromaattinen aminohappo ja n2 on kokonaisluku välillä 0-3, AA} on proliinitähde tai modifioitu proliinitähde (joka on määritelty jäljempänä) ja n3 on kokonaisluku välillä 0-1,
3. 5 AA» on neutraali, pieni aminohappo tai vastaava N-alkyloitu muoto ja n4 on kokonaislu ku välillä 0-3, kumpikin X! ja X2 ovat erikseen tähteitä, jotka kykenevät muodostamaan sidoksen X,:n ja X2:n välille, jotta saataisiin aikaan syklinen yhdiste, kuten jäljempänä on esitetty, ja kumpikin Y! ja Y2 ovat erikseen sellaisia substituentteja, jotka eivät vaikuta kyseisen 10 molekyylin sitoutumiseen tai muihin olennaisiin ominaisuuksiin, ja ne voivat myös puuttua kokonaan, missä yksi tai useampia peptidisidoksia voi olla valinnaisesti korvautunut jollakin seu-raavassa esitettyyn ryhmään kuuluvalla sidoksella, joka mainittu ryhmä käsittää -CH2NH-, -CH2S-, CH2CH2-, -CH=CH- (cis ja trans), -COCH2-,
4. 15 -CH(OH)CH2- ja -CH2SO-, sillä varauksella, että, jos n3 on 0, niin joko 1. n2:n ja n4:n summan on oltava ainakin 2, tai
5. 2. K*:n on oltava jokin muu kuin Har tai K, tai 3. ainakin toisen X] :stä ja X2:sta on oltava muu kuin Cys (C), penisillamiini (Pen), tai 2- 20 amino-3,3,-syklopentaanimetyleeni-3-merkaptopropionihappo (APmp), tai 4. yksi tai useampia peptidisidoksista on korvautunut edellä mainitulla vaihtoehtoisella si-• doksella; tunnettu siitä että se käsittää seuraavat vaiheet: joko synteesi aloitetaan mainitun peptidin karboksyylipäästä käyttäen aminohappoa 25 jossa on alfa-aminosuojaryhmä, jolloin mainittu aminohappo on sidottuna hartsikantajaan; kootaan suojattu hartsiin sidottu peptidiketju; poistetaan mainittu suojaus; lohkaistaan peptidi ’ _« mainitusta hartsista; syklisoidaan mainittu peptidi ja vaihtoehtoisesti puhdistetaan mainittu peptidi; tai synteesi aloitetaan liuoksessa kondensoimalla suojattuja) aminohappotäh-50 de/tahteitä; kootaan suojattu peptidi; lohkaistaan suojaryhmät; syklisoidaan peptidi, ja vaihtoehtoisesti puhdistetaan mainittu peptidi. 78 104364
6. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä että Y, on H, asyyli-, tai pep- tiditähde tai tällaisen derivatisoitu muoto tai puuttuu kokonaan; ja/tai Y2 on OH, NH2 tai peptiditähde tai tällaisen derivatisoitu muoto tai puuttuu kokonaan; ja/tai X] ja X2 valitaan ryhmästä, joka käsittää kysteiinin (Cys), merkaptopropionyylin (Mpr) ja 5 penisillamiinin (Pen); ja/tai AA, on G ja nl on 0 tai 1; ja/tai AA2 on valittuna ryhmästä, joka käsittää W:n,F:n,L:n,Y:n ja V:n; ja/tai AA2 on W; ja/tai K* on K, Har, asetimidyyli-Lys tai fenyyli-imidyyli-Lys; ja/tai kaavan (1) mukainen yhdiste on valittuna ryhmästä PAI3: G-C-G-K-G-D-W-P-C-A-NH2
7. 10 PAI 4: G-C-K-G-D-W-P-C-A-NH2 PAI 5: C-G-K-G-D-W-P-C-NH2 PAI 10: C-K-G-D-W-P-C-NH2 PAI 12: C-K-G-D-Y-P-C-NH2 PAI 13: C-K-G-D-F-P-C-NH2
8. 15 PAI 19: Mpr-K-G-D-W-P-C-NH2 PAI 25: Mpr-K-G-D-(2-Nal)-P-C-NH2 PAI 34: C-K-G-D-W-G-C-NH2 PAI 39: C-K-G-D-W-(Sar)-C-NH2 PAI 42: C-K-G-D-(4-Cl-Phe)-P-NH2
