ES3034914A1 - ELECTROCHEMICAL BIOSENSOR AND METHOD FOR THE DETECTION OR QUANTIFICATION OF AN ANALYTE - Google Patents
ELECTROCHEMICAL BIOSENSOR AND METHOD FOR THE DETECTION OR QUANTIFICATION OF AN ANALYTEInfo
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Abstract
Description
DESCRIPCIÓNDESCRIPTION
Biosensor electroquímico y método para la detección o cuantificación de un analitoElectrochemical biosensor and method for the detection or quantification of an analyte
SECTOR DE LA TÉCNICA TECHNICAL SECTOR
La presente invención se relaciona con biosensores electroquímicos. The present invention relates to electrochemical biosensors.
ESTADO ANTERIOR DE LA TÉCNICA PRIOR STATE OF THE ART
Los sensores electroquímicos son conocidos para la determinación y/o cuantificación de analitos presentes en muestras líquidas. Un «sensor electroquímico» es un dispositivo que registra cambios en la corriente eléctrica o potencial derivados de su interacción con el analito de interés. Estos cambios son transducidos a una señal eléctrica que se puede correlacionar con una cantidad, una concentración o un nivel del analito de interés en una muestra. Electrochemical sensors are well-known for the determination and/or quantification of analytes present in liquid samples. An "electrochemical sensor" is a device that records changes in electrical current or potential resulting from its interaction with the analyte of interest. These changes are translated into an electrical signal that can be correlated with the quantity, concentration, or level of the analyte of interest in a sample.
La portabilidad, el fácil manejo, la capacidad de realizar análisis rápidos con poco pretratamiento de la muestra y pequeños volúmenes de muestra, el procedimiento simple y el bajo costo son algunos de los requisitos previos para una aplicación exitosa en cualquier método analítico. Los biosensores electroquímicos enzimáticos basados en el empleo de electrodos serigrafiados suelen ser una buena solución en respuesta a estas necesidades. No obstante, dependiendo del analito a medir, por ejemplo, en el caso de los nitritos, el oxígeno presente en la muestra y/o zona de reacción puede interferir en la medida dando un resultado analítico erróneo. Portability, ease of use, the ability to perform rapid analyses with little sample pretreatment and small sample volumes, a simple procedure, and low cost are some of the prerequisites for successful application in any analytical method. Enzymatic electrochemical biosensors based on the use of screen-printed electrodes are often a good solution to address these needs. However, depending on the analyte being measured, for example, in the case of nitrites, the oxygen present in the sample and/or reaction zone can interfere with the measurement, giving an erroneous analytical result.
Purgar argón o desgasificar la solución de trabajo antes del análisis suele ser la técnica más comúnmente empleada, pero aparte de esto, se han intentado varios mecanismos de eliminación de oxígeno, como el uso de eliminadores químicos y enzimáticos. Purging argon or degassing the working solution prior to analysis is usually the most commonly employed technique, but other than this, various oxygen removal mechanisms have been attempted, such as the use of chemical and enzymatic scavengers.
EXPOSICIÓN DE LA INVENCIÓN EXPOSURE OF THE INVENTION
El objeto de la invención es el de proporcionar un biosensor electroquímico y un método para la detección y/o cuantificación de al menos un analito, según se define en las reivindicaciones. The object of the invention is to provide an electrochemical biosensor and a method for the detection and/or quantification of at least one analyte, as defined in the claims.
Un primer aspecto de la invención se refiere a un biosensor electroquímico para la detección y/o cuantificación de al menos un analito presente en una muestra líquida, comprendiendo el biosensor una entrada de la muestra líquida, una zona de contactos eléctricos, un sustrato de soporte que comprende al menos un juego de electrodos, dicho juego comprendiendo al menos un electrodo de trabajo y un electrodo de referencia, en donde el electrodo de trabajo comprende al menos una enzima y opcionalmente un mediador cuyos procesos redox (oxidación y/o reducción electroquímica) se dan a un potencial respecto al electrodo de referencia, y una cubierta aislante. El biosensor de la invención comprende entre el sustrato y la cubierta aislante un tramo conectado en comunicación fluídica con la entrada, comprendiendo dicho tramo una cámara de detección en donde se dispone el juego de electrodos, y una salida de muestra líquida que están en comunicación fluídica con el tramo, de tal manera que permite la circulación de la muestra líquida por capilaridad entre la entrada y salida a través del tramo y la cámara de detección. A first aspect of the invention relates to an electrochemical biosensor for the detection and/or quantification of at least one analyte present in a liquid sample, the biosensor comprising an inlet for the liquid sample, an electrical contact area, a support substrate comprising at least one set of electrodes, said set comprising at least one working electrode and a reference electrode, wherein the working electrode comprises at least one enzyme and optionally a mediator whose redox processes (electrochemical oxidation and/or reduction) occur at a potential with respect to the reference electrode, and an insulating cover. The biosensor of the invention comprises between the substrate and the insulating cover a section connected in fluidic communication with the inlet, said section comprising a detection chamber in which the set of electrodes is arranged, and a liquid sample outlet that are in fluidic communication with the section, such that it allows the circulation of the liquid sample by capillarity between the inlet and outlet through the section and the detection chamber.
