ES2989539A1 - CNR1 and GPR55 as early biomarkers of type 1 diabetes - Google Patents
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Abstract
La presente invención describe los niveles de expresión de los receptores CNR1 y GPR55 en células mononucleares periféricas de la sangre, en concreto en linfocitos CD4+ circulantes, como biomarcadores precoces mínimamente invasivo de la diabetes de tipo 1, el método de diagnóstico precoz que los utiliza y kit para su puesta en práctica.The present invention describes the expression levels of the CNR1 and GPR55 receptors in peripheral blood mononuclear cells, specifically in circulating CD4+ lymphocytes, as minimally invasive early biomarkers of type 1 diabetes, the early diagnosis method that uses them and a kit for its implementation.
Description
DESCRIPCIÓN DESCRIPTION
CNR1yGPR55como biomarcadores tempranos de la diabetes de tipo 1 CNR1 and GPR55 as early biomarkers of type 1 diabetes
CAMPO DE LA INVENCIÓN FIELD OF INVENTION
La presente invención se encuentra dentro del campo de la Medicina y más concretamente, se enmarca en el estudio, diagnóstico y evaluación del desarrollo de la diabetes tipo I. The present invention is within the field of Medicine and more specifically, it is framed within the study, diagnosis and evaluation of the development of type I diabetes.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR STATE OF THE PRIOR ART
La diabetes insulinodependiente, es decir, la diabetes mellitus tipo 1 (DT1), es una enfermedad autoinmune sin cura que conduce a una destrucción progresiva de las células beta productoras de insulina hasta la pérdida total de una masa celular beta funcional. Esta destrucción provoca la dependencia de insulina exógena para vivir. Las personas con DT1 corren el riesgo diario de sufrir hiper e hipoglucemia, esta última potencialmente mortal. Además, una glucemia descontrolada aumenta el riesgo de complicaciones macro y microvasculares. Insulin-dependent diabetes, i.e. type 1 diabetes mellitus (T1D), is an incurable autoimmune disease that leads to a progressive destruction of insulin-producing beta cells until the total loss of functional beta cell mass. This destruction results in dependence on exogenous insulin for survival. People with T1D run the daily risk of hyper- and hypoglycemia, the latter potentially fatal. In addition, uncontrolled blood sugar increases the risk of macro- and microvascular complications.
Esta patología se desencadena por una combinación de factores genéticos y ambientales. Sin embargo, la disposición genética explica menos del 50% de los casos. This pathology is triggered by a combination of genetic and environmental factors. However, genetic disposition explains less than 50% of cases.
La DT1 cursa con insulitis o inflamación de los islotes de Langerhans. Los islotes de Langerhans son un conjunto de tejido endocrino situado en el páncreas que ayuda a regular los niveles de glucosa. La infiltración de células inmunes (linfocitos B y T, macrófagos y células dendríticas) en los islotes de Langerhans, conduce a la atrofia y a la desaparición de las células beta productoras de insulina. Este proceso denominado insulitis desempeña un papel fundamental en el desarrollo de la enfermedad de la DT1, pero también es un factor fisiopatológico de la diabetes de tipo 2. T1D is characterized by insulitis or inflammation of the islets of Langerhans. The islets of Langerhans are a group of endocrine tissue located in the pancreas that helps regulate glucose levels. The infiltration of immune cells (B and T lymphocytes, macrophages and dendritic cells) into the islets of Langerhans leads to atrophy and the disappearance of insulin-producing beta cells. This process, called insulitis, plays a key role in the development of T1D, but is also a pathophysiological factor in type 2 diabetes.
Como se ha señalado anteriormente, la DT1, a diferencia de la tipo 2, es una enfermedad autoinmune, por lo que presenta de forma característica autoanticuerpos (AA). Los autoanticuerpos son anticuerpos desarrollados por el sistema inmunitario que actúan directamente en contra de uno o más antígenos del propio individuo. Los AA asociados a la DT1 son varios y van desde autoanticuerpos citoplasmáticos de las células de los islotes pancreáticos, a los autoanticuerpos frente a la insulina, pasando por autoanticuerpos decarboxilasa del ácido glutámico, autoanticuerpos GAD65, autoanticuerpos asociados a insulinoma, IA-2A, autoanticuerpos ICA512, autoanticuerpos proteína tirosina fosfatasa-like o autoanticuerpos del transportador de zinc-8 (ZnT8A). As noted above, T1D, unlike type 2, is an autoimmune disease, which is why it typically presents autoantibodies (AA). Autoantibodies are antibodies developed by the immune system that act directly against one or more antigens of the individual. The AA associated with T1D are diverse and range from cytoplasmic autoantibodies of pancreatic islet cells, to autoantibodies against insulin, including glutamic acid decarboxylase autoantibodies, GAD65 autoantibodies, insulinoma-associated autoantibodies, IA-2A, ICA512 autoantibodies, protein tyrosine phosphatase-like autoantibodies or zinc transporter-8 autoantibodies (ZnT8A).
La evolución natural de la DT1 es progresiva y pasa por tres estadios. The natural evolution of T1D is progressive and goes through three stages.
Estadio 1: aparición de autoanticuerpos (AA); en este estadio aún no hay insulitis ni enfermedad. Puede detectarse mediante análisis de sangre, pero sólo cuando se detectan múltiples AA, lo que ocurre solo en un 70% de los casos. Stage 1: Autoantibody (AA) development; at this stage there is no insulitis or disease yet. It can be detected by blood tests, but only when multiple AA are detected, which occurs in only 70% of cases.
Estadio 2: inicio de la insulitis pero sin aparición de hiperglicemia o hipoinsulinemia. Stage 2: onset of insulitis but without the appearance of hyperglycemia or hypoinsulinemia.
Estadio 3: debut de la enfermedad. La DT1 se diagnostica en función de la glucemia, hipoinsulinemia y los autoanticuerpos. Cuando la enfermedad llega a este estadio la tasa de células beta restante es ya muy baja. Stage 3: disease onset. T1D is diagnosed based on blood glucose, hypoinsulinemia and autoantibodies. When the disease reaches this stage, the rate of remaining beta cells is already very low.
En los estadios iniciales de la enfermedad, y durante varios años, existe un remanente de células beta productoras de insulina. Los esfuerzos de la comunidad científica se centran en preservar estas células beta en los pacientes. Para ello resulta clave, además de desarrollar un tratamiento eficaz, obtener un diagnóstico precoz de la enfermedad. Se entiende por precoz al inicio de la insulitis, antes de la pérdida de masa crítica funcional de células beta. Por tanto, este diagnóstico debería darse antes de la aparición clínica de la enfermedad (estadio 3) donde ya existe pérdida de células beta suficiente como para llegar a presentar problemas con el control de la glucosa en sangre y el metabolismo de la insulina, es decir, hipoinsulinemia y consecuente hiperglicemia. La posibilidad de una detección precoz en estadios tempranos del desarrollo de la enfermedad guiaría el diseño de un nuevo enfoque terapéutico para prevenir o retrasar el debut de la DT1. Ya existen tratamientos profilácticos que retrasan el debut, como el recientemente aprobado por la FDA teplizumab. In the early stages of the disease, and for several years, there is a remnant of insulin-producing beta cells. The efforts of the scientific community are focused on preserving these beta cells in patients. To do this, it is essential, in addition to developing an effective treatment, to obtain an early diagnosis of the disease. Early diagnosis is understood as the onset of insulitis, before the loss of the functional critical mass of beta cells. Therefore, this diagnosis should be given before the clinical appearance of the disease (stage 3) where there is already sufficient loss of beta cells to cause problems with blood glucose control and insulin metabolism, that is, hypoinsulinemia and consequent hyperglycemia. The possibility of early detection in the early stages of the development of the disease would guide the design of a new therapeutic approach to prevent or delay the onset of T1D. There are already prophylactic treatments that delay the onset, such as the recently approved teplizumab by the FDA.
