ES2970841T3 - Polipéptido MBNL para su uso en el tratamiento de la distrofia miotónica - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a composiciones y métodos para tratar la distrofia miotónica. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Polipéptido MBNL para su uso en el tratamiento de la distrofia miotónica

Campo de la invención

La presente invención se refiere a composiciones y procedimientos para tratar la distrofia miotónica.

Antecedentes de la invención

La distrofia miotónica de tipo 1 (DM1), uno de los trastornos neuromusculares más comunes en adultos, es una enfermedad hereditaria autosómica dominante provocada por una expansión inestable de CTG ubicada en la región no traducida (UTR) 3' del gen de ladistrofia miotónica proteína quinasa (DMPK)(Brook et al. 1992). El número de CTG varía de cincuenta a más de varios miles de repeticiones en los pacientes afectados, mientras que los individuos no afectados tienen menos de 38 repeticiones, y de forma general existe una correlación entre el tamaño de las repeticiones CTG, la gravedad de la enfermedad e inversamente con la edad de aparición (Hunter et al. 1992; Tsilfidis et al. 1992). Las características clínicas de la DM1 son variables, pero comúnmente incluyen miotonía, debilidad y atrofia muscular progresiva, así como defectos de la conducción cardíaca, pero también síntomas extramusculares tales como disfunciones cognitivas, cataratas, hipogonadismo y deficiencias endocrinas (Harper 2001).

El tracto CTG patógeno se transcribe y da lugar a ARN que contienen repeticiones CUG expandidas (ARN-CUGexp) ubicadas en la UTR 3' de los transcritosDMPK,que son responsables de un mecanismo de ganancia de función de ARN tóxico en la patogénesis de DM1 (Klein et al. 2011). Los ARN-CUGexp que se retienen en los núcleos como agregados o focos discretos alteran la función de los factores de empalme de ARN miembros de las familias MBNL y CELF, lo que da como resultado una desregulación del empalme alternativo de un grupo específico de transcritos en los tejidos DM1 afectados (Taneja et al. 1995; Ranum y Cooper 2006). La regulación anormal de los eventos de empalme da lugar principalmente a la reexpresión de un patrón de empalme fetal en tejidos adultos DM1, y los eventos de empalme incorrecto que afectan a los pre-ARNm de CLC-1, INSR y BIN1 se han asociado respectivamente con miotonía, resistencia a la insulina y debilidad muscular. Savkur et al. 2001; Charlet et al. 2002; Mankodi et al. 2002; Fugier et al. 2011). Un estudio reciente realizado en una cohorte de cincuenta pacientes DM1 confirmó cuarenta y dos defectos de empalme en los músculos esqueléticos afectados y demostró que estos cambios de empalme eran específicos de la DM1 en comparación con otros trastornos musculares, y principalmente atribuibles a la pérdida de función de MBNL1 (Nakamori et al. 2013).

El MBNL1 es un miembro de la familia de proteínas de unión a ARN de tipo músculo ciego, que incluye MBNL1, -2 y -3 (Pascual et al. 2006), y es la principal proteína MBNL expresada en el músculo esquelético adulto (Kanadia et al.

2003; Holt et al. 2009). El MBNL1, al igual que los otros parálogos de proteínas MBNL, se une a repeticiones CUG expandidas con alta afinidad y se colocaliza con focos nucleares de ARN-CUGexp en células musculares DM1 (Miller et al. 2000; Fardaei et al. 2001). El secuestro de MBNL1 en estos complejos de ribonucleoproteínas debido a la gran cantidad de repeticiones CUG en los ARN mutantes provoca su pérdida de función y, en consecuencia, una desregulación del empalme alternativo de varios pre-ARNm diana, incluido el propio MBNL1. De acuerdo con esta hipótesis, los ratones conMbnllinactivado reproducen la mayor parte de los eventos de empalme desregulados observados en muestras de músculo de pacientes DM1 o en modelos de ratones DM1 que expresan ARN-CUGexp (Mankodi et al. 2000; Kanadia et al. 2003; Lin et al. 2006; Du et al. 2010). Además, la sobreexpresión de MBNL1 funcional y de longitud completa (isoforma 40 o 41) en los músculos esqueléticos de ratones DM1 es suficiente para corregir los defectos de empalme y abolir la miotonía, características distintivas de la enfermedad DM1 (Kanadia et al.

2006; Chamberlain y Ranum 2012). Además, en el documento WO2010/044894 se propone administrar una proteína MBNL o una variante funcional de la misma, es decir, una variante que conserva la actividad biológica de una proteína MBNL, en forma de un polipéptido quimérico conjugado con un resto de direccionamiento. Este documento no divulga el uso de un polipéptido MBNL no funcional para el tratamiento de DM1. Además, la alteración de MBNL2, que se expresa de forma prominente en el cerebro, desregula eventos de empalme específicos en ratones que están desregulados de forma similar en cerebros DM1 humanos, lo que respalda un papel destacado de la pérdida de función de MBNL2 en los cambios patológicos en la enfermedad humana (Charizanis et al. 2012). En conjunto, estos resultados respaldan la pérdida de función de MBNL como un mecanismo clave involucrado en la toxicidad de ARN inducida por repeticiones CUG expandidas en DM1.

Ya se han propuesto enfoques antisentido de oligonucleótidos modificados que interfieren con los ARN-CUGexp para liberar MBNL1 de los focos para revertir desregulaciones de empalme y miotonía en un modelo de ratón DM1. Sin embargo, todavía se necesitan medios alternativos y eficaces para revertir desregulaciones de empalme y contrarrestar síntomas clínicos tales como miotonía en distrofia miotónica.

Sumario de la invención

Específicamente, la presente invención es tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.

El objetivo de la presente invención es proporcionar nuevas herramientas y procedimientos para el tratamiento de la distrofia miotónica. La presente invención se basa en la evidencia proporcionada en el presente documento de que un polipéptido MBNL modificado expresado ectópicamente, en particular mediante el uso de vectores víricos, es eficaz para contrarrestar la toxicidad de ARN-CUGexp tantoin vitrocomoin vivo.

Un aspecto de la presente invención se refiere a un polipéptido MBNL modificado para su uso como medicamento. Tal como se proporciona a continuación, el polipéptido MBNL modificado de la invención tiene una actividad de empalme reducida, en particular una actividad de empalme reducida en al menos el 60%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85% o en al menos el 90% o incluso en al menos el 95%, en comparación con la actividad de empalme de la proteína MBNL de longitud completa, pero conserva su propiedad de unión a YGCY. En particular, el polipéptido MBNL modificado de la invención es capaz de unirse a repeticiones CUG patológicas. Además, el polipéptido MBNL modificado utilizado en el presente documento puede contrarrestar la toxicidad de ARN-CUGexp liberando MBNL endógeno secuestrado tal como MBNL1 y MBNL2 de los agregados de ARN-CUGexp para restaurar la función de estas proteínas MBNL endógenas.

El polipéptido MBNL modificado de la presente invención es para su uso en el tratamiento de distrofias miotónicas. Otro aspecto se refiere al polipéptido MNBL modificado para su uso en el tratamiento de distrofias miotónicas, que comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de un polipéptido MBNL modificado según la invención. Un aspecto adicional de la invención es el uso de un polipéptido MBNL modificado tal como se describe en el presente documento, para la fabricación de un medicamento para su uso en el tratamiento de distrofias miotónicas.

Otro aspecto divulgado en el presente documento es el uso del polipéptido MBNL modificado según la invención para desplazar una proteína MBNL endógena, tal como MBNL1 o MBNL2 endógena, de repeticiones CUG en una célula u organismo que lo necesita, y revertir de este modo eventos de empalme desregulados inducidos por la expresión de ARN-CUGexp. En una forma de realización particular, el polipéptido MBNL modificado se proporciona a la célula u organismo usando un vector vírico.

