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ES2820548T3 - Métodos y composiciones para modular la expresión de la apolipoproteína (a) - Google Patents

Métodos y composiciones para modular la expresión de la apolipoproteína (a) Download PDF

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ES2820548T3
ES2820548T3 ES13793955T ES13793955T ES2820548T3 ES 2820548 T3 ES2820548 T3 ES 2820548T3 ES 13793955 T ES13793955 T ES 13793955T ES 13793955 T ES13793955 T ES 13793955T ES 2820548 T3 ES2820548 T3 ES 2820548T3
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antisense
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Rosanne Crooke
Mark Graham
Susan Freier
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Original Assignee
Ionis Pharmaceuticals Inc
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Abstract

Un compuesto para disminuir la expresion de apo(a) que comprende un oligonucleotido modificado constituido por de 15 a 30 nucleosidos ligados y que tiene una secuencia de bases nitrogenadas que comprende una porcion de al menos 15 bases nitrogenadas contiguas complementarias a una porcion de igual longitud de las bases nitrogenadas 3900 a 3923 de la SEQ ID NO: 1, y donde la secuencia de bases nitrogenadas del oligonucleotido modificado es complementaria en al menos un 80% a la SEQ ID NO: 1.

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos y composiciones para modular la expresión de la apolipoproteína (a)
Campo
Las realizaciones descritas en la presente divulgan métodos, compuestos y composiciones para reducir la expresión del ARNm y proteína de apolipoproteína (a) en un animal. Tales métodos, compuestos y composiciones son útiles para tratar, prevenir o mejorar enfermedades, trastornos o afecciones cardiovasculares y/o metabólicos.
Antecedentes
Las lipoproteínas son partículas globulares, de tipo micelas que están constituidas por un núcleo apolar de acilgliceroles y ésteres de colesterilo rodeados por un recubrimiento anfifílico de proteínas, fosfolípidos y colesterol. Las lipoproteínas se han clasificado en cinco categorías amplias en función de sus propiedades funcionales y físicas: quilomicrones, lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL, por sus siglas en inglés), lipoproteínas de densidad intermedia (IDL, por sus siglas en inglés), lipoproteínas de baja densidad (LDL, por sus siglas en inglés) y lipoproteínas de alta densidad (HDL, por sus siglas en inglés). Los quilomicrones transportan lípidos de la dieta desde el intestino hasta los tejidos. Los VLDL, IDL y LDL transportan triacilgliceroles y colesterol desde el hígado hasta los tejidos. Los HDL transportan colesterol endógeno desde los tejidos hasta el hígado.
Las partículas lipoproteicas experimentan un procesamiento metabólico continuo y tienen propiedades y composiciones variables. La densidad de las lipoproteínas aumenta sin que aumente el diámetro de la partícula debido a que la densidad de su recubrimiento exterior es menor que la del núcleo interior. Los componentes proteicos de las lipoproteínas se conocen como apolipoproteínas. Se distribuyen al menos nueve apolipoproteínas en cantidades significativas entre las diversas lipoproteínas humanas.
La partícula de la lipoproteína (a) [Lp(a)] se identificó hace casi 50 años y comprende una partícula de LDL sumamente distintiva en la que una proteína de tipo apolipoproteína B (apoB) está ligada mediante un enlace disulfuro a una única proteína de tipo apolipoproteína (a) [apo(a)]. La proteína apo(a) comparte un grado elevado de homología con el plasminógeno, especialmente dentro del dominio repetitivo kringle IV de tipo 2. Los niveles de Lp(a) circulante son inversamente proporcionales al número de repeticiones variables de kringle IV de tipo 2 presentes en la molécula y, ya que ambos alelos se coexpresan en los individuos, pueden mostrar perfiles de isoforma plasmática heterocigótica (Kraft et al., Eur J Hum Genet, 1996; 4(2): 74-87). Se cree que este dominio de repetición kringle en apo(a) puede ser responsable de sus propiedades protrombóticas y antifibrinolíticas, que potencialmente fomentan la evolución aterosclerótica.
Apo(a) es regulada transcripcionalmente por IL-6 y en estudios en pacientes con artritis reumatoide tratados con un inhibidor de IL-6 (tocilizumab), los niveles plasmáticos se vieron reducidos en un 30% después de 3 meses de tratamiento (Schultz et al., PLoS One 2010; 5:e14328).
Se ha mostrado que apo(a) se une preferentemente a fosfolípidos oxidados y potencia la inflamación vascular (Bergmark et al., J Lipid Res 2008; 49:2230-2239; Tsimikas et al., Circulation. 2009; 119(13):1711-1719).
Además, hay estudios que sugieren que la partícula Lp(a) también puede estimular la permeabilidad endotelial, inducir la expresión del inhibidor del activador del plasminógeno de tipo 1 y activar la secreción de interleucina 8 por macrófagos (Koschinsky y Marcovina, Curr Opin Lipidol 2004; 15:167-174). Notablemente, estudios de asociación genética recientes han revelado que Lp(a) era un factor de riesgo independiente de infarto de miocardio, accidente cerebrovascular, enfermedad vascular periférica y aneurisma aórtico abdominal (Rifai et al., Clin Chem 2004; 50:1364-71; Erqou et al., JAMA 2009;302:412-23; Kamstrup et al., Circulation 2008; 117:176-84). Además, en el reciente estudio de la enfermedad arterial coronaria precoz (PROCARDIS), Clarke et al. (Clarke et al., NEJM (2009)361; 2518-2528) se describieron asociaciones robustas e independientes entre la cardiopatía coronaria y concentraciones plasmáticas de Lp(a). Además, Solfrizzi et al. sugirieron que un incremento sérico de Lp(a) puede estar ligado a un incremento en el riesgo de enfermedad de Alzheimer (AD, por sus siglas en inglés) (Solfrizzi et al., J Neurol Neurosurg Psychiatry 2002, 72:732-736. En la actualidad, en el contexto clínico, los ejemplos de inhibidores indirectos de apo(a) para tratar la enfermedad cardiovascular incluyen la aspirina, Niaspan, Mipomersen, Anacetrapib, Epirotiroma y Lomitapida que reducen los niveles plasmáticos de Lp(a) en un 18%, 39%, 32%, 36%, 43% y 17%, respectivamente. Además, se ha utilizado la aféresis de Lp(a) en el contexto clínico para reducir partículas de Lp(a) que contienen apo(a).
El documento WO 2013/173789 describe composiciones de oligonucleótidos antisentido.
El documento WO 2005/000201 describe la modulación de la expresión de la apolipoproteína (a).
Graham et al. (2012) Circulation 126(21) S20, página A11050 describe la inhibición antisentido de la apolipoproteína (a).
Hasta la fecha, las estrategias terapéuticas para tratar la enfermedad cardiovascular actuando directamente sobre los niveles de apo(a) han sido limitados. Se han desarrollado oligonucleótidos de ribozima (patente de EE. UU. 5877022) y oligonucleótidos antisentido (documentos 2005/000201; WO 2003/014397; patente de Ee . UU. 8138328; Merki et al., J Am Coll Cardiol 2011; 57:1611-1621), pero ninguno de los compuestos que tienen como diana directamente apo(a) se utilizan en la actualidad en el entorno clínico.
Por lo tanto, sigue habiendo una clara necesidad médica no cubierta de agentes novedosos que puedan reducir de manera potente y selectiva los niveles de apo(a) en pacientes con un mayor riesgo de eventos cardiovasculares debido a niveles plasmáticos de Lp(a) elevados de manera crónica.
Compendio
La invención proporciona un compuesto para disminuir la expresión de apo(a) que comprende un oligonucleótido modificado constituido por de 15 a 30 nucleósidos ligados y que tiene una secuencia de bases nitrogenadas que comprende una porción de al menos 15 bases nitrogenadas contiguas complementarias a una porción de igual longitud de las bases nitrogenadas 3900 a 3923 de la SEQ ID NO: 1, y donde la secuencia de bases nitrogenadas del oligonucleótido modificado es complementaria en al menos un 80% a la SEQ ID NO: 1.
La invención proporciona además un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado constituido por 20 nucleósidos ligados y que tiene una secuencia de bases nitrogenadas de la SEQ ID NO: 58, donde el oligonucleótido modificado comprende:
un segmento gap constituido por diez desoxinucleósidos ligados;
un segmento lateral (wing) en 5' constituido por cinco nucleósidos ligados;
un segmento lateral (wing) en 3' constituido por cinco nucleósidos ligados;
donde el segmento gap se ubica entre el segmento lateral en 5' y el segmento lateral en 3', donde cada nucleósido de cada segmento lateral comprende un 2'-0-metoxietilazúcar, donde cada unión internucleosídica es una unión fosforotioato y donde cada residuo de citosina es una 5-metilcitosina.
La invención proporciona además una composición que comprende un compuesto de la invención, donde opcionalmente el compuesto es una sal, y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
La invención proporciona además el compuesto o composición de la invención para su uso en terapia.
COMPENDIO DE LA DIVULGACIÓN
En la presente se divulgan composiciones y métodos para modular la expresión de ARNm y proteína de apo(a). En ciertos casos, el inhibidor específico para apo(a) disminuye la expresión de ARNm y proteína de apo(a).
En ciertos casos, la composición es un inhibidor específico para apo(a). En ciertos casos, el inhibidor específico para apo(a) es un ácido nucleico, proteína o molécula de bajo peso molecular. En ciertos casos, el inhibidor específico para apo(a) es un oligonucleótido antisentido que tiene como diana apo(a). En ciertos casos, el inhibidor específico para apo(a) es un oligonucleótido modificado constituido por de 12 a 30 nucleósidos ligados y que comprende una secuencia de bases nitrogenadas que comprende una porción de al menos 8 bases nitrogenadas contiguas complementarias a una porción de igual longitud de las bases nitrogenadas 3901 a 3920 de la SEQ ID NO: 1, donde la secuencia de bases nitrogenadas del oligonucleótido modificado es complementaria en al menos un 80% a la SEQ ID NO: 1. En ciertos casos, el inhibidor específico para apo(a) es un oligonucleótido modificado constituido por de 12 a 30 nucleósidos ligados y que tiene una secuencia de bases nitrogenadas que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 o 20 bases nitrogenadas contiguas de la secuencia de bases nitrogenadas de la SEQ ID NO: 1-130, 133, 134. En ciertos casos, el inhibidor específico para apo(a) es un oligonucleótido modificado constituido por 20 nucleósidos ligados y que comprende una secuencia de bases nitrogenadas que comprende al menos 8 bases nitrogenadas contiguas de cualquiera de la SEQ ID NO: 58, donde el oligonucleótido modificado comprende: (a) un segmento gap constituido por diez desoxinucleósidos ligados; (b) un segmento lateral en 5' constituido por cinco nucleósidos ligados; (c) un segmento lateral en 3' constituido por cinco nucleósidos ligados; y donde el segmento gap se ubica entre el segmento lateral en 5' y el segmento lateral en 3', donde cada nucleósido de cada segmento lateral comprende un 2'-0-metoxietilazúcar, donde cada unión internucleosídica es una unión fosforotioato y donde cada residuo de citosina es una 5-metilcitosina.
Ciertos casos de la divulgación incluyen una composición que comprende un compuesto descrito en la presente, o una sal de este, y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
En ciertos casos, la modulación de la expresión de apo(a) ocurre en una célula o tejido. En ciertos casos, la modulación ocurre en una célula o tejido en un animal. En ciertos casos, el animal es un ser humano. En ciertos casos, la modulación es una reducción en el nivel de ARNm de apo(a). En ciertos casos, la modulación es una reducción en el nivel de proteína de apo(a). En ciertos casos, se reducen los niveles de ARNm y de proteína de apo(a). Tal reducción puede depender del tiempo o depender de la dosis.
Ciertos casos de la divulgación incluyen composiciones y métodos para su uso en la terapia. Ciertos casos de la divulgación incluyen composiciones y métodos para prevenir, tratar, retrasar, ralentizar la evolución y/o mejorar las enfermedades, trastornos y afecciones relacionados con apo(a). Ciertos casos de la divulgación incluyen composiciones y métodos para prevenir, tratar, retrasar, ralentizar la evolución y/o mejorar las enfermedades, trastornos y afecciones relacionados con Lp(a). En ciertos casos, tales enfermedades, trastornos y afecciones son enfermedades, trastornos y afecciones inflamatorios, cardiovasculares y/o metabólicos. En ciertos casos, las composiciones y métodos para la terapia incluyen administrar un inhibidor específico para apo(a) a un individuo que lo necesite. En ciertos casos, el inhibidor específico para apo(a) es un ácido nucleico. En ciertos casos, el ácido nucleico es un compuesto antisentido. En ciertos casos, el compuesto antisentido es un oligonucleótido modificado.
Descripción detallada
Se debe entender que tanto la descripción general anterior como la descripción detallada siguiente son únicamente ejemplares y explicatorias, y no restrictivas de la invención tal como se reivindica. En la presente, el uso del singular incluye el plural a menos que se afirme específicamente lo contrario. Tal como se utiliza en la presente, el uso de «o» significa «y/o» a menos que se afirme lo contrario. Adicionalmente, tal como se utiliza en la presente, el uso de «y» significa «y/o» a menos que se afirme lo contrario. Además, el uso de la expresión «que incluye», así como también otras formas, tales como «incluye» e «incluido», no es limitante. Asimismo, términos tales como «elemento» o «componente» engloban ambos elementos y componentes que comprenden una unidad y elementos y componentes que comprenden más de una subunidad, a menos que se afirme específicamente lo contrario.
Los títulos de sección utilizados en la presente solo tienen fines organizativos y no se deben interpretar como limitantes de la materia descrita.
Definiciones
A menos que se proporcionen definiciones específicas, la nomenclatura utilizada en relación con, y los procedimientos de laboratorio y técnicas de, química analítica, química orgánica sintética, y química médica y farmacéutica que se describen en la presente son los conocidos en la técnica y de uso común en la técnica. Se pueden utilizar técnicas estándar para la síntesis química y análisis químico.
A menos que se indique lo contrario, los siguientes términos tienen los siguientes significados:
«2'-0-metoxietilo» (también 2'-MOE, MOE, 2'-O(CH2)2-OCH3 y 2'-0-(2-metoxietilo)) se refiere a una modificación de tipo O-metoxietilo de la posición 2' del anillo furanosilo. Un azúcar con una modificación de tipo 2’-0-metoxietilo es un azúcar modificado.
«2-Desoxirribonucleósido» se refiere a un nucleósido que comprende un resto de azúcar 2’-H-furanosilo, como se observa en los desoxirribonucleósidos de origen natural (ADN).
«2’-MOE-nucleósido» (también 2’-0-metoxietilnucleósido) se refiere a un nucleósido que comprende un resto de azúcar con una modificación de tipo 2’-MOE. «2’-0-metoxietilnucleótido» se refiere a un nucleótido que comprende un resto de azúcar con una modificación de tipo 2’-0-metoxietilo.
«3-Fluoro-HNA» (también «F-HNA» o «3’-F-HNA») se refiere al resto de azúcar de un nucleósido que tiene la siguiente estructura:
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donde Bx es una base nitrogenada.
«Sitio diana 3’» se refiere al nucleótido de un ácido nucleico diana que es complementario al nucleótido en la posición del extremo 3’ de un compuesto antisentido particular.
«Sitio diana 5’» se refiere al nucleótido de un ácido nucleico diana que es complementario al nucleótido en la posición del extremo 5’ de un compuesto antisentido particular.
«5-Metilcitosina» se refiere a una citosina modificada con un grupo metilo unido a la posición 5’. Una 5-metilcitosina es una base nitrogenada modificada.
«Aproximadamente» significa dentro de un ±10% de un valor. Por ejemplo, si se afirma que «un marcador puede haber aumentado en aproximadamente un 50%», se sugiere que el marcador puede haber aumentado entre un 45%-55%.
«Agente farmacéutico activo» se refiere a la sustancia o sustancias en una composición farmacéutica que proporcionan un beneficio terapéutico cuando se administran a un individuo. Por ejemplo, en ciertos casos, un oligonucleótido antisentido que tiene como diana apo(a) es un agente farmacéutico activo.
«Región diana activa» o «región diana» se refiere a una región a la que están dirigidos uno o más compuestos antisentido activos. «Compuestos antisentido activos» se refiere a compuestos antisentido que reducen los niveles de ácido nucleico o niveles de proteína diana.
«Administrado simultáneamente» se refiere a la administración conjunta de dos agentes de manera que los efectos farmacológicos de ambos se manifiestan en el paciente a la vez. La administración simultánea no requiere que ambos agentes se administren en una única composición farmacéutica, en la misma forma farmacéutica o mediante la misma vía de administración. No es necesario que los propios efectos de ambos agentes se manifiesten a la vez. Solo es necesario que los efectos se superpongan durante un periodo de tiempo y no es necesario que sean coextensivos.
«Administrar» o «administración» se refiere a proporcionar un agente farmacéutico a un individuo e incluye, sin carácter limitante, la administración por parte de un profesional médico y la autoadministración. La administración de un agente farmacéutico a un individuo puede ser continua, crónica, poco prolongada o intermitente. La administración puede ser parenteral o no parenteral.
«Agente» se refiere a una sustancia activa que puede proporcionar un beneficio terapéutico cuando se administra a un animal. «Primer agente» se refiere a un compuesto terapéutico de la invención. Por ejemplo, un primer agente puede ser un oligonucleótido antisentido que tiene como diana apo(a). «Segundo agente» se refiere a un segundo compuesto terapéutico de la invención (por ejemplo, un segundo oligonucleótido antisentido que tiene como diana apo(a)) y/o un compuesto terapéutico que no es apo(a).
«Mejora» o «mejorar» o «que mejora» se refiere a una reducción de al menos un indicador, signo o síntoma de una enfermedad, trastorno o afección asociados. La gravedad de los indicadores se puede determinar mediante medidas subjetivas u objetivas, que conocen los expertos en la técnica.
«Animal» se refiere a un animal humano o no humano, incluidos, sin carácter limitante, ratones, ratas, conejos, perros, gatos, cerdos y primates no humanos incluidos, sin carácter limitante, monos y chimpancés.
«Anticuerpo» se refiere a una molécula caracterizada por que reacciona de manera específica con un antígeno de alguna manera, donde el anticuerpo y el antígeno se definen cada uno en relación con el otro. Anticuerpo se puede referir a una molécula de anticuerpo completo o cualquier fragmento o región de este, tal como la cadena pesada, la cadena ligera, región Fab y región Fc.
«Actividad antisentido» se refiere a cualquier actividad detectable o medible atribuible a la hibridación de un compuesto antisentido con su ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, la actividad antisentido es una disminución en la cantidad o expresión de un ácido nucleico diana o proteína codificada por tal ácido nucleico diana.
«Compuesto antisentido» se refiere a un compuesto oligomérico que es capaz de experimentar hibridación con un ácido nucleico diana mediante enlaces de hidrógeno. Los ejemplos de compuestos antisentido incluyen compuestos monocatenarios y bicatenarios tales como oligonucleótidos antisentido, ARNip, ARNhc, ARNnop, miARN y repeticiones satélite. Tal como se utiliza en la presente, la expresión «compuesto antisentido» engloba derivados farmacéuticamente aceptables de los compuestos descritos en la presente.
«Inhibición antisentido» significa reducción de los niveles de ácido nucleico diana o niveles de proteína diana en presencia de un compuesto antisentido complementario a un ácido nucleico diana en comparación con los niveles de ácido nucleico diana o niveles de proteína diana en ausencia del compuesto antisentido.
«Oligonucleótido antisentido» se refiere a un oligonucleótido monocatenario que tiene una secuencia de bases nitrogenadas que permite la hibridación con una región correspondiente o segmento de un ácido nucleico diana. Tal como se utiliza en la presente, la expresión «oligonucleótido antisentido» engloba derivados farmacéuticamente aceptables de los compuestos descritos en la presente.
«Apo(a)» se refiere a cualquier secuencia de ácido nucleico o proteína que codifica apo(a). Por ejemplo, en ciertos casos, apo(a) incluye una secuencia de ADN que codifica apo(a), una secuencia de ARN transcrita a partir de ADN que codifica apo(a) (incluido el ADN genómico que comprende intrones y exones), una secuencia de ARNm que codifica apo(a) o una secuencia peptídica que codifica apo(a).
«Ácido nucleico de apo(a)» se refiere a cualquier ácido nucleico que codifica apo(a). Por ejemplo, en ciertos casos, un ácido nucleico de apo(a) incluye una secuencia de ADN que codifica apo(a), una secuencia de ARN transcrita a partir de ADN que codifica apo(a) (incluido el ADN genómico que comprende intrones y exones) y una secuencia de ARNm que codifica apo(a).
«ARNm de apo(a)» se refiere a un ARNm que codifica una proteína apo(a).
«Proteína apo(a)» se refiere a cualquier secuencia de proteína que codifica apo(a).
«Inhibidor específico para apo(a)» se refiere a cualquier agente capaz de inhibir de manera específica la expresión de un ácido nucleico de apo(a) y/o proteína apo(a). Por ejemplo, los inhibidores específicos de apo(a) incluyen ácidos nucleicos (incluidos compuestos antisentido), péptidos, anticuerpos, moléculas de bajo peso molecular, y otros agentes capaces de inhibir la expresión de ácido nucleico de apo(a) y/o proteína apo(a). En ciertos casos, modulando de manera específica la expresión de ácido nucleico de apo(a) y/o expresión de la proteína apo(a), los inhibidores específicos de apo(a) pueden afectar a otros componentes del sistema de transporte de lípidos incluidos los componentes posteriores. De manera similar, en ciertos casos, los inhibidores específicos de apo(a) pueden afectar a otros procesos moleculares en un animal.
«Aterosclerosis» se refiere a un endurecimiento de las arterias que afecta a arterias de tamaño grande y medio y se caracteriza por la presencia de depósitos grasos. Los depósitos grasos se denominan «ateromas» o «placas», que están constituidos principalmente por colesterol y otras grasas, calcio y tejido cicatricial, y daño en el revestimiento de las arterias.
«Azúcar bicíclico» se refiere a un anillo furanosilo modificado por el puente entre dos átomos. Un azúcar bicíclico es un azúcar modificado.
«Nucleósido bicíclico» (también BNA, por sus siglas en inglés) se refiere a un nucleósido que tiene un resto de azúcar que comprende un puente que conecta dos átomos de carbono del anillo de azúcar, y de esta manera forma un sistema anular bicíclico. En ciertas realizaciones, el puente conecta el carbono 4' y el carbono 2' del anillo de azúcar.
«Estructura de caperuza» o «resto de caperuza terminal» se refiere a modificaciones químicas, que se han incorporado en cualquier extremo de un compuesto antisentido.
«Enfermedad cardiovascular» o «trastorno cardiovascular» se refiere a un grupo de afecciones relacionadas con el corazón, vasos sanguíneos o la circulación. Los ejemplos de enfermedades cardiovasculares incluyen, sin carácter limitante, aneurisma, angina, arritmia, aterosclerosis, enfermedad cerebrovascular (accidente cerebrovascular), cardiopatía coronaria, hipertensión, dislipidemia, hiperlipidemia, hipertrigliceridemia e hipercolesterolemia.
«Región distinta desde un punto de vista químico» se refiere a una región de un compuesto antisentido que de alguna manera es diferente desde un punto de vista químico a otra región del mismo compuesto antisentido. Por ejemplo, una región que tiene 2'-0-metoxietilnucleótidos es distinta químicamente de una región que tiene nucleótidos sin las modificaciones de tipo 2'-0-metoxietilo.
«Compuesto antisentido quimérico» se refiere a un compuesto antisentido que tiene al menos dos regiones distintas desde un punto de vista químico.
«Colesterol» es una molécula de esterol detectadas en las membranas celulares de todos los tejidos animales. El colesterol debe ser transportado en el plasma sanguíneo de un animal por lipoproteínas que incluyen las lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), lipoproteínas de densidad intermedia (IDL), lipoproteínas de baja densidad (LDL) y lipoproteínas de alta densidad (HDL). «Colesterol plasmático» se refiere a la suma de todas las lipoproteínas (VDL, IDL, LDL, HDL), colesterol esterificado y/o no esterificado presentes en el plasma o suero.
«Inhibidor de la absorción de colesterol» se refiere a un agente que inhibe la absorción de colesterol exógeno obtenido de la dieta.
«Administración conjunta» se refiere a la administración de dos o más agentes a un individuo. Los dos o más agentes pueden estar en una composición farmacéutica única o pueden estar en composiciones farmacéuticas separadas. Cada uno de los dos o más agentes se puede administrar a través de la misma o de diferentes vías de administración. La administración conjunta engloba la administración en paralelo o secuencial.
«Complementariedad» se refiere a la capacidad de apareamiento entre bases nitrogenadas de un primer ácido nucleico y un segundo ácido nucleico. En ciertas realizaciones, la complementariedad entre el primer y el segundo ácido nucleico puede ser entre dos hebras de ADN, entre dos hebras de ARN o entre una hebra de ADN y una de ARN. En ciertas realizaciones, algunas de las bases nitrogenadas en una hebra se emparejan con una base con enlace de hidrógeno complementaria en la otra hebra. En ciertas realizaciones, todas las bases nitrogenadas en una hebra se emparejan con una base con enlace de hidrógeno complementaria en la otra hebra. En ciertos casos, un primer ácido nucleico es un compuesto antisentido y un segundo ácido nucleico es un ácido nucleico diana. En ciertos casos de este tipo, un oligonucleótido antisentido es un primer ácido nucleico y un ácido nucleico diana es un segundo ácido nucleico.
«Etilo restringido» o «cEt» se refiere a un nucleósido bicíclico que tiene un azúcar furanosilo que comprende un puente de metil(metilenoxi) (4'-CH(CH3)-O-2') entre los átomos de carbono 4' y 2'.
«Nucleósido con etilo restringido» (también nucleósido cEt) se refiere a un nucleósido que comprende un resto de azúcar bicíclico que comprende un puente 4'-CH(CH3)-O-2'.
«Bases nitrogenadas contiguas» se refiere a bases nitrogenadas inmediatamente adyacentes entre sí.
«Con reactividad cruzada» se refiere a un compuesto oligomérico que tiene como diana una secuencia de ácido nucleico que se puede hibridar con una secuencia de ácido nucleico diferente. Por ejemplo, en algunos casos un oligonucleótido antisentido que tiene como diana apo(a) humana puede presentar reactividad cruzada con apo(a) de otra especie. Que un compuesto oligomérico presente reactividad cruzada con una secuencia de ácido nucleico que no es la diana designada depende del grado de complementariedad que el compuesto tenga con la secuencia de ácido nucleico no diana. Cuanto mayor sea la complementariedad entre el compuesto oligomérico y el ácido nucleico no diana, más probable será que el compuesto oligomérico presente reactividad cruzada con el ácido nucleico.
«Cura» se refiere a un método que restaura la salud o un tratamiento prescrito para una enfermedad.
«Cardiopatía coronaria (CHD, por sus siglas en inglés)» se refiere a un estrechamiento de los vasos sanguíneos pequeños que proporcionan sangre y oxígeno al corazón, que a menudo es el resultado de la aterosclerosis.
«Desoxirribonucleótido» se refiere a un nucleótido que tiene un hidrógeno en la posición 2' de la porción de azúcar del nucleótido. Los desoxirribonucleótidos se pueden modificar con una variedad de sustituyentes.
«Diabetes mellitus» o «diabetes» es un síndrome caracterizado por un metabolismo desorganizado y una cantidad de azúcar en sangre anómalamente elevada (hiperglicemia) resultado de niveles insuficientes de insulina o una sensibilidad reducida a la insulina. Los síntomas característicos son una producción de orina excesiva (poliuria) debido a los niveles elevados de glucosa en sangre, sed excesiva y aumento del consumo de líquidos (polidipsia) en un intento de compensar el aumento de orina, visión borrosa debido a los efectos de la glucosa en sangre elevada en el sistema óptico del ojo, pérdida de peso sin explicación y letargia.
«Dislipidemia diabética» o «diabetes de tipo 2 con dislipidemia» se refiere a una afección caracterizada por diabetes de tipo 2, reducción de HDL-C, elevación de triglicéridos (TG), y elevación de las partículas pequeñas y densas LDL.
«Diluyente» se refiere a un ingrediente en una composición que carece de actividad farmacológica pero es deseable o necesario desde un punto de vista farmacéutico. Por ejemplo, el diluyente en una composición inyectada puede ser un líquido, por ejemplo, solución salina.
«Dislipidemia» se refiere a un trastorno del metabolismo de lípidos y/o lipoproteínas, que incluye la sobreproducción o deficiencia de lípidos y/o lipoproteínas. Las dislipidemias se pueden manifestar mediante la elevación de lípidos tales como quilomicrones, colesterol y triglicéridos así como también lipoproteínas tales como la lipoproteína de baja densidad (LDL) colesterol.
«Unidad de dosificación» se refiere a una forma en la que se proporciona un agente farmacéutico, por ejemplo, pastilla, comprimido, u otra unidad de dosificación conocida en la técnica. En ciertas realizaciones, una unidad de dosificación es un vial que contiene un oligonucleótido antisentido liofilizado. En ciertas realizaciones, una unidad de dosificación es un vial que contiene un oligonucleótido antisentido reconstituido.