Actualmente, no existen biomarcadores para el diagnóstico precoz que determinen el inicio de la insulitis previo al debut. Debe tenerse en cuenta que ni la presencia de autoanticuerpos ni la predisposición genética deriva en todos los casos a un debut de DT1. El diagnóstico actualmente se basa en la detección de hiperglicemia, falta de péptido c y presencia de autoanticuerpos. Por tanto, sólo se detecta a los pacientes cuando ya se ha perdido suficiente masa de células beta para que aparezca la DT1 y se mantengan insuficientemente los niveles glucémicos dentro de un rango normal, es decir, cuando aparece insulinodeficiencia. Currently, there are no biomarkers for early diagnosis that determine the onset of insulitis prior to onset. It should be noted that neither the presence of autoantibodies nor genetic predisposition leads to the onset of T1D in all cases. Diagnosis is currently based on the detection of hyperglycemia, lack of peptide c and the presence of autoantibodies. Therefore, patients are only detected when sufficient beta cell mass has already been lost for T1D to appear and blood glucose levels are insufficiently maintained within a normal range, that is, when insulin deficiency appears.
El sistema endocannabinoide desempeña un papel importante en la modulación metabólica e inmunitaria en roedores y humanos. El sistema endocannabinoide está compuesto por al menos dos receptores transmembrana acoplados a proteínas G, el receptor cannabinoide 1 (CB1R) y el receptor cannabinoide 2 (CB2R), sus ligandos y las enzimas sintetizadoras y degradativas. El CB2R, codificado por el genCNR2,se expresa principalmente en las células inmunitarias, y en menor medida en el cerebro, y su activación reduce la liberación de citoquinas y la proliferación de células inmunitarias; el CB2R se considera un regulador clave de la respuesta inmunitaria. El CB1R, codificado por el genCNR1,se expresa en diversos tejidos, como las neuronas del cerebro, los hepatocitos, las células musculares y las células beta del páncreas. Más recientemente se ha observado que el CB1R también se expresa en las células inmunitarias y que desempeña un papel importante en la inflamación. Por su parte, el GPR55, codificado por el genGPR55es un receptor acoplado a proteínas G que puede ser activado tanto por lisofosfatidilinositol como por determinados cannabinoides. Su implicación en el sistema endocannabinoide está siendo estudiada y debatida y parece desempeñar un relevante papel en la regulación del metabolismo óseo, en el control del dolor inflamatorio así como en la proliferación de células tumorales. The endocannabinoid system plays an important role in metabolic and immune modulation in rodents and humans. The endocannabinoid system is composed of at least two G-protein-coupled transmembrane receptors, cannabinoid receptor 1 (CB1R) and cannabinoid receptor 2 (CB2R), their ligands, and synthesizing and degradative enzymes. CB2R, encoded by the CNR2 gene, is mainly expressed in immune cells, and to a lesser extent in the brain, and its activation reduces cytokine release and immune cell proliferation; CB2R is considered a key regulator of the immune response. CB1R, encoded by the CNR1 gene, is expressed in various tissues, such as neurons in the brain, hepatocytes, muscle cells, and beta cells in the pancreas. More recently, it has been observed that CB1R is also expressed in immune cells and that it plays an important role in inflammation. GPR55, encoded by the gene GPR55, is a G protein-coupled receptor that can be activated by both lysophosphatidylinositol and certain cannabinoids. Its involvement in the endocannabinoid system is being studied and debated and appears to play a relevant role in the regulation of bone metabolism, in the control of inflammatory pain, as well as in the proliferation of tumor cells.
Diversas patologías cursan con una desregulación del tono endocannabinoide, incluida la diabetes de tipo 2. En concreto, la expresión del CB1R está regulada al alza en múltiples tejidos, incluidos los islotes de Langerhans, en individuos que presentan obesidad y diabetes de tipo 2 (1) y algunos estudios lo señalan como una posible diana terapéutica (2). En este sentido, se han descrito fármacos antagonistas de los receptores CB1R usados en conjunto con abridores de canales de potasio para el tratamiento de la DT1 y otras afecciones relacionadas. (3). Por otro lado, se ha podido comprobar que GPR55 juega un papel importante en la regulación de la fisiología de los islotes de Langerhans (4). Various pathologies are associated with a deregulation of endocannabinoid tone, including type 2 diabetes. Specifically, CB1R expression is upregulated in multiple tissues, including the islets of Langerhans, in individuals with obesity and type 2 diabetes (1) and some studies point to it as a possible therapeutic target (2). In this regard, CB1R receptor antagonist drugs have been described and used in conjunction with potassium channel openers for the treatment of T1D and other related conditions (3). On the other hand, it has been shown that GPR55 plays an important role in regulating the physiology of the islets of Langerhans (4).
Otro estudio reciente en humanos ha realizado un análisispostmortemdel páncreas de individuos sanos y pacientes con DT1 diagnosticada y de largo recorrido. Entre los individuos inicialmente categorizados como sanos, se ha identificado un grupo de pacientes sin diabetes pero positivos para autoanticuerpos, que se puede catalogar de pre-diabéticos o con altas posibilidades de haber podido desarrollar DT1 a largo plazo. En las muestras de páncreas de dichos pacientes la señalización de CB1R es la más regulada al alza (5). Another recent study in humans has performed a postmortem analysis of the pancreas of healthy individuals and patients with diagnosed and long-standing T1D. Among the individuals initially categorized as healthy, a group of patients without diabetes but positive for autoantibodies has been identified, who can be classified as pre-diabetic or with a high probability of having developed T1D in the long term. In the pancreas samples of these patients, CB1R signaling is the most upregulated (5).
Sin embargo, no se ha contemplado el uso de los niveles de expresión de CB1R como un biomarcador para el diagnóstico de DT1, ni para su detección temprana/precoz o previa al debut. Tampoco se ha señalado hasta la fecha si estos niveles de expresión se encontraban elevados en pacientes con DT1 o en individuos en estadios tempranos de desarrollo de la enfermedad. However, the use of CB1R expression levels as a biomarker for the diagnosis of T1D, or for its early detection or prior to onset, has not been considered. Nor has it been indicated to date whether these expression levels were elevated in patients with T1D or in individuals in early stages of disease development.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN BRIEF DESCRIPTION OF THE INVENTION
La presente invención proporciona nuevos biomarcadores precoces y no invasivos de la DT1: los niveles de expresión de los receptoresCNR1yGPR55en células mononucleares periféricas de la sangre. Estos receptores son marcadores precoces del proceso de la insulitis previo a la pérdida de la masa funcional de células beta y la insulinodeficiencia. Su detección y cuantificación se realiza en muestras de sangre, en concreto en células mononucleares periféricas de la sangre, y más concretamente en linfocitos CD4+ circulantes, lo que deriva en un método de diagnóstico precoz mínimamente invasivo, seguro para el paciente y sencillo para su puesta en práctica. The present invention provides new early and non-invasive biomarkers of T1D: the expression levels of the CNR1 and GPR55 receptors in peripheral blood mononuclear cells. These receptors are early markers of the insulitis process prior to the loss of functional beta cell mass and insulin deficiency. Their detection and quantification is carried out in blood samples, specifically in peripheral blood mononuclear cells, and more specifically in circulating CD4+ lymphocytes, which results in a minimally invasive early diagnosis method that is safe for the patient and easy to implement.