Leyenda de las figuras

Fig 1:Organización del ADN genómico del genMBNL1humano. Se muestran el orden y los nombres de los exones, así como la longitud en nucleótidos de cada exón. Los cuadros grises claros representan UTR. Los cuadros de color representan exones de casete. Los cuadros vacíos representan exones constitutivos. El empalme alternativo de casetes alternativos de MBNL1 da lugar a más de diez isoformas, incluidas MBNL143 o MBNL140. Se indica la longitud en aminoácidos (aa) y las cajas de color gris oscuro representan motivos de dedos de zinc C<3>H<1>. Dos están ubicados en el exón 2 de MBNL1 y los otros dos están ubicados en el exón 4 de MBNL1. El polipéptido MBNL1 modificado (en el presente documento denominado ACT3) es el constructo MBNL1 truncado que carece del dominio C-terminal que sigue al cuarto motivo de dedos de zinc C<3>H<1>.

Fig 2: El ACT3 se colocaliza con agregados nucleares de ARN-CUGexpin vitro.Se cotransfectaron constructos GFP, GFP-ACT3 o GFP-MBNL140 con 960 repeticiones CTG en células Hela. Los focos de ARN-CUGexp se visualizaron mediante FISH utilizando una sonda Cy3-CAG7.

Fig 3: La expresión de varias isoformas de MBNL1, así como del constructo ACT3, restaura el empalme desregulado por DM1 del minigén del exón 2/3 de Tau. El minigén del exón 2/3 de Tau comprende los dos casetes alternos 2 y 3 insertados en el minigén indicador de empalme psvIRB (Tran et al.2011). Las isoformas de MBNL1<35>o<38>o<41>o<43>(panel A) o GFP-ACT3 (panel B) se coexpresaron con el minigén del exón 2/3 de Tau y un plásmido que contenía 960 repeticiones CTG interrumpidas en células Hela, tal como se ha descrito anteriormente (Tran et al. 2011). Se calculó y se estableció el porcentaje de inclusión de E2 de Tau después de RT-PCR utilizando cebadores que rodean el exón 2 y el exón 3 de Tau.

Fig 4: Se requiere la localización nuclear de ACT3 para modular los eventos de empalme. A) Los constructos GFP-ACT3 que contienen o no una señal de exportación nuclear (NES) se coexpresaron o no con 960 repeticiones CTG en células Hela. B) La inclusión del exón 5 de cTNT o del exón 11 de IR se evaluó mediante RT-PCR después de la cotransfección de constructos MBNL o GFP y minigenes del exón 5 de cTNT o del exón 11 de IR en células Hela. C). La inclusión del exón 2 de Tau se analizó en células Hela cotransfectadas con el minigén del exón 2/3 de Tau, 960 repeticiones de CTG y constructos MBNL o GFP.

Fig 5: El ACT3 puede desplazar MBNL1 de las repeticiones CUGin vitro.La proteína MBNL140 (o ACT3) recombinante se entrecruzó con 32P-ARN transcritoin vitroque contiene 95 repeticiones CUG en ausencia o presencia de concentraciones crecientes de proteína ACT3 (MBNLU<0>) recombinante.

Fig 6: El ACT3 se colocaliza con ARN-CUGexp nuclear en células musculares DM1 humanas. Las células musculares DM1 primarias se transdujeron con vectores lentivirales que contenían el ADNc que codifica el GFP-ACT3. Los focos de ARN-CUGexp se visualizaron por FISH utilizando una sonda Cy3-CAG7.

Fig 7A: El ACT3 normaliza los eventos de empalme incorrecto en células musculares DM1 humanas diferenciadas. Las células musculares primarias humanas DM1 y no-DM1 se transdujeron o no con vectores lentivirales que expresaban GFP-ACT3 o GFP sola. El perfil de empalme de los transcritos del exón 11 de BIN1, el exón 7 de LDB3 y el exón 78 de DMD se analizó mediante RT-PCR.

Fig. 7B: Se transfectaron o no células musculares diferenciadas (Control, DM1 o DM1 que expresa C) con ARNpi de MBNL1 dirigido nuevamente al exón 9 del extremo C (presente en MBNL1 pero no en secuencias ACT3). El perfil de empalme de los transcritos del exón 78 de<d>M<d>se analizó mediante RT-PCR.

Fig 8: La inyección intramuscular de virus adenoasociado de serotipo 9 (AAV9) que contiene el ADNc que codifica GFP-ACT3 normaliza desregulaciones de empalme en ratones DM1. A los músculos gastrocnemios de ratones HSA-LR se les inyectó AAV9 GFP-ACT3 (1.1011 vg; n= 6) y se analizaron después de 6 semanas. Se inyectó solución salina en los músculos contralaterales. El perfil de empalme del exón 22 de Serca1, el exón 7 de Mbnl1 y el exón 7a de Clcn1 se analizaron mediante RT-PCR.

Fig 9: El GFP-ACT3 se colocaliza con focos nucleares de ARN-CUGexpin vivo.Se realizaron FISH-IF para detectar focos de ARN-CUGexp y GFP-ACT3 en secciones musculares de ratones HSA-LR a los que se inyectó AAV9 GFP-ACT3.

Fig 10: El GFP-ACT3 desplaza a Mbnl1 de los focos nucleares de ARN-CUGexpin vivo.Se realizaron FISH-IF para detectar focos de ARN-CUGexp, Mbnl1 endógeno y GFP-ACT3 en secciones musculares de ratones HSA-LR a los que se inyectó AAV9 GFP-ACT3 o solución salina. El pico de intensidad para cada componente se midió a lo largo de focos de cruce de carriles arbitrarios observados dentro del núcleo.

Fig 11: La inyección intramuscular de AAV9 GFP-ACT3 suprime la miotonía en ratones DM1. Se midió la relajación de la fuerza de músculos gastrocnemios de HSA-LR a los que se inyectó AAV9 GFP-ACT3 (1.1011 vg; n= 6) o solución salina (músculos contralaterales) 6 semanas después de la inyección. La relajación de la fuerza también se determinó en músculos gastrocnemios de ratones FVB wt.

Fig 12: No hay signos de degeneración muscular en ratones FVB wt que expresan AAV9 GFP-ACT3. A los músculos tibiales anteriores de ratones FVB wt se les inyectó AAV9 GFP-ACT3 (1.1011 vg; n=6) y se analizaron por IF después de 3, 4 o 6 semanas. A los músculos contralaterales se les inyectó AAV9 MCS vacío. Se utilizaron anticuerpos embrionarios MyHC y laminina para detectar fibras en regeneración y fibras musculares, respectivamente. Los núcleos se tiñeron con Dapi.

Fig 13: La expresión de AAV9 GFP-ACT3 por sí sola no desregula el empalme alternativo en ratones wt. A los músculos tibiales anteriores de ratones FVB wt se les inyectó AAV9 GFP-ACT3 (1.1011 vg, n = 6) y los perfiles de empalme del exón 7a de Clcn1 o del exón 11 de Serca1 se analizaron después de 3, 4 o 6 semanas tras la transducción. A los músculos contralaterales se les inyectó AAV9 MCS vacío.

Fig 14A: La inyección intramuscular de AAV9 GFP-ACT3 normaliza desregulaciones de empalme en ratones DM1. A los músculos tibiales anteriores de ratones HSA-LR se les inyectó AAV9 GFP-ACT3 (1.1011 vg; n= 6) y se analizaron después de 6 semanas. A los músculos contralaterales se les inyectó AAV9 MCS. Los perfiles de empalme del exón 7a de Clcn1, el exón 11 de Serca1 y el exón 11 de LDB3 se determinaron mediante RT-PCR.

Fig. 14B: Inyección intramuscular de constructos AAV9-V5-ACT. Los constructos NLS-V5-ACT3 y V5-ACT3 normalizan las desregulaciones de empalme en ratones DM1 en contraste con VS-ACT(-3) que carece del exón 3. A los músculos tibiales anteriores de ratones HSA-LR se les inyectaron constructos AAV9-V5-ACT (5.1010 vg; n= 3) y se analizaron después de 6 semanas. Se inyectó PBS en los músculos contralaterales. Los perfiles de empalme del exón 7a de Clcn1 y del exón 11 de Serca1 se determinaron mediante RT-PCR.

