ES3035047A1 - Nanoestructuras viricas sinteticas y sus usos - Google Patents

Abstract

Nanoestructuras víricas sintéticas y sus usos. La presente invención se refiere a una nanoestructura que comprende un núcleo magnético recubierto por uno o más componentes celulares, donde dicho núcleo magnético comprende nanopartículas magnéticas, al método de obtener dicha nanoestructura, y al empleo de dicha nanoestructura como medicamento, como vacuna, o para el análisis in vitro de compuestos capaces de inhibir virus, para la validación in vitro de anticuerpos o como sistema in vitro de biopsia intracelular.

Description

DESCRIPCIÓN

Nanoestructuras víricas sintéticas y sus usos

La presente invención pertenece al sector biomédico, particularmente de la inmunología y el desarrollo de vacunas y análisis de inhibidores víricos. La presente invención se refiere a unas nanoestructuras víricas sintéticas compuestas por un núcleo magnético recubiertas de una membrana celular que contiene proteínas ligando víricas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La experimentación con virus patógenos es necesaria para comprender los riesgos potenciales que plantean los virus, para el desarrollo de fármacos inhibidores y vacunas y para entender la forma en que se propagan y causan enfermedades(Yeh KB., et al, Significance of High-Containment Biological Laboratories Performing Work During the COVID-19 Pandemic: Biosafety Level-3 and -4 Labs. Front Bioeng Biotechnol. Frontiers Media S.A.; 2021;9:731).

Aunque estos estudios son necesarios para mejorar la comprensión de los virus y desarrollar tratamientos y vacunas efectivas, es importante que se realicen bajo estrictas medidas de seguridad, debido a los riesgos que implica trabajar con microorganismos altamente infecciosos y potencialmente letales. Estos estudios se realizan en laboratorios de bioseguridad nivel III (P3), también conocidos como BSL-3 (laboratorios de bioseguridad nivel 3), que son laboratorios especializados con un alto nivel de seguridad. Permiten un rápido avance de la investigación para caracterizar patógenos humanos y animales, ayudar en la vigilancia de enfermedades y realizar la investigación preclínica inicial para el desarrollo de diagnósticos, terapias y vacunas.

Sin embargo, estos laboratorios presentan varios desafíos técnicos y de financiación ya que para poder acceder a ellos es necesario cumplir con unas certificaciones externas consistentes y rigurosas, proporcionar un entrenamiento al personal especializado, llevar a cabo controles exhaustivos y monitorización constante (flujo de aire, presión, flujo de agua, temperatura y potencia)(Xia H, Yuan Z. High-containment facilities and the role they play in global health security. J Biosaf Biosecurity. Elsevier; 2022;4:1-4).Además, el diseño, la construcción y la puesta en marcha de estos laboratorios son costosos y requieren una gran inversión.

Por ello, son poco frecuentes en los institutos de investigación, las universidades o las clínicas, limitando así los estudios de I+D frente a estos patógenos. Esto es un problema en pandemias como la sufrida por el SARS-CoV-2, donde se necesita estudiar intensamente y conocer los mecanismos patológicos del virus para poder desarrollar sistemas de protección eficientes.

Además de los problemas que hemos comentado en referencia a la manipulación de virus para su estudio, es necesario, en primer lugar, obtener una muestra del virus y sus diferentes variantes, normalmente a partir de muestras clínicas. Esto que limita notablemente el acceso a este material para generar fármacos inhibidores o vacunas. Otro de los hándicaps es que para trabajar con virus hay que obtener especímenes de muestras clínicas y que, si existen diferentes variantes genéticas no siempre la toma de muestras es posible (por cuestiones de disponibilidad) y segura.

Por otro lado, para generar vacunas protectoras contra los virus patógenos humanos con envoltura, es esencial comprender cómo interactúan los anticuerpos con las proteínas de la envoltura viral, en particular con las proteínas de fusión, y cómo neutralizar a estos virus con anticuerpos. La creación de vacunas basadas en proteínas recombinantes implica la producción de una proteína viral específica en un sistema de expresión celular, que luego se purifica y se utiliza como antígeno en la vacuna. En concreto, proteínas como la Spike o "S” del SARS-CoV-2 de forma recombinante tiene numerosas desventajas. En general, se considera que la producción recombinante de proteínas es un método seguro y eficiente para obtener proteínas recombinantes a gran escala, pero es necesario tener en cuenta algunos inconvenientes en el proceso. En primer lugar, el proceso de producción y purificación de proteínas recombinantes compuestas por varios polipéptidos puede ser costoso, lento y requiere de un equipamiento y formación técnica específica ya que no se puede producir en bacterias debido a que no la pliegan bien y no la glicosilan. En concreto, la proteína Spike o "S” se tiene que producir en células humanas y su producción es lenta, con riesgo elevado de contaminación bacteriana y fúngica, afectando a la calidad del producto final.

Los virus como el coronavirus (virus con envoltura) consisten en una cápsula con material genético rodeado de una membrana lipídica bilaminada con proteínas ligando (por ejemplo, en el SarCov2, la proteína Spike o "S”) incorporadas al virus en el momento que el virión gema fuera de las células que ha infectado (célula hospedadora). La mayoría de los virus patógenos están cubiertos por estas membranas que median en la adhesión a la superficie de sus células diana y permite la fusión de la envoltura viral con la bicapa lipídica de la membrana de sus células a infectar. Cada virus dispone de proteínas ligando diferentes pero el fin del éstas en el mismo, dirigir al virión a los receptores de las células diana para su replicación.

En resumen, lo ideal sería disponer de un sistema sintético, una especie de avatar vírico, incapaz de replicarse, pero externamente idéntico al virus en su tamaño y propiedades de superficie, que las células diana de estos microrganismos lo reconociesen de forma idéntica a como al propio virus.

A la vista de todo lo anterior descrito, sería necesario desarrollar nanosistemas sintéticos y bioseguros, para la experimentación del virus y sus enfermedades, así como para el desarrollo de vacunas.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a nanoestructuras magnéticas, preferiblemente esféricas, ovaladas, cuadradas, de dimensiones similares a un virus (de 50 a 500 nm de diámetro), con posibilidad de ser fluorescentes, de naturaleza de sílice o poliestireno. Gracias a sus propiedades magnéticas, su entrada y salida de las células puede favorecerse empleando fuerza magnética. Adicionalmente, las nanoestructuras se pueden visualizar mediante técnicas de microscopía electrónica (Figura 1), y estar recubiertas de proteínas víricas ligando de virus con envoltura, formado así un sistema incapaz de replicarse pero extremadamente idéntico al virus, obteniendo así un "avatar vírico”.

Para obtener las nanoestructuras magnéticas arriba descritas, nanopartículas magnéticas y fluorescentes se añaden a un cultivo de células, preferiblemente, células recombinantes que expresan en su superficie proteínas víricas ligando de virus con envoltura, y se fuerza su entrada al interior celular empleando un campo magnético perpendicular a la base de la placa de crecimiento celular. Posteriormente, las nanopartículas se extraen del interior celular desplazando, o aplicando de nuevo, el campo magnético a la parte superior del cultivo, para que dichas nanopartículas salgan por gemación forzada, en un efecto semejante al“budding”vírico, obteniendo así las mencionadas nanoestructuras magnética que comprenden un componente celular en su superficie. Estas nano estructuras, una vez recolectadas, por ejemplo, empleando un campo magnético, se pueden emplear para su uso en estudios de interacción celular, ensayos de inhibidores víricos o de inmunización (Figura 2). En un ejemplo de la presente invención, estas nanoestructuras están rodeadas de una corona de proteína Spike idéntica a la del coronavirus objeto de estudio (Figura 3).

