ES2778037T3 - Procedimiento para la producción de L-aminoácidos bajo empleo de una bacteria alcalífila - Google Patents

Abstract

Procedimiento para la sobreproducción de un L-aminoácido, caracterizado por que en este procedimiento se emplea Corynebacterium humireducens.

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimiento para la producción de L-aminoácidos bajo empleo de una bacteria alcalífila

La presente invención se refiere a un procedimiento para la producción de L-aminoácidos, en el que se emplea una bacteria alcalífila, en especial una cepa de la especie Corynebacterium humireducens.

Los procedimientos para la producción de L-aminoácidos en los que se emplean bacterias de la especie Corynebacterium son conocidos por el especialista.

Aunque son conocidos numerosos tipos de Corynebacterium, en estos procedimientos se emplean habitualmente bacterias del tipo Corynebacterium glutamicum, ya que este tipo ha demostrado ser especialmente ventajoso para la producción de L-aminoácidos.

De este modo, en el documento EP 1 108 790 A2 se describe un procedimiento para la producción de L-lisina en bacterias corineformes, en especial en Corynebacterium glutamicum.

Sahm et al. (1995) "Metabolic design in amino acid producing bacterium Corynebacterium glutamicum", FEMS Microbiology Reviews, tomo 16, N° 2-3, páginas 243-252, dan a conocer cepas recombinantes de C. glutamicum, que se pueden emplear para la producción de diversos aminoácidos.

Monica Barriuso-Iglesias et al. (2006), Microbiology (Reading), tomo 152, parte 1, páginas 11-21, describen el análisis transcripcional del operón F0F1-ATPase de C. glutamicum ATCC 13032.

Plachy et al. (1985), Folia Microbiologica, Praque, CZ, tomo 30, N° 6, páginas 485-492, describen que se puede emplear Corynebacterium sp. para la producción fermentativa de L-homoserina, L-lisina y L-treonina.

Ikeda et al. (1994), Archives of Microbiology, tomo 162, N° 6, páginas 381-386, describen el aislamiento y la caracterización de una nueva bacteria, facultativamente alcalífila, de la especie Corynebacterium.

Wu et al. (2011), International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, tomo 61, N° 4, páginas 882-887, así como CN 101 892 180 A, informan sobre el aislamiento y la caracterización bioquímica de Corynebacterium humireducens.

Era tarea de la presente invención poner a disposición una nueva cepa que se considere como alternativa a C. Glutamicum inmediatamente para la producción de L-aminoácidos, al presentar una sobreproducción significativa de al menos un L-aminoácido, o bien se considere al menos como cepa de partida prometedora para el desarrollo de una nueva cepa de producción de aminoácidos.

Con el fin de entrar en consideración como cepa de partida para el desarrollo de una nueva cepa de producción de L-aminoácidos, es ya suficiente una sobreproducción de L-aminoácido relativamente reducida. Mediante sobreexpresión o debilitamiento de genes, o bien enzimas, cuya influencia beneficiosa o dañina sobre la producción del aminoácido en cuestión es conocida, así como, en caso dado, mediante mutagénesis no orientada, se puede aumentar de modo correspondiente el rendimiento en L-aminoácido partiendo de tal cepa de partida.

Según la invención, ahora se descubrió sorprendentemente que una bacteria alcalífila, concretamente una bacteria de tipo Corynebacterium humireducens, sobreproduce ya naturalmente los L-aminoácidos L-alanina, ácido L-glutámico y L-valina en cantidad significativa.

Además, mediante cultivo en un medio que contiene AEC, así como, en caso dado, treonina, se pudo producir una cepa de C. Humireducens, que produce cantidades significativas de L-lisina.

De este modo, C. humireducens representa simultáneamente un punto de partida apropiado para la elaboración de otras cepas de producción de L-aminoácidos. Mediante desvío correspondiente del metabolismo bacteriano se puede convertir la sobreproducción de los citados L-aminoácidos en una sobreproducción de otros L-aminoácidos deseados.

La sobreproducción de L-alanina que se produce de manera natural se puede atribuir presumiblemente, sobre todo, a un alanina deshidrogenasa altamente eficiente, que se encontró en C. Humireducens. Solo para algunas otras corinebacterias se describieron alanina deshidrogenasas hasta la fecha, pero para ninguna una alanina deshidrogenasa activa hasta tal punto, cuya presencia conduce ya a una acumulación de L-alanina en el interior de la célula de tipo salvaje.

La sobreproducción de L-glutamato que se produce de manera natural se puede atribuir presumiblemente, sobre todo, a genes hut altamente eficientes (genes "histidine utilization"). El clúster hut está constituido por los cuatro genes hutU (urocanato deshidrogenasa), hutl (imidazolona propionasa) hutH (histidina amonialiasa) y hutG (formididoil glutamasa). Solo para algunas otras corinebacterias se describieron genes hut hasta la fecha, pero para ninguna genes hut activos hasta tal punto, cuya presencia conduce ya a una acumulación de L-glutamato en el interior de la célula del tipo salvaje.

Por lo tanto, un primer objeto de la presente invención es un procedimiento para la sobreproducción de un L-aminoácido, caracterizado por que en este procedimiento se emplea C. Humireducens.

Según la invención, se debe entender por "L-aminoácido" en especial los L-aminoácidos proteinógenos.

En este caso, el L-aminoácido se selecciona preferentemente a partir de L-alanina, L-valina, L-aminoácidos de la familia del glutamato, en especial L-glutamato, L-glutamina, L-prolina y L-arginina, así como L-aminoácidos de la familia del aspartato, en especial L-aspartato, L-asparagina, L-metionina, L-lisina, L-isoleucina y L-treonina. El L-aminoácido se selecciona de modo especialmente preferente a partir de L-alanina, L-valina, L-glutamato, L-metionina, L-lisina, y L-treonina, sobre todo a partir de L-alanina, L-valina, L-glutamato y L-lisina.

La cepa Stamm C. humireducens se describe por primera vez por Wu et al. (International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (2011), 61,882-887). Esta se depositó en la DSMZ bajo el número de depósito DSM 45392, su 16S rRNA se depositó en EMBL y tiene el número de acceso GQ421281. En el caso de la cepa de partida se trata de una bacteria halotolerante, alcalífila, que reduce ácido húmico.

Se pueden extraer otras informaciones sobre C. humireducens de las siguientes publicaciones: Wu et al. (Microb. Biotechnol. (2013), 6(2), 141-149), Lin et al. (Bioresour. Technol. (2013), 136, 302-308).

Correspondientemente, otro objeto de la presente invención es asimismo una alanina deshidrogenasa (Ald), caracterizada por que presenta una identidad secuencial de al menos 85 o 90 %, preferentemente al menos 92, 94, 96 o 98 %, sobre todo de 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 72.

Por lo tanto, otro objeto de la presente invención es asimismo un polinucleótido, que codifica para una alanina deshidrogenasa según la invención. En este caso se trata preferentemente de un polinucleótido que presenta una identidad secuencial de al menos 90 o 95 %, sobre todo de 100 %, respecto a la secuencia de posición 301 a 1365 según SEQ ID NO: 71.