Un segundo aspecto de la invención se refiere a un método para la detección o cuantificación de al menos un analito disuelto en una muestra líquida mediante el biosensor electroquímico de la invención, comprendiendo el método las siguientes etapas: A second aspect of the invention relates to a method for the detection or quantification of at least one analyte dissolved in a liquid sample by means of the electrochemical biosensor of the invention, the method comprising the following steps:
a) Introducir una cantidad de muestra líquida a analizar a través de la entrada hasta llenar completamente el tramo; a) Introduce a quantity of liquid sample to be analyzed through the inlet until the section is completely filled;
b) Aplicar un potencial al juego de electrodos durante un determinado periodo de tiempo con respecto al electrodo de referencia; b) Apply a potential to the set of electrodes for a certain period of time with respect to the reference electrode;
c) Medir la intensidad de corriente producida por la reacción redox; y c) Measure the current intensity produced by the redox reaction; and
d) Traducir el dato de intensidad de corriente obtenido en la etapa anterior mediante una curva de calibrado obtenida a partir de muestras patrón que comprenden diferentes concentraciones del analito a determinar. d) Translate the current intensity data obtained in the previous stage using a calibration curve obtained from standard samples comprising different concentrations of the analyte to be determined.
Gracias a la invención, las posibles interferencias en el proceso de reacción enzima-mediadoranalito por el efecto de contaminantes o elementos ambientales sobre la muestra se ve disminuido o eliminado, según el caso. Tal y como se muestra en los ejemplos que se aportan, gracias a la invención se minimiza la interferencia debida al oxígeno u otros elementos ambientales presentes durante la medición. La invención además aporta otras ventajas como una mayor simplicidad estructural del biosensor y de método. Thanks to the invention, potential interference in the enzyme-mediator reaction process due to the effect of contaminants or environmental elements on the sample is reduced or eliminated, as appropriate. As shown in the examples provided, the invention minimizes interference due to oxygen or other environmental elements present during the measurement. The invention also offers other advantages, such as greater structural simplicity of the biosensor and the method.
Estas y otras ventajas y características de la invención se harán evidentes a la vista de las figuras y de la descripción detallada de la invención. These and other advantages and features of the invention will become apparent from the figures and the detailed description of the invention.
DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS DESCRIPTION OF THE DRAWINGS
Las figuras 1A y 1B muestran una vista explosionada (Fig. 1A) y no explosionada (Fig. 1B) de un biosensor según una realización de la invención. Figures 1A and 1B show an exploded (Fig. 1A) and non-exploded (Fig. 1B) view of a biosensor according to an embodiment of the invention.
Las figuras 2A y 2B muestran una vista explosionada (Fig. 2A) y no explosionada (Fig. 2B) de un biosensor según otra realización de la invención. Figures 2A and 2B show an exploded (Fig. 2A) and non-exploded (Fig. 2B) view of a biosensor according to another embodiment of the invention.
Las figuras 3A y 3B muestran vista explosionada (Fig. 3A) y no explosionada (Fig. 3B) de un biosensor según otra realización de la invención. Figures 3A and 3B show exploded (Fig. 3A) and non-exploded (Fig. 3B) views of a biosensor according to another embodiment of the invention.
La figura 4 muestra gráficos que representan el funcionamiento de un sensor según unas realizaciones de la invención. Figure 4 shows graphs depicting the operation of a sensor according to embodiments of the invention.
La figura 5 muestra gráficos que representan el funcionamiento comparativo de un biosensor de nitrito según una realización de la invención frente a un biosensor de referencia. Figure 5 shows graphs depicting the comparative performance of a nitrite biosensor according to an embodiment of the invention versus a reference biosensor.
La figura 6 muestra gráficos de la recta de calibrado obtenido con los biosensores de la figura 5. Figure 6 shows graphs of the calibration line obtained with the biosensors in Figure 5.
La figura 7 muestra gráficos que representan el funcionamiento comparativo de un biosensor de nitrito según la realización de la figura 5 en presencia (7B) y en ausencia (7A) de un oxygen scavenger. Figure 7 shows graphs representing the comparative operation of a nitrite biosensor according to the embodiment of Figure 5 in the presence (7B) and absence (7A) of an oxygen scavenger.
EXPOSICIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN DETAILED EXPLANATION OF THE INVENTION
Tal y como se muestra en las figuras 1A a 3B, el biosensor electroquímico de la invención para la detección y/o cuantificación de al menos un analito presente en la muestra líquida, comprende una entrada 10 para la muestra líquida que comprende el analito, una zona 19 de contactos eléctricos, y un sustrato 11 de soporte, en forma de lámina, que comprende al menos un juego de electrodos 12 serigrafiados y una cubierta aislante 13 en forma de lámina. El juego de electrodos comprende al menos un electrodo de trabajo, un electrodo de referencia y opcionalmente un contraelectrodo, en donde el electrodo de trabajo comprende al menos una enzima y opcionalmente un mediador electroquímico depositados, preferiblemente inmovilizados, sobre el mismo, y cuyos procesos redox se dan a un potencial determinado con respecto al electrodo de referencia. Entre el sustrato 11 y la cubierta aislante 13 hay un tramo 18 conectado en comunicación fluídica con la entrada 10 para la muestra líquida, estando en el tramo 18 una cámara de detección 16 en donde se dispone el juego de electrodos 12. En la cámara de detección es donde ocurre la reacción electroquímica. El biosensor también comprende una salida 17 para la muestra líquida que está en comunicación fluídica con el tramo 18, de tal manera que permite la circulación de la muestra líquida por capilaridad entre la entrada 10 y salida 17 a través del tramo 18 y la cámara de detección 16. La entrada 10 y la salida 17 consisten en aberturas en el biosensor que comunican fluídicamente con el tramo 18. As shown in Figures 1A to 3B, the electrochemical biosensor of the invention for the detection and/or quantification of at least one analyte present in the liquid sample, comprises an inlet 10 for the liquid sample comprising the analyte, an area 19 of electrical contacts, and a support substrate 11, in the form of a sheet, comprising at least one set of screen-printed electrodes 12 and an insulating cover 13 in the form of a sheet. The set of electrodes comprises at least one working electrode, a reference electrode and optionally a counter electrode, wherein the working electrode comprises at least one enzyme and optionally an electrochemical mediator deposited, preferably immobilized, thereon, and whose redox processes occur at a determined potential with respect to the reference electrode. Between the substrate 11 and the insulating cover 13 there is a section 18 connected in fluid communication with the inlet 10 for the liquid sample, with a detection chamber 16 in section 18 where the set of electrodes 12 is arranged. The electrochemical reaction occurs in the detection chamber. The biosensor also comprises an outlet 17 for the liquid sample that is in fluid communication with the section 18, such that it allows the circulation of the liquid sample by capillarity between the inlet 10 and outlet 17 through the section 18 and the detection chamber 16. The inlet 10 and the outlet 17 consist of openings in the biosensor that fluidly communicate with the section 18.
Por “inmovilizado” se entiende que está atrapado sobre, o unido químicamente a, la superficie del electrodo. La enzima y el mediador están «inmovilizados» en un sensor, por ejemplo, cuando están unidos de manera covalente, iónica o coordinadamente a los constituyentes del sensor y/o están atrapados en una matriz o membrana polimérica o sol-gel que impide la movilidad de los mismos. "Immobilized" refers to entrapped on, or chemically bound to, the electrode surface. The enzyme and mediator are "immobilized" in a sensor, for example, when they are covalently, ionically, or coordinately bound to the sensor components and/or trapped in a polymeric matrix or membrane or sol-gel that prevents their mobility.
En una realización preferente, tal y como se muestra en las figuras 1A a 3B, en una dirección longitudinal X, el biosensor tiene un extremo proximal X1, un extremo distal X2 y una zona central X3. La zona 19 de contactos eléctricos está en el extremo distal X2 del biosensor, la entrada 10 de muestra líquida está en el extremo proximal X1 y la salida 17 de muestra líquida se dispone en la zona central X3, en una posición anterior a la zona 19 de contactos eléctricos. In a preferred embodiment, as shown in Figures 1A to 3B, in a longitudinal direction X, the biosensor has a proximal end X1, a distal end X2 and a central area X3. The electrical contact area 19 is at the distal end X2 of the biosensor, the liquid sample inlet 10 is at the proximal end X1 and the liquid sample outlet 17 is arranged in the central area X3, in a position before the electrical contact area 19.
En una realización, mostrada en la figura 1A y 1B, la salida 17 consiste en una abertura en la cubierta aislante 13, en una posición anterior a la zona 19 de contactos eléctricos y posterior al juego de electrodos. In one embodiment, shown in Figure 1A and 1B, the outlet 17 consists of an opening in the insulating cover 13, in a position before the electrical contact area 19 and after the set of electrodes.
