ES2970828T3

ES2970828T3 - Nuevos anticuerpos anti-lam

Info

Publication number: ES2970828T3
Application number: ES17750586T
Authority: ES
Inventors: Abraham Pinter; Deendayal Patel; Alok Choudhary
Original assignee: Rutgers State University of New Jersey
Current assignee: Rutgers State University of New Jersey
Priority date: 2016-02-10
Filing date: 2017-02-01
Publication date: 2024-05-30
Anticipated expiration: 2037-02-01
Also published as: CN110092830A; JP7316685B2; US11273220B2; EP3414573A1; RU2732502C2; US11707525B2; AU2024205286A1; CN110092830B; BR112018016226A2; AU2017218415B2; CA3013904A1; ZA202307912B; US10729771B2; RU2018131622A; US20190038747A1; US20200316199A1; RU2018131622A3; AU2017218415A1; JP7813481B2; US20220168420A1

Abstract

La presente invención proporciona en términos generales diferentes composiciones, kits, vectores y métodos que incluyen anticuerpos monoclonales dirigidos a epítopos encontrados dentro del lipoarabinomanano (LAM) y fosfatidil-mioinositol manósido 6 (PIM6) para el diagnóstico y tratamiento de infecciones por Mycobacterium tuberculosis. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Nuevos anticuerpos anti-lam

REFERENCIA CRUZADA A LA SOLICITUD RELACIONADA

Esta solicitud reivindica prioridad sobre la Solicitud Provisional de EE. UU. núm. 62/293.406, presentada el 10 de febrero de 2016.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

Se describen aquí composiciones, kits, vectores y métodos que incluyen anticuerpos dirigidos contra epítopos encontrados en lipoarabinomanano (LAM), lipomanano (LM) y fosfatidil-mioinositol manósido 6 (PIM6) para el diagnóstico, prevención y tratamiento de infecciones porMycobacterium tuberculosis.

LISTADO DE SECUENCIAS

La presente descripción contiene un Listado de Secuencias.

ANTECEDENTES

A. Mycobacterium tuberculosis

La tuberculosis (TB) sigue siendo una de las enfermedades transmisibles más mortales del mundo, infectando actualmente aproximadamente a 1/3 de la población mundial. Según el Informe Mundial sobre Tuberculosis de la OMS, 2014: Tuberculosis, en 2013, se estima que 9,0 millones de personas desarrollaron tuberculosis, y 1,5 millones murieron a causa de la enfermedad. Aunque actualmente existen medicamentos eficaces disponibles para la tuberculosis, estos requieren tratamientos prolongados con múltiples antibióticos, y están cada vez más comprometidos por el desarrollo de cepas multirresistentes (MDR-TB), que actualmente son responsables de alrededor del 3,5 % de las infecciones recientes. Estas cepas son mucho más difíciles de tratar y tienen tasas de curación significativamente más bajas. También se están propagando las cepas de tuberculosis extremadamente resistentes a fármacos (XDR-TB), que son incluso más caras y difíciles de tratar que las cepas de MDR-TB, y ya se han informado en 100 países de todo el mundo. En consecuencia, se necesitan nuevos enfoques para el diagnóstico y tratamiento más tempranos de las infecciones por tuberculosis.

B. Lipoarabinomanano (LAM)

El glicolípido lipoarabinomanano (LAM) es un importante componente estructural y antigénico de la pared celular de los miembros delcomplejo Mycobacterium tuberculosis,y media en una serie de funciones importantes que promueven la infección productiva y el desarrollo de enfermedades. LAM también es una diana de inmunodiagnóstico importante para detectar la infección activa por tuberculosis, especialmente en pacientes coinfectados con VIH-1, y una diana potencial para la vacuna. A pesar de la importancia de LAM como diana de inmunodiagnóstico y su importante papel en la fisiología de la infección y patogenicidad deM.tb,sorprendentemente se sabe poco sobre la naturaleza de la respuesta humoral humana contra este antígeno. Los anticuerpos monoclonales específicos de LAM previamente disponibles se han obtenido de ratones inmunizados con LAM purificado de Mycobacterium leprae o Mycobacterium tuberculosis, y no ha habido descripciones de ningún anticuerpo monoclonal humano contra LAM que se haya inducido en respuesta a la inmunización o a la infección por Mycobacterium tuberculosis.

Lipomanano (LM) es el precursor inmediato de LAM, y contiene un dominio de fosfatidil-mioinositol modificado por un dominio de manano compuesto por una cadena principal de Manp enlazada a través de a (1^6 ) sustituida con cadenas laterales cortas de a(1^ 2)--manopiranosilo, pero sin cadenas laterales de arabinosa

C. Fosfatidil-mioinositol manósido 6 (PIM6)

PIM6 es un producto de PIM2, un precursor común de LM y LAM. El núcleo de estas moléculas es una estructura de mioinositol glicosilada con una unidad de Manp en las posiciones 2 y 6. En PIM6, la unidad de Manp en las posiciones 6 se sustituye además por dos azúcares terminales a-Manp enlazados a través de (1^2 ) idénticos a la caperuza de manosa en ManLAM. Estas moléculas están aciladas por hasta 4 cadenas de ácidos grasos, unidas al grupo principal de inositol y al resto de Man central, que anclan de forma no covalente estas moléculas a las membranas internas y externas de la envoltura celular. Se informó que PIM6 se une a lectinas de tipo C y a DC-SIGN, el principal receptor en células dendríticas, y que es un fuerte agonista de TLR2 y un potenciador de la replicación del VIH-1 que posee potentes actividades antiinflamatorias.

El documento US 2001/0007660 A1 se refiere a composiciones que comprenden un anticuerpo monoclonal que reacciona con epítopos de superficie deM. tuberculosis,a métodos para tratar la tuberculosis inmunizando pasivamente a un sujeto usando las composiciones de anticuerpo, determinantes antigénicos para uso como vacuna para proteger contra infección deM. tuberculosis,y a un método de uso de la vacuna para prevenir infecciones deM. tuberculosis.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La invención se expone en el conjunto de reivindicaciones adjunto. Las realizaciones y/o ejemplos de la siguiente descripción que no están cubiertos por las reivindicaciones adjuntas no se consideran como parte de la presente invención. Las referencias a métodos de tratamiento en los párrafos siguientes de esta descripción deben interpretarse como referencias a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico).

La presente invención es como se define en las reivindicaciones. Es decir, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal humano antilipoarabinomanano (anti-LAM), o una porción de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a un epítopo de LAM que comprende una estructura Ara4, una estructura Ara6, o una combinación de las mismas, en la que el anticuerpo anti-LAM comprende una región variable de cadena ligera de CDR1 que tiene SEQ ID NO: 1, una región variable de cadena ligera de CDR2 que tiene SEQ ID NO: 2, una región variable de cadena ligera de CDR3 que tiene SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 26, una región variable de cadena pesada de CDR1 que tiene SEQ ID NO: 4, una región variable de cadena pesada de CDR2 que tiene SEQ ID NO: 5, y una región variable de cadena pesada de CDR3 que tiene SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 23. Dicho anticuerpo puede comprender opcionalmente una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:21 y SEQ ID NO:23, y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 y SEQ ID NO: 26. Dicho anticuerpo puede ser opcionalmente un anticuerpo scFv-IgG, un IgA o un IgM.

Se describen aquí nuevos anticuerpos monoclonales (mAb) anti-LAM y anti-PIM6/LAM para el diagnóstico y tratamiento de infecciones por Mycobacterium tuberculosis. A continuación se describen el aislamiento y la caracterización de estos nuevos anticuerpos humanos específicos para glicolípidos de Mycobacterium tuberculosis, incluidos mAb humanos específicos para epítopos de LAM, y un mAb humano específico para un epítopo compartido por LAM y PIM6.

Por consiguiente, se describe aquí un anticuerpo monoclonal humano anti-lipoarabinomanano (anti-LAM), o una porción de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a un epítopo de LAM que incluye una estructura Ara4, una estructura Ara6, o una combinación de las mismas, en el que el anticuerpo anti-lipoarabinomanano (anti-LAM) incluye una región ligera variable de CDR1 que tiene al menos un 80 % de identidad con SEQ ID NO: 1 o fragmentos antigénicos de la misma, una región ligera variable de CDR2 que tiene al menos un 80 % de identidad con SEQ ID NO: 2 o fragmentos antigénicos de la misma, una región ligera variable de CDR3 que tiene al menos un 80 % de identidad con SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 26 o fragmentos antigénicos de la misma, una región pesada variable de CDR1 que tiene al menos un 80 % de identidad con SEQ ID NO: 4 o fragmentos antigénicos de la misma, una región pesada variable de CDR2 que tiene al menos un 80 % de identidad con SEQ ID NO: 5 o fragmentos antigénicos de la misma, y una región pesada variable de CDR3 que tiene al menos un 80 % de identidad con SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 23 o fragmentos antigénicos de la misma. El anticuerpo monoclonal humano anti-LAM o su porción de unión a antígeno puede incluir una región variable de cadena pesada que incluye las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:21 y SEQ ID NO:23, y una región variable de cadena ligera que incluye las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 y SEQ ID NO: 26. El anticuerpo anti-LAM puede ser un anticuerpo scFv-IgG, un IgA o un IgM. Un ejemplo de un anticuerpo anti-LAM es A194.

También se describe aquí un anticuerpo monoclonal humano anti-LAM o una porción de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a un epítopo de LAM que incluye al menos una de: una estructura Ara4 encaperuzada con manosa y una estructura Ara6 encaperuzada con manosa. El anticuerpo anti-LAM puede incluir una región ligera variable de CDR1 que tiene al menos un 80 % de identidad con SEQ ID NO: 7 o fragmentos antigénicos de la misma, una región ligera variable de CDR2 que tiene al menos un 80 % de identidad con SEQ ID NO: 8 o fragmentos antigénicos de la misma, una región ligera variable de CDR3 que tiene al menos un 80 % de identidad con SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 32 o fragmentos antigénicos de la misma, una región pesada variable de CDR1 que tiene al menos un 80 % de identidad con SEQ ID NO: 10 o fragmentos antigénicos de la misma, una región pesada variable de CDR2 que tiene al menos un 80 % de identidad con SEQ ID NO: 11 o fragmentos antigénicos de la misma, y una región pesada variable de CDR3 que tiene al menos un 80 % de identidad con SEQ ID NO: 12 o SEQ ID NO: 29 o fragmentos antigénicos de la misma. El anticuerpo puede incluir una región variable de cadena pesada que incluye la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:43, y una región variable de cadena ligera que incluye la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:44. El anticuerpo anti-LAM puede ser, por ejemplo, un anticuerpo IgM o IgA. Un ejemplo de un anticuerpo anti-LAM es P3B09.

Se describe aquí además un anticuerpo anti-LAM monoclonal humano, o una porción de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a un epítopo de LAM que incluye una estructura a-Manp enlazada a través de (1^2 ) unida a un extremo no reductor de Ara4 o Ara6, en el que el anticuerpo anti-LAM incluye una región ligera variable de CDR1 que tiene al menos un 80 % de identidad con SEQ ID NO: 7 o fragmentos antigénicos de la misma, una región ligera variable de CDR2 que tiene al menos un 80 % de identidad con SEQ ID NO: 8 o fragmentos antigénicos de la misma, una región ligera variable de CDR3 que tiene al menos un 80 % de identidad con SEQ ID NO: 9 o fragmentos antigénicos de la misma, una región pesada variable de CDR1 que tiene al menos un 80 % de identidad con SEQ ID NO: 10 o fragmentos antigénicos de la misma, una región pesada variable de CDR2 que tiene al menos un 80 % de identidad con SEQ ID NO: 11 o fragmentos antigénicos de la misma, y una región pesada variable de CDR3 que tiene al menos un 80 % de identidad con SEQ ID NO: 12 o fragmentos antigénicos de la misma. El anticuerpo anti-LAM (por ejemplo, P3B09) puede ser, por ejemplo, un anticuerpo IgM o IgA.

Aún se describe aquí además un anticuerpo monoclonal humano anti-PIM6/LAM, o una porción de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a un epítopo presente en LAM y PIM6, incluyendo el epítopo al menos una estructura de polimanosa. El epítopo está en el dominio de manano de PIM6, y también está presente en el lipomanano (LM) micobacteriano. El anticuerpo anti-PIM6/LAM puede incluir una región ligera variable de CDR1 que tiene al menos un 80 % de identidad con SEQ ID NO: 13 o fragmentos antigénicos de la misma, una región ligera variable de CDR2 que tiene al menos un 80 % de identidad con SEQ ID NO: 14 o fragmentos antigénicos de la misma, una región ligera variable de CDR3 que tiene al menos un 80 % de identidad con SEQ ID NO: 15 o fragmentos antigénicos de la misma, una región pesada variable de CDR1 que tiene al menos un 80 % de identidad con SEQ ID NO: 16 o fragmentos antigénicos de la misma, una región pesada variable de CDR2 que tiene al menos un 80 % de identidad con SEQ ID NO: 17 o fragmentos antigénicos de la misma, y una región pesada variable de CDR3 que tiene al menos un 80 % de identidad con SEQ ID NO: 18 o fragmentos antigénicos de la misma. El anticuerpo puede incluir, por ejemplo, una región variable de cadena pesada que incluye la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:47, y una región variable de cadena ligera que incluye la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:48. El anticuerpo anti-PIM6/LAM puede ser, por ejemplo, un anticuerpo IgM, IgA o IgG. Un ejemplo de un anticuerpo anti-PIM6/LAM es P95C1.

También se describe aquí un kit para detectar al menos un epítopo de LAM. El kit incluye (a) al menos un primer anticuerpo anti-LAM que se une específicamente a un epítopo de LAM; (b) un soporte al que está unido el al menos primer anticuerpo anti-LAM; (c) un anticuerpo de detección que se une específicamente a LAM, o específicamente al al menos primer anticuerpo anti-LAM, en el que el anticuerpo de detección está marcado con una molécula informadora; y (d) un amortiguador. El al menos primer anticuerpo anti-LAM es, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal humano anti-LAM como se describe aquí. El anticuerpo de detección puede ser, por ejemplo, un segundo anticuerpo anti-LAM que se une específicamente a LAM. En algunos casos, el al menos uno del primer anticuerpo anti-LAM y el segundo anticuerpo anti-LAM es un anticuerpo scFv-IgG o IgM, e incluye una región ligera variable de CDR1 que tiene al menos un 80 % de identidad con SEQ ID NO: 1 o fragmentos antigénicos de la misma, una región ligera variable de CDR2 que tiene al menos un 80 % de identidad con SEQ ID NO: 2 o fragmentos antigénicos de la misma, una región ligera variable de CDR3 que tiene al menos un 80 % de identidad con SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 26 o fragmentos antigénicos de la misma, una región pesada variable de CDR1 que tiene al menos un 80 % de identidad con SEQ ID NO: 4 o fragmentos antigénicos de la misma, una región pesada variable de CDR2 que tiene al menos un 80 % de identidad con SEQ ID NO: 5 o fragmentos antigénicos de la misma, y una región pesada variable de CDR3 que tiene al menos un 80 % de identidad con SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO:23, o fragmentos antigénicos de la misma. En algunos casos del kit, al menos uno del primer anticuerpo anti-LAM y el segundo anticuerpo anti-LAM incluye una región variable de cadena pesada que incluye las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:21 y SEQ ID NO:23, y una región variable de cadena ligera que incluye las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 y SEQ ID NO: 26.

Todavía se describe aquí un método para diagnosticar una infección activa de tuberculosis en un individuo, que incluye: (a) obtener una muestra de un individuo que incluye o se sospecha que incluye LAM; (b) tratar dicha muestra para exponer epítopos de LAM individuales; (c) poner en contacto dicha muestra con al menos un primer anticuerpo que se une específicamente a un primer epítopo en dicho LAM; (d) poner en contacto dicha muestra con un anticuerpo de detección que se une específicamente a LAM, o específicamente al al menos primer anticuerpo; (e) detectar la unión del al menos primer anticuerpo a dicho primer epítopo en LAM; y (f) diagnosticar que dicho paciente tiene una infección tuberculosa activa, indicando la unión del al menos primer anticuerpo a dicho primer epítopo en LAM una infección tuberculosa activa. El al menos primer anticuerpo es, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal humano anti-LAM o un anticuerpo monoclonal humano anti-PIM6/LAM como se describe aquí. El anticuerpo de detección puede ser, por ejemplo, un anticuerpo anti-LAM que se une específicamente a LAM. En algunos casos del método, el al menos primer anticuerpo y el anticuerpo de detección incluyen cada uno una región ligera variable de CDR1 que tiene al menos un 80 % de identidad con SEQ ID NO: 1 o fragmentos antigénicos de la misma, una región ligera variable de CDR2 que tiene al menos un 80 % de identidad con SEQ ID NO: 2 o fragmentos antigénicos de la misma, una región ligera variable de CDR3 que tiene al menos un 80 % de identidad con SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 26 o fragmentos antigénicos de la misma, una región pesada variable de CDR1 que tiene al menos un 80 % de identidad con SEQ ID NO: 4 o fragmentos antigénicos de la misma, una región pesada variable de CDR2 que tiene al menos un 80 % de identidad con SEQ ID NO: 5 o fragmentos antigénicos de la misma, y una región pesada variable de CDR3 que tiene al menos un 80 % de identidad con SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 23 o fragmentos antigénicos de la misma. En algunos casos del método, al menos uno del primer anticuerpo y el anticuerpo de detección es un anticuerpo scFv-IgG o IgM, e incluye una región de CDR1 que tiene una región ligera variable que tiene al menos un 80 % de identidad con SEQ ID NO: 1 o fragmentos antigénicos de la misma, una región ligera variable de CDR2 que tiene al menos un 80 % de identidad con SEQ ID NO: 2 o fragmentos antigénicos de la misma, una región ligera variable de CDR3 que tiene al menos un 80 % de identidad con SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 26 o fragmentos antigénicos de la misma, una región pesada variable de CDR1 que tiene al menos un 80 % de identidad con SEQ ID NO: 4 o fragmentos antigénicos de la misma, una región pesada variable de CDR2 que tiene al menos un 80 % de identidad con SEQ ID NO: 5 o fragmentos antigénicos de la misma, y una región pesada variable de CDR3 que tiene al menos un 80 % de identidad con SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 23 o fragmentos antigénicos de la misma. En algunos casos, el individuo es un ser humano.

También se describe aquí un método para tratar una infección de tuberculosis en un individuo (por ejemplo, un ser humano). El método incluye administrar a dicho individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un anticuerpo monoclonal humano anti-LAM o un anticuerpo monoclonal humano anti-PIM6/LAM como se describe aquí. El método puede incluir además administrar a dicho individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un antibiótico. La infección tuberculosa puede ser una infección tuberculosa multirresistente (MDR-TB).

Se describen aquí además secuencias nucleotídicas que codifican las cadenas pesadas y las cadenas ligeras (incluidas las regiones variables) de los anticuerpos descritos aquí.

A. Anticuerpos anti-LAM y anticuerpos anti-PIM6/LAM

En algunas realizaciones, la invención proporciona un anticuerpo anti-LAM, o una porción de unión a antígeno del mismo. También se describe aquí un anticuerpo anti-PIM6/LAM, o una porción de unión a antígeno del mismo. Un anticuerpo anti-LAM (o una porción de unión a antígeno del mismo), como se describe aquí, se une específicamente a un epítopo de LAM. Un anticuerpo anti-PIM6/LAM (o una porción de antígeno de unión del mismo), como se describe aquí, se une específicamente tanto a un epítopo de LAM como a un epítopo de PIM6. En algunos casos, los epítopos de LAM y PIM6 derivan de diversas especies micobacterianas. En otros casos, las diversas especies micobacterianas son miembros virulentos del complejo Mycobacterium tuberculosis. En aún otros casos, la especie micobacteriana es Mycobacterium tuberculosis. En algunos casos, el anticuerpo anti-LAM o el anticuerpo anti-PIM6/LAM es un anticuerpo monoclonal (mAb). En casos adicionales, el anticuerpo anti-LAM o el anticuerpo anti-PIM6/LAM es un anticuerpo monoclonal humano anti-LAM o un anticuerpo monoclonal humano anti-PIM6/LAM, respectivamente. En otros casos, el anticuerpo anti-LAM o el anticuerpo anti-PIM6/LAM es un anticuerpo monoclonal humanizado anti-LAM o un anticuerpo anti-PIM6/LAM, respectivamente. En algunos casos, el anticuerpo anti-LAM se une a las estructuras de Ara4 y Ara6.

En algunos casos, el epítopo de LAM es una cadena de arabinosa sin encaperuzar. En algunos casos, el epítopo de LAM es una cadena de arabinosa sin encaperuzar o encaperuzada con una sola manosa, con o sin una sustitución terminal de MTX.

En algunos casos, el epítopo de LAM es una estructura de Ara4 encaperuzada con manosa y una estructura de Ara6 encaperuzada con manosa. En otros casos, el anticuerpo anti-LAM se une específicamente a una estructura de dimanosa enlazada a través de a (1^2), que puede estar unida a una estructura de Ara4/Ara6 o a una estructura de polimanosa (FIG. 8). En algunos casos, el epítopo de PIM6 incluye al menos una estructura de polimanosa también presente en el lipomanano (LM) micobacteriano. En algunos casos, el anticuerpo anti-PIM6/LAM se une específicamente a un epítopo de PIM6 que incluye al menos una estructura de polimanosa en el dominio de manano de PIM6. En algunos casos, el epítopo de LAM incluye al menos una sustitución de metiltioxilosa (MTX) o metilsilfinilxilofuranosilo (MSX). En algunos casos, el epítopo de LAM incluye al menos una sustitución de fosfatidilmioinositol (PILAM). En algunos casos, el epítopo de LAM es una cadena de arabinosa encaperuzada con al menos una manosa, es decir, un epítopo de Man-LAM manosilado. En casos adicionales, la cadena de arabinosa encaperuzada incluye estructuras de Ara4 y/o Ara6. En algunos casos, el epítopo de Man-LAM incluye cadenas de arabinosa sustituidas con monomanosa, cadenas de arabinosa sustituidas con dimanosa, cadenas de arabinosa sustituidas con trimanosa, o combinaciones de las mismas. En algunos casos, el epítopo de Man-LAM incluye estructuras Ara4 y/o Ara6 encaperuzadas con dimanosa o trimanosa. En algunos casos, el epítopo de Man-LAM es Ara6 encaperuzada con dimanosa. En algunos casos, el anticuerpo anti-LAM o el anticuerpo anti-PIM6/LAM incluye un anticuerpo IgG. En casos adicionales, el anticuerpo IgG anti-LAM o el anti-PIM6/LAM incluye una subclase de IgG1, IgG2 o IgG3. En algunos casos, el anticuerpo anti-LAM o el anticuerpo anti-PIM6/LAM no es un anticuerpo IgG. En otros casos, el anticuerpo anti-LAM o el anticuerpo anti-PIM6/LAM incluye un anticuerpo IgA. En otros casos, el anticuerpo anti-LAM o el anticuerpo anti-PIM6/LAM incluye un anticuerpo IgM. En algunos casos, el anticuerpo anti-LAM o el anticuerpo anti-PIM6/LAM incluye un segundo isotipo que se ha cambiado del isotipo aislado originalmente. En algunos casos, el anticuerpo anti-LAM o el anticuerpo anti-PIM6/LAM incluye un anticuerpo recombinante. En algunos casos, el anticuerpo recombinante incluye un anticuerpo IgM multivalente. En casos adicionales, el anticuerpo recombinante incluye un anticuerpo IgM pentavalente. En otros casos, el anticuerpo recombinante incluye un anticuerpo ScFv-IgG, en el que un fragmento Fv monocatenario de un anticuerpo está unido al extremo N de la cadena pesada de ese u otro mAb anti-LAM diferente. En casos adicionales, el anticuerpo recombinante incluye un anticuerpo ScFv-IgG multivalente. En casos adicionales, el anticuerpo recombinante incluye un anticuerpo ScFv-IgG tetravalente homólogo, en el que los dominios de scFv se obtuvieron de las regiones variables del IgG presente en el constructo. En aún otros casos, el anticuerpo recombinante incluye un anticuerpo scFv-IgG tetramérico heterólogo en el que las regiones scFv se obtuvieron de un anticuerpo anti-LAM o anticuerpo anti-PIM6/LAM diferente de la región IgG incluida. En algunos casos, el dominio de scFv incluye una secuencia líder unida a la región pesada variable (VH) del segundo anticuerpo anti-LAM o anticuerpo anti-PIM6/LAM que está unida al dominio ligero variable (VL) de dicho anticuerpo anti-LAM o anticuerpo anti-PIM6/LAM. En otros casos, el dominio de scFv incluye una secuencia líder unida a la región de cadena ligera variable de un primer anticuerpo anti-LAM o anticuerpo anti-PIM6/LAM que está unida a la región pesada variable (VH) de un segundo anticuerpo anti-LAM o anticuerpo anti-PIM6/LAM. En algunos casos, el anticuerpo anti-LAM es un anticuerpo anti-LAM aislado que se une específicamente a un epítopo de LAM (por ejemplo, uno de Ara4 y Ara6 o combinaciones de los mismos, una estructura de dimanosa enlazada a través de a (1^2), que puede estar unida ya sea a una estructura de Ara4/Ara6, o a una estructura de polimanosa). En algunos casos, el anticuerpo anti-LAM no compite con CS-35 ni FIND25. En algunos casos, el anticuerpo anti-PIM6/LAM es un anticuerpo anti-PIM6/LAM aislado que se une específicamente a al menos una estructura de polimanosa en el lipomanano (LM) micobacteriano.

En algunos casos, el anticuerpo anti-LAM o el anticuerpo anti-PIM6/LAM incluye un enlazador flexible. En algunos casos, el enlazador flexible une los correspondientes dominios de cadena pesada y ligera en una molécula monocatenaria. En algunos casos, el enlazador flexible conecta una cadena ligera de inmunoglobulina (IgVL) con una cadena pesada de inmunoglobulina (IgVH). En casos adicionales, el enlazador flexible está compuesto por la fórmula (GGSGG)n (SEQ ID NO: 19), en la que n es cualquier número entero positivo entre 1 y 200 y cualesquiera intervalos intermedios, por ejemplo 1 a 5, 1 a 10, 1 a 15, 1 a 25, 1 a 50, 5 a 10, 5 a 25, 10 a 25, 10 a 50, 1 a 100, 1 a 150, y todos los intervalos intermedios.

El anticuerpo anti-LAM descrito aquí (por ejemplo, P30B9, A194-01) tiene al menos una (por ejemplo, una, dos, tres) región determinante de la complementariedad (CDR) (por ejemplo, CDR1, CDR2, CDR3). En algunos casos, la región ligera variable de CDR1 consiste esencialmente en SEQ ID NO: 1 o fragmentos antigénicos de la misma. En otros casos, la región ligera variable de la región de CDR1 consiste esencialmente en SEQ ID NO: 7 o fragmentos antigénicos de la misma. En otros casos, la región ligera variable de la región de CDR1 consiste esencialmente en SEQ ID NO: 13 o fragmentos antigénicos de la misma. En algunos casos, la región pesada variable de CDR1 consiste esencialmente en SEQ ID NO: 4 o fragmentos antigénicos de la misma. En otros casos, la región pesada variable de la región de CDR1 consiste esencialmente en SEQ ID NO: 10 o fragmentos antigénicos de la misma. En otros casos, la región pesada variable de la región de CDR1 consiste esencialmente en SEQ ID NO: 16 o fragmentos antigénicos de la misma.

En algunos casos, la región ligera variable de CDR2 consiste esencialmente en SEQ ID NO: 2 o fragmentos antigénicos de la misma. En otros casos, la región ligera variable de CDR2 consiste esencialmente en SEQ ID NO: 8 o fragmentos antigénicos de la misma. En otros casos, la región ligera variable de CDR2 consiste esencialmente en SEQ ID NO: 14 o fragmentos antigénicos de la misma. En algunos casos, la región pesada variable de CDR2 consiste esencialmente en SEQ ID NO: 5 o fragmentos antigénicos de la misma. En otros casos, la región pesada variable de la región de CDR2 consiste esencialmente en SEQ ID NO: 11 o fragmentos antigénicos de la misma. En otros casos, la región pesada variable de la región de CDR2 consiste esencialmente en SEQ ID NO: 17 o fragmentos antigénicos de la misma.

