ES3009108T3 - Hla-b57 open conformers - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a un confórmero abierto HLA-B57 o a una proteína de fusión HLA-B57 Fc para su uso en el tratamiento o la prevención del cáncer. El confórmero abierto Fc comprende o consiste en un primer y un segundo monómero, y cada monómero comprende una cadena HLA-B57. La proteína de fusión Fc comprende además una secuencia polipeptídica estabilizadora de proteínas y, opcionalmente, un enlazador de aminoácidos. Otros aspectos de la invención proporcionan medicamentos combinados que comprenden el confórmero abierto HLA-B57 Fc y agentes inhibidores y/o agonistas de puntos de control inmunitario. Asimismo, la invención se refiere al uso del confórmero abierto HLA-B57 como inmunomodulador, particularmente en enfermedades donde la modulación de diversos componentes de las células inmunitarias (p. ej., linfocitos T CD8+ citotóxicos, Tregs) es una estrategia terapéutica, p. ej., enfermedades infecciosas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Confórmenos abiertos HLA-B57

[0001]La presente invención se refiere al uso de confórmenos abiertos HLA-B57, particularmente para su uso en la profilaxis o el tratamiento del cáncer, y para su uso como inmunomodulador.

[0002]Los antígenos leucocitarios humanos (HLA) pertenecen a la familia de proteínas del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) clásico. El complejo HLA ayuda al sistema inmunológico a distinguir las proteínas propias del cuerpo de las proteínas producidas por invasores extraños, como virus y bacterias. Los seres humanos tienen tres genes principales del CMH de clase I clásico, conocidos como HLA-A, HLA-B y HLA-C. Los genes HLA clásicos tienen muchas variaciones posibles, lo que permite que el sistema inmunológico de cada persona reaccione a una amplia gama de invasores extraños. Algunos genes HLA tienen cientos de versiones identificadas (alelos), a cada una de las cuales se le asigna un número particular (como HLA-B57). Los alelos estrechamente relacionados se clasifican juntos; por ejemplo, al menos 82 alelos muy similares son subtipos de HLA-B57. Estos subtipos se designan como HLA-B*5701 a HLA-B*5782, y el estrechamente relacionado HLA-B*5801.

[0003]Las moléculas clásicas CMH-I (denominadas HLA-I en humanos) son estructuras triméricas que comprenden una cadena pesada unida a la membrana con tres dominios extracelulares (al, a2 y a3) que se asocia de forma no covalente con p2-microglobulina (p2m) y un péptido pequeño. Las cadenas pesadas de HLA I pueden existir en una forma no asociada a p2-microglobulina o péptido. Estas formas se denominan confórmeros abiertos.

[0004]Como todas las demás moléculas de HLA, la función principal de HLA-B57 es presentar péptidos derivados de células a los linfocitos T citotóxicos CD8+ (LTC), como parte de la respuesta inmunitaria adaptativa. En condiciones fisiológicas normales, las moléculas de HLA-B57 forman complejos heterotriméricos que consisten en cadenas pesadas de B57, p2-microglobulina y péptidos que se derivan de proteínas propias, virus o bacterias. En este sentido, HLA-B57 se parece a todos los demás alelos de<h>L<a>de clase I. Sin embargo, las moléculas de HLA también pueden estar presentes en las células como cadenas pesadas libres que carecen de p2m-microglobulina y péptido, y pueden denominarse confórmeros abiertos de HLA-B57 (Arosa et al. Open conformers: the hidden face of CMH-I molecule, Trends in Immunology 2007 Mar; 28(3):115-23).

[0005]El cáncer es un grupo de enfermedades caracterizadas por células anormales del cuerpo. Las células cancerosas pueden propagarse por el cuerpo y hacer metástasis para formar tumores; este patrón de crecimiento se denomina maligno. El cáncer se puede tratar mediante cirugía, quimioterapia, radioterapia, terapia hormonal, terapia dirigida e inmunoterapia. La elección de la terapia depende del tipo de cáncer, el paso del cáncer (cuánto se ha propagado), la edad, el estado de salud y otras características personales. No existe un único tratamiento para el cáncer y los pacientes a menudo reciben una combinación de terapias y cuidados paliativos.

[0006]La inmunoterapia contra el cáncer se refiere a un conjunto diverso de estrategias terapéuticas diseñadas para inducir al propio sistema inmunológico del paciente a combatir el tumor, y se basa en la idea de que la progresión del cáncer, que implica la acumulación de diversas mutaciones, es monitoreada por el sistema inmunológico. Las inmunoterapias estimulan las actividades de componentes celulares específicos del sistema inmunológico o contrarrestan las señales producidas por las células cancerosas que suprimen las respuestas inmunológicas (Mahoney et al., Nat Rev Drug Discov. 2015 Ago;14(8):561-84).

[0007]Diferentes tipos de células inmunes están involucradas en la respuesta inmune contra el cáncer. Dentro de este grupo de glóbulos blancos (contextura inmune), las células más notorias son: células T (células T CD8+ citotóxicas, células T colaboradoras CD4+ - fenotipo Th1, Th2 y Th17), células T reguladoras (Tregs), macrófagos (tipo M1 -proinflamatorias y tipo M2 -protumorales), células supresoras derivadas de mieloides (MDSCs), células asesinas naturales (células NK) y células dendríticas (CD). Estas células inmunes pueden estar ubicadas en el centro del tumor, en el margen invasivo o en las estructuras linfoides terciarias adyacentes (Fridman et al., Nat. Rev. Cancer. 2012, abril:12, 298-306).

[0008]La densidad y la composición del microambiente inmunitario es heterogénea entre pacientes y tumores. Actualmente está bien establecido que, en general, la infiltración tumoral con macrófagos de fenotipo M2 y células supresoras derivadas de mieloides (MDSC) promueve la progresión tumoral, mientras que la infiltración de células T CD8+ citotóxicas, células de fenotipo Th1 y macrófagos de tipo M1 a menudo se asocian con un buen resultado clínico y una buena respuesta a la inmunoterapia. El impacto clínico de otras poblaciones de células linfoides y mieloides es menos consistente y parece depender del tipo y estadio del tumor. La presencia de células Th17 y NK, y la ausencia/reducción de células Treg en infiltrados tumorales se correlaciona con un buen resultado en algunas indicaciones de cáncer (Giraldo et al., Current Opinion in Immunology 2014, 27:8-15). En la figura 1 se analiza una descripción general del equilibrio entre los infiltrados de leucocitos y el resultado clínico. (Becht et al. Current Opinion in Immunology. 2016, 39:17-13).

[0009]En general, modular la contextura inmune de los tumores favoreciendo la infiltración de macrófagos de tipo M1, células T CD8 citotóxicas y células Th1, y/o reduciendo la infiltración de MDSC y macrófagos de tipo M2 es una enorme vía terapéutica para tratar el cáncer que se explora aquí con el uso de proteínas B572-Fc en diversas indicaciones de cáncer.

Términos y definiciones

[0010]Las secuencias de aminoácidos se dan desde el extremo amino hasta el extremo carboxilo. Las letras mayúsculas para las posiciones de secuencia se refieren a los L-aminoácidos en el código de una letra (Stryer, Biochemistry, 3.a ed., pág. 21).

[0011]El términoconfórmero abiertotal como se utiliza en la presente memoria descriptiva se refiere a una molécula de cadena pesada de HLA aislada no asociada a p2-microglobulina ni como monómero ni como dímero (homodímero o heterodímero). Ciertas formas de realización de los confórmeros abiertos descritos en el presente documento son monómeros o dímeros de proteínas de fusión, en los que la cadena pesada de HLA está unida covalentemente a una región polipeptídica estabilizadora, en particular un dominio de inmunoglobulina de fragmento cristalizable. En el contexto de la presente memoria descriptiva, los términosidentidad de secuenciayporcentaje de identidad de secuenciase refieren a los valores determinados mediante la comparación de dos secuencias alineadas. Los métodos para la alineación de secuencias para comparación son bien conocidos en la técnica. La alineación de secuencias para comparación puede realizarse mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), mediante el algoritmo de alineación global de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), mediante el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Nat. Acad. Sci. 85:2444 (1988) o mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos, incluidos, entre otros: CLUSTAL, GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA. El software para realizar análisis BLAST está disponible públicamente, por ejemplo, a través del Centro Nacional de Información Biotecnológica (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/). Un ejemplo de comparación de secuencias de aminoácidos es el algoritmo BLASTP que utiliza la configuración predeterminada: Umbral de expectativa: 10; Tamaño de palabra: 3; Máximo de coincidencias en un rango de consulta: 0; Matriz: BLOSUM62; Costos de brecha: Existencia 11, Extensión 1; Ajustes de composición: Ajuste de matriz de puntuación de composición condicional. Un ejemplo de comparación de secuencias de ácidos nucleicos es el algoritmo BLASTN, que utiliza los siguientes parámetros predeterminados: Umbral de expectativa: 10; Tamaño de palabra: 28; Máximo de coincidencias en un rango de consulta: 0; Puntuaciones de coincidencia/discordancia: 1-2; Costes de brecha: lineales. A menos que se indique lo contrario, los valores de identidad de secuencia que se proporcionan en este documento se refieren al valor obtenido con el conjunto de programas BLAST (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)) utilizando los parámetros predeterminados identificados anteriormente para la comparación de proteínas y ácidos nucleicos, respectivamente.

[0012]En el contexto de la presente memoria descriptiva, el términocomplejo mayor de histocompatibilidad(CMH) se utiliza en su significado conocido en la técnica de la biología celular y la bioquímica; se refiere a una molécula de la superficie celular que muestra una fracción específica (péptido), también denominada epítopo, de una proteína. Existen dos clases principales de moléculas de CMH: clase I y clase II.

[0013]Las moléculas de cadena pesada de clase I de CMH por lo general (es decir, cuando no están en forma de confórmero abierto) se presentan como una cadena alfa unida a una unidad de la molécula no CMH p2-microglobulina. La cadena alfa comprende, en dirección desde el extremo N al extremo C, un péptido señal, tres dominios extracelulares (a1-3, con a1 en el extremo N), una región transmembrana y una cola citoplasmática en el extremo C. El péptido que se muestra o presenta se sostiene mediante el surco de unión al péptido, en la región central de los dominios a1/a2.