Tal y como se muestra en las figuras 2A, 2B y 3A, 3B, para un mejor control de la salida de muestra líquida, el tramo 18 que define la cámara de detección 16 comprende al menos un canal fluídico 16a lateral que está en comunicación fluídica con la salida 17 de muestra líquida, estando la salida 17 en un lateral 17a del biosensor. En una realización preferente, en la dirección longitudinal X, el canal fluídico lateral 16a se dispone en una posición posterior al juego de electrodos 12, en un ángulo con respecto a la dirección longitudinal X de entre 90° y 175°, coincidiendo la salida del canal fluídico con la salida 17 de muestra líquida. La disposición de estas salidas de muestra favorece que la muestra líquida cubra la cámara de detección y que cualquier salida de muestra líquida durante el uso de biosensor esté alejada de la zona 19 de contactos eléctricos. La realización del canal fluídico lateral 16a, con ángulo menor a 90° impide aún más el efecto del oxígeno en la reacción. As shown in Figures 2A, 2B and 3A, 3B, for better control of the liquid sample outlet, the section 18 defining the detection chamber 16 comprises at least one lateral fluidic channel 16a that is in fluid communication with the liquid sample outlet 17, the outlet 17 being on a side 17a of the biosensor. In a preferred embodiment, in the longitudinal direction X, the lateral fluidic channel 16a is arranged in a position behind the set of electrodes 12, at an angle with respect to the longitudinal direction X of between 90° and 175°, the outlet of the fluidic channel coinciding with the liquid sample outlet 17. The arrangement of these sample outlets favors the liquid sample covering the detection chamber and that any liquid sample outlet during the use of the biosensor is away from the electrical contact area 19. The construction of the lateral fluidic channel 16a, with an angle less than 90°, further prevents the effect of oxygen on the reaction.
En una realización preferente, la cámara de detección 16 comprende un canal fluídico que está en comunicación fluídica con la entrada 10 de muestra líquida. Este tipo de configuración permite la generación de un canal interno de entrada de muestra líquida hacia la cámara de detección 16. In a preferred embodiment, the detection chamber 16 comprises a fluidic channel that is in fluidic communication with the liquid sample inlet 10. This type of configuration allows the generation of an internal liquid sample inlet channel toward the detection chamber 16.
En las figuras 2A, 2B y 3A, 3B se muestran biosensores con al menos una lámina separadora 14 divida en dos partes 14a y 14b, las cuales definen la geometría que dispondrá el tramo 18 con su cámara de detección y canales fluídicos, una vez la lámina se una al soporte y la cubierta. Figures 2A, 2B and 3A, 3B show biosensors with at least one separating sheet 14 divided into two parts 14a and 14b, which define the geometry that the section 18 will have with its detection chamber and fluidic channels, once the sheet is joined to the support and the cover.
En una realización preferente, el biosensor comprende al menos una lámina separadora 14 entre el sustrato 11 y la cubierta 13. La lámina separadora 14, junto con el sustrato 11 y la cubierta 13 definen el tramo 18 así como su geometría. La lámina separadora 14 tiene dos caras, estando unida o adherida por una de las caras al sustrato 11 y por la otra cara a la cubierta 13. En la realización que no comprende la lámina separadora 14, el sustrato 11 y la cubierta 13 están unidas o adheridas entre sí, de tal manera que dejan un espacio sin unir el cual define el tramo 18, así como su geometría. In a preferred embodiment, the biosensor comprises at least one separator sheet 14 between the substrate 11 and the cover 13. The separator sheet 14, together with the substrate 11 and the cover 13, define the section 18 and its geometry. The separator sheet 14 has two faces, being joined or adhered on one side to the substrate 11 and on the other side to the cover 13. In the embodiment that does not include the separator sheet 14, the substrate 11 and the cover 13 are joined or adhered to each other, such that they leave an unjoined space which defines the section 18 and its geometry.
Con respecto a los materiales, en una realización preferente: With respect to materials, in a preferred embodiment:
- El sustrato 11 de soporte comprende un material aislante y no poroso. A modo de ejemplo no limitativo, el sustrato comprende o consiste en tereftalato de polietileno (PET), policarbonato (PC), poliimida, alúmina u otros materiales cerámicos, papel para electrónica impresa, cloruro de polivinilo (PVC), politetrafluoroetileno (PTFE), preferiblemente PET, PC o alúmina. - The support substrate 11 comprises an insulating, non-porous material. By way of non-limiting example, the substrate comprises or consists of polyethylene terephthalate (PET), polycarbonate (PC), polyimide, alumina or other ceramic materials, paper for printed electronics, polyvinyl chloride (PVC), polytetrafluoroethylene (PTFE), preferably PET, PC or alumina.