En algunos casos, la región ligera variable de CDR3 consiste esencialmente en SEQ ID NO: 3 o fragmentos antigénicos de la misma. En otros casos, la región ligera variable de CDR3 consiste esencialmente en SEQ ID NO: 9 o fragmentos antigénicos de la misma. En otros casos, la región ligera variable de CDR3 consiste esencialmente en SEQ ID NO: 15 o fragmentos antigénicos de la misma. En algunos casos, la región pesada variable de CDR3 consiste esencialmente en SEQ ID NO: 6 o fragmentos antigénicos de la misma. En otros casos, la región pesada variable de la región de CDR3 consiste esencialmente en SEQ ID NO: 12 o fragmentos antigénicos de la misma. En otros casos, la región pesada variable de la región de CDR3 consiste esencialmente en SEQ ID NO: 18 o fragmentos antigénicos de la misma.

En algunos casos, el anticuerpo anti-PIM6/LAM descrito aquí (por ejemplo, P95C1) tiene al menos una (por ejemplo, una, dos, tres) CDR (por ejemplo, CDR1, CDR2, CDR3). En algunos casos, la región ligera variable de CDR1 consiste esencialmente en SEQ ID NO: 13 o fragmentos antigénicos de la misma. En algunos casos, la región pesada variable de CDR1 consiste esencialmente en SEQ ID NO: 16 o fragmentos antigénicos de la misma. En algunos casos, la región ligera variable de CDR2 consiste esencialmente en SEQ ID NO: 14 o fragmentos antigénicos de la misma. En algunos casos, la región pesada variable de CDR2 consiste esencialmente en SEQ ID NO: 17 o fragmentos antigénicos de la misma. En algunos casos, la región ligera variable de CDR3 consiste esencialmente en SEQ ID NO: 15 o fragmentos antigénicos de la misma. En algunos casos, la región pesada variable de CDR3 consiste esencialmente en SEQ ID NO: 18 o fragmentos antigénicos de la misma.

B. Kits y métodos de diagnóstico

La presente descripción facilita kits para detectar la presencia de LAM y/o PIM6 en fluidos biológicos de un sujeto humano. En algunos casos, los componentes de estos ensayos se ensamblan en un dispositivo de flujo lateral (véase la Organización Mundial de la Salud 2015, The use of lateral flow orina lipoarabinomannan assay (LF-LAM) for the diagnostic and screening of active tuberculosis in people living with HIV). En algunos casos, los kits incluyen un primer anticuerpo de captura anti-LAM (por ejemplo, A194-01, P30B9) o anti-PIM6/LAM (por ejemplo, P95C1), un segundo anticuerpo detector (detección) anti-LAM o anti-PIM6/LAM marcado con una molécula informadora, un soporte al que se une el primer anticuerpo anti-LAM o anti-PIM6/LAM, y un amortiguador. En algunos casos, al menos uno del primer anticuerpo anti-LAM o anti-PIM6/LAM y el segundo anticuerpo anti-LAM o anti-PIM6/LAM es un anticuerpo monoclonal humano anti-LAM que se une específicamente a uno de Ara4 y Ara6 o combinaciones de los mismos, o un anticuerpo monoclonal humano anti-PIM6/LAM que se une específicamente al dominio de manano de LAM (y de lipomanano (LM)). En algunos casos, el primer anticuerpo anti-LAM y el segundo anticuerpo anti-LAM se unen a los mismos epítopos de LAM que están presentes en múltiples copias en una única molécula de LAM. En otros casos, el primer anticuerpo anti-LAM y el segundo anticuerpo anti-LAM se unen a diferentes epítopos presentes en una única molécula de LAM. Los epítopos de LAM y PIM6 pueden ser cualquiera de los epítopos de LAM y PIM6 descritos aquí. En otros casos, se incluye un tercer anticuerpo detector (de detección) que se une a un sitio no competitivo del segundo anticuerpo. En algunas realizaciones, el primer anticuerpo y el segundo anticuerpo tienen el mismo isotipo. En otros casos, el primer anticuerpo y el segundo anticuerpo tienen isotipos diferentes. En algunos casos de un ensayo de captura, sólo el anticuerpo de captura o el anticuerpo de detección es un anticuerpo anti-LAM (por ejemplo, A194-01, P30B9) o un anticuerpo anti-PIM6/LAM (por ejemplo, P95C1) como se describe aquí.

Los anticuerpos descritos aquí se pueden usar para aplicaciones de detección y diagnóstico adicionales. Por ejemplo, en un ensayo de diagnóstico, se pueden usar uno o más de los anticuerpos descritos aquí (por ejemplo, A194-01, P30B9, P95C1) para teñir tejidos obtenidos de pacientes para detectar la presencia de LAM en lesiones sospechosas de contener TB o células infectadas con TB (por ejemplo, granulomas). Esto se puede hacer, por ejemplo, con un único anticuerpo como se describe aquí (por ejemplo, A194-01, P30B9, P95C1) que está conjugado con un marcador que permite una detección sensible. En tal método o ensayo, la detección mediante P95C1 de PIM6 o moléculas relacionadas se puede lograr en tejidos infectados. En otro ejemplo, P95C1 se puede usar en un ensayo de competición de PIM6, en el que la captura de una forma marcada de PIM6 por P95C1 inmovilizado compite con PIM6 soluble presente en un fluido biológico (por ejemplo, sangre u orina) de un sujeto. En ausencia de PIM6 soluble, esto daría como resultado la captura de una señal, que sería competida por la presencia de PIM6 soluble (véase er World Health Organization, 2015 Policy Guidance- The use of lateral flow urine lipoarabinomannan assay (LF-LAM) for the diagnosis and screening of active tuberculosis in people living with HIV).

La presente descripción facilita kits para distinguir entre un miembro patógeno del complejo Mycobacterium tuberculosis y un miembro no patógeno del complejo Mycobacterium tuberculosis. En algunos casos, el anticuerpo anti-LAM es un anticuerpo monoclonal humano anti-LAM que se une específicamente a una de las estructuras de Ara4 y Ara6 con o sin una sustitución de Man o MTX-Man o combinaciones de las mismas, o un anticuerpo anti-PIM6/LAM que se une específicamente a al menos una estructura de polimanosa en PIM6 o en el dominio de manano de LAM. En algunos casos, el anticuerpo anti-LAM se une específicamente a un epítopo de Man-LAM que incluye cadenas laterales sustituidas con dimanosa, cadenas laterales sustituidas con trimanosa, o combinaciones de las mismas. En casos adicionales, el anticuerpo anti-LAM se une específicamente a epítopos de Man-LAM que incluyen estructuras de Ara4 y/o Ara6 encaperuzadas con dimanosa o trimanosa. En aún otros casos, el anticuerpo anti-LAM se une específicamente a estructuras de Ara6 encaperuzadas con dimanosa.

La presente descripción facilita métodos para diagnosticar una infección tuberculosa activa en un individuo. En algunos casos, el anticuerpo anti-LAM o anti PIM6/LAM puede modificarse con una etiqueta sensible y usarse para identificar material relacionado con PIM6 o LAM micobacteriano en una muestra de tejido, como diagnóstico de infección y localización de tuberculosis. En algunos casos, el método implica la captura de LAM soluble, e incluye las etapas de (a) obtener una muestra de un individuo que incluye LAM; (b) tratar la muestra para aislar o exponer dicho LAM, (c) capturar dicho LAM aislado o expuesto con un primer anticuerpo anti-LAM que se une a un primer epítopo en dicho LAM; (d) poner en contacto dicho LAM aislado o expuesto con un segundo anticuerpo anti-LAM, en el que dicho segundo anticuerpo anti-LAM se une a un segundo epítopo en dicho LAM; (e) detectar la unión de al menos uno de dicho primer anticuerpo anti-LAM y dicho segundo anticuerpo anti-LAM a dicho LAM; y (f) diagnosticar que dicho paciente tiene una infección de tuberculosis activa, en el que dicha presencia de unión de al menos uno de dicho primer anticuerpo anti-LAM y dicho segundo anticuerpo anti-LAM a dicho LAM indica una infección de tuberculosis activa. En algunos casos, al menos uno del primer anticuerpo anti-LAM y del segundo anticuerpo anti-LAM es un anticuerpo monoclonal humano anti-LAM que se une específicamente a uno de Ara4 y Ara6 o combinaciones de los mismos. En algunos casos, al menos uno del primer y segundo anticuerpos es un anticuerpo monoclonal humano anti-PIM6/LAM que se une específicamente a al menos una estructura de polimanosa en el dominio de manano de LAM. En casos adicionales, el primer anticuerpo y el segundo anticuerpo tienen isotipos diferentes. En algunas realizaciones, al menos uno del primer anticuerpo y el segundo anticuerpo son anticuerpos recombinantes. En otros casos, ni el primer anticuerpo ni el segundo anticuerpo son anticuerpos recombinantes. En aún otros casos, tanto el primer anticuerpo como el segundo anticuerpo son anticuerpos recombinantes.

La presente descripción permite métodos para cuantificar la cantidad de LAM y/o PIM6 presente en una muestra. En algunos casos, el método incluye las etapas de (a) obtener una muestra que incluye LAM y/o PIM6; (b) poner en contacto dicha muestra con un anticuerpo anti-LAM y/o un anticuerpo anti-PIM6; (c) detectar la presencia de unión específica del anticuerpo anti-LAM a dicho LAM y/o la unión del anticuerpo anti-PIM6/LAM a dicho LAM o dicho PIM6; y (d) cuantificar la cantidad de LAM o PIM6 en dicha muestra. En algunos casos, el anticuerpo anti-LAM es un anticuerpo monoclonal humano anti-LAM que se une específicamente a uno de Ara4 y Ara6 o combinaciones de los mismos. En algunos casos, el anticuerpo anti-PIM6/LAM es un anticuerpo monoclonal humano anti-PIM6/LAM que se une específicamente a al menos una estructura de polimanosa en el dominio de manano de PIM6 (por ejemplo, a al menos una estructura de polimanosa en lipomanano (LM) micobacteriano). En algunos casos, la cuantificación de dicha cantidad de LAM y/o PIM6 se logra comparando la intensidad de la señal con la de una muestra de control diluida en serie que tiene una concentración conocida de LAM y/o PIM6.

La presente descripción permite métodos para diagnosticar que un individuo está infectado con Mycobacterium tuberculosis. En algunos casos, el método incluye las etapas de (a) obtener una muestra que incluye LAM o PIM6; (b) poner en contacto dicha muestra con un anticuerpo anti-LAM y/o un anticuerpo anti-PIM6, en el que el anticuerpo anti-LAM se une específicamente a un epítopo de LAM que incluye Man-LAM que tiene al menos una sustitución de 5-desoxi-5-metiltiopentofuranosilo (MTX), y el anticuerpo anti-PIM6/LAM se une específicamente a un epítopo que incluye al menos una estructura de polimanosa en el dominio de manano de LAM, y (c) detectar la presencia de unión específica del anticuerpo anti-LAM a dicho Man-LAM y/o la presencia de unión específica del anticuerpo anti-PIM6/LAM a dicho PIM6. En algunos casos, el anticuerpo anti-LAM es un anticuerpo monoclonal humano anti-LAM que se une específicamente a uno de Ara4 y Ara6 o combinaciones de los mismos. En algunos casos, el anticuerpo anti-PIM6/LAM es un anticuerpo monoclonal humano anti-PIM6/LAM (por ejemplo, P95C1) que se une específicamente a al menos una estructura de polimanosa en el dominio de manano de PIM6.

El método puede incluir una etapa de amplificación que aumenta la sensibilidad del método de detección. Los ejemplos implican la generación de sitios diana adicionales mediante el uso del kit de amplificación de señal de tiramida (Perkin-Elmer) o la amplificación de la señal inicial mediante el uso del sistema de amplificación ELISA (Thermo Fisher).

La presente descripción facilita métodos para diferenciar entre un miembro patógeno del complejo Mycobacterium tuberculosis y un miembro no patógeno del complejo Mycobacterium tuberculosis. En algunos casos, el método incluye las etapas de (a) obtener una muestra que comprende LAM y/o PIM6; (b) poner en contacto dicha muestra con un anticuerpo anti-LAM que se une específicamente a un epítopo de Man-LAM que incluye cadenas laterales sustituidas con dimanosa, cadenas laterales sustituidas con trimanosa o combinaciones de las mismas, o con un anticuerpo anti-PIM6/LAM que se une específicamente a al menos una estructura de polimanosa en el dominio de manano de PIM6; y (c) detectar la presencia de unión específica del anticuerpo anti-LAM a dicho Man-LAM, o la presencia de la unión específica del anticuerpo anti-PIM6/LAM a dicha al menos una estructura de polimanosa en el dominio de manano de PIM6, en el que la presencia de dicha unión específica indica la presencia de un miembro patógeno del complejo Mycobacterium tuberculosis. En algunos casos, el anticuerpo anti-LAM es un anticuerpo monoclonal humano anti-LAM que se une específicamente a uno de Ara4 y Ara6 o combinaciones de los mismos. En casos adicionales, el epítopo de Man-LAM incluye estructuras de Ara4 y/o Ara6 encaperuzadas con dimanosa o trimanosa. En otros casos, el epítopo de Man-LAM es Ara6 encaperuzada con dimanosa. En algunos casos, el anticuerpo anti-PIM6/LAM es un anticuerpo monoclonal humano anti-PIM6/LAM que se une específicamente a al menos una estructura de polimanosa en el dominio de manano de PIM6.

C. Composiciones terapéuticas, métodos, vacunas, y vectores

La presente descripción facilita métodos para tratar la infección por un miembro virulento delcomplejo Mycobacterium tuberculosisen un individuo. En algunos casos, el método incluye administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un anticuerpo anti-LAM o un anticuerpo anti-PIM6/LAM a un individuo expuesto a M.tb infecciosa. En casos adicionales, el método incluye la administración de al menos un antibiótico. En algunos casos, la infección de tuberculosis está activa. En otros casos, la infección de tuberculosis está latente. En algunos casos, la infección se debe a una cepa de tuberculosis multirresistente (MDR). En otros casos, la infección se debe a una cepa de tuberculosis extremadamente resistente a fármacos (XDR).

La presente descripción facilita una terapia combinada para tratar la infección por un miembro virulento del complejo Mycobacterium tuberculosis en un individuo. En algunos casos, el método incluye administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un primer anticuerpo anti-LAM que se une específicamente a un primer epítopo de LAM que incluye al menos uno de LAM no sustituido, Man-LAM monomanosilado, LAM sustituido con MSX, y combinaciones de los mismos, o un primer anticuerpo anti-PIM6/LAM que se une específicamente a al menos una estructura de polimanosa en el dominio de manano de PIM6 y LAM; y administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un segundo anticuerpo anti-LAM que se une específicamente a un segundo epítopo de LAM que incluye al menos uno de Man-LAM sustituido con dimanosa, Man-LAM sustituido con trimanosa, y combinaciones de los mismos. En algunos casos, el primer anticuerpo y el segundo anticuerpo se administran simultáneamente (por ejemplo, en una única composición, o en dos composiciones administradas al mismo tiempo). En otros casos, el primer anticuerpo y el segundo anticuerpo se administran en momentos diferentes. En algunos casos, al menos uno del primer anticuerpo anti-LAM y del segundo anticuerpo anti-LAM es un anticuerpo monoclonal humano anti-LAM que se une específicamente a uno de Ara4 y Ara6 o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-PIM6/LAM es un anticuerpo monoclonal humano anti-PIM6 que se une específicamente a al menos una estructura de polimanosa en PIM6 y/o en el dominio de manano de reacción cruzada de PIM6 de LAM. En algunos casos, el primer anticuerpo anti-LAM y el segundo anticuerpo anti-LAM, o el anticuerpo anti-PIM6/LAM tienen isotipos diferentes. En algunos casos, al menos uno del primer anticuerpo anti-LAM y del segundo anticuerpo anti-LAM, y el anticuerpo anti-PIM6/LAM, son anticuerpos recombinantes. En otros casos, ni el primer anticuerpo anti-LAM ni el segundo anticuerpo anti-LAM, ni el anticuerpo anti-PIM6/LAM, son anticuerpos recombinantes. En aún otros casos, tanto el primer anticuerpo anti-LAM como el segundo anticuerpo anti-LAM, o el anticuerpo anti-PIM6/LAM, son anticuerpos recombinantes. En casos adicionales, el método incluye la administración de al menos un antibiótico. En tales casos, el al menos un antibiótico se puede administrar (por ejemplo, coadministrar) simultáneamente con el primer y segundo anticuerpos, o el al menos un antibiótico se puede administrar en un momento diferente del momento de la administración del primer y segundo anticuerpos. En algunos casos, la infección está activa. En otros casos, la infección está latente. En algunas realizaciones, la infección es una infección de tuberculosis multirresistente (MDR). En otros casos, la infección es una infección de tuberculosis extremadamente resistente a fármacos (XDR).

La presente descripción facilita vacunas o composiciones farmacéuticas para prevenir la infección por un miembro virulento del complejo Mycobacterium tuberculosis. En algunos casos, la descripción proporciona un método para estimular una respuesta inmune del hospedante en un paciente, que incluye administrar a dicho paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un antígeno LAM y/o un antígeno PIM6. En algunos casos, estos antígenos se conjugan con portadores de proteínas inmunogénicas, y/o se coadministran con un adyuvante que estimula potentemente una respuesta inmune a los antígenos glicolípidos. En algunos casos, la vacuna o composición farmacéutica induce un anticuerpo anti-LAM que se une específicamente a un epítopo de Man-LAM, y/o un anticuerpo anti-PIM6/LAM que se une específicamente a al menos una estructura de polimanosa en el dominio de manano de PIM6. En casos adicionales, el epítopo de Man-LAM presente en la vacuna o en las composiciones farmacéuticas incluye estructuras de Ara4 y/o Ara6 encaperuzadas con dimanosa o trimanosa. En otros casos, el epítopo de Man-LAM es Ara6 encaperuzada con dimanosa. En algunos casos, el epítopo de Man-LAM tiene al menos una sustitución de MTX. En algunos casos, el anticuerpo anti-LAM y/o el anticuerpo anti-PIM6/LAM es un anticuerpo IgM. En otros casos, el anticuerpo anti-LAM y/o el anticuerpo anti-PIM6/LAM es un anticuerpo recombinante.

La presente descripción facilita un método para prevenir la infección por un miembro virulento del complejo Mycobacterium tuberculosis en un individuo mediante la administración pasiva de un anticuerpo protector. En algunos casos, el anticuerpo anti-LAM es un anticuerpo monoclonal humano anti-LAM que se une específicamente a uno de Ara4 y Ara6 o combinaciones de los mismos. En algunos casos, el anticuerpo anti-PIM6/LAM es un anticuerpo monoclonal humano anti-PIM6/LAM que se une específicamente a al menos una estructura de polimanosa en el dominio de manano de PIM6 y LAM. En algunos casos, el método incluye administrar a un individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-LAM que se une específicamente a un epítopo de Man-LAM, y/o un anticuerpo anti-PIM6 que se une específicamente a un epítopo de PIM6 (por ejemplo, un epítopo compartido por PIM6 y LAM). En casos adicionales, el epítopo de ManLAM diana incluye estructuras Ara4 y/o Ara6 encaperuzadas con dimanosa o trimanosa. En aún otros casos, el epítopo de ManLAM es Ara6 encaperuzado con dimanosa. En algunos casos, el epítipo de ManLAM tiene al menos una sustitución de MTX. En algunos casos, el anticuerpo anti-LAM o el anticuerpo anti-PIM6/LAM es un anticuerpo IgM. En otros casos, el anticuerpo anti-LAM o el anticuerpo anti-PIM6/LAM es un anticuerpo recombinante.

La presente descripción facilita la administración pasiva de un anticuerpo protector mediante vectores recombinantes. En algunos casos, los vectores recombinantes incluyen un primer ácido nucleico que codifica una IgVL de un anticuerpo anti-LAM y un segundo ácido nucleico que codifica una IgVH de un anticuerpo anti-LAM, en los que cada uno de los ácidos nucleicos está operativamente enlazado a una región promotora. En algunos casos, al menos una de IgVL e IgVH deriva de un anticuerpo monoclonal humano anti-LAM que se une específicamente a uno de Ara4 y Ara6 o combinaciones de los mismos. En otros casos, los vectores recombinantes incluyen un primer ácido nucleico que codifica una IgVL de un anticuerpo anti-PIM6/LAM y un segundo ácido nucleico que codifica una IgVH de un anticuerpo anti-PIM6/LAM, en los que cada uno de los ácidos nucleicos está operativamente enlazado a una región promotora. En algunos casos, los vectores recombinantes incluyen elementos reguladores transcripcionales adicionales. En algunos casos, al menos una de la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda secuencia de ácido nucleico están organizadas en un operón. En algunos casos, al menos una de la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda secuencia de ácido nucleico están organizadas en un casete de expresión. En algunos casos, la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda secuencia de ácido nucleico están organizadas en un único casete de expresión. En algunos casos, el primer ácido nucleico y el segundo ácido nucleico están situados en el mismo vector de clonación. En otros casos, el primer ácido nucleico y el segundo ácido nucleico están ubicados en diferentes vectores de clonación. En algunos casos, la expresión del primer ácido nucleico y del segundo ácido nucleico puede ser concomitante. En otros casos, la expresión del primer ácido nucleico y del segundo ácido nucleico es inducible de forma separable. En algunos casos, la expresión del primer ácido nucleico puede estar temporalmente separada de la expresión del segundo ácido nucleico. En algunos casos, el vector recombinante es un plásmido. En otras realizaciones, el vector recombinante es un virus no replicado. En casos adicionales, el vector recombinante es un virus adenoasociado.

La presente descripción facilita un método para tratar la infección por un miembro virulento del complejo Mycobacterium tuberculosis en un individuo. En algunos casos, el método incluye administrar a un individuo un primer ácido nucleico que codifica una IgVH de un anticuerpo anti-LAM, y un segundo ácido nucleico que codifica una IgVL de un anticuerpo anti-LAM, en el que cada uno de los ácidos nucleicos es operativamente enlazado a una región promotora. En otros casos, el método incluye administrar a un individuo un primer ácido nucleico que codifica una IgVH de un anticuerpo anti-PIM6/LAM, y un segundo ácido nucleico que codifica una IgVL de un anticuerpo anti-PIM6/LAM, en el que cada uno de los ácidos nucleicos están operativamente enlazados a una región promotora. En algunos casos, al menos una de la IgVL e IgVH deriva de un anticuerpo monoclonal humano anti-LAM que se une específicamente a uno de Ara4 y Ara6 o combinaciones de los mismos, o de un anticuerpo monoclonal humano anti-PIM6/LAM que se une específicamente a al menos una estructura de polimanosa en el dominio de manano de PIM6. En algunos casos, el primer ácido nucleico y el segundo ácido nucleico están situados en el mismo vector de clonación. En otros casos, el primer ácido nucleico y el segundo ácido nucleico están ubicados en diferentes vectores de clonación. En algunos casos, el vector recombinante es un plásmido. En otros casos, el vector recombinante es un virus no replicado. En casos adicionales, el vector recombinante es un virus adenoasociado.

En caso de conflicto, prevalecerá la presente memoria descriptiva, incluyendo las definiciones. Las realizaciones particulares que se analizan a continuación son sólo ilustrativas y no pretenden ser limitativas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

FIG. 1A- Modelo de forma IgG de A194-01 y fragmentos de la misma usados en ensayos de competición de unión. Estos incluyeron estructuras scFv y Fab monovalentes, y dímero de scFv divalente, e IgG natural. 1 B-Curvas de competición que muestran que las formas monovalentes de A194-01 compitieron con menos eficacia que las formas divalentes. 1C- Estructura de la forma de valencia superior de A194-01. Esta representa un A194-01 scFv-IgG tetravalente homólogo, que contiene un dominio de scFv de A194-01 unido al extremo N de cada una de las cadenas pesadas normales.

FIG. 2A- Actividad de unión de las formas IgG e IgM de P30B9, e IgM en las que se eliminó el inserto de 6 aminoácidos en la región VH, o las 9 mutaciones mutáticas somáticas en la región VH se revirtieron a la secuencia de la línea germinal más cercana, a ManLAM derivado de Mycobacterium tuberculosis. El inserto de 6 aminoácidos contribuyó en mayor medida a la reactividad que las 9 mutaciones de ácidos somáticas. Las FIG. 2B y 2C comparan la reactividad de las formas IgM e IgG de P30B9 y la mutación con la deleción de 6 aminoácidos en la cadena pesada contra ManLAM de Mycobacterium tuberculosis (B) y PILAM de Mycobacterium smegmatis (C). La forma IgM, pero no la forma IgG, reaccionó específicamente con ManLAM derivado de Mycobacterium tuberculosis (2B) pero no con PILAM (2C), y la reactividad del aminoácido mutante A6 fue muy reducida para ManLAM y negativa para PILAM.

FIG. 3- Comparación de la reactividad de 2 mAb humanos y 4 mAb de ratón frente a PILAM en el panel izquierdo, y frente a ManLAM aislado de la cepa H37Rv de Mycobacterium tuberculosis en el panel derecho. Se trazaron curvas usando las concentraciones molares de los anticuerpos, para controlar los diferentes pesos moleculares de estos agentes reaccionantes.

FIG. 4A- Estructuras de 25 oligosacáridos sintéticos que representan estructuras de glucanos microbianos relacionadas con motivos presentes en LAM. Estas estructuras se acoplaron a la proteína transportadora BSA, y se usaron para investigar la especificidad del epítopo. 4B- Perfiles de unión para seis anticuerpos monoclonales específicos de LAM contra un panel de 25 oligosacáridos sintéticos. Los resultados de unión se muestran para tres concentraciones, y las afinidades relativas de los anticuerpos por estos antígenos se indican mediante el patrón de titulación.

FIG. 5- Panel izquierdo- estructura de IgA1 (A), IgA2 (B), y complejo dimérico IgA1 -J (C). Panel derecho- gel de SDS-PAGE de proteínas IgA1, IgA2 e IgA3 de P30B9 purificadas, tanto antes como después de la reducción con DTT. Más tarde se reveló que P30B9 IgA3 era un artefacto de la PCR con una región bisagra más larga.

FIG. 6- Curvas de unión de diferentes isotipos de P30B9 para ManLAM que muestran mayor actividad para la forma IgM, seguida de las formas IgA, sin reactividad para la forma IgG.

FIG. 7- Comparación de la eficacia de las sondas de anticuerpos monoclonales biotinilados para detectar ManLAM soluble en el ensayo de captura de CS-35, en el que la concentración indicada de ManLAM se capturó por CS-35 y se detectó por los mAb indicados marcados con biotina.

FIG. 8- Curvas de unión de P30B9 a diversas estructuras de Ara4 encaperuzadas con manosa, o a estructuras de tetra- y pentamanosa. Se observó unión preferencial para las estructuras 3 (dimanosa-Ara4) y 59, que contenían el enlace a-Manp(1^2)-Manp relacionado.

FIG. 9- Titulación de anticuerpos monoclonales anti-LAM contra diversos glicoconjugados relacionados con LAM sin encaperuzar para determinar los requisitos estructurales para la reactividad. 9A-Análisis de la importancia del enlace Ara-a(1^5)-Ara en la penúltima posición del extremo no reductor de la secuencia de Ara4. 9B- Análisis de la dependencia del enlace Ara-p(1^2)-Ara en la posición terminal de la secuencia de Ara4.

FIG. 10 Curvas de unión de A194-01 IgG y tres anticuerpos murinos anti-LAM contra diversos glicoconjugados que contienen Ara6, que muestran el efecto de diferentes motivos de encaperuzamiento sobre la reactividad de los anticuerpos.

FIG. 11 Estudios de competición de unión para medir la capacidad de los anticuerpos anti-LAM individuales para competir por la unión de un anticuerpo sonda al antígeno ManLAM. Los anticuerpos se biotinilaron cuando se probaron contra anticuerpos de la misma especie. Obsérvese la incapacidad de A194-01 para competir con P30B9 biotinilado.