Fig 15: El ACT3 restaura eventos dependientes del empalme de MBNL2. Los constructos MBNL (MBNL1, panel A; MBNL2, panel B; ACT3, panel C) se coexpresaron con el minigén del exón 2 de hTau y 960 repeticiones CTG en células T98G, tal como se describe en (Carpentier et al., 2014). La inclusión de E2 de Tau se analizó mediante RT-PCR. El gráfico indica el porcentaje de exclusión del exón 2 de Tau (promediado ± S.E.M. para al menos tres experimentos independientes). Las diferencias significativas se indican con asteriscos: *, p < 0,05; **,p<0,01, ***,p<0,001. Se utilizaron transcritos de 18S como controles internos para verificar las cantidades de ARN. La eficacia de la transfección DT960 se verificó mediante RT-PCR de la UTR 3' del genDMPKhumano. El panel D muestra los sitios de MBNL1 mutantes que se han mutado (gris negrita) en el constructo MBNL mut.

Descripción detallada de la invención

El polipéptido MBNL modificado para su uso según la invención es capaz de unirse al motivo de ARN de MBNL YGCY, en el que "Y" representa una pirimidina (uridina o citosina). En particular, el polipéptido MBNL modificado para su uso según la invención es capaz de unirse al motivo UGCU, que es el componente básico de las repeticiones CUG expandidas por DM1 patológicas. En una forma de realización particular, el polipéptido MBNL modificado para su uso según la invención incluye o no los aminoácidos correspondientes al exón 3 del ARNm de MBNL1 (número de acceso NM_021038). En una forma de realización adicional, el polipéptido MBNL modificado para su uso según la invención carece de los aminoácidos de SEQ ID NO:1 (SEQ ID NO:1: TQSAVKSLKRPLEATFDLGIPQAVLPPLPKRPALEKTNGATAVFNTGIFQYQQALAN MQLQQHTAFLPPGSILCMTPATS V VPMVHGATPATVSAATTSATS VPFAATTANQIPII SAEHLTSHKYVTQM) correspondientes a los exones 5 a 10 del ARNm de MBNL1.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "MBNL" denota todos los miembros parálogos de la familia de proteínas de unión a ARN de tipo músculo ciego e incluye en particular MBNL1, -2 y -3. En una forma de realización particular, el polipéptido MBNL modificado para su uso según la invención se deriva de la secuencia de la proteína MBNL1 humana. En una forma de realización, el polipéptido MBNL modificado es una proteína MBNL1 que tiene la secuencia codificada por el exón 3 pero que carece de las secuencias de aminoácidos codificadas por los exones 5 a 10 del gen MBNL1. En una forma de realización específica, el polipéptido derivado de MBNL1 modificado se denomina ACT3 y tiene la secuencia de aminoácidos siguiente:

MAVSVTPIRDTKWLTLEVCREFQRGTCSRPDTECKFAHPSKSCQVENGRVIACFDSL KGRCSRENCKYLHPPPHLKTQLEINGRNNLIQQKNMAMLAQQMQLANAMMPGAPL QP VPMFS V APS L ATN AS A A AFNP YLGP V S PS LVP AEILPT APML VT GNPG VP VP A A A A AAAQKLMRTDRLEVCREYQRGNCNRGENDCRFAHPADSTMIDTNDNTVTVCMDYI KGRCSREKCKYFHPPAHLQAKIKAAQYQVNQAAAAQAAATAAAM (SEQ ID NO: 2).

En una forma de realización, el polipéptido MBNL modificado es una proteína MBNL1 que carece tanto de la secuencia codificada por el exón 3 como de las secuencias codificadas por los exones 5 a 10 del gen MBNL1. En una forma de realización específica, el polipéptido derivado de MBNL1 no funcional se denomina ACT y tiene la secuencia de aminoácidos siguiente:

MAVSVTPIRDTKWLTLEVCREFQRGTCSRPDTECKFAHPSKSCQVENGRVIACFDSL KGRCSRENCKYLHPPPHLKTQLEINGRNNLIQQKNMAMLAQQMQLANAMMPGAPL QPVVCREYQRGNCNRGENDCRFAHPADSTMIDTNDNTVTVCMDYIKGRCSREKCKY FHPP AHLQ AKIKA AQ Y Q VN Q A A A AQ A A AT A A AM (SEQ ID NO: 3).

En otra forma de realización, el polipéptido MBNL modificado es una proteína MBNL2 codificada por las secuencias de aminoácidos de los exones 2 a 5 de la proteína MBNL2. En una forma de realización específica, el polipéptido derivado de MBNL2 modificado se denomina MBNL2-ACT3 y tiene la secuencia de aminoácidos siguiente:

M ALN V AP VRDTKWLTLE V CRQFQRGTC S RS DEEC KFAHPPKS C Q VEN GR VIACFDS L KGRCSRENCKYLHPPTHLKTQLEINGRNNLIQQKTAAAMLAQQMQFMFPGTPLHPV PTFP V GP AIGTNT AIS F AP YLAP VTPG V GL VPTEILPTTP VIVPGS PP VT VPGS T AT QKLL RTDKLEVCREFQRGNCARGETDCRFAHPADSTMIDTSDNTVTVCMDYIKGRCMREK CKYFHPPAHLQAKIKAAQHQANQAAVAAQAAAAAATVM (SEQ ID NO:4).

Tal como se utiliza en el presente documento, una "variante" del polipéptido MBNL modificado de la invención es una proteína que tiene propiedades de unión iguales o similares al motivo YGCY, en particular a repeticiones CUG, que la proteína MBNL de tipo silvestre de la que se deriva (en particular MBNL1,2 o 3) o que la proteína MBNL modificada de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 o Se Q ID NO: 4 tal como se ha mostrado anteriormente, teniendo dicha variante una actividad de empalme reducida en comparación con la proteína MBNL de tipo silvestre. En otros términos, el polipéptido MBNL modificado usado en la presente invención es un polipéptido MBNL no funcional, que tiene actividad de empalme baja en comparación con la proteína MBNL parental de tipo silvestre o incluso nula. El uso de tal polipéptido MBNL no funcional con respecto a su actividad de empalme nunca se ha notificado en la técnica anterior para el tratamiento de una distrofia miotónica, ya que todos los intentos terapéuticos anteriores se llevaron a cabo usando una proteína MBNL funcional, es decir, una proteína que tiene todas las características de la proteína de tipo silvestre, incluida su capacidad para unirse al motivo YGCY y su actividad de empalme. De hecho, los intentos anteriores tenían como objetivo proporcionar a la célula tratada una sobreexpresión de una proteína MBNL que compensara la pérdida de proteínas MBNL endógenas libres y funcionalmente disponibles que se han secuestrado en repeticiones patológicas. La estrategia aplicada en la presente divulgación no está relacionada. En lugar de proporcionar una sobreexpresión de una proteína MBNL funcional, los inventores proponen introducir en las células que lo necesitan una proteína MBNL modificada, es decir, una proteína MBNL variante no funcional que tiene actividad de empalme reducida o incluso nula, para competir con, desplazar y reemplazar la(s) proteína(s) endógena(s) MBNL para evitar las consecuencias negativas de su secuestro. Tal como se proporciona en la parte experimental de la presente divulgación, los resultados obtenidos con la presente estrategia han sido extremadamente satisfactorios.

En una forma de realización particular, la variante según la invención puede tener una secuencia al menos el 50%, en particular al menos el 60%, el 70%, el 80%, el 90% y más particularmente al menos el 95% o incluso al menos el 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos correspondiente a los exones 1 a 4 de la proteína MBNL de tipo silvestre (por ejemplo, de MBNL1,2 o 3) o a la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2, 3 o 4.

El polipéptido MBNL modificado para su uso en la invención no es un péptido quimérico que consiste en un polipéptido MBNL y un resto de direccionamiento.

La presente invención implementa un polipéptido MBNL modificado que casi no tiene actividad de empalme, o, dicho de otra forma, tiene una actividad reducida en comparación con la proteína MBNL de tipo silvestre. En el presente documento se pretende que por "casi ninguna actividad" o "actividad reducida" se describa una actividad de empalme que está reducida en al menos el 60%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90% o incluso al menos el 95% en comparación con la actividad de empalme de la proteína MBNL de tipo silvestre. Dicha actividad puede determinarse según procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica, tales como el uso de minigenes para analizar el empalme alternativo del exón 5 de cTNT, el exón 11 de IR y el exón 2 de Tau (Tran et al., 2011).