- La cubierta aislante 13 comprende un área hidrofílica que está en contacto con el tramo 18. A modo de ejemplo, pero no limitativo, la cubierta comprende o consiste en tereftalato de polietileno (PET), policarbonato (PC), policloruro de vinilo (PVC) o poliéster (PL). La cubierta aislante 13 puede ser translúcida o transparente de tal manera que permite visualizar el juego de electrodos 12 y la cámara de detección 16. - La lámina separadora (14) comprende un material aislante eléctrico seleccionado entre adhesivos sensibles a la presión (PSA) y/o adhesivos térmicos y/o polidimetilsiloxano (PDMS), y/o polietileno (PE), tereftalato de polietileno (PET), policarbonato (PC) y/o polimetilmetacrilato (PMMA) recubiertos de un adhesivo por ambas caras, de tal manera que se adhieran al sustrato y a la cubierta aislante. - The insulating cover 13 comprises a hydrophilic area that is in contact with the section 18. By way of example, but not limited to, the cover comprises or consists of polyethylene terephthalate (PET), polycarbonate (PC), polyvinyl chloride (PVC) or polyester (PL). The insulating cover 13 may be translucent or transparent such that it allows viewing the set of electrodes 12 and the detection chamber 16. - The separator sheet (14) comprises an electrically insulating material selected from pressure sensitive adhesives (PSA) and/or thermal adhesives and/or polydimethylsiloxane (PDMS), and/or polyethylene (PE), polyethylene terephthalate (PET), polycarbonate (PC) and/or polymethylmethacrylate (PMMA) coated with an adhesive on both sides, such that they adhere to the substrate and to the insulating cover.
En una realización preferente, el sustrato 11 comprende PET, la cubierta aislante comprende PL y la lámina separadora 14 comprende PE. In a preferred embodiment, the substrate 11 comprises PET, the insulating cover comprises PL and the separator sheet 14 comprises PE.
Con respecto a la cámara de detección 16, en una realización preferente, la cámara de detección alberga entre 5 y 50 μL, preferiblemente 40 μL, con la ventaja adicional de que no se requieren muestras de gran volumen de muestra líquida de análisis. With respect to the detection chamber 16, in a preferred embodiment, the detection chamber holds between 5 and 50 μL, preferably 40 μL, with the additional advantage that large volume samples of liquid analysis sample are not required.
Con respecto al origen de la muestra líquida, esta puede ser de origen biológico, alimentario o medioambiental, preferiblemente de origen alimentario. La muestra de origen puede ser sometida un pretratamiento que permita la disolución del analito a cuantificar o detectar. A modo de ejemplo pero no limitativo, la muestra puede ser pretratada, por ejemplo, mediante filtración, dilución o pretratamiento con compuestos químicos. Regarding the origin of the liquid sample, it can be of biological, food, or environmental origin, preferably food. The source sample can be pretreated to allow the dissolution of the analyte to be quantified or detected. By way of example, but not limited to, the sample can be pretreated, for example, by filtration, dilution, or pretreatment with chemical compounds.
Con respecto a las dimensiones del biosensor, preferiblemente comprende las siguientes dimensiones: Regarding the dimensions of the biosensor, it preferably comprises the following dimensions:
- el biosensor tiene un tamaño de entre 15 y 20 mm de ancho y 25 y 40 mm de largo y 150 μm y 2,4 mm de grosor, preferiblemente 300 μm. - the biosensor has a size between 15 and 20 mm wide and 25 and 40 mm long and 150 μm and 2.4 mm thick, preferably 300 μm.
- la entrada tiene un tamaño de entre 2 y 5 mm, preferiblemente 3 mm - the inlet has a size between 2 and 5 mm, preferably 3 mm
- la salida tiene un tamaño de entre 2 y 5 mm, preferiblemente 1,5 mm. - the outlet has a size between 2 and 5 mm, preferably 1.5 mm.
- la cámara de detección tiene entre 14 y 17 mm y 6 y 9 mm. - the detection chamber is between 14 and 17 mm and 6 and 9 mm.
- El ancho del canal fluídico es menor que el largo, siendo la anchura de entre 2 y 5 mm, preferiblemente de 1,5 mm. - The width of the fluidic channel is smaller than the length, with the width being between 2 and 5 mm, preferably 1.5 mm.
- El grosor del sustrato, de la cubierta y de la lámina separadora es de entre 50 y 800 μm cada uno, preferiblemente de 100 μm de grosor cada uno. - The thickness of the substrate, cover and separator sheet is between 50 and 800 μm each, preferably 100 μm thick each.
El biosensor de la invención, por lo tanto, comprende unas dimensiones que le permiten un transporte fácil y manipulación por parte del usuario. The biosensor of the invention, therefore, comprises dimensions that allow easy transport and handling by the user.