FIG. 12- Competición de unión de anticuerpos monoclonales anti-LAM a LAM derivado de Mycobacterium tuberculosis (ManLAM) y LAM derivado de Mycobacterium smegmatis (PILAM). La competición eficiente entre FIND25 y P30B9 por ManLAM es consistente con el predominio de Ara6 sustituido con dimanosa, mientras que la falta de competición de estos dos mAb por A194 es consistente con su pobre reactividad con estructuras encaperuzadas con dimanosa. La competición eficiente de A194 por FIND25 frente a PILAM es consistente con la ausencia de encaperuzamiento con dimanosa en esta estructura.

FIG. 13- Competición de unión de anticuerpos monoclonales sonda biotinilados con un exceso de anticuerpos no modificados contra antígenos LAM naturales y glicoconjugados seleccionados. 13A- Competición de unión de A194-01 IgG biotinilada, CS-35 y FIND25 a MAnLAM por cuatro mAb; 13B- Competición de unión de FIND25 tanto a ManLAM como a PILAM por tres mAb; 13C- Competición de unión de p30B9 IgM a MAnLAM y dos antígenos glicoconjugados sintéticos por cuatro mAb.

FIG. 14- Las variantes y/o derivados genéticamente modificados de A194-01 reaccionan con una gama más amplia de glicoconjugados, incluidas formas sustituidas con di- y trimanosa poco reconocidas por el isotipo IgG de A194-01.

FIG. 15- Competición diferencial de A194-01 IgG y variantes y/o derivados genéticamente modificados de A194-01 por la unión de FIND25 y P30B9 IgM a ManLAM. Aunque A194 IgG no compite con P30B9 o FIND25 contra ManLAM, las formas multiméricas sí lo hacen, lo que coincide con la especificidad de epítopo más amplia de estas formas. Como se muestra anteriormente, A194 IgG compite bien con FIND25 para PILAM.

FIG. 16- Comparación del análisis del efecto del encaperuzamiento con manosa sobre la reactividad de los mAb CS-40, A194-01 y P30B9. Las especificidades de unión de los anticuerpos se midieron mediante ELISA frente a glicoconjugados específicos que contenían diferentes sustituciones de manosa. Las titulaciones de anticuerpos se muestran en 16A, y las estructuras de los antígenos de glucano que contienen manosa se muestran en 16B.

FIG. 17-17A. scFv-IgG homólogo. En este ejemplo, tanto el dominio IgG como el scFv derivan del mismo anticuerpo. Esto da como resultado un aumento de la valencia (tertavalente frente a divalente) pero no modifica directamente la especificidad diana. 17B. scFv-IgG heterólogo. Además del aumento de la valencia, también se introduce una especificidad ampliada, que puede permitir el reconocimiento de distintos epítopos en una única molécula de antígeno. 17C. scFv-IgM heterólogo. En esta formulación se combina un scFv distinto con un constructo de IgM. Un ejemplo sería la unión del A194-01 scFv con el P30B9 IgM. Además del aumento de la valencia, esto introduciría una especificidad de epítopo adicional, que puede permitir el reconocimiento multivalente de epítopos distintos que pueden no ser reconocidos por el scFv-IgM homólogo, y conducir a afinidades aumentadas.

FIG. 18A-18C- Cartografiado de epítopos reconocidos por nuevos mAbs. La especificidad del epítopo de P95C1 se comparó con la de dos mAb descritos anteriormente, A194-01 y P30B9, y dos nuevos mAb, P61H5 y P83A8, que reconocen epítopos relacionados con esos dos mAb descritos anteriormente. 18A. Reactividad de mAb específicos de LAM para moléculas precursoras de LAM. P30B9 y P61H5 fueron específicos de ManLAM sobre PILAM, mientras que A194-01, P83A8 y P95C1 reconocieron ambas formas de La M. P95C1 también se unió eficientemente a L<m>y PIM6. La débil reactividad de los otros mAb para LM y PIM6 se debe, al menos en parte, a la contaminación de estos materiales por ManLAM. 18B. Reactividad de glicoconjugados sintéticos derivados de LAM. 18C. A diferencia de los mAb previamente conocidos, P95C1 fue el único anticuerpo que no reconoció ninguna de las estructuras de poliarabinosa, pero reaccionó específicamente con dos estructuras de polimanosa, YB-BSA-05 e YB-BSA-11, que se parecían a las estructuras presentes en PIM6 y en los dominios de manano en la base de LM y LAM.

FIG. 19- Efecto del cambio de isotipo sobre la unión de P95C1 y P30B9 a ManLAM y PI-LAM. Para P95C1, los isotipos IgM, IgA e IgG tienen una actividad de unión comparable tanto para ManLAM como para PILAM, a diferencia de P30B9, que reacciona sólo con ManLAM y sólo en las formas IgM e IgA, pero no como IgG.

FIG. 20(A)-20(B)- Análisis de transferencia Western de reactividad cruzada de P95C1 con LAM y glicolípidos de M.tb adicionales. 20 (A) Los glicolípidos asociados a LAM purificados se separaron en gel de SDS-PAGE al 12 %, seguido de oxidación y tinción de moléculas de azúcar con tinción de ácido periódico de Schiff, para revelar material que contenía glicanos reactivos. 20(B) Se sondaron transferencias paralelas con mAb A194 IgG1, P30B9 IgM y P95C1 IgM, seguido de anticuerpos secundarios anti-IgG e IgM humana conjugados con fosfatasa alcalina y tratamiento con sustrato de desarrollo de color bcip/nbt. A194-01 reacciona de forma cruzada con ManLAM de M.tb y PILAM de M.smeg. P30B9 es específico para ManLAM de M.tb. P95C1 reconoce ambas especies de<l>A<m>, así como LM y PIM6 aislados de M.tb. La tinción débil por A194-01 de bandas en LM y PIM6 que co-migran con LAM se debe aparentemente a una contaminación menor de estas muestras con LAM.

FIG. 21 - Alineaciones de secuencias de aminoácidos para secuencias de regiones variables de cadena pesada y cadena ligera de A194, y su comparación con sus secuencias de línea germinal más cercanas. En la alineación superior, desde arriba, la primera secuencia de aminoácidos (A194-VH) es una secuencia de la región variable de cadena pesada de A194 sin la secuencia de CDR3 (SEQ ID NO:23). La secuencia de la región variable de cadena pesada sin CDR3 es SEQ ID NO:21. En la alineación superior, la segunda secuencia de aminoácidos (línea germinal Homsap IGHV3-20*01) es SEQ ID NO:22. En la alineación superior, la tercera secuencia de aminoácidos es la CDR3 de una región variable de cadena pesada de A194, y es SEQ ID NO:23. En la alineación inferior, desde arriba, la primera secuencia de aminoácidos (A-194-Vk) es una región variable de cadena ligera de A194 sin la secuencia de CDR3 (SEQ ID NO: 26). La secuencia de la región variable de cadena ligera sin CDR3 es SEQ ID NO:24. En la alineación inferior, la segunda secuencia de aminoácidos (línea germinal Homsap IGKV3-15*01) es SEQ ID NO:25. En la alineación inferior, la tercera secuencia es la CDR3 de una región variable de cadena ligera de A194, y es SEQ ID NO:26.

FIG. 22 - Secuencias de aminoácidos para las secuencias de la región variable de cadena pesada y de cadena ligera de P30B9-IgM, y sus comparaciones con sus líneas germinales más cercanas. En la alineación superior, desde arriba, la primera secuencia de aminoácidos (P30B9-Vh) es una secuencia de región variable de cadena pesada de P30B9-IgM sin la secuencia de CDR3 (SEQ ID NO:29). La secuencia de la región variable de la cadena pesada sin CDR3 es SEQ ID NO: 27. La segunda secuencia de aminoácidos (Homsap IGHV4-34*01 F) es SEQ ID NO:28. La tercera secuencia de aminoácidos es de una región variable de cadena pesada de P30B9-IgM, y es SEQ ID NO:29. En la alineación inferior, desde arriba, la primera secuencia de aminoácidos (P30B9-Vk) es una región variable de cadena ligera de P30B9 sin la secuencia de CDR3 (SEQ ID NO:32). La secuencia de la región variable de cadena ligera sin CDR3 es SEQ ID NO:30. En la alineación inferior, la segunda secuencia de aminoácidos (línea germinal Homsap IGKV1-5*03) es SEQ ID NO:31. En la alineación inferior, la tercera secuencia es la CDR3 de una región variable de cadena ligera de P30B9, y es SEQ ID NO:32.

FIG. 23 - Alineaciones de secuencias de aminoácidos para las secuencias de las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera de P95C1 -IgM, y su comparación con sus secuencias de línea germinal más cercanas. En la alineación superior, desde arriba, la primera secuencia de aminoácidos (P95C1-VH) es una secuencia de la región variable de cadena pesada de P95C1 sin la secuencia de CDR3 (SEQ ID NO: 18). La secuencia de la región variable de cadena pesada sin CDR3 es SEQ ID NO:33. En la alineación superior, la segunda secuencia de aminoácidos (línea germinal Homsap IGHV4-4*02) es SEQ ID NO:34. En la alineación superior, la tercera secuencia de aminoácidos es la CDR3 de una región variable de cadena pesada de P95C1 -gM, y es SEQ ID NO:18. En la alineación inferior, desde arriba, la primera secuencia de aminoácidos (P95C1-Vk) es una región variable de cadena ligera de P95C1 sin la secuencia de CDR3 (SEQ ID NO:15). La secuencia de la región variable de cadena ligera sin CDR3 es SEQ ID NO:36. En la alineación inferior, la segunda secuencia de aminoácidos (línea germinal Homsap IGKV4-1*01 F) es SEQ ID NO:37. En la alineación inferior, la tercera secuencia es la CDR3 de una región variable de cadena ligera de P95C1, y es SEQ ID NO:15.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

A. Definiciones

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos usados aquí tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto normal en la técnica a la que pertenece esta invención.

Un anticuerpo anti-LAM puede adoptar una de numerosas formas en la técnica, como se describe aquí. Los anticuerpos se definen en parte por los antígenos a los que se unen; de este modo, un "anticuerpo anti-LAM" es cualquier anticuerpo que se une específicamente a al menos un epítopo de lipoarabinomanano (LAM) como se describe aquí. Se entiende en la técnica que un anticuerpo es una glicoproteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces de disulfuro, o una porción de unión a antígeno de la misma. Una cadena pesada está compuesta por una región variable de cadena pesada (VH) y una región constante de cadena pesada (CH1, CH2 y CH3). Una cadena ligera está compuesta por una región variable (VL) de cadena ligera y una región constante (CL) de cadena ligera. Las regiones variables de las cadenas tanto pesada como ligera comprenden regiones estructurales (FWR) y regiones determinantes de la complementariedad (CDR). Las cuatro regiones FWR están relativamente conservadas, mientras que las regiones CDR (CDR1, CDR2 y CDR3) representan regiones hipervariables y están dispuestas desde el extremo NH2 hasta el extremo COOH de la siguiente manera: FWR1, CDR1, FWR2, CDR2, FW<r>3, CDR3, FWR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno, mientras que, según el isotipo, la o las regiones constantes pueden mediar en la unión de la inmunoglobulina a los tejidos o factores hospedantes.

Un anticuerpo anti-PIM6/LAM puede adoptar una de numerosas formas en la técnica, como se describe aquí. Un "anticuerpo anti-PIM6/LAM" es cualquier anticuerpo que se une específicamente a al menos un epítopo compartido por el fosfatidilinositol manósido 6 (PIM6) y LAM como se describe aquí. Un mAb humano específico para un epítopo compartido por LAM y PIM6 descrito aquí es P95C1, que se une específicamente a al menos una estructura de polimanosa en PIM6 y en el dominio de manano relacionado con PIM6 de LM y LAM. P95C1 se une tanto a LAM como a PIM6 debido a que ve un epítopo común (compartido), y por lo tanto, aquí se le denomina "anticuerpo anti-PIM6/LAM" o "anticuerpo monoclonal anti-PIM6/LAM", "anticuerpo anti-PIM6/LAM humano", o "anticuerpo monoclonal humano anti-PIM6/LAM".

Se sabe en la técnica que es posible manipular anticuerpos monoclonales y otros anticuerpos y usar técnicas de tecnología de ADN recombinante para producir otros anticuerpos o moléculas quiméricas que conserven la especificidad del anticuerpo original. Tales técnicas pueden evolucionar introduciendo ADN que codifica la región variable de inmunoglobulina, o CDR, de un anticuerpo en las regiones constantes, o regiones constantes más regiones estructurales, de una inmunoglobulina diferente.

El término "anticuerpo" (Ab), como se usa aquí, se usa en el sentido más amplio, y específicamente puede incluir cualquier inmunoglobulina, ya sea natural o producida parcial o totalmente de manera sintética, incluyendo, pero sin limitarse a, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos y anticuerpos polirreactivos), y fragmentos de anticuerpos. Por lo tanto, el término "anticuerpo", como se usa en cualquier contexto dentro de esta memoria descriptiva, pretende incluir, pero no se limita a, cualquier miembro de unión específico, clase de inmunoglobulina y/o isotipo (por ejemplo, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD, e IgE) y fragmento biológicamente relevante o miembro de unión específica del mismo, incluidos, pero sin limitarse a, Fab, F(ab')2, scFv (monocatenario o entidad relacionada) y (scFv)2.

La expresión "fragmentos de anticuerpo", como se usa aquí, puede incluir aquellos fragmentos de anticuerpo obtenidos usando técnicas fácilmente conocidas y disponibles para los expertos en la técnica, como se revisa aquí. Por lo tanto, el término "anticuerpo" describe cualquier polipéptido o proteína que comprende una porción de un anticuerpo intacto, tal como la región variable o de unión al antígeno del anticuerpo intacto. Estos pueden derivar de fuentes naturales, o pueden producirse parcial o totalmente de forma sintética. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; diacuerpos, y anticuerpos lineales. En particular, como se usa aquí, "Fv monocatenario" ("sFv" o "scFv") son fragmentos de anticuerpo que comprenden los dominios de anticuerpo VH y VL conectados en una única cadena polipeptídica. El polipéptido sFv puede comprender además, por ejemplo, un enlazador, tal como un enlazador polipeptídico flexible entre los dominios de VH y VL, que permite que el scFv forme la estructura deseada para la unión al antígeno.

La expresión "anticuerpo monoclonal" o "mAb", como se usa aquí, puede referirse a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones que ocurren naturalmente que pueden estar presentes en cantidades menores.

Los términos "variantes", "derivados" y/o "variantes y/o derivados", como se usan aquí, pueden referirse a anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, anticuerpos recombinantes, ya sean derivados de fuentes naturales o producidos parcial o totalmente de forma sintética, así como proteínas, fragmentos proteicos, y polipéptidos, en la medida en que los compuestos anteriores sean estructuralmente similares, es decir, conservan un grado de identidad que es al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 %, o mayor identidad de secuencia con un anticuerpo original no modificado, y/o, independientemente de la identidad estructural, pueden ser funcionalmente similares a los anticuerpos anti-LAM y anti-PIM6/LAM originales no modificados, es decir, retienen la capacidad de unirse específicamente a al menos un epítopo de LAM o al epítopo compartido de PIM6/LAM, respectivamente. Por ejemplo, tales variantes y/o derivados pueden incluir anticuerpos anti-LAM o anti-PIM6/LAM con dominios de Fc variantes, anticuerpos quiméricos, proteínas de fusión, anticuerpos biespecíficos, u otros anticuerpos recombinantes. Tales variantes y/o anticuerpos derivados pueden poseer, pero no necesariamente, una mayor especificidad de unión para uno o más epítopos de LAM o PIM6, y/o pueden unirse a epítopos de LAM o PIM6 adicionales.

La expresión "muestra biológica" se refiere a una muestra obtenida de un organismo (por ejemplo, un paciente) o de componentes (por ejemplo, células) de un organismo. La muestra puede ser de cualquier tejido biológico, célula(s) o fluido. La muestra puede ser una "muestra clínica" que es una muestra derivada de un sujeto, tal como un paciente humano. Tales muestras incluyen, pero no se limitan a, saliva, esputo, sangre, células sanguíneas (por ejemplo, glóbulos blancos), líquido amniótico, plasma, semen, médula ósea, y muestras de tejido o de biopsia con aguja fina, orina, líquido peritoneal, y líquido pleural, o células del mismo. Las muestras biológicas también pueden incluir secciones de tejidos, tales como secciones congeladas tomadas con fines histológicos. Una muestra biológica también puede denominarse "muestra de paciente". Una muestra biológica también puede incluir una proteína sustancialmente purificada o aislada, una preparación de membrana, o un cultivo celular.

Las expresiones "cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz", como se usan aquí, pueden referirse a una cantidad del compuesto o agente que es capaz de producir un resultado médicamente deseable en un sujeto tratado.

El método de tratamiento se puede realizar in vivo o ex vivo, solo o junto con otros fármacos o terapia. Una cantidad terapéuticamente eficaz puede administrarse en una o más administraciones, aplicaciones o dosificaciones, y no pretende limitarse a una formulación o vía de administración particular.

La expresión "fragmento de unión a antígeno" o "Fab", como se usa aquí, puede referirse a una región de un anticuerpo que se une a antígenos. Un experto en la técnica entenderá que los Fab están compuestos por un dominio constante y un dominio variable de cada una de las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo.

Como se usan aquí, las expresiones "unión específica", "unión selectiva", "se une selectivamente" y "se une específicamente" pueden referirse a la unión de un anticuerpo a un epítopo de un antígeno predeterminado, pero no a otros antígenos. Normalmente, el anticuerpo (i) se une con una constante de disociación en equilibrio (K<d>) de aproximadamente menos de 10-6 M, tal como aproximadamente menos de 10 -7 M, 10 -8 M, 10-9 M o 10-10 M, o incluso menor cuando se determina, por ejemplo, mediante tecnología de resonancia de plasmones superficiales (SPR) en un instrumento de resonancia de plasmones superficiales BIACORE® 2000 usando como analito el antígeno predeterminado, por ejemplo un epítopo de LAM, y el anticuerpo como ligando, o análisis de Scatchard de unión del anticuerpo a células positivas para antígeno, y (ii) se une al antígeno predeterminado con una afinidad que es al menos dos veces mayor que su afinidad por la unión a un antígeno no específico (por ejemplo, BSA, caseína) distinto del antígeno predeterminado o un antígeno estrechamente relacionado.

Las expresiones "modificaciones de secuencia conservativas" o "sustituciones conservativas", como se usan aquí, pueden referirse a modificaciones de aminoácidos que no afectan ni alteran significativamente las características de unión del anticuerpo que contiene la secuencia de aminoácidos. Tales modificaciones conservativas incluyen sustituciones, adiciones y eliminaciones de aminoácidos. Se pueden introducir modificaciones en un anticuerpo de la invención mediante técnicas estándar conocidas en la técnica, tales como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR. Las sustituciones conservativas de aminoácidos son aquellas en las que el resto de aminoácido se reemplaza por un resto de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. En la técnica se han definido familias de restos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por lo tanto, uno o más restos de aminoácidos dentro de las regiones CDR de un anticuerpo de la invención se pueden reemplazar por otros restos de aminoácidos de la misma familia de cadenas laterales, y la función retenida del anticuerpo alterado se puede probar usando los ensayos funcionales descritos aquí.

El término "identidad", como se usa aquí, puede referirse a la existencia de una estructura compartida entre dos composiciones. El término "identidad", en el contexto de las proteínas, puede referirse a la cantidad (por ejemplo, expresada en porcentaje) de solapamiento entre dos o más secuencias de aminoácidos y/o péptidos. En el contexto de ácidos nucleicos, el término puede referirse a la cantidad (por ejemplo, expresada en porcentaje) de solapamiento entre dos o más secuencias de ácidos nucleicos. Como se usa aquí, el porcentaje (%) de identidad entre dos secuencias es equivalente al porcentaje de identidad entre las dos secuencias. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de identidad = número de posiciones idénticas/número total de posiciones x 100), teniendo en cuenta el número de espacios, y la longitud de cada espacio, que deben introducirse para una alineación óptima de las dos secuencias. La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias se pueden lograr usando un algoritmo matemático. Tal identidad está bien representada en la técnica mediante herramientas y/o algoritmos de alineación local, y puede incluir alineación por pares, métodos de alineación de secuencias múltiples, métodos de alineación estructural, y/o métodos de análisis filogenético. Los ejemplos específicos incluyen los siguientes. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se puede determinar usando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (Comput. Aplica. Biosci., 4:11-17 (1988)), que se ha incorporado al programa ALIGN (versión 2.0), que usa una tabla ponderal de restos PAM120, una penalización de longitud de espacio de 12 y una penalización de espacio de 4. Además, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se puede determinar usando el algoritmo Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)), que se ha incorporado al programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en www.gcg.com), que usa una matriz Blossum 62 o una matriz PAM250, y un peso de espacio de 16, 14, 12, 10, 8, 6, o 4, y un peso de longitud de 1,2, 3, 4, 5, o 6. Adicional o alternativamente, las secuencias proteicas de la presente invención se pueden usar además como una "secuencia de consulta" para realizar una búsqueda en bases de datos públicas, por ejemplo para identificar secuencias relacionadas. Tales búsquedas se pueden realizar usando el programa XBLAST (versión 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol.215:403-10. Las búsquedas de proteínas BLAST se pueden llevar a cabo con el programa XBLAST, puntuación = 50, longitud de palabra = 3, para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las moléculas de anticuerpo de la invención. Para obtener alineamientos con espacios con fines de comparación, se puede utilizar Gapped BLAST como se describe en Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, se pueden usar los parámetros predeterminados de los respectivos programas (por ejemplo, XBLAST y NBLAST).

Los términos "coadministración", "coadministrado" y "en combinación con", como se usan aquí, pueden referirse a la administración de al menos dos agentes o terapias a un sujeto. En algunas realizaciones, la coadministración de dos o más agentes/terapias es simultánea. En otras realizaciones, un primer agente/terapia se administra antes de un segundo agente/terapia. Los expertos en la técnica entienden que las formulaciones y/o vías de administración de los diversos agentes/terapias usadas pueden variar.

El término "vehículos", como se usa aquí, puede incluir vehículos, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables que no sean tóxicos para la célula o el mamífero que se expone a ellos en las dosis y concentraciones empleadas. A menudo, el vehículo fisiológicamente aceptable es una disolución acuosa de pH amortiguado. Ejemplos de vehículos fisiológicamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, amortiguadores tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, que incluyen, pero no se limitan a, ácido ascórbico; polipéptido de bajo peso molecular (menos de alrededor de 10 restos); proteínas, tales como, pero no se limitan a, seroalbúmina, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como, pero no se limitan a, polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como, pero no se limitan a, glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono, que incluyen, pero no se limitan a, glucosa, manosa, o dextrinas; agentes quelantes tales como, pero no se limitan a, EDTA; alcoholes de azúcar, tales como, pero no se limitan a, manitol o sorbitol; contraiones formadores de sales, tales como, pero no se limitan a, sodio; y/o tensioactivos no iónicos, tales como, pero no se limitan a, TWEEN.; polietilenglicol (PEG), y PLURONICS.

El término "tratar" o "tratamiento" de una enfermedad se refiere a ejecutar un protocolo, que puede incluir la administración de uno o más fármacos a un paciente (humano o no), en un esfuerzo por aliviar los signos o síntomas de la enfermedad. El alivio puede ocurrir antes de que aparezcan los signos o síntomas de la enfermedad, así como después de su aparición. Por tanto, "tratar" o "tratamiento" incluye "prevenir" o "prevención" de una enfermedad. Los términos "prevenir" o "que previene" se refieren a medidas profilácticas y/o preventivas, en las que el objetivo es prevenir o ralentizar la condición o trastorno patológico diana. Por ejemplo, en el caso de una infección por una cepa virulenta del complejo Mycobacterium tuberculosis, "prevenir" o "que previene" puede surgir en una situación en la que se avanza un curso de tratamiento para prevenir o detener la infección por una cepa virulenta del complejo Mycobacterium tuberculosis, tal como mediante vacunación o administración pasiva de un anticuerpo protector. Tal "prevenir" o "prevención" también surge en el caso de una infección latente por Mycobacterium tuberculosis, en el que el objetivo sería prevenir la infección activa y/o curar al paciente dicha infección latente. Además, "tratar" o "tratamiento" no requiere un alivio completo de los signos o síntomas, no requiere una cura, e incluye específicamente protocolos que tienen sólo un efecto marginal en el paciente.

Los términos "paciente", "sujeto" e "individuo" se usan indistintamente aquí, y pueden referirse a un sistema biológico al que se puede administrar un tratamiento. Un sistema biológico puede incluir, por ejemplo, una célula individual, un conjunto de células (por ejemplo, un cultivo celular), un órgano, un tejido, o un organismo multicelular. Un "paciente", "sujeto" o "individuo" puede referirse a un paciente, sujeto o individuo humano, o un paciente, sujeto o individuo no humano.

El término "epítopo", como se usa aquí, puede referirse a la región de un antígeno a la que se une un anticuerpo o célula T. Un "antígeno" se refiere a una sustancia que provoca una reacción inmunológica o se une a los productos de esa reacción.

Como se usa aquí, el término "vector" significa una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Los vectores capaces de dirigir la expresión de genes a los que están unidos operativamente se denominan aquí "vectores de expresión".

Como se usa aquí, "proteína" y "polipéptido" se usan como sinónimos para referirse a cualquier cadena de aminoácidos unida a péptidos, independientemente de su longitud o modificación postraduccional, por ejemplo glicosilación o fosforilación.

El término "marcado", con respecto a un anticuerpo, ácido nucleico, péptido, polipéptido, célula, o sonda, pretende abarcar el marcaje directo del anticuerpo, ácido nucleico, péptido, polipéptido, célula, o sonda acoplando (es decir, uniendo físicamente) una sustancia detectable al anticuerpo, ácido nucleico, péptido, polipéptido, célula, o sonda.

Los términos péptido, polipéptido o proteína "purificado" o "aislado" se refieren a un péptido, polipéptido o proteína, como se usa aquí, puede referirse a un péptido, polipéptido o proteína que se ha separado de otras proteínas, lípidos y ácidos nucleicos con los que está asociado naturalmente. El polipéptido/proteína puede constituir al menos el 10 % (es decir, cualquier porcentaje entre el 10 % y el 100 %, por ejemplo, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % y 99 %) en peso seco de la preparación purificada. La pureza se puede medir mediante cualquier método estándar apropiado, por ejemplo mediante cromatografía en columna, electroforesis en gel de poliacrilamida, o análisis por HPLC. Un polipéptido/proteína aislado (por ejemplo, anticuerpos anti-LAM) descrito en la invención puede producirse mediante técnicas de ADN recombinante.

B. Mycobacterium tuberculosis

La tuberculosis (TB) sigue siendo una de las enfermedades transmisibles más mortales del mundo, y actualmente infecta aproximadamente a un tercio de la población mundial. Se estima que 9,0 millones de personas desarrollaron tuberculosis en 2013, y aproximadamente 1,5 millones murieron a causa de la enfermedad. Aunque actualmente existen tratamientos con antibióticos disponibles, estos requieren tratamientos prolongados, y están cada vez más comprometidos por el desarrollo de cepas multirresistentes (MDR-TB), que actualmente son responsables de alrededor del 3,5 % de las infecciones recientes. Estas cepas son mucho más difíciles de tratar y tienen tasas de curación significativamente más bajas. También se están propagando las cepas de tuberculosis extremadamente resistentes a fármacos (XDR-TB), que son incluso más caras y difíciles de tratar que las cepas de MDR-TB, y ya se han informado en 100 países de todo el mundo.