La determinación cuantitativa de los niveles de expresión de estos biomarcadores permite el diagnóstico temprano del inicio de la insulitis previo a la pérdida de masa funcional de células beta. Los niveles de expresión de estos biomarcadores pueden combinarse con, o adelantarse a, la detección de autoanticuerpos (AA), en pacientes con predisposición genética, lo que hace posible una intervención temprana y el seguimiento del paciente para evitar cetoacidosis diabética. También es aplicable en pacientes sin predisposición genética, en combinación con la detección de AA. Se trata por tanto de un método de diagnostico previo al debut de la enfermedad. Quantitative determination of the expression levels of these biomarkers allows for early diagnosis of the onset of insulitis prior to the loss of functional beta cell mass. The expression levels of these biomarkers can be combined with, or preceded by, the detection of autoantibodies (AA) in patients with a genetic predisposition, which makes possible early intervention and patient monitoring to prevent diabetic ketoacidosis. It is also applicable in patients without a genetic predisposition, in combination with the detection of AA. It is therefore a method of diagnosis prior to the onset of the disease.
Los datos experimentales muestran cómo los linfocitos CD4+ circulantes de pacientes con debut reciente (menos de 2 ± 2 meses) de DT1 expresan niveles elevados de los receptoresCNR1yGPR55comparados con pacientes sanos. Experimental data show how circulating CD4+ lymphocytes from patients with recent onset (less than 2 ± 2 months) of T1D express elevated levels of the CNR1 and GPR55 receptors compared to healthy patients.
Existen grandes limitaciones a la hora de obtener datos para su estudio de pacientes de forma previa al debut de la enfermedad. La principal limitación es la propia falta de un método que permita identificar a dichos pacientes, problema al que la presente invención da respuesta. Los estudios poblacionales realizados hasta la fecha en este sentido, especialmente en el norte de Europa, han recogido muestras de sangre y plasma para su almacenamiento a largo plazo, cara a realizar un seguimiento de los individuos objeto del estudio y localizar a aquellos que finalmente desarrollen DT1. Sin embargo, no se dispone de un catálogo de muestras de células aisladas de sangre periférica sobre el que poder estudiar marcadores como los que se proponen en la presente invención. There are major limitations when it comes to obtaining data for studying patients prior to the onset of the disease. The main limitation is the lack of a method to identify these patients, a problem that the present invention addresses. The population studies carried out to date in this regard, especially in northern Europe, have collected blood and plasma samples for long-term storage, in order to monitor the individuals studied and locate those who eventually develop T1D. However, there is no catalogue of samples of cells isolated from peripheral blood on which to study markers such as those proposed in the present invention.
La realización de este tipo de estudios implica, además de la obtención y almacenamiento a muy largo plazo de muestras celulares aisladas de sangre fresca, disponer de un muy elevado número de individuos sujetos a estudio debido a la escasa prevalencia de la DT1 en la población. Serían necesarios grandes grupos poblacionales para poder localizar un número suficiente de pacientes que finalmente desarrollen DT1 sobre el que realizar un estudio comparativo cuyos resultados resulten estadísticamente significativos. Conducting this type of study involves, in addition to obtaining and storing isolated cell samples from fresh blood for a very long time, having a very high number of individuals to study due to the low prevalence of T1D in the population. Large population groups would be necessary to locate a sufficient number of patients who ultimately develop T1D in order to conduct a comparative study with statistically significant results.
Al no disponer de un método alternativo para seleccionar a ese grupo de pacientes que se encuentran en un estadio previo al debut de la DT1, no se dispone de datos sobre los que realizar una comparativa de la expresión diferencial de biomarcadores entre dicho grupo de pacientes e individuos sanos. Since there is no alternative method to select this group of patients who are in a stage prior to the onset of T1D, there is no data available on which to compare the differential expression of biomarkers between this group of patients and healthy individuals.
Se debe considerar a este respecto que el desarrollo de la DT1 es progresivo, tal y como se ha mencionado anteriormente, y que no se presenta en forma de brote o desarrollo súbito. Todo lo contrario, se trata de una enfermedad de patología progresiva sin un fenotipo claro hasta que la degradación de masa funcional de células beta acumulada es suficiente para generar un fallo que resulta evidente de manera fisiológica. Así pues, los niveles de expresión de los marcadores de la enfermedad aumentan de forma progresiva con el desarrollo de la enfermedad, que puede tomar años hasta manifestarse fisiológicamente. Por tanto, se puede inferir que los niveles de expresión de los biomarcadores que presenta un individuo una vez se produce el debut de la enfermedad son muy similares a los que ese mismo individuo presenta antes del debut de la enfermedad. Es por ello que se han seleccionado pacientes con debut reciente (menos de 2 ± 2 meses) de DT1 para la identificación de los marcadores de la invención. It should be noted in this regard that the development of T1D is progressive, as mentioned above, and that it does not present itself in the form of an outbreak or sudden development. On the contrary, it is a disease with a progressive pathology without a clear phenotype until the degradation of the accumulated functional mass of beta cells is sufficient to generate a failure that is physiologically evident. Thus, the expression levels of the disease markers increase progressively with the development of the disease, which can take years to manifest physiologically. Therefore, it can be inferred that the expression levels of the biomarkers that an individual presents once the onset of the disease occurs are very similar to those that the same individual presents before the onset of the disease. For this reason, patients with recent onset (less than 2 ± 2 months) of T1D have been selected for the identification of the markers of the invention.
Por otro lado, gracias al paralelismo con otras patologías y a los estudios desarrollados en ellas, se concluye que la sobreactivación en el tejido patológico se refleja en una sobreactivación a nivel sistémico. Por tanto, la sobreexpresión de los marcadores detectados a nivel sistémico, en este casoCNR1yGPR55,ocurre a la vez que ocurre en el páncreas y es reflejo del grado desarrollo de la DT1. On the other hand, thanks to the parallelism with other pathologies and the studies developed in them, it is concluded that the overactivation in the pathological tissue is reflected in an overactivation at the systemic level. Therefore, the overexpression of the markers detected at the systemic level, in this case CNR1 and GPR55, occurs at the same time as it occurs in the pancreas and is a reflection of the degree of development of T1D.
Así pues los niveles de expresión deCNR1y/oGPR55constituyen biomarcadores sistémicos que dan cuenta de una sobreactivación en el tejido patológico, en este caso pancreático, y que se encuentra sobreexpresados en linfocitos T CD4+ aislados de muestras de sangre de pacientes con debut reciente (menos de 2 ± 2 meses) de DT1, como aproximación más cercana posible a la situación que muestran los pacientes previo al debut de la enfermedad. Thus, the expression levels of CNR1 and/or GPR55 constitute systemic biomarkers that indicate an overactivation in the pathological tissue, in this case pancreatic, and that are overexpressed in CD4+ T lymphocytes isolated from blood samples of patients with recent onset (less than 2 ± 2 months) of T1D, as the closest possible approximation to the situation shown by patients prior to the onset of the disease.
Un primer aspecto de la invención describe el usoin vitrode los niveles de expresión deCNR1y/oGPR55,preferiblemente de forma simultánea, en linfocitos T CD4+ como biomarcadores para diagnosticar de forma previa al debut y/o pronosticar la DT1. A first aspect of the invention describes the in vitro use of CNR1 and/or GPR55 expression levels, preferably simultaneously, in CD4+ T cells as biomarkers for pre-onset diagnosis and/or prognosis of T1D.
En el contexto de la presente invención,GPR55se define como las moléculas de ácido nucleico de secuencia SEQ ID NO:1, que corresponde a la secuencia de referencia NCBI: NG_050956.1 In the context of the present invention, GPR55 is defined as nucleic acid molecules of sequence SEQ ID NO:1, which corresponds to the NCBI reference sequence: NG_050956.1
GPR55se define también como las moléculas de ácido nucleico que se transcriben en la secuencia de ARNm SEQ ID NO: 2, que corresponde a la secuencia de referencia NCBI: NM_005683.4 GPR55 is also defined as nucleic acid molecules that are transcribed into the mRNA sequence SEQ ID NO: 2, which corresponds to the NCBI reference sequence: NM_005683.4
En el contexto de la presente invención,CNR1se define como las moléculas de ácido nucleico SEQ ID NO: 3, que corresponde a la secuencia de referencia NCBI: NC_000006.12. In the context of the present invention, CNR1 is defined as the nucleic acid molecules SEQ ID NO: 3, which corresponds to the NCBI reference sequence: NC_000006.12.