Este sistema, basado en nanobiotecnología, seguro, escalable y fácil de manipular, proporciona las mismas características de tamaño y envoltura que los virus, pero carece de capacidad infectiva (sin material genético), por lo que pueden denominarse “avatares víricos”. Esto permite emplear estas nanoestructuras tanto en inmunización como en investigación de inhibidores víricos o validación de anticuerpos, evitando todos los problemas de bioseguridad que serían necesarias en caso de usar partículas víricas. Por tanto, las nanoestructuras de la presente invención se pueden emplear en: (i) inmunización, (ii) estudios de compuestos para la inhibición de los mismos mecanismos de penetración de los virus; (iii) estudios para la selección de anticuerpos frente a diferentes virus; y (iv) desarrollo de kits de inmunodetección, entre otras aplicaciones.

La versatilidad del sistema es enorme puesto que permite obtener nanoestructuras estructuralmente semejantes a un virus que comprenden en su superficie cualquier componente celular, así como expresar cualquier proteína ligando vírica de membrana mediante transfección de las células humanas del cultivo, lo que permite que el sistema sea aplicable a cualquier virus con envoltura.

Nanoestructura de la invención

En vista de lo anterior, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a nanoestructuras, de aquí en adelante "las nanoestructuras de la invención”, que comprenden una nanoestructura que comprende un núcleo magnético recubierto por uno o más componentes celulares, donde dicho núcleo magnético comprende nanopartículas magnéticas.

El término “nanoestructuras”, tal como se usa en la presente invención, se refiere a estructuras, sistemas o complejos que comprenden unas dimensiones en el rango comprendido entre 1 y 1000 nm. Preferiblemente, las nanoestructuras de la invención se caracterizan por presentar un tamaño medio de diámetro comprendido entre 5 y 500 nm (extremos incluidos). Este tamaño permite a las nanoestructuras presentar unas dimensiones similares a los virus y favorecer la entrada y la salida de las células.

En una realización preferida, las nanoestructuras de la invención tienen un tamaño entre 50 nm a 500 nm (extremos incluidos), más preferiblemente entre 100 nm y 200 nm (extremos incluidos) de diámetro.

En la presente invención se entiende por "núcleo magnético” al compartimento central de la nanoestructura de la invención que comprende un medio de soporte y nanopartículas magnéticas.

Las nanoestructuras de la invención comprenden nanopartículas magnéticas. El término "nanopartículas de magnéticas”, tal como se usa en la presente invención, se refiere a nanopartículas que pueden manipularse mediante campos magnéticos externos, es decir, que su comportamiento y posición pueden controlarse utilizando un campo magnético generado desde fuera de la nanopartícula y que tienen la capacidad de responder a influencias magnéticas externas.

En una realización preferida de las nanoestructuras de la invención, las nanopartículas magnéticas son nanopartículas de óxido de hierro.

En otra realización preferida de las nanoestructuras de la invención, el soporte del núcleo magnético comprende al menos una esfera de poliestireno (de aquí en adelante, "nanoestructura de poliestireno de la invención”, ver Figura 5) o al menos una esfera sílice (de aquí en adelante, "nanoestructura de sílice de la invención”, ver Figura 6) en combinación con las nanopartículas magnéticas, más preferiblemente, nanopartículas magnéticas de óxido de hierro.

Nanoestructura de poliestireno de la invención

En otra realización preferida de la nanoestructura de la invención, el nucleó magnético comprende, al menos, una esfera de poliestireno como medio de soporte para las nanopartículas magnéticas. La nanoestructura de poliestireno de la invención se muestra en la Figura 5.

El término "esfera de poliestireno”, tal como se usa en la presente invención, se refiere a nanopartículas esféricas del polímero poliestireno, compuesto por unidades repetitivas de estireno, un monómero de hidrocarburo aromático. El poliestireno es altamente biocompatible ya que se utiliza en importantes aplicaciones médicas y biomédicas como dispositivos médicos, implantes y otros productos que entrarán en contacto directo o indirecto con tejidos y fluidos biológicos.

En una realización particular de la nanoestructura de poliestireno de la invención, la esfera de poliestireno está rodeada por, al menos, 2, 3 o 4 capas de polielectrolitos.

El término "polielectrolito”, tal como se usa en la presente invención, se refiere a cualquier polímero que posea grupos electrolitos, es decir, policationes y polianiones. Estos grupos se disocian en disoluciones acuosas (agua), por lo que quedan como polímeros cargados. Ejemplos de polielectrolitos cargados positivamente incluyen, sin limitar a, polietilenimina, poli(clorhidrato de alilamina), poli(cloruro de dialildimetilamonio) o PPDA, Poli(ácido acrílico). Ejemplos de polielectrolitos cargados negativamente incluyen, sin limitar a, sulfonato de poliestireno, poliacrilamida, ácido poliacrílico, ácido polimetacrílico, poli(4-estirenosulfato sódico o PSS), poli-(estirenosulfonato), poli(sulfato de sodio), poli(acrilato de sodio).

Cualquier polielectrolito puede ser usado en la presente invención. No obstante, en otra realización todavía más particular de la nanoestructura de poliestireno de la invención, la capa de polielectrolitos comprende poli(4-estirenosulfato sódico) (PSS) y/o poli(cloruro de dialildimetilamonio) (PPDA).

Los términos "poli(4-estirenosulfato sódico)”, "poli(sulfonato de estireno) de sodio” , "sulfonato de poliestireno sódico” o "PSS”, tal como se usan en la presente invención, se refieren a un polímero sustituido de poliestireno en el que un grupo sulfonato SO3" está unido a cada átomo de carbono n4 del grupo fenil. Tiene un aspecto de polvo sólido o blanco, muy soluble en agua. Se obtiene por polimerización o copolimerización de estireno sulfonato, o por sulfonación de poliestireno ya polimerizado.

Los términos "poli(cloruro de dialildimetilamonio)” o "PPDA”, tal como se usan en la presente invención, se refieren a un polielectrolito catiónico preparado por la polimerización radical de cloruro de dialildimetilamonio en presencia de un catalizador en forma de peróxido orgánico.

El PPDA y PSS pueden usarse en combinación en la nanoestructura de poliestireno de la invención para formar una película adsorbida capa por capa de polímeros cargados negativa y positivamente. Así, en otra realización preferida de la nanoestructura de poliestireno de la invención, las capas de polielectrolitos están alternando una capa de PPDA y otra de PSS.

Adicionalmente, el PPDA de la nanoestructura de poliestireno de la invención puede llevar unido a un fluorocromo con la finalidad de que la nanoestructura de poliestireno de la invención poder ser visualizada o identificada mediante fluorescencia. Así, en una realización particular de la nanoestructura de poliestireno de la invención, la nanoestructura comprende una bicapa de PSS y PPDA, donde el PPDA lleva unido un fluorocromo. Esta bicapa de PSS y PDA-Fluorocromo puede ser adicional a otras capas de polieletrolitos presentes en la nanoestructura de poliestireno de la invención.

En la presente invención, se entiende por fluorocromo por fluoróforo a un compuesto químico fotorreactivo que absorbe la energía de la luz de una cierta longitud de onda y emiten esa luz a una longitud de onda más amplia. En términos generales, los fluorocromos son grupos funcionales que van unidos a otra molécula, lo que permite la visualización de dichas moléculas por fluorescencia. Ejemplos de fluorocromos incluyen, sin limitarse a, fluoresceína, rodamina, cianina 5 (Cy 5), Tetrametil Rodamina IsoTioCianato (TRITC), Alexa Fluor serires, Pacific blue y cualquiera de ellos puede usarse en la presente invención. No obstante, en otra realización todavía más particular, el fluorocromo es isotiocianato de fluoresceína (FITC).