«Dosis» se refiere a una cantidad especificada de un agente farmacéutico proporcionada en una única administración, o en un periodo de tiempo especificado. En ciertos casos, una dosis se puede administrar en uno, dos o más bolos, comprimidos o inyecciones. Por ejemplo, en ciertos casos donde se desea la administración subcutánea, la dosis deseada requiere un volumen que no se puede acomodar con facilidad en una única inyección, por lo tanto, se pueden utilizar dos o más inyecciones para conseguir la dosis deseada. En ciertos casos, el agente farmacéutico se administra por infusión a lo largo de un periodo de tiempo prolongado o de manera continua. Las dosis se pueden indicar como la cantidad de agente farmacéutico por hora, día, semana o mes. Las dosis también se pueden indicar como mg/kg o g/kg.
«Cantidad eficaz» o «cantidad terapéuticamente eficaz» se refiere a la cantidad de agente farmacéutico activo suficiente para conseguir un resultado fisiológico deseado en un individuo que necesita el agente. La cantidad eficaz puede variar entre los individuos dependiendo de la salud y el estado físico del individuo que se vaya a tratar, el grupo taxonómico de los individuos que se vayan a tratar, la formulación de la composición, la evaluación del estado médico del individuo y otros factores relevantes.
«Totalmente complementario» o «complementario en un 100%» significa que cada base nitrogenada de una secuencia de bases nitrogenadas de un primer ácido nucleico tiene una base nitrogenada complementaria en una segunda secuencia de bases nitrogenadas de un segundo ácido nucleico. En ciertos casos, un primer ácido nucleico es un compuesto antisentido y un segundo ácido nucleico es un ácido nucleico diana.
«Furanosilo» se refiere a una estructura que comprende un anillo de 5 miembros que comprende cuatro átomos de carbono y un átomo de oxígeno.
«Gápmero» se refiere a un compuesto antisentido quimérico en el que una región interna que tiene una pluralidad de nucleósidos que favorecen la escisión por RNasaH se dispone entre regiones externas que tienen uno o más nucleósidos, donde los nucleósidos que comprende la región interna son distintos desde un punto de vista químico del nucleósido o nucleósidos que comprenden las regiones externas. La región interna se puede denominar «gap» y las regiones externas se pueden denominar los «laterales».
«Gap ampliado» se refiere a un compuesto antisentido quimérico que tiene un segmento gap de 12 o más 2'-desoxirribunucleósidos contiguos ubicados entre e inmediatamente adyacentes a los segmentos laterales en 5' y 3' que tienen de uno a seis nucleósidos.
«Glucosa» es un monosacárido utilizado por las células como fuente de energía e intermedio inflamatorio. «Glucosa plasmática» se refiere a la glucosa presente en el plasma.
«Lipoproteína de alta densidad-C» o «HDL-C» se refiere al colesterol asociado con partículas lipoproteicas de alta densidad. La concentración de HDL-C en suero (o plasma) se cuantifica habitualmente en mg/dL o nmol/L. «HDL-C sérica» y «HDL-C plasmática» se refieren a la HDL-C en suero y plasma, respectivamente.
«Inhibidor de la HMG-CoA-reductasa» se refiere a un agente que actúa mediante la inhibición de la enzima HMG-CoA-reductasa, tal como atorvastatina, rosuvastatina, fluvastatina, lovastatina, pravastatina y simvastatina.
«Hibridación» se refiere al apareamiento de moléculas de ácido nucleico complementarias. En ciertos casos, las moléculas de ácido nucleico complementarias incluyen un compuesto antisentido y un ácido nucleico diana.
«Hipercolesterolemia» se refiere a una afección caracterizada por la elevación de colesterol o colesterol circulante (plasma), LDL-colesterol y VLDL-colesterol, según las directrices del Informe del Grupo de Expertos del Programa de Educación Nacional sobre Colesterol (NCEP, por sus siglas en inglés) para la Detección, Evaluación y Tratamiento del colesterol elevado en adultos (véase, Arch. Int. Med. (1988) 148, 36-39).
«Hiperlipidemia» o «hiperlipemia» es una afección caracterizada por una elevación de lípidos séricos o lípidos circulantes (plasmáticos). Esta afección se manifiesta en una concentración anómalamente elevada de grasas. Las fracciones lipídicas en la sangre circulante son colesterol, lipoproteínas de baja densidad, lipoproteínas de muy baja densidad, quilomicrones y triglicéridos. La clasificación de Fredrickson de hiperlipidemias se basa en el patrón de TG y partículas lipoproteicas ricas en colesterol, medidos por electroforesis o ultracentrifugación y se utiliza habitualmente para caracterizar las causas primarias de hiperlipidemias tales como hipertrigliceridemia (Fredrickson y Lee, Circulation, 1965, 31:321-327; Fredrickson et al., New Eng J Med, 1967, 276 (1): 34-42).
«Hipertrigliceridemia» se refiere a una afección caracterizada por niveles elevados de triglicéridos. Su etiología incluye factores primarios (es decir, causas genéticas) y secundarios (otras causas subyacentes tales como diabetes, síndrome metabólico/resistencia a la insulina, obesidad, inactividad física, consumo de cigarrillos, alcohol en exceso y una dieta muy rica en carbohidratos) o, más a menudo, una combinación de ambos (Yuan et al. CMAJ, 2007, 176: 1113-1120).
«Identificar» o «seleccionar un animal con enfermedad metabólica o cardiovascular» se refiere a identificar o seleccionar a un sujeto con tendencia, o al que se le ha diagnosticado, una enfermedad metabólica, una enfermedad cardiovascular o un síndrome metabólico; o identificar o seleccionar a un sujeto que tiene cualquier síntoma de una enfermedad metabólica, enfermedad cardiovascular o síndrome metabólico incluidos, sin carácter limitante, hipercolesterolemia, hiperglicemia, hiperlipidemia, hipertrigliceridemia, hipertensión aumento de la resistencia a la insulina, reducción de la sensibilidad a la insulina, peso corporal superior al normal y/o contenido graso en el cuerpo superior al normal o cualquier combinación de estos. Tal identificación se puede conseguir mediante cualquier método incluidos, sin carácter limitante, evaluaciones o pruebas clínicas estándar como la medida de colesterol sérico o circulante (plasmático), medida de la glucosa sanguínea sérica o circulante (plasmática), medida de triglicéridos séricos o circulantes (plasmáticos), medida de la tensión arterial, medida del contenido graso del cuerpo, medida del peso corporal y similares.
«Mejora de la respuesta cardiovascular» se refiere a una reducción en la aparición de eventos cardiovasculares adversos, o el riesgo de estos. Los ejemplos de eventos cardiovasculares adversos incluyen, sin carácter limitante, fallecimiento, reinfarto, accidente cerebrovascular, choque cardiógeno, edema pulmonar, parada cardiaca y disritmia auricular.
«Inmediatamente adyacente» significa que no hay elementos intermedios entre los elementos inmediatamente adyacentes, por ejemplo, entre regiones, segmentos, nucleótidos y/o nucleósidos.
«Aumento de HDL» o «elevación de HDL» se refiere al aumento del nivel de HDL en un animal después de la administración de al menos un compuesto de la invención, en comparación con el nivel de HDL en un animal al que no se le ha administrado ningún compuesto.
«Individuo» o «sujeto» o «animal» se refiere a un animal humano o no humano seleccionado para el tratamiento o terapia. «Individuo que lo necesita» se refiere a un animal humano o no humano seleccionado para el tratamiento o terapia que necesita tal tratamiento o terapia.
«Inducir», «inhibir», «potenciar», «elevar», «aumentar», «disminuir», «reducir» o similares denotan las diferencias cuantitativas entre dos estados. Por ejemplo, «una cantidad eficaz para inhibir la actividad o expresión de apo(a)» se refiere a que el nivel de actividad o expresión de apo(a) en una muestra tratada diferirá del nivel de actividad o expresión de apo(a) en una muestra no tratada. Tales términos se aplican, por ejemplo, a los niveles de expresión y niveles de actividad.
«Afección inflamatoria» se refiere a una enfermedad, estado patológico, síndrome u otra afección que da como resultado inflamación. Por ejemplo, la artritis reumatoide y fibrosis hepática son afecciones inflamatorias. Otros ejemplos de afecciones inflamatorias incluyen la septicemia, lesión por isquemia/reperfusión de miocardio, síndrome de dificultad respiratoria aguda, nefritis, rechazo del injerto, enfermedad intestinal inflamatoria, esclerosis múltiple, arteriosclerosis, aterosclerosis y vasculitis.
«Inhibición de la expresión o actividad» se refiere a una reducción o bloqueo de la expresión o actividad de un ARN o proteína y no indica necesariamente la eliminación total de la expresión o actividad.
La «resistencia a la insulina» se define como la afección en la que las cantidades normales de insulina son inadecuadas para producir una respuesta normal a la insulina por parte de las células hepáticas, musculares y grasas. La resistencia a la insulina en las células grasas da como resultado la hidrólisis de triglicéridos almacenados, que eleva los ácidos grasos libre en el plasma sanguíneo. La resistencia a la insulina en el músculo reduce la captación de glucosa mientras que la resistencia a la insulina en el hígado reduce el almacenamiento de glucosa, y ambos efectos sirven para elevar la glucosa sanguínea. Los niveles plasmáticos elevados de insulina y glucosa debido a la resistencia a la insulina a menudo dan lugar al síndrome metabólico y diabetes de tipo 2.
La «sensiblidad a la insulina» es una medida de la eficacia con la que un individuo procesa la glucosa. Un individuo que tiene una sensibilidad a la insulina elevada procesa de manera eficaz la glucosa mientras que un individuo con una sensibilidad a la insulina baja no procesa de manera eficaz la glucosa.
«Unión internucleosídica» se refiere al enlace químico entre nucleósidos.
«Administración intravenosa» se refiere a la administración por una vena.
«Nucleósidos ligados» se refiere a nucleósidos adyacentes que están unidos entre sí.
«Reducción de lí pidos» se refiere a una reducción en uno o más lípidos (por ejemplo, LDL, VLDL) en un sujeto. «Elevación de lípidos» se refiere a un aumento en un lípido en un sujeto (por ejemplo, HDL). La reducción de lípidos o la elevación de lípidos puede ocurrir con una o más dosis en el tiempo.
«Terapia de reducción de lípidos» o «agente de reducción de lípidos» se refiere a un régimen terapéutico proporcionado a un sujeto para reducir uno o más lípidos en un sujeto. En ciertas realizaciones, se proporciona una terapia de reducción de lípidos para reducir uno o más de apo(a), CETP, apoB, colesterol total, LDL-C, v Ld L-C, IDL-C, no HDL-C, triglicéricos, partículas de LDL pequeñas y densas y Lp(a) en un sujeto. Los ejemplos de la terapia de reducción de lípidos incluyen, sin carácter limitante, inhibidores de apoB, estatinas, fibratos e inhibidores de MTP.
«Lipoproteína», tal como VLDL, LDL y HDL, se refiere a un grupo de proteínas detectado en el suero, plasma y linfa y que son importantes para el transporte de lípidos. La composición química de cada lipoproteína difiere, por ejemplo, en que el HDL tiene una proporción más elevada de proteínas respecto a lípidos, mientras que VLDL tiene una proporción más baja de proteínas respecto a lípidos.
«Lp(a)» comprende apo(a) y una partícula de tipo LDL que contiene apoB. La apo(a) se liga al apoB mediante un enlace disulfuro.
«Lipoproteína de baja densidad-colesterol (LDL-C)» se refiere a colesterol portado por partículas lipoproteicas de baja densidad. La concentración de LDL-C en suero (o plasma) se cuantifica habitualmente en mg/dL o nmol/L. «LDL-C sérica» y «LDL-C plasmática» se refieren a la LDL-C en suero y plasma, respectivamente.
«Factores de riesgo importantes» se refiere a factores que contribuyen a un riesgo elevado de una enfermedad o afección particular. En ciertos casos, los factores de riesgo importantes para la cardiopatía coronaria incluyen, sin carácter limitante, consumo de cigarrillos, hipertensión, LDL elevado, HDL-C bajo, antecedentes familiares de cardiopatía coronaria, edad y otros factores divulgados en la presente.
«Trastorno metabólico» o «enfermedad metabólica» se refiere a una afección caracterizada por una alteración o perturbación de la función metabólica. «Metabólico» y «metabolismo» son términos muy conocidos en la técnica y, por lo general, incluyen toda la gama de procesos bioquímicos que ocurren en un organismo vivo. Los trastornos metabólicos incluyen, sin carácter limitante, hiperglicemia, prediabetes, diabetes (de tipo 1 y de tipo 2), obesidad, resistencia a la insulina, síndrome metabólico y dislipidemia debida a la diabetes de tipo 2.
«Síndrome metabólico» se refiere a una afección caracterizada por un agrupamiento de factores de riesgo cardiovasculares lipídicos y no lipídicos de origen metabólico. En ciertas realizaciones, el síndrome metabólico está identificado por la presencia de 3 cualesquiera de los siguientes factores: circunferencia de la cintura superior a 102 cm en los hombres o superior a 88 cm en mujeres; triglicéridos séricos de al menos 150 mg/dL; HDL-C inferior a 40 mg/dL en hombres e inferior a 50 mg/dL en mujeres; tensión arterial de al menos 130/85 mmHg; y glucosa en ayunas de al menos 110 mg/dL. Estos determinantes se pueden medir fácilmente en la práctica clínica (JAMA, 2001,285: 2486-2497).
«Emparejamiento erróneo» o «base nitrogenada no complementaria» se refiere al caso en el que una base nitrogenada de un primer ácido nucleico no es capaz de aparearse con la correspondiente base nitrogenada de un segundo ácido nucleico o ácido nucleico diana.
«Dislipidemia mixta» se refiere a una afección caracterizada por colesterol elevado y triglicéridos elevados.
«Unión internucleosídica modificada» se refiere a una sustitución o cualquier cambio en un enlace internucleosídico de origen natural (es decir, un enlace internucleosídico fosfodiéster). Por ejemplo, una unión fosforotioato es una unión internucleosídica modificada.
«Base nitrogenada modificada» se refiere a cualquier base nitrogenada que no es adenina, citosina, guanina, timidina o uracilo. Por ejemplo, 5-metilcitosina es una base nitrogenada modificada. Una «base nitrogenada no modificada» se refiere a las bases de purina adenina (A) y guanina (G), y las bases de pirimidina timina (T), citosina (C) y uracilo (U).
«Nucleósido modificado» se refiere a un nucleósido que tiene al menos un resto de azúcar modificado, y/o una nucleobase modificada.
«Nucleótido modificado» se refiere a un nucleótido que tiene al menos un resto de azúcar modificado, unión internucleosídica modificada y/o una nucleobase modificada.
«Oligonucleótido modificado» se refiere a un oligonucleótido que comprende al menos un nucleótido modificado.
«Azúcar modificado» se refiere a una sustitución o cambio respecto a un azúcar natural. Por ejemplo, un azúcar con una modificación de tipo 2'-0-metoxietilo es un azúcar modificado.
«Nucleósido MOE» se refiere a un nucleósido que comprende un resto de azúcar con sustitución en la posición 2' que comprende MOE en la posición 2'.
«Motivo» se refiere al patrón de regiones distintas desde un punto de vista químico en un compuesto antisentido.
«Unión internucleosídica de origen natural» se refiere a una unión fosfodiéster de 3' a 5'.
«Resto de azúcar natural» se refiere a un azúcar observado en ADN (2'-H) o ARN (2'-OH).
«Ácido nucleico» se refiere a moléculas compuestas de nucleótidos monoméricos. Un ácido nucleico incluye ácidos ribonucleicos (RNA), ácidos desoxirribonucleicos (ADN), ácidos nucleicos monocatenarios (ADNmc), ácidos nucleicos bicatenarios (ADNbc), ácidos ribonucleicos interferentes pequeños (ARNip) y microARN (miARN). Un ácido nucleico también puede comprender cualquier combinación de estos elementos en una única molécula.
«Base nitrogenada» se refiere a un resto heterocíclico capaz de aparearse con una base de otro ácido nucleico.
«Complementariedad de bases nitrogenadas» se refiere a una base nitrogenada que es capaz de apareamiento de bases con otra base nitrogenada. Por ejemplo, en el ADN, la adenina (A) es complementaria con la timina (T). Por ejemplo, en el ARN, la adenina (A) es complementaria con el uracilo (U). En ciertas realizaciones, la base nitrogenada complementaria se refiere a una base nitrogenada de un compuesto antisentido que es capaz de apareamiento de bases con una base nitrogenada de su ácido nucleico diana. Por ejemplo, si una base nitrogenada de una cierta posición de un compuesto antisentido es capaz de establecer enlaces de hidrógeno con una base nitrogenada en una cierta posición de un ácido nucleico diana, entonces se considera que el oligonucleótido y el ácido nucleico diana son complementarios en ese par de bases nitrogenadas.
«Secuencia de bases nitrogenadas» se refiere al orden de bases nitrogenadas contiguas independiente de cualquier modificación de azúcares, uniones o bases nitrogenadas.
«Nucleósido» se refiere a una base nitrogenada ligada a un azúcar.
«Mimético de nucleósidos» incluye aquellas estructuras utilizadas para reemplazar el azúcar o el azúcar y la base, y no necesariamente la unión en una o más posiciones de un compuesto oligomérico; por ejemplo, miméticos de nucleósidos que tienen miméticos de azúcar de tipo morfolino, ciclohexenilo, ciclohexilo, tetrahidropiranilo, biciclo o triciclo tales como unidades de azúcar que no son furanosa.
«Nucleótido» se refiere a un nucleósido que tiene un grupo fosfato ligado covalentemente a la porción de azúcar del nucleósido.
«Mimético de nucleótidos» incluye aquellas estructuras utilizadas para reemplazar el nucleósido y la unión en una o más posiciones de un compuesto oligomérico tal como, por ejemplo, ácidos peptidonucleicos o morfolinos (morfolinos ligados por -N(H)-C(=O)-O- u otras uniones que no son fosfodiéster).
«Compuesto oligomérico» u «oligómero» se refiere a un polímero o subunidades monoméricas ligadas que es capaz de hibridarse con una región de una molécula de ácido nucleico. En ciertos casos, los compuestos oligoméricos son oligonucleósidos. En ciertos casos, los compuestos oligoméricos son oligonucleótidos. En ciertos casos, los compuestos oligoméricos son compuestos antisentido. En ciertos casos, los compuestos oligoméricos son oligonucleótidos antisentido. En ciertos casos, los compuestos oligoméricos son oligonucleótidos quiméricos.
«Oligonucleótido» se refiere a un polímero de nucleósidos ligados donde cada uno de los cuales puede estar modificado o no modificado, independientemente unos de otros.
«Administración parenteral» se refiere a la administración mediante inyección o infusión. La administración parenteral incluye la administración subcutánea, administración intravenosa, administración intramuscular, administración intraarterial, administración intraperitoneal o administración intracraneal, por ejemplo, administración intratecal o intracerebroventricular. La administración puede ser continua, crónica, corta o intermitente.
«Péptido» se refiere a una molécula formada ligando al menos dos aminoácidos por enlaces de amida. Péptido se refiere a polipéptidos y proteínas.
«Agente farmacéutico» se refiere a una sustancia que proporciona un beneficio terapéutico cuando se administra a un individuo. Por ejemplo, en ciertos casos, un oligonucleótido antisentido que tiene como diana apo(a) es un agente farmacéutico.
«Composición farmacéutica» o «composición» se refiere a una mezcla de sustancias adecuada para la administración a un individuo. Por ejemplo, una composición farmacéutica puede comprender uno o más agentes activos y un portador farmacéutico, por ejemplo, una solución acuosa estéril.
«Portador farmacéuticamente aceptable» se refiere a un medio o diluyente que no interfiere con la estructura del compuesto. Ciertos portadores de este tipo permiten que las composiciones farmacéuticas se formulen como, por ejemplo, comprimidos, pastillas, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, suspensiones espesas, suspensiones y pastillas para chupar para la ingestión oral por parte de un sujeto. Ciertos portadores de este tipo permiten que las composiciones farmacéuticas se formulen para la administración por inyección, infusión o tópica. Por ejemplo, un portador farmacéuticamente aceptable puede ser una solución acuosa estéril.
«Derivado farmacéuticamente aceptable» engloba derivados de los compuestos descritos en la presente tales como solvatos, hidratos, ésteres, profármacos, polimorfos, isómeros, variantes marcadas con isótopos, sales farmacéuticamente aceptables y otros derivados conocidos en la técnica.
«Sales farmacéuticamente aceptables» se refiere a sales fisiológica y farmacéuticamente aceptables de compuestos antisentido, es decir, sales que retienen la actividad biológica deseada del compuesto precursor y no confieren efectos toxicológicos no deseados a este. La expresión «sal farmacéuticamente aceptable» o el término «sal» incluye una sal preparada de ácidos o bases atóxicos farmacéuticamente aceptables, incluidos ácidos y bases orgánicos e inorgánicos. Las «sales farmacéuticamente aceptables» de los compuestos descritos en la presente se pueden preparar mediante métodos muy conocidos en la técnica. Para consultar una revisión de sales farmacéuticamente aceptables, véase Stahl y Wermuth, Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use (Wiley-VCH, Weinheim, Alemania, 2002). Las sales sódicas de los oligonucleótidos antisentido son útiles y muy aceptadas para la administración terapéutica a los seres humanos. En consecuencia, en un caso los compuestos descritos en la presente están en forma de una sal sódica.
«Unión fosforotioato» se refiere a una unión entre nucleósidos donde el enlace fosfodiéster se modifica reemplazando uno de los átomos de oxígeno que no son puente con un átomo de azufre. Una unión fosforotioato (P=S) es una unión internudeosídica modificada.
«Porción» se refiere a un número definido de bases nitrogenadas contiguas (es decir, ligadas) de un ácido nucleico. En ciertos casos, una porción es un número definido de bases nitrogenadas contiguas de un ácido nucleico diana. En ciertos casos, una porción es un número definido de bases nitrogenadas contiguas de un compuesto antisentido.
«Prevenir» o «prevención» se refiere a retrasar o detener la aparición o desarrollo de una enfermedad, trastorno o afección durante un periodo de tiempo, desde minutos hasta indefinidamente. Prevenir también significa reducir el riesgo de desarrollar una enfermedad, trastorno o afección.
«Profármaco» se refiere a un agente terapéutico que se prepara en una forma inactiva que se convierte en una forma activa (es decir, un fármaco) dentro del cuerpo o células de este por acción de enzimas endógenas u otros agentes químicos o afecciones.
«Elevar» se refiere a incrementar la cantidad. Por ejemplo, elevar los niveles plasmáticos de HDL se refiere a incrementar la cantidad de HDL en el plasma.
«Reducir» se refiere a disminuir hasta un grado, tamaño, cantidad o número menor. Por ejemplo, reducir los niveles plasmáticos de triglicéridos se refiere a disminuir la cantidad de triglicéridos en el plasma.
La «región» o «región diana» se define como una porción de un ácido nucleico diana que tiene al menos una estructura, función o característica identificable. Por ejemplo, una región diana puede englobar una UTR 3', una UTR 5', un exón, un intrón, una unión de exón/intrón, una región codificante, una región de inicio de la traducción, una región de terminación de la traducción, u otra región definida de ácido nucleico. Se pueden obtener las regiones definidas estructuralmente para apo(a) mediante el número de acceso a partir de bases de datos de las secuencias tales como NCBI. En ciertos casos, una región diana puede englobar la secuencia desde un sitio diana 5' de un segmento diana dentro de la región diana hasta un sitio diana 3' de otro segmento diana dentro de la región diana.
«Ribonucleótido» se refiere a un nucleótido que tiene un hidroxi en la posición 2' de la porción de azúcar del nucleótido. Los ribonucleótidos se pueden modificar con una variedad de sustituyentes.
«Segundo agente» o «segundo agente terapéutico» se refiere a un agente que se puede utilizar combinado con un «primer agente». Un segundo agente terapéutico puede incluir, sin carácter limitante, oligonucleótidos antisentido que tienen como diana apo(a) o apoB. Un segundo agente también puede incluir anticuerpos anti-apo(a), inhibidores de péptidos apo(a), agentes que reducen el colesterol, agentes que reducen los lípidos, agentes que reducen la glucosa y agentes antiinflamatorios.
Los «segmentos» se definen como subporciones o regiones más pequeñas dentro de un ácido nucleico. Por ejemplo, un «segmento diana» se refiere a la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico diana que es la diana de uno o más compuestos antisentido. «Sitio diana 5'» se refiere al nucleótido del extremo 5' de un segmento diana. «Sitio diana 3'» se refiere al nucleótido del extremo 3' de un segmento diana. Como alternativa, un «sitio de inicio» se puede referir al nucleótido del extremo 5' de un segmento diana y un «sitio de parada» se refiere al nucleótido del extremo 3' de un segmento diana. Un segmento diana también puede comenzar en el «sitio de inicio» de una secuencia y finalizar en el «sitio de parada» de otra secuencia.
En las versiones «truncadas» o «acortadas» de los oligonucleótidos antisentido o ácidos nucleicos diana expuestos en la presente se han eliminado uno, dos o más nucleósidos.
«Efectos secundarios» se refiere a respuestas fisiológicas atribuibles a un tratamiento que no son los efectos deseados. En ciertos casos, los efectos secundarios incluyen reacciones en el sitio de inyección, anomalías en las pruebas de la función hepática, anomalías de la función renal, toxicidad hepática, toxicidad renal, anomalías del sistema nervioso central, miopatías y malestar general. Por ejemplo, un aumento de los niveles de aminotransferasa en el suero puede indicar toxicidad hepática o anomalías de la función hepática. Por ejemplo, un aumento de la bilirrubina puede indicar toxicidad hepática o anomalías de la función hepática.
«Oligonucleótido monocatenario» se refiere a un oligonucleótido que no está hibridado con una hebra complementaria. «Que se puede hibridar de manera específica» se refiere a un compuesto antisentido que tiene un grado suficiente de complementariedad con un ácido nucleico diana para inducir un efecto deseado mientras muestra efectos mínimos o ninguno en absoluto en ácidos nucleicos que no son la diana en condiciones en las que se desea la unión específica, es decir, en condiciones fisiológicas en el caso de ensayos in vivo y tratamientos terapéuticos.
«Estatina» se refiere a un agente que inhibe la actividad de la HMG-CoA-reductasa.
«Administración subcutánea» se refiere a la administración justo por debajo de la piel.
«Sujeto» se refiere a un animal humano o no humano seleccionado para el tratamiento o terapia.
«Resto de azúcar» se refiere a un resto de azúcar de origen natural o un resto de azúcar modificado de un nucleósido.
«Síntoma de una enfermedad o trastorno cardiovascular» se refiere a un fenómeno que surge de una enfermedad o trastorno cardiovascular o que los acompaña y que sirve como un indicador de estos. Por ejemplo, angina; dolor de pecho; disnea; palpitaciones; debilidad; mareos; náuseas; sudoración; taquicardia; bradicardia; arritmia; fibrilación auricular; edema en las extremidades inferiores; cianosis; fatiga; desvanecimiento; entumecimiento de la cara; entumecimiento de las extremidades; claudicación o calambres en los músculos; hinchazón del abdomen; o fiebre son síntomas de una enfermedad o trastorno cardiovascular.
«Dirigido» o «que tiene como diana» se refiere al proceso de diseñar y seleccionar un compuesto antisentido que se hibridará específicamente con un ácido nucleico diana e inducirá un efecto deseado.
«Ácido nucleico diana», «ARN diana» y «transcrito de ARN diana» se refieren todos a un ácido nucleico que puede ser la diana de compuestos antisentido.
«Cantidad terapéuticamente eficaz» se refiere a una cantidad de un agente farmacéutico que proporciona un beneficio terapéutico a un individuo.
«Cambio terapéutico del estilo de vida» se refiere a cambios dietéticos y en el estilo de vida que pretenden reducir la masa de tejido graso/adiposo y/o colesterol». Tal cambio puede reducir el riesgo de desarrollar una cardiopatía y puede incluir recomendaciones sobre la ingesta en la dieta de calorías diarias totales, grasa total, grasa saturada, grasa poliinsaturada, grasa monoinsaturada, carbohidratos, proteínas, colesterol, fibra insoluble, así como también recomendaciones sobre la actividad física.
«Tratar» o «que trata» se refiere a la administración de un compuesto descrito en la presente para dar lugar a una alteración o mejora de una enfermedad, trastorno o afección.
«Triglicérido» o «TG» se refiere a un lípido o grasa neutra constituido por glicerol combinado con tres moléculas de ácido graso.
«Diabetes de tipo 2» (también conocida como «diabetes mellitus de tipo 2», «diabetes mellitus, tipo 2», «diabetes no insulinodependiente», «NIDDM, por sus siglas en inglés», «diabetes relacionada con la obesidad» o «diabetes de aparición adulta») es un trastorno metabólico que está caracterizado principalmente por la resistencia a la insulina, deficiencia de insulina relativa e hiperglucemia.