CNR1se define también como las moléculas de ácido nucleico que se transcriben en las siguientes secuencias de ARNm: CNR1 is also defined as nucleic acid molecules that are transcribed into the following mRNA sequences:
SEQ ID NO: 4 que corresponde a la secuencia de referencia NCBI: NM_016083.6, SEQ ID NO: 4 corresponding to the NCBI reference sequence: NM_016083.6,
SEQ ID NO: 5 que corresponde a la secuencia de referencia NCBI: NM_001160226.3, SEQ ID NO: 5 corresponding to the NCBI reference sequence: NM_001160226.3,
SEQ ID NO: 6 que corresponde a la secuencia de referencia NCBI: NM_001160258.3, SEQ ID NO: 6 which corresponds to the NCBI reference sequence: NM_001160258.3,
SEQ ID NO: 7 que corresponde a la secuencia de referencia NCBI: NM_001160259.3, SEQ ID NO: 7 which corresponds to the NCBI reference sequence: NM_001160259.3,
SEQ ID NO: 8 que corresponde a la secuencia de referencia NCBI: NM_033181.4 (isoforma b). SEQ ID NO: 8 which corresponds to the NCBI reference sequence: NM_033181.4 (isoform b).
Según se deriva de los resultados que se describen más adelante en los ejemplos de realización de la invención, la sobreexpresión deCNR1y/oGPR55en linfocitos T CD4+ se correlaciona con la posterior aparición de la diabetes mellitus tipo 1. As derived from the results described below in the embodiments of the invention, overexpression of CNR1 and/or GPR55 in CD4+ T lymphocytes correlates with the later onset of type 1 diabetes mellitus.
Un segundo aspecto de la invención describe un perfil de expresión de biomarcadores adecuado para diagnosticar de forma previa al debut y/o pronosticar la diabetes mellitus tipo 1 que comprende los niveles de expresión deCNR1y/oGPR55,preferiblemente de forma simultánea, en linfocitos T CD4+, donde la sobreexpresión deCNR1y/oGPR55es indicador de estadios tempranos de diabetes mellitus tipo 1. A second aspect of the invention describes a biomarker expression profile suitable for diagnosing type 1 diabetes mellitus prior to onset and/or prognosing it, comprising the expression levels of CNR1 and/or GPR55, preferably simultaneously, in CD4+ T cells, where the overexpression of CNR1 and/or GPR55 is an indicator of early stages of type 1 diabetes mellitus.
Un tercer aspecto de la invención describe un métodoin vitrode obtención de datos útiles para diagnosticar de forma previa al debut y/o pronosticar diabetes mellitus tipo 1 que comprende medir los niveles de expresión deCNR1y/oGPR55,preferentemente de forma simultánea, en linfocitos T CD4+ previamente aislados de una muestra de sangre previamente aislada de un individuo. A third aspect of the invention describes an in vitro method for obtaining data useful for diagnosing type 1 diabetes mellitus prior to onset and/or prognosing it, which comprises measuring the expression levels of CNR1 and/or GPR55, preferably simultaneously, in CD4+ T lymphocytes previously isolated from a blood sample previously isolated from an individual.
Un cuarto aspecto de la invención describe métodoin vitropara diagnosticar de forma previa al debut y/o pronosticar diabetes mellitus tipo 1 severa que comprende: A fourth aspect of the invention describes an in vitro method for diagnosing and/or predicting severe type 1 diabetes mellitus prior to onset, comprising:
a) medir los niveles de expresión de uno o más deCNR1y/oGPR55,preferentemente de forma simultánea, en linfocitos T CD4+ previamente aislados de una muestra de sangre previamente aislada de un individuo, a) measure the expression levels of one or more of CNR1 and/or GPR55, preferably simultaneously, in CD4+ T lymphocytes previously isolated from a blood sample previously isolated from an individual,
b) comparar los valores obtenidos con los de una muestra de referencia obtenidos de individuos control sanos, y b) compare the values obtained with those of a reference sample obtained from healthy control individuals, and
c) clasificar al individuo en el grupo de individuos que van a padecer diabetes tipo 1 cuando los niveles deCNR1y/oGPR55se encuentran diferencialmente expresados al alza respecto a las muestras de los individuos control sanos. c) classify the individual in the group of individuals who will suffer from type 1 diabetes when the levels of CNR1 and/or GPR55 are differentially expressed upwards compared to the samples of healthy control individuals.
Los métodos de la invención se pueden aplicar con muestras de individuos de cualquier sexo, es decir, hombres o mujeres, y a cualquier edad. The methods of the invention can be applied with samples from individuals of either sex, i.e., men or women, and at any age.
Preferentemente se llevan a cabo en muestras aisladas de individuos que presentan autoanticuerpos asociados a la DT1 tales como autoanticuerpos citoplasmáticos de las células de los islotes pancreáticos, autoanticuerpos frente a la insulina, autoanticuerpos decarboxilasa del ácido glutámico, autoanticuerpos GAD65, autoanticuerpos asociados a insulinoma, IA-2A, autoanticuerpos ICA512, autoanticuerpos proteína tirosina fosfatasa-like o autoanticuerpos del transportador de zinc-8 (ZnT8A). They are preferably carried out on isolated samples from individuals who present autoantibodies associated with T1D such as cytoplasmic autoantibodies of pancreatic islet cells, autoantibodies against insulin, glutamic acid decarboxylase autoantibodies, GAD65 autoantibodies, autoantibodies associated with insulinoma, IA-2A, ICA512 autoantibodies, protein tyrosine phosphatase-like autoantibodies or zinc transporter-8 (ZnT8A) autoantibodies.
En la presente invención se entiende por "pronóstico" la evolución esperada de una enfermedad y se refiere a la valoración de la probabilidad según la cual un sujeto padece una enfermedad, así como a la valoración de su inicio, estado de desarrollo, evolución, o de su regresión, y/o el pronóstico del curso de la enfermedad en el futuro. Como entenderán los expertos en la materia, tal valoración, aunque se prefiere que sea, normalmente puede no ser correcta para el 100% de los sujetos que se van a diagnosticar. El término, sin embargo, requiere que una parte estadísticamente significativa de los sujetos se pueda identificar como que padecen la enfermedad o que tienen predisposición a la misma. Si una parte es estadísticamente significativa se puede determinar sin más por el experto en la materia usando varias herramientas de evaluación estadística bien conocidas, por ejemplo, determinación de intervalos de confianza, determinación de valores de significación P, test de Student o funciones discriminantes de Fisher, medidas no paramétricas de Mann Whitney, correlación de Spearman, regresión logística, regresión lineal, área bajo la curva de ROC (AUC). Preferiblemente, los intervalos de confianza son al menos del 90%, al menos del 95%, al menos del 97%, al menos del 98% o al menos del 99%. Preferiblemente, el valor de p es menor de 0,1, de 0,05, de 0,01, de 0,005 o de 0,0001. Preferiblemente, la presente invención permite detectar correctamente la enfermedad de forma diferencial en al menos el 60%, más preferiblemente en al menos el 70%, mucho más preferiblemente en al menos el 80%, o aún mucho más preferiblemente en al menos el 90% de los sujetos de un determinado grupo o población analizada. In the present invention, "prognosis" is understood as the expected course of a disease and refers to the assessment of the probability that a subject has a disease, as well as the assessment of its onset, stage of development, evolution, or regression, and/or the prognosis of the future course of the disease. As will be understood by those skilled in the art, such an assessment, although preferred, may not typically be correct for 100% of the subjects to be diagnosed. The term, however, requires that a statistically significant portion of the subjects can be identified as having the disease or having a predisposition to it. Whether a portion is statistically significant can be readily determined by the skilled person using various well-known statistical evaluation tools, for example, determination of confidence intervals, determination of significance P values, Student's test or Fisher's discriminant functions, non-parametric Mann Whitney measures, Spearman correlation, logistic regression, linear regression, area under the ROC curve (AUC). Preferably, the confidence intervals are at least 90%, at least 95%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%. Preferably, the p-value is less than 0.1, 0.05, 0.01, 0.005, or 0.0001. Preferably, the present invention enables the disease to be correctly detected differentially in at least 60%, more preferably in at least 70%, much more preferably in at least 80%, or even much more preferably in at least 90% of the subjects in a given group or population analysed.