En otra realización preferida de la nanoestructura de poliestireno de la invención, las capas de electrolitos están rodeadas por las nanopartículas magnéticas.

Resumidamente, en una realización preferida de la nanoestructura de la invención, la nanoestructura comprende un núcleo magnético recubierto por un componente celular, donde

(i) el núcleo magnético comprende

(a) nanopartículas magnéticas, preferiblemente, nanopartículas de óxido de hierro, (b) al menos, una esfera de poliestireno, y

© al menos 2, 3, o 4 capas de polielectrolitos; preferiblemente, la capa de polielectrolitos comprende PSS y/o PPDA,

donde la esfera de poliestireno está rodeada por las capas de polielectrolitos la cuales, a su vez, están rodeadas por las nanopartículas magnéticas; y

(ii) el componente celular.

Nanoestructura de sílice de la invención

En otra realización preferida de la nanoestructura de la invención, el soporte del nucleó magnético comprende, al menos, una esfera de sílice. La nanoestructura de sílice de la invención se muestra en la Figura 6.

El término "esfera de sílice”, tal como se usa en la presente invención, se refiere a nanopartículas esféricas de sílice (por ejemplo, dióxido de silicio, SiO2) con un tamaño en el rango nanométrico. El dióxido de silicio es un compuesto químico compuesto por un átomo de silicio y dos átomos de oxígeno, y es uno de los componentes más comunes en la corteza terrestre. El silicio es el elemento más cercano al carbono y, de hecho, muchos compuestos de carbono tienen equivalentes homólogos al silicio. La sílice coloidal es altamente biocompatible y actualmente se usa como aditivo en la producción de alimentos y en las industrias cosmética y farmacéutica.

La nanoestructura de sílice de la invención comprende una esfera de sílice, en la que las nanopartículas magnéticas se encuentran en el interior de la esfera de sílice. Así, en una realización particular de la nanoestructura de sílice de la invención, la esfera de sílice comprende en su interior las nanopartículas magnéticas, preferiblemente, al menos 2 nanopartículas magnéticas.

Asimismo, como entiende el experto en la materia, nanoestructura de sílice de la invención puede ser fluorescente si ésta comprende un fluorocromo, lo que permite su fácil identificación. Así, en otra realización preferida de la nanoestructura de sílice de la invención, la esfera de sílice comprende un fluoróforo, más preferiblemente, el fluoróforo es FITC. El término fluoróforo y ejemplos de fluoróforos que pueden emplearse en el contexto de la presente invención han sido descritos en párrafos anteriores.

Resumidamente, en una realización preferida de la nanoestructura de la invención, la nanoestructura comprende un núcleo magnético recubierto por un componente celular, donde

(i) el núcleo magnético comprende

(a) nanopartículas magnéticas, preferiblemente, nanopartículas de óxido de hierro, y

(b) al menos, una esfera sílice,

donde la esfera de sílice comprende en su interior las nanopartículas magnéticas; y

(ii) el componente celular.

Como puede apreciarse, la nanoestructura de la invención, tanto si comprende esferas de poliestireno o esferas de sílice, comprende un componente celular.

En la presente invención se entiende por “componente celular” a cualquier compuesto, estructura, o parte, de una célula. Ejemplos de componentes celulares incluyen, sin limitarse a, ácidos nucleicos, proteínas, azúcares, membranas celulares, organelas del citoplasma celular, etc. Así, en una realización preferida de la nanoestructura de la invención, el componente celular es una membrana celular, un ácido nucleico, o un componente del citoplasma celular, tal como ácidos nucleicos, proteínas del citoplasma, organelas celulares, etc,

En otra realización preferida de la nanoestructura de la invención, sola o en combinación con todas o cada una del resto de realizaciones preferidas antes mencionadas, el componente celular es una membrana celular, donde la membrana celular comprende, al menos, una proteína ligando de un virus con envoltura.

En la presente invención se entiende por “membrana celular” , también llamada “membrana citoplasmática”, a la bicapa lipídica semipermeable que separa el interior de la célula del medio exterior que la rodea. Como es sabido, la membrana celular regula el transporte de sustancias que entran y salen de la célula. En el contexto de la presente invención, la membrana celular de la nanoestructura de la invención comprende, al menos, una proteína ligando de un virus con envoltura.

En la presente invención se entiende “virus con envoltura”, a aquel virus que comprende una envoltura, envuelta o bicapa lipídica (también denominada “envoltura lipídica”, "membrana lipídica”, "membrana viral” o "envoltura vírica”) que rodea la cápside del virus, tanto virus animales y vegetales como bacteriófagos. Dicha envoltura lipídica comprende glucoproteínas o glicoproteínas, es decir las proteínas ligando, que están codificadas en el genoma vírico y que ayudan al virus a entrar en la célula huésped mediante la identificación y unión a los receptores en la membrana de dicha célula huésped. Ejemplos de virus con envoltura incluyen, sin limitar a, coronavirus de tipo 2 causante del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV-2); virus de la influenza, virus herpes simplex 1 (VHS1), virus herpes simplex 2 (VHS-2), virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), el virus del dengue (DENV), o virus de la rabia.

Así, en una realización preferida de las nanoestructuras de la invención, el virus con envoltura se selecciona de la lista que consiste en: coronavirus de tipo 2 causante del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV-2); virus de la influenza, virus herpes simplex 1 (VHS1), virus herpes simplex 2 (VHS-2), virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), el virus del dengue (DENV), y el virus de la rabia.

Ejemplos de proteínas ligando que pueden proceden de virus con envoltura incluyen, sin limitar a, proteína S (spike o proteína espícula, proteína ligando de SARS-CoV-2), las proteínas hemaglutinina (H) y la neuraminidasa (N) (en el virus de la influenza), glicoproteínas de superficie C, B y D (en el virus del herpes), la glicoproteina gp120 (proteína crucial en el proceso de infección), la proteína E (en el virus del Dengue, o de la glicoproteína G (virus de la rabia). No obstante, en una realización preferida de la nanoestructura de la invención, la proteína ligando de un virus con envoltura es la proteína S (spike o proteína espícula, proteína ligando de SARS-CoV-2).

El componente celular también puede ser un componente del citoplasma celular, tales como, ácidos nucleicos, organelas celulares o proteínas del citoplasma.

El componente celular de la nanoestructura de la invención, también puede ser un ácido nucleico, el cual puede ser tanto ARN, como ADN, organelas celulares, proteínas del citoplasma, etc. Así, en una realización preferida de la nanopartícula de la invención, sola o en combinación con todas o cada una de las realizaciones preferidas anteriores, el ácido nucleico es ADN o ARN,

Composición de la invención

Como entiende un experto en la materia, las nanoestructuras de la invención pueden estar comprendidas en una composición.

Por tanto, otro aspecto de la invención es una composición que comprende las nanoestructuras de la invención, de aquí en adelante la “composición de la invención”.

Las nanoestructuras de la invención han sido descritas anteriormente en el presente documento y se aplica de igual forma a este aspecto de la invención, así como a todas sus realizaciones preferidas, tanto solas como en combinación unas con otras.

Particularmente, la composición de la invención puede ser una composición farmacéutica para su uso como medicamento, por ejemplo, en inmunización. Así, en una realización preferida, la composición de la invención es una composición farmacéutica.