«Nucleótido no modificado» se refiere a un nucleótido compuesto por bases nitrogenadas de origen natural, resto de azúcar y uniones internucleosídicas. En ciertos casos, un nucleótido no modificado es un nucleótido de ARN (es decir, p-D-ribonucleósidos) o un nucleótido de ADN (es decir, p-D-desoxirribonucleósidos).
«Segmento lateral» se refiere a uno o una pluralidad de nucleósidos modificados para conferir a un oligonucleótido propiedades tales como una mayor actividad inhibidora, mayor afinidad de unión por un ácido nucleico diana, o resistencia a la degradación por nucleasas in vivo.
Ciertos aspectos
Ciertos casos de la divulgación incluyen compuestos y métodos para reducir la expresión de ARNm y proteína de apo(a). En ciertos casos, el compuesto es un inhibidor específico para apo(a) para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad asociada con apo(a). En ciertos casos, el compuesto es un oligonucleótido antisentido que tiene como diana apo(a).
Ciertos casos de la divulgación incluyen compuestos y métodos para reducir los niveles de Lp(a). En ciertos casos, el compuesto es un inhibidor específico para apo(a) para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad asociada con Lp(a). En ciertos casos, el compuesto es un oligonucleótido antisentido que tiene como diana apo(a).
Ciertos casos de la divulgación incluyen un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que tiene como diana apo(a) constituido por de 12 a 30 nucleósidos ligados. En ciertos casos, el oligonucleótido modificado está constituido por de 15 a 30, de 18 a 24, de 19 a 22, de 13 a 25, de 14 a 25, de 15 a 25 nucleósidos ligados. En ciertos casos, el oligonucleótido modificado comprende al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24, al menos 25, al menos 26, al menos 27, al menos 28, al menos 29 o 30 nucleósidos ligados. En ciertos casos, el oligonucleótido modificado está constituido por 20 nucleósidos ligados.
Ciertos casos de la divulgación incluyen un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que tiene como diana apo(a) que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, o 20 bases nitrogenadas contiguas complementarias a una porción de igual longitud de cualquiera de las SEQ ID NOs: 1-4. Ciertos casos de la divulgación incluyen un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que tiene como diana un segmento de apo(a) que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, o 20 bases nitrogenadas contiguas complementarias a una porción de igual longitud de cualquiera de los segmentos diana que se muestran en las Tablas 3-13 y 28-30. En las tablas, el «Sitio de inicio» se refiere al nucleótido del extremo 5' de un segmento diana y el «Sitio de parada» se refiere al nucleótido del extremo 3' de un segmento diana. Un segmento diana se puede extender desde el sitio de inicio hasta el sitio de parada de cada secuencia enumerada en las tablas. Como alternativa, el segmento diana también se puede extender desde el sitio de inicio de una secuencia y finalizar en el sitio de parada de otra secuencia. Por ejemplo, como se muestra en la Tabla 5, un segmento diana se puede extender desde 3901-3920, el sitio de inicio hasta el sitio de parada de la SEQ ID NO: 58. En otro ejemplo, como se muestra en la Tabla 5, un segmento diana se puede extender desde 3900-3923, el sitio de inicio de la Se Q ID NO: 57 hasta el sitio de parada de la SEQ ID NO: 61.
Ciertos casos de la divulgación incluyen un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que tiene como diana apo(a), donde la secuencia de bases nitrogenadas del oligonucleótido modificado es complementaria en al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95% o un 100% a cualquiera de las SEQ ID NOs: 1-4. Ciertos casos de la divulgación incluyen un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que tiene como diana apo(a), donde la secuencia de bases nitrogenadas del oligonucleótido modificado es complementaria en al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95% o un 100% a cualquiera de los segmentos diana que se muestran en las Tablas 3-13 y 28-30.
Ciertos casos de la divulgación incluyen un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que tiene como diana apo(a) constituido por de 12 a 30 nucleósidos ligados y que comprende una secuencia de bases nitrogenadas que comprende una porción de al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, o 20 bases nitrogenadas contiguas complementarias a una porción de igual longitud de las bases nitrogenadas 3901 a 3920 de la SEQ ID NO: 1, donde la secuencia de bases nitrogenadas del oligonucleótido modificado es complementaria en al menos un 80% a la SEQ ID NO: 1.
Ciertos casos de la divulgación incluyen un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que tiene como diana apo(a) constituido por de 12 a 30 nucleósidos ligados y que comprende una secuencia de bases nitrogenadas que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24, al menos 25, al menos 26, al menos 27, al menos 28, al menos 29 o 30 bases nitrogenadas contiguas complementarias a una porción de igual longitud de las bases nitrogenadas 3900 a 3923 de la SEQ ID NO: 1, donde la secuencia de bases nitrogenadas del oligonucleótido modificado es complementaria en al menos un 80% a la SEQ ID NO: 1.
Ciertos casos de la divulgación incluyen un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que tiene como diana apo(a) constituido por de 12 a 30 nucleósidos ligados y que tiene una secuencia de bases nitrogenadas que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 o 20 bases nitrogenadas contiguas de cualquiera de las secuencias de bases nitrogenadas de las SEQ ID NOs: 12-130, 133, 134. En ciertos casos, el oligonucleótido modificado tiene una secuencia de bases nitrogenadas que comprende al menos 8 bases nitrogenadas contiguas de cualquiera de las secuencias de bases nitrogenadas de las Se Q ID NOs: 12-130, 133, 134.
Ciertos casos de la divulgación incluyen un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que tiene como diana apo(a) constituido por de 12 a 30 nucleósidos ligados y que tiene una secuencia de bases nitrogenadas que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 o 20 bases nitrogenadas contiguas de cualquiera de las secuencias de bases nitrogenadas de las SEQ ID NOs: 12-20, 22-33, 34-43, 46-49, 50, 53 ,57-62, 65-66, 68, 70-79, 81, 85-86, 89-90, 92-94, 97, 105-110, 103-104, 133-134.
Ciertos casos de la divulgación incluyen un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que tiene como diana apo(a) constituido por de 12 a 30 nucleósidos ligados y que tiene una secuencia de bases nitrogenadas que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 o 20 bases nitrogenadas contiguas de cualquiera de las secuencias de bases nitrogenadas de las SEQ ID NOs: 12-19, 26-30, 32, 34, 37-43, 45-46, 49, 57-58, 61, 64-66, 68, 72-74, 76-77, 92-94, 103-110.
Ciertos casos de la divulgación incluyen un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que tiene como diana apo(a) constituido por de 12 a 30 nucleósidos ligados y que tiene una secuencia de bases nitrogenadas que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 o 20 bases nitrogenadas contiguas de cualquiera de las secuencias de bases nitrogenadas de las SEQ ID NOs: 111, 114-121, 123-129.
Ciertos casos de la divulgación incluyen un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que tiene como diana apo(a) constituido por de 12 a 30 nucleósidos ligados y que tiene una secuencia de bases nitrogenadas que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 o 20 bases nitrogenadas contiguas de cualquiera de las secuencias de bases nitrogenadas de las SEQ ID NOs: 14, 17, 18, 26-28, 38, 71, 106-107.
Ciertos casos de la divulgación incluyen un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que tiene como diana apo(a) constituido por de 12 a 30 nucleósidos ligados y que tiene una secuencia de bases nitrogenadas que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 o 20 bases nitrogenadas contiguas de cualquiera de las secuencias de bases nitrogenadas de las SEQ ID NOs: 14, 26-29, 38-39, 82.
Ciertos casos de la divulgación incluyen un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que tiene como diana apo(a) constituido por de 12 a 30 nucleósidos ligados y que tiene una secuencia de bases nitrogenadas que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 o 20 bases nitrogenadas contiguas de cualquiera de las secuencias de bases nitrogenadas de las SEQ ID NOs: 14, 16-18.
Ciertos casos de la divulgación incluyen un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que tiene como diana apo(a) constituido por de 12 a 30 nucleósidos ligados y que tiene una secuencia de bases nitrogenadas que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 o 20 bases nitrogenadas contiguas de cualquiera de las secuencias de bases nitrogenadas de las SEQ ID NOs: 26-27,107.
Ciertos casos de la divulgación incluyen un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que tiene como diana apo(a) constituido por de 12 a 30 nucleósidos ligados y que tiene una secuencia de bases nitrogenadas que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 o 20 bases nitrogenadas contiguas de cualquiera de las secuencias de bases nitrogenadas de las SEQ ID NOs: 28-29, 38-39, 46.
Ciertos casos de la divulgación incluyen un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que tiene como diana apo(a) constituido por de 12 a 30 nucleósidos ligados y que tiene una secuencia de bases nitrogenadas que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 o 20 bases nitrogenadas contiguas de cualquiera de las secuencias de bases nitrogenadas de las SEQ ID NOs: 28, 93, 104, 134.
Ciertos casos de la divulgación incluyen un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que tiene como diana apo(a) constituido por de 12 a 30 nucleósidos ligados y que tiene una secuencia de bases nitrogenadas que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 o 20 bases nitrogenadas contiguas de la secuencia de bases nitrogenadas de la SEQ ID NO: 58.
En ciertos casos, el oligonucleótido modificado tiene una secuencia de bases nitrogenadas que comprende al menos 8 bases nitrogenadas contiguas de la secuencia de bases nitrogenadas de la SEQ ID NO: 58.
Ciertos casos de la divulgación incluyen un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que tiene como diana apo(a), donde el oligonucleótido modificado es monocatenario.
Ciertos casos de la divulgación incluyen un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que tiene como diana apo(a), donde al menos una unión internucleosídica es una unión internucleosídica modificada. En ciertos casos, cada unión internucleosídica es una unión internucleosídica fosforotioato.
Ciertos casos de la divulgación incluyen un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que tiene como diana apo(a), donde al menos un nucleósido comprende una base nitrogenada modificada. En ciertos casos, la base nitrogenada modificada es 5-metilcitosina.
Ciertos casos de la divulgación incluyen un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que tiene como diana apo(a), donde el oligonucleótido modificado comprende al menos un azúcar modificado. En ciertos casos, el azúcar modificado es un azúcar bicíclico. En ciertos casos, el azúcar modificado comprende un 2'-0-metoxietilo, un etilo restringido, un 3'-fluoro-HNA o un puente 4'-(CH2)n-O-2', donde n es 1 o 2.
Ciertos casos de la divulgación incluyen un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que tiene como diana apo(a), donde el oligonucleótido modificado está constituido por de 12 a 30 nucleósidos ligados y comprende: (a) un segmento gap constituido por desoxinucleósidos ligados; (b) un segmento lateral en 5' constituido por nucleósidos ligados; (c) un segmento lateral en 3' constituido por nucleósidos ligados; y donde el segmento gap se ubica entre el segmento lateral en 5' y el segmento lateral en 3' y donde cada nucleósido de cada segmento lateral comprende un azúcar modificado.
Ciertos casos de la divulgación incluyen un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que tiene como diana apo(a), donde el oligonucleótido modificado está constituido por de 20 nucleósidos ligados y comprende: (a) un segmento gap constituido por diez desoxinucleósidos ligados; (b) un segmento lateral en 5' constituido por cinco nucleósidos ligados; (c) un segmento lateral en 3' constituido por cinco nucleósidos ligados; y donde el segmento gap se ubica entre el segmento lateral en 5' y el segmento lateral en 3', donde cada nucleósido de cada segmento lateral comprende un 2'-0-metoxietilazúcar, donde cada unión internucleosídica es una unión fosforotioato y donde cada residuo de citosina es una 5-metilcitosina.
Ciertos casos de la divulgación incluyen un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que tiene como diana apo(a), donde el oligonucleótido modificado está constituido por 20 nucleósidos ligados y tiene una secuencia de bases nitrogenadas que comprende al menos 8 bases nitrogenadas contiguas de cualquiera de las SEQ ID NOs: 12-130, 133, 134, donde el oligonucleótido modificado comprende: (a) un segmento gap constituido por diez desoxinucleósidos ligados; (b) un segmento lateral en 5' constituido por cinco nucleósidos ligados; (c) un segmento lateral en 3' constituido por cinco nucleósidos ligados; y donde el segmento gap se ubica entre el segmento lateral en 5' y el segmento lateral en 3', donde cada nucleósido de cada segmento lateral comprende un 2'-0-metoxietilazúcar, donde cada unión internucleosídica es una unión fosforotioato y donde cada residuo de citosina es una 5-metilcitosina.
Ciertos casos de la divulgación incluyen un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que tiene como diana apo(a), donde el oligonucleótido modificado está constituido por 20 nucleósidos ligados y tiene una secuencia de bases nitrogenadas que comprende al menos 8 bases nitrogenadas contiguas de la SEQ ID NO: 58, donde el oligonucleótido modificado comprende: (a) un segmento gap constituido por diez desoxinucleósidos ligados; (b) un segmento lateral en 5' constituido por cinco nucleósidos ligados; (c) un segmento lateral en 3' constituido por cinco nucleósidos ligados; y donde el segmento gap se ubica entre el segmento lateral en 5' y el segmento lateral en 3', donde cada nucleósido de cada segmento lateral comprende un 2'-0-metoxietilazúcar, donde cada unión internucleosídica es una unión fosforotioato y donde cada residuo de citosina es una 5-metilcitosina.
Ciertas realizaciones proporcionan un oligonucleótido modificado que tiene como diana apo(a), donde el oligonucleótido modificado está constituido por 20 nucleósidos ligados con la secuencia de bases nitrogenadas de la SEQ ID NO: 58, donde el oligonucleótido modificado comprende: (a) un segmento gap constituido por diez desoxinucleósidos ligados; (b) un segmento lateral en 5' constituido por cinco nucleósidos ligados; (c) un segmento lateral en 3' constituido por cinco nucleósidos ligados; y donde el segmento gap se ubica entre el segmento lateral en 5' y el segmento lateral en 3', donde cada nucleósido de cada segmento lateral comprende un 2'-0-metoxietilazúcar, donde cada unión internucleosídica es una unión fosforotioato y donde cada residuo de citosina es una 5-metilcitosina.
En ciertos casos, el compuesto está en forma de sal. En casos adicionales, el compuesto comprende además un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. En ciertos casos, el compuesto comprende un oligonucleótido modificado que tiene como diana apo(a), o una sal de este, y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
Ciertos casos de la divulgación incluyen una composición que comprende un compuesto como se describe en la presente, donde el nivel de viscosidad del compuesto es inferior a 40 centipoise (cP). En ciertos casos, los compuestos antisentido como se describen en la presente son eficaces debido a que tienen una viscosidad inferior a 40 cP, inferior a 35 cP, inferior a 30 cP, inferior a 25 cP, inferior a 20 cP o inferior a 15 cP cuando se mide mediante los parámetros descritos en el Ejemplo 13.
Ciertos casos de la divulgación incluyen composiciones y métodos para su uso en la terapia para tratar una enfermedad, trastorno o afección relacionados con apo(a). Ciertos casos de la divulgación incluyen composiciones y métodos para su uso en la terapia para tratar una enfermedad, trastorno o afección relacionados con Lp(a). En ciertos casos, la composición es un compuesto que comprende un inhibidor específico para apo(a). En ciertos casos, el inhibidor específico para apo(a) es un ácido nucleico. En ciertos casos, el ácido nucleico es un compuesto antisentido. En ciertos casos, el compuesto antisentido es un oligonucleótido modificado que tiene como diana apo(a). En ciertos casos, el oligonucleótido modificado que tiene como diana apo(a) se utiliza para tratar, prevenir, retrasar la evolución, mejorar una enfermedad, trastorno o afección cardiovasculares y/o metabólicos. En ciertos casos, las composiciones y métodos para la terapia incluyen administrar un inhibidor específico para apo(a) a un individuo que lo necesite.
Ciertos casos de la divulgación incluyen composiciones y métodos para reducir los niveles de apo(a). Ciertos casos de la divulgación incluyen composiciones y métodos para reducir los niveles de Lp(a). En ciertos casos, reducir los niveles de apo(a) en un tejido, órgano o sujeto mejora la proporción de LDL respecto a HDL o la proporción de TG respecto a HDL.
Ciertos casos de la divulgación incluyen composiciones y métodos para prevenir, tratar, retrasar, ralentizar la evolución y/o mejorar enfermedades, trastornos y afecciones relacionados con apo(a) en un sujeto que lo necesite. Ciertos casos de la divulgación incluyen composiciones y métodos para prevenir, tratar, retrasar, ralentizar la evolución y/o mejorar enfermedades, trastornos y afecciones relacionados con Lp(a) en un sujeto que lo necesite. En ciertos casos, tales enfermedades, trastornos y afecciones incluyen enfermedades, trastornos y afecciones cardiovasculares y/o metabólicos. Ciertas enfermedades, trastornos o afecciones cardiovasculares de este tipo incluyen, sin carácter limitante, aneurisma (por ejemplo, aneurisma aórtico abdominal), angina, arritmia, aterosclerosis, enfermedad cerebrovascular, arteriopatía coronaria, cardiopatía coronaria, dislipidemia, hipercolesterolemia, hiperlipidemia, hipertensión, hipertrigliceridemia, infarto de miocardio, enfermedad vascular periférica (por ejemplo, arteriopatía periférica, arteriopatía oclusiva periférica), oclusión vascular retinal o accidente cerebrovascular. Ciertas enfermedades, trastornos o afecciones metabólicos de este tipo incluyen, sin carácter limitante, hiperglucemia, prediabetes, diabetes (de tipo I y tipo II), obesidad, resistencia a la insulina, síndrome metabólico y dislipidemia diabética. Ciertas enfermedades, trastornos o afecciones inflamatorios de este tipo incluyen, sin carácter limitante, arteriopatía coronaria (CAD, por sus siglas en inglés), enfermedad de Alzheimer y enfermedades tromboembólicas, trastorno o afecciones Ciertas enfermedades, trastornos o afecciones tromboembólicos incluyen, sin carácter limitante, accidente cerebrovascular, trombosis (por ejemplo, tromboembolismo venoso), infarto de miocardio y enfermedad vascular periférica.
Ciertos casos de la divulgación incluyen un método para reducir al menos un síntoma de una enfermedad, trastorno o afección cardiovasculares. En ciertos casos, los síntomas incluyen, sin carácter limitante, angina, dolor de pecho, disnea, palpitaciones, debilidad, mareos, náuseas, sudoración, taquicardia, bradicardia, arritmia, fibrilación auricular, edema en las extremidades inferiores, cianosis, fatiga, desvanecimiento, entumecimiento de la cara, entumecimiento de las extremidades, claudicación o calambres en los músculos, hinchazón del abdomen y fiebre.
En ciertos casos, la modulación de la expresión de apo(a) o Lp(a) ocurre en una célula, tejido u órgano. En ciertos casos, la modulación ocurre en una célula, tejido u órgano en un animal. En ciertos casos, la modulación es una reducción en el nivel de ARNm de apo(a). En ciertos casos, la modulación es una reducción en el nivel de proteína de apo(a). En ciertos casos, se reducen los niveles de ARNm y de proteína de apo(a). En ciertos casos, la modulación es una reducción en el nivel de Lp(a). Tal reducción puede depender del tiempo o depender de la dosis.
En ciertos casos, el sujeto o animal es un ser humano.
En ciertos casos, el compuesto se administra por vía parenteral. En casos adicionales, la administración parenteral es subcutánea.
En ciertos casos, el compuesto se administra conjuntamente con un segundo agente o terapia. En ciertos casos, el segundo agente es un agente que reduce la glucosa. En ciertos casos, el segundo agente es un agente que reduce el LDL, TG o colesterol. En ciertos casos, el segundo agente es un agente antiinflamatorio. En ciertos casos, el segundo agente es un fármaco para la enfermedad de Alzheimer. En ciertos casos, el segundo agente puede ser, sin carácter limitante, un fármaco antiinflamatorio no esteroide (AINE, por ejemplo, aspirina), niacina (por ejemplo, Niaspan), ácido nicotínico, un inhibidor de apoB (por ejemplo, Mipomersen), un inhibidor de CETP (por ejemplo, Anacetrapib), un inhibidor de apo(a), un análogo de la hormona tiroidea (por ejemplo, Eprotiroma), un inhibidor de la HMG-CoA-reductasa (por ejemplo, una estatina), un fibrato (por ejemplo, Gemfibrozil) y un inhibidor de la proteína microsomal de transferencia de triglicéridos (por ejemplo, Lomitapida). La terapia puede ser, sin carácter limitante, aféresis de Lp(a). Los agentes o terapias se pueden administrar conjuntamente o administrar a la vez. Los agentes o terapias se pueden administrar secuencial o posteriormente.
Ciertos casos de la divulgación incluyen el uso de un compuesto que tiene como diana apo(a) para reducir los niveles de apo(a) en un animal. Ciertos casos de la divulgación incluyen el uso de un compuesto que tiene como diana apo(a) para reducir los niveles de Lp(a) en un animal. Ciertos casos de la divulgación incluyen el uso de compuestos que tienen como diana apo(a) para el tratamiento, prevención o mejora de una enfermedad, trastorno o afección asociados con apo(a). Ciertos casos de la divulgación incluyen el uso de compuestos que tienen como diana apo(a) para el tratamiento, prevención o mejora de una enfermedad, trastorno o afección asociados con Lp(a).
Ciertos casos de la divulgación incluyen el uso de un compuesto que tiene como diana apo(a) en la preparación de un medicamento para reducir los niveles de apo(a) en un animal. Ciertos casos de la divulgación incluyen el uso de un compuesto que tiene como diana apo(a) en la preparación de un medicamento para reducir los niveles de Lp(a) en un animal. Ciertos casos de la divulgación incluyen el uso de un compuesto para la preparación de un medicamento para el tratamiento, prevención o mejora de una enfermedad, trastorno o afección asociados con apo(a). Ciertos casos de la divulgación incluyen el uso de un compuesto para la preparación de un medicamento para el tratamiento, prevención o mejora de una enfermedad, trastorno o afección asociados con Lp(a).
Ciertos casos de la divulgación incluyen un kit para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad, trastorno o afección como se describe en la presente donde el kit comprende: (i) un inhibidor específico para apo(a) como se describe en la presente; y opcionalmente (ii) un segundo agente o terapia como se describe en la presente.
Un kit de la presente divulgación puede incluir además instrucciones para utilizar el kit para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad, trastorno o afección como se describe en la presente mediante terapia combinada como se describe en la presente.
Compuestos antisentido
Los compuestos oligoméricos incluyen, sin carácter limitante, oligonucleótidos, oligonucleósidos, análogos de oligonucleótidos, miméticos de oligonucleótidos, compuestos antisentido, oligonucleótidos antisentido, ribozimas, microARN y ARNip. Un compuesto oligomérico puede ser «antisentido» respecto a un ácido nucleico diana, lo que significa que es capaz de experimentar hibridación con un ácido nucleico diana mediante enlaces de hidrógeno.
En ciertos casos, un compuesto antisentido tiene una secuencia de bases nitrogenadas que, cuando se escribe en la dirección de 5' a 3', comprende el complementario inverso del segmento diana de un ácido nucleico diana al que tiene como diana. En ciertos casos de este tipo, un oligonucleótido antisentido tiene una secuencia de bases nitrogenadas que, cuando se escribe en la dirección de 5' a 3', comprende el complementario inverso del segmento diana de un ácido nucleico diana al que tiene como diana.
En ciertos casos, un compuesto antisentido que tiene como diana un ácido nucleico de apo(a) tiene una longitud de 12 a 30 subunidades. En otras palabras, los compuestos antisentido tienen de 12 a 30 subunidades ligadas. En otros casos, el compuesto antisentido tienen de 8 a 80, de 10 a 80, de 12 a 50, de 15 a 30, de 18 a 24, de 19 a 22, de 13 a 25, de 14 a 25 o de 15 a 25 subunidades ligadas. En ciertos casos de este tipo, los compuestos antisentido tienen una longitud de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, o 80 subunidades ligadas, o un intervalo definido por dos cualesquiera de los valores anteriores. En ciertos casos de este tipo, los compuestos antisentido tienen una longitud de 8 subunidades ligadas. En algunos casos, el compuesto antisentido es un oligonucleótido antisentido. En algunos casos, las subunidades ligadas son nucleósidos.
En ciertos casos, el compuesto antisentido comprende un oligonucleótido modificado acortado o truncado. En el oligonucleótido modificado acortado o truncado se pueden haber eliminado uno o más nucleósidos del extremo 5' (truncamiento 5'), haber eliminado uno o más nucleósidos del extremo 3' (truncamiento 3') o haber eliminado uno o más nucleósidos de la porción central. Como alternativa, los nucleósidos eliminados se pueden dispersar a lo largo del oligonucleótido modificado, por ejemplo, en un compuesto antisentido en el que se haya eliminado un nucleósido del extremo 5' y se haya eliminado un nucleósido del extremo 3'.
Cuando está presente un único nucleósido adicional en un oligonucleótido alargado, el nucleósido adicional se puede ubicar en la porción central, extremo 5' o 3' del oligonucleótido. Cuando están presentes dos o más nucleósidos adicionales, los nucleósidos añadidos pueden estar adyacentes entre sí, por ejemplo, en un oligonucleótido que tiene dos nucleósidos añadidos a la porción central, al extremo 5' (adición 5'), o como alternativa al extremo 3' (adición 3'), del oligonucleótido. Como alternativa, los nucleósidos añadidos se pueden dispersar a lo largo del compuesto antisentido, por ejemplo, en un oligonucleótido en el que se haya añadido un nucleósido al extremo 5' y se haya añadido una subunidad al extremo 3'.
Es posible aumentar o reducir la longitud del compuesto antisentido, tal como un oligonucleótido antisentido, y/o introducir bases emparejadas erróneamente sin eliminar la actividad. Por ejemplo, en Woolf et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7305-7309, 1992), se estudiaron una serie de oligonucleótidos antisentido con una longitud de 13-25 bases nitrogenadas para determinar su capacidad de inducir la escisión de un ARN diana en un modelo de inyección de oocitos. Los oligonucleótidos antisentido con una longitud de 25 bases nitrogenadas con 8 u 11 bases emparejadas erróneamente cerca de los extremos de los oligonucleótidos antisentido fueron capaces de dirigir la escisión específica del ARNm diana, aunque en menor grado que los oligonucleótidos antisentido que no contuvieron emparejamientos erróneos. De manera similar, se consiguió una escisión específica diana utilizando oligonucleótidos antisentido de 13 bases nitrogenadas, incluidos aquellos con 1 o 3 emparejamientos erróneos.
Gautschi et al (J. Natl. Cancer Inst. 93:463-471, marzo de 2001) demostraron la capacidad de un oligonucleótido que tiene un 100% de complementariedad con el ARNm de bcl-2 y que tiene 3 emparejamientos erróneos con el ARNm de bcl-xL para reducir la expresión tanto de bcl-2 como de bcl-xL in vitro e in vivo. Además, este oligonucleótido demostró una potente actividad antitumoral in vivo.
Maher y Dolnick (Nuc. Acid. Res. 16:3341-3358,1988) estudiaron una serie de oligonucleótidos antisentido de 14 bases nitrogenadas en tándem, y oligonucleótidos antisentido de 28 y 42 bases nitrogenadas que comprendían la secuencia de dos o tres de los oligonucleótidos antisentido en tándem, respectivamente, para determinar su capacidad de detener la traducción de DHFR humano en un ensayo con reticulocitos de conejo. Cada uno de los tres oligonucleótidos antisentido de 14 bases nitrogenadas en solitario fue capaz de inhibir la traducción, aunque a un nivel más moderado que los oligonucleótidos antisentido de 28 o 42 bases nitrogenadas.
Motivos de compuestos antisentido
En ciertos casos, los compuestos antisentido que tienen como diana un ácido nucleico de apo(a) tienen subunidades modificadas químicamente dispuestas en patrones, o motivos, para conferir a los compuestos antisentido propiedades, tales como una mayor actividad inhibidora, mayor afinidad de unión por un ácido nucleico diana, o resistencia a degradación por parte de nucleasas in vivo.
Los compuestos antisentido quiméricos contienen habitualmente al menos una región modificada de manera que confiera una mayor resistencia a la degradación de nucleasas, mayor captación celular, mayor afinidad de unión por el ácido nucleico diana y/o mayor actividad inhibidora. Una segunda región de un compuesto antisentido quimérico puede actuar opcionalmente como un sustrato para la endonucleasa RNasa H celular, que escinde la hebra de ARN de un dúplex de ARN: ADN.