[0014]En el contexto de la presente memoria descriptiva, el término dominio¡52-microglobulinase utiliza en su significado conocido en la técnica de la biología celular y la bioquímica; se refiere a una molécula no CMH que forma parte de la molécula del heterodímero CMH de clase I. En otras palabras, constituye la cadena p del heterodímero CMH de clase I.

[0015]En el contexto de la presente memoria descriptiva, el términoantígeno leucocitario humano (HLA)se utiliza en su significado conocido en la técnica de la biología celular y la bioquímica; se refiere a los loci génicos que codifican las proteínas CMH de clase I humanas. Los tres genes principales de CMH de clase I en HLA son HLA-A, HLA-B y HLA-C y todos estos genes tienen un número variable de alelos, por ejemplo, HLA-B tiene 3590 alelos conocidos. Los alelos estrechamente relacionados se combinan en subgrupos de un alelo determinado. Por ejemplo, el alelo HLA-B57 tiene más de 100 alelos estrechamente relacionados que, según el Comité de Nomenclatura de la OMS para Factores del Sistema HLA, están etiquetados como HLA-B*57:01:01 a HLA-B*57:82. La secuencia completa o parcial de todos los genes HLA conocidos y sus respectivos alelos están disponibles para el experto en la materia en bases de datos especializadas como IMGT/HLA (http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/) y se proporcionan en la tabla 1 de esta especificación.

[0016]En el contexto de la presente memoria descriptiva, el términoagente inhibidor de puntos de controloanticuerpo inhibidor de puntos de controlpretende abarcar un agente, en particular un anticuerpo (o molécula similar a un anticuerpo) capaz de interrumpir la cascada de señales que conduce a la inhibición de las células T después de la activación de las células T como parte de lo que se conoce en la técnica como el mecanismo de punto de control inmunitario. Los ejemplos no limitantes de unagente inhibidor de puntos de controloanticuerpo inhibidor de puntos de controlincluyen anticuerpos contra CTLA-4 (Uniprot P16410), PD-1 (Uniprot Q15116), PD-L1 (Uniprot Q9NZQ7), B7H3 (CD276; Uniprot Q5ZPR3), Tim-3, Gal9, VISTA, Lag3.

[0017]En el contexto de la presente memoria descriptiva, el términoagente agonista de punto de controloanticuerpo agonista de punto de controlpretende abarcar un agente, en particular, pero sin limitarse a, un anticuerpo (o molécula similar a un anticuerpo) capaz de activar la cascada de señales que conduce a la activación de células T como parte de lo que se conoce en la técnica como el mecanismo de punto de control inmunitario. Los ejemplos no limitantes de receptores que se sabe que estimulan la activación de células T incluyen CD122 y CD137 (4-1BB; Uniprot 007011). El términoagente agonista de punto de controloanticuerpo agonista de punto de controlabarca los anticuerpos agonistas de CD137 (4-1BB), CD134 (OX40), CD357 (GITR), CD278 (ICOS), CD27, CD28.

[0018]En el contexto de la presente memoria descriptiva, el términoanticuerpose utiliza en su significado conocido en la técnica de la biología celular y la inmunología; se refiere a anticuerpos completos que incluyen, entre otros, inmunoglobulina de tipo G (IgG), tipo A (IgA), tipo D (IgD), tipo E (IgE) o tipo M (IgM), cualquier fragmento de unión a antígeno o cadenas individuales de los mismos y construcciones relacionadas o derivadas. Un anticuerpo completo es una glicoproteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada está compuesta por una región variable de cadena pesada (Vh) y una región constante de cadena pesada (C<h>). La región constante de cadena pesada está compuesta por tres dominios, C<h>1, CHg2 y Ch3. Cada cadena ligera está compuesta por una región variable de cadena ligera (abreviada en el presente documento como V<l>) y una región constante de cadena ligera (C<l>). La región constante de cadena ligera está compuesta por un dominio, Cl. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar la unión de la inmunoglobulina a los tejidos o factores del huésped, incluidas varias células del sistema inmunitario (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente del sistema del complemento clásico.

[0019]El términomolécula similar a un anticuerpoen el contexto de la presente memoria descriptiva se refiere a una molécula capaz de unirse específicamente a otra molécula o diana con alta afinidad / una Kd < 10E-8 mol/l. Una molécula similar a un anticuerpo se une a su diana de manera similar a la unión específica de un anticuerpo. El términomolécula similar aun anticuerpo abarca una proteína repetitiva, tal como una proteína repetitiva anquirina diseñada (Molecular Partners, Zúrich), un polipéptido derivado de proteínas repetitivas armadillo, un polipéptido derivado de proteínas repetitivas ricas en leucina y un polipéptido derivado de proteínas repetitivas tetratricopeptídicas.

[0020]El términomolécula similar a un anticuerpocomprende además un polipéptido derivado de dominios de proteína A, un polipéptido derivado del dominio de fibronectina FN3, un polipéptido derivado de dominios de consenso de fibronectina, un polipéptido derivado de lipocalinas, un polipéptido derivado de dedos de zinc, un polipéptido derivado del dominio de homología de Src 2 (SH2), un polipéptido derivado del dominio de homología de Src 3 (SH3), un polipéptido derivado de dominios PDZ, un polipéptido derivado de gamma-cristalina, un polipéptido derivado de ubiquitina, un polipéptido derivado de un polipéptido de nudo de cisteína y un polipéptido derivado de una knottina.

[0021]El términopolipéptido derivado de dominios de proteína Ase refiere a una molécula que es un derivado de la proteína A y es capaz de unirse específicamente a la región Fc y a la región Fab de las inmunoglobulinas.

[0022]El términoproteína de repetición de armadillose refiere a un polipéptido que comprende al menos una repetición de armadillo, en donde una repetición de armadillo se caracteriza por un par de hélices alfa que forman una estructura de horquilla.

[0023]En el contexto de la presente especificación, el términoregión de fragmento cristalizable (Fc)se utiliza en su significado conocido en la técnica de la biología celular y la inmunología; se refiere a una fracción de un anticuerpo que comprende dos fragmentos de cadena pesada idénticos compuestos por un dominio CHg2 y un dominio C<h>3, unidos covalentemente por enlaces disulfuro.

[0024]En el contexto de la presente especificación, el términodímerose refiere a una unidad que consta de dos subunidades.

[0025]En el contexto de la presente memoria descriptiva, el términohomodímerose refiere a un dímero compuesto de dos subunidades que son idénticas o son miembros muy similares de la misma clase de subunidades. Un ejemplo de un homodímero sería un dímero que consiste en dos subunidades seleccionadas independientemente de la lista de alelos HLA-B57. En ciertas formas de realización, los homodímeros consisten en dos alelos HLA-B57 idénticos.

[0026]En el contexto de la presente memoria descriptiva, el términoenlazador de aminoácidosse refiere a un polipéptido de longitud variable que se utiliza para conectar dos polipéptidos con el fin de generar un polipéptido de cadena sencilla. Las formas de realización ejemplares de enlazadores útiles para poner en práctica la invención especificada en el presente documento son cadenas de oligopéptidos que consisten en 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40 o 50 aminoácidos. Un ejemplo no limitante de un enlazador de aminoácidos es el polipéptido GGGGSGGGGGSGGGGS que enlaza un polipéptido HLA-B57 con un dominio Fc.

[0027]La presente invención proporciona confórmeros abiertos HLA-B57 para su uso como medicamento.

[0028]También se describen aquí confórmeros abiertos HLA-B57 para su uso en la prevención o el tratamiento del cáncer, o como inmunomodulador.

[0029] Según otro aspecto, se proporciona una proteína confórmera abierta HLA-B57 aislada, particularmente como medicamento, más particularmente para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer, o como inmunomodulador.

[0030] Según otro aspecto, se proporciona una proteína de confórmero abierto HLA-B57 aislada como agente inmunomodulador o para su uso como modulador negativo de células T reguladoras (Tregs), para su uso en enfermedades humanas en las que las Tregs perjudican el desarrollo de la inmunidad protectora, tales como el cáncer y las enfermedades infecciosas (von Boehmer et al. ibid.).

[0031] En ciertas formas de realización, el confórmero abierto HLA-B57 comprende dos cadenas polipeptídicas HLA-B57 idénticas. En ciertas formas de realización, el confórmero abierto HLA-B57 comprende dos cadenas polipeptídicas HLA-B57 diferentes.

[0032] Según un aspecto adicional, se proporciona un confórmero abierto HLA-B57 para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer, o para su uso como agente inmunomodulador para tratar enfermedades infecciosas, en particular para su uso en la prevención o terapia del virus de inmunodeficiencia humana (VIH), virus de la hepatitis A, B y C (VHA, VHB y VHC respectivamente), virus de la gripe, virus sincitial respiratorio (VSR), virus del sarampión, virus del herpes y/o virus de la fiebre amarilla. El confórmero abierto según este aspecto es una proteína de fusión que existe como un dímero de dos monómeros, y cada monómero, independientemente del otro monómero, comprende una cadena HLA-B57 y un dominio polipeptídico conocido por estabilizar metabólicamente un polipéptidoin vivo.Un ejemplo de dicho dominio estabilizador es un dominio Fc (fragmento cristalizable) de una inmunoglobulina, en particular el dominio polipeptídico Fc de una inmunoglobulina gamma. La cadena HLA-B57 y el dominio estabilizador pueden unirse opcionalmente mediante un enlace de aminoácidos. Una proteína de fusión de confórmero abierto que comprende la cadena HLA-B57 y un fragmento Fc de inmunoglobulina se denomina en adelante confórmero abierto HLA-B57 Fc o B572-Fc.

[0033] La presencia del dominio Fc en la proteína de fusión facilita el aumento de la solubilidad, estabilidad, avidez, vida media y, desde un punto de vista tecnológico, una producción y purificación rentable en sistemas mamíferos (purificación de proteína A o G).

[0034] En ciertas formas de realización, el homodímero de confórmero abierto HLA-B57 comprende adicionalmente un fragmento de epítopo peptídico. De acuerdo con un segundo aspecto, se proporciona un monómero de confórmero abierto HLA-B57 (es decir, el HLA-B57 no unido a un segundo polipéptido de cadena pesada HLA-B57, y no unido por p2-microglobulina) para su uso en el tratamiento o la prevención del cáncer, o para su uso como agente inmunomodulador. En ciertas formas de realización de este aspecto, el monómero HLA-B57 comprende adicionalmente un fragmento de epítopo peptídico.