Existe un paradigma establecido desde hace mucho tiempo de que la inmunidad contra la tuberculosis se relaciona únicamente con los mecanismos de defensa celular. Sin embargo, los estudios en el campo del VIH destacan la notable capacidad del sistema inmunológico humoral humano para generar diversos anticuerpos con notable abanico y potencia de neutralización, y la presente invención destaca la capacidad del sistema inmunológico humoral para producir anticuerpos de alta afinidad que reconocen múltiples epítopos de LAM. Esto sugiere que gran parte de la dificultad pasada para demostrar un papel importante de la protección mediada por anticuerpos contra la tuberculosis puede deberse a las limitaciones en la calidad y fuente de los anticuerpos usados en estudios anteriores, y que la aplicación de métodos de la presente invención para generar anticuerpos más altamente evolucionados de pacientes humanos con infección crónica puede ilustrar el papel fundamental de la respuesta humoral en la inmunidad a la tuberculosis.

Algunos métodos se refieren al cultivo in vitro de células B de memoria de humanos infectados, y a la clonación molecular de las regiones variables de cadenas pesada (H) y ligera (L) de IgG de una sola célula. Estos métodos pueden utilizarse para generar anticuerpos monoclonales humanos contra el principal antígeno de superficie LAM. Tales anticuerpos, y los derivados genéticamente modificados de estos anticuerpos, pueden poseer especificidades de epítopo y propiedades de unión únicas, lo que brinda aplicaciones de inmunodiagnóstico e inmunoterapia.

C. Lipoarabinomanano (LAM)

Una diana antigénica destacada de los anticuerpos de la presente invención es el glicolípido de superficie, lipoarabinomanano (LAM), un componente estructural importante de la pared celular de los miembros delcomplejo Mycobacterium tuberculosis.La presente invención identifica una heterogeneidad no apreciada previamente en la estructura antigénica de LAM y en la respuesta inmune humoral hacia LAM en respuesta a la infección y la inmunización. La estructura de LAM se detalla en Khoo et al., "Variation in Mannose-capped Terminal Arabinan Motifs of Lipoarabinomannan from Clinical Isolates of Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium avium Complex," Journal of Biological Chemistry Vol 276, No. 6, 9 de febrero de 2001, incorporado aquí como referencia en su totalidad. La estructura de LAM es compleja, y exhibe una estructura tripartita general con cuatro dominios estructurales distintos; un ancla lipídica de fosfatidilmositol (mannonsil-fosfatidil-mio-inositol), una cadena principal de D-manano enlazada a través de a (1^6 ) con cadenas laterales terminales enlazadas a través de a(1^2)-Manp, una cadena de D-arabinano que contiene múltiples ramas de tetra-/hexa-arabinofuranósido, y diversos motivos de encaperuzamiento. LAM consiste en una población heterogénea de moléculas, que pueden resolverse en múltiples isoformas que poseen diferentes propiedades biológicas. Esta heterogeneidad se debe a longitudes variables de las cadenas de manano y arabinano, a diferentes patrones de ramificación, a diferentes números de tales ramificaciones, y a la modificación de las cadenas de arabinósido mediante encaperuzamiento con manosa, la adición de MTX y la acilación por ácidos grasos, succinatos y lactatos.

Las cepas virulentas del complejo Mycobacterium tuberculosis están ampliamente encaperuzadas con unidades de sacárido mono-, di- y tri-a(1^ 2)-D-Manp, mientras que las cepas no patógenas de rápido crecimiento como M. smegmatis tienen extremos no encaperuzados o caperuzas de fosfatidil-mio-inositol (PILAM). Se ha estimado que 40 70 % de los extremos no reductores de LAM de cepas patógenas del complejo Mycobacterium tuberculosis están encaperuzados con manosa, y el análisis de la abundancia relativa de los diferentes motivos de caperuza para la cepa clínica virulenta MT103 mostró que la unidad de dimanosilo fue el motivo estructural principal (75-80 %), mientras que los motivos de manosilo y trimanosilo estuvieron presentes en concentraciones más bajas (10-13 %). Este amplio encaperuzamiento puede presentar un marcador único para diferenciar cepas virulentas del complejo Mycobacterium tuberculosis de cepas no virulentas/no patógenas, tal como M. smegmatis, y también puede proporcionar dianas antigénicas potenciales para uso terapéutico de los anticuerpos anti-LAM de la presente invención. Además, algunos de los azúcares de manosa terminales en ManLAM que se encuentran en la cepa de M. tuberculosis se modifican aún más mediante la adición a(1^4) de una estructura única, 5-desoxi-5-metil-tio-pentofuranosa (MTX), que afecta la inmunorreactividad contra diferentes mAb sensibles a motivos de encaperuzamiento, tales como A194-01 y P30B9; la adición de MTX aumenta la reactividad con A194-01 y disminuye la reactividad frente a P30B9. Esta sustitución está presente en baja abundancia, y puede presentar un marcador único para identificar M. tuberculosis, potencialmente incluso de otros miembros virulentos del complejo Mycobacterium tuberculosis, tales como M. bovis y M. africanum, y también puede proporcionar una diana antigénica potencial para uso terapéutico de los anticuerpos anti-LAM de la presente invención.

Las formas segregadas de LAM son dianas importantes para los ensayos de inmunodiagnóstico de infección por miembros patógenos del complejoM. tuberculosis.Además, un conjunto considerable de pruebas indica que LAM es un mediador importante de una serie de funciones que promueven la infección productiva y la patogenicidad. LAM participa en el mantenimiento de la integridad de la pared celular y en la resistencia a los antibióticos betalactámicos. La expresión reducida de LAM en la superficie bacteriana se correlaciona con la entrada defectuosa de los macrófagos, la inhibición de la fusión fagosoma-lisosoma, la atenuación en los macrófagos, y una mayor sensibilidad a la inmunidad adaptativa, y la unión de las unidades de manosilo terminales de ManLAM al receptor de manosa en la superficie de los macrófagos se ha descrito como una etapa crítica en la absorción de micobacterias en las células fagocíticas. Sin desear estar atados por ninguna teoría, se cree que ManLAM interactúa con las lectinas de tipo C, tales como la molécula de adhesión intercelular 3 específica de células dendríticas (ICAM-3) no asociada a integrina (DC-SIGN), el receptor de manosa de macrófagos (MMR), y Dectina-2 en células dendríticas. Una vez dentro de los macrófagos, se cree que LAM inhibe la fusión fagosoma-lisosoma, lo que conduciría a la destrucción de las bacterias, permitiendo así que las bacterias persistan dentro de los macrófagos.

LAM también se segrega desde la superficie de las bacterias, y el LAM extracelular se une a los receptores de la superficie de las células dendríticas, incluidas DC-SIGN y Dectina-2. Se cree que estas interacciones suprimen la función de las células dendríticas e interfieren con el sistema inmunológico del hospedante, lo que contribuye a la evasión inmunitaria. Debido a que LAM se encuentra en cantidades relativamente grandes durante la infección activa, puede detectarse en la sangre y la orina de pacientes infectados, por ejemplo mediante uno o más anticuerpos anti-LAM de la presente invención. Estos pueden usarse, por ejemplo, en kits de diagnóstico y métodos relacionados con dichos kits de diagnóstico.

D. Anticuerpos anti-LAM y anti-PIM6/LAM

Los anticuerpos anti-LAM pueden incluir variantes y/o derivados aislados, cultivados, o genéticamente modificados, de anticuerpos monoclonales humanos que reconocen al menos un epítopo en lipoarabinomanano (LAM). Un anticuerpo anti-PIM6/LAM (por ejemplo, P95C1) como se describe aquí se une específicamente al menos a una estructura de polimanosa en PIM6 y en el dominio de manano de reacción cruzada de PIM6 de LAM. Los anticuerpos anti-LAM y anti-PIM6/LAM se pueden purificar según métodos conocidos en la técnica. Tales métodos pueden incluir, por ejemplo, pero no se limitan a, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de quelato metálico inmovilizado, adsorción tiofílica, fraccionamiento fisicoquímico, u otros métodos de afinidad específicos de antígeno, por ejemplo métodos que incluyen ligandos de unión a anticuerpos contra proteínas A, G y L. Tales anticuerpos purificados pueden tener o no características estructurales que sean diferentes de los anticuerpos monoclonales humanos que no están purificados. Por ejemplo, durante la purificación pueden producirse cambios conformacionales del epítopo para los anticuerpos monoclonales humanos. Los anticuerpos se pueden unir a moléculas adicionales que se eliminan tras la purificación. En consecuencia, tales anticuerpos purificados pueden tener o no una actividad funcional diferente. Los anticuerpos anti-LAM y anti-PIM6/LAM pueden tener varias modificaciones estructurales. Por ejemplo, los anticuerpos anti-LAM y anti-PIM6/LAM de la presente invención pueden estar glicosilados, PEGilados, o modificados químicamente de otro modo de tal manera que afecte la estabilidad, función, biodisponibilidad, reconocimiento de epítopos, u otra actividad funcional. Los anticuerpos anti-LAM y anti-PIM6/LAM pueden ser variantes y/o derivados genéticamente modificados de aquellos anticuerpos descritos a continuación, y pueden poseer o no equivalencia funcional o estructural.

1. A194-01

Se describe aquí el anticuerpo monoclonal humano A194-01, incluidas variantes y/o derivados del mismo. A194-01 es específico para LAM. A194-01 posee una actividad de unión muy alta para LAM; por ejemplo, el isotipo IgG de A194-01 puede exhibir un 50 % de actividad de unión máxima del anticuerpo a una concentración de aproximadamente 20 ng/ml, lo que significa una alta afinidad por LAM. A194-01 se aisló y purificó originalmente como una IgG; sin embargo, A194-01 puede existir en varios isotipos, así como en isotipos recombinantes y genéticamente modificados, que incluyen, pero no se limitan a, IgG, IgA, IgM, fragmentos de Fv monocatenario monovalentes (scFv), proteínas Fab, fragmentos de scFv divalentes, fragmentos de scFv monocatenarios (monómeros) en los que las regiones ligeras variables y pesadas variables individuales están unidas, por ejemplo, mediante un enlazador flexible, y proteínas scFv diméricas en las que dos monómeros de scFv están unidos entre sí (FIG. 1A) Algunas variantes y/o derivados genéticamente modificados de A194-01 particulares incluyen, pero no se limitan a, las siguientes. Una variante y/o derivado genéticamente modificado de A194-01 comprende un scFv-IgG tetravalente, formada uniendo el antígeno de A194-01 scFv al extremo N de de A194-01 IgG (FIG. 1B, FIG. 17), que puede aumentar afinidad de unión y ampliar la gama de epítopos reconocidos (se dan ejemplos de esto en las FIGS. 14 y 15). El scFv-IgG tetravalente puede comprender líder-VH-VL-IgG, o puede comprender líder-VL-VH-IgG. Un experto normal en la técnica apreciará que las variantes y/o derivados de scFv-IgG genéticamente modificados tienen valencias más allá de simplemente tetravalentes. Otra variante y/o derivado genéticamente modificado de A194-01 comprende una IgM pentavalente, generada al convertir un A194-01 IgG dimérico en un dominio que contiene IgM humana, en los que dicha IgM pentavalente contiene 10 sitios de unión (FIG. 1B). Un experto normal en la técnica apreciará que son posibles combinaciones adicionales de fragmentos antigénicos de A194-01, y se consideran dentro del alcance de esta invención, particularmente aquellos fragmentos de anticuerpo que muestran regiones determinantes de la complementariedad (CDR) específicas de A194-01.

El isotipo IgG de A194-01 reconoce un epítopo único y complejo que se expresa en las cadenas laterales de Ara4 y Ara6 no modificadas y en cadenas laterales que portan una sola manosa. Aunque A194-01 no reconoce cadenas laterales que portan sustituciones de di- o trimanosa, sí reacciona con tales estructuras si se modifican adicionalmente con un sustituyente de MSX. En consecuencia, el isotipo IgG de A194-01 se une a PILAM y ManLAM con alta afinidad, y también se une fuertemente con versiones no encaperuzadas de las estructuras tanto de Ara4 como de Ara6, y se une algo menos fuertemente a estructuras de Ara4/Ara6 sustituidas con MSX y encaperuzadas con una sola manosa, pero malamente, si lo hace, respecto a ManLAM disustituido y trisustituido (FIG. 4). Sin desear estar atados por ninguna teoría, el efecto drásticamente diferente de la unión de manosa frente a MSX a la manosa terminal de la estructura de Ara4 monomanosilada puede reflejar una diferencia entre el enlace a (1 ^2 ) de la manosa y el enlace a (1 ^4 ) de la sustitución con MSX. Las variantes y/o derivados genéticamente modificados de A194-01, incluidos aquellos que poseen valencias más altas, pueden exhibir una especificidad de epítopo más amplia que el isotipo IgG de A194-01 (FIG. 14), y pueden exhibir además una afinidad mejorada por LAM (FIG. 15). Por ejemplo, el A194-01 genéticamente modificado con scFv-IgG tetravalente, y los isotipos IgA e IgM genéticamente modificados, se unen a las estructuras tanto de Ara4 como de Ara6 con mayor afinidad que el isotipo IgG de A194-01, y además, también reconocen estructuras encaperuzadas con dimanosa y trimanosa a las que el isotipo IgG se une mal (FIG. 14). Debido a que las especies patógenas delcomplejo Mycobacterium tuberculosisexhiben predominantemente estructuras encaperuzadas con dimanosa, estas variantes y/o derivados genéticamente modificados de A194-01, incluidos los isotipos scFv-IgG e IgM, pueden resultar particularmente útiles para kits y métodos de diagnóstico, así como para uso terapéutico.

Otras variantes y/o derivados genéticamente modificados de A194-01 incluyen aquellos anticuerpos en los que el dominio Fc de IgG1 se convierte en IgG3, que es más opsógeno, o generando versiones multiméricas, sustituyendo el dominio constante de IgG1 por IgA dimérica o IgM pentamérica o hexamérica. Sin desear estar atados por ninguna teoría, esto puede mejorar significativamente la avidez de los anticuerpos anti-LAM al aumentar la flexibilidad y el intervalo de unión bivalente y multivalente, lo que contribuye a la afinidad (FIG. 1). Esto tiene una importancia clínica potencial, ya que los tratamientos serían particularmente valiosos en casos de exposición o infección con cepas MDR o X-MDR deMyocbacterium tuberculosis,que no pueden tratarse eficazmente con antibióticos tradicionales.

Tabla 1. Re iones Determinantes de Com lementariedad CDR de A194-01

Un experto normal en la técnica apreciará que las CDR son cruciales para la diversidad de especificidades de antígenos. Un experto normal en la técnica apreciará además que CDR3 es la más variable de las regiones CDR, y como tal, tiene la mayor importancia, siendo suficiente la diversidad en la región CDR3 de la cadena pesada variable para la mayoría de las especificidades de los anticuerpos. Algunos anticuerpos anti-LAM descritos aquí tienen una región CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera variable como se expone en SEQ ID NOS: 1,2 y 3, respectivamente. En algunos casos, los anticuerpos anti-LAM tienen una región CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera variable como se expone en SEQ ID NOS: 1, 2 y 3 respectivamente con modificaciones de secuencia conservativas. En algunos casos, los anticuerpos anti-LAM tienen una región CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera variable que tiene hasta un 95 % de identidad con SEQ ID NOS: 1,2 y 3 respectivamente. En otros casos, los anticuerpos anti-LAM tienen una región CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera variable que tiene hasta un 90 % de identidad con SEQ ID NOS: 1, 2 y 3 respectivamente. En otros casos, los anticuerpos anti-LAM tienen una región CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera variable que tiene hasta un 85 % de identidad con SEQ ID NOS: 1, 2 y 3 respectivamente. En otros casos, los anticuerpos anti-LAM tienen una región CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera variable que tiene hasta un 80 % de identidad con SEQ ID NOS: 1,2 y 3 respectivamente. En algunos casos, los anticuerpos anti-LAM tienen una región CDR3 de la cadena ligera variable como se expone en SEQ ID NO: 3. En algunos casos, los anticuerpos anti-LAM tienen una región CDR3 de la cadena ligera variable como se expone en SEQ ID NO: 3 con modificaciones de secuencia conservativas. En otros casos, los anticuerpos anti-LAM tienen una región CDR3 de la cadena ligera variable que tiene hasta un 95 % de identidad con SEQ ID NO: 3. En otras realizaciones, los anticuerpos anti-LAM tienen una región CDR3 de la cadena ligera variable que tiene hasta un 90 % de identidad con SEQ ID NO: 3. En otras realizaciones, los anticuerpos anti-LAM tienen una región CDR3 de la cadena ligera variable que tiene hasta un 85 % de identidad con SEQ ID NO: 3. En otras realizaciones, los anticuerpos anti-LAM tienen una región CDR3 de la cadena ligera variable que tiene hasta un 80 % de identidad con SEQ ID NO: 3.

Algunos anticuerpos anti-LAM descritos aquí tienen una región CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada variable como se expone en SEQ ID NOS: 4, 5 y 6, respectivamente. En algunos casos, los anticuerpos anti-LAM tienen una región CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada variable como se expone en SEQ ID NOS: 4, 5 y 6, respectivamente con modificaciones de secuencia conservativas. En algunos casos, los anticuerpos anti-LAM tienen una región CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada variable que tiene hasta un 95 % de identidad con SEQ ID NOS: 4, 5 y 6 respectivamente. En otros casos, los anticuerpos anti-LAM tienen una región CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada variable que tiene hasta un 90 % de identidad con SEQ ID NOS: 4, 5 y 6 respectivamente. En otros casos, los anticuerpos anti-LAM tienen una región CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada variable que tiene hasta un 85 % de identidad con SEQ ID NOS: 4, 5 y 6 respectivamente. En otros casos, los anticuerpos anti-LAM tienen una región CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada variable que tiene hasta un 80 % de identidad con SEQ ID NOS: 4, 5 y 6 respectivamente. En algunos casos, los anticuerpos anti-LAM tienen una región CDR3 de la cadena pesada variable como se expone en SEQ ID NO: 6. En algunos casos, los anticuerpos anti-LAM tienen una región CDR3 de la cadena pesada variable como se expone en SEQ ID NO: 6 con modificaciones de secuencia conservativas. En otros casos, los anticuerpos anti-LAM tienen una región CDR3 de la cadena pesada variable que tiene hasta un 95 % de identidad con SEQ ID NO: 6. En otros casos, los anticuerpos anti-LAM tienen una región CDR3 de la cadena pesada variable que tiene hasta un 90 % de identidad con SEQ ID NO: 6. En otros casos, los anticuerpos anti-LAM tienen una región CDR3 de la cadena pesada variable que tiene hasta un 85 % de identidad con SEQ ID NO: 6. En otros casos, los anticuerpos anti-LAM tienen una región CDR3 de la cadena pesada variable que tiene hasta un 80 % de identidad con SEQ ID NO: 6.

En los experimentos descritos aquí, el anticuerpo A194-01 se expresó mediante transfección de vectores de cadena H y L en células Expi293, y se cultivó en medio estándar Expi293 sin suero durante varios días. El anticuerpo segregado se purificó del sobrenadante del cultivo mediante cromatografía de afinidad en columnas conjugadas con ligandos de Proteína A o Proteína G. Los anticuerpos unidos se liberaron de los ligandos mediante tratamiento con amortiguador de pH bajo (glicina-HCl 0,2 M, pH 2,5), y se neutralizaron con 1/50 de volumen de amortiguador tris 2 M (pH 8,8). El amortiguador se intercambió con PBS mediante diálisis o mediante varias rondas de concentración en filtros centrífugos (filtros centrífugos Amicon Ultra, límite de peso molecular 30 K).

Las secuencias de aminoácidos (aa) y de ácidos nucleicos (nt) para las secuencias de las cadenas pesada y ligera de A194 son las siguientes:

Secuencia de nt de cadena pesada de A194:

CAAGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGTGTGGTACGGCCGGGGGGGTCCCTG

AGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCAACTTTGAAGATTTTGGCATGAGCTGGGT

CCGCCAAGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCTAGTATTAGTTGGAATGGT

GCTAATATAGGCTATGTAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACA

ACGCCAAGAACTCCCTATATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCCGAGGACACGG

CCTTATATTACTGTGCGATAGACTGGTACAGAGACGACTACTACAAGATGGACGT

CTGGGGCAAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCGACCAAGGGCCCATCG

GTCTTCCCGCTAGCGCCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGG

GCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCTGTGACGGTCTCGTGGAACTCAGG

CGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCT

ACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTA

CATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGA

GCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTC

CTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGA

TCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCC

T GAGGT C A AGTT C A ACTGGT AC GT GGAC GGC GT GGAGGT GC AT A AT GC C A AGAC

AAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCAC

CGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAAC

AAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCC

CGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACC

AGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGA

GTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCT

GGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGG

TGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACC

ACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (SEQ ID NO:39)

Secuencia de aa de cadena pesada de A194

QVQLLESGGGVVRPGGSLRLSCAASGFNFEDFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISWNGA

NIGYVD S VKGRFTISRDNAKN SLYLQMN SLRAEDTAL YY C AIDWYRDD YYKMD VW

GKGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTS

GYHTFP A YLQ S S GL Y SL S S V YT YP S S SLGTQT YICNYNHKP SNTK YDKK YEPK S CDKT

HT CPPCP APELLGGP S VFLFPPKPKDTLMISRTPE VT C VVVD V SHEDPEVKFNW YVDG

VEVHNAKTKPREEQYN STYRVV S VLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALPAPIEKTISK

AKGQPREPQ V YTLPP SRDELTKNQ V SLT CL VKGF YP SDIA VEWE SN GQPENN YKTTPP

VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK* (SEQ

ID NO:40)

Secuencia de nt de cadena ligera de A194 (kappa):

GAAATAGTGATGACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTCTCTCCAGGGGAAAG

AGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCGGAGTATTCGCAGCGCCTTAGCCTGGTA

CCAGCACAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTTTGGTGCATCCACCAG

GGC C ACTGGT ATCC C AGC C AGGTTC AGT GGC AGT GGGT C T GGGAC AGAC TTC A

CTCTCACCGTCAGCAGCATACGGTCTGAGGATTCTGCAGTTTATTACTGTCAGC

AGTATGATTTCTGGTACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGA

ACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAA

TCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCC

AAAGT AC AGT GGAAGGTCGAC AACGCCCTCC AATCGGGT AACTCCC AGGAGAG

TGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGA

CGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACC

CATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTA

G (SEQ ID NO:41)

Secuencia de aa de cadena ligera A194 (kappa):

EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASRSIRSALAWYQHKPGQAPRLLIFGASTRATGIP

ARFSGSGSGTDFTLTVSSIRSEDSAVYYCQQYDFWYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFP

PSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS

S TLTL SK AD YEKHK V Y ACE VTHQGL S SP VTK SFNRGEC * (SEQ ID NO:42)

2. P30B9

También se describe aquí el anticuerpo monoclonal humano recombinante P30B9, incluyendo variantes y/o derivados del mismo. P30B9 es específico para LAM. P30B9 se aisló y purificó originalmente como una IgM; sin embargo, P30B9 puede existir en varios isotipos, así como en isotipos recombinantes y genéticamente modificados, que incluyen, pero no se limitan a, IgM, IgG, IgA, así como fragmentos antigénicos de los mismos, que incluyen, pero no se limitan a, fragmentos de Fv monocatenario monovalentes (scFv), proteínas Fab, fragmentos de scFv divalentes, fragmentos de scFv monocatenarios (monómeros) en los que las regiones ligeras variables y pesadas variables individuales están unidas, por ejemplo, mediante un enlazador flexible, y proteínas scFv diméricas en las que dos monómeros de scFv se unen entre sí.

El isotipo IgM de P30B9 se une más potentemente a epítopos de LAM que tienen Ara4 y Ara6 sustituidos con dimanosa con las estructuras Manp-a(1^2)-Manp-(1^5)-Araf (FIGS. 4, 16 y 18), aunque otras estructuras sustituidas con Manp-a (por ejemplo, las estructuras 2, 4 y 59 en la FIG. 8) también pueden ser reconocidas con afinidades más bajas. El reconocimiento preferencial de P30B9 para LAM encaperuzado con dimanosa tiene posible relevancia clínica, ya que se informa que las caperuzas de dimanosa son la modificación de LAM dominante en cepas virulentas del complejoMycobacterium tuberculosis.Sin desear estar atados por ninguna teoría, se cree que las unidades de manosilo terminales median la unión de LAM de cepas virulentas del complejoMycobacterium tuberculosisa macrófagos humanos y otras células inmunitarias, lo que conduce a la alteración de la función inmunitaria y al establecimiento de una infección estable. Sin desear estar atados por ninguna teoría, se cree que la unión de las caperuzas de manosa al receptor de manosa limita la fusión fagosoma-lisosoma (PL) y facilita la supervivencia de la bacteria en macrófagos infectados. La especificidad de P30B9 para LAM encaperuzado con dimanosa está indicada por la especificidad de este mAb para los glicoconjugados que portan esta estructura, y por el hecho de que el isotipo IgM de P30B9 se une específicamente a LAM derivado deMycobacterium tuberculosis,pero no a LAM deMycobacterium smegmatisoMycobacterium leprae,que no contienen epítopos de LAM encaperuzados con dimanosa. Esto contrasta con el isotipo IgG de A194-01, que se une a PILAM, restos de Ara4/Ara6 no encaperuzados, y epítopos de LAM encaperuzados con monomanosa, todos los cuales son comunes en Mycobacterium smegmatis y Mycobacterium leprae. Al igual que el ¡sotipo IgM de P30B9, el ¡sotipo IgM de A194-01 es capaz de unirse a epítopos de LAM encaperuzados con dimanosa y trimanosa (FIG. 14), presumiblemente debido a una mayor avidez de unión.

Por lo tanto, los isotipos IgM de P30B9 pueden servir como un importante reactivo de inmunodiagnóstico para detectar infección por miembros virulentos del complejoMycobacterium tuberculosisy distinguir dichos miembros virulentos de otras especies micobacterianas no patógenas, ya que es específico de LAM encaperuzado con dimanosa. Además, el isotipo IgM del anticuerpo P30B9, así como las variantes y/o derivados genéticamente modificados de A194-01, pueden poseer actividad inmunoterapéutica que limita la infección y la patogénesis de miembros virulentos del complejoMycobacterium tuberculosis,y pueden ser adecuados para uso en terapia, ya sea en combinación con antibióticos tradicionales, anticuerpos adicionales, o solos, o se pueden usar como agente inmunoterapéutico pasivo. El isotipo IgM de P30B9 se une específicamente a ManLAM derivado deMycobacterium tuberculosiscon alta afinidad (FIG. 2A, B), pero no a PILAM derivado deMycobacterium smegmatis(FiG. 2C).

Las variantes y/o derivados genéticamente modificados de P30B9 pueden incluir, por ejemplo, P30B9 expresado en el isotipo IgA, incluyendo IgA1 e IgA2 diméricos. Sin desear estar atados por ninguna teoría, se cree que se requiere polivalencia para la función de P30B9, ya que este anticuerpo se aisló como una IgM, y no es activo cuando se expresa como una IgG. La presente descripción muestra que P30B9 es activo en isotipos IgA genéticamente modificados, incluyendo IgA1 e IgA2 diméricos. Esto se probó moviendo el dominio de VH de P30B9 a vectores de IgA1 e IgA2. IgA1 se diferencia de IgA2 principalmente por la presencia de una inserción de 16 aminoácidos, compuesta por una repetición de 8 aminoácidos rica en prolina, serina y treonina, y modificada con 3 - 6 oligosacáridos enlazados a través de O [FIG. 5]. La actividad de unión de las formas IgA genéticamente modificadas de P30B9 a ManLAM se comparó con las de las formas IgG e IgM. La forma IgM tuvo la mayor actividad, mientras que ambas formas IgA también fueron capaces de unirse a ManLAM, mostrando la forma IgA2 una actividad más débil que la forma IgA1, y la forma IgG fue inactiva en un ELISA contra ManLAM (FIG. 6).