En una forma de realización particular, la proteína MBNL modificada para su uso según la invención puede comprender una secuencia de localización tal como una secuencia de localización nuclear (NLS) o una señal de exportación nuclear (NES). Una NLS representativa tiene la secuencia representada en S<e>Q ID NO: 5: PKKKRKV. Una NES representativa tiene la secuencia representada en SEQ ID NO: 6: LPPLERLTLD. La presente divulgación incluye cualquier polipéptido MBNL modificado tal como se ha descrito anteriormente, combinado con dicha secuencia de localización, en particular con una NLS o NES tales como las mencionadas específicamente anteriormente.

La divulgación se refiere además a una composición farmacéutica que comprende el polipéptido MBNL modificado para su uso según la invención o una variante del mismo.

Otro aspecto de la invención es una secuencia de ácido nucleico que comprende o consiste en una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido MBNL modificado para su uso según la invención. La invención se refiere además a un constructo genético que consiste en, o comprende, una secuencia de nucleótidos tal como se define en el presente documento, y secuencias reguladoras (tales como promotor(es), potenciador(es), terminador(es), etc... adecuados) que permiten la expresión (por ejemplo, la transcripción y la traducción) de un polipéptido MBNL modificado según la invención en una célula huésped. Los constructos genéticos de la invención pueden ser ADN o ARN, y preferentemente son ADN bicatenario. Los constructos genéticos de la invención también pueden estar en una forma adecuada para la transformación de la célula huésped o del organismo huésped previsto, en una forma adecuada para la integración en el ADN genómico de la célula huésped prevista o en una forma adecuada para la replicación, el mantenimiento y/o la herencia independientes en el organismo huésped previsto. Por ejemplo, los constructos genéticos de la invención pueden estar en forma de un vector, tal como por ejemplo un plásmido, un cósmido, un YAC, un vector codificante vírico o un transposón. En particular, el vector puede ser un vector de expresión, es decir, un vector que puede proporcionar la expresiónin vitroy/oin vivo(por ejemplo, en una célula huésped, organismo huésped y/o sistema de expresión adecuado). En un aspecto preferido pero no limitante, un constructo genético de la invención comprende i) al menos una secuencia de ácido nucleico de la invención; unida operativamente a ii) uno o más elementos reguladores, tales como un promotor y opcionalmente un terminador adecuado; y opcionalmente también iii) uno o más elementos adicionales de constructos genéticos tales como secuencias UTR 3' o 5', secuencias líder, marcadores de selección, marcadores de expresión/genes informadores y/o elementos que pueden facilitar o aumentar (la eficacia de) la transformación o integración o localización subcelular o expresión del polipéptido MBNL modificado, tales como una señal de localización nuclear (NLS) o una señal de exportación nuclear (NES).

En una forma de realización particular, el constructo genético corresponde al genoma de un vector vírico recombinante. Los vectores víricos adecuados usados en la práctica de la presente invención incluyen retrovirus, lentivirus, adenovirus y virus adenoasociados. En particular, la invención se refiere a un lentivirus que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido MBNL modificado según la invención. En otra forma de realización particular, la invención se refiere a un vector AAV, en particular un vector AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 o AAV11, en particular un vector AAV9, que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína MBNL modificada según la invención. El vector AVV puede ser un vector pseudotipado, es decir, su genoma y su cápside pueden derivar de diferentes serotipos de AAV. Por ejemplo, el genoma puede derivarse de un genoma de AAV2 y sus proteínas de la cápside pueden ser del serotipo<a>A<v>1 ,<a>A<v>3, AAV4, A<a>V5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV 10 o AAV11.

Otro aspecto se refiere a un polipéptido MBNL modificado según la invención, para su uso como medicamento.

El polipéptido MBNL modificado para su uso según la invención es un agente terapéutico útil, en particular en el tratamiento de una enfermedad o trastorno relacionada con un secuestro de una proteína MBNL, o con una función desregulada de un miembro de MBNL tal como MBNL1, u otros miembros parálogos (incluidos MBNL2 y MBNL3). En una forma de realización preferida, el polipéptido modificado de la invención es para su uso en el tratamiento de una distrofia miotónica tal como DM1 y DM2, o cualquier enfermedad en la que una pérdida de la función de MBNL (por ejemplo, secuestro, agregación, mutaciones...) pueda rescatarse mediante la administración ectópica del polipéptido MBNL modificado de la invención.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a un polipéptido MBNL modificado tal como se ha descrito anteriormente, para su uso en un procedimiento para el tratamiento de una distrofia miotónica.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "tratamiento" o "terapia" incluye tratamiento curativo y/o preventivo. Más particularmente, el tratamiento curativo se refiere a cualquiera de alivio, mejora y/o eliminación, reducción y/o estabilización (por ejemplo, incapacidad para progresar a etapas más avanzadas) de un síntoma, así como retraso en la progresión de un síntoma de un síntoma de un trastorno particular. El tratamiento preventivo se refiere a cualquiera de: impedir la aparición, retrasar la aparición, reducir el desarrollo, reducir el riesgo de desarrollo, reducir la incidencia, reducir la gravedad, así como aumentar el tiempo hasta la aparición de los síntomas y la supervivencia de un trastorno determinado.

Se describe así un procedimiento para tratar distrofias miotónicas en un sujeto que lo necesita, procedimiento que comprende administrar a dicho paciente un polipéptido MBNL modificado según la invención, o una secuencia de ácido nucleico que codifica dicho polipéptido MBNL modificado.

En el contexto de la invención, "sujeto" o "paciente" significa un mamífero, particularmente un ser humano, cualquiera que sea su edad o sexo, que padezca una distrofia miotónica. El término incluye específicamente mamíferos domésticos y comunes de laboratorio, tales como primates no humanos, felinos, caninos, equinos, porcinos, bovinos, cabras, ovejas, conejos, ratas y ratones. Preferentemente el paciente que se va a tratar es un ser humano, incluido un niño o un adolescente.

Para los usos y procedimientos según la invención, el polipéptido MBNL modificado, el ácido nucleico, el constructo genético o el vector vírico (tal como un vector lentiviral o AAV) pueden formularse mediante procedimientos conocidos en la técnica. Además, puede considerarse cualquier vía de administración. Por ejemplo, el polipéptido MBNL modificado, el ácido nucleico, el constructo genético y el vector vírico (tal como un vector lentiviral o AAV) pueden administrarse mediante cualquier vía de administración convencional incluidas, pero sin limitación, las vías oral, pulmonar, intraperitoneal (ip), intravenosa (iv), intramuscular (im), subcutánea (sc), transdérmica, bucal, nasal, sublingual, ocular, rectal y vaginal. Además, la administración directamente al sistema nervioso puede incluir, pero sin limitación, las vías de administración intracerebral, intraventricular, intracerebroventricular, intratecal, intracisternal, intraespinal o periespinal mediante administración por medio de agujas o catéteres intracraneales o intravertebrales con o sin dispositivos de bombeo. Será fácilmente evidente para los expertos en la técnica que cualquier dosis o frecuencia de administración que proporcione el efecto terapéutico descrito en el presente documento es adecuada para su uso en la presente invención. En una forma de realización particular, se administra al sujeto un vector vírico que codifica un polipéptido MBNL modificado según la invención por vía intramuscular. En una variante específica de esta forma de realización, el vector es un vector AAV tal como se ha definido anteriormente, en particular un vector AAV9. En un aspecto específico adicional, el sujeto recibe una única inyección del vector.

Además, se pueden emplear procedimientos farmacéuticos estándar para controlar la duración de la acción. Éstos son bien conocidos en la técnica e incluyen preparaciones de liberación controlada y pueden incluir macromoléculas apropiadas, por ejemplo polímeros, poliésteres, poliaminoácidos, polivinilo, pirrolidona, acetato de etilenvinilo, metilcelulosa, carboximetilcelulosa o sulfato de protamina.

Además, la composición farmacéutica puede comprender nanopartículas que contienen el polipéptido MBNL modificado para su uso según la presente invención.

Los ejemplos siguientes ilustran la invención sin limitar su alcance.