El primer método de la invención implica la comparación de los niveles de expresión deCNR1y/oGPR55con los niveles deCNR1y/oGPR55de una muestra de referencia o con un valor mediano de individuos sanos. En el contexto de la presente invención, se entiende por "muestra de referencia" la muestra que se usa para determinar la variación de los niveles de expresión deCNR1y/oGPR55de la presente invención. The first method of the invention involves comparing the expression levels of CNR1 and/or GPR55 with the levels of CNR1 and/or GPR55 of a reference sample or with a median value of healthy individuals. In the context of the present invention, "reference sample" means the sample used to determine the variation in the expression levels of CNR1 and/or GPR55 of the present invention.
Preferiblemente, se toman muestras de referencia de varios individuos y se combinan, de modo que el valor de referencia refleje el valor medio de dichas moléculas en la población de individuos sanos. "Valor de referencia" es el nivel de expresión deCNR1y/oGPR55en una muestra de referencia. El perfil de expresión en la muestra de referencia de preferencia puede ser generado a partir de una población de dos o más personas. La población, por ejemplo, pueden contener 10, 15, 20, 30, 40, 50 o más personas. Preferably, reference samples are taken from several individuals and combined, such that the reference value reflects the average value of such molecules in the population of healthy individuals. "Reference value" is the expression level of CNR1 and/or GPR55 in a reference sample. The expression profile in the reference sample may preferably be generated from a population of two or more individuals. The population may, for example, contain 10, 15, 20, 30, 40, 50 or more individuals.
La detección la cantidad de producto de expresión deCNR1y/oGPR55,puede realizarse por cualquier medio conocido en el estado de la técnica. The detection of the amount of CNR1 and/or GPR55 expression product can be carried out by any means known in the state of the art.
Los niveles de expresión van a dar un determinado “perfil de expresión”. El término "nivel de expresión", también denominado "cantidad producto" o "cantidad de producto de expresión" se refiere al material bioquímico, en concreto ARNm. Expression levels will give a certain “expression profile”. The term “expression level”, also called “product quantity” or “quantity of expression product” refers to the biochemical material, specifically mRNA.
La medida de la cantidad o la concentración de producto de expresión preferiblemente de manera semi-cuantitativa o cuantitativa, puede ser llevada a cabo de manera directa o indirecta. La medida directa se refiere a la medida de la cantidad o la concentración del producto de expresión, está correlacionada directamente con el número de moléculas de ARN. Dicha señal (a la que también podemos referirnos como señal de intensidad) puede obtenerse, por ejemplo, midiendo un valor de intensidad de una propiedad química o física de dichos productos. La medida indirecta incluye la medida obtenida de un componente secundario o un sistema de medida biológica (por ejemplo la medida de respuestas celulares, ligandos, "etiqueta" o productos de reacción enzimática). The measurement of the amount or concentration of the expression product, preferably in a semi-quantitative or quantitative manner, can be carried out directly or indirectly. Direct measurement refers to the measurement of the amount or concentration of the expression product, which is directly correlated with the number of RNA molecules. Such a signal (which can also be referred to as an intensity signal) can be obtained, for example, by measuring an intensity value of a chemical or physical property of said products. Indirect measurement includes the measurement obtained from a secondary component or a biological measurement system (for example the measurement of cellular responses, ligands, "labels" or enzymatic reaction products).
El término "cantidad", tal y como se utiliza en la descripción, se refiere pero no se limita, a la cantidad absoluta o relativa de los productos de expresión, así como a cualquier otro valor o parámetro relacionado con los mismos o que pueda derivarse de éstos. Dichos valores o parámetros comprenden valores de intensidad de la señal obtenidos a partir de cualquiera de las propiedades físicas o químicas de dichos productos de expresión obtenidos mediante medida directa. Adicionalmente, dichos valores o parámetros incluyen todos aquellos obtenidos mediante medida indirecta, por ejemplo, cualquiera de los sistemas de medida descritos en otra parte del presente documento. The term "quantity" as used in the description refers to, but is not limited to, the absolute or relative quantity of the expression products, as well as any other value or parameter related to them or that can be derived from them. Such values or parameters include signal intensity values obtained from any of the physical or chemical properties of said expression products obtained by direct measurement. Additionally, such values or parameters include all those obtained by indirect measurement, for example, any of the measurement systems described elsewhere in this document.
El término "comparación", tal y como se utiliza en la descripción, se refiere pero no se limita, a la comparación de la cantidad del productos de expresión deCNR1y/oGPR55de la muestra biológica a analizar, también llamada muestra biológica problema, con una cantidad de los productos de expresión deCNR1y/oGPR55de una o varias muestras de referencia. La muestra de referencia puede ser analizada, por ejemplo, simultánea o consecutivamente, junto con la muestra biológica problema. The term "comparison" as used in the description refers to, but is not limited to, the comparison of the amount of CNR1 and/or GPR55 expression products of the biological sample to be analyzed, also called the test biological sample, with an amount of CNR1 and/or GPR55 expression products of one or more reference samples. The reference sample may be analyzed, for example, simultaneously or consecutively, together with the test biological sample.
En la invención, el método para determinar el resultado, es decir, el nivel de expresión deCNR1y/oGPR55,no necesita estar particularmente limitado. In the invention, the method for determining the result, i.e., the expression level of CNR1 and/or GPR55, does not need to be particularly limited.
Los métodos de la invención preferentemente llevan a cabo la determinación de los niveles de expresión mediante: The methods of the invention preferably carry out the determination of expression levels by:
(i) un micromatriz, y/o (i) a microarray, and/or
(ii) un método que comprende PCR (reacción en cadena de la polimerasa), tal como PCR en tiempo real o RT-PCR o digital PCR (dPCR) y/o (ii) a method comprising PCR (polymerase chain reaction), such as real-time PCR or RT-PCR or digital PCR (dPCR) and/or
(iii) un Northern Blot y/o (iii) a Northern Blot and/or
(iv) un inmunoensayo, como un método de inmunohistoquímica o un método basado en ELISA. (iv) an immunoassay, such as an immunohistochemistry method or an ELISA-based method.