Tabla 2. Re iones Determinantes de Complementariedad CDR de P30B9

Un experto normal en la técnica apreciará que las CDR son cruciales para la diversidad de especificidades de antígenos. Un experto normal en la técnica apreciará además que CDR3 es la más variable de las regiones CDR, y como tal, tiene la mayor importancia, siendo suficiente la diversidad en la región CDR3 de la cadena pesada variable para la mayoría de las especificidades de los anticuerpos. Por consiguiente, en algunos casos, los anticuerpos anti-LAM tienen una región<c>DR1 , CDR2 y CDR3 de la cadena ligera variable como se expone en SEQ ID NOS: 7, 8 y 9, respectivamente. En algunos casos, los anticuerpos anti-LAM tienen una región CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera variable como se expone en SEQ ID NOS: 7, 8 y 9, respectivamente con modificaciones de secuencia conservativas. En algunos casos, los anticuerpos anti-LAM tienen una región CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera variable que tiene hasta un 95 % de identidad con SEQ ID NOS: 7, 8 y 9 respectivamente. En otros casos, los anticuerpos anti-LAM tienen una región CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera variable que tiene hasta un 90 % de identidad con SEQ ID NOS: 7, 8 y 9 respectivamente. En otros casos, los anticuerpos anti-LAM tienen una región CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera variable que tiene hasta un 85 % de identidad con SEQ ID NOS: 7, 8 y 9 respectivamente. En otros casos, los anticuerpos anti-LAM tienen una región CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera variable que tiene hasta un 80 % de identidad con SEQ ID NOS: 7, 8 y 9 respectivamente. En algunos casos, los anticuerpos anti-LAM tienen una región CDR3 de la cadena ligera variable como se expone en SEQ ID NO: 9. En algunos casos, los anticuerpos anti-LAM tienen una región CDR3 de la cadena ligera variable como se expone en SEQ ID NO: 9 con modificaciones de secuencia conservativas. En otros casos, los anticuerpos anti-LAM tienen una región CDR3 de la cadena ligera variable que tiene hasta un 95 % de identidad con SEQ ID NO: 9. En otros casos, los anticuerpos anti-LAM tienen una región CDR3 de la cadena ligera variable que tiene hasta un 90 % de identidad con SEQ ID NO: 9. En otros casos, los anticuerpos anti-LAM tienen una región CDR3 de la cadena ligera variable que tiene hasta un 85 % de identidad con SEQ ID NO: 9. En otros casos, los anticuerpos anti-LAM tienen una región CDR3 de la cadena ligera variable que tiene hasta un 80 % de identidad con SEQ ID NO: 9.

En algunos casos, los anticuerpos anti-LAM tienen una región CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada variable como se expone en SEQ ID NOS: 10, 11 y 12, respectivamente. En algunos casos, los anticuerpos anti-LAM tienen una región CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada variable como se expone en SEQ ID NOS: 10, 11 y 12, respectivamente con modificaciones de secuencia conservativas. En algunos casos, los anticuerpos anti-LAM tienen una región CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada variable que tiene hasta un 95 % de identidad con SEQ ID NOS: 10, 11 y 12, respectivamente. En otros casos, los anticuerpos anti-LAM tienen una región CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada variable que tiene hasta un 90 % de identidad con SEQ ID NOS: 10, 11 y 12, respectivamente. En otros casos, los anticuerpos anti-LAM tienen una región CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada variable que tiene hasta un 85 % de identidad con SEQ ID NOS: 10, 11 y 12, respectivamente. En otros casos, los anticuerpos anti-LAM tienen una región CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada variable que tiene hasta un 80 % de identidad con SEQ ID NOS: 10, 11 y 12, respectivamente. En algunos casos, los anticuerpos anti-LAM tienen una región CDR3 de la cadena pesada variable como se expone en SEQ ID NO: 12. En algunos casos, los anticuerpos anti-LAM tienen una región CDR3 de la cadena pesada variable como se expone en SEQ ID NO: 12 con modificaciones de secuencia conservativas. En otros casos, los anticuerpos anti-LAM tienen una región CDR3 de la cadena pesada variable que tiene hasta un 95 % de identidad con SEQ ID NO: 12. En otros casos, los anticuerpos anti-LAM tienen una región CDR3 de la cadena pesada variable que tiene hasta un 90 % de identidad con SEQ ID NO: 12. En otros casos, los anticuerpos anti-LAM tienen una región CDR3 de la cadena pesada variable que tiene hasta un 85 % de identidad con SEQ ID NO: 12. En otros casos, los anticuerpos anti-LAM tienen una región CDR3 de la cadena pesada variable que tiene hasta un 80 % de identidad con SEQ iD NO: 12.

En los experimentos descritos aquí, el anticuerpo P30B9 se expresó mediante transfección de vectores de cadena H y L en células Expi293, y se cultivó en medio estándar Expi293 sin suero durante varios días. El anticuerpo segregado se purificó del sobrenadante del cultivo mediante cromatografía de afinidad en columnas conjugadas con ligando de proteína L. El anticuerpo unido se liberó de los ligandos mediante tratamiento con amortiguador de pH bajo (glicina-HCl 0,2 M, pH 2,5), y se neutralizaron con 1/50 de volumen de amortiguador tris 2 M (pH 8,8). El amortiguador se intercambió con PBS mediante diálisis o mediante varias rondas de concentración en filtros centrífugos (filtros centrífugos Amicon Ultra, límite de peso molecular 30 K).

Las secuencias de aminoácidos para la cadena pesada y la cadena ligera de P30B9, y su comparación con su línea germinal más cercana, se muestran en la FIG. 22. Las secuencias de aminoácidos y nucleotídicas de P30B9, incluida la región CDR3, se copian a continuación:

P30B9-Región variable de cadena pesada: QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVY

GGSFSGYY WSWTRQSPETGLEWLGE FDLGGS ITHSRGT NYNPSLKSRVTISGDTSKNQFSLKLTSVTAADTAVYYC ARGLAMGGTKEFDS

(SEQ ID NO: 43)

P30B9-Región variable de cadena pesada: QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVY

(SEQ ID NO: 43)

P30B9-Secuencia de ADN de cadena pesada:

caggtgcagctacagcagtggggcgcaggactgttgaagccttcggagaccctgtccctcacctgcgctgtctatggtgg

gtccttcagtggttactactggagctggatccgccagtccccagagacggggctggagtggcttggcgaaTTCGATCTT

G

GTGGAAGCatcactcatagtagaggcaccaactacaacccgtcgctcaagagtcgagtcaccatctcaggagacacgtcc

aagaaccagttctccctgaaactgacctctgtgaccgccgcggacacggctgtctattactgtgcgagaggtttagcaat

gggtggaactaaggagtttgactcctggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcag (SEQ ID NO: 45)

P30B9-Cadena ligera:

gacatccagatgacccagtctccagactccctgtctgcatctgtaggagacagaatcaccatcacttgccgggccagtca

gagtattaatagtaatttggcctggtatcagcagaaaccggggaaagcccctaagctcctgatctataaggcgtctgatt

tagaaagtggggtcccatcaaggttcagcggcagtggatctgggacagaattcactctcaccatcagcagcctgcagcct

gatgattttgcaacttattattgccaacagtataaagcattcaagacgttcggccacgggaccaaggtggaaatcaaac (SEQ

ID NO: 46)

3. P95C1

También se describe aquí el anticuerpo monoclonal humano recombinante P95C1, incluyendo variantes y/o derivados del mismo. P95C1 es específico para un epítopo compartido por LAM, LM y PIM6. Aunque P95C1 se aisló y purificó originalmente como una IgM, P95C1 también es activo cuando se expresa en otros isotipos, incluyendo, pero sin limitarse a, las formas IgG e IgA.

Un experto normal en la técnica apreciará que las CDR son cruciales para la diversidad de especificidades de antígenos. Un experto normal en la técnica apreciará además que CDR3 es la más variable de las regiones CDR, y como tal, tiene la mayor importancia, siendo suficiente la diversidad en la región CDR3 de la cadena pesada variable para la mayoría de las especificidades de los anticuerpos. Por consiguiente, en algunos casos, los anticuerpos anti-LAM tienen una región c DR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera variable como se expone en SEQ ID NOS: 13, 14 y 15, respectivamente. En algunos casos, los anticuerpos anti-LAM tienen una región CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera variable como se establece en SEQ ID NOS: 13, 14 y 15, respectivamente con modificaciones de secuencia conservativas. En algunos casos, los anticuerpos anti-LAM tienen una región CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera variable que tiene hasta un 95 % de identidad con SEQ ID NOS: 13, 14 y 15, respectivamente. En otros casos, los anticuerpos anti-LAM tienen una región CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera variable que tiene hasta un 90 % de identidad con SEQ ID NOS: 13, 14 y 15, respectivamente. En otros casos, los anticuerpos anti-LAM tienen una región CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera variable que tiene hasta un 85 % de identidad con SEQ ID NOS: 13, 14 y 15, respectivamente. En otros casos, los anticuerpos anti-LAM tienen una región CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera variable que tiene hasta un 80 % de identidad con SEQ ID NOS: 13, 14 y 15, respectivamente. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-LAM tienen una región CDR3 de la cadena ligera variable como se expone en SEQ ID NO: 15. En algunos casos, los anticuerpos anti-LAM tienen una región CDR3 de la cadena ligera variable como se expone en SEQ ID NO: 15 con modificaciones de secuencia conservativas. En otros casos, los anticuerpos anti-LAM tienen una región CDR3 de la cadena ligera variable que tiene hasta un 95 % de identidad con SEQ ID NO: 15. En otros casos, los anticuerpos anti-LAM tienen una región CDR3 de la cadena ligera variable que tiene hasta un 90 % de identidad con SEQ ID NO: 15. En otros casos, los anticuerpos anti-LAM tienen una región CDR3 de la cadena ligera variable que tiene hasta un 85 % de identidad con SEQ ID NO: 15. En otros casos, los anticuerpos anti-LAM tienen una región CDR3 de la cadena ligera variable que tiene hasta un 80 % de identidad con SEQ ID NO: 15.

En algunos casos, los anticuerpos anti-LAM tienen una región CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada variable como se expone en SEQ ID NOS: 16, 17 y 18, respectivamente. En algunos casos, los anticuerpos anti-LAM tienen una región CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada variable como se expone en SEQ ID NOS: 16, 17 y 18, respectivamente con modificaciones de secuencia conservativas. En algunos casos, los anticuerpos anti-LAM tienen una región CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada variable que tiene hasta un 95 % de identidad con SEQ ID NOS: 16, 17 y 18, respectivamente. En otros casos, los anticuerpos anti-LAM tienen una región CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada variable que tiene hasta un 90 % de identidad con SEQ ID NOS: 16, 17 y 18, respectivamente. En otros casos, los anticuerpos anti-LAM tienen una región CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada variable que tiene hasta un 85 % de identidad con SEQ ID NOS: 16, 17 y 18, respectivamente. En otros casos, los anticuerpos anti-LAM tienen una región CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada variable que tiene hasta un 80 % de identidad con SEQ ID NOS: 16, 17 y 18, respectivamente. En algunos casos, los anticuerpos anti-LAM tienen una región CDR3 de la cadena pesada variable como se expone en SEQ ID NO: 18. En algunos casos, los anticuerpos anti-LAM tienen una región CDR3 de la cadena pesada variable como se expone en SEQ ID NO: 18 con modificaciones de secuencia conservativas. En otros casos, los anticuerpos anti-LAM tienen una región CDR3 de la cadena pesada variable que tiene hasta un 95 % de identidad con SEQ ID NO: 18. En otros casos, los anticuerpos anti-LAM tienen una región CDR3 de la cadena pesada variable que tiene hasta un 90 % de identidad con SEQ ID NO: 18. En otros casos, los anticuerpos anti-LAM tienen una región CDR3 de la cadena pesada variable que tiene hasta un 85 % de identidad con SEQ ID NO: 18. En otros casos, los anticuerpos anti-LAM tienen una región CDR3 de la cadena pesada variable que tiene hasta un 80 % de identidad con SEQ iD NO: 18.

Tabla 3. R i n D rmin n m l m n ri DR P 1

El anticuerpo P95C1 IgM/K se identificó originalmente en sobrenadantes de células B de memoria transducidas con BCL6/Bcl-xL, y se clonó a partir de estas células en vectores de expresión de IgM/K usando el protocolo estándar de RT-PCR. El anticuerpo se expresó mediante transfección de vectores de cadena H y L en células Expi293, y se cultivó en medio estándar Expi293 sin suero durante varios días. El anticuerpo segregado se purificó del sobrenadante del cultivo mediante cromatografía de afinidad en columnas conjugadas con ligando de proteína L. El anticuerpo unido se liberó de los ligandos mediante tratamiento con amortiguador de pH bajo (glicina-HCl 0,2 M, pH 2,5), y se neutralizaron con 1/50 de volumen de amortiguador tris 2 M (pH 8,8). El amortiguador se intercambió con PBS mediante diálisis o mediante varias rondas de concentración en filtros centrífugos (filtros centrífugos Amicon Ultra, límite de peso molecular 30 K).

Las secuencias de aminoácidos para la cadena pesada y la cadena ligera de P95C1, y su comparación con su línea germinal más cercana, se muestran en la FIG. 23. Las secuencias de aminoácidos y nucleotídicas de P95C1, incluida la región CDR3, se copian a continuación:

P95C1-Región variable de cadena pesada: EVQLLESGPGLVRPWGTLSLTCAVS GGSINTNNW W SW VRQ SPGKGLEWIGE IHRHGDT NYNPSLKRRVSISMDESMNQFSLRLISVTAADTAVYYC CPLGYCSGDDCHRVA

(SEQ ID NO:47)

P95C1-Región variable de cadena ligera: DIQMTQSPSSLSVSLGERATINCKSS QNVLDSANNRNY FGWYQQKPGQPPKLLIS WAS TRESGVPDRFSGSGSGTDFTLIISGLQVEDVAVYYC TQYHRLPHT (SEQ ID NO:48)

P95C1-Cadena pesada: gaggtgcagctcttggagtcgggcccaggactggtgaggccttgggggactctgtccctcacctgcgctgtctctggtgg ctccatcaatactaataactggtggagttgggtccgccagtccccggggaaggggctggagtggattggagaaatccatc gtcatggggacaccaactacaacccgtcactcaagaggcgagtctccatatcgatggacgagtccatgaaccagttctcc ctgaggcttatctctgtgaccgccgcggacacggccgtgtattactgttgtcccctaggatattgtagtggtgatgactg tcaccgagttgcctggggccggggaatcctggtcaccgtctcttcag (SEQ ID NO:49)

P95C1-Cadena ligera: gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgtgtctctgggcgagagggccaccatcaactgcaagtccagcca gaatgttttagacagcgccaacaataggaactacttcggttggtaccagcagaaaccagggcagcctcctaagctgctca tttcctgggcatctacacgggaatccggggtccctgaccgattcagtggcagcggctctgggacagacttcactctcatc atcagcggcctgcaggttgaagatgtggcagtttattactgtacacagtatcatagacttcctcacaccttcggccaagg gacacgactggaaattaaac (SEQ ID NO:50)

E. Otras variantes y/o derivados

Un experto en la técnica apreciará que dadas las regiones CDR de A194-01, P30B9 y P95C1, se puede construir un gran número de variantes y/o derivados genéticamente modificados de los anticuerpos anti-LAM descritos aquí. Por ejemplo, los anticuerpos anti-LAM se pueden modificar genéticamente para convertirlos en anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados y anticuerpos quiméricos/humanizados que exhiban afinidad por uno o más epítopos de LAM. Los anticuerpos se pueden modificar genéticamente para convertirlos en anticuerpos biespecíficos, o se pueden modificar genéticamente de modo que un único constructo de anticuerpo se una a múltiples epítopos de LAM.

Como se describe aquí, los anticuerpos anti-LAM se pueden modificar genéticamente como constructos de scFv-IgG homólogos o como constructos de scFv-IgG heterólogos. En esta solicitud se detallan constructos homólogos de scFv-IgG de A194-01 (FIG. 17A). Un ejemplo no limitativo de un constructo de scFv-IgG heterólogo sería aquel en el que las cadenas VH y VL de P30B9 se unieran a la IgG de A194-01 mediante un enlazador (FIG. 17B), aunque podrían usarse otras cadenas VH/VL, por ejemplo otros anticuerpos anti-LAM tales como anticuerpos anti-LAM murinos. Esto puede permitir el reconocimiento de distintos epítopos en una única molécula de antígeno, y puede mejorar la unión multivalente y conducir a una mayor afinidad. Alternativamente, los constructos heterólogos de scFv-IgG pueden generar anticuerpos biespecíficos si las cadenas VH/VL adicionales se dirigen contra un antígeno distinto de LAM. Los anticuerpos anti-LAM también pueden modificarse genéticamente para crear constructos de scFv-IgM, incluyendo constructos de scFv-IgM tanto homólogos como heterólogos. Un ejemplo no limitativo de un scFv-IgM homólogo sería aquel en el que las cadenas VH/VL de P30B9 se unen a la IgM de P30B9. En este constructo, todos los sitios de unión poseerían la misma especificidad de epítopo. Un ejemplo no limitativo de un constructo de scFv-IgM heterólogo es aquel en el que el scFv de A194-01 se une a la IgM de P30B9, a diferencia del dominio constante de IgG [FIG. 17C]. Tal constructo variante y/o derivado modificado genéticamente retendría el reconocimiento dependiente de IgM de los epítopos de dimanosa del mAb P30B9 parental, y agregaría la especificidad de unión adicional del scFv de A194-01. Esto puede permitir el reconocimiento de matrices de epítopos únicos y conducir a afinidades mejoradas, lo que podría ser valioso para mejorar los ensayos de detección de antígenos en el lugar de atención.

F. Kits y métodos de diagnóstico

La presente descripción permite kits y métodos de diagnóstico para la detección y/o cuantificación de LAM y/o PIM6 en una muestra. Como se describe aquí, los anticuerpos anti-LAM A194-01 y P30B9, así como el anticuerpo anti-PIM6/LAM P95C1, incluyendo variantes y/o derivados genéticamente modificados de los mismos, pueden ser eficaces para detectar y/o cuantificar la cantidad de LAM y /o PIM6 presente en una muestra. El LAM o PIM6 puede derivar de cualquier fuente, tal como deMycobacterium tuberculosisoMycobacterium smegmatis,o de una muestra de suero u orina de un paciente, por ejemplo un paciente infectado con una cepa virulenta delcomplejo Mycobacterium tuberculosis.El LAM puede ser, por ejemplo, PILAM, ManLAM, o AraLAM no encaperuzado/no modificado procedente de otras cepas micobacterianas, tales como M.leprae.Estas cepas difieren en la naturaleza y el grado de encaperuzamiento que se produce, y por lo tanto diferentes combinaciones de anticuerpos tendrían diferentes especificidades para las diferentes formas, lo que permitiría llevar a cabo cierto nivel de diferenciación o tipaje. En particular, el isotipo IgM, y el IgA1 genéticamente modificado de P30B9, así como los isotipos IgM y scFv-IgG genéticamente modificados de A194-01, serían muy adecuados para detectar y/o cuantificar ManLAM sustituido con dimanosa en una muestra de un paciente con tuberculosis, que en algunas circunstancias puede comprender el 80% de dicho LAM, y diversos isotipos de P30B9 serían especialmente eficaces para detectar y/o cuantificar LAM que porta restos de Ara6 sustituidos con dimanosa, que como se describe aquí son particularmente prevalentes en LAM derivada deMycobacterium tuberculosis.Dado que el epítopo de P95C1 está altamente conservado en todas las especies de LAM, este anticuerpo, cuando se acopla con un segundo anticuerpo con la especificidad adecuada, sería muy adecuado para detectar y/o cuantificar diversos tipos de LAM en una muestra. El isotipo IgG de A194-01 se une muy eficazmente a diversas formas de LAM, especialmente LAM no sustituida, LAM monomanonsilada, y PILAM, y por lo tanto sería eficaz para detectar y/o cuantificar LAM derivado de diversas cepas de micobacterias. Los isotipos IgM y scFv-IgG genéticamente modificados también serían bastante eficaces para detectar y/o cuantificar la cantidad de LAM no sustituida, LAM monomanonsilada y PILAM, y además pueden unirse a LAM sustituida con di y trimanosa. Esto dota a las variantes y/o derivados modificados genéticamente de A194-01 de un mayor reconocimiento de epítopos que el isotipo IgG de A194-01 o el isotipo IgM de P30B9, pero a expensas de la especificidad para sólo aquellos epítopos de LAM que son específicos de cepas virulentas de Mycobacterium tuberculosis. En algunos casos, la cuantificación de dicha especificidad para LAM y/o PIM6 se logra comparando la intensidad de la señal de una muestra de control diluida en serie que tiene una concentración conocida de LAM y/o PIM6 en diversos ensayos de unión directa o ensayos de captura de antígeno.

Debido a que el isotipo IgG de A194-01, los isotipos IgM/IgA de P30B9, y los diversos isotipos de P95C1 se unen a diferentes epítopos de LAM que se expresan de forma variable en diferentes cepas de Mycobacterium tuberculosis, estos isotipos particulares podrían usarse para diferenciar el origen de una fuente de LAM; LAM sustituido con dimanosa, en particular restos de Ara6 sustituidos con dimanosa que comprenden la mayoría de los restos de LAM en cepas virulentas de Mycobacterium tuberculosis, mientras que los restos de LAM/PILAM no sustituidos comprenden la mayoría de los restos de LAM en cepas no virulentas de rápido crecimiento tales como Mycobacterium smegmatis. Por ejemplo, las muestras que comprenden LAM que se unen sólo a A194-01 IgG y no a P30B9 IgM probablemente no se originaron a partir de una cepa virulenta de Mycobacterium tuberculosis, mientras que las muestras que se unen tanto a la P30B0 IgM como a A194-01 IgG probablemente sí se originaron a partir de una cepa virulenta de Mycobacterium tuberculosis o una especie de micobacteria que introduce un motivo de encaperuzamiento similar.

Debido a que los isotipos IgM/IgA de P30B9 son específicos para ManLAM sustituido con dimanosa, que como se detalla aquí es la forma dominante en cepas virulentas de Mycobacterium tuberculosis, dichos isotipos de P30B9 son candidatos ideales para kits de diagnóstico y métodos de uso para diagnosticar a un paciente como infectado con una cepa virulenta del complejo Mycobacterium tuberculosis. Además, las variantes y/o derivados de IgM y scFv-IgG modificados genéticamente de A194-01 pueden ser adecuados para tal uso, ya que también reconocen epítopos de ManLAM sustituidos con dimanosa y trimanosa. Tal paciente podría tener una infección activa o en curso, o la infección podría estar latente. La cepa podría ser multirresistente (MDR) o extremadamente resistente a fármacos (XDR). Específicamente con respecto a pacientes con infecciones latentes, el cambio en la concentración de LAM en el suero o en la orina puede ser de particular importancia, ya que los aumentos en las concentraciones pueden significar un cambio a una infección activa. Alternativamente, una disminución en la concentración en un individuo que tiene una infección activa puede significar que el tratamiento es eficaz y debe continuarse, o un aumento en la concentración durante el tratamiento puede indicar que el tratamiento actual no es eficaz y debe eliminarse, cambiarse y/o modificarse.

Los métodos para diagnosticar la infección pueden incluir poner en contacto una muestra biológica de dicho paciente, por ejemplo sangre, plasma, orina, esputo, u otro fluido corporal, con al menos un anticuerpo anti-LAM y/o al menos un anticuerpo anti-PIM6/LAM de la presente invención, particularmente aquellos anticuerpos anti-LAM que reconocen ManLAM sustituido con dimanosa y aquellos anticuerpos anti-PIM6/LAM que reconocen al menos una estructura de polimanosa en el dominio de manano de PIM6. Estos incluyen, por ejemplo, los ¡sotipos IgM e IgA de P30B9, los ¡sotipos genéticamente modificados IgA, IgM y scFv-IgG de A194-01, y los diversos isotipos (IgG, IgM, IgA) de P95C1.

Los anticuerpos usados como reactivo de detección pueden unirse a moléculas informadoras tales como las conocidas en la técnica. Los anticuerpos pueden ser parte de un kit, por ejemplo unidos a un sustrato o parte de un ensayo tipo sándwich. Los kits pueden incluir un primer anticuerpo de captura anti-LAM o anti-PIM6/LAM, un segundo anticuerpo detector (de detección) anti-LAM o anti-PIM6/LAM que está unido a una molécula informadora, y un soporte al que está unido el anticuerpo de captura anti-LAM o anti-PIM6/LAM. El primer y segundo anticuerpo anti-LAM pueden unirse a los mismos epítopos de LAM que están presentes en múltiples copias en una única molécula de LAM, o preferiblemente pueden unirse a diferentes epítopos presentes en una única molécula de LAM. Los epítopos de LAM y PIM6 pueden ser cualquiera de los descritos aquí. Los kits pueden incluir un tercer anticuerpo de captura o detector (de detección) que se une a un sitio no competitivo del primer y segundo anticuerpo. Esto puede aumentar la cantidad de moléculas capturadas y la cantidad de moléculas detectoras unidas, y la intensidad de la señal correspondiente.

Los kits pueden incluir instrucciones de uso, y pueden contener además diversos reactivos, disolventes, diluyentes, y/o conservantes farmacéuticamente aceptables. Se llevó a cabo la sensibilidad de diferentes anticuerpos monoclonales anti-LAM marcados con biotina en dicho ensayo [FIG. 7]. En este ensayo, se usó el anticuerpo murino anti-LAM CS-35 para capturar ManLAM de la disolución. Este anticuerpo se seleccionó debido a su amplia especificidad. Se usó CS-35 (250 ng/pocillo) para capturar ManLAM a partir de disoluciones que contenían diferentes concentraciones, y entonces se usaron diferentes anticuerpos monoclonales biotinilados para sondar la presencia de ManLAM en el pocillo de captura. Usando un corte de 3 x SD del fondo, la sonda más sensible fue A194-01 IgM, que proporcionó una señal fuerte (1,8 OD) para la dilución más alta de ManLAM (0,016 ng/pocillo). Esto fue superior a los dos anticuerpos murinos FIND, que anteriormente se consideraban las mejores sondas disponibles para este tipo de ensayo.

G. Composiciones terapéuticas, métodos, vacunas y vectores

También se describen aquí composiciones farmacéuticas que comprenden al menos un anticuerpo anti-LAM o un anticuerpo anti-PIM6/LAM de la presente invención, así como sus métodos de uso en el tratamiento de un paciente que lo necesita. El paciente puede tener una infección latente o activa por una cepa virulenta de Mycobacterium tuberculosis, y de particular utilidad, la cepa puede ser multirresistente (MDR) o ampliamente resistente a fármacos (XDR) a terapias/antibióticos tradicionales. Los anticuerpos anti-LAM y anti-PIM6/LAM utilizados en estas composiciones y métodos pueden ser cualquier anticuerpo anti-LAM o anticuerpo anti-PIM6/LAM descrito aquí, pero de particular utilidad pueden ser aquellos anticuerpos anti-LAM que reconocen ManLAM encaperuzado con di-manosa, particularmente restos de Ara6 encaperuzados con dimanosa, por ejemplo el isotipo IgM o IgA1/IgA2 de P30B9 y el isotipo IgM pentavalente o el scFv-IgG tetravalente de A194-01, y diversos isotipos de P95C1.

Una composición de anticuerpo anti-LAM y/o anticuerpo anti-PIM6/LAM farmacéuticamente aceptable adecuada para la administración al paciente contendrá una cantidad eficaz del anticuerpo o anticuerpos anti-LAM o anti-PIM6/LAM en una formulación que conserva la actividad biológica al mismo tiempo que promueve la máxima estabilidad durante el almacenamiento dentro de un intervalo de temperatura aceptable. Las composiciones farmacéuticas también pueden incluir, dependiendo de la formulación deseada, diluyentes farmacéuticamente aceptables, vehículos farmacéuticamente aceptables y/o excipientes farmacéuticamente aceptables, o cualquier vehículo de este tipo comúnmente usado para formular composiciones farmacéuticas para administración animal o humana. El diluyente se selecciona de manera que no afecte la actividad biológica de la combinación. Ejemplos de tales diluyentes son agua destilada, disolución salina fisiológica amortiguada con fosfato, disoluciones de Ringer, disolución de dextrosa, y disolución de Hank. La cantidad de un excipiente que es útil en la composición o formulación farmacéutica de esta invención es una cantidad que sirve para distribuir uniformemente el anticuerpo por toda la composición de modo que pueda dispersarse uniformemente cuando se vaya a administrar a un sujeto que lo necesite. Puede servir para diluir el anticuerpo a una concentración que proporcione los resultados paliativos o curativos beneficiosos deseados y al mismo tiempo minimice cualquier efecto secundario adverso que pueda producirse por una concentración demasiado alta. También puede tener un efecto conservante. Por tanto, para el anticuerpo que tiene una alta actividad fisiológica, se empleará más excipiente. Por otro lado, para cualquier ingrediente o ingredientes activos que presenten una menor actividad fisiológica, se empleará una menor cantidad de excipiente.