El término “composición farmacéutica” se refiere a un conjunto, mezcla, combinación de componentes o sustancias que comprenden las nanoestructuras de la invención en cualquier concentración. La composición farmacéutica puede ser de uso humano. El término “composición farmacéutica de uso humano” se refiere a una composición, sustancia o combinación de sustancias con propiedades para su uso como medicamento, particularmente como medicamento o que pueda usarse en seres humanos o administrarse a seres humanos con el fin de restaurar, corregir o modificar las funciones fisiológicas ejerciendo una acción farmacológica, inmunológica o metabólica, o de establecer un diagnóstico médico.

En otra realización preferida, la composición farmacéutica además comprende, al menos, un vehículo y/o un excipiente farmacéuticamente aceptable.

El término “vehículo” o “portador”, se refiere a una sustancia, preferiblemente una sustancia inerte, que facilita la incorporación de otros compuestos, que permite una mejor dosificación y administración o mejora la consistencia y forma de la composición farmacéutica para su uso como medicamento. Por tanto, el vehículo es una sustancia que se emplea en el medicamento para diluir cualquiera de los componentes de la composición farmacéutica hasta un volumen o peso determinado; o bien que aún sin diluir dichos componentes, es capaz de permitir una mejor dosificación y administración o dar consistencia y forma al medicamento. Cuando la forma de presentación es líquida, el vehículo farmacéuticamente aceptable es el diluyente.

El término “excipiente” hace referencia a una sustancia que ayuda a la absorción de cualquiera de los componentes de la composición farmacéutica, estabiliza dichos componentes, modificar sus propiedades organolépticas o determinar las propiedades físico-químicas de la composición farmacéutica y su biodisponibilidad. Así pues, los excipientes podrían tener la función de mantener los componentes unidos, como por ejemplo, almidones, azúcares o celulosas; función de endulzar; función de colorante; función de protección del medicamento, como por ejemplo, para aislarlo del aire y/o la humedad; función de relleno de una pastilla, cápsula, píldora o cualquier otra forma de presentación como, por ejemplo, el fosfato de calcio dibásico; función desintegradora para facilitar la disolución de los componentes; sin excluir otro tipo de excipientes no mencionados en este párrafo.

Además, como entiende el experto en la materia, el excipiente y/o el vehículo deben ser farmacéuticamente aceptables. El término “farmacéuticamente aceptable” se refiere a que el vehículo o el excipiente deben permitir la actividad de los compuestos de la composición farmacéutica, en particular de la nanoestructura de la invención, es decir, que sea compatible con dichos componentes, de modo que no cause daño a los organismos a los que se administra.

La composición farmacéutica se puede presentar bajo cualquier forma de administración clínicamente permitida y en una cantidad terapéuticamente efectiva. Por ejemplo, puede estar en una forma adaptada a la administración oral, sublingual, nasal, intratecal, bronquial, linfática, rectal, transdérmica, intravenosa, intraperitoneal, orogástrica, intracolónica, inhalada o parenteral.

Usos de la nanoestructura y composición de la invención

Usos médicos de la invención

Tal como se ha explicado al inicio de la presente descripción, las nanoestructuras de la invención pueden usarse como medicamento. Por tanto, otro aspecto de la invención se refiere a las nanoestructuras o la composición de la invención, para su uso como medicamento.

El término "medicamento", tal y como se usa en la presente invención, hace referencia a cualquier sustancia usada para la prevención, el alivio, el tratamiento o la curación de enfermedades en un sujeto, o que pueda administrarse al sujeto, con el fin de restablecer, corregir o modificar sus funciones fisiológicas ejerciendo una acción farmacológica, inmunológica o metabólica. A efectos de la presente invención, los términos “medicamento” y “composición farmacéutica” se emplean como sinónimos.

Asimismo, otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de las nanoestructuras de la invención, o de la composición de la invención, para la fabricación de un medicamento.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a las nanoestructuras o la composición de la invención, para su uso como vacuna.

El término "vacuna" tal como se usa en el presente documento se refiere a una nanoestructura o composición que, cuando es administrada a un sujeto, induce una respuesta inmunitaria celular y/o humoral.

En una realización particular, la vacuna es frente al SARS-CoV-2.

Usos no médicos de la invención

Tal como se ha descrito en el presente documento, entre las ventajas de las nanoestructuras de la invención se encuentran, además del uso médico como vacuna,su uso en el estudio, o screening, de compuestos para la inhibición de los mecanismos de penetración de los virus, de anticuerpos frente a diferentes virus, o su uso como sistema de “biopsia” intracelular mediante la extracción de material genético.

En la presente invención se entiende por “biopsia intracelular” a la extracción del material genético del núcleo celular, o algún componente del citoplasma celular. Ejemplos de componentes del citoplasma celular han sido definidos y explicados en párrafos anteriores de la presente descripción.

Así, otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de las nanoestructuras de la invención para el análisis in vitro de compuestos capaces de inhibir virus, para la validaciónin vitrode anticuerpos o como sistemain vitrode biopsia intracelular.

En la presente invención, el término"in vitro"se refiere a que los experimentos se llevan a cabo en un entorno controlado fuera del organismo vivo, como en cultivos celulares. La expresión “análisisin vitrode compuestos capaces de inhibir virus” se refiere a estudiar en cultivos celulares de compuestos que interfieran entre la unión del virus y las células humanas receptoras, lo que podrá conducir al desarrollo de medicamentos efectivos para tratar la infección.

En la presente invención, la expresión “validación de anticuerpos” se refiere al estudio de diferentes anticuerpos para detectar la respuesta inmunitaria del cuerpo frente a la infección por este virus, asegurando la especificidad, sensibilidad y precisión de las pruebas de anticuerpos.

Método de obtención de la nanoestructura de la invención.

En otro aspecto, la presente invención se relaciona con un método para obtener la nanoestructura de la invención, de aquí en adelante “método de la invención”, que comprende las siguientes etapas:

(a) poner en contacto nanopartículas magnéticas con un medio de soporte para obtener un núcleo magnético,

(b) poner en contacto el núcleo magnético obtenido en (a) con un medio de cultivo que comprende una línea celular;

(c) aplicar un campo magnético a las células del medio de cultivo, forzando así la entrada del núcleo magnético al interior de la célula;

(d) eliminar aquellos núcleos magnéticos que tras el paso (c) no hayan entrado en las células, y

(e) aplicar de nuevo un campo magnético al medio de cultivo para extraer los núcleos magnéticos del interior celular, obteniendo tras la extracción un medio de cultivo que comprende la nanoestructura de la invención.

Opcionalmente, el método de obtención de la nanoestructura de la invención puede comprender una etapa (f) que comprende el aislamiento de la nanoestructura de la invención del medio de cultivo. Preferiblemente dicho aislamiento se lleva a cabo mediante la centrifugación del medio de cultivo obtenido en (e), lavado con solución salina, y filtrado.

Como se ha explicado a lo largo de la presente descripción, la nanoestructura de la invención comprende un núcleo magnético que puede estar basado en esferas de poliestireno o en esferas de sílice que actúan como un medio de soporte para las nanopartículas magnéticas. Así, dependiendo de la naturaleza del núcleo magnético que se quiera obtener, se lleva a cabo uno y otro método, los cuales serán explicados a continuación.