La PCR (reacción en cadena de la polimerasa) cuantitativa en tiempo real (generalmente abreviada como RQ-PCR, RT-qPCR, rt-PCR o qPCR) es una técnica de cuantificación de la expresión de ARNms sensible y reproducible que se puede usar particularmente para perfilar la expresión de ARNm en células y tejidos. Se puede utilizar cualquier método para evaluar los resultados de la RT-PCR, y se puede preferir el método ACt y el método AACt. El método AACt se describe en detalle por Livak et al.. (Ct = Valores umbral de ciclo). El AACt-method incluirá una 'muestra de control' y una 'muestra de sujeto'. La 'muestra de sujeto' es una muestra del sujeto a analizar. Típicamente, se utilizan varias réplicas para cada concentración diluida para derivar la eficiencia de amplificación. La eficiencia de la amplificación por PCR se puede definir como porcentaje de amplificación (de 0 a 1). Durante la reacción de qPCR, un software mide típicamente para cada muestra el número de ciclo en el que la fluorescencia (indicador de amplificación por PCR) cruza una línea arbitraria, el umbral. Este punto de cruce es el valor Ct. Real-time quantitative PCR (polymerase chain reaction) (usually abbreviated as RQ-PCR, RT-qPCR, rt-PCR or qPCR) is a sensitive and reproducible mRNA expression quantification technique that can be particularly used to profile mRNA expression in cells and tissues. Any method can be used to evaluate RT-PCR results, and the ACt method and the AACt method may be preferred. The AACt-method is described in detail by Livak et al.. (Ct = Cycle Threshold Values). The AACt-method will include a 'control sample' and a 'subject sample'. The 'subject sample' is a sample from the subject to be tested. Typically, several replicates are used for each diluted concentration to derive amplification efficiency. PCR amplification efficiency can be defined as percentage amplification (from 0 to 1). During the qPCR reaction, software typically measures for each sample the cycle number at which fluorescence (indicator of PCR amplification) crosses an arbitrary line, the threshold. This crossing point is the Ct value.
Una micromatriz es una matriz sobre un sustrato sólido (generalmente una lámina de vidrio o una célula de película delgada de silicio) que analiza grandes cantidades de material biológico, en el presente caso una gran cantidad de ARNm o, preferiblemente, sus transcritos de ADN inversos, que son detectables mediante sondas específicas inmovilizadas sobre el sustrato sólido. A microarray is an array on a solid substrate (usually a glass slide or a silicon thin film cell) that analyzes large amounts of biological material, in this case a large amount of mRNA or, preferably, its reverse DNA transcripts, which are detectable by specific probes immobilized on the solid substrate.
Una transferencia Northern implica el uso de electroforesis para separar muestras de ARN por tamaño y detección posterior con una sonda de hibridación complementaria a (parte de) la secuencia diana del ARN de interés. A Northern blot involves the use of electrophoresis to separate RNA samples by size and subsequent detection with a hybridization probe complementary to (part of) the target RNA sequence of interest.
El término "inmunoensayo", tal y como se utiliza en la presente descripción se refiere a cualquier técnica analítica que se basa en la reacción de la conjugación de un anticuerpo con un antígeno. Ejemplos de inmunoensayos conocidos en el estado de la técnica son, por ejemplo, pero sin limitarse: inmunoblot, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), inmunoensayo lineal (LIA), radioinmunoensayo (RIA), inmunofluoresecencia, x-map o chips de proteína. En otra realización preferida, el inmunoensayo es un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas o ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay). El ELISA se basa en la premisa de que un inmunorreactivo (antígeno o anticuerpo) puede ser inmovilizado en un soporte sólido, poniendo luego ese sistema en contacto con una fase fluida que contiene el reactivo complementario que puede unirse a un compuesto marcador. Existen diferentes tipos de ELISA: ELISA directo, ELISA indirecto o ELISA sándwich. El término "compuesto marcador", tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a un compuesto capaz de dar lugar a una señal cromogénica, fluorogénica, radiactiva y/o quimioluminiscente que permita la detección y cuantificación de la cantidad de anticuerpos frente a CNR1 y/o GPR55. El compuesto marcador se selecciona de la lista que comprende radioisótopos, enzimas, fluoroforos o cualquier molécula susceptible de ser conjugada con otra molécula o detectada y/o cuantificada de forma directa. Este compuesto marcador puede unirse al anticuerpo directamente, o a través de otro compuesto. Algunos ejemplos de compuestos marcadores que se unen directamente son, pero sin limitarse, enzimas como la fosfatasa alcalina o la peroxidasa, isótopos radiactivos como 32P o 35S, fluorocromos como fluoresceína o partículas metálicas, para su detección directa mediante colorimetría, autoradiografía, fluorimetría, o metalografía respectivamente. The term "immunoassay" as used in the present description refers to any analytical technique that is based on the conjugation reaction of an antibody with an antigen. Examples of immunoassays known in the state of the art are, for example, but not limited to: immunoblot, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), linear immunoassay (LIA), radioimmunoassay (RIA), immunofluorescence, x-map or protein chips. In another preferred embodiment, the immunoassay is an enzyme-linked immunosorbent assay or ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay). The ELISA is based on the premise that an immunoreactive (antigen or antibody) can be immobilized on a solid support, then putting that system in contact with a fluid phase containing the complementary reagent that can bind to a marker compound. There are different types of ELISA: direct ELISA, indirect ELISA or sandwich ELISA. The term "marker compound", as used in the present description, refers to a compound capable of giving rise to a chromogenic, fluorogenic, radioactive and/or chemiluminescent signal that allows the detection and quantification of the amount of antibodies against CNR1 and/or GPR55. The marker compound is selected from the list comprising radioisotopes, enzymes, fluorophores or any molecule capable of being conjugated with another molecule or detected and/or quantified directly. This marker compound can bind to the antibody directly, or through another compound. Some examples of marker compounds that bind directly are, but are not limited to, enzymes such as alkaline phosphatase or peroxidase, radioactive isotopes such as 32P or 35S, fluorochromes such as fluorescein or metallic particles, for their direct detection by colorimetry, autoradiography, fluorimetry, or metallography respectively.
En el método de la presente invención, la expresión del ARNm puede normalizarse, preferiblemente en relación con la expresión de otra molécula de ARN. Existen métodos de normalización bien conocidos en el estado de la técnica. In the method of the present invention, the expression of the mRNA can be normalized, preferably relative to the expression of another RNA molecule. Normalization methods are well known in the art.
Una vez que los niveles de expresión en relación con los valores de referencia se han determinado, es necesario identificar si existen alteraciones en la expresión (aumento o disminución de la expresión). La expresión (y los niveles del producto de expresión del gen) se considera aumentada en una muestra de la materia objeto de estudio cuando los niveles de incremento con respecto a la muestra de referencia son al menos de un 5%, por lo menos 10%, por lo menos 15%, por lo menos el 20%, al menos un 25%, por lo menos 30%, por lo menos el 35%, por lo menos el 40%, por lo menos 45%, por lo menos el 50%, por lo menos el 55%, por lo menos el 60%, por menos por lo menos 65%, por lo menos el 70%, por lo menos el 75%, por lo menos el 80%, por lo menos el 85%, por lo menos el 90%, por lo menos el 95%, por lo menos 100%, por lo menos 110 %, por lo menos 120%, por lo menos 130%, por lo menos 140%, por lo menos 150%, o más. Del mismo modo, la expresión se considerada disminuida cuando sus niveles disminuyen con respecto a la muestra de referencia en al menos un 5%, por lo menos 10%, por lo menos 15%, por lo menos el 20%, por lo menos el 25%, al menos un 30%, por lo menos el 35%, por lo menos el 40%, por lo menos 45%, por lo menos el 50%, por lo menos el 55%, por lo menos el 60%), por lo menos el 65%, por lo menos 70%, por lo menos el 75%, por lo menos el 80%, por lo menos el 85%, por lo menos el 90%, por lo menos el 95%, por lo menos 100% (es decir, ausente). Once the expression levels in relation to the reference values have been determined, it is necessary to identify whether there are alterations in expression (increase or decrease in expression). Expression (and levels of the gene expression product) are considered to be increased in a sample of the subject matter when the levels of increase relative to the reference sample are at least 5%, at least 10%, at least 15%, at least 20%, at least 25%, at least 30%, at least 35%, at least 40%, at least 45%, at least 50%, at least 55%, at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 100%, at least 110%, at least 120%, at least 130%, at least 140%, at least 150%, or more. Similarly, expression is considered decreased when its levels decrease with respect to the reference sample by at least 5%, at least 10%, at least 15%, at least 20%, at least 25%, at least 30%, at least 35%, at least 40%, at least 45%, at least 50%, at least 55%, at least 60%), at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 100% (i.e., absent).