[0035] Este aspecto se puede resumir en los siguientes puntos:

Punto 1: Un monómero polipeptídico de cadena pesada HLA-B57 único aislado esencialmente libre de p2-microglobulina asociada para su uso como medicamento, en particular para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer, o para su uso como agente inmunomodulador.

Punto 2: El monómero polipeptídico de cadena pesada HLA-B57 único aislado para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer o como agente inmunomodulador según el punto 1, en el que el monómero comprende adicionalmente un fragmento de epítopo peptídico.

Punto 3: El monómero polipeptídico de cadena pesada HLA-B57 único aislado para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer o como agente inmunomodulador según los puntos 1 o 2, en el que la cadena HLA-B57 solo consta de los dominios alfa 1, 2 y 3 de HLA-B57.

Punto 4: Monómero polipeptídico de cadena pesada HLA-B57 único aislado para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer o como agente inmunomodulador según cualquiera de los artículos anteriores, en donde la cadena HLA-B57 comprende el dominio transmembrana y no comprende el dominio intracelular (cola citoplasmática).

Punto 5: Monómero polipeptídico de cadena pesada HLA-B57 único aislado para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer o como agente inmunomodulador según cualquiera de los puntos anteriores, en donde la cadena HLA-B57 tiene > 70%, > 80%, > 85%, > 90%, > 92%, > 93%, > 94%, > 95%, > 96%, > 97% o > 98%, o 100%, de identidad de secuencia en comparación con cualquiera de las secuencias proporcionadas en la tabla 1.

Punto 6: Un medicamento combinado que comprende

a. un monómero polipeptídico de cadena pesada HLA-B57 único aislado como se especifica en cualquiera de los puntos 1 a 5, y

b. un agente inhibidor de puntos de control, particularmente un anticuerpo inhibidor de puntos de control, y/o un agente agonista de puntos de control, particularmente un anticuerpo agonista de puntos de control.

Punto 7: Medicamento de combinación según el punto 6, en el que dicho agente inhibidor de puntos de control se selecciona entre un inhibidor de la interacción de CTLA4 con CD80 o CD86, y un inhibidor de la interacción de PD-1 con su ligando PDL1, en particular un anticuerpo contra cualquiera de CTLA4, CD80, CD86, PD-1, PD-L1, más en particular un anticuerpo monoclonal contra CTLA4, PD-1 o PD-L1 humanos, y/o en el que dicho agente agonista de puntos de control se selecciona entre un anticuerpo agonista o ligando de 4-1BB y/o 4-1BBL (CD137L, Uniprot P41273).

[0036] En ciertas formas de realización de cualquiera de los aspectos de la invención expuestos anteriormente, un fragmento de epítopo peptídico está unido de forma no covalente al polipéptido dentro del dominio de presentación de antígeno de la cadena peptídica HLA-B57.

[0037] En ciertas formas de realización de cualquiera de los aspectos de la invención expuestos anteriormente, la cadena HLA-B57 comprende únicamente los dominios extracelulares alfa 1, 2 y 3 de HLA-B57. En estas formas de realización, los dominios transmembrana e intracelular de la cadena HLA-B57 no están incluidos en el polipéptido terapéutico de la invención con el fin de permitir su expresión extracelular en células recombinantes. El experto en la materia puede identificar fácilmente los respectivos dominios incluso en secuencias HLA-B57 previamente desconocidas mediante alineamiento de secuencias por pares con secuencias HLA-B57 anotadas.

[0038] En ciertas formas de realización de cualquiera de los aspectos de la invención expuestos anteriormente, la cadena HLA-B57 del homodímero se selecciona de HlA-B*57:01 a HLA-B*57:82.

[0039] En ciertas formas de realización de cualquiera de los aspectos de la invención expuestos anteriormente, la cadena HLA-B57 comprende solo los dominios alfa 1, 2 y 3 de HLA-B57, pero no el dominio transmembrana e intracelular de una secuencia seleccionada de la Tabla 1.

[0040] En ciertas formas de realización de cualquiera de los aspectos de la invención expuestos anteriormente, la cadena HLA-B57 tiene > 98%, o 100% de identidad de secuencia en comparación con cualquiera de las secuencias proporcionadas en la Tabla 1. En ciertas formas de realización, el confórmero abierto HLA-B57 consiste en dos subunidades seleccionadas independientemente de los alelos HLA-B57 anteriores. En ciertas formas de realización, los homodímeros consisten en dos alelos HLA-B57 idénticos.

[0041] En ciertas formas de realización, el confórmero abierto HLA-B57 comprende un dominio Fc. En ciertas formas de realización particulares, el dominio Fc comprende regiones constantes de cadena pesada Ch2 y Ch3 de inmunoglobulina tipo G (IgG), tipo A (IgA), tipo D (IgD), tipo E (IgE) o tipo M (IgM).

[0042] En ciertas formas de realización, el confórmero abierto HLA-B57 comprende un enlazador de aminoácidos que une un dominio estabilizador, particularmente un dominio Fc, al polipéptido HLA. En ciertas formas de realización particulares, el enlazador de aminoácidos comprende de 1 a 50 aminoácidos, particularmente de 5 a 40 aminoácidos, más particularmente de 10 a 30 aminoácidos, incluso más particularmente de 15 a 25 aminoácidos que unen la cadena HLA-B57 al dominio Fc como una sola cadena polipeptídica.

[0043] Según un tercer aspecto, se proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica un monómero de confórmero abierto HLA-B57, particularmente un monómero de confórmero abierto Fc, según los aspectos anteriores de la invención, para su uso en el tratamiento o la terapia del cáncer. La expresión del confórmero abiertoin vivoa partir de la molécula de ácido nucleico conducirá, después de la dimerización, al polipéptido de proteína de fusión de la invención. El concepto de expresar polipéptidos farmacéuticamente activos a partir de ácidos nucleicos que los codifican en el cuerpo del paciente es bien conocido y puede conferir beneficios significativos al paciente.

[0044] En ciertas formas de realización, la molécula de ácido nucleico codifica un monómero de confórmero abierto HLA-B57, particularmente un monómero de confórmero abierto Fc que comprende un fragmento de epítopo peptídico.

[0045] En ciertas formas de realización, la molécula de ácido nucleico codifica un monómero de confórmero abierto HLA-B57, particularmente un monómero de confórmero abierto Fc que comprende únicamente los dominios extracelulares alfa 1,2 y 3 de HLA-B57. En ciertas formas de realización, la molécula de ácido nucleico codifica un monómero de confórmero abierto HLA-B57, particularmente un monómero de confórmero abierto Fc que comprende únicamente los dominios extracelulares alfa 1, 2 y 3 de HLA-B57, y un fragmento de epítopo peptídico.

[0046] En ciertas formas de realización, la molécula de ácido nucleico codifica un monómero de confórmero abierto HLA-B57, particularmente un monómero de confórmero abierto Fc que comprende un enlazador de aminoácidos y/o un dominio Fc (fragmento cristalizable), y se utiliza en el tratamiento o la terapia del cáncer.

[0047] Según un cuarto aspecto, se proporciona un vector de expresión recombinante que comprende la molécula de ácido nucleico según el tercer aspecto de la invención para su uso en el tratamiento o la terapia del cáncer.

[0048] En ciertas formas de realización, el vector de expresión recombinante es un plásmido que comprende un promotor que es operativo en una célula de mamífero, particularmente en una célula humana. El promotor está unido operativamente a la molécula de ácido nucleico de la invención.

[0049] Según otro aspecto de la invención, se proporciona un virus que comprende la molécula de ácido nucleico según el tercer aspecto de la invención para su uso en el tratamiento o la terapia del cáncer. La molécula de ácido nucleico está bajo el control de una secuencia promotora que opera en una célula de mamífero, particularmente en una célula humana. En ciertas formas de realización, el virus es un adenovirus, un virus adenoasociado, un virus del herpes o un lentivirus.

[0050] Según otro aspecto más, se proporciona una célula huésped modificada genéticamentein vitroque comprende la molécula de ácido nucleico según el tercer aspecto de la invención.

[0051] Otro aspecto prevé el uso del homodímero de confórmero abierto HLA-B57 Fc o del homodímero de proteína de fusión según el primer y segundo aspecto de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención del cáncer.

[0052] Según otro aspecto más, se proporciona un método de tratamiento para el cáncer, que comprende administrar un confórmero abierto HLAB57 Fc según el primer y segundo aspecto de la invención a un paciente que lo necesita.

[0053] Según otro aspecto, se proporciona un medicamento de combinación, en donde el medicamento de combinación comprende:

- un confórmero abierto HLA-B57, particularmente un confórmero abierto HLA-B57 Fc, según cualquiera de los aspectos o formas de realización anteriores de la invención,

y

- un agente inhibidor de puntos de control, particularmente un anticuerpo inhibidor de puntos de control seleccionado entre un inhibidor de la interacción de la proteína 4 asociada a linfocitos T citotóxicos (CTLA4; también conocida como CD152) con CD80 o CD86, un inhibidor de la interacción de la proteína de muerte celular programada 1 (PD-1; también conocida como CD279) con su ligando PD-L1, y un ligando de inmunoglobulina de células T y dominio de mucina que contiene 3 (TIM-3),

- un agente agonista de puntos de control, particularmente un anticuerpo agonista de puntos de control seleccionado para unirse a y activar el receptor del factor de necrosis tumoral 4-1BB (también conocido como CD137 o TNFRSF9).

[0054] En ciertas formas de realización, el agente inhibidor del punto de control inmunitario es un inhibidor de la interacción de CTLA4 con CD80 o CD86.

[0055] En ciertas formas de realización, el agente inhibidor del punto de control inmunológico es ipilimumab (Yervoy; CAS No. 477202-00-9).

[0056] En ciertas formas de realización, el agente inhibidor del punto de control inmunitario es un inhibidor de la interacción de la proteína de muerte celular programada 1 (PD-1) con su receptor PD-L1. En ciertas formas de realización, el agente inhibidor del punto de control inmunitario se selecciona de entre los fármacos de anticuerpos disponibles clínicamente nivolumab (Bristol-Myers Squibb; CAS No. 946414-94-4), pembrolizumab (Merck Inc.; CAS No. 1374853-91-4), pidilizumab (CAS No. 1036730-42-3), atezolizumab (Roche Ag ; CAS No. 1380723-44-3) y avelumab (Merck KGaA; CAS No. 1537032-82-8).