Los compuestos antisentido que tienen un motivo de gápmero se consideran compuestos antisentido quiméricos. En un gápmero, una región interna que tiene una pluralidad de nucleótidos que favorece la escisión por RNasa H está ubicada entre las regiones externas que tienen una pluralidad de nucleótidos que son distintos desde un punto de vista químico de los nucleósidos de la región interna. En el caso de un oligonucleótido antisentido que tiene un motivo de tipo gápmero, el segmento gap actúa generalmente como el sustrato para la escisión por endonucleasa, mientras que los segmentos laterales comprenden nucleósidos modificados. En ciertos casos, las regiones de un gápmero están diferenciadas por los tipos de restos de azúcar que comprende cada región distinta. Los tipos de restos de azúcar que se utilizan para diferenciar las regiones de un gápmero pueden incluir, en algunas realizaciones, p-D-ribonucleósidos, p-D-desoxirribonucleósidos, nucleósidos modificados en la posición 2' (tales nucleósidos modificados en la posición 2' pueden incluir 2'-MOE y 2'-O-CH3 , entre otros), y nucleósidos modificados con azúcares bicíclicos (tales nucleósidos modificados con azúcares bicíclicos pueden incluir aquellos que tienen un puente 4'-(CH2)n-O-2', donde n=1 o n=2). Preferentemente, cada región distinta comprende restos de azúcar uniformes. El motivo lateral-gap-lateral se describe con frecuencia como «X-Y-Z», donde «X» representa la longitud de la región lateral 5', «Y» representa la longitud de la región gap, y «Z» representa la longitud de la región lateral 3'. Tal como se utiliza en la presente, un gápmero descrito como «X-Y-Z» tiene una configuración tal que el segmento gap se ubica inmediatamente adyacente a cada uno del segmento lateral en 5' y el segmento lateral en 3'. Por lo tanto, no existen nucleótidos intermedios entre el segmento lateral en 5' y el segmento gap, o el segmento gap y el segmento lateral en 3'. Cualquiera de los compuestos antisentido descritos en la presente pueden tener un motivo de gápmero. En algunas realizaciones, X y Z son idénticos; en otros casos son diferentes. En un caso preferido, Y tiene entre 8 y 15 nucleótidos. X, Y o Z pueden tener cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 2 8 , 29, 30 o más nucleótidos. Por lo tanto, los gápmeros incluyen, sin carácter limitante, por ejemplo, 5-10-5, 4-8-4, 4-12-3, 4-12-4, 3-14-3, 2-13-5, 2-12-2, 2-16-2, 1-18-1, 3-10-3, 2-10-2, 1-10­ 1, 2-8-2, 6 -8 -6 , 5-8-5, 1-8-1,2-6-2, 2-13-2, 1-8-2, 2-8-3, 3-10-2, 1-18-2 o 2-18-2.
En ciertos casos, el compuesto antisentido como un motivo «wingmero» tiene una configuración lateral-gap o gap-lateral, es decir, una configuración X-Y o Y-Z como se ha descrito anteriormente para la configuración de gápmero. Por lo tanto, las configuraciones de wingmeros incluyen, sin carácter limitante, por ejemplo, 5-10, 8-4, 4-12, 12-4, 3-14, 16-2, 18-1, 10­ 3, 2-10, 1-10, 8-2,2-13 o 5-13.
En ciertos casos, los compuestos antisentido que tienen como diana un ácido nucleico de apo(a) poseen un motivo gápmero 5-10-5.
En ciertos casos, un compuesto antisentido que tiene como diana un ácido nucleico de apo(a) tiene un motivo gap ampliado.
Ácidos nucleicos diana, regiones diana y secuencias de nucleótidos
Las secuencias de nucleótidos que codifican la secuencia diana de apo(a) incluyen, sin carácter limitante, los siguientes: N.° de acceso GENBANK NM_005577.2, incorporado a la presente como la SEQ ID NO: 1; N.° de acceso GENBANK NT_007422.12, truncado de los nucleótidos 3230000 a 3380000, incorporado a la presente como la SEQ ID NO: 2; N.° de acceso GENBANK NT_025741.15, truncado de los nucleótidos 65120000 a 65258000, designado en la presente como la SEQ ID NO: 3; y N.° de acceso GENBANK NM_005577.1, incorporado a la presente como la SEQ ID NO: 4.
Se entiende que la secuencia expuesta en cada SEQ ID NO en los Ejemplos que contiene la presente es independiente de cualquier modificación a un resto de azúcar, una unión internucleosídica o una base nitrogenada. Como tal, los compuestos antisentido definidos por la SEQ ID NO pueden comprender, independientemente, una o más modificaciones en un resto de azúcar, una unión internucleosídica o una base nitrogenada. Los compuestos antisentido descritos por el número Isis (N.° Isis) indican una combinación de secuencia de bases nitrogenadas y motivo.
En ciertos casos, una «región diana» es una región definida estructuralmente del ácido nucleico diana. Por ejemplo, una región diana puede englobar una UTR 3', una UTR 5', un exón, un intrón, una unión de exón/intrón, una región codificante, una región de inicio de la traducción, una región de terminación de la traducción, u otra región definida de ácido nucleico. Se pueden obtener las regiones definidas estructuralmente para apo(a) mediante el número de acceso a partir de bases de datos de las secuencias tales como NCBI. En ciertos casos, una región diana puede englobar la secuencia desde un sitio diana 5' de un segmento diana dentro de la región diana hasta un sitio diana 3' de otro segmento diana dentro de la misma región diana.
En ciertos casos, un «segmento diana» es una subporción más pequeña de una región diana dentro de un ácido nucleico. Por ejemplo, un «segmento diana» puede ser la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico diana que es la diana de uno o más compuestos antisentido. «Sitio diana 5'» se refiere al nucleótido del extremo 5' de un segmento diana. «Sitio diana 3'» se refiere al nucleótido del extremo 3' de un segmento diana.
Una región diana puede contener uno o más segmentos diana. Múltiples segmentos diana dentro de una región diana pueden estar superpuestos. Como alternativa, pueden no estar superpuestos. En ciertos casos, los segmentos diana dentro de una región diana están separados por no más de aproximadamente 300 nucleótidos. En ciertos casos, los segmentos diana dentro de una región diana están separados por un número de nucleótidos que es, es aproximadamente, no es más de, no es más de aproximadamente 250, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 o 10 nucleótidos en el ácido nucleico diana, o es un intervalo definido por dos cualesquiera de los valores anteriores. En ciertos casos, los segmentos diana dentro de una región diana están separados por no más, o no más de aproximadamente, 5 nucleótidos en el ácido nucleico diana. En ciertos casos, los segmentos diana son contiguos. Se contemplan regiones diana definidas por un intervalo que tiene un ácido nucleico de partida que es cualquiera de los sitios diana 5' o sitios diana 3' enumerados en la presente.
El direccionamiento incluye la determinación de al menos un segmento diana con el cual se hibrida un compuesto antisentido, de modo que ocurra un efecto deseado. En ciertos casos, el efecto deseado es una reducción de los niveles de ácido nucleico diana de tipo ARNm. En ciertos casos, el efecto deseado es la reducción de niveles de proteína codificada por el ácido nucleico diana o un cambio fenotípico asociado con el ácido nucleico diana.
Se pueden encontrar segmentos diana adecuados dentro de una UTR 5', una región codificante, una UTR 3', un intrón, un exón, o una unión de exón/intrón. Los segmentos diana que contienen un codón de inicio o un codón de parada también son segmentos diana adecuados. Un segmento diana adecuado puede excluir específicamente una cierta región definida estructuralmente, tal como el codón de inicio o codón de parada.
La determinación de segmentos diana adecuados puede incluir una comparación de la secuencia de un ácido nucleico diana con otras secuencias a lo largo del genoma. Por ejemplo, se puede utilizar el algoritmo BLAST para identificar regiones de similitud entre diferentes ácidos nucleicos. La comparación puede evitar la selección de secuencias de compuestos antisentido que se puedan hibridar de manera no específica con secuencias que no son un ácido nucleico diana seleccionado (es decir, secuencias que no son la diana o inespecíficas).
Puede haber una variación en la actividad (por ejemplo, según define la reducción porcentual de niveles de ácido nucleico diana) de los compuestos antisentido dentro de una región diana activa. En ciertos casos, las reducciones en los niveles de ARNm de apo(a) pueden ser indicativas de la inhibición de la expresión de apo(a). Las reducciones en los niveles de una proteína apo(a) pueden ser indicativas de la inhibición de la expresión de ARNm diana. Además, los cambios fenotípicos pueden ser indicativos de la inhibición de la expresión de apo(a). Por ejemplo, un aumento en los niveles de HDL, disminución en los niveles de LDL, disminución en los niveles de colesterol o disminución en los niveles de triglicéridos, están entre los cambios fenotípicos que se pueden evaluar para determinar la inhibición de la expresión de apo(a). También se pueden evaluar otras indicaciones fenotípicas, por ejemplo, síntomas asociados con una enfermedad cardiovascular; por ejemplo, angina; dolor de pecho; disnea; palpitaciones; debilidad; mareos; náuseas; sudoración; taquicardia; bradicardia; arritmia; fibrilación auricular; edema en las extremidades inferiores; cianosis; fatiga; desvanecimiento; entumecimiento de la cara; entumecimiento de las extremidades; claudicación o calambres en los músculos; hinchazón del abdomen; o fiebre.
Hibridación
En algunos casos, ocurre hibridación entre un compuesto antisentido divulgado en la presente y un ácido nucleico de apo(a). El mecanismo más común de hibridación conlleva los enlaces de hidrógeno (por ejemplo, Watson-Crick, Hoogsteen o enlaces de hidrógeno Hoogsteen invertidos) entre bases nitrogenadas complementarias de las moléculas de ácido nucleico.
Puede ocurrir hibridación en condiciones diferentes. Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia y están determinadas por la naturaleza y composición de las moléculas de ácido nucleico que se van a hibridar.
Los métodos para determinar si una secuencia se puede hibridar específicamente con un ácido nucleico diana son muy conocidos en la técnica (Sambrooke y Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3.a Ed., 2001). En ciertos casos, los compuestos antisentido proporcionados en la presente se pueden hibridar específicamente con un ácido nucleico de apo(a).
Complementariedad
Un compuesto antisentido y un ácido nucleico diana son complementarios entre sí cuando un número suficiente de bases nitrogenadas del compuesto antisentido puede establecer enlaces de hidrógeno con las bases nitrogenadas correspondientes del ácido nucleico diana, de modo que ocurrirá un efecto deseado (por ejemplo, inhibición antisentido de un ácido nucleico diana, tal como un ácido nucleico de apo(a)).
Se pueden tolerar bases nitrogenadas no complementarias entre un compuesto antisentido y un ácido nucleico de apo(a) siempre que el compuesto antisentido siga siendo capaz de hibridarse específicamente con un ácido nucleico diana. Además, un compuesto antisentido se puede hibridar en uno o más segmentos de un ácido nucleico de apo(a) de modo que los segmentos intermedios o adyacentes no estén implicados en el evento de hibridación (por ejemplo, una estructura de bucle, emparejamiento erróneo o estructura de tipo horquilla).
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido proporcionados en la presente, o una porción especificada de estos, son complementarios en, o son complementarios en al menos, un 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% con un ácido nucleico de apo(a), una región diana, un segmento diana o porciones especificadas de este. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con un ácido nucleico diana se puede determinar utilizando métodos habituales.
Por ejemplo, un compuesto antisentido en el que 18 de 20 bases nitrogenadas del compuesto antisentido son complementarias con una región diana, y por lo tanto se hibridarían específicamente, representaría una complementariedad de un 90%. En este ejemplo, las bases nitrogenadas no complementarias restantes pueden estar agrupadas o intercaladas con bases nitrogenadas complementarias y no es necesario que sean contiguas entre sí o con las bases nitrogenadas complementarias. Como tal, un compuesto antisentido que tiene una longitud de 18 bases nitrogenadas que tiene 4 (cuatro) bases nitrogenadas no complementarias que están flanqueadas por dos regiones de complementariedad completa con el ácido nucleico diana tendría una complementariedad total de un 77,8% con el ácido nucleico diana y, por lo tanto, estaría comprendido en el alcance de la presente invención. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con una región de un ácido nucleico diana se puede determinar de manera rutinaria utilizando programas BLAST (herramientas de búsqueda de alineación local básica) y programas PowerBLAST conocidos en la técnica (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403410; Zhang y Madden, Genome Res., 1997, 7, 649656). Se puede determinar el porcentaje de homología, identidad secuencial o complementariedad mediante, por ejemplo, el programa Gap (Paquete de Análisis Secuencial Wisconsin, Versión 8 para Unix, Grupo de Genética Computacional, Parque de Investigación de la Universidad, Madison Wis.), utilizando parámetros predeterminados, que utiliza el algoritmo de Smith and Waterman (Adv. Appl. Math., 1981, 2,482489).
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido proporcionados en la presente, o porciones especificadas de estos, son totalmente complementarios (es decir, complementarios en un 100%) con un ácido nucleico diana, o una porción especificada de este. Por ejemplo, un compuesto antisentido puede ser totalmente complementario con un ácido nucleico de apo(a), o una región diana, o un segmento diana o secuencia diana de este. Tal como se utiliza en la presente, «totalmente complementario» significa que cada base nitrogenada de un compuesto antisentido es capaz de un emparejamiento de bases preciso con las bases nitrogenadas correspondientes de un ácido nucleico diana. Por ejemplo, un compuesto antisentido de 20 bases nitrogenadas es totalmente complementario con una secuencia diana que tiene una longitud de 400 bases nitrogenadas, siempre que haya una porción de 20 bases nitrogenadas correspondiente del ácido nucleico diana que sea totalmente complementaria al compuesto antisentido. También se puede utilizar la complementariedad total en referencia a una porción especificada del primer y/o segundo ácido nucleico. Por ejemplo, una porción de 20 bases nitrogenadas de un compuesto antisentido de 30 bases nitrogenadas puede ser «totalmente complementaria» con una secuencia diana que tenga una longitud de 400 bases nitrogenadas. La porción de 20 bases nitrogenadas del oligonucleótido de 30 bases nitrogenadas es totalmente complementaria con la secuencia diana si la secuencia diana tiene una porción de 20 bases nitrogenadas correspondiente donde cada base nitrogenada es complementaria con la porción de 20 bases nitrogenadas del compuesto antisentido. Al mismo tiempo, todo el compuesto antisentido de 30 bases nitrogenadas puede ser o no ser totalmente complementario con la secuencia diana, dependiendo de si las 10 bases nitrogenadas restantes del compuesto antisentido también son complementarias a la secuencia diana.
La(s) base(s) nitrogenada(s) no complementaria(s) puede(n) estar ubicada(s) en el extremo 5' o 3' del compuesto antisentido. Como alternativa, la(s) base(s) nitrogenada(s) no complementaria(s) puede(n) estar en una posición interna del compuesto antisentido. Cuando están presentes dos o más bases nitrogenadas no complementarias, pueden ser contiguas (es decir, ligadas) o no contiguas. En una realización, una base nitrogenada no complementaria se ubica en el segmento lateral de un oligonucleótido antisentido gápmero.
En ciertos casos, los compuestos antisentido que tienen una longitud de, o tienen una longitud de hasta, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 bases nitrogenadas comprenden no más de 4, no más de 3, no más de 2 o no más de 1 base(s) nitrogenada(s) no complementaria(s) respecto a un ácido nucleico diana, tal como un ácido nucleido de apo(a), o una porción especificada de este.
En ciertos casos, los compuestos antisentido que tienen una longitud de, o tienen una longitud de hasta, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30 bases nitrogenadas comprenden no más de 6, no más de 5, no más de 4, no más de 3, no más de 2 o no más de 1 base(s) nitrogenada(s) no complementaria(s) respecto a un ácido nucleico diana, tal como un ácido nucleico de apo(a), o una porción especificada de este.
Los compuestos antisentido proporcionados en la presente también incluyen aquellos que son complementarios con una porción de un ácido nucleico diana. Tal como se utiliza en la presente, «porción» se refiere a un número definido de bases nitrogenadas contiguas (es decir, ligadas) dentro de una región o segmento de un ácido nucleico diana. Una «porción» también se puede referir a un número definido de bases nitrogenadas contiguas de un compuesto antisentido. En ciertos casos, los compuestos antisentido son complementarios con al menos una porción de 8 bases nitrogenadas de un segmento diana. En ciertos casos, los compuestos antisentido son complementarios con al menos una porción de 12 bases nitrogenadas de un segmento diana. En ciertos casos, los compuestos antisentido son complementarios con al menos una porción de 15 bases nitrogenadas de un segmento diana. También se contemplan compuestos antisentido que son complementarios con al menos una porción de 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más bases nitrogenadas de un segmento diana, o un intervalo definido por dos cualesquiera de estos valores.
Identidad
Los compuestos antisentido proporcionados en la presente también pueden tener un porcentaje de identidad definido con una secuencia de nucleótidos particular, SEQ ID NO, o compuesto representado por un número Isis específico, o porción de estos. Tal como se utiliza en la presente, un compuesto antisentido es idéntico a la secuencia divulgada en la presente si tiene la misma capacidad de emparejamiento de bases nitrogenadas. Por ejemplo, un ARN que contiene uracilo en lugar de timidina en una secuencia de ADN divulgada se consideraría idéntico a la secuencia de ADN ya que tanto el uracilo como la timidina se emparejan con la adenina. También se contemplan versiones acortadas y alargadas de los compuestos antisentido descritos en la presente así como también compuestos que tienen bases no idénticas respecto a los compuestos antisentido proporcionados en la presente. Las bases no idénticas pueden ser adyacentes entre sí o estar dispersadas a lo largo del compuesto antisentido. El porcentaje de identidad de un compuesto antisentido se calcula de acuerdo con el número de bases que tienen un emparejamiento de bases idéntico respecto a la secuencia con la que se comparan.
En ciertos casos, los compuestos antisentido, o porciones de estos, son idénticos en al menos un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% a uno o más de los compuestos antisentido o SEQ ID NOs, o una porción de estos, divulgados en la presente.
En ciertos casos, una porción de un compuesto antisentido se compara con una porción de la misma longitud del ácido nucleico diana. En ciertos casos, una porción de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 bases nitrogenadas se compara con una porción de la misma longitud del ácido nucleico diana.
En ciertos casos, una porción del oligonucleótido antisentido se compara con una porción de la misma longitud del ácido nucleico diana. En ciertos casos, una porción de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 bases nitrogenadas se compara con una porción de la misma longitud del ácido nucleico diana.
Modificaciones
Un nucleósido es una combinación base-azúcar. La porción de la base nitrogenada (también conocida como base) del nucleósido es normalmente un resto de base heterocíclica. Los nucleótidos son nucleósidos que incluyen además un grupo fosfato ligado covalentemente a la porción de azúcar del nucleósido. Para aquellos nucleósidos que incluyen un azúcar pentofuranosilo, el grupo fosfato puede estar ligado con el resto hidroxilo en 2', 3' o 5' del azúcar. Los oligonucleótidos se forman a través de la unión covalente de nucleósidos adyacentes entre sí, para formar un oligonucleótido polimérico lineal. Dentro de la estructura del oligonucleótido, se hace referencia a los grupos fosfatos habitualmente como los que forman las uniones internucleosídicas del oligonucleótido.
Las modificaciones de los compuestos antisentido engloban sustituciones o cambios en uniones internucleosídicas, restos de azúcar o bases nitrogenadas. A menudo se prefieren los compuestos antisentido modificados respecto a las formas nativas debido a sus propiedades deseables tales como, por ejemplo, mejor captación celular, mejor afinidad por el ácido nucleico diana, mayor estabilidad en presencia de nucleasas o mayor actividad inhibidora.
También se pueden emplear nucleósidos modificados químicamente para aumentar la afinidad de unión de un oligonucleótido antisentido acortado o truncado por su ácido nucleico diana. En consecuencia, a menudo se pueden obtener resultados comparables como compuestos antisentido más cortos que tienen nucleósidos modificados químicamente de este tipo.
Uniones internucleosídicas modificadas
La unión internucleosídica de origen natural de ARN y ADN es una unión fosfodiéster de 3' a 5'. A menudo se seleccionan compuestos antisentido que tienen una o más uniones internucleosídicas modificadas, es decir, que no tienen un origen natural, respecto a compuestos antisentido que tienen uniones internucleosídicas de origen natural debido a propiedades deseables tales como, por ejemplo, mejor captación celular, mejor afinidad por los ácidos nucleicos diana y mayor estabilidad en presencia de nucleasas.
Los oligonucleótidos que tienen uniones internucleosídicas modificadas incluyen uniones internucleosídicas que mantienen un átomo de fósforo así como también uniones internucleosídicas que no tienen un átomo de fósforo. Las uniones internucleosídicas que contienen fósforo representantivas incluyen, sin carácter limitante, fosfodiésteres, fosfotriésteres, metilfosfonatos, fosforamidato y fosforotioatos. Los métodos de preparación de uniones que contienen fósforo y que no contienen fósforo son muy conocidos.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido que tienen como diana un ácido nucleico de apo(a), tal como se definen en las reivindicaciones, comprenden una o más uniones internucleosídicas modificadas. En ciertas realizaciones, las uniones internucleosídicas modificadas son uniones de fosforotioato. En ciertas realizaciones, cada unión internucleosídica de un compuesto antisentido es una unión internucleosídica de fosforotioato.
Restos de azúcar modificados
Los compuestos antisentido pueden contener opcionalmente uno o más nucleósidos donde el grupo azúcar se ha modificado. Tales nucleósidos modificados en el azúcar pueden conferir una mayor estabilidad frente a nucleasas, mayor afinidad de unión o alguna otra propiedad biológica beneficiosa a los compuestos antisentido. En ciertas realizaciones, los nucleósidos comprenden restos de anillos de ribofuranosa modificados químicamente. Los ejemplos de anillos de ribofuranosa modificados químicamente incluyen, sin carácter limitante, la adición de grupos sustituyentes (incluidos grupos sustituyentes en 5' y 2', puente entre átomos anulares no geminales para formar ácidos nucleicos bicíclicos (BNA, por sus siglas en inglés), reemplazo del átomo de oxígeno del anillo de ribosilo con S, N(R), o C(R1)(R2) (R, R1 y R2 son cada uno independientemente H, alquilo C1-C12 o un grupo protector) y combinaciones de estos. Los ejemplos de azúcares modificados químicamente incluyen un nucleósido con sustitución 2'-F-5'-metilo (véase la solicitud internacional PCT WO 2008/101157 publicada el 21/8/08 para otros nucleósidos con sustitución 5',2'-bis divulgados) o reemplazo del átomo de oxígeno del anillo de ribosilo con S con sustitución adicional en la posición 2' (véase la solicitud de patente de EE. UU. publicada US2005-0130923, publicada el 16 de junio de 2005) o como alternativa la sustitución en 5' de un BNA (véase la solicitud internacional PCT WO 2007/134181 publicada el 22/11/07 donde LNA se sustituye con, por ejemplo, un grupo 5'-metilo o 5'-vinilo).
Los ejemplos de nucleósidos que tienen restos de azúcar modificados incluyen, sin carácter limitante, nucleósidos que comprenden grupos sustituyentes 5'-vinilo, 5'-metilo (R o S), 4'-S, 2'-F, 2-OCH3 , 2-OCH2CH3 , 2-OCH2CH2F y 2'-O(CH2)2OCH3. El sustituyente en la posición 2' también se puede seleccionar entre alilo, amino, azido, tio, O-alilo, O­ alquilo C1-C10, OCF3 , OCH2F, O(CH2)2SCH3, O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn), y O-CH2-C(=O)-N(R1)-(CH2)2-N(Rm)(R.), donde cada Rl, Rm y Rn es, independientemente, H o alquilo C1-C10 sustituido o no sustituido.
Tal como se utiliza en la presente, «nucleósidos bicícliclos» se refiere a nucleósidos modificados que comprenden un resto de azúcar bicíclico. Los ejemplos de nucleósidos bicíclicos incluyen, sin carácter limitante, nucleósidos que comprenden un puente entre los átomos 4' y 2' del anillo ribosilo. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido proporcionados en la presente incluyen uno o más nucleósidos bicíclicos que comprenden un puente de 4' a 2'. Los ejemplos de tales nucleósidos bicíclicos con puente de 4' a 2' incluyen, sin carácter limitante, uno o más de las fórmulas: 4'-(CH2)-O-2' (LNA); 4'-(CH2)-S-2'; 4'-(CH2)2-O-2' (ENA); 4'-CH(CH3)-O-2' y 4'-CH(CH2OCH3)-O-2' (y análogos de estos, véase la patente de EE. UU. 7399845, emitida el 15 de julio de 2008); 4'-C(CH3)(CH3)-O-2' (y análogos de este, véase la solicitud internacional publicada WO/2009/006478, publicada el 8 de enero de 2009); 4'-CH2-N(OCH3)-2' (y análogos de este, véase la solicitud internacional publicada w O/2008/150729, publicada el 11 de diciembre de 2008); 4-CH2-O-N(CH3)-2' (véase la solicitud de patente de EE. UU. publicada US2004-0171570, publicada el 2 de septiembre de 2004); 4'-CH2-N(R)-O-2', donde R es H, alquilo C1-C12, o un grupo protector (veáse la patente de EE. UU. 7427672, emitida el 23 de septiembre de 2008); 4'-CH2-C(H)(CH3)-2' (véase Chattopadhyaya et al., J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134); y 4'-CH2-C(=CH2)-2' (y análogos de este, véase la solicitud internacional publicada WO 2008/154401, publicada el 8 de diciembre de 2008).
También se pueden consultar informes adicionales relacionados con nucleósidos bicíclicos en la bibliografía publicada (véase, por ejemplo: Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2000, 97, 5633-5638; Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039; Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 2007,129(26) 8362­ 8379; Elayadi et al., Curr. Opinion Invest. Drugs, 2001,2, 558-561; Braasch et al., Chem. Biol., 2001, 8, 1-7; y Orum et al., Curr. Opinion Mol. Ther, 2001, 3, 239-243; patentes de EE. UU. N.os 6268490; 6525 191; 6670461; 6770748; 6 794499; 7034 133; 7053207; 7399845; 7547684; y 7696 345; publicación de patente de EE. UU. N.° US2008-0039618; US2009-0012281; patente de EE. UU. con N.os de serie 60/989574; 61/026995; 61/026998; 61/056564; 61/086231; 61/097787; y 61/099 844; solicitudes internacionales PCT publicadas WO 1994/014226; WO 2004/106356; WO 2005/021570; WO 2007/134181; WO 2008/150729; WO 2008/154401; y WO 2009/006478. Cada uno de los nucleósidos bicíclicos anteriores se pueden preparar de manera que tengan una o más configuraciones estereoquímicas del azúcar incluidas, por ejemplo, a-L-ribofuranosa y p-D-ribofuranosa (véase la solicitud internacional PCT PCT/DK98/00393, publicada el 25 de marzo de 1999 como WO 99/14226).
En ciertas realizaciones, los restos de azúcar bicíclicos de nucleósidos BNA incluyen, sin carácter limitante, compuestos que tienen al menos un puente entre la posición 4’ y la 2’ del resto de azúcar pentofuranosilo donde tales puentes comprenden independientemente 1 o de 2 a 4 grupos ligados seleccionados independientemente entre -[C(Ra)(Rb)]n-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -C(=O)-, -C(=NRa)-, -C(=S)-, -O-, -Si(Ra)2-,-S(=O)x-, y -N(Ra)-;
donde:
x es 0, 1 o 2;
n es 1, 2, 3 o 4;
cada Ra y Rb son, independientemente, H, un grupo protector, hidroxilo, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, arilo C5-C20, arilo C5-C20 sustituido, radical heterociclo, radical heterociclo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, radical alicíclico C5-C7 , radical alicíclico C5-C7 sustituido, halógeno, OJ1, NJ1J2 , SJ1, N3 , COOJ1, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, CN, sulfonilo (S(=O)2-J1), o sulfoxilo (S(=O)-J1); y
cada J1 y J2 son, independientemente, H, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, arilo C5-C20, arilo C5-C20 sustituido, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, un radical heterociclo, un radical heterociclo sustituido, aminoalquilo C1-C12, aminoalquilo C1-C12 sustituido o un grupo protector.
En ciertas realizaciones, el puente de un resto de azúcar bicíclico es -[C(Ra)(Rb)]n-, -[C(Ra)(Rb)]n-O-, -C(RaRb)-N(R)-O- o -C(RaRb)-O-N(R)-. En ciertas realizaciones, el puente es 4'-CH2-2', 4 '-(Ch2)2-2', 4'-(Ch2)3-2', 4'-CH2-O-2', 4'-(CH2)2-O-2', 4'-cH2-O-N(R)-2' y 4'-CH2-N(R)-O-2'- donde cada R es, independientemente, H, un grupo protector o alquilo C1-C12.
En ciertas realizaciones, los nucleósidos bicíclicos están definidos adicionalmente por la configuración isomérica. Por ejemplo, un nucleósido que comprende un puente 4’-2’ metilenoxi puede estar en la configuración a-L o en la configuración P-D. Anteriormente, se han incorporado a-L-metilenoxi (4'-CH2-O-2') BNA a oligonucleótidos antisentido que mostraron actividad antisentido (Frieden et al., Nucleic Acids Research, 2003, 21,6365-6372).
En ciertas realizaciones, los nucleósidos bicíclicos incluyen, sin carácter limitante, (A) a-L-metilenoxi (4'-CH2-O-2') BNA, (B) p-D-metilenoxi (4'-CH2-O-2') BNA, (C) etilenoxi (4'-(CH2)2-O-2') BNA, (D) aminooxi (4'-CH2-O-N(R)-2') BNA, (E) oxiamino (4'-CH2-N(R)-O-2') BNA y (F) metil(metilenoxi) (4'-CH(CH)-O-2') BNA, (G) metilentio (4'-CH2-S-2') BNA, (H) metilenamino (4'-CH2-N(R)-2') BNA, (I) metilcarbocíclico (4'-CH2-Ch (Ch 3)-2') BNA y (J) propilencarbocíclico (4'-(CH2)3-2') BNA como se muestra a continuación.