Por lo tanto, otro objeto de la presente invención son también las enzimas del clúster hut, seleccionadas a partir de

a) una urocanato hidratasa (hutU), caracterizada por que presenta caracterizada por que presenta una identidad secuencial de al menos 85 o 90 %, preferentemente al menos 92, 94, 96 o 98 %, sobre todo 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 190;

b) una imidazolona propionasa (hutl), caracterizada por que presenta una identidad secuencial de al menos 85 o 90 %, preferentemente al menos 92, 94, 96 o 98 %, sobre todo 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 192;

c) una histidina amonialiasa (hutH), caracterizada por que presenta una identidad secuencial de al menos 85 o 90 %, preferentemente al menos 92, 94, 96 o 98 %, sobre todo 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 194; y

d) una formididoil glutamasa, caracterizada por que presenta una identidad secuencial de al menos 85 o 90 %, preferentemente al menos 92, 94, 96 o 98 %, sobre todo 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 196.

Por lo tanto, otro objeto de la presente invención son asimismo polinucleótidos que codifican para los genes según la invención del clúster hut. En este caso se trata preferentemente de los siguientes polinucleótidos:

a) un polinucleótido que codifica para una urocanato hidratasa (hutU), y presenta una identidad secuencial de al menos 70 o 75 %, preferentemente de al menos 80 o 85 %, de modo especialmente preferente de al menos 90 o 95 %, sobre todo de 100 %, respecto a la secuencia de posición 301 a 1983 según SEQ ID NO: 189;

b) un polinucleótido que codifica para una imidazolona propionasa (hutl), y presenta una identidad secuencial de al menos 70 o 75 %, preferentemente de al menos 80 o 85 %, de modo especialmente preferente de al menos 90 o 95 %, sobre todo de 100 %, respecto a la secuencia de posición 301 a 1509 según SEQ ID NO: 191;

c) un polinucleótido que codifica para una histidina amonialiasa (hutH), y presenta una identidad secuencial de al menos 70 o 75 %, preferentemente de al menos 80 o 85 %, de modo especialmente preferente de al menos 90 o 95 %, sobre todo de 100 %, respecto a la secuencia de posición 301 a 1851 según SEQ ID NO: 193; y

d) un polinucleótido que codifica para una formididoil glutamasa (hutG), y presenta una identidad secuencial de al menos 70 o 75 %, preferentemente de al menos 80 o 85 %, de modo especialmente preferente de al menos 90 o 95 %, sobre todo de 100 %, respecto a la secuencia de posición 301 a 1209 según SEQ ID NO: 195.

Otro objeto de la presente invención son asimismo polinucleótidos que son complementarios a los polinucleótidos codificantes según la invención.

Correspondientemente, otro aspecto de la divulgación son también vectores, en especial vectores de clonación y de expresión, que contienen polinucleótidos según la invención. Estos vectores se pueden incorporar correspondientemente en microorganismos, en especial en bacterias corineformes, sobre todo de la especie Corynebacterium, o Enterobacteriaceae, sobre todo de la especie Escherichia.

Además, para la expresión de genes codificados, un polinucleótido según la invención se puede incorporar también en el genoma de microorganismos, en especial en el genoma de bacterias corineformes, en especial aquellas de la especie Corynebacterium, o en el genoma de enterobacterias, en especial aquellas de la especie Escherichia.

Correspondientemente, otro objeto de la presente invención son también microorganismos recombinantes, preferentemente bacterias, en especial bacterias corineformes, sobre todo de la especie Corynebacterium, de modo especialmente preferente del tipo C. humireducens o C. glutamicum, así como enterobacterias, sobre todo de la especie Escherichia, que contienen una alanina deshidrogenasa según la invención y/o una o varias, preferentemente todas las enzimas del clúster hut según la invención y/o uno o varios polinucleótidos según la invención.

En este caso, un objeto preferente son corinebacterias recombinantes, en especial de tipo C. humireducens y de tipo C. glutamicum, que contienen una alanina deshidrogenasa según la invención y un polinucleótido que codifica para ésta.

En este caso, otro objeto preferente son corinebacterias recombinantes, en especial de tipo C. humireducens y de tipo C. glutamicum, que contienen al menos una, preferentemente todas las enzima(s) del clúster hut y/o polinucleótidos que codifican para éstas.

Un objeto especial de la presente invención son particularmente también microorganismos recombinantes, preferentemente bacterias, en especial bacterias corineformes, sobre todo aquellas de la especie Cornyebacterium con excepción del tipo C. humireducens, en especial de tipo C. glutamicum, que contienen una alanina deshidrogenasa según la invención y/o una o varias, preferentemente todas las enzimas del clúster hut según la invención y/o uno o varios polinucleótidos según la invención.

Según la invención, se debe entender por un "microorganismo recombinante", o bien "bacteria recombinante", un microorganismo, o bien una bacteria, que se sometió al menos a una medida de técnica génica. En el caso de la medida de técnica génica se puede tratar en especial de una mutación orientada al objetivo o no orientada, la incorporación de un gen ajeno al huésped y/o la sobreexpresión o el debilitamiento de un gen propio del huésped o ajeno al huésped. Un microorganismo recombinante según la invención, o bien una bacteria recombinante según la invención, se distingue preferentemente por la sobreexpresión o el debilitamiento de al menos un gen. En una forma de realización especialmente preferente, un microorganismo recombinante según la invención, o bien una bacteria recombinante según la invención, se distingue por la sobreexpresión de la alanina deshidrogenasa según la invención, o bien del polinucleótido que codifica para ésta. En otra forma de realización especialmente preferente, un microorganismo según la invención, o bien una bacteria según la invención, se distingue por la sobreexpresión de al menos una enzima del clúster hut según la invención, en especial de todas las enzimas del clúster hut según la invención, o bien de los correspondientes polinucleótidos que codifican para las enzimas.

Dentro de la especie Corynebacterium son preferentes cepas que se basan en los siguientes tipos: Corynebacterium efficiens, como por ejemplo de la cepa de tipo DSM44549, Corynebacterium glutamicum, como por ejemplo de la cepa de tipo ATCC13032 o de la cepa R, Corynebacterium ammoniagenes, como por ejemplo de la cepa ATCC6871, Corynebacterium humireducens, como por ejemplo de la cepa DSM 45392, así como Corynebacterium pekinese, como por ejemplo de la cepa CGMCC N° 5361.

Son especialmente preferentes los tipos Corynebacterium glutamicum y Corynebacterium humireducens. En tanto en el ámbito de esta solicitud se trate de la cepa Corynebacterium humireducens, se trata preferentemente de la cepa DSM 45392 o de una cepa derivada de la misma.