[0057] En ciertas formas de realización, el agente agonista del punto de control inmunitario es utomilumab (PF-05082566), un anticuerpo monoclonal IgG2 completamente humano contra 4-1BB que actualmente se encuentra en ensayos clínicos.

[0058] En ciertas formas de realización, el confórmero abierto HLA-B57, particularmente el confórmero abierto HLA-B57 Fc, se proporciona como una forma de dosificación parenteral, particularmente preparada para inyección. En ciertas formas de realización, el agente inhibidor de puntos de control y/o el agente agonista de puntos de control se proporcionan como una forma de dosificación parenteral, particularmente preparada para inyección. En ciertas formas de realización, tanto el confórmero abierto HLA-B57 como el agente inhibidor de puntos de control y/o el agente agonista de puntos de control están presentes en la misma forma de administración.

[0059] Otro aspecto más se refiere a un método para producir polipéptidos de cadena pesada de HLA recombinantes. Este método se resume en los siguientes puntos:

Punto A: Un método para producir, mediante métodos de biotecnología recombinante, un polipéptido de cadena pesada de HLA humano, en donde dicho método comprende los siguientes pasos:

a. Paso de expresión:

i. una secuencia de ácido nucleico que codifica HLA que codifica al menos la cadena alfa 1, la cadena alfa 2 y la cadena alfa 3 de una cadena pesada de HLA bajo el control de una secuencia promotora operable en una célula, particularmente una célula eucariota, más particularmente una célula de mamífero, y

ii. una secuencia de ácido nucleico que codifica p2-microglobulina que codifica la beta 2 microglobulina de HLA humana (UniProt P61769) bajo el control de una secuencia promotora operable en dicha célula (la misma célula que en el punto 1.a.) se coexpresan en una célula de mamífero ("línea celular de producción");

b. Paso de purificación: el complejo de cadena pesada de HLA/p2-microglobulina resultante se purifica a partir de la célula de mamífero (la línea celular de producción);

c. Paso de disociación: el complejo de cadena pesada de HLA/p2-microglobulina purificado se disocia en condiciones adecuadas y los polipéptidos de cadena pesada de HLA se separan de los polipéptidos de p2-microglobulina;

d. Paso de replegamiento: los polipéptidos de cadena pesada de HLA separados se incuban en condiciones que conducen al replegamiento (de su estructura proteica terciaria nativa encontrada en moléculas de confórmero abierto de HLA fisiológicamente activas).

Punto B: El método para producir un polipéptido de cadena pesada de HLA humano según el punto A, en donde la secuencia de ácido nucleico que codifica HLA comprende, desde el extremo N al C del polipéptido codificado, la cadena alfa 1, la cadena alfa 2, la cadena alfa 3 y una secuencia estabilizadora.

Punto C: El método para producir un polipéptido de cadena pesada de HLA humano según el punto B, en donde la secuencia estabilizadora se selecciona de albúmina de suero bovino y un fragmento constante de inmunoglobulina (Fc), particularmente un fragmento constante de inmunoglobulina G, más particularmente un Fc de IgG4.

Punto D: El método para producir un polipéptido de cadena pesada de HLA humano según cualquiera de los puntos anteriores, en donde la secuencia de ácido nucleico que codifica HLA y la secuencia de ácido nucleico que codifica p2-microglobulina están presentes en la misma molécula de vector de ácido nucleico (particularmente, un plásmido de expresión de ADN).

Punto E: El método para producir un polipéptido de cadena pesada de HLA humano según cualquiera de los puntos anteriores A a C, en donde la secuencia de ácido nucleico que codifica HLA y la secuencia de ácido nucleico que codifica p2-microglobulina están presentes en diferentes moléculas de vector de ácido nucleico (particularmente, diferentes plásmidos de expresión de ADN).

Punto F: El método del punto E, en donde el vector de ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica HLA está presente en un exceso de aproximadamente 1 a 5 veces, particularmente en un exceso de 1,5 a 5 veces con respecto al vector de ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica p2-microglobulina, particularmente en un exceso de aproximadamente 3 veces.

Punto G: El método de cualquiera de los puntos anteriores, en el que la secuencia de ácido nucleico que codifica HLA comprende un fragmento Fc de inmunoglobulina como secuencia estabilizadora y el paso de purificación se efectúa mediante la adsorción de los polipéptidos de cadena pesada de HLA recombinantes a una superficie unida a la proteína A.

Punto H: El método de cualquiera de los puntos anteriores, en el que el paso de disociación se efectúa mediante tratamiento en condiciones ácidas, particularmente a un pH de aproximadamente 2, y diálisis en condiciones reductoras.

Punto I: El método de cualquiera de los puntos anteriores, en el que el paso de replegamiento se efectúa mediante tratamiento en condiciones neutras.

[0060]Más específicamente apuntando a los confórmeros abiertos B57 especificados en este documento, el método se puede resumir en los siguientes puntos:

Punto A': Un método para producir, mediante métodos de biotecnología recombinante, un polipéptido de cadena pesada HLA-B57 humano, en donde dicho método comprende los siguientes pasos:

a. Paso de expresión:

i. una secuencia de ácido nucleico que codifica HLA-B57 que codifica al menos la cadena alfa 1, la cadena alfa 2 y la cadena alfa 3 de una cadena pesada HLA-B57 bajo el control de una secuencia promotora operable en una célula, particularmente una célula eucariota, más particularmente una célula de mamífero, y

ii. una secuencia de ácido nucleico que codifica p2-microglobulina que codifica la microglobulina beta 2 HLA humana (UniProt P61769) bajo el control de una secuencia promotora operable en dicha célula (la misma célula que en el punto 1.a.) se coexpresan en una célula de mamífero ("línea celular de producción");

b. Paso de purificación: el complejo de cadena pesada HLA-B57/p2-microglobulina resultante se purifica a partir de la célula de mamífero (la línea celular de producción);

c. Paso de disociación: el complejo de cadena pesada HLA-B57/p2-microglobulina purificado se disocia en condiciones adecuadas y los polipéptidos de cadena pesada HLA se separan de los polipéptidos de p2-microglobulina;

d. Paso de replegamiento: los polipéptidos de cadena pesada HLA-B57 separados se incuban en condiciones que conducen al replegamiento (de su estructura proteica terciaria nativa encontrada en moléculas de confórmero abierto HLA fisiológicamente activas).

Punto B': El método para producir un polipéptido de cadena pesada HLA-B57 humano según el punto A', en donde la secuencia de ácido nucleico que codifica HLA-B57 comprende, desde el extremo N al C del polipéptido codificado, la cadena alfa 1, la cadena alfa 2, la cadena alfa 3 y una secuencia estabilizadora.

Punto C': El método para producir un polipéptido de cadena pesada HLA-B57 humano según el punto B', en el que la secuencia estabilizadora se selecciona de albúmina de suero bovino y un fragmento constante de inmunoglobulina (Fc), en particular un fragmento constante de inmunoglobulina G, más en particular un Fc de IgG4.

Punto D': El método para producir un polipéptido de cadena pesada HLA-B57 humano según cualquiera de los puntos anteriores, en el que la secuencia de ácido nucleico que codifica HLA y la secuencia de ácido nucleico que codifica p2-microglobulina están presentes en la misma molécula de vector de ácido nucleico (en particular, un plásmido de expresión de ADN).

Punto E': El método para producir un polipéptido de cadena pesada HLA-B57 humano según cualquiera de los puntos anteriores A' a C', en el que la secuencia de ácido nucleico que codifica HLA y la secuencia de ácido nucleico que codifica p2-microglobulina están presentes en diferentes moléculas de vector de ácido nucleico (en particular, diferentes plásmidos de expresión de ADN).

Punto F': El método del punto E', en el que el vector de ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica HLA está presente en un exceso de aproximadamente 1 a 5 veces, particularmente en un exceso de 1,5 a 5 veces con respecto al vector de ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica p2-microglobulina, particularmente en un exceso de aproximadamente 3 veces.

Punto G': El método de cualquiera de los puntos anteriores, en el que la secuencia de ácido nucleico que codifica HLA-B57 comprende un fragmento Fc de inmunoglobulina como secuencia estabilizadora y el paso de purificación se efectúa mediante la adsorción de los polipéptidos de cadena pesada de HLA recombinantes a una superficie unida a la proteína A.

Punto H': El método de cualquiera de los puntos anteriores, en el que el paso de disociación se efectúa mediante tratamiento en condiciones ácidas, particularmente a un pH de aproximadamente 2, y diálisis en condiciones reductoras.

Punto I': El método de cualquiera de los puntos anteriores, en el que el paso de replegamiento se efectúa mediante tratamiento en condiciones neutras.

[0061]Siempre que se exponen en el presente documento alternativas para características separables individuales tales como, por ejemplo, un alelo o una secuencia codificante como "formas de realización", se debe entender que dichas alternativas pueden combinarse libremente para formar formas de realización discretas divulgadas en el presente documento.

[0062]La invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos y figuras, de los que se pueden extraer otras formas de realización y ventajas. Estos ejemplos tienen por objeto ilustrar la invención pero no limitar su alcance.

Breve descripción de las figuras

[0063]

Fig. 1 Representación esquemática que muestra tres clasificaciones diferentes de tumores en función de sus infiltrados de células inmunitarias. Los "tumores inmunogénicos" se caracterizan por una abundante infiltración de linfocitos T citotóxicos (LTC), macrófagos de tipo M1, presencia de estructuras linfoides terciarias (ELT) y vascularización baja/moderada, a la vez que se asocian con la supervivencia más prolongada del paciente. Los tumores "inmunológicamente desatendidos" se caracterizan por la falta de infiltración de células inmunitarias, vascularización baja/moderada y pronóstico intermedio. Finalmente, los "tumores inflamatorios" se caracterizan por abundantes<l>T<c>en ausencia de ELT, infiltración notable con macrófagos M2, vascularización grave y mal pronóstico (Becht et al. Current Opinion in Immunology. 2016, 39:17-13).