Con respecto a los mediadores, este puede ser seleccionado entre mediadores orgánicos, inorgánicos, organometálicos o polímeros redox. Regarding the mediators, these can be selected from organic, inorganic, organometallic or redox polymer mediators.
En el caso de mediadores orgánicos, en una realización preferente, este es seleccionado entre viológenos, azul de metileno, verde de metileno, azul de bromofenol, fenotiazinas, fenoxazinas, sales de Wurster, citocromo C, quinoideos y sus derivados, fulvalenos y derivados y/o anilinas, entre otros. In the case of organic mediators, in a preferred embodiment, this is selected from viologens, methylene blue, methylene green, bromophenol blue, phenothiazines, phenoxazines, Wurster salts, cytochrome C, quinoids and their derivatives, fulvalenes and derivatives and/or anilines, among others.
En el caso de los mediadores inorgánicos, este es seleccionado entre complejos de rutenio, cobalto y hexacianoferrato (II y/o III), entre otros. In the case of inorganic mediators, this is selected from ruthenium, cobalt and hexacyanoferrate (II and/or III) complexes, among others.
En el caso de los mediadores organometálicos, estos son seleccionados entre, ferrocenos y derivados, complejos de osmio, hierro y/o rutenio, pentacianoferrato con piridina, pirazol, imidazol o heterociclos, entre otros. In the case of organometallic mediators, these are selected from ferrocenes and derivatives, osmium, iron and/or ruthenium complexes, pentacyanoferrate with pyridine, pyrazole, imidazole or heterocycles, among others.
En el contexto de la invención, por mediador se entiende un compuesto con actividad redox que facilita la transferencia de electrones de la enzima con la superficie electródica una vez que se ha producido la reacción enzimática. El empleo de mediadores para facilitar una catálisis enzimática es necesario en el caso de que la enzima no tenga una transferencia electrónica directa con el electrodo o en el caso de que esta sea poco efectiva. En el primer caso, el mediador permite el transporte de electrones del centro activo de la enzima con la superficie electródica. En el segundo caso, el mediador redox mejora la transferencia electrónica entre enzima y superficie electródica aumentando la eficiencia catalítica y por lo tanto la sensibilidad del dispositivo. In the context of the invention, a mediator is understood to mean a compound with redox activity that facilitates the transfer of electrons from the enzyme to the electrode surface once the enzymatic reaction has occurred. The use of mediators to facilitate enzymatic catalysis is necessary when the enzyme does not have direct electron transfer with the electrode or when this is ineffective. In the first case, the mediator allows the transport of electrons from the active site of the enzyme to the electrode surface. In the second case, the redox mediator improves the electron transfer between the enzyme and the electrode surface, increasing the catalytic efficiency and therefore the sensitivity of the device.
Con respecto al enzima, en una realización preferente, la enzima es seleccionada entre reductasas, oxidasas, deshidrogenasas, y/o oxidorreductasas. En una realización, la enzima es una reductasa y es seleccionada entre nitrito reductasa, nitrato reductasa, citocromo C reductasa, aldehído reductasa, glutatión reductasa, cetona reductasa o acetoacetil-CoA reductasa, entre otras. En otra realización, la enzima es una oxidasa y es seleccionada entre glucosa oxidasa, NAD(P)H oxidasa, alcohol oxidasa o citocromo oxidasa, entre otras. En otra realización, la enzima es una deshidrogenasa y es seleccionada entre glucosa deshidrogenasa, alcohol deshidrogenasa, lactato deshidrogenasa, o glutamato deshidrogenasa, entre otras. En otra realización, la enzima es una oxidorreductasa y es seleccionada entre peroxidasas, hidroxilasas, oxidasas y reductasas, entre otras. With respect to the enzyme, in a preferred embodiment, the enzyme is selected from reductases, oxidases, dehydrogenases, and/or oxidoreductases. In one embodiment, the enzyme is a reductase and is selected from nitrite reductase, nitrate reductase, cytochrome C reductase, aldehyde reductase, glutathione reductase, ketone reductase, or acetoacetyl-CoA reductase, among others. In another embodiment, the enzyme is an oxidase and is selected from glucose oxidase, NAD(P)H oxidase, alcohol oxidase, or cytochrome oxidase, among others. In another embodiment, the enzyme is a dehydrogenase and is selected from glucose dehydrogenase, alcohol dehydrogenase, lactate dehydrogenase, or glutamate dehydrogenase, among others. In another embodiment, the enzyme is an oxidoreductase and is selected from peroxidases, hydroxylases, oxidases and reductases, among others.