La composición de anticuerpo anti-LAM y/o anticuerpo anti-PIM6/LAM farmacéuticamente aceptable puede estar en forma líquida o sólida. Una formulación sólida generalmente se liofiliza y se disuelve antes de la administración para una dosificación única o múltiple. Las formulaciones no deben exponerse a temperaturas o pH extremos, para evitar la desnaturalización térmica. Por tanto, es esencial formular una composición de anticuerpos de la presente invención dentro de un intervalo de pH biológicamente relevante. Está indicada una disolución amortiguada para mantener un intervalo de pH adecuado durante el almacenamiento, especialmente para formulaciones líquidas almacenadas durante períodos de tiempo más largos entre la formulación y la administración. Hasta la fecha, tanto las formulaciones líquidas como las sólidas requieren almacenamiento a temperaturas más bajas (normalmente 2-8°C) para conservar la estabilidad durante períodos más largos. Las composiciones de anticuerpos formuladas, especialmente las formulaciones líquidas, pueden contener un bacteriostato para prevenir o minimizar la proteólisis durante el almacenamiento, incluyendo, pero sin limitarse a, concentraciones eficaces (normalmente <1 % p/v) de alcohol bencílico, fenol, m-cresol, clorobutanol, metilparabeno, y/o propilparabeno. Un bacteriostato puede estar contraindicado para algunos pacientes. Por lo tanto, una formulación liofilizada puede reconstituirse en una disolución que contenga o no tal componente. Se pueden añadir componentes adicionales a una formulación de anticuerpo sólida o líquida amortiguada, incluyendo, pero sin limitarse a, azúcares como crioprotector (incluidos, pero sin limitarse necesariamente a, hidrocarburos polihidroxilados tales como sorbitol, manitol, glicerol y dulcitol, y/o disacáridos tales como sacarosa, lactosa, maltosa o trehalosa) y, en algunos casos, una sal relevante (incluyendo, pero sin limitarse a, NaCl, KCl o LiCl). Tales formulaciones de anticuerpos, especialmente las formulaciones líquidas previstas para almacenamiento a largo plazo, dependerán de un intervalo útil de osmolaridad total tanto para promover la estabilidad a largo plazo a una temperatura de 2-8°C, o mayor, como al mismo tiempo hacer que la formulación sea útil para la inyección parenteral. Un intervalo eficaz de osmolaridad total (el número total de moléculas en disolución) es de alrededor de 200 mOs/l a alrededor de 800 mOs/l. Será evidente que la cantidad de un crioprotector, tal como sacarosa o sorbitol, dependerá de la cantidad de sal en la formulación, a fin de que la osmolaridad total de la disolución permanezca dentro de un intervalo apropiado. Por lo tanto, una formulación libre de sal puede contener de alrededor de 5% a alrededor de 25% de sacarosa, con un intervalo preferido de sacarosa de alrededor de 7% a alrededor de 15%, siendo una concentración de sacarosa especialmente preferida en una formulación libre de sal de 10% a 12%. Alternativamente, una formulación basada en sorbitol sin sal puede contener sorbitol dentro de un intervalo de alrededor de 3% a alrededor de 12%, con un intervalo preferido de alrededor de 4% a 7%, y un intervalo especialmente preferido es de alrededor de 5% a alrededor de 6% de sorbitol en una formulación sin sal. Por supuesto, las formulaciones sin sal garantizarán mayores intervalos del crioprotector respectivo a fin de mantener niveles de osmolaridad eficaces. Estas formulaciones también pueden contener un catión divalente (incluyendo, pero sin limitarse a, MgCl2, CaCl2 y MnCl2); y un tensioactivo no iónico 32 (incluyendo, pero sin limitarse a, Polisorbato-80 (Tween 80®), Polisorbato-60 (Tween 60®), Polisorbato-40 (Tween 40®) y Polisorbato-20 (Tween 20®), éteres alquílicos de polioxietileno, incluyendo, pero sin limitarse a, Brij 58®, Brij 35®, así como otros, tales como Triton X-100®, Triton X 114®, NP40®, Span 85 y la serie Pluronic de tensioactivos no iónicos (por ejemplo, Pluronic 121)). Cualquier combinación de tales componentes, incluida la probable inclusión de un bacteriostato, puede ser útil para rellenar las formulaciones que contienen anticuerpos. La composición de anticuerpo también puede ser un "derivado químico", que describe un anticuerpo que contiene restos químicos adicionales que normalmente no forman parte de la molécula de inmunoglobulina (por ejemplo, pegilación). Tales restos pueden mejorar la solubilidad, la vida media, la absorción, etc. de la molécula base. Alternativamente, los restos pueden atenuar los efectos secundarios indeseables de la molécula base, o disminuir la toxicidad de la molécula base.

Las realizaciones específicas incluyen microesferas de PLGA, como se analiza aquí y como se conoce además en la técnica, así como vehículos no degradables a base de polímeros que comprenden poli(etileno-co-acetato de vinilo; PEVAc). Además, la administración de liberación controlada y la administración localizada de productos terapéuticos basados en anticuerpos se revisan en Grainger, et al., 2004, Expert Opin. Biol. Ther. 4(7): 1029-1044), incorporado aquí como referencia en su totalidad. Las microcápsulas adecuadas capaces de encapsular el anticuerpo también pueden incluir microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de polimetacrilato de metilo preparadas mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial. Véase la publicación PCT WO 99/24061 titulada "Method for Proproduction IGF-1 Sustained-Release Formulations", en la que una proteína se encapsula en microesferas de PLGA; esta referencia se incorpora aquí como referencia en su totalidad. Además, también se pueden usar microemulsiones o sistemas de administración de fármacos coloidales, tales como liposomas y microesferas de albúmina. Otras composiciones de liberación sostenida preferidas emplean un bioadhesivo para retener el anticuerpo en el sitio de administración. Como se señaló anteriormente, la formulación de liberación sostenida puede incluir un polímero biodegradable en el que se dispone el anticuerpo, que puede proporcionar una liberación no inmediata. Los dispositivos no inyectables pueden describirse aquí como un "implante", "implante de depósito farmacéutico", "implante de depósito", "depósito no inyectable" o algún término similar. Los implantes de depósito comunes pueden incluir, pero no se limitan a, dispositivos de polímeros sólidos biodegradables y no biodegradables (tales como un polímero extendido o un dispositivo con forma de varilla coaxial), así como numerosos sistemas de bomba también conocidos en la técnica. Los dispositivos inyectables se dividen en inyecciones de bolo (liberación y disipación del fármaco después de la inyección) e inyecciones de almacén o de depósito, que proporcionan un reservorio de almacenamiento en el lugar de la inyección, lo que permite una liberación sostenida del agente biológico a lo largo del tiempo. Un implante de depósito puede atarse quirúrgicamente al punto de administración para proporcionar un reservorio adecuado para la liberación prolongada del anticuerpo a lo largo del tiempo. Tal dispositivo será capaz de transportar la formulación farmacéutica en las cantidades terapéutica o profilácticamente necesarias para el tratamiento durante el período preseleccionado. El implante de depósito también puede proporcionar protección a la formulación contra la degradación por procesos corporales (tales como proteasas) durante todo el tratamiento. Como se sabe en la técnica, la expresión "liberación sostenida" se refiere a la liberación gradual (continua o discontinua) de tal agente de la matriz polimérica en bloque durante un período de tiempo prolongado. Independientemente del dispositivo específico, la liberación sostenida de la composición del anticuerpo anti-LAM y/o del anticuerpo anti-PIM6/LAM dará como resultado concentraciones locales biológicamente eficaces del anticuerpo. Una liberación sostenida del agente o agentes biológicos será por un periodo de un solo día, varios días, una semana o más; pero lo más probable es que dure un mes o más, o hasta alrededor de seis meses, según la formulación. Los polímeros naturales o sintéticos conocidos en la técnica serán útiles como implante de depósito debido a características tales como una cinética de degradación versátil, la seguridad y la biocompatibilidad. Estos copolímeros se pueden manipular para modificar la farmacocinética del ingrediente activo, proteger al agente del ataque enzimático, y degradarse con el tiempo en el sitio de unión o inyección. El experto comprenderá que existen amplias enseñanzas en la técnica para manipular las propiedades de estos copolímeros, incluyendo el procedimiento de producción respectivo, los catalizadores usados, y el peso molecular final del implante de depósito de liberación sostenida o la inyección de depósito. Los polímeros naturales incluyen, pero no se limitan a, proteínas (por ejemplo, colágeno, albúmina o gelatina); polisacáridos (celulosa, almidón, alginatos, quitina, quitosano, ciclodextrina, dextrano, ácido hialurónico) y lípidos. Los polímeros sintéticos biodegradables pueden incluir, pero no se limitan a, diversos poliésteres, copolímeros de ácido L-glutámico y gamma-etil-L-glutamato (Sidman et al., 1983, Biopolymers 22:547-556), polilactidas ([PLA]; patente de EE. UU. 3.773.919 y documento EP 058.481), polilactato poliglicolato (PLGA) ,tal como polilactida-co-glicolida (véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. núms. 4.767.628 y 5.654.008), poliglicolida (PG), conjugados polietilenglicólicos (PEG) de poli(a-hidroxiácidos), poliortoésteres, poliaspirinas, polifosfagenos, vinilpirrolidona, polialcohol vinílico (PVA), PVA-g-PLGA, copolímero PEGT-PBT (poliactivo), metacrilatos, poli(N-isopropilacrilamida), PEO-PPO-PEO (plurónicos), copolímeros PEO-PPO-PAA, p Lg A-PEO-PLGA, poliortoésteres (POE), o cualquier combinación de los mismos, como se describe anteriormente (véanse, por ejemplo, la patente de EE. UU. núm. 6.991.654 y la solicitud de patente de EE. UU. núm. 20050187631, cada uno de los cuales se incorpora aquí como referencia en su totalidad, hidrogeles (véase, por ejemplo, Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res.

15:167-277; Langer, 1982, Chem. Tech. 12:98-105, etileno-acetato de vinilo no degradable (por ejemplo, discos de etileno-acetato de vinilo y poli(etileno-co-acetato de vinilo)), copolímeros degradables de ácido láctico-ácido glicólico, tal como Lupron Depot™, ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico (documento EP 133.988), geles de ácido hialurónico (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. 4.636.524), suspensiones de ácido algínico, poliortoésteres (POE), y similares. La polilactida (PLA) y sus copolímeros con glicolida (PLGA) han sido bien conocidos en la técnica desde la comercialización de Lupron Depot™, aprobado en 1989 como la primera formulación parenteral de liberación sostenida que utiliza polímeros de PLA. Ejemplos adicionales de productos que utilizan PLA y PLGA como excipientes para lograr una liberación sostenida del ingrediente activo incluyen Amidox (PLA; enfermedad periodontal), Nutropin Depot (PLGA; con hGH) y Trelstar Depot (PLGA; cáncer de próstata). Otros polímeros sintéticos incluyen, pero no se limitan a, poli(c-caprolactona), poli3-hidroxibutirato, poli(ácido p-málico) y poli(dioxanona)]; polianhídridos, poliuretano (véase el documento WO 2005/013936), poliamidas, ciclodextranos, poliortoésteres, alcohol n-vinílico, óxido de polietileno/tereftalato de polietileno, polifosfato, polifosfonato, poliortoéster, policianoacrilato, polietilenglicol, polidihidropirano, y poliacitol. Los dispositivos no biodegradables incluyen, pero no se limitan a, diversos derivados de celulosa (carboximetilcelulosa, acetato de celulosa, acetato-propionato de celulosa, etilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa), implantes a base de silicio (polidimetilsiloxano), polímeros acrílicos (polimetacrilato, polimetilmetacrilato, polihidroxi(etilmetilacrilato), así como polietileno-co-(acetato de vinilo), poloxámero, polivinilpirrolidona, poloxamina, polipropileno, poliamida, poliacetal, poliéster, polietileno-clorotrifluoroetileno, politetrafluoroetileno (PTFE o "Teflon™"), caucho de estireno-butadieno, polietileno, polipropileno, polióxido de fenilenopoliestireno, poli-a-cloro-p-xileno, polimetilpenteno, polisulfona, y otros polímeros bioestables relacionados. Los vehículos adecuados para formulaciones de depósito de liberación sostenida incluyen, pero no se limitan a, micoesferas, películas, cápsulas, partículas, geles, revestimientos, matrices, obleas, píldoras, u otras composiciones de administración farmacéutica. Anteriormente se describen ejemplos de tales formulaciones de liberación sostenida. Véanse también las patentes de EE. UU. núms. 6.953.593; 6.946.146; 6.656.508; 6.541.033; y 6.451.346, cuyos contenidos se incorporan aquí como referencia. La forma de dosificación debe ser capaz de contener la formulación farmacéutica en las cantidades y concentraciones terapéuticamente necesarias para el tratamiento durante el período preseleccionado, y debe proporcionar suficiente protección a la formulación contra la degradación por procesos corporales durante todo el tratamiento. Por ejemplo, la forma de dosificación puede estar rodeada por un exterior hecho de un material que tenga propiedades para proteger contra la degradación de procesos metabólicos y el riesgo de, por ejemplo, fugas, grietas, roturas, o distorsiones. Esto puede evitar la expulsión del contenido de la forma de dosificación de una manera incontrolada bajo tensiones a las que estaría sometido durante el uso, por ejemplo debido a fuerzas físicas ejercidas sobre el dispositivo de liberación de fármaco como resultado de la articulación normal de la articulación y otros movimientos por parte del sujeto, o, por ejemplo en dispositivos de administración de fármacos por convección, las fuerzas físicas asociadas con la presión generada dentro del depósito. El depósito de medicamento u otros medios para retener o contener el fármaco también deben ser de un material tal que evite reacciones no deseadas con la formulación del agente activo, y preferiblemente ser biocompatibles (por ejemplo, cuando se implanta la forma de dosificación, es sustancialmente no reactiva con con respecto al cuerpo o fluidos corporales de un sujeto). Generalmente, el o los agentes biológicos respectivos se administran a un individuo durante al menos 12 horas hasta al menos una semana, y muy probablemente a través de un implante diseñado para suministrar un fármaco durante al menos 10, 20, 30, 100 días o al menos 4 meses, o al menos 6 meses o más, según sea necesario. El anticuerpo anti-LAM y/o el anticuerpo anti-PIM6/LAM se pueden administrar a velocidades de volumen relativamente bajas, por ejemplo de alrededor de 0,001 ml/día a 1 ml/día, para minimizar la alteración del tejido o el trauma cerca del sitio donde se libera la formulación. La formulación se puede liberar a una velocidad, dependiendo del o de los agentes biológicos específicos, a una dosis baja, por ejemplo de alrededor de 0,01 pg/h o 0,1 pg/h, 0,25 pg/h, 1 pg/h, generalmente hasta alrededor de 200 pg/h, o la formulación se administra a una velocidad de volumen baja, por ejemplo una velocidad de volumen de alrededor de 0,001 ml/día a alrededor de 1 ml/día, por ejemplo 0,01 microgramos por día hasta alrededor de 20 miligramos por día. La dosis depende de una serie de factores tales como la potencia, la biodisponibilidad, y la toxicidad del ingrediente activo (por ejemplo, anticuerpo IgG) usado, y los requisitos del sujeto.

Para el tratamiento in vivo de pacientes humanos y no humanos, al paciente se le administra o se le proporciona una formulación farmacéutica que incluye al menos un anticuerpo anti-LAM y/o al menos un anticuerpo anti-PIM6/LAM descrito aquí. Cuando se usan para terapia in vivo, los anticuerpos anti-LAM o anti-PIM6/LAM se administran al paciente en cantidades terapéuticamente eficaces (es decir, cantidades que eliminan o reducen la carga bacteriana total). Los anticuerpos se administran a un paciente humano, según métodos conocidos, tales como administración intravenosa, por ejemplo en forma de bolo o mediante infusión continua durante un período de tiempo, por vía intramuscular, intraperitoneal, intracerobroespinal, subcutánea, intraarticular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica, o por inhalación. Los anticuerpos se pueden administrar por vía parenteral, cuando sea posible, en el sitio de la célula diana, o por vía intravenosa. En algunas realizaciones, el anticuerpo se administra mediante administración intravenosa o subcutánea. Las composiciones terapéuticas se pueden administrar a un paciente o sujeto por vía sistémica, parenteral, o local. Los parámetros anteriores para evaluar el tratamiento exitoso y la mejora de la enfermedad se pueden medir fácilmente mediante procedimientos rutinarios familiares para un médico.

Para la administración parenteral, los anticuerpos anti-LAM y anti-PIM6/LAM se pueden formular en una forma inyectable de dosificación unitaria (disolución, suspensión, emulsión) en asociación con un vehículo parenteral farmacéuticamente aceptable. Ejemplos de tales vehículos incluyen, pero no se limitan a, agua, disolución salina, disolución de Ringer, disolución de dextrosa, y seroalbúmina humana al 5 %. Los vehículos no acuosos incluyen, pero no se limitan a, aceites fijos y oleato de etilo. Los liposomas se pueden usar como vehículos. El vehículo puede contener cantidades menores de aditivos, tales como sustancias que mejoran la isotonicidad y la estabilidad química, tales como, por ejemplo, amortiguadores y conservantes.

Los anticuerpos anti-LAM y anti-PIM6/LAM se pueden administrar al hospedante de cualquier manera, estrategia y/o combinación disponible en la técnica, en cantidades suficientes para ofrecer un tratamiento terapéutico contra la infección por una cepa virulenta del complejo Mycobacterium tuberculosis. Estas composiciones pueden proporcionarse al individuo mediante una variedad de vías conocidas en la técnica, especialmente vías parenterales, que incluyen, pero no limitadas a, vías parenterales tales como administración intravenosa (IV), intramuscular (IM), o subcutánea (SC), siendo la administración IV la norma dentro de la técnica de la administración de anticuerpos terapéuticos. Estas composiciones se pueden administrar como dosis separadas o múltiples (es decir, administración del anticuerpo en momentos escalonados manteniendo la condición estéril de la formulación durante todo el régimen de tratamiento).

La dosis y el régimen de dosificación dependen de una variedad de factores fácilmente determinados por un médico, tales como la naturaleza de la infección, por ejemplo su índice terapéutico, el paciente, y los antecedentes del paciente. Generalmente, se administra a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo. En algunas realizaciones, la cantidad de anticuerpo administrada está en el intervalo de alrededor de 0,01 mg/kg a alrededor de 1000 mg/kg de peso corporal del paciente, y cualquier intervalo intermedio. Dependiendo del tipo y gravedad de la infección, alrededor de 0,1 mg/kg a alrededor de 50 mg/kg de peso corporal (por ejemplo, alrededor de 0,1-15 mg/kg/dosis) de anticuerpo es una dosis candidata inicial para administración al paciente, ya sea, por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas, o mediante infusión continua. El progreso de esta terapia se monitoriza fácilmente mediante métodos y ensayos convencionales, y se basa en criterios conocidos por el médico u otras personas expertas en la técnica. Los parámetros anteriores para evaluar el tratamiento exitoso y la mejora de la enfermedad se pueden medir fácilmente mediante procedimientos rutinarios familiares para un médico.

Estos anticuerpos también se pueden administrar a través de vectores genéticos que expresan las cadenas pesadas y ligeras emparejadas de un anticuerpo determinado. Esto puede implicar un plásmido que exprese eficientemente estos genes o un vector viral, tales como vectores adenovirales o de virus adenoasociados (AAV). Estos vectores pueden administrarse mediante inyección en el tejido muscular, y, dependiendo de la dosis, pueden segregar una cantidad relativamente grande de anticuerpo segregado a la circulación durante un período de tiempo relativamente largo.

Se pueden combinar otros regímenes terapéuticos con la administración de los anticuerpos anti-LAM y/o anti-PIM6/LAM, por ejemplo con otro anticuerpo anti-LAM, incluyendo, pero sin limitarse a, aquellos anticuerpos anti-LAM conocidos en la técnica, por ejemplo anticuerpos anti-LAM murinos o versiones humanizadas de los mismos, o con un compuesto farmacéutico, tal como, pero sin limitarse a, antibióticos. Los antibióticos que son adecuados para la coadministración con los anticuerpos anti-LAM y/o anti-PIM6/LAM de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, isoniazida, rifampicina, rifapentina, etambutol, pirazinamida, bedaquilina, capreomicina, cicloserina, dexametasona, kanamicina, y tinocordina. La administración combinada incluye la coadministración, usando formulaciones separadas o una única formulación farmacéutica, y la administración consecutiva en cualquier orden, en la que preferiblemente hay un período de tiempo mientras ambos (o todos) los agentes activos ejercen simultáneamente sus actividades biológicas. Esta terapia combinada puede dar como resultado un efecto terapéutico sinérgico. Los parámetros anteriores para evaluar el tratamiento exitoso y la mejora de la enfermedad se pueden medir fácilmente mediante procedimientos rutinarios familiares para un médico.

También se describe aquí una vacuna pasiva o composiciones farmacéuticas que incluyen al menos un anticuerpo anti-LAM y/o anti-PIM6/LAM y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Según un ejemplo, la vacuna o las composiciones farmacéuticas son una composición que incluye al menos un anticuerpo descrito aquí y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La vacuna puede incluir una pluralidad de anticuerpos que tienen las características descritas aquí en cualquier combinación, y puede incluir además otros anticuerpos anti-LAM, incluidos los descritos aquí y aquellos conocidos en la técnica, por ejemplo anticuerpos anti-LAM murinos o versiones humanizadas de los mismos. La vacuna pasiva puede incluir uno o más conservantes, vehículos y/o excipientes farmacéuticamente aceptables, que se conocen en la técnica.

También se describe aquí una vacuna activa o una composición farmacéutica que incluye la administración al paciente de al menos un epítopo antigénico de LAM o PIM6. El epítopo particular que se va a emplear se puede determinar probando la actividad terapéutica de los anticuerpos descritos en esta patente en un modelo animal apropiado para la infección y/o patogénesis de la tuberculosis. Esta especie modelo puede ser un ratón, un cobaya, un conejo, o un primate. Por ejemplo, si A194-01 es más protector, entonces se usaría una vacuna que lleve una forma del epítopo de A194-01, mientras que si P30B9 es más protector, los restos de Ara6 sustituidos con dimanosa pueden ser más eficaces para generar una respuesta humoral apropiada. La vacuna activa puede incluir uno o más adyuvantes, que son conocidos en la técnica, por ejemplo alumbre, hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, aceite de parafina, y citocinas, por ejemplo IL-1, IL-2, IL-12. La vacuna activa puede comprender uno o más conservantes, vehículos, y/o excipientes farmacéuticamente aceptables, que se conocen en la técnica.

También se describe aquí un vector recombinante, por ejemplo un plásmido, que incluye un ácido nucleico que codifica una cadena pesada de inmunoglobulina (Ig VH) de un anticuerpo anti-LAM o un anticuerpo anti-PIM6/LAM, y un segundo ácido nucleico que codifica una cadena ligera de inmunoglobulina (Ig VL). En otras realizaciones, el primer ácido nucleico y el segundo ácido nucleico están en dos vectores recombinantes diferentes. También se describe aquí un método para tratar una infección tuberculosa en un individuo, que incluye administrar a dicho individuo un primer ácido nucleico que codifica una cadena pesada de inmunoglobulina (Ig VH) de un anticuerpo anti-LAM o anti-PIM6/LAM y un segundo ácido nucleico que codifica una cadena ligera de inmunoglobulina (Ig VL) de un anticuerpo anti-LAM o anti-PIM6/LAM, en el que cada uno de los ácidos nucleicos está unido operativamente a una región promotora. El primer ácido nucleico y el segundo ácido nucleico pueden estar en un mismo vector recombinante o en dos vectores recombinantes diferentes. El vector recombinante puede ser vectores virales no replicantes, por ejemplo virus adenoasociados (AAV), o pueden ser plásmidos. En ciertos casos, una célula puede transformarse con uno o más vectores descritos aquí.

Los anticuerpos y las composiciones de anticuerpos, composiciones de vacunas, y vectores descritos anteriormente se pueden administrar para el tratamiento profiláctico y terapéutico de la infección por cepas virulentas delcomplejo Mycobacterium tuberculosis.

H. Equivalentes

Cuando se proporciona un valor de intervalos, se entiende que cada valor intermedio, hasta la décima parte de la unidad del límite inferior, a menos que el contexto dicte claramente lo contrario, entre el límite superior e inferior de ese intervalo y cualquier otro valor indicado o intermedio en ese intervalo indicado está abarcado dentro de la invención. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños que pueden incluirse independientemente en los intervalos más pequeños también están abarcados dentro de la invención, sujetos a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo indicado. Cuando el intervalo indicado incluye uno o ambos límites, también se incluyen en la invención los intervalos que excluyen cualquiera de los límites incluidos.

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados aquí tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto normal en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque cualquier método y material similar o equivalente a los descritos aquí también se puede usar en la práctica o ensayo de la presente invención, a continuación se describen los métodos y materiales preferidos. Todas las publicaciones mencionadas aquí se incorporan aquí como referencia en su totalidad.

Como se usa aquí y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el/la" incluyen referencias en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

La expresión "alrededor de" se refiere a un intervalo de valores que una persona con conocimientos habituales en la técnica no consideraría como sustancialmente diferentes de los valores de referencia. Por ejemplo, la expresión "alrededor de" puede referirse a un valor que está dentro del 20 %, 15 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, o 0,01 % del valor indicado, así como los valores que intermedios entre tales valores indicados.

Las publicaciones descritas aquí se proporcionan únicamente para su descripción antes de la fecha de presentación de la presente invención.

Los siguientes ejemplos no limitativos sirven para ilustrar mejor la presente invención.

EJEMPLOS

EJEMPLO 1: Los métodos descritos aquí se utilizaron para cultivar células B de memoriain vitroy para clonar molecularmente genes de la región variable de inmunoglobulina para aislar varios anticuerpos monoclonales (mAb) humanos nuevos específicos para LAM. Un experto normal en la técnica reconocerá que estos métodos descritos aquí se pueden ajustar para identificar selectivamente anticuerpos raros con muy alta afinidad, que podrían estar presentes en tan sólo 1 de cada 100.000 células B de memoria que circulan en la sangre del paciente.

Anticuerpos monoclonales

Anticuerpos monoclonales murinos: Las líneas celulares de hibridoma que producen anticuerpos monoclonales murinos específicos de LAM CS-35 y CS-40 obtenidas del laboratorio del Dr. Delphi Chatterjee se volvieron a clonar hasta homogeneidad, y los anticuerpos se purificaron mediante cromatografía de proteína A.

Los anticuerpos 906.41, 906.7, 908.1 y 922.5 fueron proporcionados por el Dr. John Spencer, y FIND25 y FIND170 fueron proporcionados por Tobias Broger en FIND.

Antígenos

El lipoarabinomanano (LAM) de H37Rv derivado deMycobacterium tuberculosis(NR-14848) y el LAM derivado deMycobacterium smegmatis(NR-14860) se obtuvieron de la Universidad Estatal de Colorado a través de BEI Resources. Los glicoconjugados derivados de LAM se sintetizaron en el laboratorio de Lowary.