Fig. 2 muestra que B57<2>-Fc bloquea la conversión de células T CD4<+>de ratón en iTreg. La incubación de B57<2>-Fc de forma dosis-dependiente con células T CD4<+>naive bloquea la conversión a iTregs. A) B57<2>-Fc bloquea la expresión de CD25 (marcador de linaje de Tregs) en una materia dosis-dependiente (mg/200<j>L) (C). B) B57<2>-Fc bloquea la expresión de FoxP3 (marcador de diferenciación de Tregs) en una materia dosis-dependiente (mg/200<j>L) (D). El control B57-p2m-Fc, isotipo, medio suplementado con TGFp e IL-2 y medio sin suplementación demuestran la influencia específica de B57<2>-Fc en la conversión a iTregs.

Fig. 3 muestra que B57<2>-Fc perjudica la supresión de Tregs murinos en una materia dosis-dependiente. A) histograma de proliferación de células T CD8<+>y Tregs que muestra a B57<2>-Fc bloqueando la supresión de Tregs de ratón y permitiendo la proliferación de células T CD8<+>. El control B57-p2m-Fc y el isotipo no alteran la función de supresión de Tregs murinos. B) % de supresión de iTreg de células T CD8<+>murinas a diferentes concentraciones de B57<2>-Fc (mg/200<j>L).

Fig. 4 muestra que B57<2>-Fc suprime las células T del linfoma. A-C) ensayos de supresión para determinar la proliferación de células en presencia de (A) isotipo de control, (B) control B57-p2m-Fc y (C) B57<2>-Fc. B57<2>-Fc suprime las líneas celulares de linfoma humano (Jurkat) y de ratón (EG.7) de manera dependiente de la dosis (mg/200<j>L) en comparación con las líneas celulares de control.

Fig. 5 muestra la interacción de B57<2>-Fc con diferentes receptores reguladores inmunes de poblaciones de leucocitos. A) KIR3DL1 (expresado en células NK y subconjuntos de células T); B) KIR3DL2 (expresado en células NK y subconjuntos de células T); C) KIR3DL3 (expresado en células NK y subconjuntos de células T); D) LILRB1 (expresado en poblaciones de células NK, células T, monocitos y macrófagos); E) LILRB2 (expresado principalmente en macrófagos y MDSC), y F) PirB (homólogo murino de LILRB2) mediante ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).

Fig. 6 muestra la representación esquemática de los casetes de ADN B57-Fc y p2m y la expresión de moléculas B57-p2m-Fc de células CHO. A) dominios alfa 1, 2 y 3 de la cadena pesada HLA-B57 insertados en un casete de vector IgG4-Fc humano; y la microglobulina p2-humana insertada en un casete de vector separado. B) Las transfecciones en células de ovario de hámster chino (CHO) se realizan utilizando tanto el vector B57-Fc el vector p2m en una proporción de 1:1 para la producción extracelular de la proteína B57-p2m-Fc. Los sobrenadantes se recolectaron y B57-p2m-Fc purificado utilizando protocolos de purificación de anticuerpos estándar. p2m se elimina del complejo B57-p2m-Fc y los siguientes monómeros B57-Fc se repliegan para formar homodímeros B57<2>-Fc.

Fig. 7 muestra la combinación de B57<2>-Fc con anticuerpos PD-1 para reducir el tamaño de los tumores en el modelo de carcinoma de colon singénico murino C38. A) Diseño experimental de los puntos de tiempo de inyección de células de carcinoma de colon (C38) e inyección de compuestos. B) Volumen tumoral promedio mm<3>de los grupos tratados (n=6). C) % de inhibición tumoral de los grupos tratados con B57<2>-Fc y PD-1 en comparación con el isotipo. El diseño experimental de la inyección de sustancias fue el siguiente: vehículo PBS Q3Dx7, isotipo (10 mg/Kg) Q3Dx7; B57<2>-Fc (10 mg/Kg) Q3Dx7; PD-1 biwk x 2 (200 jg); y B57<2>-Fc PD-1 (Q3Dx7 y biwk x 2, respectivamente). Los volúmenes tumorales se expresan como media ± SEM y se analizan mediante ANOVA de dos vías seguido de análisis post-hoc de Bonferroni, **p<0,01. Q= días entre inyecciones; Dx= número de inyecciones, biwk= dos veces por semana.

Fig. 8 muestra la combinación de B57<2>-Fc con anticuerpos PD-1 para reducir el tamaño de los tumores en el modelo murino de cáncer de páncreas (Pan02). A) Diseño experimental de los puntos de tiempo de inyección de células de cáncer de páncreas (Pan02) e inyección de compuestos. B) Volumen tumoral promedio mm<3>de los grupos tratados (n=8) con B57<2>-Fc y/o PD-1. El diseño experimental de la inyección de sustancias fue el siguiente: isotipo (5 mg/Kg) bisemana x 3; B57<2>-Fc (5 mg/Kg) bisemana x 3; PD-1 (5 mg/Kg) bisemana x 3; y B57<2>-Fc PD-1 (bisemana x 3). Los volúmenes tumorales se expresan como media ± SEM y se analizan mediante ANOVA de dos vías seguido de análisis post-hoc de Bonferroni, *p<0,05; **p<0,01; ****p<0,0001. biwk= dos veces por semana.

Fig. 9 muestra la combinación de B57<2>-Fc con anticuerpos PD-L1 reduce el tamaño de los tumores en el modelo de ratón de cáncer de páncreas (Pan02). A) Volumen tumoral promedio mm<3>de los grupos tratados (n=8) con B57<2>-Fc y/o PD-L1. B) % de inhibición tumoral de los grupos tratados con B57<2>-Fc, PD-1 y PD-L1 en comparación con el isotipo. El diseño experimental de la inyección de sustancias fue el siguiente: isotipo (5 mg/Kg) biwk x 3; B57<2>-Fc (5 mg/Kg) biwk x 3; PD-L1 (5 mg/Kg) biwk x 3; y B57<2>-Fc PD-L1 (biwk x 3). Los volúmenes tumorales se expresan como media ± SEM y se analizan mediante ANOVA de dos vías seguido de análisis post-hoc de Bonferroni, *p<0,05; **p<0,01; ****p<0,0001. biwk= dos veces por semana.

Fig. 10 muestra el análisis de contextura inmune de leucocitos infiltrados en tumores de ratones con cáncer de páncreas (Pan02) tratados con B57<2>-Fc y PD-1 por citometría de flujo. Leucocitos relevantes analizados infiltrando el tumor: A) células NK; B) proporción CD8/Treg; y C) células supresoras derivadas de mieloides (MDSCs); los números de leucocitos se expresan como media ± SEM y se analizan por ANOVA unidireccional seguido de análisis post-hoc de Turkey, *p<0,05.

Fig. 11 muestra el análisis de contextura inmune (continuación de la Fig. 10) de leucocitos infiltrados en tumores de ratones con cáncer de páncreas (Pan02) tratados con B572-Fc y PD-1 por citometría de flujo. Leucocitos relevantes analizados infiltrando el tumor: A) Macrófagos, y B) Relación M1/M2 de macrófagos. Los números de leucocitos se expresan como media ± SEM y se analizan mediante ANOVA de una vía seguido de análisis posthoc de Turkey, *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001.

Fig. 12 muestra el análisis de contextura inmune de leucocitos infiltrados en tumores de ratones con cáncer de páncreas (Pan02) tratados con B572-Fc y PD-L1 mediante citometría de flujo. Leucocitos relevantes analizados infiltrando el tumor: A) Células NK; B) Relación CD8/Treg; y C) Células supresoras derivadas de mieloides (MDSC). Los números de leucocitos se expresan como media ± SEM y se analizan mediante ANOVA de una vía seguido de análisis post-hoc de Turkey, *p<0,05.

Fig. 13 muestra el análisis de la contextura inmune (continuación de la Fig. 12) de leucocitos infiltrados en tumores de ratones con cáncer de páncreas (Pan02) tratados con B572-Fc y PD-L1 por citometría de flujo. Leucocitos relevantes analizados infiltrando el tumor: A) Macrófagos, y B) Relación M1/M2 de macrófagos. Los números de leucocitos se expresan como media ± SEM y se analizan mediante ANOVA unidireccional seguido de análisis post-hoc de Turkey, *p< 0,05; **p<0,01.

Fig. 14 muestra que la combinación de B572-Fc con anticuerpos agonistas del punto de control 4-1BB reduce el tamaño de los tumores en el modelo de ratón de cáncer de melanoma (B16F10). A) Diseño experimental de los puntos de tiempo de inyección de células de cáncer de melanoma (B16F10) e inyección de compuestos. B) Promedio del volumen tumoral en mm3 de los grupos tratados (n=8) con B572-Fc y anticuerpo 4-1BB. El diseño experimental de la inyección de las sustancias fue el siguiente: isotipo (5 mg/Kg) bisemanal 3 inyecciones; B572-Fc (5 mg/Kg) bisemanal 3 inyecciones; anticuerpo 4-1BB (1 mg/Kg) bisemanal x 3 inyecciones; y B572-Fc 4-1BB bisemanal 3 inyecciones. Los volúmenes tumorales se expresan como media ±<s>E<m>y se analizan mediante ANOVA de dos vías seguido de análisis post-hoc de Bonferroni, **p< 0,01; ****p<0,0001. bisemanal= dos veces por semana.

Fig. 15 muestra que la combinación de B572-Fc con anticuerpos agonistas del punto de control 4-1BB y las combinaciones con anticuerpos antagonistas PD-1 reducen el tamaño de los tumores en el modelo de ratón de cáncer de melanoma (B16F10) (continuación del experimento de la Fig. 14). A) Volumen tumoral promedio medio mm3 de los grupos tratados (n=8) con anticuerpos B572-Fc, PD-1 y 4-1BB. B) % de inhibición tumoral de los grupos tratados con B572-Fc, 4-1BB y PD-1 en comparación con el isotipo. El diseño experimental de la inyección de sustancias fue el siguiente: isotipo (5 mg/Kg) bisemanal 3 inyecciones; B572-Fc (5 mg/Kg) bisemanal 3 inyecciones; anticuerpo 4-1BB (1 mg/Kg) bisemanal 3 inyecciones; PD-1 bisemanal 3 inyecciones (5 mg/Kg); y b572-F<c>+ 4-1BB biwk 3 inyecciones, B572-Fc PD-1 biwk 3 inyecciones, PD-1 4-1BB biwk 3 inyecciones, y B572-Fc 4-1BB PD-1 biwk 3 inyecciones. Los volúmenes tumorales se expresan como media ± SEM. biwk= dos veces por semana.