Algunos representantes del tipo Corynebacterium glutamicum son conocidos en el estado de la técnica también bajo otras denominaciones. A estas pertenecen, a modo de ejemplo: Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870, Corynebacterium lilium DSM20137, Corynebacterium melassecola ATCC17965, Brevibacterium flavum ATCC14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 y Brevibacterium divaricatum ATCC14020. El concepto "Micrococcus glutamicus" para Corynebacterium glutamicum era igualmente de uso común. Algunos representantes típicos del tipo Corynebacterium efficiens se designan también Corynebacterium thermoaminogenes en el estado de la técnica, como por ejemplo de la cepa FERM BP-1539.

Se encuentran datos sobre la clasificación taxonómica de cepas de los grupos de bacterias coreniformes, entre otros, en Seiler (Journal of General Microbiology 129, 1433-1477 (1983)), Kinoshita (1985, Glutamic Acid Bacteria, p 115­ 142. En: Demain and Solomon (ed.), Biology of Industrial Microorganisms. The Benjamin/Cummins Publishing Co., London, UK), Kampfer y Kroppenstedt (Canadian Journal of Microbiology 42, 989-1005 (1996)), Liebl et al (International Journal of Systematic Bacteriology 41,255-260 (1991)), Fudou et al (International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 52, 1127-1131 (2002)) y en el documento US-A-5,250,434.

Se pueden adquirir cepas con la denominación "ATCC" de la American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Se pueden adquirir cepas con la denominación "DSM" de la Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Alemania). Se pueden adquirir cepas con la denominación "NRRL" de la Agricultural Research Service Patent Culture Collection (ARS, Peoria, Illinois, US). Se pueden adquirir cepas con la denominación "FERM" del National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST Tsukuba Central 6, 1 -1 -1 Higashi, Tsukuba Ibaraki, Japan), se pueden adquirir cepas con la denominación "CGMCC" del China General Microbiological Culture Collection Center (CGMCC, Beijing, China).

Asimismo, es otro objeto de la presente invención un procedimiento para la superproducción de un L-aminoácido, caracterizado por que en este procedimiento se emplea una alanina deshidrogenasa según la invención y/o al menos una enzima del clúster hut según la invención, preferentemente todas las enzimas del clúster hut según la invención y/o al menos un polinucleótido según la invención y/o un microorganismo recombinante según la invención, preferentemente una bacteria recombinante según la invención, en especial una bacteria recombinante corineforme según la invención, de modo especialmente preferente una corinebacteria recombinante según la invención, sobre todo una corinebacteria de tipo C. humireducens o C. glutamicum. En una forma preferente de realización según la invención, en este caso se emplea al menos un polinucleótido según la invención, o bien el polipéptido codificado a través de este en forma sobreexprimida.

En este caso, un objeto preferente de la presente invención es un procedimiento para la sobreproducción de un L-aminoácido, caracterizado por que en este procedimiento se emplea una alanina deshidrogenasa según la invención y/o al menos un polinucleótido que codifica para esta y/o una corinebacteria recombinante, preferentemente de tipo C. humireducens o C. glutamicum, que contiene una alanina deshidrogenasa según la invención y/o al menos un polinucleótido que codifica para ésta.

Por lo tanto, otro objeto preferente de la presente invención es asimismo un procedimiento para la sobreproducción de un L-aminoácido, caracterizado por que en este procedimiento se emplea al menos una enzima del clúster hut según la invención, preferentemente todas las enzimas del clúster hut según la invención y/o al menos un polinucleótido que codifica para esta(s) enzima(s), preferentemente polinucleótidos que codifican para todas las enzimas del clúster hut según la invención, y/o una corinebacteria recombinante, preferentemente de tipo C. humireducens o C. glutamicum, que contiene al menos una enzima del clúster hut según la invención, preferentemente todas las enzimas del clúster hut según la invención y/o al menos un polinucleótido que codifica para esta(s) enzima(s), preferentemente polinucleótidos que codifican todas las enzimas del clúster hut según la invención.

En este caso, el L-aminoácido producido según la invención se selecciona preferentemente a partir de L-alanina, L-valina, L-aminoácidos de la familia de glutamato, en especial L-glutamato, L-glutamina, L-prolina y L-arginina, así como L-aminoácidos de la familia de aspartato, en especial L-aspartato, L-asparagina, L-metionina, L-lisina, L-isoleucina y L-treonina, de modo especialmente preferente seleccionado a partir de L-alanina, L-valina, L-glutamato, L-metionina, L-lisina y L-treonina, sobre todo a partir de L-alanina, L-valina, L-glutamato y L-lisina.

La corinebacteria empleada en el procedimiento de producción según la invención se selecciona preferentemente a partir de C. humireducens y C. glutamicum.

Según la invención, se debe entender por "producción excedente", o bien "superproducción", respecto al L-aminoácido, que los microorganismos producen los L-aminoácidos más allá de su demanda propia, y se concentran en la célula, o bien precipitan en el medio nutriente circundante, y se acumulan en el mismo. En este caso, a tal efecto, los microorganismos pueden concentrarse, o bien acumularse en la célula o en el medio nutriente > (al menos) 0,25 g/l, > 0,5 g/l, > 1,0 g/l, > 1,5 g/l, > 2,0 g/l, > 4 g/l o > 10 g/l del respectivo L-aminoácido en < (máximo) 120 horas, < 96 horas, < 48 horas, < 36 horas, < 24 horas o < 12 horas.

En una forma de realización preferente, ya antes de la incorporación de polinucleótidos y/o vectores según la invención, los microorganismos recombinantes según la invención, en los que se introdujeron polinucleótidos según la invención y/o vectores según la invención, poseen la capacidad de sobreproducir un L-aminoácido. En el caso de las cepas de partida se trata preferentemente de cepas que se produjeron mediante mutagénesis y selección, mediante técnicas de ADN recombinantes o mediante una combinación de ambos métodos.

Es evidente, y no requiere explicaciones adicionales, que se puede llegar a un microorganismo recombinante según la invención también induciéndose a continuación un tipo salvaje, en el que está contenido o se incorporó un polinucleótido según la invención y/o un vector según la invención, a producir el L-aminoácido, o bien a aumentar la producción de L-aminoácido, mediante otras medidas genéticas apropiadas.