Ensayos ELISA

Man-LAM (H37Rv) y PI-LAM (derivado deMycobacterium smegmatic)se diluyeron en amortiguador CBC (carbonato de sodio 7,5 mM, bicarbonato de sodio 17,4 mM, pH 9,0) y se sembraron en placas a una concentración de 100 ng/pocillo en placas ELISA de 96 pocillos. Después de la incubación de las placas durante la noche a 4°C, los pocillos se lavaron con PBS, pH 7,4, que contenía Tween-20 al 0,05 % (PBST), después se bloquearon con BSA al 1 % (Sigma) en amortiguador de PBS. Las placas lavadas con PBST se incubaron durante 1 hora a 37°C con plasma derivado de individuos infectados conMycobacterium tuberculosisy plasma de control diluido en medio RPMI que contenía FBS al 2 %. Las placas lavadas con PBST se incubaron entonces durante 1 hora con una dilución 1:100ü de anti-IgG (yespecífica) (Millipore), o -IgM (p-específica) (Millipore), o -IgA (a-específica) humana de cabra conjugado con fosfatasa alcalina. Después del lavado con PBST, el color se desarrolló con 50 pl de amortiguador DEA. La OD se midió a 405 nm mediante espectrofotómetro. Los títulos se definieron como la dilución recíproca que produjo una OD después de restar la OD de fondo tomada de la placa revestida con BSA, y se determinaron mediante interpolación exponencial.

Titulaciones de plasma

Los dos antígenos purificados se obtuvieron del BEI Repository, y se sembraron durante la noche a 4°C en placas de ELISA de 96 pocillos a una concentración de 2 pg/ml, y las placas se bloquearon entonces con BSA al 1 % en PBS 1X. Los títulos de plasma específicos de LAM se analizaron incubando muestras diluidas en serie a 37°C durante 1 hora, después de lo cual las placas se lavaron tres veces con PBS Tween20 al 0,1%. El anticuerpo unido se detectó con una mezcla de anti-kappa humano de cabra y anti-lambda humano de cabra conjugados con fosfatasa alcalina en una dilución 1:1000 en BSA al 1 % en PBS, y las señales se desarrollaron añadiendo sustrato de fosfato alcalino en amortiguador DEA. La reactividad se midió como OD405 a los 30 min.

Sujetos humanos

Se inscribieron pacientes con infección activa porMycobacterium tuberculosisen el Lattimore Practice en el Global Tuberculosis Institute. La infección activa se definió como enfermedad tuberculosa comprobada por cultivo, o un diagnóstico de tuberculosis clínica. Este grupo incluyó a pacientes con un diagnóstico reciente de tuberculosis, pacientes que se encontraban en el segundo mes de la terapia. Los pacientes no infectados eran voluntarios sanos seronegativos para el VIH, negativos para la prueba cutánea de la tuberculina, sin antecedentes de vacunación contra el bacilo de Calmette-Guérin (BCG) y negativos para el ensayo de liberación de interferón gamma (IGRA) (Quantiferon Gold In-Tube, Cellestis Inc, Valencia, CA). Se obtuvo la autorización escrita de los participantes, y el estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Rutgers.

Tabla 4. Características clínicas de los acientes con tuberculosis usados en este estudio

Tabla 4. Demografía de sujetos humanos

1. Cultivo y aislamiento de A194-01 (isotipo IgG)

El anticuerpo monoclonal humano anti-LAM A194-01, isotipo IgG, se aisló de células B de memoria cultivadas obtenidas de un paciente infectado con tuberculosis, TB-194. Un componente crítico del sistema de cultivoin vitroes la presencia de células alimentadoras adecuadas que puedan proporcionar estimulación por CD40L, el ligando para CD40, un miembro de la superfamilia de receptores de TNF que se expresa en la superficie de las células B y desempeña un papel esencial en la mediación del cambio de clase de inmunoglobulina dependiente de células T y el desarrollo de células B de memoria. Se sembraron células B de memoria en una capa alimentadora de células MS40L-low que expresan CD40L. Estas células expresan un nivel bajo de CD40L, y se ha demostrado previamente que apoyan de manera eficiente la replicación de las células B de memoria y su maduración a células plasmáticas (Luo, X., et al., Blood, 2009. 113(7). Estas células se generaron infectando células MS5 del estroma murino, que proporcionan el factor de crecimiento del linaje B IL-7, con FUW-CD40L, un virus que transduce el CD40L humano, obtenido originalmente de Origene (Rockville, MD). Las células B de memoria se aislaron con el kit de aislamiento de células B de memoria humanas MACS de Miltenyi (n.° de cat. #130-093-546). Las células no B se excluyeron de las PBMC mediante selección negativa con perlas magnéticas que contenían anticuerpos contra el marcador de superficie celular CD2, CD3, CD14, CD16, CD36, CD43, CD56, CD66b y glicoforina A. Para eliminar aún más las células B vírgenes, las subpoblaciones de células B de memoria se seleccionaron positivamente con perlas magnéticas acopladas a un anticuerpo contra el marcador de superficie celular CD27, un marcador para células B de memoria que también se expresa en niveles bajos en células plasmáticas, pero no en células B vírgenes. En presencia de células alimentadoras que expresan CD40L, estas condiciones apoyan la replicación de las células B de memoria y su diferenciación en plasmablastos que segregan títulos relativamente altos de Igs en sobrenadantes de cultivo.

Los cultivos se realimentaron a intervalos semanales reemplazando la mitad del sobrenadante del cultivo con medio nuevo. Después de 2 a 3 semanas, había suficientes células B para producir ~1-5 pg/ml de anticuerpo segregado. Suponiendo la presencia de 100-1.000 clones distintos en cada pocillo, esto correspondía a una concentración promedio de 1-10 ng/ml de Ig por clon de células B. Esta concentración es bastante baja, y por lo tanto este método se inclinó hacia anticuerpos con afinidades relativamente altas por los antígenos diana. Se purificaron aproximadamente 80.000 células B de memoria de la sangre de este paciente, y se cultivaron en 96 pocillos de una placa de cultivo de 96 pocillos, para una densidad inicial de ~800 células/pocillo.

Los sobrenadantes de los cultivos se examinaron mediante ELISA para detectar la presencia de anticuerpos contra LAM derivado de Mycobacterium tuberculosis. LAM se revistió a una concentración de 2 pg/ml en 50 pl de amortiguador de revestimiento de bicarbonato por pocillo de una placa ELISA de 96 pocillos, y se incubó a 4°C durante la noche. La placa se lavó 4 veces con PBST (Tween 20 al 0,1 % en PBS 1X), y se bloqueó con 200 pl de leche desnatada al 2 % en PBS 1X durante 1 hora a 37°C. Se añadieron 100 pl del sobrenadante del cultivo a los pocillos correspondientes de la placa de ELISA que contenían LAM, y se incubaron durante 1 hora a 37°C. Después de etapas de lavado adicionales, se añadió anticuerpo anti-Fab humano de ratón conjugado con AP, para detectar el anticuerpo humano unido. Después de media hora de incubación a 37°C, se añadieron 100 pl de sustrato AP en amortiguador DEA a los pocilios de ELISA, y la reactividad se determinó colorimétricamente midiendo la absorbancia a 405 nm.

Se detectó una señal positiva (OD de ~1 en 1 hora) en sólo 1 pocillo de 96 pocillos, lo que indica la rareza de estas células en esta muestra. Las células procedentes de las células positivas se volvieron a cultivar a una densidad de 5 10 células/pocillo en 10 pocillos de placas de 96 pocillos, y se volvieron a examinar para detectar actividad contra LAM. Esto dio como resultado ~ 6 pocillos positivos (OD de ~1 en 1 hora), nuevamente consistente con la baja frecuencia de células reactivas para LAM y sugiriendo que el pocillo positivo original contenía sólo un único clon de células B positivas para LAM. Se lisaron células procedentes de varios de los subclones positivos, y se usaron para aislar las regiones variables de las cadenas H y L, que entonces se clonaron en vectores de expresión de las cadenas H y L. Se aislaron un total de 10 secuencias de VH diversas y 9 secuencias de VL de estos pocillos, y después se analizó su actividad transfectando combinaciones individuales en células 293. De las 90 combinaciones analizadas, sólo una única combinación de cadena pesada (p9045-IgG1-VH) y cadena ligera (p9044-Vk) dio una señal positiva contra LAM. Los anticuerpos se expresaron mediante cotransfección de los correspondientes plásmidos de cadena pesada y ligera en células Expi-292, como se describe por el fabricante, y se cultivaron en medios sin suero. Los anticuerpos se purificaron mediante cromatografía de afinidad en perlas de proteína A (para IgG) o perlas de proteína L (para IgG), y se eluyeron con amortiguador de pH bajo. Los anticuerpos purificados se concentraron y caracterizaron mediante SS-PAGE en cuanto a tamaño y pureza.

2. Aislamiento y cultivo del isotipo IgM de P30B9

El anticuerpo monoclonal humano anti-LAM P30B9, isotipo IgM, se aisló de células B de memoria cultivadas obtenidas de un paciente infectado con tuberculosis, TB-314. Se aislaron PBMC de la sangre del paciente TB-314 mediante centrifugación en un gradiente de ficoll, y se purificaron ~ 30.000 células B de memoria como se describió anteriormente, con el kit de aislamiento de células B de memoria humana MACS de Miltenyi. Las células B de memoria purificadas se cultivaron durante 14 días sembrando en placas a 400 células/pocillo sobre monocapas de células MS40-L cultivadas en placas de 96 pocillos, en presencia de IL-21 (100 ng/ml), iL-10 (100 ng/ml). ml), IL-2 (10 ng/ml), IL-4 (2 ng/ml), y CpG (1 pM), y los sobrenadantes celulares se examinaron mediante ELISA para determinar su unión a ManLAM de H37Rv. ManLAM se revistió a una concentración de 2 pg/ml en 50 pl de amortiguador de revestimiento de bicarbonato por pocillo de una placa ELISA de 96 pocillos, y se incubó a 4°C durante la noche. La placa se lavó 4 veces con PB<s>T (Tween 20 al 0,1 % en PBS 1X), y se bloqueó con 100 pl de BSA al 1 % en PBS 1X durante 1 hora a 37°C. Se añadieron 50 pl del sobrenadante del cultivo o del anticuerpo diluido a los pocillos correspondientes de la placa de ELISA que contenían LAM, y se incubaron durante 1 hora a 37°C. Después de etapas de lavado adicionales, se añadió anticuerpo anti-IgG (H+L) humana de cabra conjugado con AP, para detectar el anticuerpo humano unido. Después de media hora de incubación a 37°C, se añadieron 50 pl de sustrato AP en amortiguador DEA a los pocillos de ELISA, y la reactividad se determinó midiendo el color amarillo a 405 nm. Sólo 1 de 78 pocillos dio una señal positiva cuando se sondaron con un reactivo secundario anti-IgG, IgA, IgM, cadena kappa humanas de cabra. Después de la expansión, este pocillo se transdujo para BCL6 y Bcl-xL, unidos por la secuencia peptídica de autoescisión del teschovirus porcino 1 (P2A) y seguido por un gen informador de GFP dirigido por IRES. Estos dos genes estabilizan las células B de memoria para una replicación a largo plazo, y permiten que las células se cultiven incluso después de la selección de células positivas para antígeno mediante la participación del BCR. Los vectores retrovirales se pseudotiparon con la glicoproteína de la envoltura del virus de la leucemia del gibón (GaLV), con el péptido R eliminado del dominio de TM C-terminal. La transducción exitosa de células B primarias condujo a la expresión de BCL-6, BclxL y la proteína marcadora GFP. Los títulos virales se determinaron contando las células 293T positivas para GFP bajo el microscopio fluorescente. Las células B activadas se transdujeron con un vector retroviral en presencia de polibreno/retronectina.

Después de una expansión adicional, las células transducidas se subcultivaron a diluciones limitantes en presencia de IL-21 (100 ng/ml) e IL-2 (10 ng/ml). Se seleccionó el pocillo B9 en la placa 30 (P30B9) en función de su fuerte actividad de unión a LAM y la demostración microscópica de la presencia de un único clon. El sobrenadante de P30B9 se unió exclusivamente a pocillos revestidos con H37Rv-LAM, y no a pocillos revestidos con LAM derivado demycobacterium smegmatico alfa cristalina. Las células de este pocillo se lisaron, y el ARN se aisló usando el RNeasy mini kit (Qiagen), seguido de la síntesis de ADNc con oligo (dT), usando el sistema de síntesis de ADNc Superscript III (Invitrogen). Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo se amplificaron usando cebadores de Smith-Tiller, y se clonaron en vectores de expresión de cadenas pesadas y ligeras humanas. La región variable de la cadena pesada se clonó inicialmente en un vector de IgG estándar. Sin embargo, cuando se combinó con la secuencia de cadena ligera clonada en un vector de expresión de cadena kappa humana, no se detectó actividad de unión a LAM. En ese momento, los anticuerpos reactivos contra ManLAM producidos en el pocillo policlonal original transducido de forma estable se volvieron a sondar con reactivos específicos del isotipo, y se descubrió que eran exclusivamente IgM. Posteriormente, la secuencia de VH de P30B9 se clonó en un vector de expresión de la región constante de la cadena H de IgM, y se obtuvo una buena actividad de unión tras la cotransfección con la cadena kappa correspondiente.

3. Caracterización de la especificidad para el epítopo de A194-01 IgG y P30B9 IgM y anticuerpos murinos anti-LAM contra LAM

A. Para definir los epítopos reconocidos por A194-01 IgG y P30B9 IgM, las actividades de unión de dichos anticuerpos se compararon con las de varios anticuerpos monoclonales murinos específicos de LAM (CS-35, CS-40, FIND25, FIND170, y la serie 900 de anticuerpos monoclonales representada por 908.1) contra una serie de 25 glicoconjugados en los que se conjugaron con seroalbúmina bovina glicanos sintéticos que representan diferentes estructuras presentes en LAM (FIG. 4A). Estos variaban en tamaño de 4 a 26 anillos de hidratos de carbono, y representaban la variedad de motivos estructurales que se sabe están presentes en diversos LAM micobacterianos, incluyendo una serie de estructuras de poliarabinosa tanto no encaperuzadas como encaperuzadas con fosfoinositol, estructuras de manosa mono-, di- y tri-Manp enlazadas a través de alfa(1^ 2 ) , y motivos de 5-desoxi-5-metiltiopentofuranosilo (MTX), y diversas estructuras de Ara4 y Ara6 encaperuzadas.

Se obtuvieron seis patrones de reactividad distintos con este panel antigénico para estos anticuerpos monoclonales (FIG. 4B). Las afinidades relativas de los anticuerpos monoclonales por estos antígenos quedaron indicadas por el perfil de titulación; las reacciones de alta afinidad retienen una alta reactividad en la dilución intermedia, mientras que la baja afinidad se indica por una rápida caída en la reactividad. El patrón más amplio se observó para el mAb de ratón CS-35, que reaccionó con modesta afinidad con LAM derivado deMycobacterium tuberculosisy LAM derivado deMycobacterium smegmatis,y reconoció estructuras encaperuzadas o no que contenían los motivos básicos Ara4 y Ara6, consistente con la especificidad conocida de este mAb para el motivo de p-D-AraA(1^2)-a-D-Ara/-(1^5)-a-D-AraA(1^ 5)-a-D-Araf.

El anticuerpo monoclonal humano anti-LAM A194-01 IgG también reconoció una gran fracción de estas estructuras, y en muchos casos poseía la mayor afinidad. El A109-01 IgG se unió fuertemente a todas las estructuras de Ara4 y Ara6 no encaperuzadas y a la estructura de Ara4 encaperuzada con fosfoinositol, y con menos fuerza a un subconjunto de estructuras encaperuzadas con manosa. El A109-01 IgG se unió bien a las estructuras encaperuzadas con monomanosa, pero muy débilmente a las estructuras de di- y trimanosa, aunque la reactividad con estas últimas estructuras mejoró cuando estaba presente la sustitución de MTX. Cuatro de las series 900 de anticuerpos monoclonales de ratón (representados por 908.1) reaccionaron con una afinidad relativamente débil con todas las estructuras de Ara4 y Ara6 no encaperuzadas, pero no con ninguna de las estructuras encaperuzadas. Dos anticuerpos monoclonales de ratón de FIND (FIND25, también denominado KI25), se unieron fuertemente a todas las estructuras de Ara6, independientemente de la presencia o ausencia de encaperuzamiento, pero no reconocieron ninguna estructura de Ara4. CS-40, que se sabe que reacciona específicamente con ManLAM, reaccionó débilmente con LAM derivado deMycobacterium tuberculosis,y se unió preferentemente a estructuras de Ara4 y Ara6 encaperuzadas con monomanosa.

El anticuerpo monoclonal humano anti-LAM P30B9 IgM reaccionó fuertemente y con alta especificidad con ManLAM derivado deMycobacterium tuberculosisy con estructuras de Ara4 y Ara6 encaperuzadas con dimanosa, y con una actividad considerablemente más débil con las otras estructuras que contienen manosa. La visualización de esta actividad residual depende de las condiciones del ensayo, y aparece en algunos formatos de ensayo (por ejemplo, FIGS. 4b, 8) pero no en otros (por ejemplo, FIGS. 16, 18). Sin desear estar atados por ninguna teoría, la especificidad relativa de P30B9 IgM por las estructuras encaperuzadas con dimanosa es potencialmente clínicamente relevante, ya que se sabe que las unidades terminales de manosilo median la unión del lipoarabinomanano de cepas virulentas delcomplejo Mycobacterium tuberculosisa macrófagos humanos, y, además, se sabe que las caperuzas de dimanosa son la modificación dominante de LAM derivado deMycobacterium tuberculosis.

Se obtuvieron resultados similares cuando la especificidad del epítopo del A104-01 IgG y el P30B9 IgM se cartografiaron adicionalmente en un ensayo de micromatrices frente a un panel más grande de antígenos de hidratos de carbono. Este panel incluía varias estructuras de polimanosa adicionales que fueron reconocidas por el P30B9 IgM, pero no por ninguno de los otros anticuerpos analizados (FIG. 8). Esto fue consistente con la preferencia de P30B9 IgM por las estructuras de Ara4 y Ara6 encaperuzadas con di-manosa, particularmente, pero no necesariamente, aquellas que contienen Man-a(1^2)-Man-a(1^5) enlazadas a la arabinosa terminal. El P30B9 IgM también reaccionó fuertemente con una estructura pentamanosa (59. AS-3-71) que contenía el Man-a(1^2)-Man-a(1^6), pero solo débilmente a una estructura similar que contenía el Man-a(1^3)-Man-a(1^ 6) (50. YB-BSA-18). A pesar de su preferencia por el enlace a (1^2), el P30B9 IgM no reaccionó con AS-2-91, una estructura de tetramanosa que contenía el enlace Man-a(1^2) junto con una manosa adicional enlazada a (1 ^6 ) a la segunda manosa. Sin desear estar atados por ninguna teoría, esto sugiere que la especificidad del isotipo IgM de P30B9 puede requerir que ambos azúcares del motivo de dimanosa no contengan sustituciones adicionales.

B. Una titulación más precisa para cartografiar las finas especificidades de estos anticuerpos monoclonales para los glicanos derivados de LAM demostró el papel crítico del disacárido terminal p-D-Ara/L(1^2)-a-D-Ara/L(1^5 ) en el reconocimiento de anticuerpos de las estructuras de Ara4. La estructura de Ara4 consiste en un tetrasacárido p-D-Araf-(1^2)-a-D-Araf-(1^5)-a-D-Araf-(1^5)-a-D-Araf, mientras que la estructura de Ara6 contiene una rama de disacárido p-D-Araf-(1^2)-a-D-Araf-(1^3) adicional en el segundo azúcar. Tres de los anticuerpos monoclonales se unieron a las estructuras de Ara4 y Ara6, independientemente del encaperuzamiento con manosa. Los tres anticuerpos monoclonales se unieron a la estructura de Ara4 (YB-8-099) y a YB-BSA-03, correspondiente a la estructura de Ara4 con cuatro azúcares a-D-Ara/-(1^5) adicionales en el extremo reductor (FIG. 9A). Sin embargo, ninguno de los anticuerpos monoclonales se unió a un octasacárido relacionado (MJ-LZ-2) que contenía un disacárido terminal p-D-Araf-(1^2)-a-D-Araf-(1^3), correspondiente a la rama inferior de la estructura de Ara6. Esto indicó que la rama superior de la estructura de Ara6 que contiene el enlace p-D-Araf-(1^2)-a-D-Araf-(1^5) fue reconocida por estos anticuerpos monoclonales, y no la rama inferior, que contenía el disacárido p-D-Araf-(1^2)-a-D-Araf-(1^ 3).

Se examinó el papel del enlace terminal p-D-Araf-(1^2) en el reconocimiento de anticuerpos investigando la reactividad de estos anticuerpos monoclonales y el anticuerpo FIND25 dependiente de Arab frente a tres estructuras de poli a-D-Araf-(1^5) relacionadas que contenían formas truncadas del disacárido terminal (FIG. 9B). Las tres estructuras también contenían una rama interna a-D-Araf-(1^3). YB-BSA-07 terminó en una estructura lineal de a-D-Araf-(1^5) y no reaccionó en absoluto con todos los anticuerpos anti-LAM. YB-BSA-09 contenía azúcares a-D-Araf adicionales unidos a través de una rama (1^3 ) en los penúltimos azúcares de las dos ramas más largas, asemejándose a la estructura de la rama de Ara6. Esta estructura fue reconocida sólo débilmente por las concentraciones más altas ensayadas del isotipo IgG de A194-01 y por CS-35. YB-BSA-10 incluía azúcares p-D-Ara/-(1 ^2 ) terminales en cada una de las ramas, formando dos estructuras de Ara6 completas en los extremos no reductores del polisacárido. Esta estructura fue reconocida por todos los anticuerpos monoclonales, con fuerzas de unión relativas consistentes con sus afinidades por el antígeno LAM natural. Estos ensayos indicaron que un disacárido terminal p-D-Araf-(1^ 2)-a-D-Araf-(1^ 5 ) era un componente crítico de todos los anticuerpos monoclonales específicos de LAM reactivos con arabinosa disponibles.

C. Una distinción fundamental entre las cepas patógenas delcomplejo Mycobacterium tuberculosis,tales comoMycobacterium tuberculosisyMycobacterium bovis,y las cepas no patógenas de crecimiento rápido, tal comoMycobacterium smegmatis,es la presencia de extremos encaperuzados con manosa en las cepas patógenas. Como tal, los anticuerpos monoclonales que son específicos para distintas estructuras manosiladas podrían ser útiles para estudios estructurales y para determinar las contribuciones funcionales de estas modificaciones. Las actividades de dos de los anticuerpos monoclonales caracterizados en este estudio, CS-35 y FIND25/170, no se vieron afectadas en absoluto por la presencia o ausencia de caperuzas de manosa. Por el contrario, la unión de los anticuerpos monoclonales de la serie 900 se anuló completamente mediante manosilación de cualquier tipo (FIG. 4).

CS-40, por otro lado, se unía sólo débilmente al glicano Ara4 no modificado (YB-8-099), pero fuertemente a las estructuras de Ara4 (YB-8-101) y Ara6 (YB-8-149) que contenían caperuzas de manosa individuales. Este experimento usó un CS-40 modificado, en el que el dominio de la cadena pesada de ratón se sustituyó por la secuencia constante de IgG 1 humana, puesto que esto dio como resultado una detección de la unión más sensible en comparación con el anticuerpo de ratón natural usado en la FIG. 4. La débil reactividad del CS-40 con la estructura de arabinofuranosa encaperuzada se reflejó en su débil reactividad con LAM de M. smegmatis, en comparación con LAM de M. tb. La unión de un azúcar MSX enlazado a través de a(1^ 4 ) a la manosa terminal (es decir, YB-8-141 e YB-8-149) no tuvo efecto sobre la afinidad de unión, mientras que la unión de un segundo azúcar de manosa enlazado a través de a (1^2 ) (YB-8-111 y YB-8-125), para generar una caperuza de dimanosa, anuló completamente la reactividad del CS-40 (FIG.

16).

A194-01 poseía un patrón de reactividad más complejo. A194-01 se unió fuertemente con cadenas laterales de arabinofuranosilo no encaperuzadas, y con estructuras de Ara4 (YB-8-101) y Ara6 (YB-8-123) encaperuzadas con monomanosa, pero este mAb reaccionó sólo débilmente con Ara4 encaperuzado con dimanosa (YB-8-111) y aún más pobremente con Ara4 encaperuzado con trimanosa (YB-8-113) y casi nada para Ara6 encaperuzado con dimanosa (YB-8-125). Como se observó para CS-40, la sustitución de MTX en las estructuras de monomanosa (YB-8-141, YB-8-149) no inhibió la unión de A104-01, y de particular interés, la adición de MSX mejoró significativamente el reconocimiento de las estructuras de Ara4 encaperuzadas con dimanosa y trimanosa (YB-8-133, YB-8-143). De acuerdo con la alta selectividad de P30B9 para ManLAM, el mAb se unió específicamente a las estructuras de Ara4 (YB-111) y Ara6 (YB-8-125) encaperuzadas con dimanosa. En contraste con los efectos benignos o beneficiosos de la sustitución de MSX sobre la unión de CS-40 y A194-01, esta sustitución dio como resultado la pérdida completa de reactividad de P30B9, al igual que la adición de una manosa adicional para formar las estructuras encaperuzadas con trimanosa. Estos resultados sugirieron que los diferentes anticuerpos monoclonales reconocían diferentes regiones y aspectos estructurales de la estructura de LAM, uniéndose algunos únicamente a las cadenas laterales de arabinofuranosa y uniéndose otros con diferentes niveles de especificidad a los motivos de encaperuzamiento.

Se compararon las especificidades y afinidades de unión relativas de los anticuerpos reactivos con Ara6 para glicoconjugados representativos (FIG. 11). Los patrones generales fueron consistentes con los obtenidos para los antígenos naturales, PILAM y ManLAM (FIG. 3) y en la titulación preliminar contra los glicoconjugados (FIG. 4). El A194-01 IgG humano poseía una mayor afinidad relativa por todas las estructuras no encaperuzadas y por la estructura monomanosa de Ara6 sustituida con MSX (YB-8-149), reaccionaba con igual afinidad con la estructura de Ara6 con caperuzas de manosa individuales, pero no reconoció las caperuzas de dimanosa o trimanosa. FIND25 se unió con afinidad similar o ligeramente mayor que CS-35 a todas las estructuras que portaban la estructura de Ara6 estándar, tanto encaperuzada como no encaperuzada, pero no se unió a dos estructuras (YB-BSA-06 e YB-BSA-08) en las cuales una de las ramas se extendió en el extremo no reductor lejos del punto de ramificación. 908.1 se unió con afinidad más débil a todas las estructuras no encaperuzadas, incluidas las dos últimas, pero no reconoció ninguna de las estructuras4 encaperuzadas con manosa.

Estudios de competición que implican a anticuerpos monoclonales anti-LAM A, Descripción general

La capacidad de los anticuerpos individuales para competir por la unión de mAbs sonda biotinilados a LAM se tituló mediante ELISA. Las curvas de competición típicas se muestran en la FIG. 16 para cuatro de los anticuerpos anti-LAM, A194-01, CS-35, FIND25 y P30B9. Como era de esperar, todos los anticuerpos biotinilados compitieron por las cantidades en exceso de sus versiones no marcadas. El anticuerpo murino anti-LAM 908.6 compitió pobremente, si lo hizo, contra los otros anticuerpos. Esto se debió hasta cierto grado a la débil afinidad de este anticuerpo, pero también refleja la restricción de la unión de 908.6 a estructuras no encaperuzadas, y sugiere que las estructuras encaperuzadas fueron las dianas dominantes en ManLAM reconocidas por CS-35 y FIND25.