Fig. 16 muestra el análisis de contextura inmune de leucocitos infiltrados en tumores de ratones con melanoma tratados (B16F10) por citometría de flujo. Leucocitos relevantes analizados infiltrando el tumor: A) células NK; B) proporción CD8/Treg; y C) células supresoras derivadas de mieloides (MDSCs). Los números de leucocitos se expresan como media ± SEM y se analizan por ANOVA unidireccional seguido de análisis post-hoc de Turkey, *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001; ****p<0,0001.

Fig. 17 muestra el análisis de la contextura inmunitaria (continuación de la figura 16) de los leucocitos infiltrados en tumores de ratones con melanoma tratado (B16F10) mediante citometría de flujo. Leucocitos relevantes analizados que se infiltraron en el tumor: A) macrófagos; y B) proporción de macrófagos M1/M2. Los números de leucocitos se expresan como media ± SEM y se analizan mediante ANOVA de una vía seguido de un análisis post-hoc de Turkey, *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001.

Ejemplos

[0064]Para su sorpresa, los inventores encontraron que los confórmeros abiertos de HLA-B57 interactúan con diferentes receptores de superficie inmunomoduladores presentes en células NK, células T, células derivadas de mieloides (macrófagos y MDSC), y regulan la diferenciación y la función supresora de los Tregs in vitro.

[0065]Los inventores descubrieron sorprendentemente que los confórmeros abiertos de HLA-B57, particularmente cuando están presentes como proteínas de fusión que comprenden un fragmento de inmunoglobulina Fc, podrían ser útiles en la terapia contra el cáncer. Las moléculas de HLA-B57-Fc pueden usarse solas o en combinaciones con otros agentes terapéuticos contra el cáncer.

[0066]Además, descubrieron un nuevo modo de acción in vivo con inyecciones de B572-Fc como monoterapia o en enfoques combinatorios utilizando inhibidores de puntos de control o anticuerpos agonistas. La terapia con B572-Fc sola o en combinaciones puede regular la infiltración de diversos conjuntos de leucocitos en los tumores, según lo determinado por la mayor proporción de células M1/M2, la mayor infiltración de células NK, la mayor proporción de células CD8+T/Treg y la menor infiltración de MDSC. En general, el modo de acción de B57<2>-Fc solo o en un enfoque combinatorio con anticuerpos antagonistas/agonistas es de indudable relevancia en el tratamiento del cáncer y se correlaciona con la necesidad clínica actual en inmunoterapia contra el cáncer.

[0067]Los confórmeros abiertos de HLA-B57 Fc se pueden utilizar como terapia para atacar enfermedades en las que la inmunomodulación es un enfoque terapéutico, como es el caso del cáncer y las enfermedades infecciosas.

Pruebas in vitro

[0068]La molécula B57<2>-Fc es capaz de modular las respuestas inmunes a través del bloqueo de la diferenciación de iTreg e influyendo negativamente en la supresión de Tregs (Fig. 2-3).

B572-Fc bloquea la conversión de células T CD4+ murinas en iTregs

[0069]Se analizó la influencia de las moléculas HLA sobre las células T CD4<+>naive en la conversión de iTreg en una cuestión dependiente de la dosis (pg/mL) con B57<2>-Fc, B57-p2m-Fc, isotipo y PBS incubados con células T CD4<+>naive en condiciones de cultivo óptimas para la conversión de iTreg. Se demostró que B57<2>-Fc modulaba negativamente la inducción de CD25 (Fig. 2A, C) y FoxP3 (Fig. 2B, D).

B572-Fc altera la supresión de las células T CD8+ de ratón por parte de los Tregs

[0070]Se determinó la función supresora de las células Treg murinas utilizando células T CD8<+>naive marcadas con violeta como células respondedoras (Fig. 3). Las células Treg se co-cultivaron con B57<2>-Fc y controles B57-p2m-Fc, y anticuerpo de isotipo, y se midió la proliferación de células T CD8<+>después de 96 h. Las células T CD8<+>solas mostraron una fuerte proliferación y, como se esperaba, las células Treg suprimieron la proliferación de células T CD8<+>cuando se incubaron con controles (B57-p2m-Fc, e isotipo). Sorprendentemente, la función supresora de las células Treg se vio muy afectada en presencia de B57<2>-Fc indicada por una fuerte proliferación de células T CD8<+>(Fig. 3A). El efecto de B57<2>-Fc fue dependiente de la dosis (Fig. 3B).

B572-Fc altera la proliferación de células T de leucemia.

[0071]Determinamos el efecto de proliferación de B57<2>-Fc en diferentes líneas celulares de cáncer (Fig. 4). Los resultados demostraron que B57<2>-Fc modula la proliferación de líneas de células T de linfoma, en comparación con su contraparte de control B57-p2m-Fc o el isotipo IgG4, lo que indica su posible aplicación al tratamiento del linfoma como terapia dirigida.

B572-Fc se une a receptores inmunomoduladores expresados en diversos tipos de leucocitos

[0072]Determinamos si B57<2>-Fc interactúa con receptores reguladores inmunitarios específicos mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). Los resultados demostraron que B57<2>-Fc interactúa con los receptores KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL3, LILRB1, LILRB2 y Pirb de una manera diferente a sus contrapartes de control B57-p2m-Fc (Fig. 5 AD). Además, también comparamos B27<2>-Fc y B27-p2m-Fc para demostrar si moléculas de confórmero abierto de HLA similares interactúan con los mismos receptores pero con diferentes afinidades.

Producción de confórmeros abiertos B57 como proteína de fusión Fc humana en células CHO

[0073]Una estrategia válida, desde un punto de vista terapéutico, es producir moléculas de confórmero abierto HLA-B57 en formato estable (fusión Fc), para aumentar la solubilidad, estabilidad, avidez, vida media y, desde un punto de vista tecnológico, producción y purificación rentables en sistemas mamíferos. El complejo B57-p2m-Fc se produjo con éxito insertando los dominios alfa 1,2 y 3 de HLA-B57 en un casete de vector IgG4-Fc humano (Fig. 6A), junto con un vector p2m humano, necesario para la producción extracelular de la proteína B57-p2m-Fc (Fig. 6A,B). Las transfecciones en células de ovario de hámster chino (CHO) se realizaron utilizando tanto el vector B57-Fc como el vector p2m en una proporción de 1:1. Los sobrenadantes se recogieron y se purificó B57-p2m-Fc utilizando protocolos de purificación de anticuerpos estándar (Recombinant Protein Purification Handbook, principles and methods. 2009. GE Healthcare, 18 1142-75) (Fig. 6B). La separación de p2m de las cadenas pesadas libres de B57-Fc se realizó utilizando condiciones desnaturalizantes mediante métodos de SEC o diálisis. El replegamiento de B57<2>-Fc se evaluó utilizando el método de dilución en tampón de replegamiento y se analizó mediante transferencia Western (datos no mostrados).

Pruebas preclínicas de terapia combinada de B572-Fc con anticuerpos PD-1, PD-L1 y 4-1BB en diversos modelos murinos de cáncer de colon singénico

[0074]El estudio de prueba de conceptoin vivode B57<2>-Fc como molécula terapéutica inmunomoduladora se demostró en modelos de ratón singénicos de carcinoma de colon murino (C38), cáncer de páncreas (Pan02) y melanoma (B16-F10) como monoterapia y en combinación con anticuerpos PD-1, PD-L1 o 4-1BB.

[0075]Para el modelo de carcinoma de colon, siguiendo protocolos establecidos, se inyectaron tumores de fragmentos C38 por vía subcutánea en el flanco de ratones singénicos. Una vez que el tumor alcanzó “80 mm<3>(entre 1 y 2 semanas después del trasplante de tumores), los ratones se distribuyeron estadísticamente de acuerdo con su volumen tumoral. Se inyectó B57<2>-Fc ip siete veces cada 3 días (Q3Dx7) y<p>D-1 se inyectó 4 veces dos veces por semana (biwk x 2) (Fig. 7A).

[0076]En el cáncer de colon (C38), los datos demostraron que la combinación de B57<2>-Fc con anticuerpos PD-1 reduce significativamente los tumores (Fig. 7B). La terapia combinada B57<2>-Fc PD-1 frente al anticuerpo de control de isotipo redujo notablemente el volumen del tumor (333 mm<3>frente a 2120 mm<3>, respectivamente, p<0,01). Además, la terapia combinada B57<2>-Fc PD-1 frente a la monoterapia con PD-1 también mostró una reducción significativa del tamaño del tumor (333 mm<3>frente a 1423 mm<3>, respectivamente, p<0,01) (Fig. 7B). La monoterapia con B57<2>-Fc o la monoterapia con PD-1 no mostraron diferencias frente al control de isotipo al final del experimento, sin embargo, el día 24, los ratones tratados con B57<2>-Fc fueron significativamente diferentes del isotipo (384 mm<3>frente a 652 mm<3>, p<0,05), así como PD-1 frente al isotipo (151 mm<3>frente a 652 mm<3>, p<0,01), (Fig. 7B), lo que indica que la monoterapia con B57<2>-Fc también tiene efectos inmunomoduladores en la progresión tumoral de ratones con cáncer de colon.

[0077]Para los modelos de ratón de páncreas (Pan02) y melanoma (B16F10), siguiendo los protocolos establecidos, se inyectaron células a 1x10<5>en el flanco derecho de ratones singénicos respectivamente. Una vez que el tumor alcanzó =80 mm<3>(entre 1 y 2 semanas después de la inyección de células), los ratones se distribuyeron estadísticamente de acuerdo con su volumen tumoral (Fig. 8A, 14A).