La invención proporciona un método para asignar a un sujeto humano en uno de los dos grupos: el grupo, que comprende sujetos identificables por el método de la invención y el grupo 2, que representa los sujetos restantes. Los individuos identificables por el método de la invención serían aquellos donde los niveles de expresión deCNR1y/oGPR55se encuentran sobreexpresados. Este grupo de pacientes se catalogaría como el grupo de individuos que van a padecer diabetes tipo 1. The invention provides a method for assigning a human subject into one of two groups: group 1, comprising subjects identifiable by the method of the invention and group 2, representing the remaining subjects. Individuals identifiable by the method of the invention would be those where the expression levels of CNR1 and/or GPR55 are overexpressed. This group of patients would be classified as the group of individuals who will suffer from type 1 diabetes.
Un quinto aspecto de la invención describe un kit o dispositivo que comprende al menos uno o más oligonucleótidos capaces de hibridar con los ARNm deCNR1yGPR55en condiciones rigurosas. A fifth aspect of the invention describes a kit or device comprising at least one or more oligonucleotides capable of hybridizing with the mRNAs of CNR1 and GPR55 under stringent conditions.
En una realización preferida el kit o dispositivo de la invención comprende: In a preferred embodiment the kit or device of the invention comprises:
(a) medios para detectar en una muestra biológica obtenida del sujeto los niveles de expresión deCNR1y/oGPR55.(a) means for detecting in a biological sample obtained from the subject the expression levels of CNR1 and/or GPR55.
En una realización más preferida el kit o dispositivo de la invención además comprende: In a more preferred embodiment the kit or device of the invention further comprises:
(b) medios para comparar el nivel de expresión (a) con una muestra de referencia. (b) means of comparing the level of expression (a) with a reference sample.
En realizaciones particulares, el kit se selecciona de (a) un kit adecuado para PCR, (b) un kit adecuado para Northern Blot, (c) un kit adecuado para análisis de micromatrices y (d) un inmunoensayo. También se pueden combinar dos o más de estas realizaciones, de modo que el kit pueda comprender, por ejemplo, tanto (a) como (c). In particular embodiments, the kit is selected from (a) a kit suitable for PCR, (b) a kit suitable for Northern Blot, (c) a kit suitable for microarray analysis, and (d) an immunoassay. Two or more of these embodiments may also be combined, such that the kit may comprise, for example, both (a) and (c).
En una realización preferida el kit o dispositivo que comprende al menos uno o más oligonucleótidos capaces de hibridar conCNR1y/oGPR55.In a preferred embodiment the kit or device comprises at least one or more oligonucleotides capable of hybridizing with CNR1 and/or GPR55.
Se prefiere que dicho oligonucleótido(s) sea capaz de hacerlo en condiciones de astringencia. La astringencia es un término usado en experimentos de hibridación que refleja el grado de complementariedad entre el oligonucleótido y el ácido nucleico; cuanto mayor sea la astringencia, mayor porcentaje de homología entre la sonda y el ácido nucleico unido al filtro. El experto en la materia sabe bien que la temperatura y las concentraciones de sal tienen un efecto directo sobre los resultados que se obtienen. Se reconoce que los resultados de la hibridación están relacionados con el número de grados por debajo de la Tm (temperatura de fusión) del ADN en el que se realiza el experimento. A menudo, las condiciones rigurosas se definen como un lavado con 0.1X SSC (solución salina-citrato de sodio (SSC) tampón a 65 °C. (SSC se proporciona generalmente como una solución madre 20X, que consiste en cloruro de sodio 3 M y citrato de trisodio 300 mM (ajustado a pH 7,0 con HCl)). It is preferred that said oligonucleotide(s) be capable of doing so under stringent conditions. Stringency is a term used in hybridization experiments that reflects the degree of complementarity between the oligonucleotide and the nucleic acid; the higher the stringency, the higher percentage of homology between the probe and the nucleic acid bound to the filter. It is well known to the skilled artisan that temperature and salt concentrations have a direct effect on the results that are obtained. It is recognized that hybridization results are related to the number of degrees below the Tm (melting temperature) of the DNA on which the experiment is performed. Stringent conditions are often defined as a wash with 0.1X SSC (saline-sodium citrate (SSC) buffer) at 65°C. (SSC is usually provided as a 20X stock solution, consisting of 3 M sodium chloride and 300 mM trisodium citrate (adjusted to pH 7.0 with HCl)).
El kit o dispositivo de la invención puede comprender controles, instrucciones de programa e información necesaria para llevar a cabo cualquiera de los métodos de la invención. The kit or device of the invention may comprise controls, program instructions and information necessary to carry out any of the methods of the invention.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso del kit o dispositivo de la invención en el método de la invención en cualquiera de sus realizaciones, aunque su uso no está particularmente limitado. Another aspect of the invention relates to the use of the kit or device of the invention in the method of the invention in any of its embodiments, although its use is not particularly limited.
Otro aspecto de la invención se refiere a un programa de ordenador que comprende instrucciones para realizar el procedimiento de acuerdo con cualquiera de los métodos de la invención. Another aspect of the invention relates to a computer program comprising instructions for performing the procedure according to any of the methods of the invention.
En particular, la invención abarca programas de ordenador dispuestos sobre o dentro de una portadora. La portadora puede ser cualquier entidad o dispositivo capaz de soportar el programa. Como variante, la portadora podría ser un circuito integrado en el que va incluido el programa y que se haya adaptado para ejecutar, o para ser utilizado en la ejecución de los procesos correspondientes. In particular, the invention encompasses computer programs arranged on or within a carrier. The carrier may be any entity or device capable of supporting the program. Alternatively, the carrier could be an integrated circuit in which the program is included and which has been adapted to execute, or to be used in the execution of, the corresponding processes.
Por ejemplo, los programas podrían estar incorporados en un medio de almacenamiento, como una memoria ROM, una memoria CD ROM o una memoria ROM de semiconductor, una memoria USB, o un soporte de grabación magnética, por ejemplo, un disco flexible o un disco duro. Alternativamente, los programas podrían estar soportados en una señal portadora transmisible; por ejemplo, podría tratarse de una señal eléctrica u óptica que podría transportarse a través de cable eléctrico u óptico, por radio o por cualesquiera otros medios. For example, the programs could be embodied in a storage medium such as a ROM, CD-ROM or semiconductor ROM, a USB memory stick, or a magnetic recording medium such as a floppy disk or hard disk. Alternatively, the programs could be supported by a transmissible carrier signal; for example, this could be an electrical or optical signal that could be carried by electrical or optical cable, by radio, or by any other means.
La invención se extiende también a programas de ordenador adaptados para que cualquier medio de procesamiento pueda llevar a la práctica los métodos de la invención. Los programas de ordenador también abarcan aplicaciones en la nube basadas en dicho procedimiento. The invention also extends to computer programs adapted so that any processing means can implement the methods of the invention. The computer programs also encompass cloud applications based on said method.
Otros aspectos de la invención se refieren al medio de almacenamiento legible y a la señal transmisible que comprende instrucciones de programa necesarias para la ejecución del método de invención por un ordenador. Other aspects of the invention relate to the readable storage medium and the transmittable signal comprising program instructions necessary for the execution of the inventive method by a computer.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. Throughout the description and claims the word "comprises" and its variants are not intended to exclude other technical features, additives, components or steps. For those skilled in the art, other objects, advantages and features of the invention will become apparent partly from the description and partly from the practice of the invention. The following examples and drawings are provided by way of illustration, and are not intended to be limiting of the present invention.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS DESCRIPTION OF FIGURES
Figura 1. Niveles de expresión de los receptores de cannabinoides (A)CNR1,(B)CNR2y de (C)GPR55en células mononucleares de sangre periféricas (PBMCs) de donantes sanos y pacientes con debut reciente de DT1 (emparejando edad, sexo y IMC). Los datos muestran PCR a tiempo real. Los datos se analizaron mediante t-test. Figure 1. Expression levels of cannabinoid receptors (A)CNR1, (B)CNR2, and (C)GPR55 in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from healthy donors and patients with recent onset of T1D (matched for age, sex, and BMI). Data show real-time PCR. Data were analyzed by t-test.