De acuerdo con su amplia reactividad, CS-35 compitió completamente por la unión de todos los anticuerpos sonda, aunque su competición con A194-01 biotinilado fue menos potente que la de A194-01 por sí mismo, lo que coincide con una menor afinidad de CS-35 por LAM. Mientras que CS-35 compitió plenamente contra FIND25 biotinilado, FIND25 compitió sólo parcialmente contra CS-35 marcado (~74 % de competición máxima), y aún menos eficazmente contra A194-01 (-50 %). Sin desear estar atados por ninguna teoría, este resultado probablemente refleja la presencia de estructuras de Ara4 que son reconocidas por A194-01 y CS-35, pero no por FIND25, que se une exclusivamente al motivo de Ara6. El hecho de que FIND25 compitiera con la mayoría de las uniones de CS-35 sugirió que las estructuras de Ara6 eran más comunes que las estructuras de Ara4. A pesar de su alta afinidad, A194-01 compitió sólo contra sí mismo, pero no contra CS-35 o FIND25, lo que sugiere además que las dianas en LAM reconocidas por los dos últimos anticuerpos consistían predominantemente en estructuras (por ejemplo, estructuras encaperuzadas con dimanosa y trimanosa) que no son reconocidas por A194-01. En contraste con este resultado, A194-01 compitió total y eficientemente por la unión de FIND25 al PILAM no manosilado, consisten con el papel para el encaperuzamiento eficiente con manosa de estructuras de Ara6 en la falta de competición en ManLAM.

Los estudios de competición que usaron el anticuerpo P30B9 respaldaron aún más la conclusión de que la gran mayoría de las estructuras de Ara6 en ManLAM estaban encaperuzadas con dimanosa, y que la mayor parte de las caperuzas de dimanosa residían en estructuras de Ara6. P30B9 compitió con ~70 % de la unión de FIND25 y -80 % de la unión de CS-35 a ManLAM, lo que confirma que la mayoría de las estructuras reconocidas por estos mAb de ratón también fueron reconocidas por P30B9. La unión de P30B9 a ManLAM se compitió de manera eficiente por sí mismo, y por CS-35 y FIND25. El nivel de competición de P30B9 por FIND25 era próximo al 100 %, lo que indica que esencialmente todos los sitios de unión de P30B9 dependientes de dimanosa estaban ubicados en sitios de Ara6, y pocos en estructuras de Ara4. Como se esperaba, A194-01 compitió muy mal por la unión de P30B9 a ManLAM, y 908.7 no compitió en absoluto, lo que coincide con el pobre reconocimiento de las estructuras encaperuzadas con dimanosa por parte de estos anticuerpos. La incapacidad de estos últimos anticuerpos para competir eficazmente por la unión de P30B9 confirmó que este efecto requería la unión del mAb competidor a la misma rama que el mAb sonda, y que la unión a epítopos heterólogos ubicados en una rama adyacente de la misma molécula no conducía a una competición eficaz.

B. Afinidades relativas de A194-01 IgG y P30B9 IgM mediante ensayos de competición

El cartografiado de la reactividad de anticuerpos monoclonales anti-LAM individuales, incluido el isotipo IgG de A194-01 y el isotipo IgM de P30B9, a estructuras de glicano específicas permitió la caracterización de la distribución de dichas estructuras de glicano específicas en LAM mediante estudios de competición de anticuerpos (FIG. 10). Estos ensayos de competición asumieron que para que un anticuerpo compita por la unión de un segundo anticuerpo (biotinilado, en los casos en que sean de la misma especie), los dos epítopos deben estar muy próximos entre sí en la molécula nativa, potencialmente, pero no necesariamente, en la misma rama de arabinano o en la vecina. Este modelo estaba respaldado por patrones de competición asimétricos, en los que, por ejemplo, la IgG A194-01 biotinilada, que se une a estructuras de Ara4 y Ara6 monomanosiladas y sustituidas con MSX, compitió eficientemente por sí misma y por variantes y/o derivados genéticamente modificados de A194-01, pero sólo parcialmente por el anticuerpo monoclonal murino FIND25, que se une sólo a las estructuras de Ara6. Por otro lado, el anticuerpo monoclonal murino CS-35, que se une a todas las estructuras de Ara4 y Ara6, ofrece una competición más completa, aunque menos eficiente, presumiblemente debido a su afinidad relativamente baja.

Los resultados de estos ensayos revelaron algunas propiedades sorprendentes e inesperadas. Por ejemplo, el isotipo IgM de P30B9, que se une a todas las estructuras de ManLAM encaperuzadas con dimanosa, compitió fuerte y completamente por sí mismo, CS-35 y FIND170. Sin desear estar atados por ninguna teoría, la competición eficiente de P30B9 por el anticuerpo monoclonal murino anti-LAM FIND25 sugiere que las estructuras encaperuzadas con dimanosa en LAM nativo están localizadas en gran medida en las estructuras de Ara6 reconocidas por los anticuerpos FIND, y no se expresan apreciablemente en estructuras de Ara4. Esto resalta la importancia de poder dianizar y unirse específicamente a los restos de Ara6 encaperuzados con dimanosa, ya que se cree que el encaperuzamiento con dimanosa es la forma dominante de LAM que se encuentra en cepas virulentas del complejoMycobacterium tuberculosis.La competición altamente eficiente del FIND25 biotinilado por el isotipo IgM variante genéticamente modificado de A194-01 es una prueba más del mayor reconocimiento de estructuras manosiladas por el isotipo IgM de A194-01.

C. Estudios de competición de A194-01 IgG y P30B9 IgM y anticuerpos murinos anti-LAM contra ManLAM y PILAM

Se usaron ensayos de competición de unión entre diferentes anticuerpos monoclonales anti-LAM para analizar la distribución de diversas formas estructurales en LAM. El isotipo IgG de A194-01 reconoció tanto cadenas laterales de Ara4 y Ara6 no modificadas como cadenas que contenían una única caperuza de manosa, pero no se unió a cadenas laterales con motivos de encaperuzamiento con dimanosa o trimanosa. Los dos anticuerpos murinos FIND reaccionaron con todas las formas de Ara6, pero no con ninguna estructura de Ara4. P30B9 IgM fue relativamente específico para las estructuras de Ara4 y Ara6 que contenían caperuzas de dimanosa.

Consistente con la ampliación de la reactividad para los constructos de A194-01 con mayores valencias, estos constructos exhibieron una mayor potencia en la actividad de competición de los anticuerpos. Cuando se probó la capacidad de competir por la unión de A194-01 IgG biotinilado contra ManLAM, las variantes decamérica A194-01 IgM y tetramérica scFv-IgG compitieron más eficientemente que el propio isotipo A194-01 IgG (FIG. 11), lo que significa una mayor utilidad terapéutica y diagnóstica potencial, mientras que las formas monoméricas Fab y scFv compitieron con menos eficacia (FIG. 1). La variante y/o derivado dimérico de A194-01 genéticamente modificado con scFv compitió igual de bien que el isotipo A194-01 IgG.

Cuando se comparó la especificidad para el epítopo de las variantes y/o derivados genéticamente modificados de A194-01 con la del A194-01 IgG, se observó que poseían una reactividad más amplia (FIG. 14). Mientras que el isotipo IgG no se unía apreciablemente a las estructuras sustituidas con di-manosa (YB-8-123, YB-8-125) y tri-manosa (YB-BSA-113, YB-BSA-13), la IgM reconoció estas estructuras, y la forma scFv-IgG poseía también una mayor actividad contra algunas de estas estructuras. Debido a que el encaperuzamiento con dimanosa, y especialmente Ara6 encaperuzado con dimanosa, es el motivo de LAM dominante enMycobacterium tuberculosisvirulento, esto sugiere una utilidad potencialmente mejorada de estas formas genéticamente modificadas de A194-01 en aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico.

A194-01 no marcado compitió contra la unión de A194-01 IgG biotinilado a LAM derivado de Mycobacterium tuberculosis (ManLAM) (FIG. 12A) o Mycobacterium smegmatis (PILAM) (FIG. 12D), mientras que los anticuerpos monoclonales murinos FIND170 y P30B9 no fueron capaz de competir por la unión de A194-01 a cualquiera de los antígenos (FIG. 12A, D). Esto fue consistente con el reconocimiento dominante de las estructuras de Ara4 que fueron reconocidas por el isotipo A194-01 IgG pero no por FIND170, que es específico para Ara6, o P30B9 IgM, que depende de los restos de encaperuzamiento con dimanosa. De manera similar, A194-01 no compitió con la unión de FIND25 biotinilado (FIG. 12B) o P30B9 IgM (FIG. 12C) a ManLAM, consistente con las diferentes especificidades para el epítopo para estos anticuerpos. En contraste con la incapacidad de A194-01 IgG para competir por la unión de FIND25 a ManLAM, A194-01 IgG compitió fuertemente con ~90% de la unión de FIND25 a PILAM (FIG. 12E), consistente con la ausencia conocida de encaperuzamiento de manosa en PILAM y con la alta afinidad de A194-01 por las estructuras de Ara4 y Ara6 no encaperuzadas.

En contraste con la competición ineficaz de A194-01 IgG, P30B9 IgM compitió con ~80 % de unión de FIND25, y FIND170 compitió casi completamente con la unión de P30B9 (FIG. 12B, C). Esto sugirió fuertemente que la gran mayoría de las estructuras de Ara6 reconocidas por los anticuerpos murinos FIND poseían caperuzas de dimanosa, y por lo tanto también fueron reconocidas por P30B9 IgM, y que la mayoría de las estructuras encaperuzadas con dimanosa reconocidas por P30B9 estaban presentes en estructuras de Ara6. Esto sugiere que Ara6 encaperuzado con dimanosa es el motivo inmunológico dominante en el motivo de LAM delMycobacterium tuberculosisvirulento.

D. Estudios adicionales de competición

Se llevaron a cabo estudios de competición adicionales para resaltar el hecho de que LAM es un antígeno complejo de heterogeneidad indefinida. La definición de las diferentes especificidades de los epítopos de los anticuerpos monoclonales reactivos contra LAM permitió el uso de ensayos de competición de unión para examinar la distribución de los diversos epítopos en los LAM nativos. Mediante ELISA se tituló la capacidad de diversos anticuerpos para competir por la unión de anticuerpos monoclonales sonda biotinilados a LAM y glicoconjugados sintéticos. Las curvas de competición típicas para tres anticuerpos monoclonales anti-LAM, A194-01 IgG, CS-35, y FIND25, se muestran en la FIG. 13A. Los anticuerpos monoclonales sonda biotinilados compitieron por sus versiones no marcadas cuando estaban presentes en gran exceso. El anticuerpo monoclonal murino 908.6 compitió pobremente, si es que lo hizo, contra los otros anticuerpos. Esto se debió hasta cierto punto a la débil afinidad de este anticuerpo, pero también reflejó la restricción de la unión de 908.6 a estructuras no encaperuzadas, y sugirió además que las estructuras encaperuzadas con manosa fueron las dianas dominantes en ManLAM reconocidas por CS-35 y FIND25. De acuerdo con su amplia reactividad, CS-35 compitió por la unión de A194-01 IgG biotinilado, aunque de manera menos eficiente que el propio A194-01 IgG, lo que coincide con la mayor afinidad de A104-01 IgG por LAM. CS-35 también compitió completamente contra FIND25 biotinilado, mientras que FIND25 compitió sólo parcialmente contra CS-35 marcado (~74 % de competición máxima), e incluso menos eficazmente contra A194-01 IgG (-50 %). Este resultado probablemente refleja la presencia de estructuras de Ara4 que son reconocidas por A194-01 IgG y CS-35, pero no por FIND25, que se une exclusivamente a estructuras que contienen la cadena principal de Ara6. A pesar de su alta afinidad general por LAM, A194-01 IgG compitió sólo contra sí mismo, pero no contra CS-35 ni contra FIND25. Esto sugirió que los sitios en LAM reconocidos por los anticuerpos monoclonales murinos estaban dominados por estructuras encaperuzadas con dimanosa y trimanosa que no fueron reconocidas por A194-01 IgG.

Estudios de competición adicionales que usaron P30B9 IgM, que se une específicamente a ManLAM encaperuzado con di-manosa, respaldaron aún más la conclusión clínicamente significativa de que la gran mayoría de las estructuras de Ara6 en ManLAM estaban encaperuzadas con di-manosa, y que la mayor parte de las caperuzas de di-manosa residían en estructuras de Ara6 en ManLAM derivado de Mycobacterium tuberculosis. P30B9 IgM compitió con ~80 % de la unión de FIND25 a ManLAM (FIG. 13B), consistente con la mayoría de las estructuras de Ara6 reconocidas por FIND25 que también son reconocidas por P30B9 IgM. P30B9 IgM no compitió por la unión de FIND25 a PI<l>A<m>, consistente con la ausencia del epítopo de dimanosa para P30B9 en PILAM, debido a la falta de manosilación en PILAM. Además, el A194-01 IgG no compitió por la unión de FIND25 a ManLAM, nuevamente consistente con la gran mayoría de las estructuras de Ara6 que portan caperuzas de dimanosa, que no son reconocidas por el A194-01 IgG. Confirmando el papel de la manosilación en este efecto, A194-01 IgG compitió de manera muy eficiente por la unión de FIND25 a PILAM, lo que coincide con la alta afinidad de A194-01 por PILAM y la ausencia de encaperuzamiento de manosa en este antígeno.

Los datos de competición para la unión de P30B9 IgM biotinilado respaldaron aún más esta conclusión. La unión de P30B9 IgM biotinilado compitió de manera más eficiente por sí mismo y con igual eficiencia por CS-35 y FIND25, pero sólo débil e incompletamente por A194-01 IgG (FIG. 13C). El nivel de competición por FIND25 fue cercano al 100%, lo que indica que esencialmente todos los sitios de unión de P30B9 IgM dependientes de dimanosa estaban ubicados en estructuras de Ara6. De acuerdo con esta interpretación, CS-35 también compitió por la unión de P30B9 a Ara4 encaperuzado con dimanosa (YB-8-111) y Ara6 encaperuzado con dimanosa (YB-8-125), mientras que FIND170 compitió sólo por este último antígeno, y A194-01 IgG no compitió por ninguno de los dos. La similitud general entre las curvas de competición para ManLAM y los glicoconjugados homogéneos YB-8-125 indicó que los resultados de la competición se correlacionaban con la presencia o ausencia de los epítopos relevantes en una única cadena lateral de hidrato de carbono, y que los efectos estéricos indirectos debidos a la unión de anticuerpos a sitios heterólogos más distantes desempeñaron poco o ningún papel en la competición.

Un resultado sorprendente e inesperado es la total falta de competición entre A194-01 IgG frente a CS-35 y FIND25. Se esperaba que CS-35 tuviera la capacidad de competir por la unión de A194-01 IgG a ManLAM debido al reconocimiento de todos las dianas de A194-01 IgG por parte de CS-35, y la competición menos eficiente de CS-35 que de A194-01 IgG por sí mismo es consistente con las afinidades relativas de estos anticuerpos por ManLAM (FIG.

3). De manera similar, la competición incompleta de la unión de A194-01 IgG por FIND25 puede explicarse por la presencia de dianas de Ara4 reconocidas por el primer anticuerpo, pero no por el segundo.

La competición eficiente y completa de la unión de P30B9 IgM biotinilado tanto por CS-35 como por FIND170 sugiere que las caperuzas de dimanosa reconocidas por P30B9 IgM estaban presentes casi exclusivamente en estructuras de Ara6 reconocidas por el mAb FIND, lo cual es de importancia clínica y diagnóstica. Esto fue respaldado por la competición relativamente eficiente de unión de FIND25 por P30B9 IgM, que bloqueó ~80 % de la actividad de unión de FIND25 a ManLAM pero no tuvo ningún efecto para PILAM. Esto sugiere fuertemente que ~80 % de los sitios de Ara6 en ManLAM reconocidos por FIND25 contenían caperuzas de di-manosa, y que esencialmente todas las caperuzas de di-manosa están presentes en las estructuras de Ara6, y no de Ara4. Tomados junto con la incapacidad de A194-01 IgG para competir con CS-35 o FIND25, estos resultados demuestran que Ara6 sustituido con dimanosa fue la estructura inmunogénica dominante en ManLAM derivado de Mycobacterium tuberculosis, y por lo tanto representa una diana antigénica muy importante.

Los estudios de las respuestas de anticuerpos específicos de LAM en plasma de pacientes indican que la respuesta está dominada por isotipos IgG2 dirigidos contra estructuras lineales de Ara4/Ara6, independientemente del cartografiado. La competición eficiente de P30B9 IgM por anticuerpos monoclonales IgG anti-LAM específicos para epítopos dependientes de arabinofuranosa tales como CS-35 y FIND25, sugiere que las respuestas dominantes de IgG2 contra tales epítopos en el plasma del paciente también competirían por cualesquiera anticuerpos específicos de ManLAM dependientes de di-manosa que pueden producirse en títulos más bajos. Por lo tanto, incluso si la última clase de anticuerpos pudiera tener actividades antibacterianas más eficaces, es probable que estos efectos puedan verse limitados por la competición por la unión de los anticuerpos IgG2 dominantes y no funcionales dirigidos contra epítopos dependientes de arabinosa que están presentes en sueros de pacientes. Sin desear estar atados por ninguna teoría, la respuesta humoral dominante puede en realidad proteger a las bacterias contra los efectos potenciales de anticuerpos más raros, tales como los anticuerpos multivalentes como P30B9 IgM, o las variantes y/o derivados genéticamente modificados de A194-01, tal como el isotipo IgM pentavalente o el scFv-IgG tetravalente que podría proporcionar control inmunológico contra la infección y la patogenicidad.

5. Efectos de la valencia en la unión de A194-01

El descubrimiento de que la reactividad de la dependencia de P30B9 reactivo con dimanosa en su isotipo IgM sugiere que la multivalencia puede contribuir a la afinidad de los anticuerpos contra LAM. Sin desear estar atados por ninguna teoría, esto sugirió que una sola molécula de LAM poseía múltiples sitios o epítopos de unión a anticuerpos, consistentes con la estructura ramificada y la complejidad conocidas de LAM, y que los anticuerpos con valencias más altas eran capaces de unirse a más sitios que los anticuerpos divalentes, lo que da como resultado mayores afinidades. Se examinó el efecto de la valencia del anticuerpo frente a la eficiencia de unión a LAM para diversas variantes y/o formas derivadas y/o isotipos genéticamente modificados del anticuerpo monoclonal humano A194-01 en un ensayo de competición de unión, usando A194-01 IgG biotinilado como diana. Las formas de anticuerpos incluían un scFv monocatenario monovalente en el que las regiones VH y VL estaban unidas mediante un enlazador peptídico flexible, una proteína Fab monovalente, una proteína scFv dimérica en la que dos dominios de scFv estaban unidos mediante un enlazador flexible, la IgG dimérica natural (Fig. 1A), y dos formas de valencia superior, un isotipo scFv-IgG de A194-01 tetravalente y un isotipo IgM pentavalente (decavalente para los sitios de unión) (Fig. 1B). La conversión de la IgG divalente intacta en un Fab monovalente dio como resultado una pérdida muy grande de actividad de unión, con un aumento >100 veces en la concentración requerida para competir por el 50 % de la actividad de unión del A194-01 IgG biotinilado, en comparación con la IgG contra sí misma (FIG. 1C). La cadena sencilla también compitió de manera ineficiente, con una disminución de 33 veces en su actividad. Por otro lado, el dímero scFv compitió con una eficiencia similar al isotipo IgG de A194-01. Sin desear estar atados por ninguna teoría, esto sugirió que la unión eficaz de las formas divalentes de A194-01 a LAM requería la unión de ambos sitios de unión a dianas adyacentes en una única molécula del antígeno. Las formas con valencia superior compitieron de manera más eficiente, en términos molares. Esto puede deberse simplemente a la presencia de sitios de unión adicionales, pero también puede reflejar una mayor afinidad de las formas con valencia superior.

La especificidad tanto de la variante y/o derivado tetramérico scFv-IgG de A194-01 como del isotipo IgM decamérico de A194-01 se comparó con la del isotipo IgG de A194-01 frente al panel de glicoconjugados sintéticos descrito anteriormente (FIG. 14). Esto reveló que tanto la variante scFv-IgG genéticamente modificada como el isotipo IgM genéticamente modificado poseían reactividades más amplias con algunos de los glicanos que el isotipo IgG reconocía sólo débilmente o no reconocía en absoluto. Se observó una unión mejorada con las estructuras encaperuzadas con di-manosa (YB-8-111, YB-8-125, YB-8-133) y con algunas de las estructuras encaperuzadas con tri-manosa (YB-8-113, YB-8-143, YB-BSA-13) con el isotipo IgM genéticamente modificado de A194-01 que posee el panel de reactividad más amplio. Esto tiene un importante potencial diagnóstico y terapéutico, dada la importancia del encaperuzamiento con dimanosa. Curiosamente, también se observó una reactividad mejorada para el isotipo A194-01 IgM con una estructura de arabinosa a la que le faltaba el enlace terminal p-D-Ara/-(1^2) (YB-BSA-09), que no fue reconocida por ninguno de los anticuerpos monoclonales anti-LAM probados. Sin desear estar atados por ninguna teoría, esto sugirió que el aumento de valencia dio como resultado un fortalecimiento de la avidez del isotipo IgM de A194-01 por su epítopo básico que contiene arabinosa, hasta el punto de que se superaron los efectos inhibidores de la sustitución terminal.

Los perfiles de reactividad de A194-01 IgG y las formas IgM y scFv-IgG genéticamente modificadas de A194-01 se analizaron adicionalmente mediante experimentos de competición de unión recíproca contra ManLAM o PILAM. Mientras que las tres formas compitieron cruzadamente por la unión de los anticuerpos biotinilados a PILAM y por la unión de A194-01 IgG a ManLAM, sólo las formas scFv-IgG e IgM de mayor valencia de A194-01 compitieron eficientemente con la unión de los anticuerpos modificados a ManLAM. Estas diferencias en las actividades competitivas fueron consistentes con un perfil de unión más amplio de las formas genéticamente modificadas, y sugirieron que se unían a sitios en LAM que no eran reconocidos por la forma IgG.

Esta conclusión fue respaldada aún más por estudios de competición recíproca en los que los diferentes isotipos de A194-01 compitieron con la unión de FIND25 IgG y P30B9 IgM biotinilados a ManLAM. Mientras que el A194-01 IgG no compitió con la unión de P30B9 IgM y FIND25 a ManLAM, tanto la forma scFv-IgG como IgM de A194-01 compitieron casi completamente con la unión de estos dos anticuerpos monoclonales (FIG. 15A, B). Como se esperaba, las tres formas de A194-01 compitieron con la unión de FIND25 a PILAM (FIG. 15C), consistente con la ausencia de manosilación en PILAM. Esta actividad mejorada sugiere que estas modificaciones mejorarían la utilidad potencial de este anticuerpo para aplicaciones de inmunodiagnóstico, y también pueden aumentar la eficacia de estos reactivos con fines inmunoterapéuticos.

EJEMPLO 2- Aislamiento y caracterización de nuevos anticuerpos monoclonales humanos específicos para glicolípidos deM.tb- Aislamiento del primer mAb específico para un epítopo compartido por LAM y PIM6.

Las cadenas pesada y ligera del anticuerpo P95C1 se aislaron de un único clon de células B, mediante detección de reactividad con ManLAM, de un paciente con infección tuberculosa latente (LTBI). P95C1 es un anticuerpo de isotipo IgM, que se une tanto a ManLAM como a PILAM. Esto se demostró mediante estudios de unión de glicoconjugados, que indicaron que P95C1 no se unía a ninguna molécula que expresara diversas cadenas laterales de arabinosa, ya sea no encaperuzadas o encaperuzadas con diversas estructuras de manosa. Las únicas estructuras reconocidas fueron dos estructuras de polimanosa que poseían motivos estructurales presentes en la base de manano que se conservaban entre PIM6 y diversos LAM (FIG. 18(A), 18(B), 18(C)). Esta reactividad cruzada de LAM-PIM6 se confirmó mediante un ensayo de transferencia Western que muestra que mientras que A194-01 y P30B9 se unían sólo a LAM, P95C1 también reaccionaba con moléculas de glicolípidos precursores de LAM, tales como LM y PIM6 (FIG. 20(A), 20(B)).

Aunque P95C1, al igual que P30B9, se expresó naturalmente como una IgM, en contraste con P30B9 conservaba reactividad cuando se convertía al isotipo IgA o IgG (FIG. 19). Esto puede ser un reflejo de la naturaleza del epítopo o su ubicación en la región de manano de la molécula de LAM, o puede estar relacionado con un mayor número de mutaciones en las regiones variables de P95C1, consistente con una secuencia de anticuerpos más madura. Las regiones variables de la cadena pesada y ligera de P95C1 tienen mutaciones puntuales de 19 y 13 aminoácidos respectivamente de su secuencia de anticuerpos de línea germinal más cercana.

Recientemente se ha demostrado que los anticuerpos producidos por individuos con enfermedad latente son funcionalmente superiores a los de aquellos con tuberculosis activa para promover la fusión fagolisosomal, la activación del inflamasoma, y la destrucción por macrófagos de micobacterias internalizadas (Lu et al. 2016). Por lo tanto, es interesante que P95C1 se haya aislado de un paciente con LTBI, y que tenga más mutaciones en su región variable que P30B9 y otros dos mAb específicos de LAM que se aislaron del mismo paciente con LTBI y que poseen una especificidad para el epítopo de ManLAM distinta.

Se sabe poco sobre la naturaleza de la respuesta inmune humoral humana contra la infección por M.tb. Aunque es ampliamente conocido que los glicolípidos de superficie de M.tb contribuyen a la inhibición de la actividad de los macrófagos y células dendríticas, existe información contradictoria sobre si el lipoarabinomanano encaperuzado con manosa (ManLAM) o el fosfatidilinositol manósido 6 (PIM6) es el principal componente inmunoinhibidor de la superficie deM.tb.Esta cuestión se complica aún más por la contaminación común de preparaciones purificadas de PIM6 con ManLAM, y viceversa. Una forma de abordar esta cuestión es probar la capacidad de los anticuerpos específicos para estos dos moduladores para inhibir estas actividades inhibidoras. Sin embargo, esto no ha sido posible debido a la ausencia de anticuerpos bien caracterizados que sean específicos para estos dos antígenos. Hasta la fecha, no se han informado anticuerpos que reconozcan PIM6, y esta invención describe el primer mAb de alta afinidad que reconoce PIM6. Los PIM (PIM2 y PIM4) son precursores de ManLAM, y existe cierta relación estructural entre el dominio de manano de ManLAM y la estructura de polimanosa de PIM6.

Los anticuerpos pueden ejercer sus funciones de dos maneras: 1) mediante el bloqueo directo de la invasión de la célula hospedante y la neutralización de productos bacterianos; 2) indirectamente a través del complemento mediado por Fc y mecanismos de activación celular a través de receptores Fc. La función efectora mediada por anticuerpos se ve muy afectada por el isotipo del anticuerpo. Un estudio reciente mostró respuestas de anticuerpos inhibidores humanos dependientes del isotipo contraM.tb,y demostró que los anticuerpos IgA, pero no IgG, específicos para diferentes antígenos de superficie deM.tbpueden bloquear la captación deM. tbpor las células epiteliales pulmonares independientemente de la expresión de receptores Fc de IgA. Para probar el efecto de los isotipos de P95C1 sobre la unión de LAM, la región constante de la cadena pesada de P95C1-IgM se reemplazó por CH-IgA y CH-IgG para generar P95C1-IgA y P95C1-IgG. La afinidad de unión de los isotipos de P95C1 (IgM, IgA, IgG) con ManLAM y PILAM fue comparable (FIG. 19).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo monoclonal humano anti-lipoarabinomanano (anti-LAM), o una porción de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a un epítopo de LAM que comprende una estructura de Ara4, una estructura de Ara6, o una combinación de las mismas, en el que el anticuerpo anti-LAM comprende una región variable de cadena ligera de CDR1 que tiene SEQ ID NO: 1, una región variable de cadena ligera de CDR2 que tiene SEQ ID NO: 2, una región variable de cadena ligera de CDR3 que tiene SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 26, una región variable de cadena pesada de CDR1 que tiene SEQ ID NO: 4, una región variable de cadena pesada de CDR2 que tiene SEQ ID NO: 5, y una región variable de cadena pesada de CDR3 que tiene SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 23.

2. El anticuerpo monoclonal humano anti-LAM o su porción de unión a antígeno de la reivindicación 1, comprendiendo dicho anticuerpo una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 23, y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 y SEQ ID NO: 26.

3. El anticuerpo monoclonal humano anti-LAM o su porción de unión a antígeno de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo anti-LAM es un anticuerpo scFv-IgG, un anticuerpo IgA o un anticuerpo IgM.