Método de obtención de la nanoestructura de poliestireno de la invención

En el caso de que la nanoestructura esté basada en esferas de poliestireno, en una realización particular el método de la invención comprende, previamente a la etapa (a), mezclar al menos una esfera de poliestireno con una disolución acuosa de polielectrolitos mediante agitación por sonicación con ondas ultrasónicas de baja intensidad durante un tiempo de entre 0,5 y 4 horas, obteniendo así un complejo que comprende la esfera de poliestireno rodeada de una capa de polielectrolitos. Esta etapa puede repetirse cuantas veces sea necesaria para dar lugar a múltiples capas de polielectrolitos. Así, en una realización preferida del método de la invención, la etapa que comprende mezclar al menos una esfera de poliestireno con una disolución acuosa de polielectrolitos se lleva a cabo al menos 2, 3, 4 o 5 veces.

La mezcla de la esfera de poliestireno con una disolución acuosa de polielectrolitos se lleva a cabo mediante agitación por sonicación con ondas ultrasónicas de baja intensidad, preferiblemente entre 20-40KHz, durante un tiempo de entre 0,5 y 4 horas, obteniendo un complejo que comprende la esfera de poliestireno rodeada de una capa de polielectrolitos.

El término “polielectrolito”, así como ejemplos de polielectrolitos, ha sido definido previamente en la presente descripción, y dicha definición es aplicable al método de la invención, así como sus realizaciones preferidas.

Así, en una realización particular del método de la invención, la disolución acuosa de polielectrolitos comprende poli-4-estirenosulfato sódico (PSS) y/o poli(cloruro de dialildimetilamonio) (PPDA). Igualmente, los términos PSS y PPDA, y sus realizaciones preferidas, han sido definidos en párrafos anteriores.

La concentración de polielectrolitos en la solución acuosa puede ser muy variable. No obstante, en una realización preferida del método de la invención, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, la concentración de polielectrolitos en la solución acusa es de entre 0,5 y 3 mg/mL en NaCl entre 0,1 y 1M. En otra realización todavía más particular del método de la invención, la concentración de polielectrolitos en la solución acusa es de 2 mg/mL en NaCl 0,5 M.

Al igual que la concentración de polilectrolitos, la concentración de nanopartículas magnéticas puede ser muy variable, y dependerá de la cantidad de fuerza magnética que el experto en la materia quiera que posea la nanoestructura de la invención. No obstante, en otra realización preferida del método de la invención, sóla o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, la concentración de nanopartículas magnéticas es de entre 1 a 2 mg/mL.

Asimismo, como entiende el experto en la materia, las capas de polielectrolitos, ya sean al menos 2, 3 o 4, pueden comprender un fluoróforo con la finalidad de identificar la nanoestructura de la invención obtenida mediante el método de la invención. Así, en una realización preferida del método de la invención, la capa de polielectrolitos de la invención comprende un fluorocromo, más preferiblemente, el fluorocromo está unido a PPDA. El término “fluorocromo”, así como ejemplos de fluorocromos, han dicho descritos en el presente documento. No obstante, en otra realización todavía más preferida del método de la invención, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, el fluorocromo es isotiocianato de fluoresceína (FITC).

Tras mezclar de la esfera de poliestireno con una disolución acuosa de polielectrolitos tal como se ha indicado previamente, se obtiene un complejo que comprende la esfera de poliestireno rodeada de una capa de polielectrolitos, y dicho complejo se emplea para llevar a cabo la etapa (a) del método de la invención, es decir, el complejo se pone en contacto con las nanopartículas magnéticas para obtener, en este caso, el núcleo magnético de la nanoestructura de poliestireno la invención. Una vez obtenido el núcleo magnético de la nanoestructura de la invención, se procede con la etapa (b) del método de la invención.

Método de obtención de la nanoestructura de sílice de la invención

En el caso de que la nanoestructura de la invención esté basada en esferas de sílice, en una realización particular del método de la invención, la etapa (a) del método de la invención comprende

(i) mezclar etanol (EtOH) y agua mediante agitación,

(ii) añadir a la mezcla obtenida en (i) amoniaco, tetraetoxisilano (TEOS) y, al menos, dos nanopartículas magnéticas,

(iii) agitar para dar lugar a la formación del núcleo magnético y

(iv) obtener el núcleo magnético formado en (iii) mediante centrifugación y lavado con etanol.

La etapa (i) comprende mezclar EtOH con agua mediante agitación. En una realización preferida del método de la invención, dicha agitación de la etapa (i) se lleva a cabo entre 1.000 y 1.500 rpm durante un tiempo de entre 2 y 10 minutos.

A continuación [etapa (ii)], se procede a añadir amoniaco, TEOS y al menos 2 nanopartículas magnéticas a la mezcla obtenida en la etapa (i) y se agita en la etapa (iii). En una realización particular del método de la invención, la agitación de la etapa (iii) se lleva a cabo entre 500 y 1.000 rpm durante 1 y 5 horas.

Opcionalmente, en otra realización preferida del método de la invención, la etapa (ii) puede comprender la adición de un fluoróforo, que en otra realización todavía más preferida, dicho fluoróforo es FITC. Como sabe el experto en la materia, la adición de un fluoróforo a la mezcla origina que la nanoestructura resultante de aplicar todas las etapas del método de la invención sea fluorescente, pudiendo ser identificada por técnicas de fluorescencia. El término “fluoróforo” y ejemplos de los mismos han sido descritos en párrafos anteriores de la presente descripción.

Una vez terminada la etapa (iii), se obtiene un núcleo magnético, el cuál se procede a aislar en la etapa (iv) del método mediante centrifugación y lavado con etanol. En una realización preferida del método de la invención, la centrifugación de la etapa (iv) se lleva a cabo entre 1.000 y 5.000 rpm durante un tiempo de entre 2 y 10 minutos. La etapa (iv) puede llevarse a cabo tantas veces como sea necesaria hasta conseguir aislar el núcleo magnético con la pureza deseada. No obstante, en una realización preferida del método de la invención, sola o en combinación con las anteriores realizaciones preferidas, la etapa (iv) se lleva a cabo de entre 2 a 5 veces.

Una vez obtenido el núcleo magnético basado en una esfera de poliestireno o en una esfera de sílice, se procede a la etapa (b) del método de la invención, es decir, se pone en contacto el núcleo magnético obtenido en la etapa (a) con un medio de cultivo que comprende una línea celular.

Cualquier medio de cultivo celular se puede emplear para llevar a cabo el método de la invención. Según la línea celular elegida, el experto en la materia sabe cuál es el medio de cultivo más apropiado para el mantenimiento y crecimiento de dicha línea celular. No obstante, en una realización preferida del método de la invención, el medio de cultivo se selecciona de la lista que consiste en DMEM (medio Eagle modificado de Dulbecco), DMEM/F12, MEM (Medio de cultivo células mínimo, en inglésMinimun Eagle Médium),IMDM (El medio Dulbecco modificado de Iscove), RPMI 1640 (medioRoswell Park Memorial Institute1640), McCoy, Ham, BME (Medio Basal Eagle) y EBSS (Solución salina equilibrada de Earle, o inglésEarle's Balanced Salt Solution).

Igualmente, cualquier línea celular emplearse para llevar a cabo el método de la invención. El término "línea celular” tal como se usan en la presente invención, se refieren a células o una población de células de un único tipo de un organismo multicelular (humano, animal o vegetal) que permiten ser cultivadasin vitrodurante periodos prolongados. Es práctica de rutina para un experto en la materia elegir el tipo de línea celular. Ejemplos de líneas celulares incluyen, sin limitar a, HEK 293T o HeLa. No obstante, en una realización preferida del método de la invención, sola o en combinación con todas o cada una de las realizaciones preferidas anteriores, la línea celular es HEK293T.