[0078]En el páncreas (Pan02), los datos demostraron que la monoterapia con B57<2>-Fc y la combinación con anticuerpos PD-1 pueden reducir significativamente los tumores (Fig. 8B, 9B). La terapia combinada B57<2>-Fc PD-1 frente al anticuerpo de control de isotipo demostró una reducción significativa sorprendente del volumen tumoral (216 mm<3>frente a 799 mm<3>, respectivamente p<0,0001) (Fig. 8B). Además, la terapia combinada B57<2>-Fc PD-1 vs. monoterapia con PD-1 también mostró una reducción significativa del tamaño del tumor (216 mm<3>vs. 445 mm<3>, respectivamente, p<0,01) (Fig. 8B). La monoterapia con B57<2>-Fc fue significativamente diferente en comparación con el isotipo (545 mm<3>vs. 799 mm<3>, respectivamente, p<0,05). La monoterapia con PD-1 fue significativamente diferente en comparación con el isotipo (445 mm<3>vs. 799 mm<3>, respectivamente, p<0,0001) (Fig. 8B).

[0079]En el estudio de páncreas (Pan02) B57<2>-Fc en combinación con anticuerpos PD-L1 redujo significativamente los tumores (Fig. 9A-B). La combinación B57<2>-Fc PD-L1 vs. isotipo mostró una reducción significativa del tamaño del tumor (397 mm<3>vs. 799 mm<3>, respectivamente, p<0,0001) (Fig. 9A). La monoterapia con PD-L1 fue significativamente diferente en comparación con el isotipo (531 mm<3>vs. 799 mm<3>, respectivamente, p<0,01) (Fig. 9A).

[0080]La contextura inmune tumoral de ratones pancreáticos (Pan02) demostró la influencia de la terapia B57<2>-Fc hacia diversos conjuntos de leucocitos infiltrantes tumorales (Fig. 10-13). La monoterapia con B57<2>-Fc aumentó la infiltración de células NK en comparación con el isotipo de control (p<0,05) (Fig. 10A), y modificó significativamente la relación de células Macrófagos M1/M2 (p<0,05) al favorecer la presencia de macrófagos de tipo M1 dentro del tumor (Fig. 11B). La terapia combinatoria B57<2>-Fc con PD-1 redujo significativamente la infiltración de células MDSC en el tumor en comparación con la monoterapia con PD-1 (p<0,05) (Fig. 10C), redujo la infiltración de macrófagos (Fig. 11A) (p<0,05) y modificó significativamente la relación de macrófagos M1/M2 en comparación con el isotipo y la monoterapia con PD-1 (Fig. 11B) (p<0,001). La terapia combinatoria B57<2>-Fc con PDL1 (Fig. 12-13) modificó significativamente la relación de células M1/M2 de macrófagos en comparación con el isotipo (p<0,01) y PD-L1 (p<0,05) (Fig. 13E).

[0081]En el melanoma (B16F10), los datos demostraron que B57<2>-Fc en combinación con anticuerpos agonistas de 4-1BB puede reducir significativamente los tumores (Fig. 14-15). La terapia combinada B57<2>-Fc 4-1BB frente al anticuerpo de control de isotipo mostró una diferencia significativa sorprendente en la reducción del volumen del tumor (756 mm<3>frente a 1424 mm<3>, respectivamente, p<0,0001) (Fig. 14B). Además, la combinación B57<2>-Fc 4-1BB frente a la monoterapia con 4-1BB también mostró una reducción significativa del tamaño del tumor (756 mm<3>frente a 1199 mm<3>, respectivamente, p<0,01) (Fig. 14B). La monoterapia con 4-1BB no fue significativamente diferente en comparación con el isotipo (1199 mm<3>frente a 1424 mm<3>, respectivamente). La monoterapia con PD-1 y la terapia combinada no mostraron significancia entre los grupos (Fig. 15A). Sin embargo, la terapia triple combinada (B57<2>-Fc 4-1BB PD-1) mostró una diferencia significativa alta en comparación con el isotipo (p < 0,0001), pero no fue mejor que la combinación B57<2>-Fc 4-1BB (Fig. 15A-B).

[0082]La contextura inmune del tumor de los animales tratados con melanoma (B16F10) demostró la influencia de la terapia con B57<2>-Fc con diversos conjuntos de leucocitos infiltrantes del tumor (Fig. 16-17). La monoterapia con B57<2>-Fc redujo significativamente la presencia de células MDSC dentro del tumor en comparación con el isotipo (p<0,05) (Fig. 16C). La terapia combinatoria con B57<2>-Fc y anticuerpos 4-1BB modificó significativamente la presencia de células T CD8<+>frente a células Treg, medida a través de la relación de células T CD8<+>/Treg (p<0,05) (Fig. 16B), redujo significativamente la presencia de células MDSC dentro del tumor (p<0,05) (Fig. 16C) y modificó significativamente la relación de células M1/M2 de macrófagos en comparación con el isotipo y la monoterapia con 4-1BB (p<0,05) (Fig. 17B). La triple terapia combinatoria B57<2>-Fc con anticuerpos 4-1BB y PD-1 indujo significativamente la infiltración de células NK en el tumor (p<0,05) (Fig. 16A), modificó notablemente la relación células T CD8<+>/Treg en comparación con el isotipo (158% vs. 23%, respectivamente, p<0,0001), y también en comparación con todos los demás grupos (Fig. 16B). Además, redujo significativamente la presencia de células MDSC dentro del tumor (p<0,001) (Fig. 16C), y modificó significativamente la relación células M1/M2 de macrófagos en comparación con todos los demás grupos (Fig. 17B).

Conclusión

[0083]La prueba de principio para el uso de moléculas B57<2>-Fc para combatir el cáncer se demostró utilizando modelos de ratón singénicos preclínicos de colon, páncreas y melanoma. Los datos actuales demuestran el potencial terapéutico de B57<2>-Fc como monoterapia y/o terapia combinatoria con conjuntos de agentes inhibidores de puntos de control y/o agentes agonistas de puntos de control como los anticuerpos PD-1, PD-L1 o 4-1BB.

[0084]El modo de acción de B57<2>-Fc también se evaluó in vivo en modelos de páncreas y melanoma en ratones estableciendo la infiltración tumoral de leucocitos. La terapia con B57<2>-Fc puede regular la infiltración de diversos conjuntos de leucocitos en los tumores de ratones, como se determina por la mayor proporción de células Macrófagos M1/M2, la menor infiltración de MDSC, la mayor proporción de infiltración de células CD8<+>T/Treg y la mayor infiltración de células NK. En general, el modo de acción de B57<2>-Fc solo o en un enfoque combinatorio con anticuerpos antagonistas/agonistas es de indudable relevancia en el tratamiento del cáncer y se correlaciona con la necesidad clínica actual de inmunoterapia contra el cáncer.

[0085]B57<2>-Fc surge como una nueva clase de fármaco inmunomodulador. Los datosin vitroein vivoapuntan a un mecanismo en el que las moléculas B57<2>-Fc actúan como un mecanismo de activación de la inmunidad antitumoral. Sin querer limitarnos a la teoría, los inventores plantean la hipótesis de que la interacción de los confórmeros abiertos de HLA-B57 se unen a diversos receptores inmunomoduladores presentes en las células mieloides (macrófagos, MDSC), las células T y las células NK participan sinérgicamente y exacerban la respuesta inmunitaria.

Materiales y métodos

Animales y líneas celulares

[0086]Se llevaron a cabo experimentosin vivoen ratones C57BI/6 utilizando la línea celular de carcinoma de colon derivada de ratón C38, la línea celular de adenocarcinoma ductal pancreático de ratón Pan02 y la línea celular de melanoma de ratón B16F10.

[0087]Las líneas celulares de experimentosin vitro:EG.7, linfoma de células T de ratón; Jurkat, linfoma de células T humano; L428, linfoma de Hodgkin humano; L540, linfoma de Hodgkin humano; L1236, linfoma de Hodgkin humano; Daudi, linfoma de células B; IMR-5, neuroblastoma; SK-N-AS, neuroblastoma; y M130428, melanoma.

Tratamientos in vivo

[0088]Los fragmentos de tumor C38 se inyectaron por vía subcutánea en los flancos derechos de ratones hembra singénicos C57BL/6 en la semana 6. Las líneas celulares Pan02 y B16F10 se inyectaron a 1x10<5>en el flanco derecho de ratones singénicos en la semana 6. Una vez que el tumor alcanzó ±80 mm<3>en colon (C38), páncreas (Pan02) y melanoma (B16F10), los animales se distribuyeron de acuerdo con el tamaño del volumen de su tumor individual y se dividieron en grupos que no mostraban diferencias estadísticas entre ellos. Los diámetros del tumor se midieron utilizando un calibrador y el volumen se calculó de acuerdo con la fórmula, D/2 xd2donde D y d son el diámetro más largo y más corto del tumor en mm, respectivamente.

[0089]El diseño experimental de los puntos de tiempo de inyección de células e inyección de sustancias se estableció de la siguiente manera para colon (C38) vehículo (PBS 200<j>L); isotipo (10 mg/Kg) Q3Dx7; B57<2>-Fc (10 mg/Kg); PD-1 biwk x 2 (200 jg); B57<2>-Fc PD-1 (Q3Dx7 y biwk x 2, respectivamente), b27<2>-Fc p D-1 (Q3Dx7 y biwk x 2, respectivamente). Para páncreas (Pan02) el diseño experimental de inyección de sustancias fue el siguiente: isotipo (5 mg/Kg) biwk x 3; B57<2>-Fc (5 mg/Kg) biwk x 3; PD-1 biwk x 3 (5 mg/Kg); PD-L1 biwk x 3 (5 mg/Kg); B57<2>-Fc PD-1 (biwk x 3) y B57<2>-Fc PD-L1 (biwk x 3). Para el melanoma (B16F10) el diseño experimental de la inyección de sustancias fue el siguiente: isotipo (5 mg/Kg) biwk 3 inyecciones; B57<2>-Fc (5 mg/Kg) biwk 3 inyecciones; anticuerpo 4-1BB (1 mg/Kg) biwk 3 inyecciones; PD-1 biwk 3 inyecciones (5 mg/Kg); B57<2>-Fc 4-1BB biwk 3 inyecciones, B57<2>-Fc PD-1 biwk 3 inyecciones, PD-1 4-1BB biwk 3 inyecciones y B57<2>-Fc 4-1BB PD-1 biwk 3 inyecciones.

[0090]La preparación de muestras tumorales para citometría de flujo se realizó utilizando protocolos descritos por eBioscience (https://www.ebioscience.com/media/pdf/best-protocols/cell-preparation-for-flow-cvtometrv.pdf. consultado el 21 de febrero de 2017).