Con respecto al juego de electrodos, en una realización preferente el juego de electrodos 12 están serigrafiados sobre el sustrato, donde el electrodo de referencia es serigrafiado con tintas de Ag/AgCl o Ag, preferiblemente de Ag/AgCl, el electrodo de trabajo de tinta de grafito, grafeno, carbono, nanotubos de carbono, oro, platino, preferiblemente de grafito, y en las realizaciones que comprende el contraelectrodo, de grafito, grafeno, carbono, nanotubos de carbono, oro, platino, preferiblemente de grafito. El juego de electrodos 12 puede comprender más de un electrodo de trabajo. With respect to the electrode set, in a preferred embodiment the electrode set 12 are screen-printed on the substrate, where the reference electrode is screen-printed with Ag/AgCl or Ag inks, preferably Ag/AgCl, the working electrode is made of graphite, graphene, carbon, carbon nanotubes, gold, platinum, preferably graphite, and in the embodiments comprising the counter electrode, of graphite, graphene, carbon, carbon nanotubes, gold, platinum, preferably graphite. The electrode set 12 may comprise more than one working electrode.
Un segundo aspecto de la invención se refiere a un método para la detección o cuantificación de al menos un analito disuelto en una muestra líquida mediante el biosensor electroquímico de la invención, que comprende las siguientes etapas: A second aspect of the invention relates to a method for the detection or quantification of at least one analyte dissolved in a liquid sample using the electrochemical biosensor of the invention, which comprises the following steps:
a) introducir una cantidad de muestra líquida a analizar a través de la entrada 10 hasta llenar completamente el tramo 18, a) introduce a quantity of liquid sample to be analyzed through inlet 10 until section 18 is completely filled,
b) aplicar un potencial, preferiblemente constante al juego de electrodos 12 durante un determinado periodo de tiempo, preferiblemente entre 20 y 60 segundos, b) applying a potential, preferably constant, to the set of electrodes 12 for a certain period of time, preferably between 20 and 60 seconds,
c) medir la intensidad de corriente producida por la reacción electroquímica y d) traducir el dato de intensidad de corriente obtenido en la etapa c) mediante una curva de calibrado obtenida a partir de muestras patrón que comprenden diferentes concentraciones del analito a determinar. c) measure the current intensity produced by the electrochemical reaction and d) translate the current intensity data obtained in step c) by means of a calibration curve obtained from standard samples comprising different concentrations of the analyte to be determined.
El potencial aplicado respecto al electrodo de referencia estará determinado por el enzima y mediador a utilizar. A modo de ejemplo, cuando la enzima es una reductasa, en una realización preferente, el potencial es un potencial negativo con respecto al electrodo de referencia, siendo este potencial preferiblemente entre -0.4V y -0.8V The potential applied relative to the reference electrode will be determined by the enzyme and mediator used. For example, when the enzyme is a reductase, in a preferred embodiment, the potential is a negative potential relative to the reference electrode, preferably between -0.4 V and -0.8 V.
Por traducir se entiende correlacionar el dato de intensidad de corriente con el valor de concentración. Translating means correlating the current intensity data with the concentration value.
En una realización preferente, en la etapa a) se introduce una cantidad de muestra líquida a analizar a través de la entrada 10 hasta llenar completamente la cámara de detección 16 forzando la salida de parte de la muestra líquida a analizar a través de la salida 17 de muestra líquida, asegurándose el usuario de que la cámara de detección se cubre o llena con la muestra líquida completamente y que se elimina cualquier presencia de burbuja en el interior de la cámara de detección. In a preferred embodiment, in step a) a quantity of liquid sample to be analyzed is introduced through inlet 10 until the detection chamber 16 is completely filled, forcing the exit of part of the liquid sample to be analyzed through the liquid sample outlet 17, the user ensuring that the detection chamber is completely covered or filled with the liquid sample and that any presence of bubbles inside the detection chamber is eliminated.
Gracias al biosensor y al método de la invención se minimiza la presencia de oxígeno en la cámara de detección, por lo tanto, la interferencia del oxígeno en la reacción. Thanks to the biosensor and the method of the invention, the presence of oxygen in the detection chamber is minimized, therefore, the interference of oxygen in the reaction.
A continuación, se describen algunos ejemplos ilustrativos que ponen de manifiesto las características y ventajas de la invención, no obstante, no se deben interpretar como limitativos del objeto de la invención tal como está definido en las reivindicaciones. Below are some illustrative examples that demonstrate the characteristics and advantages of the invention; however, they should not be construed as limiting the object of the invention as defined in the claims.