La línea celular elegida, puede expresar en su membrana al menos una proteína ligando de un virus con envoltura. Líneas celulares que expresen en su membrana al menos una proteína ligando de un virus con envoltura pueden obtenerse mediante ingeniería genética. Es práctica de rutina para el experto en la materia modificar genéticamente una célula para que exprese en su membrana la proteína ligando que se desea de un virus con envoltura, y que estará presente en la nanoestructura de la invención obtenida mediante la aplicación del método de la invención. Los términos "virus con envoltura” y “proteína ligando” han sido definidos anteriormente en la presente descripción, y su definición es aplicable al método de la invención.

Así, en otra realización preferida del método de la invención, sola o en combinación con todas y cada una de las realizaciones preferidas anteriores, la proteína ligando de un virus con envoltura procede de un virus seleccionado de la lista que consiste en: coronavirus de tipo 2 causante del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV-2); virus de la influenza, virus herpes simplex 1 (VHS1), virus herpes simplex 2 (VHS-2), virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), el virus del dengue (DENV), y el virus de la rabia. En otra realización todavía más preferida del método de la invención, la proteína ligando de un virus con envoltura es la proteína espícula de SARS-CoV-2.

Una vez que se han puesto en contacto el núcleo magnético con la línea celular que comprende en su membrana la proteína ligando de un virus con envoltura, la etapa (c) del método de la invención comprende aplicar un campo magnético a las células del medio de cultivo, forzando así la entrada del núcleo magnético al interior de la célula.

Herramientas para generar campos magnéticos son ampliamente conocidos en el estado de la técnica, y cualquiera de ellos puede aplicarse en el contexto del método de la invención. Por ejemplo, y sin limitar a, mediante imanes. En una realización preferida del método de la invención, el núcleo magnético se introduce en el interior de las células mediante la aplicación de un gradiente de campo magnético (por ejemplo 50-70 mT/m) durante un tiempo de entre 2 y 40 horas a una temperatura de entre 30 y 40°C. En otra realización todavía más preferida, sóla o en combinación con las anteriores realizaciones preferidas, el campo magnético se genera mediante la colocación de un imán en la parte inferior del cultivo.

Después de que el núcleo magnético ha entrado en el interior de las células gracias a la aplicación del campo magnético, se procede con la etapa (d) que comprende la eliminación de aquellos núcleos magnéticos que no han entrado en el interior de las células. Esta eliminación se puede hacer mediante lavado, centrifugado o aspirado del medio de cultivo.

En caso de que la eliminación de los núcleos magnéticos no internalizados suponga la eliminación del medio de cultivo, entonces antes de llevar a cabo la etapa (e) del método de la invención, se procede a añadir nuevo medio de cultivo, es decir, medio de cultivo que no contiene núcleos magnéticos.

Finalmente, la etapa (e) del método de la invención comprende aplicar de nuevo un campo magnético al medio de cultivo para extraer los núcleos magnéticos del interior celular, obteniendo tras la extracción un medio de cultivo que comprende la nanoestructura de la invención. De forma análoga a la etapa (c), en una realización preferida del método de la invención, el núcleo magnético se extrae del interior de las células mediante la aplicación de un campo magnético durante un tiempo de entre 2 y 40 horas a una temperatura de entre 30 y 40°C. En otra realización todavía más preferida, sola o en combinación con las anteriores realizaciones preferidas, el campo magnético se genera mediante la colocación de un imán en la parte superior del cultivo.

Opcionalmente, el método de la invención puede comprender una etapa adicional (f) después de la etapa (e) dirigida a aislar del medio de cultivo obtenido en (e) la nanoestructura de la invención. En una realización preferida del método de la invención, sola o en combinación con las anteriores realizaciones preferidas, el aislamiento comprende (i) la centrifugación del medio de cultivo durante un tiempo de entre 1 y 10 minutos en agitación entre 10.000 y 150.000 rpm, (ii) lavar con solución salina, y (iii) filtrar. En otra realización todavía más particular del método de la invención, el filtrado se lleva a cabo mediante un filtro que comprende un tamaño de poro de entre 50 y 500 micras.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. A)Esquema de la síntesis de las nanopartículas de poliestireno con hierro.B)Imágenes de microscopía electrónica de las nanopartículas.

Figura 2. A)Células HEK293T en donde se puede ver teñido el citoplasma de las células y la proteína S del SARS-CoV-2 como unos pequeños puntitos en la membrana.B)Células HEK293T con el núcleo y la proteína S del SAR-CoV-2 como unos pequeños puntitos en la membrana. En unos puntos más brillantes se observan las NPs en el interior de las células.

Figura 3. A)Esquema de la entrada y la salida en la célula de las nanopartículas. 1-entrada de las nanopartículas atravesando la membrana ,2- Nanopartículas en el citoplasma de la célula, 3- Nanopartículas en el citoplasma celular próximo a la membrana ,4- Nanopartícula en las proximidades de la membrana celular a punto de salir ,5- Nanopartículas saliendo de la célula recubiertas con membrana celular.B)Imágenes de microscopía electrónica de las nanopartículas. 1- entrada de las nanopartículas atravesando la membrana ,2- Nanopartículas en el citoplasma de la célula, 3- Nanopartículas en el citoplasma celular próximo a la membrana ,4-Nanopartícula en las proximidades de la membrana celular a punto de salir ,5-Nanopartículas saliendo de la célula recubiertas con membrana celular.

Figura 4.Presencia de la proteína S en las nanopartículas.A)Esquema de las NPs extraídas de las células.B)Imagen de microscopía electrónica de las NPs extraídas de las células.C)Imagen de microscopía electrónica de las NPs saliendo de las células.

D)Detección de la proteína S en las NPs mediante inmunotransferencia.

Figura 5. Esquema de la nanoestructura de poliestireno de la invención.

Figura 6. Esquema de la nanoestructura de silicio de la invención.

EJEMPLOS

Obtención de una nanopartícula con propiedades magnéticas recubierta de membrana plasmática con proteína espícula idéntica a la del SARS-CoV-2

MATERIALES y MÉTODOS

La síntesis de nanopartículas (NPs) de óxido de hierro (magnéticas) se lleva a cabo siguiendo el método descrito enMassart R., et al, Preparation of Aqueous Magnetic Liquids in Alkaline and Acidic Media. IEEE Trans Magn. 1981;17:1247-8.Así, 1 mL de una solución acuosa (2M) de FeSO4-7H2O (disuelta en una solución de (2M) HCl) y 4 mL de una solución (1M) de FeCE6H<2>O se vierten rápidamente en 50 mL de una solución de NH<4>OH (0,34 M) (29 % en peso) con agitación mecánica. Se mantiene la agitación durante 30 minutos y finalmente se deja sedimentar las nanopartículas. Después de 5 ciclos de lavado (agua) de sedimentación y decantación del sobrenadante, las nanopartículas de óxido de hierro se dispersan en 50 mL en agua ultrapura.

Para producir las nanoestructuras de poliestireno (PS) en combinación con NPs de óxido de hierro, se diluyeron 130 ^L de esferas de poliestireno (100 mg/mL) en agua ultrapura. Posteriormente, se añadieron 15 mL de PPDA (1 mg/mL en solución de NaCl 0,5 M) bajo ultrasonicación suave y se agitó durante 1 hora. El exceso de PPDA se eliminó mediante 3 ciclos de centrifugación en agua ultrapura. Luego se agregaron 15 mL de poli(4-estirenosulfato sódico) (PSS) (1 mg/mL en solución de NaCl 0,5 M) y se repitió el procedimiento hasta completar 4 capas de polielectrolitos alternados, siguiendo el protocolo de capa por capa descrito enCaruso F, Spasova M, Susha A, Giersig M, Caruso RA. Magnetic Nanocomposite Particles and Hollow Spheres Constructed by a Sequential Layering Approach. Chem Mater, American Chemical Society;13:109-16.