Figure imgf000024_0001
donde Bx es el resto de base y R es independientemente H, un grupo protector o alquilo C1-C12.
En ciertas realizaciones, se proporcionan nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula I:
donde:
Bx es un resto de base heterocíclico;
-Qa-Qb-Qc- es -CH2-N(Rc)-CH2-, -C(=O)-N(Rc)-CH2-, -CH2-O-N(Rc)-, -CH2-N(Rc)-O- o -N(Rc)-O-CH2;
Rc es alquilo C1-C12 o un grupo protector de amino; y
Ta y Tb son cada uno, independientemente, H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte.
Figure imgf000025_0001
Bx es un resto de base heterocíclico;
Ta y Tb son cada uno, independientemente, H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
Za es alquilo C1-C6 , alquenilo C2-C6 , alquinilo C2-C6 , alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 sustituido, acilo, acilo sustituido, amida sustituida, tiol o tio sustituido.
En una realización, cada uno de los grupos sustituidos está, independientemente, mono o polisustituido con grupos sustituyentes seleccionados independientemente entre halógeno, oxo, hidroxilo, OJc, NJJd, SJc, N3 , OC(=X)Jc y NJeC(=X)NJcJd, donde cada Jc, Jd y Je son, independientemente, H, alquilo C1-C6 o alquilo C1-C6 sustituido y X es O o NJc.
En ciertas realizaciones, se proporcionan nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula III:
Figure imgf000025_0002
Bx es un resto de base heterocíclico;
Ta y Tb son cada uno, independientemente, H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
Zb es alquilo C1-C6 , alquenilo C2-C6 , alquinilo C2-C6 , alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6 sustituido, alquini sustituido o acilo sustituido (C(=O)-).
En ciertas realizaciones, se proporcionan nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula IV:
Figure imgf000025_0003
Bx es un resto de base heterocíclico;
Ta y Tb son cada uno, independientemente, H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
Rd es alquilo C1-C6 , alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6 , alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 o alquinilo C2-C6 sustituido;
cada qa, qb, qc y qd son, independientemente, H, halógeno, alquilo C1-C6 , alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6 , alquenilo
C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 o alquinilo C2-C6 sustituido, alcoxilo C1-C6 , alcoxilo C1-C6 sustituido, acilo, acilo sustituido, aminoalquilo C1-C6 o aminoalquilo C1-C6 sustituido;
En ciertas realizaciones, se proporcionan nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula V:
Figure imgf000026_0001
Bx es un resto de base heterocíclico;
Ta y Tb son cada uno, independientemente, H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
qa, qb, qe y qf son cada uno, independientemente, hidrógeno, halógeno, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, alcoxi C1-C12, alcoxi C1-C12 sustituido, OJj, SJj, SOJj, SO2Jj, NJjJk, Na, CN, C(=O)OJj, C(=O)NJjJk, C(=O)Jj, O-C(=O)-NJjJk, N(H)C(=NH)NJjJk, N(H)C(=O)NJjJk o N(H)C(=S)NJjJk;
o qe y qf juntos son =C(qg)(qh);
qg y qh son cada uno, independientemente, H, halógeno, alquilo C1-C12 o alquilo C1-C12 sustituido.
La síntesis y preparación de los monómeros de metilenoxi (4'-CH2-O-2') BNA adenina, citosina, guanina, 5-metilcitosina, timina, uracilo, junto con su oligomerización y propiedades de reconocimiento de ácidos nucleicos se han descrito en (Koshkin et al., Tetrahedmn, 1998, 54, 3607-3630). Los BNA y la preparación de estos también se ha descrito en los documentos WO 98/39352 y WO 99/14226.
También se han preparado análogos de metilenoxi (4'-CH2-O-2') BNA y 2’-tio-BNA (Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222). También se ha descrito preparación de análogos de nucleósidos bloqueados que comprenden dúplex de oligodesoxirribonucleótidos como sustratos para las polimerasas de ácidos nucleicos (Wengel et al., WO 99/14226). Además, en la técnica se ha descrito la síntesis de 2’-amino-BNA, un análogo de oligonucleótidos de afinidad elevada restringido conformacionalmente novedoso (Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039). Además, se ha preparado 2’-amino- y 2’-metilamino-BNA y la estabilidad térmica de sus dúplex con hebras de ARN y ADN complementarias se ha descrito con anterioridad.
En ciertas realizaciones, se proporcionan nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula VI:
Figure imgf000026_0002
Bx es un resto de base heterocíclico;
Ta y Tb son cada uno, independientemente, H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
cada qi, qj, qk y ql son, independientemente, H, halógeno, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, alcoxilo C1-C12, alcoxilo C1-C12 sustituido, OJj, SJj, SOJj, SO2Jj, NJjJk, N3 , CN, C(=O)OJj, C(=O)NJjJk, C(=O)Jj, O-C(=O)-NJjJk, N(H)C(=NH)NJjJk, N(H)C(=O)NJjJk o N(H)C(=S)NJjJk; y
qi y qj o ql y qk juntos son =C(qg)(qh), donde qg y qh son cada uno, independientemente, H, halógeno, alquilo C1-C12 o alquilo C1-C12 sustituido.
Se han descrito un nucleósido bicíclico carbocíclico que tiene un puente 4'-(CH2)3-2’ y el análogo de alquenilo con puente 4'-CH=CH-CH2-2’ (Freier et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4429-4443 and Albaek et al., J. Org. Chem., 2006, 71, 7731-7740). También se han descrito la síntesis y preparación de nucleósidos bicílicos carbocíclicos junto con sus estudios de oligomerización y bioquímicos (Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(26), 8362-8379).
Tal como se utiliza en la presente, «nucleósido bicíclico 4’-2’» o «nucleósido bicíclico de 4’ a 2’» se refiere a un nucleósido bicíclico que comprende un anillo de furanosa que comprende un puente que conecta dos átomos de carbono del anillo de furanosa que conecta el átomo de carbono 2’ y el átomo de carbono 4’ del anillo de azúcar.
Tal como se utiliza en la presente, «nucleósidos monocíclicos» se refiere a nucleósidos que comprenden restos de azúcar modificados que no son restos de azúcar bicíclicos. En ciertas realizaciones, el resto de azúcar, o análogo de resto de azúcar, de un nucleósido puede estar modificado o sustituido en cualquier posición.
Tal como se utiliza en la presente, «azúcar modificado en la posición 2’» se refiere a un azúcar furanosilo modificado en la posición 2’. En ciertas realizaciones, tales modificaciones incluyen sustituyentes seleccionados entre: un haluro, incluido, sin carácter limitante, alcoxi sustituido y no sustituido, tioalquilo sustituido y no sustituido, aminoalquilo sustituido y no sustituido, alquilo sustituido y no sustituido, alilo sustituido y no sustituido y alquinilo sustituido y no sustituido. En ciertas realizaciones, las modificaciones en 2’ se seleccionan entre sustituyentes que incluyen, sin carácter limitante:
donde n y m son de 1 a aproximadamente 10. Otros sustituyentes 2’ también se pueden seleccionar entre: alquilo C1-C12, alquilo sustituido, alquenilo, alquinilo, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo u O-aralquilo, SH, SCH3 , OCN, Cl, Br, CN, F, CF3 , OCF3 , SOCH3 , SO2CH3 , ONO2 , NO2 , N3 , NH2 , heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo de escisión de ARN, un grupo indicador, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas, o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un compuesto antisentido y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. En ciertas realizaciones, los nucleósidos modificados comprenden una cadena lateral 2’-MOE (Baker et al., J. Biol. Chem., 1997, 272, 11944-12000). Se ha descrito que tal sustitución 2’-MOE tiene una mejor afinidad de unión en comparación con nucleósidos no modificados y otros nucleósidos modificados, tales como 2'-0-metilo, O-propilo y O-aminopropilo. Los oligonucleótidos que tienen el sustituyente 2’-MOE también han mostrado ser inhibidores antisentido de la expresión génica con características prometedoras para el uso in vivo (Martin,
Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504; Altmann et al., Chimia, 1996, 50, 168-176; Altmann et al., Biochem. Soc. Trans.,
1996, 24, 630-637; y Altmann et al., Nucleosides Nucleotides, 1997, 16, 917-926).
Tal como se utiliza en la presente, un «nucleósido tetrahidropirano modificado» o «nucleósido THP modificado» se refiere a un nucleósido que tiene un «azúcar» tetrahidropirano de seis miembros que sustituye el residuo pentofuranosilo en nucleósidos normales (un sustituto de azúcar). Los nucleósidos THP modificados incluyen, sin carácter limitante, lo que en la técnica se denomina ácido hexitolnucleico (HNA, por sus siglas en inglés), ácido anitolnucleico (ANA, por sus siglas en inglés), ácido manitolnucleico (MNA, por sus sigas en inglés) (véase Leumann, Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 841­
854 , fluoro HNA F-HNA) o aquellos compuestos que tienen la Fórmula Vil:
Figure imgf000027_0001
V I I
donde independientemente para cada uno de dicho al menos un análogo de nucleósido tetrahidropirano de Fórmula VII:
Bx es un resto de base heterocíclico;
Ta y Tb son cada uno, independientemente, un grupo de ligación internucleosídico que liga el análogo de nucleósido tetrahidropirano al compuesto antisentido o uno de Ta y Tb es un grupo de ligación internucleosídico que liga el análogo de nucleósido tetrahidropirano con el compuesto antisentido y el otro de Ta y Tb es H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado ligado o un grupo terminal 5’ o 3’;
q1, q2, q3, q4, q5, q6 y q7 son cada uno independientemente H, alquilo C1-C6 , alquilo C1-C6 sustituid alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 o alquinilo C2-C6 sustituido; y cada uno de R1 y R2 se selecciona entre hidrógeno, hidroxilo, halógeno, alcoxi sustituido o no sustituido, NJ1J2 , SJ1, N3 , OC(=X)J1, OC(=X)NJJ2 , NJ3C (=X )N JJ y CN, donde
X es O, S o NJ1 y cada uno de J1, J2 y J3 es, independientemente, H o alquilo C1-C6.
En ciertas realizaciones, se proporcionan los nucleósidos THP modificados de Fórmula VII donde q1, q2 , q3, q4, q5, q6 y q7 son cada uno H. En ciertas realizaciones, al menos uno de q1, q2 , q3, q4, q5, q6 y q7 es diferente de H. En ciertas realizaciones, el menos uno de q1, q2 , q3, q4, q5, q6 y q7 es metilo. En ciertas realizaciones, se proporcionan los nucleósidos
THP de Fórmula VII donde uno de R1 y R2 es fluoro. En ciertas realizaciones, R1 es fluoro y R2 es H; R1 es metoxi y R2 es
H, y R1 es metoxietoxi y R2 es H. En ciertas realizaciones, R1 es H y R2 es fluoro; R1 es H y R2 es metoxi, y R1 es H y y
R2 es metoxietoxi.
Tal como se utiliza en la presente «modificado en la posición 2’» o «sustituido en la posición 2’» se refiere a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un sustituyente en la posición 2’ que no es H u OH. Los nucleósidos modificados en la posición 2’ incluyen, sin carácter limitante, nucleósidos bicíclicos donde el puente que conecta dos átomos de carbono del anillo de azúcar conecta el carbono 2’ y otro carbono del anillo de azúcar; y nucleósidos con sustituyentes en
2’ que no son puentes, tales como alilo, amino, azido, tio, O-alilo, O-alquilo C1-C10 -OCF3 , O-(CH2)2-O-CH3, 2'-O(CH2)2SCH3, O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn) u O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn), donde cada Rm y Rn es, independientemente, H o alquilo
C1-C10 sustituido o no sustituido. Los nucleósidos modificados en 2’ pueden comprender además otras modificaciones, por ejemplo, en otras posiciones del azúcar y/o en la base nitrogenada.
Tal como se utiliza en la presente «2’-F» se refiere a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un grupo fluoro en la posición 2’.
Tal como se utiliza en la presente, cada uno de «2'-OMe» o «2-OCH3» o «2'-O-metNo» se refiere a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un grupo -OCH3 en la posición 2' del anillo de azúcar.
Tal como se utiliza en la presente, cada uno de «MOE» o «2'-MOE» o «2-OCH2CH2OCH3» o «2'-O-metoxietilo» se refiere a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un grupo -OCH2CH2OCH3 en la posición 2' del anillo de azúcar.
Tal como se utiliza en la presente, «oligonucleótido» se refiere a un compuesto que comprende una pluralidad de nucleósidos ligados. En ciertas realizaciones, uno o más de la pluralidad de nucleósidos está modificado. En ciertas realizaciones, un oligonucleótido comprende uno o más ribonucleósidos (ARN) y/o desoxirribonucleósidos (ADN).
En la técnica también se sabe que muchos otros sistemas anulares sustitutos de azúcar biciclo y triciclo se pueden utilizar para modificar nucleósidos para incorporarlos en compuestos antisentido (véase, por ejemplo, el artículo de revisión: Leumann, Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 841-854). Tales sistemas anulares pueden experimentar diversas sustituciones adicionales para mejorar la actividad.
Los expertos en la técnica están muy familiarizados con los métodos para preparar azúcares modificados.
En los nucleótidos que tienen restos de azúcar modificados, los restos de bases nitrogenadas (naturales, modificadas o una combinación de estas) se mantienen para la hibridación con un ácido nucleico diana apropiado.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido comprenden uno o más nucleósidos que tienen restos de azúcar modificados. En ciertas realizaciones, el resto de azúcar modificado es 2'-MOE. En ciertas realizaciones, los nucleósidos modificados con 2'-MOE se disponen en un motivo de gápmero. En ciertas realizaciones, el resto de azúcar modificado es un nucleósido bicíclico que tiene un grupo puente (4'-CH(CH3)-O-2'). En ciertas realizaciones, los nucleósidos modificados con (4'-CH(CH3)-O-2') se disponen a lo largo de los laterales de un motivo gápmero. En ciertas realizaciones, el resto de azúcar modificado es un cEt. En ciertas realizaciones, los nucleótidos modificados con cEt se disponen a lo largo de los laterales de un motivo gápmero.
Bases nitrogenadas modificadas
Las modificaciones o sustituciones en bases nitrogenadas (o bases) se pueden distinguir estructuralmente de las bases nitrogenadas de origen natural o sintéticas no modificadas y, sin embargo, son intercambiables desde un punto de vista funcional. Tanto las bases nitrogenadas naturales como modificadas son capaces de participar en enlaces de hidrógeno. Tales modificaciones en las bases nitrogenadas pueden conferir estabilidad frente a nucleasas, afinidad de unión o alguna otra propiedad biológica beneficiosa a los compuestos antisentido. Las bases nitrogenadas modificadas incluyen bases nitrogenadas sintéticas y naturales tales como, por ejemplo, 5-metilcitosina (5-me-C). Ciertas sustituciones de bases nitrogenadas, incluidas sustituciones de 5-metilcitosina, son especialmente útiles para incrementar la afinidad de unión de un compuesto antisentido por un ácido nucleico diana. Por ejemplo, las sustituciones de 5-metilcitosina han mostrado que incrementan la estabilidad de dúplex de ácidos nucleicos en 0,6-1,2 °C (Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. y Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Ratón, 1993, pp. 276-278).
Bases nitrogenadas modificadas adicionales incluyen 5-hidroximetilcitosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metil y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-propilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5-propinil (-CEC-CH3) uracilo y citosina y otros derivados de alquinilo de bases de pirimidina, 6-azouracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras adeninas y guaninas sustituidas en la posición 8, 5-halo particularmente 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros uracilos y citosinas sustituidos en la posición 5, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2-aminoadenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-desazaguanina y 7-desazaadenina y 3-desazaguanina y 3-desazaadenina.
Los restos de bases heterocíclicas pueden incluir aquellos en los que la base de purina o pirimidina se reemplaza con otros heterociclos, por ejemplo, 7-desazaadenina, 7-desazaguanosina, 2-aminopiridina y 2-piridona. Las bases nitrogenadas que son particularmente útiles para aumentar la afinidad de unión de compuestos antisentido incluyen las pirimidinas sustituidas en la posición 5, 6-azapirimidinas y purinas sustituidas en las posiciones N-2, N-6 y O-6 , incluidas 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido que tienen como diana un ácido nucleido de apo(a), tal como se definen en las reivindicaciones, comprenden una o más bases nitrogenadas modificadas. En ciertos casos, los oligonucleótidos antisentido con gap ampliado que tienen como diana un ácido nucleico de apo(a), tal como se definen en las reivindicaciones, comprenden una o más bases nitrogenadas modificadas. En ciertas realizaciones, la base nitrogenada modificada es 5-metilcitosina. En ciertas realizaciones, cada citosina es una 5-metilcitosina.
Composiciones y métodos para formular composiciones farmacéuticas
Los oligonucleótidos antisentido se pueden mezclar con sustancias inertes o activas farmacéuticamente aceptables para preparar composiciones o formulaciones farmacéuticas. Las composiciones y métodos para formular composiciones farmacéuticas depende de varios criterios que incluyen, sin carácter limitante, la vía de administración, extensión de la enfermedad o dosis que se va a administrar.
Se puede utilizar un compuesto antisentido que tiene como diana un ácido nucleico de apo(a) en composiciones farmacéuticas combinando el compuesto antisentido con un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable adecuado.
En ciertas realizaciones, el «excipiente» o «portador farmacéutico» es un disolvente, agente de suspensión o cualquier otro vehículo inerte desde un punto de vista farmacológico farmacéuticamente aceptable para suministrar uno o más ácidos nucleicos a un animal. El excipiente puede ser líquido o sólido y se puede seleccionar, teniendo en cuenta la manera prevista de administración, de manera que proporcione la cantidad, consistencia, etc., deseadas cuando se combine con un ácido nucleico y los otros componentes de una composición farmacéutica concreta. Los portadores farmacéuticos típicos incluyen, sin carácter limitante, agentes de unión (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa, etc.); rellenos (por ejemplo, lactosa y otros azúcares, celulosa microcristalina, pectina, gelatina, sulfato de calcio, etilcelulosa, poliacrilatos o hidrogenofosfato de calcio, etc.); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco, sílice, dióxido de silicio coloidal, ácido esteárico, estearatos metálicos, aceites vegetales hidrogenados, almidón de maíz, polietilenglicoles, benzoato de sodio, acetato de sodio, etc.); desintegrantes (por ejemplo, almidón, glicolato sódico de almidón, etc.); y agentes humectantes (por ejemplo, laurilsulfato de sodio, etc.).
Los excipientes orgánicos o inorgánicos farmacéuticamente aceptables, que no reaccionen de manera negativa con ácidos nucleicos, adecuados para la administración parenteral o no parenteral también se pueden utilizar para formular las composiciones de la presente invención. Los portadores farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, sin carácter limitante, agua, soluciones salinas, alcoholes, polietilenglicoles, gelatina, lactosa, amilosa, estearato de magnesio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidona y similares.
Un diluyente farmacéuticamente aceptable incluye solución salina tamponada con fosfato (PBS). PBS es un diluyente adecuado para su uso en composiciones que se van a suministrar por vía parenteral. En consecuencia, en un caso, en los métodos descritos en la presente se emplea una composición farmacéutica que comprende un compuesto antisentido que tiene como diana un ácido nucleico de apo(a) y un diluyente farmacéuticamente aceptable. En ciertos casos, el diluyente farmacéuticamente aceptable es PBS. En ciertos casos, el compuesto antisentido es un oligonucleótido antisentido.
Las composiciones farmacéuticas que comprenden compuestos antisentido engloban cualesquiera sales, ésteres o sales de tales ésteres farmacéuticamente aceptables o un oligonucleótido que, tras la administración a un animal, incluido un ser humano, es capaz de proporcionar (directa o indirectamente) el metabolito o residuo de este con actividad biológica. En consecuencia, por ejemplo, la divulgación también se refiere a sales farmacéuticamente aceptables de compuestos antisentido, profármacos, sales farmacéuticamente aceptables de tales profármacos y otros bioequivalentes. Tales sales farmacéuticamente aceptables incluyen, sin carácter limitante, sales de sodio y potasio.
Un profármaco puede incluir la incorporación de nucleósidos adicionales en uno o ambos extremos de un compuesto antisentido que son escindidos por nucleasas endógenas dentro del cuerpo, para formar el compuesto antisentido activo.
Compuestos antisentido conjugados
Los compuestos antisentido se pueden ligar covalentemente a uno o más restos o conjugados que potencian la actividad, distribución celular o captación celular de los oligonucleótidos antisentido resultantes. Los grupos conjugados típicos incluyen restos de colesterol y restos lipídicos. Los grupos conjugados adicionales incluyen carbohidratos, fosfolípidos, biotina, fenazina, folato, fenantridina, antraquinona, acridina, fluoresceínas, rodaminas, cumarinas y tintes.
Los compuestos antisentido también se pueden modificar para tener uno o más grupos estabilizantes que están unidos por lo general a uno o ambos extremos de los compuestos antisentido para potenciar propiedades tales como, por ejemplo, la estabilidad frente a nucleasas. En los grupos estabilizantes se incluyen las estructuras de tipo caperuza. Estas modificaciones terminales protegen el compuesto antisentido que tiene ácidos nucleicos terminales de la degradación por exonucleasas y puede facilitar el suministro y/o ubicación dentro de una célula. La caperuza puede estar presente en el extremo 5' (caperuza 5') o en el extremo 3' (caperuza 3') o puede estar presente en ambos extremos. Las estructuras de tipo caperuza son muy conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, caperuzas abásicas desoxi invertidas. Otros grupos estabilizantes en 3' y 5' que se pueden utilizar como caperuzas en uno o ambos extremos de un compuesto antisentido para conferir estabilidad frente a nucleasas incluyen los divulgados en el documento WO 03/004602, publicado el 16 de enero de 2003.
Cultivo celular y tratamiento con compuestos antisentido
Los efectos de los compuestos antisentido en el nivel, actividad o expresión de ácidos nucleicos de apo(a) se pueden estudiar in vitro en diversos tipos celulares. Los tipos celulares utilizados para tales análisis se pueden adquirir de proveedores comerciales (por ejemplo, la Colección de Cultivos Tipo Estadounidense, Manassus, VA; Zen-Bio, Inc., Research Triangle Park, n C; Clonetics Corporation, Walkersville, MD) y se cultivan de acuerdo con las instrucciones de proveedor utilizando reactivos comercializados (por ejemplo, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). Los tipos celulares ilustrativos incluyen, sin carácter limitante, células HepG2, células Hep3B, células Huh7 (carcinoma hepatocelular), hepatocitos primarios, células A549, fibroblastos GM04281 y células LLC-MK2.
Pruebas in vitro de oligonucleótidos antisentido
En la presente se describen métodos para el tratamiento de células con oligonucleótidos antisentido, que se pueden modificar de manera apropiada para el tratamiento con otros compuestos antisentido.
En general, las células se tratan con oligonucleótidos antisentido cuando las células alcanzan aproximadamente un 60-80% de confluencia en el cultivo.
Un reactivo utilizado habitualmente para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye el reactivo de transfección con lípidos catiónicos LIPOFECTIN® (Invitrogen, Carlsbad, CA). Los oligonucleótidos antisentido se mezclan con LIPOFECTIN® en OPTI-MEM® 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para conseguir la concentración final deseada de oligonucleótido antisentido y una concentración de LIPOFECTIN® que está comprendida habitualmente entre 2 y 12 ug/mL por oligonucleótido antisentido 100 nM.
Otro reactivo utilizado para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye LIPOFECTAMINE 2000® (Invitrogen, Carlsbad, CA). El oligonucleótido antisentido se mezcla con LIPOFECTAMINE 2000® en medio con reducción de suero OPTI-MEM® 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para conseguir la concentración deseada de oligonucleótido antisentido y una concentración de LIPOFECTAMINE® que está comprendida habitualmente entre 2 y 12 ug/mL por oligonucleótido antisentido 100 nM.
Otro reactivo utilizado para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye Cytofectin® (Invitrogen, Carlsbad, CA). El oligonucleótido antisentido se mezcla con Cytofectin® en medio con reducción de suero OPTI-MEM® 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para conseguir la concentración deseada de oligonucleótido antisentido y una concentración de Cytofectin® que está comprendida habitualmente entre 2 y 12 ug/mL por oligonucleótido antisentido 100 nM.
Otro reactivo utilizado para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye Oligofectamine™ (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). El oligonucleótido antisentido se mezcla con Oligofectamine™ en medio con reducción de suero OPTI-MEM® -1 (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) para conseguir la concentración deseada de oligonucleótido con una proporción de Oligofectamine™ respecto a oligonucleótido de aproximadamente 0,2 a 0,8 |jL por 100 nM.
Otro reactivo utilizado para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye FuGENE 6 (Roche Diagnostics Corp., Indianapolis, IN). Se mezcló un compuesto oligomérico antisentido con FuGENE 6 en 1 mL de RPMI sin suero para conseguir la concentración deseada de oligonucleótido con una proporción de FuGENE 6 respecto a compuesto oligomérico de 1 a 4 j L de FuGENE 6 por 100 nM.
Otra técnica utilizada para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye la electroporación (Sambrooke y Russell en Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Tercera edición. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York. 2001).
Las células se tratan con oligonucleótidos antisentido mediante métodos habituales. Las células se cosechan normalmente 16-24 horas después del tratamiento con el oligonucleótido antisentido, en cuyo momento se miden los niveles de ARN o proteína de los ácidos nucleicos diana mediante métodos conocidos en la técnica y descritos en la presente (Sambrooke y Russell en Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Tercera edición. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York. 2001). En general, cuando los tratamientos se realizan en múltiples réplicas, los datos se presentan como el promedio de los tratamientos replicados.
La concentración de oligonucleótido antisentido utilizado varía de línea celular a línea celular. Los métodos para determinar la concentración óptima de oligonucleótido antisentido para una línea celular particular son muy conocidos en la técnica (Sambrooke y Russell en Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Tercera edición. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York. 2001). Los oligonucleótidos antisentido se utilizan habitualmente en concentraciones comprendidas entre 1 nM y 300 nM cuando se transfectan con LIPOFECTAMINE2000® (Invitrogen, Carlsbad, CA), Lipofectin® (Invitrogen, Carlsbad, CA) o Cytofectin™ (Genlantis, San Diego, CA). Los oligonucleótidos antisentido se utilizan con concentraciones más elevadas comprendidas entre 625 y 20000 nM cuando se transfectan utilizando electroporación.
Aislamiento de ARN
El análisis de ARN se puede realizar en el ARN celular total o poli(A) ARNm. Los métodos de aislamiento de ARN son muy conocidos en la técnica (Sambrooke y Russell en Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Tercera edición. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York. 2001). Por ejemplo, el ARN se puede preparar utilizando TRIZOL® (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acuerdo con los protocolos recomendados por el fabricante.
Análisis de la inhibición de la expresión o niveles diana
La inhibición de los niveles o expresión de un ácido nucleico de apo(a) se puede analizar de diversas maneras conocidas en la técnica (Sambrooke y Russell en Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Tercera edición. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 2001). Por ejemplo, los niveles de ácidos nucleicos diana se pueden cuantificar mediante, por ejemplo, análisis Northern, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) competitiva o PCR en tiempo real cuantitativa. El análisis de ARN se puede realizar en el ARN celular total o poli(A) ARNm. Los métodos de aislamiento de ARN son muy conocidos en la técnica. El análisis Northern también es habitual en la técnica. La PCR en tiempo real cuantitativa se puede conseguir convenientemente utilizando el Sistema de detección de secuencias ABI PRISM 7600, 7700 o 7900 comercializado que se puede obtener de PE-Applied Biosystems (Foster City, CA) y utilizar de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Análisis por PCR en tiempo real cuantitativa de los niveles de ARN diana
La cuantificación de los niveles de ARN diana se puede lograr mediante PCR en tiempo real cuantitativa utilizando el Sistema de detección de secuencias ABI PRISM® 7600, 7700 o 7900 (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los métodos para realizar la PCR en tiempo real cuantitativa son muy conocidos en la técnica.
Antes de la PCR en tiempo real, el ARN aislado se somete a reacción con la transcriptasa inversa (RT, por sus siglas en inglés), que produce el ADN complementario (ADNc) que se utiliza a continuación como el sustrato para la amplificación por PCR en tiempo real. Las reacciones con RT y PCR en tiempo real se realizan de manera secuencial en el mismo pocillo de la muestra. Los reactivos para RT y PCR en tiempo real se obtienen de Invitrogen (Carlsbad, CA). Las reacciones con RT y PCR en tiempo real se llevan a cabo mediante métodos muy conocidos por los expertos en la técnica.
Las cantidades de gen (o ARN) diana obtenidas mediante la PCR en tiempo real se pueden normalizar utilizando el nivel de expresión de un gen cuya expresión es constante, tal como la ciclofilina A o GADPH, o cuantificando el ARN total utilizando RIBOGREEN® (Invitrogen, Inc. Carlsbad, CA). La expresión de la ciclofilina A o GAPDH se puede cuantificar mediante PCR en tiempo real, ejecutándola simultáneamente con la diana, de manera múltiple (multiplexing) o por separado. El ARN total se cuantifica utilizando el reactivo de cuantificación de ARN RIBOGREEN® (Invitrogen, Inc. Carlsbad, CA). Los métodos de cuantificación de ARN con RIBOGREEN® se describen en Jones, L.J., et al., (Analytical Biochemistry, 1998, 265, 368-374). Se utiliza un instrumento CYTOFLUOR® 4000 (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) para medir la fluorescencia RIBOGREEN®.