EJEMPLOS

MATERIAL Y PROCEDIMIENTO

Plásmidos y producción vírica

El plásmido que contiene la UTR 3’ deDMPKcon 960 CTG interrumpidos era un vector de minigén también bajo el control del promotor CMV (amable obsequio de T Cooper, Baylor College of Medecine, Houston TX, Estados Unidos). La secuencia de constructos variantes de longitud completa de MBNL1 y ACT3 truncado utilizados en este estudio se han descrito previamente (Tran et al. 2011). Una NES se derivó de la proteína REV del VIH (Fischer et al. 1995) y se fusionó con el constructo ACT3. La actividad de empalme de MBNL1, ACT3 y ACT3-NES se evaluó utilizando tres minigenes descritos previamente: el minigén RTB300 que contiene el exón 5 de cTNT humano (hcTNT); el minigén INSR que contiene el exón 11 del receptor de insulina humano y el minigén pSVIRB/Tau que contiene los exones 2 y 3. Todos los ADN de los plásmidos se secuenciaron de forma bicatenaria en GATC Biotech (Francia) y se purificaron utilizando el kit carente de endotoxinas Nucleobond® AX (Macherey Nagel, Alemania). El ADNc que codifica GFP-ACT3 o la proteína GFP que contiene una secuencia consenso de Kozak se clonó en los vectores de transferencia SIN-cPPT-PGK-WHV o pSMD2. Los vectores lentivirales y AAV9 se obtuvieron tal como se ha descrito anteriormente (Caillierez et al. 2013; Francois et al.; Fugier et al. 2011) y se almacenaron congelados a -80°C. Se produjeron proteínas recombinantes GST-MBNL1 y ACT3 y se realizaron experimentos de entrecruzamiento UV tal como se ha descrito anteriormente (Laurent et al. 2012, Tran et al. 2011). El minigén hTau y el constructo MBNL mut se describen en (Carpentier et al., 2014). Brevemente, el minigen E2 de hTau consiste en las secuencias del exón 1, exón 2 y exón 4 del genMAPThumano insertadas en el vector de expresión eucariota pEGFPN1 (Clontech). El exón 2 está precedido y seguido por 878 y 2100 nucleótidos de las secuencias intrónicas 2 y 3 del genMAPThumano, respectivamente (detallado en Carpentier et al., 2014). Los sitios mutados Seq250 E2250 MBNL1 en la figura 15D representan los 250 nucleótidos de las secuencias intrónicas que rodean el exón 2 para los cuales los sitios de unión de MBNL están mutados (secuencias en negrita gris). Este minigén mutante ya no responde a la actividad reguladora de empalme de MBNL. Estos minigenes se generaron por GeneArt® (empresa Gene Synthesis) y la secuencia de preparación del plásmido se verificó mediante secuencia bicatenaria por GATC (Biotech, Constanza, Alemania).

Cultivo celular, transfección e infección

Se cultivaron células HeLa en cultivos monocapa en placas de 6 pocillos en medio esencial modificado de Dulbecco (DMEM) (Invitrogen) suplementado con suero fetal de ternera (FBS) al 10% a 37°C en una incubadora humidificada con CO<2>(5%). Las células cultivadas hasta una confluencia de ~ 70% se cotransfectaron transitoriamente con 1 gg de ADN plasmídico de minigén, 1 gg de repeticiones CUG y 3 gg de ADN plasmídico de MBNL por triplicado, utilizando el reactivo de transfección FuGENE HD (Roche Diagnostics) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Se aislaron células musculares humanas a partir de biopsias de músculo esquelético tal como se describe (Furling et al, 2001), de acuerdo con la legislación francesa sobre normas éticas. Se cultivaron mioblastos de tipo silvestre (WT) y DM1 en medio F10 de HAM suplementado con el 20% de FBS y 5 gg/ml de gentamicina (Invitrogen), al 5% de CO<2>y 37°C. Se utilizaron 100 ng de P24/gl para transducir 2x105 células musculares humanas. La transducción del vector se realizó durante la noche en presencia de 4 gg/ml de polibreno (Sigma). Para desencadenar la diferenciación, se retiró el medio de crecimiento de los cultivos subconfluentes y se reemplazó por medio DMEM suplementado con 10 gg/ml de insulina (Sigma).

Transferencia de genes in vivo y experimentos

Se obtuvieron ratones HSA-LR de C. Thornton y ratones FVB de control de Janvier. Todos los procedimientos con ratones se realizaron de acuerdo con los protocolos experimentales aprobados por el Comité de Ética en Recursos Animales en las instalaciones para animales del Centre d'Exploration Fonctionnelle de Pitié-Salpetriere y con una contención biológica adecuada. A los músculos gastrocnemios o tibiales anteriores de ratones adultos se les inyectaron respectivamente 30 a 100 gl de solución fisiológica que contenía o no vectores AAV9. Para cada ratón, se inyectó AAV GFP-ACT3 en un músculo y en el músculo contralateral se inyectó AAV de control que contenía cualquiera de transgén (MCS) o GFP o vehículo solo (PBS). Seis semanas después de las inyecciones, se midieron las propiedades contráctiles isométricas de los músculos tal como se ha descrito anteriormente (Mouisel et al. 2006). Después, se sacrificaron los ratones, se recogieron los músculos y se congelaron rápidamente en isopentano líquido enfriado con nitrógeno y se almacenaron a -80°C.

Hibridación fluorescente in situ (FISH) e inmunofluorescencia

La hibridación fluorescentein situ(FISH) se realizó tal como se describe utilizando una sonda de 2-O-metil ARN (CAG)7 marcada con Cy3. El experimento combinado de FISH-inmunofluorescencia (IF) se realizó tal como se describe (Francois et al.) utilizando anticuerpos policlonales MBNL1 (Everest Biotech.) o GFP (Invitrogen) seguidos respectivamente de anticuerpos secundarios conjugados con Cy5 o Alexa 488. Las imágenes se capturaron utilizando un microscopio confocal Leica y un programa informático (Leica microsytems) y se procesaron con el programa informático ImageJ. La inmunofluorescencia en la sección muscular se realizó tal como se describe utilizando anticuerpos embrionarios MyHC (Novocastra) y laminina (Novocastra).

Extracción de proteínas y análisis por inmunotransferencia Western

La inmunotransferencia Western se realizó con procedimientos estándar tal como se ha descrito anteriormente (Tran et al. 2011) utilizando anticuerpos anti-GFP (Santa Cruz) o anti-GAPDH (Tebu-Bio).

Extracción de ARN y análisis semicuantitativo

El ARN total se aisló utilizando un kit de extracción de ARN total (kit Nucleospin® RNA II, Macherey Nagel) o reactivo TRIzol (Invitrogen) según el protocolo del fabricante. La concentración de ARN se determinó midiendo la absorbancia a 260 nm utilizando Nanodrop (Labtech). La RT-PCR se realizó utilizando 1 pg de ARN total utilizando hexámeros aleatorios y la transcriptasa inversa M-MLV (Invitrogen) según protocolos estándar. No se observó amplificación de ADN en los controles RT. La PCR se llevó a cabo tal como se ha descrito anteriormente. Los productos de reacción se resolvieron mediante electroforesis utilizando un gel de poliacrilamida al 5% o al 8% y las bandas se tiñeron con SYBR Gold (Invitrogen). La intensidad de la luminiscencia de SYBR Gold se midió utilizando un escáner Fluorolmager (Claravision). Los experimentos de PCR se repitieron al menos tres veces.

Análisis estadístico

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando la prueba t no pareada con valores de P de dos colas, utilizando el programa informático Prism 6 (GraphPad Software Inc.).