9. 20 PAI 43: C-K-(Sar)-D-W-P-C-NH2 PAI 44: C-K-G-D-(4-N02-Phe)-P-C-NH2 PAI 47: Asetyyli-C-K-G-D-W-P-C-NH2 PAI 48: Mpr-K-G-D-W(formyyli)-P-C-NH2 PAI 49: Mvl-K-G-D-W-P-C-NH2
10. 25 PAI 51: Mpr-K-G-D-W-P-Pen-NH2 PAI 52: Mpr-K-G-D-W-P-Pen+-NH2 ·; PAI 55: Mpr-K-G-D-W-(Thz)-C-NH2 « PAI 57: Mpr-K-G-D-(2-Nal)-P-Pen-NH2 PAI 58: Mvl-K-G-D-W-P-Pen-NH2
11. 30 PAI 59: Mpr-K-G-D-W-(Pip)-Pen-NH2 PAI 60: Mpr-(Har)-G-D-W-P-C-NH2 PAI 61: Mpr-K-G-D-W-P-CVNfy 79 104364 PAI62: Mpr-K+-G-D-W-P-Pen-NH2 PAI63: Mpr-(Har)-G-D-W-P-Pen-NH2 PAI 64: Mpr-(asetimidyyli-Lys)-G-D-W-P-C-NH2 PAI 65: Mpr-(asetimidyyIi-Lys)-G-D-W-P-Pen-NH2
12. 5 PAI 66: Mpr-(NG,NG-etyleeni-Har)-G-D-W-P-C-NH2 PAI 67: Mpr-CN^N^-etyleeni-Har^G-D-W-P-Pen-NHz PAI 68: Mpr-Har-Sar-D-W-P-C-NH2 * PAI 69: Mpr-(asetimidyyli-Lys)-G-D-W-P-Pen-NH2 PAI 70: Mpr-(fenyyli-imidyyli-Lys)-G-D-W-P-C-NH2
13. 10 PAI 71: Mpr-Har-Sar-D-W-P-PenNH2 PAI 72: Mpr-(fenyyli-imidyyli-Lys)-G-D-W-P-PenNH2 PAI 73: Mpr-Har-G-D-W-(3,4-dehydro-Pro)-C-NH2 Mpr-K-G-D-Y (OMe)-P-C-NH2 Mpr-K-G-D+-W-P-Pen-NH2 15 ja näiden sykliset muodot.
14. 3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen analogiamenetelmä, tunnettu siitä että verihiutaleiden aggregaation inhibiittori on Mpr-K-G-D-W-P-C-NH2.
15. 4. Patenttivaatimuksen 2 mukainen analogiamenetelmä, tunnettu siitä että verihiutaleiden aggregaation inhibiittori on Mpr-K-G-D-W(formyyli)-P-C-NH2.
16. 5. Patenttivaatimuksen 2 mukainen analogiamenetelmä, tunnettu siitä että verihiutaleiden aggregaation inhibiittori on Mvl-K-G-D-W-P-C-NH2. 25
17. 6. Patenttivaatimuksen 2 mukainen analogiamenetelmä, tunnettu siitä että verihiutaleiden * ·; aggregaation inhibiittori on Mpr-K-G-D-W-P-Pen-NH2. 1 Patenttivaatimuksen 2 mukainen analogiamenetelmä, tunnettu siitä että verihiutaleiden 30 aggregaation inhibiittori on Mpr-(Har)-G-D-W-P-C-NH2. so 104364
18. 8. Patenttivaatimuksen 2 mukainen analogiamenetelmä, tunnettu siitä että verihiutaleiden aggregaation inhibiittori on Mpr-K-G-D-W-(Pip)-Pen-NH2.
19. 9. Patenttivaatimuksen 2 mukainen analogiamenetelmä, tunnettu siitä että verihiutaleiden 5 aggregaation inhibiittori on Mpr-(Har)-G-D-W-P-Pen-NH2.
20. 10. Patenttivaatimuksen 2 mukainen analogiamenetelmä, tunnettu siitä että verihiutaleiden aggregaation inhibiittori on Mpr-(Asetimidyyli-Lys)-G-D-W-P-C-NH2.
21. 11. Patenttivaatimuksen 2 mukainen analogiamenetelmä, tunnettu siitä että verihiutaleiden aggregaation inhibiittori on Mpr-(Asetimidyyli-Lys)-G-D-W-P-Pen-NH2.
22. 12. Patenttivaatimuksen 2 mukainen analogiamenetelmä, tunnettu siitä että verihiutaleiden aggregaation inhibiittori on Mpr-(Fenyyli-imidyyli-Lys)-G-D-W-P-C-NH2. 15
23. 13. Patenttivaatimuksen 2 mukainen analogiamenetelmä, tunnettu siitä että verihiutaleiden aggregaation inhibiittori on Mpr-Har-G-D-W-(3,4-dehydro-Pro)-C-NH2. 20