Figura 2. Niveles de expresión de los receptores de cannabinoides (A)CNR1,(B)CNR2y de (C)GPR55en células CD4+ T circulantes de donantes sanos y pacientes con debut reciente de DT1 (emparejando edad, sexo y IMC). Los datos muestran PCR a tiempo real. Los datos se analizaron mediante t-test. *p < 0.05. Figure 2. Expression levels of cannabinoid receptors (A)CNR1, (B)CNR2, and (C)GPR55 in circulating CD4+ T cells from healthy donors and patients with recent onset of T1D (matched for age, sex, and BMI). Data show real-time PCR. Data were analyzed by t-test. *p < 0.05.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Receptores cannabinoides como biomarcadores de la diabetes tipo 1 Cannabinoid receptors as biomarkers of type 1 diabetes
Se tomaron muestras de sangre de pacientes sanos y de pacientes que presentaban debut (en la primera cita tras diagnóstico, menos de 2 ± 2 meses) de DT1. Blood samples were taken from healthy patients and from patients presenting with onset (at the first appointment after diagnosis, less than 2 ± 2 months) of T1D.
Los criterios de inclusión para DT1 fueron: DT1 con seguimiento habitual en la Unidad de Diabetes del Hospital Regional Universitario de Málaga con edad comprendida entre 18-65 años, ambos inclusive. HbA1c < 10%. Normopeso, definido como IMC 18.5 - 24.9, ambos inclusive. Los criterios de inclusión para pacientes control fueron: no tener DT1 ni antecedentes familiares directos con DT1. Edad e IMC iguales al grupo de DT1. HbA1c < 5.7%. Los criterios de exclusión fueron: enfermedad inflamatoria o autoinmune distinta de DT1, pacientes con diabetes mellitus tipo 2 o insulinoresistencia. Inclusion criteria for T1D were: T1D with regular follow-up in the Diabetes Unit of the Regional University Hospital of Malaga, aged between 18-65 years, both inclusive. HbA1c < 10%. Normal weight, defined as BMI 18.5 - 24.9, both inclusive. Inclusion criteria for control patients were: not having T1D or direct family history of T1D. Age and BMI equal to the T1D group. HbA1c < 5.7%. Exclusion criteria were: inflammatory or autoimmune disease other than T1D, patients with type 2 diabetes mellitus or insulin resistance.
Concentración de células usadas Concentration of used cells
De las muestras de la sangre fresca, se obtuvieron por separación por centrifugación en Ficoll, las células mononucleares de sangre periféricas (PBMCs). Tras el aislamiento de los PBMCs, se hizo un segundo aislamiento de las células CD4+ a partir de PBMCs utilizando anticuerpos unidos a bolas magnéticas. From fresh blood samples, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were obtained by centrifugation separation on Ficoll. After isolation of PBMCs, a second isolation of CD4+ cells was performed from PBMCs using antibodies attached to magnetic beads.
El ARN se extrajo tanto de las muestras de PBMCs (Figura 1) como de los linfocitos CD4+ (Figura 2). RNA was extracted from both PBMCs samples (Figure 1) and CD4+ lymphocytes (Figure 2).
La expresión génica de los receptoresCNR1, CNR2yGPR55en las muestras de PBMCs se analizó mediante PCR a tiempo real (RT-PCR) utilizando sondas Taqman FAM para cada receptor en multiplex conB-ACTIN-VICcomo gen de referencia. Se probaron como gen de referencia B-ACTIN y TBP y finalmente se eligióB-ACTINcomo gen de referencia por ser más robusto para todos los tipos celulares. Gene expression of CNR1, CNR2 and GPR55 receptors in PBMC samples was analyzed by real-time PCR (RT-PCR) using Taqman FAM probes for each receptor in multiplex with B-ACTIN-VIC as reference gene. B-ACTIN and TBP were tested as reference gene and finally B-ACTIN was chosen as reference gene because it is more robust for all cell types.
Por su parte, se aislaron linfocitos T CD4+ de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de pacientes al inicio de la DT1 (n=18) y de no diabéticos (n=10), y se extrajo ARN. La expresión deCNR1, CNR2yGPR55se analizó igualmente mediante PCR en tiempo real. CD4+ T cells were isolated from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of patients at the onset of T1D (n=18) and non-diabetics (n=10), and RNA was extracted. The expression of CNR1, CNR2 and GPR55 was also analyzed by real-time PCR.
La expresión de los receptores cannabinoides en linfocitos T CD4+ (Figura 2) se encuentra alterada en pacientes que presentan debut de DT1. Específicamente, los receptores CB1R y GPR55 están elevados en pacientes con debut reciente de DT1 comparándolos con los no diabéticos. Por otro lado, el receptor CB2R, clásicamente relacionado a la respuesta inmune, no se modifica. The expression of cannabinoid receptors in CD4+ T cells (Figure 2) is altered in patients with new onset of T1D. Specifically, the CB1R and GPR55 receptors are elevated in patients with recent onset of T1D compared to non-diabetics. On the other hand, the CB2R receptor, classically related to the immune response, is not modified.
Los linfocitos T CD4+ derivados de pacientes con debut reciente de DT1 expresaron 1,5 veces másCNR1-fulllength que las de pacientes de control (p < 0,05), y ninguna expresóCNR1-b.CD4+ T cells derived from patients with recent onset of T1D expressed 1.5 times more CNR1-fulllength than those from control patients (p < 0.05), and none expressed CNR1-b.
La expresión normalizada máxima deCNR1en linfocitos T CD4+ de los pacientes control fue de 3,42, mientras que los pacientes con debut reciente de DT1 mostraron una expresión de 0,1 a 530,6. Respecto aGPR55,la expresión máxima en células T CD4+ en el control fue de 2,63, y en los pacientes con debut reciente de DT1 la expresión varió de 0,2 a 11,7. The maximum normalized expression of CNR1 in CD4+ T cells of control patients was 3.42, while patients with recent onset of T1D showed an expression of 0.1 to 530.6. Regarding GPR55, the maximum expression in CD4+ T cells in the control was 2.63, and in patients with recent onset of T1D the expression ranged from 0.2 to 11.7.
La diferencia en el nivel de expresión en linfocitos T CD4+ tanto deCNR1como deGPR55entre pacientes con debut reciente de DT1 e individuos sanos resultó estadísticamente significativa (p < 0,05), (Figura 2), viéndose ambos genes sobreexpreados en los pacientes con debut reciente de DT1. The difference in the level of expression in CD4+ T lymphocytes of both CNR1 and GPR55 between patients with recent onset of T1D and healthy individuals was statistically significant (p < 0.05), (Figure 2), with both genes being overexpressed in patients with recent onset of T1D.
Existe una relación inversa en la expresión deCNR1yGPR55en pacientes sanos, con una disminución deGPR55en aquellos pacientes con mayores niveles deCNR1.Mientras que en debutantes de DT1 se presenta un aumento de los niveles de expresión en ambos genes. There is an inverse relationship in the expression of CNR1 and GPR55 in healthy patients, with a decrease in GPR55 in those patients with higher levels of CNR1. While in patients with new onset T1D, there is an increase in the expression levels of both genes.
Referencias References
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Also Published As
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