Otro aspecto de la divulgación son también otros polinucleótidos de C. Humireducens, así como los polipéptidos codificados a través de estos polinucleótidos. Mediante sobreexpresión de los correspondientes polinucleótidos, o bien polipéptidos, se puede influir positivamente sobre la producción de aminoácidos de determinados L-aminoácidos. Los microorganismos o las bacterias citados en este caso, en especial corinebacterias, sobre todo corinebacterias según la invención de tipo C. humireducens o C. glutamicum, en especial cepas de sobreproducción de L-valina según la invención, presentan preferentemente al menos una, de modo preferente al menos 2 o 3, de modo especialmente preferente al menos 4 o 5 de las siguientes características:

a) un polinucleótido sobreexprimido (gen ilvA), que codifica para una treonina deshidratasa (IlvA, EC 4.3.1.19), preferentemente para una treonina deshidratasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 106,

b) un polinucleótido sobreexprimido (gen ilvB), que codifica para la subunidad de una acetolactato sintasa (lIvB), preferentemente para la subunidad de una acetolactato sintasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 98,

c) un polinucleótido sobreexprimido (gen ilvN), que codifica para la subunidad preferentemente resistente a retroalimentación de una acetolactato sintasa (IlvN, EC 4.1.3.18),

d) un polinucleótido sobreexprimido (gen ilvC), que codifica para una isomerorreductasa (IlvC, EC 1.1.1.86), preferentemente para una isomerorreductasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 100,

e) un polinucleótido sobreexprimido (gen ilvD), que codifica para una dihidroxi-ácido deshidratasa (IlvD, EC 4.2.1.9), preferentemente para una dihidroxi-ácido deshidratasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 102,

f) un polinucleótido sobreexprimido (gen ilvE), que codifica para una transaminasa (IlvE, EC 2.6.1.42), preferentemente para una transaminasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 104,

g) un polinucleótido sobreexprimido (gen ilvH), que codifica para una acetolactato sintasa (IlvH, EC 2.2.1.6), preferentemente para una acetolactato sintasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 122,

h) un polinucleótido debilitado (thrB-Gen), que codifica para una homoserina quinasa (ThrB, EC 2.7.1.39), preferentemente para una homoserina quinasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 4,

i) un polinucleótido debilitado (thrC-Gen), que codifica para una treonina sintasa (ThrC, EC 4.2.3.1), preferentemente para una treonina sintasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 108,

j) un polinucleótido sobreexprimido (hom-Gen), que codifica para una homoserina deshidrogenasa, en caso dado resistente a retroalimentación (Hom, EC 1.2.1.11), preferentemente para una homoserina deshidrogenasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 46,

k) un polinucleótido debilitado (leuA-Gen), que codifica para una isopropilmalato sintasa, en caso dado resistente a retroalimentación (LeuA, EC 2.3.3.13), preferentemente para una isopropilmalato sintasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 110,

l) un polinucleótido debilitado (leuB-Gen), que codifica para una isopropilmalato deshidrogenasa (LeuB, EC 1.1.1.85), preferentemente para una isopropilmalato deshidrogenasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 112,

m) polinucleótidos debilitados (leuCD-Gene), que codifican para las subunidades de una isopropilmalato isomerasa (LeuCD, EC 4.2.1.33), preferentemente para las subunidades de una isopropilmalato isomerasa con identidades secuenciales de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a las secuencias según SEQ ID NO: 114 y SEQ ID NO: 116,

n) un polinucleótido sobreexprimido (panB-Gen), que codifica para una 3-metil-2-oxobutanoato hidroximetiltransferasa (PanB, EC 2.1.2.11), preferentemente para una 3-metil-2-oxobutanoato hidroximetiltransferasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 118,

o) un polinucleótido sobreexprimido (panC-Gen), que codifica para una pantotenato sintasa (PanC, EC 6.3.2.1), preferentemente para una pantotenato sintasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 120.

Correspondientemente, otro aspecto de la divulgación es también un procedimiento para la sobreproducción de un L-aminoácido, en especial L-valina, en el que se emplea tal microorganismo, o bien tal bacteria.

Los microorganismos o las bacterias citados en este caso, en especial corinebacterias, sobre todo corinebacterias según la invención de tipo C. humireducens o C. glutamicum, en especial cepas de sobreproducción de L-glutamato según la invención, presentan preferentemente al menos una, de modo preferente al menos dos o tres, de modo especialmente preferente al menos cuatro o cinco de las siguientes características, de modo especialmente preferente en combinación con la sobreexpresión de al menos un gen hut según la invención, en especial en combinación con la sobreexpresión de todos los genes hut según la invención:

a) un polinucleótido sobreexprimido (gdh), que codifica para una glutamato deshidrogenasa (Gdh), preferentemente para una glutamato deshidrogenasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 124,

b) un polinucleótido sobreexprimido, que codifica para una glutamina sintetasa (glutamina sintetasa 1), preferentemente para una glutamina sintetasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 126,

c) un polinucleótido sobreexprimido, que codifica para una glutamina sintetasa (glutamina sintetasa 2), preferentemente para una glutamina sintetasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 128,

d) un polinucleótido sobreexprimido, que codifica para una glutamato sintasa, preferentemente para una glutamato sintasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 130,

e) un polinucleótido sobreexprimido, que codifica para una isocitrato deshidrogenasa, preferentemente para una isocitrato deshidrogenasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 132,

f) un polinucleótido sobreexprimido, que codifica para una aconitato hidrasa, preferentemente para una aconato hidrasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 134,

g) un polinucleótido sobreexprimido, que codifica para una citrato sintasa, preferentemente para una citrato sintasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 136,

h) un polinucleótido sobreexprimido (pepC), que codifica para una aminopeptidasa C (PepC), preferentemente para una aminopeptidasa C con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 138,

i) un polinucleótido sobreexprimido, que codifica para una piruvato deshidrogenasa, preferentemente para una piruvato deshidrogenasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 140,

j) un polinucleótido sobreexprimido, que codifica para una piruvato quinasa (piruvato quinasa 1), preferentemente para una piruvato quinasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 142,

k) un polinucleótido sobreexprimido, que codifica para una piruvato quinasa (piruvato quinasa 2), preferentemente para una piruvato quinasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 144,

l) un polinucleótido sobreexprimido, que codifica para una enolasa, preferentemente para una enolasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 146,

m) un polinucleótido sobreexprimido (gpmA), que codifica para una fosfoglicerato mutasa dependiente de 2,3-bisfosfoglicerato (GpmA), preferentemente para una fosfoglicerato mutasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 148,

n) un polinucleótido sobreexprimido (pgk), que codifica para una fosfoglicerato quinasa (Pgk), preferentemente para una fosfoglicerato quinasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 150,

o) un polinucleótido sobreexprimido, que codifica para una glicerinaldehído-3-fosfato deshidrogenasa (glicerin-3-fosfato deshidrogenasa 1), preferentemente para una glicerinaldehído-3-fosfato deshidrogenasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 152,

p) un polinucleótido sobreexprimido, que codifica para una glicerinaldehído-3-fosfato deshidrogenasa (glicerin-3-fosfato deshidrogenasa 2), preferentemente para una glicerinaldehído-3-fosfato deshidrogenasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 154,

q) un polinucleótido sobreexprimido (tpiA), que codifica para una triosafosfato isomerasa (TpiA), preferentemente para una triosafosfato isomerasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 156,

r) un polinucleótido sobreexprimido, que codifica para una fructosabisfosfato aldolasa, preferentemente para una fructosabisfosfato aldolasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 158,

s) un polinucleótido sobreexprimido, que codifica para una 1-fosfofructo quinasa, preferentemente para una 1-fosfofructo quinasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 160,

t) un polinucleótido sobreexprimido, que codifica para una 6-fosfofructo quinasa, preferentemente para una 6-fosfofructo quinasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 162,

u) un polinucleótido sobreexprimido (pgi), que codifica para una glucosa-6-fosfato isomerasa, preferentemente para una glucosa-6-fosfato isomerasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 6,

v) polinucleótidos debilitados (sucCD), que codifican para las subunidades de una succinil-CoA-ligasa (SucCD, EC 6.2.1.5), preferentemente para las subunidades de una succinil-CoA-ligasa con identidades secuenciales de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a las secuencias según SEQ ID NO: 198, o bien SEQ ID NO: 200.