RESULTADOS

En un estudio previo centrado en la afinidad de unión y la actividad de empalme de las diferentes isoformas de MBNL1, demostramos que el constructo MBNL1 truncado que carece del dominio C-terminal (ACT3, Fig. 1) mantiene la propiedad de unión a YGCY con una afinidad ligeramente menor en comparación con isoformas MBNL1 de longitud completa pero tiene una reducción drástica de su actividad de empalme debido a la ausencia de la secuencia codificada por los exones 5 a 10 (Tran et al. 2011). Para evaluar si el polipéptido ACT3 no funcional aún es capaz de unirse a repeticiones CUG patógenas, se cotransfectaron células Hela con repeticiones CUG expandidas y constructos ACT3 marcados con MBNL1 o GFP. Tal como se observa en la figura 2, GFP-ACT3 se colocaliza con los focos nucleares de ARN-CUGexp, tal como se observa para el MBNL1 de longitud completa. A continuación, examinamos su efecto sobre los eventos de empalme desregulados por DM1 coexpresando constructos GFP-ACT3 o MBNL1 con repeticiones CUG expandidas y analizamos el empalme de los exones 2/3 de Tau utilizando un minigén informador de empalme en células Hela (Fig. 3). En presencia de repeticiones CUG, la inclusión del exón 2 de Tau se reduce significativamente tal como se observa en pacientes DM1, y la sobreexpresión de varias isoformas de MBNL1 que tienen actividades de empalme similares (Tran et al. 2011) restaura parcialmente la inclusión del exón 2 de Tau (Fig. 3A). Sin embargo, la sobreexpresión del constructo GFP-ACT3 que tiene una reducción de más del 80% de su actividad de empalme en comparación con MBNL1 también corrige los cambios de empalme del minigén de exones 2/3 de Tau en una medida similar a MBNL1 (Fig. 3B). Este resultado sugiere que GFP-ACT3 puede interactuar con repeticiones CUG para liberar MBNL1 funcional involucrado en la regulación del empalme del exón 2 de Tau, ya que no es probable que la actividad de empalme residual de GFP-ACT3 sea suficiente para restaurar un empalme normal de Tau en presencia de repeticiones CUG. Para confirmar esta hipótesis, generamos un constructo GFP-ACT3 fusionado con una fuerte señal de exportación nuclear (NES) derivada de la proteína REV del VIH (Fischer et al. 1995). Tal como se esperaba, GFP-ACT3-NES presenta una localización citoplasmática completa en comparación con GFP-ACT3, que mostró una localización nucleocitoplásmica (Fig. 4A). Debido a la exportación nuclear eficaz y la localización citoplásmica exclusiva, GFP-ACT3-NES no tiene más actividad de empalme residual, tal como se muestra utilizando los minigenes del exón 5 de hcTNT y del exón 11 de IR (Fig. 4B). Por el contrario, la coexpresión de GFP-ACT3-NES con repeticiones CUG y minigenes informadores de empalme de los exones 2/3 de Tau aún puede restaurar un empalme normal de Tau tal como se observó anteriormente con MBNL1 de longitud completa y GFP-ACT3 (figura 4C). Tal como se muestra en la figura 4A, GFP-ACT3-NES se colocaliza con los focos de ARN-CUGexp, pero el GFP-ACT3-NES no unido restante libre se exporta eficazmente fuera del núcleo y, por lo tanto, ya no está disponible para una regulación del empalme alternativo. En conjunto, nuestros resultados indican que ACT3 revierte los eventos de empalme desregulados en presencia de repeticiones de CUG patógenas al saturar los sitios de unión de CUG y liberar una cantidad suficiente de MBNL1 funcional de los focos de ARN-CUGexp.

Para confirmar que ACT3 puede unirse a repeticiones CUG y competir con la unión de MBNL1, se entrecruzó la proteína MBNL1 recombinante con 32P ARN transcritoin vitroque contiene 95 repeticiones CUG en ausencia o presencia de concentraciones crecientes de proteína ACT3 recombinante, o viceversa (Fig. 5). En ambas condiciones, las concentraciones crecientes de ACT3 o MBNL1 recombinantes pudieron reducir, respectivamente, la cantidad de MBNL1 o ACT3 recombinantes, lo que indica que ACT3 es capaz de competir con, y desplazar eficazmente a, MBNL1 de las repeticiones CUG.

Para evaluar si ACT3 puede interactuar con ARN-CUGexp en células DM1 y modular características moleculares de DM1 como desregulación del empalme alternativo, se transdujeron o no cultivos de células musculares primarias humanas de pacientes DM1 y no-DM1 con vectores lentivirales que expresan o bien GFP-ACT3 o bien GFP. Tal como se muestra en la figura 6, GFP-ACT3 se colocaliza con los focos nucleares de ARN-CUGexp en células musculares DM1. A continuación investigamos los efectos sobre la desregulación de empalme de los transcritosDMD, BIN1yLDB3,que están empalmados anormalmente en células musculares DM1 diferenciadas (Fig. 7A) (Francois et al.2011). La expresión de GFP-ACT3 normalizó significativamente los perfiles de empalme de estos transcritos en células DM1, mientras que no afectó a su empalme en células de control no-DM1. Estos resultados confirman que la expresión de GFP-ACT3 es capaz de revertir los cambios moleculares inducidos por los ARN-CUGexp tóxicos en células musculares DM1. Además, también muestra que GFP-ACT3 modificado por sí solo no modifica el empalme de dianas endógenas. Para descifrar aún más el mecanismo de acción de GFP-ACT3 modificado, silenciamos MBNL1 utilizando ARNip en células musculares tratadas con GFP-ACT3. Tal como se muestra en la figura 7B, GFP-ACT3 requirió actividad de MBNL1 para restaurar completamente el perfil de empalme de DMD en células musculares DM1. Cabe destacar que la pérdida de MBNL1 en las células musculares de control altera el perfil de empalme de DMD. Este resultado indica que en las células DM1, GFP-ACT3 no tiene una actividad directa sobre el empalme. Por lo tanto, ACT3 requiere la liberación de MBNL1 funcional de los CUG-RNA expandidos para corregir los cambios de empalme en las células DM1.

La capacidad de ACT3 para neutralizarin vivola toxicidad de ARN inducida por las repeticiones CUG expandidas se analizó a continuación en el modelo de ratón DM1 (HSA-LR) que expresa 220 CTG en la UTR 3’ del gen de actina esquelética humana (Mankodi et al. 2000). Estos ratones acumulan ARN-CUGexp en los núcleos de sus fibras del músculo esquelético y muestran eventos de empalme incorrecto, así como miotonía. Se inyectaron por vía intramuscular al músculo gastrocnemio (GAS) de ratones HSA-LR vectores AAV9-GFP-ACT3, mientras que se inyectó solución salina al GAS contralateral. Después de 6 semanas, se midieron las propiedades de contracción de estos músculosin situ,posteriormente se sacrificaron los ratones y se extrajeron los músculos para análisis histológico y bioquímico. Entre los cambios de empalme en los ratones HSA-LR que son similares a los observados en pacientes DM1, examinamos la desregulación del empalme de Serca1, Mbnl1 y Clc-1. Tal como se muestra en la figura 8, la inyección de AAV9-GFP-ACT3 corrigió el patrón de empalme de estos transcritos en comparación con los músculos contralaterales HSA-LR y restaura un perfil de empalme normal casi completo en comparación con los ratones FVB wt. De forma significativa, AAV9-GFP-ACT3 no tuvo efecto sobre el empalme endógeno de estos transcritos en ratones FVB wt, lo que confirma que el constructo ACT3 casi no tenía actividad reguladora de empalmein vivoy (Fig.13) o concentraciónin vitroequivalente a la proteína WT MBNL1 (Tran et al., 2011). En conjunto, nuestros resultados sugieren que ACT3 compite con MBNL endógeno por la unión anormal a repeticiones CUG expandidas, lo que da lugar a la liberación de MBNL secuestrado y funcional de los agregados de ARN-CUGexp. Para respaldar nuestros datos que indican que ACT3 libera suficiente Mbnl1 funcional de los focos de ARN-CUGexp como para restaurar perfiles de empalme alternativo normales en ratones HSA-LR, supervisamos su localización nuclear en secciones de músculo (Fig. 9). Tal como se esperaba, ACT3 se colocaliza con los focos de ARN-CUGexp en los mionucleos de ratones HSA-LR a los que se inyectó AAV9-GFP-ACT3. Por el contrario, la colocalización de Mbnl1 focos de ARN-CUGexp (tal como indica el pico de intensidad) que se superpone en los ratones HSA-LR de control se redujo en gran medida en los ratones a los que se inyectó AAV9 GFP-ACT3 (Fig. 10), lo que confirma que ACT3 reemplaza a MBNL1 en los focos y desplaza suficiente MBNL1 endógeno para restaurar la actividad de empalme funcional dependiente de MBNL en ratones DM1.