Se pueden diseñar las sondas y cebadores para hibridarse con un ácido nucleico de apo(a). Los métodos para diseñar sondas y cebadores de PCR en tiempo real son muy conocidos en la técnica y pueden incluir el uso de software tal como el software PRIMER EXPRESS® (Applied Biosystems, Foster City, CA).
Análisis de los niveles de proteínas
Se puede evaluar la inhibición antisentido de los ácidos nucleicos de apo(a) midiendo los niveles de la proteína apo(a). Se pueden evaluar o cuantificar los niveles de proteína de apo(a) de varias maneras muy conocidas en la técnica, tales como la inmunoprecipitacion, análisis de inmunoelectrotransferencia (inmnotransferencia), ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA), ensayos cuantitativos de proteínas, ensayos de actividad proteica (por ejemplo, ensayos de actividad caspasa), inmunohistoquímica, inmunocitoquímica o clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) (Sambrooke y Russell en Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Tercera edición. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York. 2001). Los anticuerpos dirigidos a una diana se pueden identificar y obtener de varias fuentes, tales como el catálogo de anticuerpos MSRS (Aerie Corporation, Birmingham, MI) o se pueden preparar mediante métodos de generación de anticuerpos monoclonales o policlonales convencionales muy conocidos en la técnica. Están comercializados anticuerpos útiles para la detección de apo(a).
Pruebas in vivo de compuestos antisentido
Los compuestos antisentido, por ejemplo, oligonucleótidos antisentido, se estudian en animales para evaluar su capacidad para inhibir la expresión de apo(a) y producir cambios fenotípicos. La prueba se puede realizar en animales normales o modelos experimentales de enfermedades. Para la administración a los animales, los oligonucleótidos antisentido se formulan en un diluyente farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina o solución salina tamponada con fosfato. La administración incluye vías de administración parenteral. El cálculo de la dosificación de oligonucleótido antisentido y la frecuencia posológica dependen con frecuencia de factores tales como la vía de administración y el peso corporal del animal. Tras un periodo de tratamiento con oligonucleótidos antisentido, se aisla el ARN de un tejido y se miden los cambios en la expresión de ácidos nucleicos de apo(a). También se miden los cambios en los niveles de proteína apo(a).
Ciertas indicaciones
En la presente se divulgan métodos para tratar a un individuo que comprenden administrar una o más composiciones farmacéuticas como se describe en la presente. En ciertos casos, el individuo tiene una enfermedad relacionada con apo(a). En ciertos casos, el individuo tiene una enfermedad relacionada con Lp(a). En ciertos casos, el individuo tiene una enfermedad, trastorno o afección inflamatorios, cardiovasculares y/o metabólicos.
En ciertos casos, las enfermedades, trastornos o afecciones cardiovasculares incluyen, sin carácter limitante, aneurisma (por ejemplo, aneurisma aórtico abdominal), angina, arritmia, aterosclerosis, enfermedad cerebrovascular, arteriopatía coronaria, cardiopatía coronaria, dislipidemia, hipercolesterolemia, hiperlipidemia, hipertensión, hipertrigliceridemia, infarto de miocardio, enfermedad vascular periférica (por ejemplo, arteriopatía periférica), accidente cerebrovascular y similares.
En ciertos casos, los compuestos que tienen como diana apo(a) descritos en la presente modulan los marcadores fisiológicos o fenotipos de la enfermedad, trastorno o afección cardiovasculares. Por ejemplo, la administración de los compuestos a los animales puede reducir los niveles de LDL y colesterol en esos animales en comparación con animales no tratados. En ciertos casos, la modulación de los marcadores fisiológicos o fenotipos se puede asociar con la inhibición de apo(a) por parte de los compuestos.
En ciertos casos, los marcadores fisiológicos de la enfermedad, trastorno o afección cardiovasculares pueden ser cuantificables. Por ejemplo, los niveles de LDL o colesterol se pueden medir y cuantificar mediante, por ejemplo, pruebas de lípidos estándar. Para tales marcadores, en ciertos casos, el marcador se puede reducir en aproximadamente un 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 99% o un intervalo definido por dos cualesquiera de estos valores.
Asimismo, también se divulgan en la presente métodos para prevenir, tratar o mejorar un síntoma asociado con la enfermedad, trastorno o afección cardiovasculares en un sujeto que lo necesite. En ciertos casos, se divulga un método para reducir la velocidad de aparición de un síntoma asociado con la enfermedad, trastorno o afección cardiovasculares. En ciertos casos, se divulga un método para reducir la gravedad de un síntoma asociado con la enfermedad, trastorno o afección cardiovasculares. En tales casos, el método comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto que tiene como diana un ácido nucleico de apo(a) a un individuo que lo necesite.
La enfermedad, trastorno o afección cardiovasculares pueden estar caracterizados por numerosos síntomas físicos. Cualquier síntoma que un experto en la técnica sepa que está asociado con la enfermedad, trastorno o afección cardiovasculares se puede prevenir, tratar, mejorar o modular de otro modo con los compuestos y métodos descritos en la presente. En ciertos casos, los síntomas pueden ser cualquiera de, sin carácter limitante, angina, dolor de pecho, disnea, palpitaciones, debilidad, mareos, náuseas, sudoración, taquicardia, bradicardia, arritmia, fibrilación auricular, edema en las extremidades inferiores, cianosis, fatiga, desvanecimiento, entumecimiento de la cara, entumecimiento de las extremidades, claudicación o calambres en los músculos, hinchazón del abdomen o fiebre.
En ciertos casos, las enfermedades, trastornos o afecciones metabólicos incluyen, sin carácter limitante, hiperglucemia, prediabetes, diabetes (de tipo I y tipo II), obesidad, resistencia a la insulina, síndrome metabólico y dislipidemia diabética.
En ciertos casos, los compuestos que tienen como diana apo(a) descritos en la presente modulan los marcadores fisiológicos o fenotipos de la enfermedad, trastorno o afección metabólicos. Por ejemplo, la administración de los compuestos a los animales puede reducir los niveles de glucosa y de resistencia a la insulina en esos animales en comparación con animales no tratados. En ciertos casos, la modulación de los marcadores fisiológicos o fenotipos se puede asociar con la inhibición de apo(a) por parte de los compuestos.
En ciertos casos, los marcadores fisiológicos de la enfermedad, trastorno o afección metabólicos pueden ser cuantificables. Por ejemplo, los niveles de glucosa o la resistencia a la insulina se pueden medir y cuantificar mediante pruebas estándar conocidas en la técnica. Para tales marcadores, en ciertos casos, el marcador se puede reducir en aproximadamente un 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 99% o un intervalo definido por dos cualesquiera de estos valores. En otro ejemplo, la sensibilidad a la insulina se puede medir y cuantificar mediante pruebas estándar conocidas en la técnica. Para tales marcadores, en ciertos casos, el marcador se puede incrementar en aproximadamente un 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 99% o un intervalo definido por dos cualesquiera de estos valores.
Asimismo, también se divulgan en la presente métodos para prevenir, tratar o mejorar un síntoma asociado con la enfermedad, trastorno o afección metabólicos en un sujeto que lo necesite. En ciertos casos, se divulga un método para reducir la velocidad de aparición de un síntoma asociado con la enfermedad, trastorno o afección metabólicos. En ciertos casos, se divulga un método para reducir la gravedad de un síntoma asociado con la enfermedad, trastorno o afección metabólicos. En tales casos, el método comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto que tiene como diana un ácido nucleico de apo(a) a un individuo que lo necesite.
La enfermedad, trastorno o afección metabólicos pueden estar caracterizados por numerosos síntomas físicos. Cualquier síntoma que un experto en la técnica sepa que está asociado con la enfermedad, trastorno o afección metabólicos se puede prevenir, tratar, mejorar o modular de otro modo con los compuestos y métodos descritos en la presente. En ciertos casos, el síntoma puede ser cualquiera de, sin carácter limitante, producción de orina excesiva (poliuria), sed excesiva y aumento del consumo de líquidos (polidipsia), visión borrosa, pérdida de peso sin explicación y letargia.
En ciertos casos, las enfermedades, trastornos o afecciones inflamatorios incluyen, sin carácter limitante, arteriopatía coronaria (CAD), enfermedad de Alzheimer y enfermedades, trastornos o afecciones tromboembólicos. Ciertas enfermedades, trastornos o afecciones tromboembólicos incluyen, sin carácter limitante, accidentes cerebrovasculares, trombosis, infarto de miocardio y enfermedad vascular periférica.
En ciertos casos, los compuestos que tienen como diana apo(a) descritos en la presente modulan los marcadores fisiológicos o fenotipos de la enfermedad, trastorno o afección inflamatorios. Por ejemplo, la administración de los compuestos a los animales puede reducir los niveles de citocinas inflamatorias u otros marcadores inflamatorios en esos animales en comparación con animales no tratados. En ciertos casos, la modulación de los marcadores fisiológicos o fenotipos se puede asociar con la inhibición de apo(a) por parte de los compuestos.
En ciertos casos, los marcadores fisiológicos de la enfermedad, trastorno o afección inflamatorios pueden ser cuantificables. Por ejemplo, los niveles de citocinas se pueden medir y cuantificar mediante pruebas estándar conocidas en la técnica. Para tales marcadores, en ciertos casos, el marcador se puede reducir en aproximadamente un 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 99% o un intervalo definido por dos cualesquiera de estos valores.
Asimismo, también se divulgan en la presente métodos para prevenir, tratar o mejorar un síntoma asociado con la enfermedad, trastorno o afección inflamatorios en un sujeto que lo necesite. En ciertos casos, se divulga un método para reducir la velocidad de aparición de un síntoma asociado con la enfermedad, trastorno o afección inflamatorios. En ciertos casos, se divulga un método para reducir la gravedad de un síntoma asociado con la enfermedad, trastorno o afección inflamatorios. En tales casos, el método comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto que tiene como diana un ácido nucleico de apo(a) a un individuo que lo necesite.
También se divulgan métodos para tratar a un individuo con una enfermedad, trastorno o afección relacionados con apo(a) que comprenden administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una o más composiciones farmacéuticas como se describen en la presente. En ciertos casos, el individuo tiene niveles elevados de apo(a). En ciertos casos, se divulgan métodos para tratar a un individuo con una enfermedad, trastorno o afección relacionados con Lp(a) que comprenden administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una o más composiciones farmacéuticas como se describen en la presente. En ciertos casos, el individuo tiene niveles elevados de Lp(a). En ciertos casos, el individuo tiene una enfermedad, trastorno o afección inflamatorios, cardiovasculares y/o metabólicos. En ciertos casos, la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto antisentido que tiene como diana un ácido nucleico de apo(a) está acompañada por la monitorización de los niveles de apo(a) o Lp(a). En ciertos casos, la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto antisentido que tiene como diana un ácido nucleico de apo(a) está acompañada por la monitorización de marcadores de una enfermedad inflamatoria, cardiovascular y/o metabólica, u otro proceso de la enfermedad que se asocia con la expresión de apo(a), para determinar la respuesta del individuo al compuesto antisentido. Un médico puede utilizar la respuesta de un individuo a la administración del compuesto antisentido que tiene como diana apo(a) para determinar la cantidad y duración de la intervención terapéutica con el compuesto.
En ciertos casos, la administración de un compuesto antisentido que tiene como diana un ácido nucleico de apo(a) da como resultado la reducción de la expresión de apo(a) en al menos aproximadamente un 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 99%, o un intervalo definido por dos cualesquiera de estos valores. En ciertos casos, la expresión de apo(a) se reduce hasta < 100 mg/dL, < 90 mg/dL, < 80 mg/dL, < 70 mg/dL, < 60 mg/dL, < 50 mg/dL, < 40 mg/dL, < 30 mg/dL, <20 mg/dL o < 10 mg/dL.
En ciertos casos, la administración de un compuesto antisentido que tiene como diana un ácido nucleico de apo(a) da como resultado la reducción de la expresión de Lp(a) en al menos aproximadamente un 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 99%, o un intervalo definido por dos cualesquiera de estos valores.
En ciertos casos, las composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto antisentido que tiene como diana apo(a) se utilizan para preparar un medicamento para tratar a un paciente que padece o susceptible de una enfermedad, trastorno o afección inflamatorios, cardiovasculares y/o metabólicos.
Dosificación
En ciertos casos, las composiciones farmacéuticas se administran de acuerdo con un régimen posológico (por ejemplo, dosis, frecuencia de la dosis y duración) donde se puede seleccionar el régimen posológico para conseguir un efecto deseado. El efecto deseado puede ser, por ejemplo, la reducción de apo(a) o la prevención, reducción, mejora o ralentización de la evolución de una enfermedad o afección asociada con apo(a).
En ciertos casos, las variables del régimen posológico se ajustan para dar como resultado una concentración deseada de la composición farmacéutica en un sujeto. La «concentración de la composición farmacéutica», tal como se utiliza con respecto al régimen posológico, se puede referir al compuesto, oligonucleótido o principio activo de la composición farmacéutica. Por ejemplo, en ciertos casos, la dosis y la frecuencia de la dosis se ajustan para proporcionar una concentración tisular o concentración plasmática de una composición farmacéutica en una cantidad suficiente para conseguir un efecto deseado.
La dosificación depende de la gravedad y grado de respuesta del estado patológico que se va a tratar, prolongándose el ciclo de tratamiento desde varios días a varios meses, o hasta que se consigue la cura o se logra una disminución del estado patológico. La dosificación también depende de la potencia del fármaco y del metabolismo. En ciertos casos, la dosificación es de 0,01 |jg a 100 mg por kg de peso corporal, o está comprendida en el intervalo de dosificación de 0,001 mg - 1000 mg y se puede administrar una o más veces al día, a la semana, al mes o al año, o incluso una vez cada 2 - 20 años. Tras el tratamiento con éxito, puede ser deseable que el paciente reciba terapia de mantenimiento para prevenir la reaparición del estado patológico, donde se administra el oligonucleótido en dosis de mantenimiento comprendidas entre 0,01 jg y 100 mg por kg de peso corporal o comprendidas en una dosificación de 0,001 mg y 1000 mg, una o más veces al día, a la semana, al mes, al año hasta una vez cada 2 - 20 años.
Ciertas terapias combinadas
En ciertos casos, un primer agente que comprende el compuesto descrito en la presente se administra conjuntamente con uno o más agentes o terapias secundarios. En ciertos casos, tales segundos agentes se diseñan para tratar la misma enfermedad, trastorno o afección que el primer agente descrito en la presente. En ciertos casos, tales segundos agentes se diseñan para tratar una enfermedad, trastorno o afección diferente que el primer agente descrito en la presente. En ciertos casos, se diseña un primer agente para tratar un efecto secundario no deseado de un segundo agente. En ciertos casos, los segundos agentes se administran conjuntamente con el primer agente para tratar un efecto no deseado del primer agente. En ciertos casos, tales segundos agentes se diseñan para tratar un efecto secundario no deseado de la una o más composiciones farmacéuticas como se describen en la presente. En ciertos casos, los segundos agentes se administran conjuntamente con el primer agente para producir un efecto combinado. En ciertos casos, los segundos agentes se administran conjuntamente con el primer agente para producir un efecto sinérgico. En ciertos casos, la administración conjunta del primer y segundo agentes permite el uso de dosificaciones mucho menores de las que serían necesarias para conseguir un efecto terapéutico o profiláctico si los agentes se administraran como una terapia independiente.
En ciertos casos, se administran a la vez una o más composiciones descritas en la presente y uno o más agentes farmacéuticos diferentes. En ciertos casos, se administran en diferentes momentos una o más composiciones de la invención y uno o más agentes farmacéuticos diferentes. En ciertos casos, se preparan juntos como una única formulación una o más composiciones descritas en la presente y uno o más agentes farmacéuticos diferentes. En ciertos casos, se preparan por separado una o más composiciones descritas en la presente y uno o más agentes farmacéuticos diferentes.
En ciertos casos, los segundos agentes incluyen, sin carácter limitante, un agente que reduce apo(a), un agente que reduce Lp(a), un agente para tratar la enfermedad de Alzheimer, un agente para reducir la formación de tromboembolismo, un agente que reduce el colesterol, un agente que reduce los lípidos que no son HDL (por ejemplo, LDL), un agente que eleva el HDL, aceite de pescado, niacina, ácido nicotínico, un fibrato, una estatina, DCCR (sal de diazóxido), un agente que reduce la glucosa, un agente antiinflamatorio y/o un agente antidiabético. En ciertos casos, el primer agente se administra combinado con la máxima dosis tolerada del segundo agente. En ciertos casos, el primer agente se administra a un sujeto que no responde a la máxima dosis tolerada del segundo agente.
Los ejemplos de agentes que reducen apo(a) incluyen un oligonucleótido antisentido para apo(a) diferente del primer agente, niacina, ácido nicotínico o un oligonucleótido antisentido para apoB (es decir, Mipomersen). Un ejemplo de una terapia que reduce apo(a) es al aféresis de Lp(a).
Los ejemplos de agentes que reducen la glucosa y/o antidiabéticos incluyen, sin carácter limitante, un cambio terapéutico del estilo de vida, agonista de PPAR, un inhibidor de la dipeptidil-peptidasa (IV), un análogo de GLP-1, insulina o un análogo de insulina, un secretagogo de insulina, un inhibidor de SGLT2, un análogo de amilina humana, una biguanida, un inhibidor de alfa-glucosidasa, metformina, sulfonilurea, rosiglitazona, meglitinida, tiazolidinodiona, inhibidor de alfaglucosidasa y similares. La sulfonilurea puede ser acetohexamida, clorpropamida, tolbutamida, tolazamida, glimepirida, una glipizida, una gliburida o una glicazida. La meglitinida puede ser nateglinida o repaglinida. La tiazolidinodiona puede ser pioglitazona o rosiglitazona. La alfa-glucosidasa puede ser acarbosa o miglitol.
Los ejemplos de terapia que reduce el colesterol o los lípidos incluyen, sin carácter limitante, un cambio terapéutico del estilo de vida, estatinas, secuestrantes de ácidos biliares, niacina, ácido nicotínico, inhibidores de CETP y agonistas de receptor activado por proliferadores de peroxisomas tales como fibratos. Las estatinas pueden ser atorvastatina, fluvastatina, lovastatina, pravastatina, rosuvastatina y simvastatina y similares. Los secuestradores de ácidos biliares pueden ser colesevelam, colestiramina, colestipol y similares. Los fibratos pueden ser gemfibrozil, fenofibrato, clofibrato y similares. El inhibidor de CETP puede ser un oligonucleótido antisentido para CETP o Torcetrapib.
Ciertas poblaciones de tratamiento
Ciertos sujetos con niveles elevados de Lp(a) tienen un riesgo significativo de diversas enfermedades (Lippi et al., Clinica Chimica Acta, 2011, 412:797-801; Solfrizz et al.). En muchos sujetos con niveles elevados de Lp(a), los tratamientos actuales no pueden reducir sus niveles de Lp(a) hasta niveles seguros. Apo(a) desempeña una función importante en la formación de Lp(a), así pues reducir apo(a) puede reducir Lp(a) y prevenir, tratar o mejorar una enfermedad asociada con Lp(a).
En ciertos casos, el tratamiento con los compuestos y métodos divulgados en la presente está indicado para un animal humano con niveles de apo(a) y/o niveles de Lp(a) elevados. En ciertos casos, el ser humano tiene niveles de apo(a) elevados > 30 mg/dL, > 40 mg/dL, > 50 mg/dL, > 6o mg/dL, > 70 mg/dL, > 80 mg/dL, > 90 mg/dL o > 100 mg/dL.
Ciertos compuestos
Se evaluaron oligonucleótidos antisentido de tipo gápmero seleccionados de la solicitud PCT W02005/000201 (Ejemplo 1) y el compuesto más potente, ISIS 144367, se utilizó como una referencia de comparación para los oligonucleótidos antisentido recién diseñados descritos en la presente.
Se observó que aproximadamente 90 de los oligonucleótidos antisentido recién diseñados eran más potentes que la referencia, ISIS 144367, como se evaluó mediante los estudios in vitro de dosis única (Ejemplos 2-3, 5). De los aproximadamente 90 oligonucleótidos antisentido, se seleccionaron aproximadamente 83 para los estudios de respuesta a múltiples dosis in vitro y se observó que 64 oligonucleótidos antisentido eran más potentes que la referencia (Ejemplos 4, 6).
Se seleccionaron posteriormente aproximadamente 32 oligonucleótidos antisentido para estudios in vivo en ratones transgénicos con apo(a) humana (Ejemplo 7). Se identificaron múltiples oligonucleótidos antisentido que eran más potentes que la referencia in vivo.
Se seleccionaron posteriormente aproximadamente 24 oligonucleótidos antisentido para pruebas de viscosidad in vitro (Ejemplo 13). Los oligonucleótidos antisentido que fueron viscosos no se siguieron utilizando en los estudios.
Se seleccionaron posteriormente aproximadamente 14 oligonucleótidos antisentido para estudios in vivo en roedores de tolerabilidad y farmacocinética (Ejemplos 8-10). Los estudios indicaron que ISIS 494372 fue el oligonucleótido antisentido mejor tolerado.
Se estudiaron SIS 494283, 494284, 494286, 494301, 494302 y 494372 en monos cinomolgos (Ejemplos 11-12). Los estudios indicaron que ISIS 494372 fue bien tolerado y potente en monos.
EJEMPLOS
Divulgación no limitante
Mientras que ciertos compuestos, composiciones y métodos descritos en la presente se han descrito con exactitud de acuerdo con ciertos aspectos, los siguientes ejemplos sirven solo para ilustrar los compuestos descritos en la presente y no pretenden limitarlos.
Ejemplo 1: Inhibición antisentido dependiente de la dosis de apolipoproteína humana (a) (apo(a)) en hepatocitos primarios humanos
Se estudiaron oligonucleótidos antisentido de tipo gápmero seleccionados de una publicación anterior (W02005/000201) en un ensayo de dosis única en hepatocitos primarios humanos. Las células se obtuvieron de Tissue Transformation Technologies (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) y se trataron con oligonucleótido antisentido 150 nM. Después de un periodo de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de apo(a) mediante PCR en tiempo real cuantitativa. Se utilizó el conjunto de sonda cebadores de apo(a) humana hAP0(a)3' (secuencia directa ACAGCAATCAAACGAAGACACTG, designada en la presente SEQ ID NO: 5; secuencia inversa AGCTTATACACAAAAATACCAAAAATGC, designada en la presente como SEQ ID N0: 6; secuencia de la sonda TCCCAGCTACCAGCTATGCCAAACCTT, designada en la presente SEQ ID NO: 7) para medir los niveles de ARNm. Además, también se midieron los niveles de ARNm utilizando el conjunto de sonda cebadores de apo(a) humana hAPO(a)12kB (secuencia directa CCACAGTGGCCCCGGT, designada en la presente SEQ ID NO: 8; secuencia inversa ACAGGGCTTTTCTCAGGTGGT, designada en la presente SEQ ID NO: 9; secuencia de la sonda CCAAGCACAGAGGCTCCTTCTGAACAAG, designada en la presente SEQ ID NO: 10). Los niveles de ARNm de apo(a) se normalizaron respecto a la expresión de ARNm de GADPH. Los resultados se presentan en la Tabla 1 como inhibición porcentual de apo(a), respecto a células de control no tratadas.
Tabla 1
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Se seleccionaron varios oligonucleótidos antisentido para pruebas adicionales en un ensayo de respuesta a la dosis.
Los oligonucleótidos antisentido seleccionados se estudiaron en hepatocitos primarios humanos con concentraciones de oligonucleótido antisentido de 25 nM, 50 nM, 150 nM o 300 nM, según se especifica en la Tabla 2 a continuación. Después de un periodo de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de apo(a) mediante PCR en tiempo real cuantitativa. Se utilizó el conjunto de sonda cebadores de apo(a) humana hAPO(a)3' para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de apo(a) se normalizaron respecto a la expresión de ARNm de GADPH. Los resultados se presentan como inhibición porcentual de apo(a), respecto a células de control no tratadas.
Tabla 2
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ISIS 144367 demostró una mejor eficacia y dependencia de la dosis que los otros oligonucleótidos antisentido. Así pues, se consideró ISIS 144367 el oligonucleótido antisentido de referencia para comparar la potencia de los oligonucleótidos antisentido recién diseñados divulgados en la presente.
Ejemplo 2: Inhibición antisentido de apo(a) humana en hepatocitos primarios de ratón transgénico
Se realizó un diseño nuevo de oligonucleótidos antisentido que tenían como diana un ácido nucleico de apo(a) y se estudiaron para determinar sus efectos en ARNm de apo(a) in vitro. Los oligonucleótidos antisentido se estudiaron para determinar su potencia en una serie de experimentos en paralelo que tuvieron condiciones de cultivo similares. En este estudio se utilizaron hepatocitos primarios de ratones transgénicos de apo(a) humana (Frazer, K.A. et al., Nat. Genet.
1995. 9: 424-431). Se transfectaron hepatocitos con una densidad de 35000 células por pocillo utilizando electroporación con oligonucleótido antisentido 1000 nM. Después de un periodo de tratamiento de aproximadamente 24 horas, se aisló ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de apo(a) mediante PCR en tiempo real cuantitativa. Se utilizó el conjunto de sonda cebadores humano hAPO(a)12kB para medir los niveles de ARNm. Se ajustaron los niveles de ARNm de apo(a) de acuerdo con el contenido de ARN total, según se mide mediante RIBOGREEN®. Los resultados para cada experimento se presentan en tablas separadas a continuación. Se utilizó ISIS 144367 como una referencia para los oligonucleótidos antisentido nuevos y también se incluyó en los estudios. Los resultados se presentan como inhibición porcentual de apo(a), respecto a células de control no tratadas. Se estudiaron en total 1511 gápmeros en estas condiciones de cultivo. En la siguiente tabla solo se presentan los oligonucleótidos antisentido que se seleccionaron para un estudio adicional, representando cada tabla un experimento separado.
Los oligonucleótidos antisentido quiméricos recién diseñados se diseñaron como gápmeros MOE 5-10-5. Los gápmeros tienen una longitud de 20 nucleósidos, donde el segmento gap central comprende diez 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos laterales en la dirección 5' y en la dirección 3' que comprenden cinco nucleósidos cada uno. Cada nucleósido en el segmento lateral 5' y cada nucleósido en el segmento lateral 3' tiene una modificación 2'-MOE. Las uniones internucleosídicas a través de cada gápmero son uniones fosforotioato (P=S). Todos los residuos de citosina a lo largo de cada gápmero son 5-metilcitosinas.
La secuencia diana apo(a) contiene múltiples secuencias de repetición Kringle, por lo tanto, un oligonucleótido antisentido puede tener como diana una o más regiones de apo(a) dependiendo de si el oligonucleótido tiene como diana una secuencia Kringle o no. «Sitio de inicio» indica el nucleósido del extremo 5' de la diana del gápmero en la secuencia humana. «Sitio de parada» indica el nucleósido del extremo 3' de la diana del gápmero secuencia humana. Un oligonucleótido antisentido para apo(a) puede tener más de un «sitio de inicio» o «sitio de parada» dependiendo de si tiene como diana o no una repetición Kringle.
La mayoría de los gápmeros enumerados en las Tablas tienen como diana, con un 100% de complementariedad, una o más regiones de ARNm de apo(a) humana, designado en la presente como la SEQ ID NO: 1 (N.° de acceso GENBANK NM_005577.2) o la secuencia genómica de apo(a) humana, designada en la presente como la SEQ ID NO: 2 (N.° de acceso GENBANK NT_007422.12 truncada desde los nucleótidos 3230000 a 3380000), o ambos. «n/a» indica que el oligonucleótido antisentido no tiene como diana la secuencia particular con un 100% de complementariedad.
Tabla 3
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Tabla 4
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Tabla 5
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Tabla 6
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Tabla 7
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Tabla 8
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Tabla 9
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Tabla 10
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Tabla 11
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Tabla 12
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Tabla 13
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Ejemplo 3: Inhibición antisentido dependiente de la dosis de apo(a) en hepatocitos primarios de ratón transgénicos
Los gápmeros de los estudios descritos anteriormente que mostraban una inhibición significativa in vitro de ARNm de apo(a) se seleccionaron y estudiaron con diversas dosis en hepatocitos primarios de ratón transgénicos en una serie de estudios en paralelo con condiciones de cultivo similares. Las células se sembraron en placas con una densidad de 35000 por pocillo y se transfectaron utilizando electroporación con concentraciones 0,0625 |jM, 0,125 |jM, 0,25 |jM, 0,500 |jM o 1,000 jiM de oligonucleótido antisentido. Después de un periodo de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de apo(a) mediante PCR en tiempo real cuantitativa. Se utilizó el conjunto de sonda cebadores de apo(a) hAPO(a)12kB para medir los niveles de ARNm. Se ajustaron los niveles de ARNm de apo(a) de acuerdo con el contenido de ARN total, según se mide mediante RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como inhibición porcentual de apo(a), respecto a células de control no tratadas.