Correspondientemente, otro aspecto de la divulgación es también un procedimiento para la sobreproducción de un L-aminoácido, en especial L-glutamato, en el que se emplea tal microorganismo, o bien tal bacteria.

Los microorganismos o las bacterias citados en este caso, en especial corinebacterias, sobre todo corinebacterias según la invención de tipo C. humireducens o C. glutamicum, en especial cepas de sobreproducción de L-alanina según la invención, presentan preferentemente al menos una, de modo preferente al menos dos o tres, de modo especialmente preferente al menos cuatro o cinco de las siguientes características, de modo especialmente preferente en combinación con la sobreexpresión del gen ald según la invención:

a) un polinucleótido sobreexprimido (alaD), que codifica para una alanina deshidrogenasa (AlaD), preferentemente para una alanina deshidrogenasa de corinebacterias,

b) un polinucleótido sobreexprimido (gapA), que codifica para una glicerinaldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GapA), preferentemente para una glicerinaldehído-3-fosfato deshidrogenasa de corinebacterias,

c) un polinucleótido desconectado o debilitado (IdhA), que codifica para una L-lactato deshidrogenasa (LdhA), preferentemente para una L-lactato deshidrogenasa de corinebacterias,

d) un polinucleótido desconectado o debilitado (ppc), que codifica para una fosfoenolpiruvato carboxilasa (Ppc), preferentemente para una fosfoenolpiruvato carboxilasa de corinebacterias,

e) un polinucleótido desconectado o debilitado (alr), que codifica para una alanina racemasa (Alr), preferentemente para una alanina racemasa de corinebacterias.

Correspondientemente, otro aspecto de la divulgación es también un procedimiento para la sobreproducción de un L-aminoácido, en especial L-alanina, en el que se emplea tal microorganismo, o bien tal bacteria.

Los microorganismos o las bacterias citados en este caso, en especial corinebacterias, sobre todo corinebacterias según la invención de tipo C. humireducens o C. glutamicum, en especial cepas de sobreproducción de L-metionina según la invención, presentan preferentemente al menos una, de modo preferente al menos dos o tres, de modo especialmente preferente al menos cuatro o cinco de las siguientes características:

a) un polinucleótido debilitado (mcbR), que codifica para un dominio de enlace de ADN de tipo HTH tetR (McbR), preferentemente para un dominio de enlace de ADN con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 2,

b) un polinucleótido debilitado (thrB-Gen), que codifica para una homoserina quinasa (ThrB, EC 2.7.1.39), preferentemente para una homoserina quinasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 4,

c) un polinucleótido debilitado (pgi), que codifica para una glucosa-6-fosfato isomerasa (Pgi, EC 5.3.1.9), preferentemente para una glucosa-6-fosfato isomerasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 6,

d) un polinucleótido debilitado (pck), que codifica para una fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (Pck, EC 4.1.1.32), preferentemente para una fosfoenolpiruvato carboxiquinasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 8,

e) un polinucleótido debilitado (metQ), que codifica para una lipoproteína que enlaza D-metionina (MetQ), preferentemente para una lipoproteína que enlaza D-metionina con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 10,

f) un polinucleótido debilitado (metP), que codifica para un transportador de metionina (MetP), preferentemente para un transportador de metionina con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 12,

g) un polinucleótido debilitado (metN), que codifica para un transportador de metionina dependiente de ATP (MetN), preferentemente para un transportador de metionina dependiente de ATP con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 14,

h) un polinucleótido debilitado (metK), que codifica para una S-adenosilmetionina sintasa (MetK), preferentemente para una S-adenosilmetionina sintasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 16,

i) un polinucleótido debilitado (metl), que codifica para un sistema de importación de metionina permeasa (Metl), preferentemente para un sistema de importación de metionina permeasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 18,

j) un polinucleótido debilitado (dapA), que codifica para una 4-hidroxi-tetrahidrodipicolinato sintasa (DapA), preferentemente para una 4-hidroxi-tetrahidrodipicolinato sintasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 20,

k) un polinucleótido sobreexprimido (CBS, cysK), que codifica para una cisteína sintasa (CBS, CysK), preferentemente para una cisteína sintasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 22,

l) un polinucleótido debilitado, que codifica para una carboxilatoamina ligasa, preferentemente para una carboxilatoamina ligasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 24,

m) un polinucleótido sobreexprimido (aecD), que codifica para una cistationina beta-liasa (AecD), preferentemente para una cistationina beta-liasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 26,

n) un polinucleótido sobreexprimido (asd), que codifica para una aspartato-semialdehído deshidrogenasa (Asd), preferentemente para una aspartato-semialdehído deshidrogenasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 28,

o) un polinucleótido sobreexprimido (metH), que codifica para una 5-metiltetrahidrofolato homocisteína metiltransferasa (MetH, EC 2.1.1.13),

p) un polinucleótido sobreexprimido (brnE), que codifica para la menor subunidad de un transportador para aminoácidos de cadena ramificada (BrnE), preferentemente para una subunidad con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 30,

q) un polinucleótido sobreexprimido (brnF), que codifica para la mayor subunidad de un transportador para aminoácidos de cadena ramificada (BrnF), preferentemente para una subunidad con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 32,

r) un polinucleótido sobreexprimido (cysE), que codifica para una serina acetiltransferasa (CysE), preferentemente para una serina acetiltransferasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 34,

s) un polinucleótido sobreexprimido (cysK), que codifica para una cisteína sintasa (CysK), preferentemente para una cisteína sintasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 36,

t) un polinucleótido sobreexprimido (gcvH), que codifica para la proteína H de un sistema que disocia glicina (GcvH), preferentemente para una proteína H con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 38,

u) un polinucleótido sobreexprimido (gcvP), que codifica para la proteína P de un sistema que disocia glicina (GcvP), preferentemente para una proteína P con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 40,

v) un polinucleótido sobreexprimido (gcvT), que codifica para la proteína T de un sistema que disocia glicina (GcvT), preferentemente para una proteína T con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 42,

w) un polinucleótido sobreexprimido (glyA), que codifica para una serina hidroximetiltransferasa (GlyA), preferentemente para una serina hidroximetiltransferasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 44,

x) un polinucleótido sobreexprimido (hom), que codifica para una homoserina deshidrogenasa, en caso dado resistente a retroalimentación (Hom), preferentemente para una homoserina deshidrogenasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 46,

y) un polinucleótido sobreexprimido (lipA), que codifica para una lipoil sintasa (LipA), preferentemente para una lipoil sintasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 48,

z) un polinucleótido sobreexprimido (lipB), que codifica para una lipoil transferasa (LipB), preferentemente para una lipoil transferasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 50,