Anticuerpos

[0091]Las poblaciones de leucocitos de ratón para pruebas in vitro se tiñeron con: CD3 (PE-Cy7-eBioscience), CD4 (FITC-BD Bioscience), FoxP3+ (efluor 450- eBioscience), CD45 (PerCP-eBioscience), Cd3 (PE- eBioscience), NK1.1 (BV421- eBioscience), CD11b (FITC-eBioscience), CD11c (FITC-eBioscience), CD25 (PE-Cy7-Biolegend).

[0092]La unión del mAb HC10 (IgG2a) a las cadenas pesadas libres de p2m de los alelos HLA-B y -C y, por lo tanto, a B57<2>fue un obsequio del Dr. Hidde Ploegh (MIT, MA).

[0093]Los anticuerpos de citometría de flujo de muestras tumorales se tiñeron con: CD45 (FITC; clon 30-F11; Biolegend), CD3 (PerCP/Cy5.5; clon 17A2; Biolegend), CD4 (BV510; clon GK1.5; Biolegend), CD8 (APC-H7; clon 53-6.7; BD), FoxP3 (PE; clon FJK-16S; eBioscence), CD11b (BV650; clon M1/70; Biolegend), F4/80 (PE/Cy7; clon BM8; Biolegend), Gr-1 (APC-R700; clon RB6-8C5; BD), NK1.1 (BV605; clon PK136; Biolegend), CD206 (APC; clon C068C2; Bioleyenda), CD86 (BV421; clon GL-1; Biolegend), tinción LID (BUV395; Invitrogen).

[0094]El anticuerpo inhibidor de punto de control anti-clon PD-1 de ratón RMP1-14 se obtuvo de Bio X Cell.

[0095]El anticuerpo inhibidor de punto de control anti-PD-L1 de ratón clon: 10F.9G2 se obtuvo de Bio X Cell. El anticuerpo agonista anti-4-1BB de ratón clon 3H3 se obtuvo de Bio X Cell.

Citometría de flujo de leucocitos

[0096]El análisis de citometría de flujo se realizó utilizando un FACS canto II (BD Bioscience) y los datos se analizaron utilizando FlowJo versión 7.6.4.

Generación de Tregs

[0097]Para inducir la expresión de Foxp3 en células T CD4<+>murinas, recolectamos células de bazo de esplenocitos C57BL/6 y las purificamos ((Kit de aislamiento de células T CD4<+>naive de ratón - Easy Sep) para obtener células T CD4<+>naive. A continuación, las células se cultivaron durante 96 h a 10<5>células/200 pL/pocillo en placas de 96 pocillos con 5 pg/mL de mAb anti-CD3 recubierto (eBioscience), 2 pg/mL de mAb anti-CD28 soluble (Biolegend), 10 pg/mL de TGF-p1 (R&D systems) y 100 UI/mL de IL-2 (R&D systems).

Conversión de iTreg en presencia de B572-Fc

[0098]Las células T CD4<+>naive murinas en condiciones de cultivo óptimas para la conversión de iTreg en presencia de diferentes concentraciones de dosis (pg/200 pL) de B57<2>-Fc, B57-p2m-Fc, B27-p2m-Fc, isotipo IgG4 y PBS durante 72 h. La conversión de iTreg se midió mediante citometría de flujo.

Ensayo de supresión

[0099]Las células T efectoras CD4<+>o CD8<+>fueron PBMC purificadas de ratones o humanos (Kit de aislamiento de células T CD4<+>naive de ratón - Easy Sep; Dynabeads® FlowComp™ Mouse CD8-Life Technologies; Dynabeads® CD8 human-Life Technologies) y se marcaron con tinción de proliferación de violeta de trazas celulares 10 pM (Molecular Probes). Las células Treg (2,5 x 10<4>) y las células T efectoras (2,5 x 10<4>) se cultivaron en placas de 96 pocillos con fondo en U con anticuerpo recubierto CD3 (eBioscience) (3 pg/mL) y CD28 soluble (eBioscience) (1 pg/mL) durante 96 horas. La proliferación de células T efectoras se midió utilizando un FACS canto II y los datos se analizaron utilizando el software de análisis de proliferación de FlowJo versión 7.6.4.

Ensayo de proliferación

[0100]Las células se sembraron en placas redondas de 96 pocillos a una densidad de 5 * 10<5>células/pocillo después de la adición de fármacos a diferentes concentraciones (10, 5 y 2 pg/pocillo) durante 1 día. El ensayo de proliferación XTT se realizó de acuerdo con las instrucciones del manual (kit de proliferación celular II, Roche). Los resultados se obtuvieron con la absorbancia de los pocillos a 450 nm utilizando un lector de microplacas.

Ensayos ELISA

[0101]Se realizaron ensayos ELISA de competición utilizando placas de 96 pocillos Maxisorp (Nunc, Suiza) recubiertas con 10 pg/mL de receptores de leucocitos recombinantes seleccionados (KIR3DL1 humano, KIR3DL2 humano, KIR3DL3 humano, LILRB1 humano, LILRB2 humano y Pirb de ratón). Los receptores se incubaron a 4 °C y se bloquearon con leche en polvo al 5 %-PBS durante 2 horas. Se añadieron B57<2>-Fc, B57-p2m-Fc, B27<2>-Fc, B27-p2m-Fc y el isotipo IgG4 a 2 pg/mL durante 2 horas a temperatura ambiente. Se utilizaron anticuerpos conjugados con HRP contra Fc humano como detectores.

Producción, purificación y replegamiento de B572-Fc

[0102]La producción recombinante de B57-p2m-Fc se logró insertando los dominios alfa 1, 2 y 3 de HLA-B57 en un vector IgG4-Fc humano, y la p2-microglobulina (p2m) humana en un vector separado. La producción de B57-p2m-Fc recombinante se realizó mediante cotransfección del vector B57-Fc y el vector p2m en células de ovario de hámster chino (CHO). La producción de B57-p2m-Fc se subcontrató a Evitria AG.

[0103]La purificación de B57-p2m-Fc se realizó utilizando protocolos convencionales para la purificación de anticuerpos. La producción de B57<2>-Fc se realizó con la adición de un paso de desnaturalización para eliminar p2m del complejo B57-p2m-Fc.

[0104]Brevemente, el paso de captura de B57-p2m-Fc se realizó después de pasar los sobrenadantes (5 mL/min) a través de columnas de proteína G (Amersham Pharmacia). Los pasos de purificación intermedios se realizaron eluyendo B57-p2m-Fc de las columnas de proteína G utilizando un tampón de elución (glicina 100 mM, pH 2,0) y recuperando las fracciones en urea 8 M, TrisHCl 100 mM pH 8,0. El primer paso de pulido fue separar las fracciones de monómeros de B57-Fc de p2m mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) utilizando superdex 200 de grado preparativo o Sephacryl S-100 HR (GE Lifescience) con un sistema AKTA (GE Lifescience), o mediante diálisis con membranas de tamaño de poro de 30 KDa o 50 KDa (Millipore). Los monómeros B57-Fc recuperados de ambos protocolos se replegaron mediante el método de dilución después de pulsar los monómeros B57-Fc 3 veces con intervalos de 8 horas cada vez en un volumen 100 veces mayor de tampón de replegamiento (50 mM Tris-HCl pH 8,5, 500 mM L-Arginina, 1 mM EDTA, 0,15 mM NaCl, 1 % sacarosa, 0,01 % Tween-20). El segundo paso de pulido mediante SEC se realizó para eliminar más impurezas y para tamponar el intercambio de fracciones recién recuperadas de moléculas B572-Fc en el tampón de dilución (PBS, 1 % sacarosa y 0,01 % Tween-20). Las soluciones purificadas de B572-Fc se esterilizaron por filtración utilizando membranas de 0,2 pm (Millipore).

[0105]Las fracciones de complejos B57-p2m-Fc y B572-Fc se analizaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida SDS (SDS-PAGE) y transferencia Western utilizando anticuerpos HC10 (específicos para cadenas pesadas libres de HLA). Las transferencias Western de p2m se realizaron con y sin condiciones desnaturalizantes (10 mM DTT) (datos no mostrados).

Secuencias completas y parciales de alelos HLA-B57

[0106]Los dominios funcionales de la cadena alfa HLA-B57 de longitud completa desde el extremo N al extremo C son: péptido señal, alfa 1, alfa 2, alfa 3, dominio transmembrana y cola citoplasmática.

Tabla 1: Alelos HLA-B57

Continuación

(Continuación)

(Continuación)

(Continuación)

(Continuación)

(Continuación)

(Continuación)

(Continuación)

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Un conformador abierto HLA-B57 aislado para uso como medicamento.

2. Confórmero abierto HLA-B57 para uso como medicamento, en donde dicho confórmero abierto comprende, o consiste en, un primer y un segundo monómero, y cada monómero independientemente del otro monómero comprende una cadena pesada HLA-B57.

3. Confórmero abierto HLA-B57 para uso como medicamento según la reivindicación 2, que comprende adicionalmente una secuencia polipeptídica Fc (fragmento cristalizable) y opcionalmente, un enlazador de aminoácidos que une la cadena pesada HLA-B57 y el fragmento Fc.

4. Confórmero abierto HLA-B57 para uso como medicamento según la reivindicación 2 o 3, en el que el primer y el segundo monómero son el mismo.

5. Confórmero abierto HLA-B57 para uso como medicamento según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en el que el primer y/o segundo monómero comprende adicionalmente un fragmento de epítopo peptídico.

6. Confórmero abierto HLA-B57 para uso como medicamento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 2 a 5, en el que la cadena pesada HLA-B57 sólo consta de los dominios alfa 1,2 y 3 de HLA-B57.

7. Confórmero abierto HLA-B57 para uso como medicamento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 2 a 5, en el que la cadena HLA-B57 comprende el dominio transmembrana y no comprende el dominio intracelular (cola citoplasmática).

8. Confórmero abierto HLA-B57 para uso como medicamento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 2 a 7, en el que la cadena HLA-B57 tiene > 98% de identidad de secuencia en comparación con cualquiera de las secuencias identificadas en la Tabla 1.

9. Confórmero abierto HLA-B57 para uso como medicamento según la reivindicación 6, en el que la cadena HLA-B57 tiene > 98% de identidad de secuencia en comparación con los dominios alfa 1, 2 y 3 de cualquiera de las secuencias identificadas en la Tabla 1.