Las esferas de PS con cuatro las capas de polielectrolitos se dispersaron en 10 mL de agua ultrapura. Finalmente, 160 ^L de la solución recién preparada de nanopartículas de óxido de hierro se diluyeron hasta 5 mL en agua ultrapura y se mezclaron con la solución de PS recubierta de polielectrolito. La mezcla se agitó durante 1 hora. Posteriormente, los coloides obtenidos se lavaron mediante 3 ciclos de centrifugación.

Adicionalmente, para que las nanoestructuras fueran fluorescentes, se añadió una bicapa de PSS (poli(4-estirenosulfato sódico) y PPDA-FITC y (poli(cloruro de dialildimetilamonio) con isotiocianato de fluoresceína) siguiendo el procedimiento anterior.

Mediante dichos procedimientos se obtuvieron nanopartículas esféricas de dimensiones similares al virus (50 a 500 nm de diámetro) magnéticas y fluorescentes, de naturaleza poliestireno, favoreciendo la entrada y la salida de las células empleando fuerza magnética y que se pueden visualizar mediante técnicas de microscopía electrónica (Figura 1).

La línea celular mutante HEK293T SARS-CoV-2 con espícula (Innoprot, P30910) se ha desarrollado transfectando el plásmido SARS-CoV-2 Spike D614G de manera estable en la línea celular HEK293T, lo cual hace que tenga niveles constantes de expresión de la proteína de la espícula del SARS-CoV-2 en su superficie celular. Se sembraron 50 x 103 células en una placa de cultivo de 60mm. De esta manera se sobre-expresa la proteína Spike o "S” que da lugar a la corona (típica de toda la familia de coronavirus) en líneas celulares humanas que expresen la proteína Spike.

A las 24 horas se añadieron 50^g de nanopartículas en la placa de 60mm y se colocó justo debajo un imán redondo de 63 mm de diámetro (P750/TCN-63, supermagnete). Esto se mantuvo en el incubador de las células a 37°C durante 24 horas. Se esperará 24h para que penetren las nanopartículas dentro de las células. Pasado ese tiempo, se eliminarán las partículas que no hayan entrado en las células mediante la eliminación del medio de cultivo. Se añadió medio de cultivo nuevo y esta vez se colocó el imán en la parte superior de la placa de cultivo. Se mantuvo así durante 48h. Se recogió todo el medio celular donde se encuentran las nanopartículas y se centrifugó 5 minutos a 13000rpm y se lavó dos veces con PBS. Finamente se pasaron por un filtro de 200 micras de poro, para eliminar los posibles restos celulares.

RESULTADOS

Las nanopartículas obtenidas se estudiaron al microscopio electrónico de transmisión (Figura 2), donde se puede observar claramente la nanopartícula de poliestereno rodeada de nanopartículas de óxido de hierro alrededor, con un tamaño comprendido entre 200-500nm.

En cuanto a los estudios celulares, primero se comprobó la existencia de la proteína S en las células HEK293T y la entrada de las nanopartículas fluorescentes en esta línea celular. Todo ello se llevó a cabo mediante microscopía de fluorescencia como se muestra en la Figura 1. En la Figura 1A se pueden observar las células HEK293T, su citoplasma, y la proteína S del SARS-CoV-2. En la Figura 1B se pueden observar las células HEK293T, su núcleo y la proteína S del SAR-CoV-2. Además, se pueden observar las NPs que están en el interior de las células. Mediante estas fotos de fluorescencia queda demostrado que las células HEK293T tiene la proteína S en su membrana y también que las nanopartículas que se han sintetizado y van a ser utilizadas en el experimento entran perfectamente en las células.

El siguiente paso evaluado fue estudiar la trayectoria de las NPs en el interior de la célula. Como se ha descrito en el apartado de materiales y métodos, las NPs son introducidas en las células mediante la colocación de un imán en la parte inferior de la placa de cultivo, por lo que las NPs atravesarán la membrana celular y se ubicarán en el citoplasma de la célula (Figura 3A, #1, #2 y #3). Una vez que las NPs están dentro de las células, se coloca un imán en la parte superior, y las nanopartículas salen de la célula por gemación forzada, semejante al "budding” vírico, y recubiertas la membrana que expresa la proteína S del SARS-CoV-2 (Figura 3A, Figura 4 y Figura 5). Para visualizar y analizar estos procesos, se utilizaron imágenes de microscopía electrónica. En la Figura 3B (#1 a #5) se muestra una representación de estas imágenes, donde se pueden observar las NPs en cada uno de los diferentes pasos mencionados anteriormente. Este enfoque experimental proporciona información sobre la internalización de las NPs en las células, y la liberación posterior de las NPs rodeadas de la proteína S viral permitiendo su uso en estudios de interacción celular y ensayos de inhibidores víricos o de inmunización

Estudio de la obtención de las NPs recubiertas con la membrana del virus. Para demostrar la existencia de la membrana vírica alrededor de las NPs, y por tanto del virus sintético (Figura 4A) que propone esta invención, se llevaron a cabo tres estudios diferentes. Por un lado, se analizó el virus sintético mediante microscopía electrónica de transmisión (Figura 4B) y se observó que las imágenes obtenidas son bastante diferentes a las de las NPs sin recubrir (Figura 2B), existiendo un claro recubrimiento alrededor de la NP. Se estudió, también por microscopía electrónica, el momento en el que las NPs salen de la célula con la membrana alrededor, como se puede ver claramente en la Figura 4C. Y, por último, se analizó la presencia de la proteína S mediante inmunotrasnferencia (Figura 4D), una técnica de laboratorio ampliamente utilizada en biología molecular y bioquímica para detectar y analizar proteínas específicas presentes en una muestra biológica.

CONCLUSIONES

El sistema es seguro, escalable y fácil de manipular, proporciona las mismas características de tamaño y envoltura que el virus, pero que carece de capacidad infectiva (sin material genético). Esto permite emplear estas partículas tanto en inmunización como en investigación de inhibidores víricos o validación de anticuerpos, evitando todos los problemas de bioseguridad que serían necesarias en caso de usar partículas víricas.

Las ventajas de este sistema basado en nanobiotecnología es que las partículas se pueden emplear en: (i) inmunización, (ii) estudios de compuestos para la inhibición de los mismos mecanismos de penetración de los virus; (iii) estudios para la selección de anticuerpos frente a diferentes virus; (iv) desarrollo de kits de inmunodetección, entre otras aplicaciones. La versatilidad del sistema en enorme, permitiendo expresar diferentes proteínas ligando víricas (por ejemplo, la proteína Spike) y que el sistema sea aplicable a cualquier virus con envoltura.

Claims (48)

REIVINDICACIONES

1. Una nanoestructura que comprende un núcleo magnético recubierto por uno o más componentes celulares, donde dicho núcleo magnético comprende nanopartículas magnéticas.

2. Nanoestructura según la reivindicación 1, donde el componente celular es una membrana celular, un ácido nucleico, o un componente del citoplasma celular.

3. Nanoestructura según la reivindicación 2, donde la membrana celular comprende, al menos, una proteína ligando de un virus con envoltura.

4. Nanoestructura según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde las nanopartículas magnéticas son nanopartículas de óxido de hierro.