aa) un polinucleótido sobreexprimido (Ipd), que codifica para una dihidrolipoil deshidrogenasa (Lpd), preferentemente para una dihidrolipoil deshidrogenasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 52,

bb) un polinucleótido sobreexprimido (IpIA), que codifica para una lipoato proteína ligasa (LplA), preferentemente para una lipoato proteína ligasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 94,

cc) un polinucleótido sobreexprimido (gcvL), que codifica para una dihidrolipoil deshidrogenasa (GcvL), preferentemente para una dihidrolipoil deshidrogenasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 96,

dd) un polinucleótido sobreexprimido (lysC), que codifica para una aspartato quinasa, preferentemente resistente a retroalimentación (LysC), preferentemente para una aspartato quinasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 54,

ee) un polinucleótido sobreexprimido (metB), que codifica para una cistationina gamma-sintasa (MetB), preferentemente para una cistationina gamma-sintasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 56,

ff) un polinucleótido sobreexprimido (metF), que codifica para una 5,10-metilentetrahidrofolato reductasa (MetF), preferentemente para una 5,10-metilentetrahidrofolato reductasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 58,

gg) un polinucleótido sobreexprimido (metX), que codifica para una homoserina-O-acetiltransferasa (MetX), preferentemente para una homoserina-O-acetiltransferasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 60,

hh) un polinucleótido sobreexprimido (metY), que codifica para una O-acetilhomoserina liasa (MetY), preferentemente para una O-acetilhomoserina liasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 62,

ii) un polinucleótido sobreexprimido (pyc), que codifica para una piruvato carboxilasa (Pyc), preferentemente para una piruvato carboxilasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 64,

jj) un polinucleótido sobreexprimido (serA), que codifica para una D-3-fosfoglicerato deshidrogenasa, en caso dado resistente a retroalimentación (SerA), preferentemente para una D-3-fosfoglicerato deshidrogenasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 66, kk) un polinucleótido sobreexprimido (serB), que codifica para una fosfoserina fosfatasa (SerB), preferentemente para una fosfoserina fosfatasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 68,

ll) un polinucleótido sobreexprimido (serC), que codifica para una fosfoserina aminotransferasa (SerC), preferentemente para una fosfoserina aminotransferasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 70,

mm) un polinucleótido sobreexprimido (cysD), que codifica para la subunidad de una sulfato adenililtransferasa (CysD), preferentemente para una subunidad con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 74,

nn) un polinucleótido sobreexprimido (cysH), que codifica para una adenosinfosfosulfato reductasa (CysH), preferentemente para una adenosinfosfosulfato reductasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 76,

oo) un polinucleótido sobreexprimido (cysl), que codifica para una sulfito reductasa (Cysl), preferentemente para una sulfito reductasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 78,

pp) un polinucleótido sobreexprimido (cysJ), que codifica para (CysJ), preferentemente para una con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 80, qq) un polinucleótido sobreexprimido (cysN), que codifica para la subunidad de una sulfato adenililtransferasa (CysD), preferentemente para una subunidad con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 82,

rr) un polinucleótido sobreexprimido (cysY), que codifica para una cistationina beta-sintasa (CysY), preferentemente para una cistationina beta-sintasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 84,

ss) un polinucleótido sobreexprimido (cysZ), que codifica para un transportador de sulfato putativo (CysZ), preferentemente para un transportador de sulfato con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 86,

tt) un polinucleótido sobreexprimido (metE), que codifica para una 5-metiltetrahidropteroiltriglutamato homocisteína metiltransferasa (MetE), preferentemente para una proteína con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 88,

uu) un polinucleótido sobreexprimido (ptH1), que codifica para una peptidil-tRNA-hidrolasa 1 (PtH1), preferentemente para una peptidil-tRNA-hidrolasa 1 con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 90,

vv) un polinucleótido sobreexprimido (ptH2), que codifica para una peptidil-tRNA-hidrolasa 2 (PtH2), preferentemente para una peptidil-tRNA-hidrolasa 2 con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 92.

Correspondientemente, otro aspecto de la divulgación es también un procedimiento para la sobreproducción de un L-aminoácido, en especial L-metionina, en el que se emplea tal microorganismo, o bien tal bacteria.

Los microorganismos o las bacterias citados en este caso, en especial corinebacterias, sobre todo corinebacterias según la invención de tipo C. humireducens o C. glutamicum, en especial cepas de sobreproducción de L-lisina según la invención, presentan preferentemente al menos una, de modo preferente al menos 2 o 3, de modo especialmente preferente al menos 4 o 5 de las siguientes características:

a) un polinucleótido sobreexprimido (dapA), que codifica para una dihidropicolinato sintasa (DapA, EC 4.2.1.52), preferentemente para una dihidropicolinato sintasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 20,

b) un polinucleótido sobreexprimido (lysC), que codifica para una aspartato quinasa, preferentemente resistente a retroalimentación (LysC, EC 2.7.2.4), preferentemente para una aspartato quinasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 54,

c) un polinucleótido sobreexprimido (ddh), que codifica para una diaminopimelato deshidrogenasa (Ddh, EC 1.4.1.16), preferentemente para una diaminopimelato deshidrogenasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 202,

d) un polinucleótido sobreexprimido (asd), que codifica para una aspartato semialdehído deshidrogenasa (Asd, EC 1.2.1.11), preferentemente para una aspartato semialdehído deshidrogenasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 28,

e) un polinucleótido sobreexprimido (lysA), que codifica para una diaminopimelato descarboxilasa (LysA, EC 4.1.1.20), preferentemente para una diaminopimelato descarboxilasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 164,

f) un polinucleótido sobreexprimido (aat), que codifica para una aspartato aminotransferasa (AaT, EC 2.6.1.1), preferentemente para una aspartato aminotransferasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 166,

g) un polinucleótido sobreexprimido (lysE), que codifica para un exportador de L-lisina (LysE, permeasa de eflujo de lisina), preferentemente para un exportador de L-lisina con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 168,

h) un polinucleótido sobreexprimido (pyc), que codifica para una piruvato carboxilasa (Pyc, EC 6.4.1.1), preferentemente para una piruvato carboxilasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 64,

i) un polinucleótido sobreexprimido (dapF), que codifica para una diaminopimelato epimerasa (DapF, EC 5.1.1.7),

j) un polinucleótido sobreexprimido (dapB), que codifica para una dihidropicolinato reductasa (DapB, EC 1.3.1.26), preferentemente para una dihidropicolinato reductasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 170,

k) un polinucleótido sobreexprimido, que codifica para una glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (EC 1.1.1.49), preferentemente para una glucosa-6-fosfato deshidrogenasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 172,

l) un polinucleótido sobreexprimido (zwf), que codifica para la subunidad Zwf de una glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (Zwf, EC 1.1.1.49), preferentemente para una subunidad Zwf con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 186,

m) un polinucleótido sobreexprimido (opcA), que codifica para la subunidad OpcA de una glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (OpcA, EC 1.1.1.49), preferentemente para una subunidad OpcA con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 188,