A nivel fisiológico, se ha establecido que la miotonía observada en este modelo de ratón DM1 es el resultado de un empalme anormal del exón 7a de Clc-1 del canal de cloruro específico del músculo (Wheeler et al. 2007). Miotonía que se caracteriza por hiperexcitabilidad muscular que da lugar a descargas eléctricas persistentes y retraso en la relajación de la fuerza. Dado que el empalme incorrecto del exón 7a de Clc-1 se normalizó casi por completo mediante la expresión de ACT3, su efecto sobre la relajación de la fuerza muscular se determinó después de una contracción inducida (Fig. 11). Se midió un aumento significativo de la relajación de la fuerza en los músculos HSA-LR en comparación con los ratones FVB wt, lo que confirma la miotonía previamente establecida mediante electromiografía en estos ratones DM1. La miotonía revelada por una relajación de la fuerza anormal se abolió en el músculo GAS de ratones HSA-LR a los que se inyectó AAV9-GFP-ACT3 en comparación con los músculos contralaterales, mientras que no se detectaron cambios significativos en la fuerza muscular ni en la histología muscular (datos no mostrados). Además, a los músculos tibiales anteriores (TA) de ratones wt también se les inyectó AAV9-GFP-ACT3 o un AAV9-MCS vacío y se sacrificaron después de 3, 4 y 6 semanas (Fig. 12). Estos músculos no mostraron signos de toxicidad o regeneración/degeneración muscular tal como indica la casi ausencia (menos del 1%) de núcleos centrales, la reexpresión de la cadena pesada de miosina embrionaria, así como el tamaño anormal de las fibras musculares. Además, el perfil de empalme de genes que están empalmados de forma anormal en DM1 no se ve alterado en ratones wt ni por la expresión de ACT3 ni por la transducción de AAV9 (Fig. 13). Finalmente, la inyección de AAV9-GFP-ACT3 en músculos TA de ratones HSA-LR también corrige la desregulación del empalme de varios genes DM1 en comparación con los músculos contralaterales a los que se inyectó AAV9-MCS vacío (Fig. 14A). Además, la adición de una señal de localización nuclear (NLS) al constructo ACT3 no modifica la eficacia de ACT3 en ratones HSA-LR (Fig. 14B). Por el contrario, la eliminación del exón 3 del constructo ACT3 impide su actividad de corrección del empalme.

Dado que MBNL2 también puede unirse a repeticiones CUG expandidas que dan lugar a su secuestro, examinamos si los cambios de empalme relacionados con la deficiencia de MBNL2 se pueden corregir mediante ACT3. Tal como se muestra en la figura 15A, mediante la cotransfección de minigenes E2 de hTau con repeticiones CUG expandidas y constructos ACT3 marcados con MBNL o GFP en células T98G, la sobreexpresión de MBNL1 no permite corregir el empalme defectuoso del exón 2 de Tau. Por el contrario, la sobreexpresión de MBNL2 revierte este evento de empalme desregulado inducido por la presencia de repeticiones CUG expandidas (Fig. 15B), lo que indica que el empalme incorrecto del minigén E2 de hTau inducido por la presencia de repeticiones CUG expandidas se debe a la deficiencia de MBNL2 más que a la deficiencia de MBNL1. ACT3 también es capaz de rescatar el empalme defectuoso del exón 2 de Tau (Fig. 15C). El efecto de rescate observado con la sobreexpresión de MBNL2 o ACT3 se anuló al usar un minigén mutado de MBNL (Fig. 15B y C) con sitios de MBNL mutados que rodean el exón 2 de Tau (Fig. 15D), lo que demuestra que el rescate no es independiente de MBNL o no se debe a un efecto indirecto. Por lo tanto, ACT3 puede rescatar eventos de empalme desregulados tanto por MBNL1 como por MBNL2 liberando varios parálogos de MBNL de repeticiones CUG expandidas.

DISCUSIÓN

En este estudio proporcionamos evidencia de que el MBNL no funcional (ACT3), que casi carece de actividad de empalme, es eficaz para contrarrestar la toxicidad de ARN-CUGexp tantoin vitroein vivo.Por lo tanto, la administración intramuscular de vectores AAV que expresan proteínas ACT3 corrige tanto la desregulación del empalme alternativo como la miotonía en ratones DM1. El ACT3 que expresa solo el dominio de unión a ARN de MBNL1 interactúa con las repeticiones CUG patógenas y libera MBNL1 secuestrado de los focos nucleares de ARN-CUGexp. Este mecanismo restaura el MBNL1 funcional endógeno en células musculares DM1 y corrige los fenotipos asociados a DM1in vivo.Este hallazgo respalda el desarrollo de un enfoque de terapia génica MBNLA modificado y no funcional como enfoque terapéutico alternativo o complementario para DM1.

Basándose en la capacidad de MBNL para unirse a repeticiones CUG expandidas con alta afinidad, proponemos utilizar el dominio de unión a ARN de MBNL1 como cebo para bloquear la interacción nociva de las proteínas de unión a poli-CUG con repeticiones patógenas. Para evaluar esta hipótesis, generamos un MBNL modificado y no funcional (ACT3) que contiene solo el dominio de unión a ARN de MBNL1 y carece de los dominios C-terminales codificados por los exones 5 a 10 que son responsables de la actividad reguladora de empalme de MBNL1, el transporte nucleocitoplasmático de MBNL y, muy posiblemente, la oligomerización de MBNL (Tran et al. 2011). Nuestros resultados confirman que ACT3 conserva su capacidad de unión a repeticiones CUG y se colocaliza con ARN-CUGexp en células musculares, tantoin vitrocomoin vivo.Tal como se muestra en el ensayo de reticulaciónin vitro,ACT3 desplaza MBNL1 de los tractos CUG expandidos, lo que sugiere quein vivola unión de ACT3 a repeticiones patógenas de DM1 puede bloquear la interacción nociva de MBNL1, así como otras proteínas de unión a poli-CUG no identificadas o desplazar MBNL1 secuestrado de los focos nucleares de ARN-CUGexp. Como consecuencia, la liberación de MBNL1 funcional revertirá los eventos desregulados por DM1.

La normalización de la desregulación del empalme alternativo por ACT3, ya sea en células musculares DM1 o en músculo esquelético de ratones DM1, respalda la capacidad de ACT3 para dirigirse a repeticiones CUG patógenas y bloquear el acceso a MBNL1 endógeno. Sin embargo, dado que los ensayosin vitrohan demostrado que la propiedad de unión a YGCY de ACT3 es similar o ligeramente inferior a la de MBNL1, nos preguntamos si ACT3 es capaz de modular directamente los eventos regulados por MBNL1. Esto parece diferente porque la actividad de empalme de ACT3 debido a la falta de los exones 5 a 10 de MBNL1 se reduce drásticamente en comparación con MBNL1 usando un ensayo de minigénin vitro,y se obtuvieron resultados similares con un constructo ACT3-NES que no tiene actividad de empalme debido a su fuerte señal de exportación nuclear. Pero, sobre todo, no se detectaron cambios de empalme en ratones wt ni en células humanas de control que expresan ACT3. Más bien, nuestros resultados argumentan a favor de una liberación de MBNL1 endógeno de los focos nucleares ARN-CUG-exp en células musculares que expresan ACT3 que restauran la actividad endógena funcional de MBNL1. Si bien el MBNL1 está secuestrado y colocalizado con focos de ARN-CUGexp en ratones HSA-LR de control, su localización está menos asociada con los focos nucleares que ACT3 en ratones HSA-LR que recibieron inyección. El secuestro de ACT3 por ARN-CUGexp desplaza al MBNL1 endógeno de estas estructuras anormales, lo que da como resultado la corrección de eventos desregulados por MBNL1 en los ratones DM1.