Los resultados de cada uno de los estudios se muestran en las Tablas presentadas a continuación, donde cada tabla representa un experimento separado. También se presenta en las Tablas la concentración con la que se consigue una inhibición de un 50% respecto a la máxima (CI50) de cada oligonucleótido. Los niveles de ARNm de apo(a) se redujeron significativamente de una manera dependiente de la dosis en las células tratadas con oligonucleótidos antisentido. Se comparó la potencia de los oligos recién diseñados con el oligonucleótido de referencia ISIS 144367.
Tabla 14
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Tabla 15
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Tabla 16
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Tabla 17
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Tabla 18
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Tabla 19
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Tabla 20
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Tabla 21
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Tabla 22
Figure imgf000050_0002
Como se presenta en las Tablas anteriores, ISIS 494157 (SEQ ID NO: 12), ISIS 494158 (SEQ ID NO:13), ISIS 494159 (SEQ ID NO:14), ISIS 494160 (SEQ ID NO: 15), ISIS 494161 (SEQ ID NO:16), ISIS 494162 (SEQ ID NO: 17), ISIS 494163 (SEQ ID NO: 18), ISIS 494164 (SEQ ID NO: 19), ISIS 494165 (SEQ ID NO: 20), ISIS 494167 (SEQ ID NO: 22), ISIS 494168 (SEQ ID NO: 23), ISIS 494169 (SEQ ID NO: 24), ISIS 494170 (SEQ ID NO: 25), ISIS 494230 (SEQ ID NO: 105), ISIS 494243 (SEQ ID NO: 106), ISIS 494244 (SEQ ID NO: 107), ISIS 494283 (SEQ ID NO: 26), ISIS 494284 (SEQ ID NO: 27), ISIS 494285 (SEQ ID NO: 28), ISIS 494286 (SEQ ID NO: 29), ISIS 494287 (SEQ ID NO: 30), ISIS 494288 (SEQ ID NO: 31), ISIS 494290 (SEQ ID NO: 32), ISIS 494291 (SEQ ID NO: 33), ISIS 494292 (SEQ ID NO: 34), ISIS 494294 (SEQ ID NO: 35), ISIS 494299 (SEQ ID NO: 36), ISIS 494300 (SEQ ID NO: 37), ISIS 494301 (SEQ ID NO: 38), ISIS 494302 (SEQ ID NO: 39), ISIS 494303 (SEQ ID NO: 40), ISIS 494304 (SEQ ID NO: 41), ISIS 494305 (SEQ ID NO:42), ISIS 494306 (SEQ ID NO: 43), ISIS 494311 (SEQ ID NO: 46), ISIS 494334 (SEQ ID NO: 47), ISIS 494336 (SEQ ID NO: 48), ISIS 494337 (SEQ ID NO: 49), ISIS 494338 (SEQ ID NO: 50), ISIS 494371 (SEQ ID NO: 57), ISIS 494372 (SEQ ID NO: 58), ISIS 494373 (SEQ ID NO: 59), ISIS 494374 (SEQ ID NO: 60), ISIS 494375 (SEQ ID NO: 61), ISIS 494386 (SEQ ID NO: 62), ISIS 494389 (SEQ ID NO: 65), ISIS 494390 (SEQ ID NO: 66), ISIS 494392 (SEQ ID NO: 68), ISIS 494466 (SEQ ID NO: 108), ISIS 494470 (SEQ ID NO: 109), ISIS 494472 (SEQ ID NO: 110), ISIS 494521 (SEQ ID NO: 51), ISIS 494530 (SEQ ID NO: 53), ISIS 498229 (SEQ ID NO: 75), ISIS 498238 (SEQ ID NO: 76), ISIS 498239 (SEQ ID NO: 77), ISIS 498240 (SEQ ID NO: 78), ISIS 498241 (SEQ ID NO: 79), ISIS 498243 (SEQ ID NO: 81), ISIS 498379 (SEQ ID NO: 70), ISIS 498408 (SEQ ID NO: 71), ISIS 498433 (SEQ ID NO: 72), ISIS 498434 (SEQ ID NO: 73), ISIS 498435 (SEQ ID NO: 74), ISIS 498517 (SEQ ID NO: 85), ISIS 498523 (SEQ ID NO: 92), ISIS 498524 (SEQ ID NO: 93), ISIS 498525 (SEQ ID NO: 94), ISIS 498550 (SEQ ID NO: 97), ISIS 498580 (SEQ ID NO: 103), ISIS 498581 (SEQ ID NO: 104), ISIS 498721 (ATGCCTCGATAACTCCGTCC; SEQ ID NO: 134), ISIS 498833 (SEQ ID NO: 86), ISIS 498875 (SEQ ID NO: 89), y ISIS 499020 (SEQ ID NO: 90) fueron más potentes que ISIS 144367 (SEQ ID NO: 11).
Ejemplo 4: Inhibición antisentido dependiente de la dosis de apo(a) en hepatocitos primarios de ratón transgénicos
Los gápmeros potentes de los estudios descritos anteriormente se seleccionaron y estudiaron adicionalmente con diversas dosis en hepatocitos primarios de ratón transgénicos en una serie de estudios con condiciones de cultivo similares. Las células se sembraron en placas con una densidad de 35000 por pocillo y se transfectaron utilizando electroporación con concentraciones 0,049 |jM, 0,148 |jM, 0,444 |jM, 1,333 |jM o 4,000 |jM de oligonucleótido antisentido, como se especifica en las Tablas a continuación. Después de un periodo de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de apo(a) mediante PCR en tiempo real cuantitativa. Se utilizó el conjunto de sonda cebadores de apo(a) hAPO(a)12kB para medir los niveles de ARNm. Se ajustaron los niveles de ARNm de apo(a) de acuerdo con el contenido de ARN total, según se mide mediante RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como inhibición porcentual de apo(a), respecto a células de control no tratadas.
Los resultados de cada uno de los estudios se muestran en las Tablas presentadas a continuación, donde cada tabla representa un experimento separado. También se presenta en las Tablas la concentración con la que se consigue una inhibición de un 50% respecto a la máxima (CI50) de cada oligonucleótido. Los niveles de ARNm de apo(a) se redujeron significativamente de una manera dependiente de la dosis en las células tratadas con oligonucleótidos antisentido. Se comparó la potencia de los oligos recién diseñados con el oligonucleótido de referencia ISIS 144367. Como se presenta en las Tablas a continuación, ISIS 494157 (SEQ ID NO: 12), ISIS 494158 (SEQ ID NO:13), ISIS 494159 (SEQ ID NO:14), ISIS 494160 (SEQ ID NO: 15), ISIS 494161 (SEQ ID NO:16), ISIS 494162 (SEQ ID NO: 17), ISIS 494163 (SEQ ID NO: 18), ISIS 494164 (SEQ ID NO: 19), ISIS 494230 (SEQ ID NO: 105), ISIS 494243 (SEQ ID NO: 106), ISIS 494244 (SEQ ID NO: 107), ISIS 494283 (SEQ ID NO: 26), ISIS 494284 (SEQ ID NO: 27), ISIS 494285 (SEQ ID NO: 28), ISIS 494286 (SEQ ID NO: 29), ISIS 494287 (SEQ ID NO: 30), ISIS 494290 (SEQ ID NO: 32), ISIS 494292 (SEQ ID NO: 34), ISIS 494300 (SEQ ID NO: 37), ISIS 494301 (SEQ ID NO: 38), ISIS 494302 (SEQ ID NO: 39), ISIS 494303 (SEQ ID NO: 40), ISIS 494304 (SEQ ID NO: 41), ISIS 494305 (SEQ ID NO: 42), ISIS 494306 (SEQ ID NO: 43), ISIS 494310 (SEQ ID NO: 45), ISIS 494311 (SEQ ID NO: 46), ISIS 494337 (SEQ ID NO: 49), ISIS 494371 (SEQ ID NO: 57), ISIS 494372 (SEQ ID NO: 58), ISIS 494375 (SEQ ID NO: 61), ISIS 494388 (SEQ ID NO: 64), ISIS 494389 (SEQ ID NO: 65), ISIS 494390 (SEQ ID NO: 66), ISIS 494392 (SEQ ID NO: 68), ISIS 494466 (SEQ ID NO: 108), ISIS 494470 (SEQ ID NO: 109), ISIS 494472 (SEQ ID NO: 110), ISIS 498238 (SEQ ID NO: 76), ISIS 498239 (SEQ ID NO: 77), ISIS 498433 (SEQ ID NO: 72), ISIS 498434 (SEQ ID NO: 73), ISIS 498435 (SEQ ID NO: 74), ISIS 498523 (SEQ ID NO: 92), ISIS 498524 (SEQ ID NO: 93), ISIS 498525 (SEQ ID NO: 94), ISIS 498580 (SEQ ID NO: 103), y ISIS 498581 (SEQ ID NO: 104) fueron más potentes que ISIS 144367 (SEQ ID NO: 11).
Tabla 23
Figure imgf000051_0001
Tabla 24
Figure imgf000051_0002
Figure imgf000052_0001
Tabla 25
Figure imgf000052_0002
Tabla 26
Figure imgf000052_0003
Tabla 27
Figure imgf000053_0001
Ejemplo 5: Inhibición antisentido de apo(a) humana en hepatocitos primarios de ratón transgénico
Se realizó un diseño nuevo de más oligonucleótidos antisentido que tenían como diana un ácido nucleico de apo(a) y se estudiaron para determinar sus efectos en ARNm de apo(a) in vitro. Los oligonucleótidos antisentido se estudiaron en una serie de experimentos que tuvieron condiciones de cultivo similares. En este estudio se utilizaron hepatocitos primarios de ratones transgénicos con apo(a) humana. Se transfectaron hepatocitos con una densidad de 35000 células por pocillo utilizando electroporación con oligonucleótido antisentido 1000 nM. Después de un periodo de tratamiento de aproximadamente 24 horas, se aisló ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de apo(a) mediante PCR en tiempo real cuantitativa. Se utilizó el conjunto de sonda cebadores humano hAPO(a)12kB para medir los niveles de ARNm. Se ajustaron los niveles de ARNm de apo(a) de acuerdo con el contenido de ARN total, según se mide mediante RIBOGREEN®. Los resultados para cada experimento se presentan en tablas separadas a continuación. También se incluyó ISIS 144367 en los estudios para comparar. Los resultados se presentan como inhibición porcentual de apo(a), respecto a células de control no tratadas. Se estudiaron en total 231 oligonucleótidos antisentido en estas condiciones de cultivo. Únicamente se presentan a continuación los oligonucleótidos antisentido que se seleccionaron para estudios adicionales.
Los oligonucleótidos antisentido quiméricos recién diseñados se diseñaron como gápmeros MOE 3-10-4. Los gápmeros tienen una longitud de 17 nucleósidos, donde el segmento gap central comprende diez 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos laterales en la dirección 5' y en la dirección 3' que comprenden tres nucleósidos y cuatro nucleósidos respectivamente. Cada nucleósido en el segmento lateral 5' y cada nucleósido en el segmento lateral 3' tiene una modificación 2'-MOE. Las uniones internucleosídicas a través de cada gápmero son uniones fosforotioato (P=S). Todos los residuos de citosina a lo largo de cada gápmero son 5-metilcitosinas.
La secuencia diana apo(a) contiene múltiples secuencias de repetición Kringle, por lo tanto, un oligonucleótido antisentido puede tener como diana una o más regiones de apo(a) dependiendo de si el oligonucleótido tiene como diana una secuencia Kringle o no. «Sitio de inicio» indica el nucleósido del extremo 5' de la diana del gápmero en la secuencia humana. «Sitio de parada» indica el nucleósido del extremo 3' de la diana del gápmero secuencia humana. Un oligonucleótido antisentido para apo(a) puede tener más de un «sitio de inicio» o «sitio de parada» dependiendo de si tiene como diana o no una repetición Kringle.
La mayoría de los gápmeros enumerados en las Tablas tienen como diana, con un 100% de complementariedad, múltiples regiones de ARNm de apo(a) humana, designado en la presente como la SEQ ID NO: 1 (N.° de acceso GENBANK NM_005577.2) o la secuencia genómica de apo(a) humana, designada en la presente como la SEQ ID NO: 2 (N.° de acceso GENBANK NT_007422.12 truncada desde los nucleótidos 3230000 a 3380000), o ambos. «n/a» indica que el oligonucleótido antisentido no tiene como diana la secuencia particular con un 100% de complementariedad.
Tabla 28
Figure imgf000054_0001
Figure imgf000055_0001
Tabla 29
Figure imgf000056_0001
Tabla 30
Figure imgf000056_0002
Ejemplo 6: Inhibición antisentido dependiente de la dosis de apo(a) en hepatocitos primarios de ratón
transgénicos
Los gápmeros potentes de los estudios descritos anteriormente se seleccionaron y estudiaron adicionalmente con
diversas dosis en hepatocitos primarios de ratón transgénicos en una serie de estudios con condiciones de cultivo
similares. Las células se sembraron en placas con una densidad de 35000 por pocillo y se transfectaron utilizando
electroporación con concentraciones 0,156 |jM, 0,313 |jM, 0,625 |jM, 1,250 |jM, 2,500 |jM o 5,000 |jM antisentido, como se especifica en las Tablas a continuación. Después de un periodo de tratamiento de aproximadamente
16 horas, se aisló ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de apo(a) mediante PCR en tiempo real
cuantitativa. Se utilizó el conjunto de sonda cebadores de apo(a) hAPO(a)12kB para medir los niveles de ARNm. Se ajustaron los niveles de ARNm de apo(a) de acuerdo con el contenido de ARN total, según se mide mediante RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como inhibición porcentual de apo(a), respecto a células de control no tratadas.
Los resultados de cada uno de los estudios se muestran en las Tablas presentadas a continuación, donde cada estudio se representa en una tabla separada. También se presenta en las Tablas la concentración con la que se consigue una inhibición de un 50% respecto a la máxima (CI50) de cada oligonucleótido.
Tabla 31
Figure imgf000057_0001
Tabla 32
Figure imgf000057_0002
Tabla 33
Figure imgf000057_0003
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Tabla 34
Figure imgf000058_0002
Los niveles de ARNm de apo(a) se redujeron significativamente de una manera dependiente de la dosis en las células tratadas con oligonucleótidos antisentido. Se comparó la potencia de los oligonucleótidos recién diseñados con el oligonucleótido de referencia ISIS 144367. Como se presenta en las Tablas anteriores, ISIS 510542 (SEQ ID NO: 111), ISIS 510545 (SEQ ID NO: 114), ISIS 510546 (SEQ ID NO: 115), ISIS 510547 (SEQ ID NO: 116), ISIS 510548 (SEQ ID NO: 117), ISIS 510549 (SEQ ID NO: 118), ISIS 510595 (SEQ ID NO: 119), ISIS 510597 (SEQ ID NO: 120), ISIS 510598 (SEQ ID NO: 121), ISIS 510701 (SEQ ID NO: 127), ISIS 510702 (SEQ ID NO: 128), ISIS 510704 (SEQ ID NO: 129), ISIS 512944 (SEQ ID NO: 123), ISIS 512947 (SEQ ID NO: 124), ISIS 512958 (SEQ ID NO: 125), y ISIS 512959 (SEQ ID NO:
126) fueron más potentes que ISIS 144367 (SEQ ID NO: 11).
Ejemplo 7: Efecto de la inhibición antisentido in v iv o de apo(a) humana en ratones transgénicos con apo(a) humana
Se utilizaron ratones transgénicos con el gen humano de apo(a) (Frazer, K.A. et al., Nat. Genet. 1995. 9: 424-431) en los estudios descritos a continuación. Los oligonucleótidos ISIS antisentido que demostraron inhibición estadísticamente significativa de ARNm de apo(a) in vitro como se ha descrito anteriormente se evaluaron adicionalmente en este modelo.
Estudio 1
Se mantuvieron ratones hembra transgénicos con apo(a) humana en un ciclo de 12 horas de luz/oscuridad y se alimentaron sin restricciones con how normal de laboratorio. Los ratones se dividieron en grupos de tratamiento constituidos cada uno por 4 ratones. Los grupos recibieron inyecciones intraperitoneales de ISIS 494159, ISIS 494160, ISIS 494161, ISIS 494162, ISIS 494163, ISIS 494230, ISIS 494243, ISIS 494244, ISIS 494283, ISIS 494284, ISIS 494285, ISIS 494286, ISIS 494301, ISIS 494302, ISIS 494304, ISIS 494466, ISIS 494470, ISIS 494472, ISIS 498239, ISIS 498408, ISIS 498517, ISIS 494158, ISIS 494311, ISIS 494337, ISIS 494372, ISIS 498238, ISIS 498523, ISIS 498525, ISIS 510548, ISIS 512944, ISIS 512947, o ISIS 512958 en una dosis de 25 mg/kg dos veces a la semana durante 2 semanas. Un grupo de ratones recibió inyecciones intraperitoneales de PBS dos veces a la semana durante 2 semanas. El grupo con p Bs sirvió como grupo de control. Dos días después de la dosis final, se sacrificaron los ratones, se recolectaron los órganos y se realizaron los análisis.
Inhibición de ARNm de apo(a) humana
Se extrajo el ARN total de los hígados de algunos de los grupos de tratamiento y se cuantificó el ARNm de apo(a) humana mediante RT-PCR. Los resultados se presentan en la Tabla 35, expresados como inhibición porcentual de ARNm de apo(a) en comparación con el control de PBS.
Tabla 35
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Figure imgf000059_0001
Los datos demuestran una inhibición significativa de ARNm de apo(a) por parte de varios oligonucleótidos ISIS. ISIS 494159 (SEQ ID NO: 14), ISIS 494162 (SEQ ID NO: 17), ISIS 494163 (SEQ ID NO: 18), ISIS 494243 (SEQ ID NO: 106), ISIS 494244 (SEQ ID NO: 107), ISIS 494283 (SEQ ID NO: 26), ISIS 494284 (SEQ ID NO: 27), ISIS 494285 (SEQ ID NO: 28), ISIS 494301 (SEQ ID NO: 38), y ISIS 498408 (SEQ ID NO: 71) fueron más potentes que la referencia ISIS 144367 (SEQ ID NO: 11).
Inhibición de la proteína apo(a) humana
Se midió la proteína apo(a) humana plasmática en todos los grupos de tratamiento utilizando un kit ELISA para apo(a) (Mercodia 10-1106-01, Uppsala, Suecia). Los resultados se presentan en la Tabla 36, expresados como inhibición porcentual de ARNm de apo(a) en comparación con el control de PBS.
Tabla 36
Figure imgf000059_0002
Figure imgf000060_0001
Los datos demuestran una inhibición significativa de ARNm de apo(a) por parte de varios oligonucleótidos ISIS. ISIS 494159 (SEQ ID NO: 14), ISIS 494244 (SEQ ID NO: 82), ISIS 494283 (SEQ ID NO: 26), ISIS 494284 (SEQ ID NO: 27), ISIS 494285 (SEQ ID NO: 28), ISIS 494286 (SEQ ID NO: 29), ISIS 494301 (SEQ ID NO: 38), y ISIS 494302 (SEQ ID NO: 39) fueron igual de potentes o más que la referencia ISIS 144367 (SEQ ID NO: 11).
Estudio 2
ISIS 494159, ISIS 494161, ISIS 494162, ISIS 494163 e ISIS 494243 se evaluaron adicionalmente en este modelo transgénico. Se incluyó ISIS 144367 para comparar.
Tratamiento
Los ratones hembra transgénicos con apo(a) humana se dividieron en grupos de tratamiento constituidos cada uno por 4 ratones. Los grupos recibieron inyecciones intraperitoneales de ISIS 144367, ISIS 494159, ISIS 494161, ISIS 494162, ISIS 494163 o ISIS 494243 con dosis de 1,5 mg/kg, 5 mg/kg, 15 mg/kg o 50 mg/kg dos veces a la semana durante 2 semanas. Un grupo de ratones recibió inyecciones intraperitoneales de PBS dos veces a la semana durante 2 semanas.
El grupo con PBS sirvió como grupo de control. Dos días después de la dosis final, se sacrificaron los ratones, se recolectaron los órganos y se realizaron los análisis.
Inhibición de ARNm de apo(a) humana
Se extrajo el ARN total de los hígados de los grupos de tratamiento y se cuantificó el ARNm de apo(a) humana mediante RT-PCR. Los resultados se presentan en la Tabla 37, expresados como inhibición porcentual de ARNm de apo(a) en comparación con el control de PBS.
Tabla 37
Figure imgf000061_0001
Los datos demuestran una inhibición significativa de ARNm de apo(a) por parte de varios oligonucleótidos ISIS. ISIS 494159 (SEQ ID NO: 14), ISIS 494161 (SEQ ID NO: ISIS 494162 (SEQ ID NO: 17) e ISIS 94163 (SEQ ID NO: 18) fueron más eficaces que la referencia ISIS 144367 (SEQ ID NO: 11).Reducción de los niveles de proteína apo(a) humana Se extrajo sangre de los grupos de tratamiento y se cuantificaron los niveles de proteína apo(a) humana mediante un kit ELISA para apo(a) (Mercodia 10-1106-01, Uppsala, Suecia). Los resultados se presentan en la Tabla 38, expresados como inhibición porcentual de niveles de proteína apo(a) en comparación con el control de PBS.
Tabla 38
Figure imgf000062_0001
Los datos demuestran una reducción significativa de los niveles plasmáticos de proteína apo(a) por parte de varios oligonudeótidos ISIS. ISIS 494159 (SEQ ID NO: 14), ISIS 494161 (SEQ ID NO: 16), ISIS 494162 (SEQ ID NO: 17) e ISIS 494163 (SEQ ID NO: 18) fueron más eficaces que la referencia ISIS 144367 (SEQ ID NO: 11).
Estudio 3
ISIS 494244, ISIS 494283 e ISIS 494284 se evaluaron adicionalmente en este modelo. Se incluyó ISIS 144367 para comparar.
Tratamiento
Los ratones hembra transgénicos con apo(a) humana se dividieron en grupos de tratamiento constituidos cada uno por 4 ratones. Los grupos recibieron inyecciones intraperitoneales de ISIS 144367, ISIS 494244, ISIS 494283 o ISIS 494284 con dosis de 0,75 mg/kg, 2,5 mg/kg, 7,5 mg/kg o 25 mg/kg dos veces a la semana durante 2 semanas. Un grupo de ratones recibió inyecciones intraperitoneales de PBS dos veces a la semana durante 2 semanas. El grupo con PBS sirvió como grupo de control. Dos días después de la dosis final, se sacrificaron los ratones, se recolectaron los órganos y se realizaron los análisis.
Inhibición de ARNm de apo(a) humana
Se extrajo el ARN total de los hígados de los grupos de tratamiento y se cuantificó el ARNm de apo(a) humana mediante RT-PCR. Los resultados se presentan en la Tabla 39, expresados como inhibición porcentual de ARNm de apo(a) en comparación con el control de PBS.
Tabla 39
Figure imgf000063_0001
Los datos demuestran una inhibición significativa de ARNm de apo(a) por parte de varios oligonucleótidos ISIS. ISIS 494244 (SEQ ID NO: 107), ISIS 494283 (SEQ ID NO: 26) e ISIS 494284 (SEQ ID NO: 27) fueron más eficaces que la referencia ISIS 144367 (SEQ ID NO: 11).
Reducción de los niveles de proteína apo(a) humana
Se extrajo sangre de los grupos de tratamiento y se cuantificaron los niveles de proteína apo(a) humana mediante un kit ELISA para apo(a) (Mercodia 10-1106-01, Uppsala, Suecia). Los resultados se presentan en la Tabla 40, expresados como inhibición porcentual de niveles de proteína apo(a) en comparación con el control de PBS.
Tabla 40
Figure imgf000063_0002
Figure imgf000064_0001
Los datos demuestran una reducción significativa de los niveles plasmáticos de proteína apo(a) por parte de varios oligonucleótidos ISIS. ISIS 494244 (SEQ ID NO: 107), ISIS 494283 (SEQ ID NO: 26) e ISIS 494284 (SEQ ID NO: 27) fueron más eficaces que la referencia ISIS 144367 (s Eq ID NO: 11).
Estudio 4
ISIS 494285, ISIS 494286, ISIS 494301, ISIS 494302 e ISIS 494311 se evaluaron adicionalmente en este modelo.
Tratamiento
Los ratones macho transgénicos con apo(a) humana se dividieron en grupos de tratamiento constituidos cada uno por 4 ratones. Cada uno de tales grupos recibió inyecciones intraperitoneales de ISIS 494285, ISIS 494286, ISIS 494301, ISIS 494302 o ISIS 494311 con dosis de 5 mg/kg, 15 mg/kg o 50 mg/kg una vez a la semana durante 2 semanas. Un grupo de 3 ratones recibió inyecciones intraperitoneales de PBS una vez a la semana durante 2 semanas. El grupo con PBS sirvió como grupo de control. Dos días después de la dosis final, se sacrificaron los ratones, se recolectaron los órganos y se realizaron los análisis.
Inhibición de ARNm de apo(a) humana
Se extrajo el ARN total de los hígados de los grupos de tratamiento y se cuantificó el ARNm de apo(a) humana mediante RT-PCR. Los resultados se presentan en la Tabla 41, expresados como inhibición porcentual de ARNm de apo(a) en comparación con el control de PBS. Los datos demuestran una inhibición significativa de ARNm de apo(a) por parte de ISIS 494285 (SEQ ID NO: 28), ISIS 494286 (SEQ ID NO: 29), ISIS 494301 (SEQ ID NO: 38), ISIS 494302 (SEQ ID NO: 39) e ISIS 494311 (SEQ ID NO: 46).
Tabla 41
Figure imgf000064_0002
Figure imgf000065_0001
Reducción de los niveles de proteína apo(a) humana
Se extrajo sangre de los grupos de tratamiento y se cuantificaron los niveles de proteína apo(a) humana mediante un kit ELISA para apo(a) (Mercodia 10-1106-01, Uppsala, Suecia). Los resultados se presentan en la Tabla 42, expresados como inhibición porcentual de niveles de proteína apo(a) en comparación con el control de PBS. Los datos demuestran una reducción significativa de los niveles de la proteína plasmática apo(a) por parte de ISIS 494285, ISIS 494286, ISIS 494301, ISIS 494302 e ISIS 494311.
Tabla 42
Figure imgf000065_0002
Estudio 5
ISIS 494372, ISIS 498524, ISIS 498581, ISIS 498721 e ISIS 498833 se evaluaron adicionalmente en este modelo. Tratamiento
Los ratones hembra transgénicos con apo(a) humana se dividieron en grupos de tratamiento constituidos cada uno por 4 ratones. Los grupos recibieron inyecciones intraperitoneales de ISIS 494372, ISIS 498524, ISIS 498581, ISIS 498721 o ISIS 498833 con dosis de 5 mg/kg, 15 mg/kg o 50 mg/kg una vez a la semana durante 2 semanas. Un grupo de 3 ratones recibió inyecciones intraperitoneales de PBS una vez a la semana durante 2 semanas. El grupo con PBS sirvió como grupo de control. Dos días después de la dosis final, se sacrificaron los ratones, se recolectaron los órganos y se realizaron los análisis.
Inhibición de ARNm de apo(a) humana
Se extrajo el ARN total de los hígados de los grupos de tratamiento y se cuantificó el ARNm de apo(a) humana mediante RT-PCR. Los resultados se presentan en la Tabla 43, expresados como inhibición porcentual de ARNm de apo(a) en comparación con el control de PBS. Los datos demuestran una inhibición significativa de ARNm de apo(a) por parte de ISIS 494372 (SEQ ID NO: 28), ISIS 498524 (SEQ ID NO: 93), ISIS 498581 (SEQ ID NO: 104) e ISIS 498721 (ATGCCTCGATAACTCCGTCC; SEQ ID NO: 134).
Tabla 43
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Reducción de los niveles de proteína apo(a) humana
Se extrajo sangre de los grupos de tratamiento y se cuantificaron los niveles de proteína apo(a) humana mediante un kit ELISA para apo(a) (Mercodia 10-1106-01, Uppsala, Suecia). Los resultados se presentan en la Tabla 44, expresados como inhibición porcentual de niveles de proteína apo(a) en comparación con el control de PBS. Los datos demuestran una reducción significativa de los niveles de proteína plasmática apo(a) por parte de ISIS 494372 (SEQ ID NO: 28), ISIS 498581 (SEQ ID NO: 104) e ISIS 498721 (ATGCCTCGATAACTCCGTCC; SEQ ID NO: 134).
Tabla 44
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Ejemplo 8: Tolerabilidad de oligonucleótidos antisentido que tienen como diana apo(a) humana en modelos en roedores
Se seleccionaron oligonucleótidos antisentido de tipo gápmero que tenían como diana apo(a) humana a partir de los estudios descritos anteriormente para los estudios de tolerabilidad en ratones CD1 y en ratas Sprague Dawley. Los roedores no expresan de manera endógena apo(a), por lo tanto, estos estudios estudiaron la tolerabilidad de cada oligonucleótido antisentido humano en un animal en lugar de cualesquiera cambios fenotípicos que puedan estar provocados por la inhibición de apo(a) en el animal.