n) un polinucleótido sobreexprimido (gnd), que codifica para una deshidrogenasa de ácido fosfoglucónico (Gnd, EC 1.1.1.44), preferentemente para una deshidrogenasa de ácido fosfoglucónico con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 174,

o) un polinucleótido desconectado o debilitado (mqo), que codifica para una malato quinona oxidorreductasa (Mqo, EC 1.1.99.16), preferentemente para una malato quinona oxidorreductasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 176,

p) un polinucleótido desconectado o debilitado, que codifica para la subunidad E1p de un complejo de piruvato deshidrogenasa (AceE, EC 1.2.4.1), preferentemente para una subunidad E1p con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 178,

q) un polinucleótido desconectado o debilitado (gltA), que codifica para una citrato sintasa (GltA, EC 4.1.3.7), preferentemente para una citrato sintasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 180,

r) un polinucleótido desconectado o debilitado (mdh), que codifica para una malato deshidrogenasa (Mdh, EC 1.1.1.37), preferentemente para una malato deshidrogenasa con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 182,

s) un polinucleótido desconectado o debilitado (murE), que codifica para una UDP-N-acetilmuramoilalanil-D-glutamato-2,6-diaminopimelato ligasa, 6-diaminopimelato ligasa (MurE, EC 6.3.2.13), preferentemente para una enzima con una identidad secuencial de al menos 90, 95 o 98 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 184.

Correspondientemente, otro aspecto de la manifestación es también un procedimiento para la sobreproducción de un L-aminoácido, en especial L-lisina, en el que se emplea tal microorganismo, o bien tal bacteria.

Los polinucleótidos y polipéptidos citados anteriormente, empleados, o bien a emplear en el procedimiento según la invención, proceden preferentemente de corinebacterias, en especial de C. glutamicum o C. humireducens, de modo especialmente preferente de C. humireducens.

Según la invención, generalmente se debe entender por "sobreexpresión" un aumento de la concentración o actividad intracelular de un ácido ribonucleico, de una proteína (polipéptido), o de una enzima, que se codifican mediante un correspondiente ADN, en un microorganismo en comparación con la cepa de partida (cepa madre) o la cepa de tipo salvaje. Se entiende por una cepa de partida (cepa madre) la cepa en la que se llevó a cabo la medida que conduce a la sobreexpresión.

El aumento de la concentración o actividad se puede conseguir, a modo de ejemplo, aumentándose el número de copias de los correspondientes polinucleótidos codificantes al menos en una copia por vía cromosómica o extracromosómica.

Un método bastante extendido para el aumento del número de copias consiste en incorporar el corrrespondiente nucleótido codificante en un vector, preferentemente un plásmido, que se replica por un microorganismo, en especial una bacteria corineforme. Además, como vectores se pueden emplear transposones, elementos de inserción (elementos de IS) o fagos. En el estado de la técnica se describe una variedad de vectores apropiados.

Otro método extendido para la consecución de una sobreexpresión es el procedimiento de amplificación génica cromosómica. En este método se inserta al menos una copia adicional del polinucleótido interesante en el cromosoma de una bacteria corineforme. Tales procedimientos de amplificación se describen, a modo de ejemplo, en el documento WO 03/014330 o el documento WO 03/040373.

Otro método para la consecución de una sobreexpresión consiste en enlazar el correspondiente gen, o bien alelo, de modo funcional (unido de manera operativa) con un promotor, o bien un cassette de expresión. Se describen promotores apropiados para Corynebacterium glutamicum, a modo de ejemplo, en la Fig. 1 del artículo recopilatorio de Patek et al. (Journal of Biotechnology 104(1 -3), 311 -323 (2003)) y en descripciones resumidas, como el "Handbook of Corynebacterium glutamicum" (Eds.: Lothar Eggeling y Michael Bott, CRC Press, Boca Raton, US (2005)) o el libro "Corynebacteria, Genomics and Molecular Biology" (Ed.: Andreas Burkovski, Caister Academic Press, Norfolk, UK (2008)). Del mismo modo se pueden emplear las variantes de promotor dapA, a modo de ejemplo el promotor A25, descritas por Vasicova et al (Journal of Bacteriology 181, 6188-6191 (1999)). Además se puede emplear el promotor gap de Corynebacterium glutamicum (EP 06007373). Finalmente se pueden emplear los promotores T3, T7, SP6, M13, lac, tac y trc, bastante conocidos, descritos por Amann et al. (Gene 69(2), 301-315 (1988)) y Amann y Brosius (Gene 40(2-3), 183-190 (1985)). Tal promotor se puede insertar, a modo de ejemplo, en línea de entrada del gen en cuestión, típicamente a distancia de aproximadamente 1 - 500 nucleobases del codón de iniciación.

Mediante la medida de sobreexpresión, la actividad o la concentración del correspondiente polipéptido aumentan preferentemente en al menos un 10 %, 25 %, 50 %, 75 %, 100 %, 150 %, 200 %, 300 %, 400 % o 500 %, como máximo hasta preferentemente 1000 % o 2000 %, referido a la actividad o la concentración de polipéptido en la cepa antes de la medida que conduce a la sobreexpresión.

La concentración de una proteína se puede determinar mediante separación en gel proteico 1- y 2-dimensional y subsiguiente identificación óptica de la concentración de proteínas con un correspondiente software de valoración en el gel. Un método común para la preparación de geles proteicos en bacterias corineformes y para la identificación de proteínas es el procedimiento descrito por Hermann et al. (Electrophoresis, 22:1712-23 (2001)). La concentración de proteínas se puede determinar igualmente mediante hibridación Western-Blot con un anticuerpo específico para la proteína a identificar (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989) y subsiguiente valoración óptica con un correspondiente software para la determinación de la concentración (Lohaus y Meyer (1998) Biospektrum 5:32-39; Lottspeich, Angewandte Chemie 38: 2630-2647 (1999)). La actividad se puede determinar con ayuda de un test enzimático apropiado.

Según la invención, el concepto "debilitamiento" designa la reducción de la concentración o actividad intracelular de un ácido ribonucleico, de una proteína (polipéptido) o de una enzima, que se codifican mediante un ADN correspondiente, en un microorganismo, en comparación con la cepa de partida (cepa madre) o la cepa de tipo salvaje. Se denomina cepa de partida (cepa madre) la cepa en la que se llevó a cabo la medida de debilitamiento.

El debilitamiento se puede conseguir reduciéndose la expresión de un polipéptido, a modo de ejemplo mediante empleo de un promotor débil, o empleándose un alelo que codifica para un polipéptido con una menor actividad, y combinándose estas medidas en caso dado. El debilitamiento también se puede conseguir suprimiéndose completamente la expresión del polipéptido, a modo de ejemplo desactivándose el gen codificante.

Mediante la medida de debilitamiento se reduce la actividad o la concentración del correspondiente polipéptido preferentemente en al menos un 10 %, un 25 %, un 50 % o un 75 %, como máximo en un 100 %, referido a la actividad o la concentración de polipéptido en la cepa antes de la medida que conduce al debilitamiento. En una forma de realización preferente, el debilitamiento consiste en la desactivación completa de la expresión del polipéptido en cuestión.