Nuestra estrategia de AAV-ACT3 es el primer enfoque de terapia génica que se dirige al ARN-CUGexp para inhibir las proteínas de unión a poli-CUG nocivas y corregir sus efectos tóxicosin vivo.Hasta la fecha, las proteínas MBNL son casi las únicas proteínas en muestras de tejido humano DM1 que se encontraron secuestradas en focos nucleares y, recientemente, las anomalías en el empalme presentes en los músculos afectados de pacientes DM1 se asociaron principalmente con la pérdida funcional de MBNL1 (Nakamori et al. 2013). El agotamiento de los factores de empalme funcionales de MBNL debido a su unión anormal y secuestro por ARN-CUGexp da lugar a una desregulación del empalme alternativo de un subconjunto específico de transcritos y, en última instancia, a cambios patológicos en tejidos DM1. Por lo tanto, los eventos regulados por MBNL1 se asociaron con defectos del músculo esquelético DM1, mientras que los eventos regulados por MBNL2 estaban desregulados en cerebro DM1. Además, la sobreexpresión de MBNL1 funcional (isoformas-40 y -41) usando vectores AAV es suficiente para revertir el empalme incorrecto y la miotonía en ratones DM1, tal como se confirma mediante ratones HSA-LR:MBNL1-OE doblemente transgénicos (Kanadia et al.

2006; Chamberlain y Ranum 2012). Esta estrategia de sobreexpresión funcional de MBNL1 compensa la pérdida de MBNL1 en células de ratones DM1 mediante el aumento artificial del nivel de MBNL1 funcional. Así, las isoformas MBNL1-40 y -41 se sobreexpresaron con éxito en los músculos; sin embargo, se describieron hasta 10 isoformas MBNL1 diferentes con diversos perfiles de expresión y patrones específicos de tejido. La función de las diferentes isoformas aún no está completamente establecida, tal como se demuestra mediante el informe reciente que indica que la isoforma-43 MBNL1 puede interactuar con la quinasa de la familia Src (Wang et al. 2012; Botta et al. 2013). Además, MBNL1, que regula los eventos de empalme alternativo, también participa en otros procesos del ARN, tales como la descomposición del ARNm y la biogénesis de miARN (Rau et al. 2011; Masuda et al. 2012). El ACT3 que se dirige a ARN-CUGexp evitará la cuestión de qué isoforma de MBNL1 debe sobreexpresarse, ya que las proteínas MBNL1 endógenas secuestradas se liberan de una forma específica del tejido. Además, el empalme incorrecto del propio MBNL1 que cambia la proporción de isoformas de MBNL1 en los tejidos DM1 se corrige en el tejido muscular de ratones DM1 que expresan ACT3. Además, no se sabe si la sobreexpresión de MBNL1 puede restaurar o compensar la pérdida de otros parálogos de MBNL tales como MBNL2. Podemos suponer que el ACT3 liberará otras proteínas MBNL del ARN-CUGexp y corregirá los eventos de empalme incorrecto de MBNL en otros tejidos distintos al músculo esquelético. Nuestros resultadosin vitroindican que el ACT3 probablemente sea capaz de compensar la pérdida de MBNL2 en un contexto de DM1 (Fig. 15). De hecho, el empalme defectuoso del minigén E2 de hTau en presencia de ARN-CUGexp puede restaurarse mediante MBNL2 o ACT3, pero no mediante la sobreexpresión de MBNL1, lo que sugiere que el ACT3 también es capaz de contrarrestar los eventos desregulados por MBNL2 en DM1. Por lo tanto, en conjunto, nuestros resultados muestran que el ACT3 puede contrarrestar el efecto de las dianas desreguladas de ARN-CUGexp que están reguladas por MBNL1, MBNL2 o ambos. A diferencia de una estrategia de sobreexpresión funcional de MBNL1 que compense la pérdida de MBNL1 endógeno libre y funcionalmente disponible debido a su secuestro en agregados de ARN-CUGexp, el ACT3 no funcional se unirá a repeticiones CUG expandidas para liberar MBNL1 endógeno de agregados de ARN-CUGexp y restaurar su localización celular y su función.

Entre los enfoques terapéuticos actualmente en desarrollo para DM1, varios oligonucleótidos modificados o pequeños compuestos dirigidos a los ARN-CUGexp mutantes han mostrado efectos beneficiosos prometedoresin vivo(Mulders et al. 2009; Warf et al. 2009; Wheeler et al. 2009; García-López et al. 2011; Sobczak et al. 2012; Wheeler et al. 2012; Leger et al. 2013). La mayor parte de estas estrategias que revierten el fenotipo muscular de ratones DM1 comparten una característica común: la liberación de parálogos de MBNL secuestrados de los focos de ARN-CUGexp, lo que da lugar a su redistribución/relocalización celular y restaura los parálogos de MBNL funcionales, lo que en última instancia da como resultado la corrección de fenotipos asociados a DM1. Este mecanismo se describió para estrategias que causan la degradación de los ARN-CUGexp o el bloqueo estérico de las repeticiones CUG expandidas. En el presente documento proponemos una nueva terapia génica AAV-ACT3 para la DM1. Una única inyección de AAV-ACT3 fue eficaz para neutralizar la toxicidad de ARN en ratones DM1. A diferencia de los oligonucleótidos sintéticos o compuestos pequeños que requieren tratamientos repetidos, se ha demostrado que los vectores AAV persisten durante varios años en los músculos (Rivera et al.2005), lo que permite la expresión permanente de ACT3 no funcional que puede contrarrestar la expresión continua de ARN-CUGexp tóxico y desencadenar un efecto duradero. Así, proponemos este nuevo enfoque de terapia génica como un valioso enfoque terapéutico alternativo o complementario para DM1.

Referencias

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Claims (16)

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido MBNL modificado que tiene una propiedad de unión a YGCY y que tiene una actividad de empalme reducida en al menos el 60% en comparación con la proteína MBNL de tipo silvestre, para su uso como medicamento, en el que dicho polipéptido no es un péptido quimérico que consiste en un polipéptido MBNL y un resto de direccionamiento.

2. El polipéptido MBNL modificado para su uso según la reivindicación 1, en el que dicho polipéptido se une a repeticiones CUG.

3. El polipéptido MBNL modificado para su uso según la reivindicación 1 o 2, que está derivado de MBNL1, MBNL2 o MBNL3.

4. El polipéptido MBNL modificado para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que está derivado de MBNL1.

5. El polipéptido MBNL modificado para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que carece del dominio C-terminal de la proteína MBNL de tipo silvestre.

6. El polipéptido MBNL modificado para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, derivado de la proteína MBNL1 y que carece de los aminoácidos correspondientes a los exones codificantes 5 a 10 del ARNm de MBNL1, en el que el polipéptido MBNL modificado tiene en particular la secuencia de referencia mostrada en SEQ ID NO: 2 y 3, o es una variante no funcional de unión a YGCY de la misma.

7. El polipéptido MBNL modificado para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que tiene una actividad de empalme reducida en al menos el 75% en comparación con la proteína MBNL de tipo silvestre.

8. Una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido MBNL modificado según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para su uso en el tratamiento de la enfermedad distrofia miotónica, en particular para el tratamiento de DM1 o DM2, o un trastorno provocado por el secuestro anormal de MBNL.

9. La molécula de ácido nucleico para su uso según la reivindicación 8, en la que dicha molécula de ácido nucleico está unida a secuencias de control dentro de un constructo genético.

10. Un constructo genético que es un genoma de vector vírico, que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido MBNL modificado tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 unida operativamente a secuencias de control.

11. El constructo genético según la reivindicación 10, que es un genoma derivado de lentivirus o de AAV.

12. Un vector vírico que comprende el constructo genético según la reivindicación 10 u 11.

13. El vector vírico según la reivindicación 12, que es un vector AAV que tiene una cápside de AAV de serotipo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11.

14. El vector vírico según la reivindicación 13, que es un vector AAV que tiene una cápside de AAV de serotipo 9.

15. Un polipéptido MBNL modificado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, el constructo genético según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 11, o el vector vírico según la reivindicación 12 o 13, para su uso en el tratamiento de la enfermedad distrofia miotónica, en particular para el tratamiento de DM1 o DM2, o un trastorno provocado por el secuestro anormal de MBNL.

16. El vector vírico para su uso según la reivindicación 15, que es un vector AAV, en particular un vector AAV9, que está destinado a administrarse por vía intramuscular o directamente en el SNC o por cualquier vía convencional.