Ejemplos Examples
Ejemplo 1: Funcionamiento de distintos mediadores en un sensor de la invención sin enzimaExample 1: Functioning of different mediators in a sensor of the invention without enzyme
Se fabricaron sensores de la invención, cada sensor comprendiendo un mediador depositado sobre el electrodo de trabajo: Sensors of the invention were manufactured, each sensor comprising a mediator deposited on the working electrode:
- Sustrato: PET - Substrate: PET
- Cubierta aislante: PL - Insulating cover: PL
- Lamina separadora: PE - Separator sheet: PE
- Electrodos serigrafiados: - Screen-printed electrodes:
- Electrodo de trabajo: grafito - Working electrode: graphite
- Electrodo de referencia: Ag/AgCl - Reference electrode: Ag/AgCl
- Contraelectrodo grafito - Graphite counter electrode
- Mediador (uno por biosensor): metil viológeno (A), azul de metileno (B) , safranina (C), azul de bromofenol (D). - Mediator (one per biosensor): methyl viologen (A), methylene blue (B), safranin (C), bromophenol blue (D).
- Electrolito: Disolución de KCl 1M. - Electrolyte: 1M KCl solution.
- Volumen de muestra: 40 μL - Sample volume: 40 μL
Se comparó el resultado con biosensores de referencia, que comprenden los mismos elementos excepto que no llevan una cubierta. The result was compared with reference biosensors, which comprise the same elements except that they do not have a cover.
Equipo de medición: potenciostato comercial. Measuring equipment: commercial potentiostat.
En la figura 4 se representan los voltamperogramas obtenidos con sensores con cubierta (línea continua) con respecto al de referencia ( línea discontínua) con cada mediador. En el eje x se muestran los datos de potencial aplicado y en el eje y la corriente registrada. Tal y como se puede observar en los gráficos de la figura 4, con los sensores con cubierta se obtienen curvas con picos de reducción mejor definidos y con potenciales menos negativos que con los sensores sin cubierta. Los procesos redox registrados con el sensor con cubierta muestran una mejor definición de los procesos electroquímicos de reducción, hecho que se debe principalmente al registro de una menor corriente de fondo, debido a la eliminación de la aportación a ésta de la reducción directa del oxígeno sobre la superficie electródica y/o de la interacción del oxígeno con el proceso redox del mediador/enzima. Figure 4 shows the voltammograms obtained with sheathed sensors (solid line) with respect to the reference (dashed line) for each mediator. The x-axis shows the applied potential data, and the y-axis shows the recorded current. As can be seen in the graphs in Figure 4, sheathed sensors produce curves with better-defined reduction peaks and less negative potentials than unsheathed sensors. The redox processes recorded with the sheathed sensor show a better definition of the electrochemical reduction processes. This is mainly due to the lower background current recorded, due to the elimination of the contribution of direct reduction of oxygen on the electrode surface and/or the interaction of oxygen with the redox process of the mediator/enzyme.
Ejemplo 2: Biosensor de nitritoExample 2: Nitrite biosensor
Se fabricaron biosensores con cubierta y sin cubierta para la cuantificación de nitrito. Sheathed and unsheathed biosensors were fabricated for nitrite quantification.
Materiales: Materials:
- Sustrato: PET - Substrate: PET
- Cubierta aislante: PL - Insulating cover: PL
- Lamina separadora; PE - Separator sheet; PE
- Electrodos serigrafiados: - Screen-printed electrodes:
- Electrodo de trabajo: grafito - Working electrode: graphite
- Electrodo de referencia: Ag/AgCl - Reference electrode: Ag/AgCl
- Contraelectrodo grafito - Graphite counter electrode
- Mediador y enzima: metil viológeno y nitrito reductasa - Mediator and enzyme: methyl viologen and nitrite reductase
- Volumen de muestra: 40 μL - Sample volume: 40 μL
- Potencial aplicado: -0.725 V - Applied potential: -0.725 V
- Tiempo de aplicación de potencial: 60 s - Potential application time: 60 s
Claims (18)
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| ES202430122A ES3034914A1 (en) | 2024-02-20 | 2024-02-20 | ELECTROCHEMICAL BIOSENSOR AND METHOD FOR THE DETECTION OR QUANTIFICATION OF AN ANALYTE |
| PCT/ES2025/070088 WO2025176927A1 (en) | 2024-02-20 | 2025-02-20 | Electrochemical biosensor and method for detecting or quantifying an analyte |
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| ES202430122A ES3034914A1 (en) | 2024-02-20 | 2024-02-20 | ELECTROCHEMICAL BIOSENSOR AND METHOD FOR THE DETECTION OR QUANTIFICATION OF AN ANALYTE |
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Citations (5)
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2024
- 2024-02-20 ES ES202430122A patent/ES3034914A1/en active Pending
-
2025
- 2025-02-20 WO PCT/ES2025/070088 patent/WO2025176927A1/en active Pending
Patent Citations (5)
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2025176927A1 (en) | 2025-08-28 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BA2A | Patent application published |
Ref document number: 3034914 Country of ref document: ES Kind code of ref document: A1 Effective date: 20250826 |