Tolerabilidad en ratones CD1: Estudio 1
Los ratones CD1® (Charles River, MA) son un modelo en ratones para múltiples objetivos, utilizados con frecuencia en las pruebas de seguridad y eficacia. Los ratones fueron tratados con oligonucleótidos antisentido ISIS seleccionados de los estudios descritos anteriormente y evaluados para detectar cambios en los niveles de diversos marcadores químicos plasmáticos.
Tratamiento
Se inyectaron 50 mg/kg de ISIS 494159, ISIS 494161, ISIS 494162, ISIS 494244, ISIS 494283, ISIS 494284, ISIS 494285, ISIS 494286, ISIS 494301, ISIS 494302, ISIS 494311, ISIS 494337, ISIS 494372, y ISIS 510548 a los grupos de ratones CD1 macho por vía subcutánea dos veces a la semana durante 6 semanas. Se inyectó PBS a un grupo de ratones CD1 de seis semanas de edad por vía subcutánea dos veces a la semana durante 6 semanas. Los ratones se sacrificaron 48 horas después de la última dosis y se recolectaron los órganos y plasma para análisis posteriores.
Marcadores químicos plasmáticos
Para evaluar los efectos de los oligonucleótidos ISIS en la función hepática y renal, se midieron los niveles plasmáticos de transaminasas, bilirrubina, albúmina, creatinina y BUN utilizando un analizador de química clínica automático (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en la tabla 45. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los niveles de cualquiera de los marcadores de la función hepática o renal fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido se excluyeron en los estudios posteriores.
Tabla 45
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Peso de los órganos
Se midió el peso de hígado, bazo y riñón al final del estudio y se presentan en la Tabla 46. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cualquier cambio en el peso de los órganos fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido se excluyeron de los estudios posteriores.
Tabla 46
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Tolerabilidad en ratas Sprague Dawley
Las ratas Sprague-Dawley son un modelo con múltiples objetivos utilizadas para evaluaciones de seguridad y eficacia. Las ratas fueron tratadas con oligonucleótidos antisentido ISIS seleccionados de los estudios descritos anteriormente y evaluadas para detectar cambios en los niveles de diversos marcadores químicos plasmáticos.
Tratamiento
Se inyectaron 30 mg/kg de ISIS 494159, ISIS 494161, ISIS 494162, ISIS 494244, ISIS 494283, ISIS 494284, ISIS 494285, ISIS 494286, ISIS 494301, ISIS 494302, ISIS 494311, ISIS 494337, ISIS 494372, y ISIS 510548 a los grupos de ratas Sprague Dawley macho por vía subcutánea dos veces a la semana durante 8 semanas. Se inyectó PBS a un grupo de seis ratas Sprague Dawley macho por vía subcutánea dos veces a la semana durante 8 semanas. Las ratas se sacrificaron 48 horas después de la última dosis y se recolectaron los órganos y plasma para análisis posteriores.
Marcadores químicos plasmáticos
Para evaluar los efectos de los oligonucleótidos ISIS en la función hepática y renal, se midieron los niveles plasmáticos de transaminasas, bilirrubina, albúmina, creatinina y BUN utilizando un analizador de química clínica automático (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en la tabla 47. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los niveles de cualquiera de los marcadores de la función hepática o renal fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido se excluyeron en los estudios posteriores.
Tabla 47
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Función renal
Para evaluar los efectos de los oligonucleótidos ISIS en la función renal, se midieron los niveles en orina de proteína total y creatinina utilizando un analizador de química clínica automático (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en la Tabla 48, expresados en mg/dL.
Tabla 48
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Peso de los órganos
Se midió el peso de hígado, bazo y riñón al final del estudio y se presentan en la Tabla 49. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cualquier cambio en el peso de los órganos fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido se excluyeron de los estudios posteriores.
Tabla 49
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Los resultados de los estudios de tolerabilidad en roedores mostraron que, en general, teniendo en cuenta todos los marcadores de tolerabilidad cribados, ISIS 494372 fue el compuesto antisentido mejor tolerado tanto en el modelo en ratones CD1 como en el modelo en ratas Sprague Dawley.
Ejemplo 9: Farmacocinética de oligonucleótidos antisentido en ratones CD1
Se trataron ratones CD1 con oligonucleótidos ISIS y se evaluaron las concentraciones de oligonucleótidos en el hígado y riñón.
Tratamiento
Se inyectaron 50 mg/kg de ISIS 494283, ISIS 494284, ISIS 494286, ISIS 494301, ISIS 494302 o ISIS 494372 a grupos de cuatro ratones CD1 cada uno por vía subcutánea dos veces a la semana durante 6 semanas. Los ratones se sacrificaron 2 días después de la dosis final. Se recolectaron los hígados para el análisis.
Medida de la concentración de oligonucleótido
Se midió la concentración de la concentración de oligonucleótido total. El método utilizado es una modificación de métodos publicados con anterioridad (Leeds et al., 1996; Geary et al., 1999) que consiste en una extracción fenol-cloroformo (líquido-líquido) seguida por una extracción en fase sólida. Se añadió un patrón interno (ISIS 355868, un oligonucleótido heptacosamérico (27-mer) fosforotioato con modificación de tipo 2'-0-metoxietilo, GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT, designado en la presente como la SEQ ID NO: 131) antes de la extracción. Se calcularon las concentraciones de la muestra de tejido utilizando curvas de calibración, con un límite inferior de cuantificación (LIDC) de aproximadamente 1,14 |jg/g. A continuación, se calcularon las semividas utilizando el software WinNonlin (PHARSIGHT).
Los resultados se presentan en la Tabla 50, expresados como jg /g de tejido hepático o renal. Los datos indican que ISIS 494372 tuvo una concentración aceptable en el hígado y los riñones.
Tabla 50
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Ejemplo 10: Farmacocinética de oligonucleótidos antisentido en ratas Sprague Dawley
Se trataron ratas Sprague Dawley macho con oligonucleótidos ISIS y se evaluaron las concentraciones de oligonucleótidos en el hígado y riñón.
Tratamiento
Se inyectaron 10 mg/kg de ISIS 494283, ISIS 494284, ISIS 494286, ISIS 494301, ISIS 494302 o ISIS 494372 a grupos de cuatro ratas cada uno por vía subcutánea dos veces a la semana durante 3 semanas. Las ratas se sacrificaron 2 días después de la dosis final. Se recolectaron los hígados para el análisis.
Medida de la concentración de oligonucleótido
Se midió la concentración de la concentración de oligonucleótido total. El método utilizado es una modificación de métodos publicados con anterioridad (Leeds et al., 1996; Geary et al., 1999) que consiste en una extracción fenol-cloroformo (líquido-líquido) seguida por una extracción en fase sólida. Se añadió un patrón interno (ISIS 355868, un oligonucleótido heptacosamérico (27-mer) fosforotioato con modificación de tipo 2'-0-metoxietilo, GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT, designado en la presente como la SEQ ID NO: 131) antes de la extracción. Se calcularon las concentraciones de la muestra de tejido utilizando curvas de calibración, con un límite inferior de cuantificación (LIDC) de aproximadamente 1,14 jg/g. A continuación, se calcularon las semividas utilizando el software WinNonlin (PHARSIGHT).
Los resultados se presentan en la Tabla 51, expresados como jg /g de tejido hepático o renal. Los datos indican que ISIS 494372 tuvo una concentración aceptable en el hígado y los riñones.
Tabla 51
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Ejemplo 11: Efectos de oligonucleótidos antisentido ISIS que tienen como diana apo(a) humana en monos cinomolgos
Se trataron monos cinomolgos con oligonucleótidos antisentido ISIS seleccionados de los estudios descritos anteriormente. En el momento en el que se llevó a cabo este estudio, no se podía consultar la secuencia genómica del mono cinomolgo en la base de datos del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI, por sus siglas en inglés); por lo tanto, no se pudo confirmar la reactividad cruzada con la secuencia génica del mono cinomolgo. En su lugar, las secuencias de los oligonucleótidos antisentido ISIS utilizados en los monos cinomolgos se compararon con una secuencia de mono rhesus para determinar la homología. Cabe esperar que los oligonucleótidos ISIS con homología con la secuencia del mono rhesus presenten una reactividad cruzada total también con la secuencia de mono cinomolgo.
Los oligonucleótidos antisentido humanos estudiados también presentan reactividad cruzada con la secuencia de ARNm rhesus (XM_001098061.1; designada en la presente como la SEQ ID NO: 132). Cuanto mayor sea la complementariedad entre el oligonucleótido humano y la secuencia de mono rhesus, más probable será que el oligonucleótido humano pueda presentar reactividad cruzada con la secuencia del mono rhesus. Se presentan los sitios de inicio y de parada para cada oligonucleótido contra la SEQ ID NO: 132 en la Tabla 52. Cada oligonucleótido antisentido tiene como diana más de una región en la SEQ ID NO: 132 y tiene múltiples sitios de inicio. «Sitio de inicio» indica el nucleótido del extremo 5' de la diana del gápmero en la secuencia de mono rhesus. «Emparejamientos erróneos» indica el número de nucleótidos emparejados erróneamente entre la secuencia del oligonucleótido humano y la secuencia de rhesus.
Se evaluó la tolerabilidad del oligonucleótido antisentido, así como también su perfil farmacocinético en el hígado y riñón.
Tabla 52
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Tratamiento
Antes del estudio, los monos se mantuvieron en cuarentena durante un periodo de al menos 30 días, durante el cual se observó a diario a los animales en lo relativo a su estado de salud general. Los monos tuvieron 2-4 años de edad y pesaron entre 2 y 4 kg. Se inyectó el oligonucleótido ISIS o PBS a siete grupos, cada uno de cuatro monos cinomolgos macho asignados al azar, por vía subcutánea utilizando una aguja de dosificación de acero inoxidable y una jeringuilla del tamaño apropiado en uno de cuatro sitios en la espalda de los monos. Las inyecciones se administraron en sentido horario; un sitio por dosificación. Los monos recibieron dosis cuatro veces a la semana durante la primera semana (días 1, 3, 5 y 7) como dosis de carga, y posteriormente una vez a la semana durante las semanas 2-12, con 40 mg/kg de ISIS 494283, ISIS 494284, ISIS 494286, ISIS 494301, ISIS 494302 o ISIS 494372. Se inyectó PBS en un grupo de control de 8 monos cinomolgos por vía subcutánea tres veces cuatro veces a la semana durante la primera semana (días 1, 3, 5 y 7) y posteriormente una vez a la semana durante las semanas 2-12.
Durante el periodo de estudio, se observó a los monos al menos una vez al día para detectar signos de enfermedad o sufrimiento. Cualquier animal que experimentó algo más que dolor o sufrimiento leve o momentáneo debido al tratamiento, lesión o enfermedad fue tratado por el personal veterinario con analgésicos o agentes aprobados para aliviar el dolor después de consultar con el Director de estudio. Se identificó cualquier animal con mala salud o que pudiera estar en un estado moribundo para una monitorización adicional y una posible eutanasia. Por ejemplo, se detectó un animal moribundo en el grupo de tratamiento con ISIS 494302 en el día 56 y se sacrificó. La eutanasia programada de los animales se llevó a cabo en los días 86 y 87 por desangrado bajo anestesia profunda. Los protocolos descritos en el Ejemplo fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucionales (IACUC, por sus siglas en inglés).
Reducción diana
Análisis de ARN
En el día 86, se extrajo ARN del tejido hepático para el análisis por PCR en tiempo real de apo(a) utilizando un conjunto de sonda cebadores humanos ABI Hs00916691_ml (Applied Biosystems, Carlsbad CA). Los resultados se presentan como inhibición porcentual de ARNm de apo(a), respecto al control de PBS. Como se muestra en la Tabla 53, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido ISIS dio como resultado una reducción significativa de ARNm de apo(a) en comparación con el control de PBS.
También se midieron los niveles de ARNm de plasminógeno, otra proteína que contiene kringle. El tratamiento con ISIS 494372 no alteró los niveles de ARNm del plasminógeno.
Tabla 53
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Análisis de proteínas
Se extrajo un mL de sangre, en días diferentes, de la vena cefálica, safena o femoral de todos los monos del estudio. Se colocaron muestras de sangre en tubos que contenían K2-EDTA para la separación de plasma. Los tubos se centrifugaron a 3000 rpm durante 10 min a temperatura ambiente para obtener plasma. Se analizaron los niveles de proteína apo(a) con un kit ELISA para apo(a) (Mercodia 10-1106-01, Uppsala, Suecia). Los resultados se presentan como cambio porcentual de los niveles respecto a las condiciones iniciales. Como se muestra en la Tabla 54, el tratamiento con varios oligonucleótidos antisentido ISIS dio como resultado una reducción significativa de los niveles de la proteína apo(a) en comparación con el control de PBS. Específicamente, el tratamiento con ISIS 494372 redujo los niveles proteicos plasmáticos en cinomolgo de apo(a).
También se midieron los niveles proteicos de apoB en los grupos de estudio. La inhibición antisentido de apo(a) no tuvo efecto en los niveles de apoB.
Tabla 54
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Estudios de tolerabilidad
Medidas del peso corporal y de los órganos
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS en la salud general de los animales, se midió el peso corporal y de los órganos en el día 86. Se midió el peso corporal y se presenta en la Tabla 55. Se midió el peso de los órganos y los datos se presentan en la Tabla 56. Los resultados indican que el tratamiento con ISIS 494372 fue bien tolerado en lo que se refiere al peso corporal y de los órganos de los monos.
Tabla 55
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Tabla 56
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Función hepática
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS en la función hepática, se mantuvieron los monos en ayunas durante la noche anterior a la extracción de sangre. Se extrajeron aproximadamente 1,5 mL de sangre de cada animal y se pusieron en tubos sin anticoagulante para la separación del suero. Los tubos se mantuvieron a temperatura ambiente durante 90 min como mínimo y a continuación se centrifugaron a 3000 rpm durante 10 min a temperatura ambiente para obtener el suero. Se midieron los niveles de varios marcadores de la función hepática utilizando un analizador químico Toshiba 200FR NEO (Toshiba Co., Japón). Se midieron los niveles plasmáticos de ALT y AST y los resultados se presentan en la Tabla 57, expresados en UI/L. Se midió de manera similar la bilirrubina, un marcador de la función hepática, y se presenta en la Tabla 57, expresada en mg/dL. Los resultados indican que el tratamiento con ISIS 494372 fue bien tolerado en lo que se refiere a la función hepática en los monos.
Tabla 57
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Análisis del nivel de proteína C-reactiva
Para evaluar cualquier efecto antiinflamatorio de los oligonucleótidos ISIS en monos cinomolgos, se extrajeron muestras de sangre para los análisis. Los monos se mantuvieron en ayunas durante la noche anterior a la extracción de sangre. Se extrajeron aproximadamente 1,5 mL de sangre de cada animal y se pusieron en tubos sin anticoagulante para la separación del suero. Los tubos se mantuvieron a temperatura ambiente durante 90 min como mínimo y a continuación se centrifugaron a 3000 rpm durante 10 min a temperatura ambiente para obtener el suero. La proteína C-reactiva (CRP), que se sintetiza en el hígado y que actúa como un marcador de la inflamación, se midió utilizando un analizador químico Toshiba 200FR NEO (Toshiba Co., Japón). Los resultados indican que el tratamiento con ISIS 494372 no provocó inflamación en los monos.
Tabla 58
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Análisis del C3 del complemento
Para evaluar cualquier efecto de los oligonucleótidos ISIS en la ruta del complemento en monos cinomolgos, se extrajeron muestras de sangre para su análisis en el día 84 (antes de la dosis) y en el día 85 (24 horas después de la dosis). Se extrajeron aproximadamente 0,5 mL de sangre de cada animal y se pusieron en tubos sin anticoagulante para la separación del suero. Los tubos se mantuvieron a temperatura ambiente durante 90 min como mínimo y a continuación se centrifugaron a 3000 rpm durante 10 min a temperatura ambiente para obtener el suero. Se midió C3 utilizando un analizador químico Toshiba 200FR NEO (Toshiba Co., Japón). Los resultados indican que el tratamiento con ISIS 494372 no provocó ningún efecto en la ruta del complemento en los monos.
Tabla 59
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Hematología
Para evaluar cualquier efecto de los oligonucleótidos ISIS en los parámetros hematológicos de monos cinomolgos, se extrajeron muestras de sangre de aproximadamente 0,5 mL de sangre en el día 87 de cada uno de los animales de estudio disponibles en tubos que contenían K2-EDTA. Las muestras se analizaron para determinar el número de glóbulos rojos (RBC, por sus siglas en inglés), número de glóbulos blancos (WBC, por sus siglas en inglés), así como también el número de plaquetas, utilizando un analizador hematológico ADVIA120 (Bayer, EE. UU.). Los datos se presentan en la Tabla 60.
Los datos indican que el tratamiento con ISIS 494372 fue bien tolerado en lo que se refiere a los parámetros hematológicos de los monos.
Tabla 60
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Ejemplo 12: Caracterización de la actividad farmacológica de ISIS 494372 en monos cinomolgos
Se caracterizó la actividad farmacológica de ISIS 494372 midiendo los niveles de ARNm de apo(a) en el hígado y de apo(a) en plasma en monos a los que se les administró el compuesto a lo largo de 13 semanas y se les permitió recuperarse durante otras 13 semanas.
Tratamiento
Se inyectó el oligonucleótido ISIS o PBS a cinco grupos, cada uno de 14 monos cinomolgos macho y hembra asignados al azar, por vía subcutánea utilizando una aguja de dosificación de acero inoxidable y una jeringuilla del tamaño apropiado en uno de cuatro sitios en la espalda (región escapular) de los monos. Los monos recibieron dosis cuatro veces a la semana durante la primera semana (días 1, 3, 5 y 7) como dosis de carga, y posteriormente una vez a la semana durante las semanas 2-13 como dosis de mantenimiento, como se muestra en la tabla a continuación. La dosis de carga durante la primera semana se expresa como mg/kg/dosis, mientras que las dosis de mantenimiento en las semanas 2-13 se expresan como mg/kg/semana.
Tabla 61
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Se extrajeron muestras hepáticas de los animales en las fases intermedias, terminales y de recuperación del estudio para el análisis de ARNm de apo(a). Además, se extrajeron muestras de plasma en diferentes días para medir los niveles de la proteína apo(a). Este estudio no clínico se llevó a cabo de acuerdo con las Directrices de la Buena Práctica en el Laboratorio (GLP, por sus siglas en inglés) de la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA, por sus siglas en inglés), 21 CFR Parte 58.
Análisis de ARN
Se extrajeron muestras del hígado de los monos en los días 30, 93 y 182 y se congelaron. Resumiendo, se homogeneizó un fragmento (0,2 g) de hígado congelado en 2 mL de solución RLT (Qiagen). El lisado resultante se aplicó a minicolumnas RNesay de Qiagen. Después de la purificación y cuantificación, los tejidos se sometieron a análisis por RT-PCR. Se utilizó el sistema de detección de secuencias ABI Prism 7700 de Perkin-Elmer, que utiliza detección por RT-PCR fluorescente en tiempo real, para cuantificar el ARNm de apo(a). El ensayo se basa en una sonda específica de la diana marcada con tintes desactivador e indicador fluorescente en extremos opuestos. La sonda se hidrolizó mediante la actividad 5'-exonucleasa de la ADN-polimerasa Taq, lo que conllevó un aumento de la emisión fluorescente del tinte indicador que se puede detectar durante la reacción. Se utilizó un conjunto de sondas (conjunto de sondas ABI Rhesus l Pa ID Rh02789275_ml, Applied Biosystems, Carlsbad CA) que tiene como diana la posición 1512 de la secuencia del transcrito de ARNm de apo(a) de mono rhesus (N.° de acceso GENBANK XM_001098061.2 (SEQ ID NO: XXX) para medir los niveles de expresión de ARNm de apo(a) en el hígado de monos cinomolgos. Se normalizó la expresión de apo(a) utilizando RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como inhibición porcentual de ARNm de apo(a), respecto al control de PBS.
Como se muestra en la Tabla 62, el tratamiento con ISIS 494372 dio como resultado una reducción dependiente de la dosis de ARNm de apo(a) en comparación con el control de PBS. En el día 30, la expresión de ARNm de apo(a) hepática se redujo de manera dependiente de la dosis en un 74% y un 99% en las cohortes de dosificación con 12 mg/kg/semana y 40 mg/kg/semana, respectivamente. Estas reducciones son estadísticamente significativas según un ANOVA unidireccional (prueba de comparación múltiple de Dunnett, P<0,05).
También se midieron los niveles de ARNm de apo(a) durante la fase de recuperación. Los niveles de expresión en el hígado en el día 88 después de la última dosis aún estuvieron reducidos un 49% y un 69% en las cohortes de dosificación con 12 mg/kg/semana y 40 mg/kg/semana, respectivamente.
Tabla 62
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Análisis de proteínas
Se analizaron aproximadamente 20 |jL de plasma utilizando un kit de ELISA para apo(a) comercializado (Mercodia 10­ 1106-01, Uppsala, Suecia). El protocolo del ensayo se realizó según lo descrito por el fabricante. Los resultados se presentan en las Tablas 63 y 64 como cambio porcentual respecto a las concentraciones de la proteína apo(a) plasmática antes de la dosis en el Día 1. Las diferencias estadísticamente significativas respecto a la apo(a) plasmática inicial en el Día 1 utilizando la prueba de comparaciones múltiple de Dunnett se marcan con un asterisco.
Se observó la reducción máxima en la proteína apo(a) plasmática en todas las cohortes de dosificación en el Día 93 o antes. En la fase de recuperación, los niveles de proteína apo(a) plasmática en la cohorte de dosificación de 40 mg/kg/semana estuvieron en un 22% y un 93% de los valores iniciales después de 4 y 13 semanas (Días 121 y 182) de recuperación, respectivamente. La tasa de recuperación en la cohorte de 12 mg/kg/semana fue similar a la observada en la cohorte de 40 mg/kg/semana.
Tabla 63
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Tabla 64
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Ejemplo 13: Medida de la viscosidad de oligonucleótidos antisentido ISIS que tienen como diana apo(a) humana
Se midió la viscosidad de oligonucleótidos seleccionados antisentido de los estudios descritos anteriormente con el objetivo de cribar los oligonucleótidos antisentido que tienen una viscosidad superior a 40 cP. Los oligonucleótidos que tienen una viscosidad superior a 40 cP tendrían una viscosidad subóptima.
Se pesaron los oligonucleótidos ISIS (32-35 mg) en un vial de vidrio, se añadieron 120 |jL de agua y el oligonucleótido antisentido se disolvió en la solución calentando el vial a 50 °C. Parte (75 j L) de la muestra precalentada se pipeteó en un microviscómetro (Cambridge). La temperatura del microviscómetro se fijó a 25 °C y se midió la viscosidad de la muestra. Se pipeteó otra parte de la muestra precalentada (20 j L) en 10 mL de agua para la lectura UV a 260 nm a 85 °C (instrumento Cary UV). Los resultados se presentan en la Tabla 65 e indican que la mayoría de las soluciones de oligonucleótidos antisentido tienen una viscosidad óptima según los criterios expuestos anteriormente. Las que no fueron óptimas se marcaron como «viscosas». Específicamente, ISIS 494372 tuvo una viscosidad óptima según los criterios expuestos anteriormente.
Tabla 65
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Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto para disminuir la expresión de apo(a) que comprende un oligonucleótido modificado constituido por de 15 a 30 nucleósidos ligados y que tiene una secuencia de bases nitrogenadas que comprende una porción de al menos 15 bases nitrogenadas contiguas complementarias a una porción de igual longitud de las bases nitrogenadas 3900 a 3923 de la SEQ ID NO: 1, y donde la secuencia de bases nitrogenadas del oligonucleótido modificado es complementaria en al menos un 80% a la SEQ ID NO: 1.
2. El compuesto de la reivindicación 1, donde el oligonucleótido modificado está constituido por de 18 a 24, de 19 a 22, de 15 a 25, 16 o 20 nucleósidos ligados.
3. El compuesto de la reivindicación 1, donde el oligonucleótido modificado comprende una secuencia de bases nitrogenadas que comprende una porción de al menos 16, al menos 18, al menos 19 o al menos 20 bases nitrogenadas contiguas complementaria a una porción de igual longitud de la SEQ ID NO: 1.
4. El compuesto de cualquier reivindicación anterior, donde la secuencia de bases nitrogenadas del oligonucleótido modificado es complementaria en al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95% o un 100% a la SEQ ID NO: 1.
5. El compuesto de cualquier reivindicación anterior, donde la secuencia de bases nitrogenadas del oligonucleótido modificado comprende al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 o 20 bases nitrogenadas contiguas de la secuencia de bases nitrogenadas de la SEQ ID NO: 58.
6. El compuesto de cualquier reivindicación anterior, donde el oligonucleótido modificado está constituido por de 18 a 24 nucleósidos ligados, y donde la secuencia de bases nitrogenadas comprende al menos 18 bases nitrogenadas contiguas de la secuencia de bases nitrogenadas de la SEQ ID NO: 58.
7. El compuesto de cualquier reivindicación anterior, donde:
(i) el oligonucleótido modificado es monocatenario,
(ii) al menos una unión internucleosídica es una unión internucleosídica modificada, opcionalmente donde al menos una unión internucleosídica es una unión internucleosídica fosforotioato,
(iii) el oligonucleótido modificado comprende al menos un azúcar modificado, opcionalmente donde: (a) al menos un azúcar modificado es un azúcar bicíclico, opcionalmente un etilo restringido o un azúcar que comprende un puente 4'-(CH2)n-O-2', donde n es 1 o 2, o (b) al menos un azúcar modificado comprende un 2'-0-metoxietilo o es un 3'-fluoro-HNA, y/o
(iv) al menos un nucleósido comprende una base nitrogenada modificada, opcionalmente donde la base nitrogenada modificada es una 5-metilcitosina.
8. El compuesto de cualquier reivindicación anterior, donde el oligonucleótido modificado comprende:
un segmento gap constituido por desoxinucleósidos ligados;
un segmento lateral en 5' constituido por nucleósidos ligados;
un segmento lateral en 3' constituido por nucleósidos ligados;
donde el segmento gap se ubica entre el segmento lateral en 5' y el segmento lateral en 3' y donde cada nucleósido de cada segmento lateral comprende un azúcar modificado.
9. El compuesto de la reivindicación 8, donde el oligonucleótido modificado está constituido por 20 nucleósidos ligados y comprende:
un segmento gap constituido por diez desoxinucleósidos ligados;
un segmento lateral (wing) en 5' constituido por cinco nucleósidos ligados;
un segmento lateral (wing) en 3' constituido por cinco nucleósidos ligados;
donde el segmento gap se ubica entre el segmento lateral en 5' y el segmento lateral en 3', donde cada nucleósido de cada segmento lateral comprende un 2'-0-metoxietilazúcar, donde cada unión internucleosídica es una unión fosforotioato y donde cada residuo de citosina es una 5-metilcitosina.
10. El compuesto de cualquier reivindicación anterior, donde el oligonucleótido modificado está constituido por 20 nucleósidos ligados y tiene una secuencia de bases nitrogenadas que comprende al menos 15 bases nitrogenadas contiguas de la secuencia de bases nitrogenadas de la SEQ ID NO: 58, donde el oligonucleótido modificado comprende: un segmento gap constituido por diez desoxinucleósidos ligados;
un segmento lateral (wing) en 5' constituido por cinco nucleósidos ligados;
un segmento lateral (wing) en 3' constituido por cinco nucleósidos ligados;
donde el segmento gap se ubica entre el segmento lateral en 5' y el segmento lateral en 3', donde cada nucleósido de cada segmento lateral comprende un 2'-0-metoxietilazúcar, donde cada unión internucleosídica es una unión fosforotioato y donde cada residuo de citosina es una 5-metilcitosina.
11. Un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado constituido por 20 nucleósidos ligados y que tiene la secuencia de bases nitrogenadas de la SEQ ID NO: 58, donde el oligonucleótido modificado comprende:
un segmento gap constituido por diez desoxinucleósidos ligados;
un segmento lateral (wing) en 5' constituido por cinco nucleósidos ligados;
un segmento lateral (wing) en 3' constituido por cinco nucleósidos ligados;
donde el segmento gap se ubica entre el segmento lateral en 5' y el segmento lateral en 3', donde cada nucleósido de cada segmento lateral comprende un 2'-0-metoxietilazúcar, donde cada unión internucleosídica es una unión fosforotioato y donde cada residuo de citosina es una 5-metilcitosina.
12. El compuesto de cualquiera de las reivindiaciones 8-11, donde el oligonucleótido es monocatenario.
13. El compuesto de cualquier reivindicación anterior, donde el compuesto es un compuesto antisentido conjugado.
14. Una composición que comprende un compuesto de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, donde opcionalmente el compuesto es una sal, y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
15. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-13 o la composición de la reivindicación 14, para su uso en terapia.
16. El compuesto o composición para su uso de la reivindicación 15, donde la terapia es tratar, prevenir o ralentizar la evolución de una enfermedad relacionada con una elevación de apo(a) y/o una elevación de Lp(a), opcionalmente donde la enfermedad es una enfermedad, trastorno o afección inflamatorios, cardiovasculares o metabólicos.
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