5. Nanoestructura según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el núcleo magnético comprende al menos una esfera de poliestireno.

6. Nanoestructura según la reivindicación 5, donde la esfera de poliestireno está rodeada por, al menos, dos capas de polielectrolitos.

7. Nanoestructura según la reivindicación 6, donde la capa de polielectrolitos comprende poli(4-estirenosulfato sódico) (PSS) y/o poli(cloruro de dialildimetilamonio) (PPDA).

8. Nanoestructura según la reivindicación 7, que comprende adicionalmente una bicapa de PSS y PPDA, donde PPDA lleva unido un fluorocromo.

9. Nanoestructura según la reivindicación 8, donde el fluorocromo es isotiocianato de fluoresceína (FITC).

10. Nanoestructura según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, donde las capas de polielectrolitos están rodeadas por las nanopartículas magnéticas.

11. Nanoestructura según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el núcleo magnético comprende al menos una esfera de sílice.

12. Nanoestructura según la reivindicación 11, donde la esfera de sílice comprende en su interior las nanopartículas magnéticas.

13. Nanoestructura según la reivindicación 12, donde la esfera de sílice comprende embebidas, al menos, dos nanopartículas magnéticas.

14. Nanoestructura según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, donde la esfera de sílice comprende un fluoróforo.

15. Nanoestructura según la reivindicación 14, donde el fluorocromo es isotiocianato de fluoresceína (FITC).

16. Nanoestructura según una cualquiera de las reivindicaciones3 a 15, donde la proteína ligando de un virus con envoltura procede de un virus seleccionado de la lista que consiste en: coronavirus de tipo 2 causante del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV-2); virus de la influenza, virus herpes simplex 1 (VHS1), virus herpes simplex 2 (VHS-2), virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), el virus del dengue (DENV), y el virus de la rabia.

17. Nanoestructura según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 15, donde la proteína ligando de un virus con envoltura es la proteína espícula de SARS-CoV-2.

18. Una composición que comprende una nanoestructura según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, preferiblemente, además comprende un vehículo y/o excipiente.

19. Composición según la reivindicación 18, donde la composición es una composición farmacéutica.

20. Composición según la reivindicación 18 o 19, donde el vehículo y/o excipiente son farmacéuticamente aceptables.

21. Composición según una cualquiera de la las reivindicaciones 18 a 20, donde la composición está formulada para su administración parenteral.

22. Nanoestructura según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, o composición según una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21, para su uso como medicamento.

23. Nanoestructura según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, o composición según una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21, para su uso como vacuna.

24. Uso de una nanoestructura según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, para el análisisin vitrode compuestos capaces de inhibir virus, para la validación in vitro de anticuerpos o como sistemain vitrode biopsia intracelular.

25. Método in vitro para obtener una nanoestructura según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, que comprende:

(a) poner en contacto nanopartículas magnéticas con un medio de soporte para obtener un núcleo magnético,

(b) poner en contacto el núcleo magnético obtenido en (a) con un medio de cultivo que comprende una línea celular;

(c) aplicar un campo magnético a las células del medio de cultivo, forzando así la entrada del núcleo magnético al interior de la célula;

(d) eliminar aquellos núcleos magnéticos que tras el paso (c) no hayan entrado en las células, y

(e) aplicar de nuevo un campo magnético al medio de cultivo para extraer los núcleos magnéticos del interior celular, obteniendo tras la extracción un medio de cultivo que comprende una nanoestructura según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16.

26. Método según la reivindicación 25, donde las nanopartículas magnéticas son nanopartículas de óxido de hierro.

27. Método según la reivindicación 25 o 26, donde la línea celular expresa en su membrana celular al menos una proteína ligando de un virus con envoltura.

28. Método según cualquiera de las reivindicaciones 25 a 27, donde el medio de soporte es una esfera de poliestireno.

29. Método según la reivindicación 28, donde previamente a la etapa (a), el método comprende mezclar al menos una esfera de poliestireno con una disolución acuosa de polielectrolitos mediante agitación por sonicación con ondas ultrasónicas de baja intensidad durante un tiempo de entre 0,5 y 4 horas, obteniendo así un complejo que comprende la esfera de poliestireno rodeada de una capa de polielectrolitos.

30. Método según la reivindicación 29, donde la disolución acuosa de polielectrolitos comprende poli-4-estirenosulfato sódico (PSS) y/o poli(cloruro de dialildimetilamonio) (PPDA).

31. Método según la reivindicación 29 o 30, donde la concentración de polielectrolitos en la solución acusa es de entre 0,5 y 3 mg/mL en NaCl entre 0,1 y 1M.

32. Método según la reivindicación 31, donde la concentración de polielectrolitos en la solución acusa es de 2 mg/mL en NaCl 0,5 M.

33. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 25 a 32, donde la concentración de nanopartículas magnéticas es de entre 1 a 2 mg/mL.

34. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 30 a 33, donde PPDA lleva unido un fluoróforo.

35. Método según la reivindicación 34, donde el fluorocromo es isotiocianato de fluoresceína (FITC).

36. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 25 a 27, donde la etapa (a) comprende

(i) mezclar etanol (EtOH) y agua mediante agitación,

(ii) añadir a la mezcla obtenida en (i) amoniaco, tetraetoxisilano (TEOS) y, al menos, dos nanopartículas magnéticas,

(iii) agitar para dar lugar a la formación del núcleo magnético y

(iv) obtener el núcleo magnético formado en (iii) mediante centrifugación y lavado con etanol.

37. Método según la reivindicación 36, donde la etapa (ii) comprende la adición de un fluoróforo.

38. Método según la reivindicación 37, donde el fluoróforo es FITC.

39. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 36 a 38, donde la agitación de la etapa (iii) se lleva a cabo entre 500 y 1000 rpm durante un tiempo de entre 1 a 5 horas.

40. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 36 a 39, donde la centrifugación de la etapa (iv) se lleva a cabo entre 1000 y 5000 rpm durante un tiempo de entre 2 y 10 minutos.

41. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 25 a 40, donde la aplicación del campo magnético de las etapas (c) y (e) se lleva a cabo durante un tiempo de entre 2 y 48 horas a una temperatura de entre 30 y 40 °C.

42. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 25 a 41, donde el método comprende una etapa (f) después de la etapa (e), que comprende el aislamiento del medio de cultivo de una nanoestructura según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17.

43. Método según la reivindicación 42, donde el aislamiento comprende (i) la centrifugación del medio de cultivo durante un tiempo de entre 1 y 10 minutos en agitación entre 10.000 y 150.000 rpm, (ii) lavar con solución salina, y (iii) filtrar.

44. Método según la reivindicación 43, donde el filtrado se lleva a cabo mediante un filtro que comprende un tamaño de poro de entre 50 y 500 micras.

45. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 25 a 44, donde la línea celular que expresa en su membrana al menos una proteína ligando de un virus con envoltura es HEK293T.

46. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 45, donde la proteína ligando de un virus con envoltura procede de un virus seleccionado de la lista que consiste en: coronavirus de tipo 2 causante del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV-2); virus de la influenza, virus herpes simplex 1 (VHS1), virus herpes simplex 2 (VHS-2), virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), el virus del dengue (DENV), y el virus de la rabia.

47. Método según la reivindicación 46, donde la proteína ligando de un virus con envoltura es la proteína espícula de SARS-CoV-2.

48. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 25 a 47, donde el medio de cultivo se selecciona de la lista que consiste en DMEM, DMEM/F12, MEM, IMDM, RPMI 1640, McCoy, Ham, BME y EBSS.