En relación con la producción de aminoácidos, generalmente se entiende por enzimas resistentes a retroalimentación enzimas que presentan una menor sensibilidad frente a la inhibición debida al L-aminoácido producido y/o análogos en comparación con la forma salvaje.

De este modo, en especial, se entiende por una aspartato quinasa resistente a retroalimentación (LysCFBR) una aspartato quinasa que presenta, en comparación con la forma salvaje, una menor sensibilidad frente a la inhibición debida a mezclas de lisina y treonina, o mezclas de AEC (aminoetilcisteína) y treonina o lisina por separado, o AEC por separado. Para la producción de lisina se emplean preferentemente correspondientes cepas que contienen tales aspartato quinasas resistentes a retroalimentación, o bien desensibilizadas.

Por la literatura son conocidas, a modo de ejemplo, las siguientes aspartato quinasas de C. glutamicum resistentes a retroalimentación: A279T, A279V, S301F, S301Y, T308I, T311I, R320G, G345D, S381F. Respecto a aspartato quinasas de C. glutamicum resistentes a retroalimentación se remite además a las siguientes publicaciones: JP1993184366-A, JP1994062866-A, JP1994261766-A, JP1997070291-A, JP1997322774-A, JP1998165180-A, JP1998215883-A, US5688671-A, EP0387527, WO00/63388, US3732144, JP6261766, Jetten et al. (1995; Applied Microbiology Biotechnology 43: 76-82). En el banco génico NCBI se depositan aspartato quinasas de C. glutamicum resistentes a retroalimentación bajo los siguientes números de acceso: E05108, E06825, E06826, E06827, E08177, E08178, E08179, E08180, E08181, E08182, E12770, E14514, E16352, E16745, E16746, I74588, I74589, I74590, I74591, I74592, I74593, I74594, I74595, I74596, I74597, X57226, L16848, L27125.

Según la invención se emplean preferentemente las siguientes aspartato quinasas de C. humireducens resistentes a retroalimentación: D274Y, A279E, S301Y, T308I, T311I, G359D.

Del mismo modo, en la producción de treonina se emplean preferentemente cepas que contienen correspondientemente una homoserina deshidrogenasa resistente a retroalimentación (HomFBR).

Del mismo modo, en la producción de isoleucina y en la producción de valina se emplean preferentemente cepas que contienen correspondientemente una acetolactato sintasa resistente a retroalimentación.

Del mismo modo, en la producción de leucina se emplean preferentemente cepas que contienen correspondientemente una isopropilmalato sintasa resistente a retroalimentación (LeuAFBR).

Del mismo modo, en la producción de prolina se emplean preferentemente cepas que contienen correspondientemente una glutamato 5-quinasa resistente a retroalimentación (ProBFBR).

Del mismo modo, en la producción de arginina se emplean preferentemente cepas que contienen correspondientemente una ornitina carbamoiltransferasa resistente a retroalimentación (ArgFFBR).

Del mismo modo, en la producción de serina se emplean preferentemente cepas que contienen correspondientemente una D-3-fosfoglicerato deshidrogenasa resistente a retroalimentación (SerAFBR).

Del mismo modo, en la producción de metionina se emplean preferentemente cepas que contienen correspondientemente una D-3-fosfoglicerato deshidrogenasa resistente a retroalimentación (SerAFBR) y/o piruvato carboxilasas resistentes a retroalimentación (PycFBR).

Del mismo modo, en la producción de triptófanos se emplean preferentemente cepas que contienen correspondientemente una fosfo-2-deshidro-3-deoxiheptonato aldolasa resistente a retroalimentación (AroGFBR o AroHFBR).

Respecto a otras propiedades preferentes de la cepa C. humireducens que sobreproduce L-aminoácidos a emplear según la invención se remite a la publicación de Wu et al. (2011) citada anteriormente, así como a las demás publicaciones citadas anteriormente.

Los microorganismos según la invención, en especial bacterias de la especie Corynebacterium, se pueden cultivar continuamente - como se describe, a modo de ejemplo, en el documento WO 05/021772 - o discontinuamente en procedimiento discontinuo (cultivo de carga, o bien procedimiento de carga) o en el procedimientos de carga de alimentación (procedimiento de alimentación) o de carga de alimentación repetida (procedimiento de alimentación repetitivo) para la producción de L-aminoácido. Se encuentra disponible un resumen de tipo general sobre métodos de cultivo conocidos en el manual de Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) o en el manual de Storhas (biorreactores y dispositivos periféricos (editorial Vieweg, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)).

El medio de cultivo, o bien el medio de fermentación a emplear debe satisfacer de modo apropiado los requisitos de las respectivas cepas. En el manual "Manual of Methods for General Bacteriology" de la American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981) están incluidas descripciones de medios de cultivo de diversos microorganismos. Los conceptos medio de cultivo y medio de fermentación, o bien medio, son sustituibles entre sí.

Como fuente de carbono se pueden emplear azúcares e hidratos de carbono, como por ejemplo glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melasa, disoluciones que contienen sacarosa de la producción de remolacha azucarera y caña de azúcar, almidón, hidrolizado de almidón y celulosa, aceites y grasas, como por ejemplo aceite de soja, aceite de girasol, aceite de cacahuete y grasa de coco, ácidos grasos, como por ejemplo ácido palmítico, ácido esteárico y ácido linolénico, alcoholes, como por ejemplo glicerina, metanol y etanol, y ácidos orgánicos, como por ejemplo ácido acético o ácido láctico.

Como fuente de nitrógeno se pueden emplear compuestos orgánicos nitrogenados, como peptonas, extracto de levadura, extracto de pescado, extracto de malta, agua de remojo de maíz, harina de habas de soja y urea, o compuestos inorgánicos, como sulfato amónico, cloruro amónico, fosfato amónico, carbonato amónico y nitrato amónico. Las fuentes de nitrógeno se pueden emplear por separado o como mezcla.

Como fuente de fósforo se pueden emplear ácido fosfórico, dihidrogenofosfato potásico o hidrogenofosfato dipotásico, o las correspondientes sales que contienen sodio.

El medio de cultivo debe contener además sales, a modo de ejemplo en forma de cloruros o sulfatos de metales, como por ejemplo sodio, potasio, magnesio, calcio y hierro, como por ejemplo sulfato amónico o sulfato de hierro, que son necesarios para el crecimiento. Finalmente se pueden emplear sustancias de crecimiento esenciales, como aminoácidos, a modo de ejemplo homoserina y vitaminas, a modo de ejemplo tiamina, biotina o ácido pantoténico, de manera adicional a las sustancias citadas anteriormente.

Las citadas substancias de empleo se pueden añadir al cultivo en forma de una única carga, o alimentar de modo apropiado durante el cultivo.

Para el control de pH del cultivo se emplean compuestos básicos, como hidróxido sódico, hidróxido potásico, amoniaco, o bien agua amoniacal, o compuestos ácidos, como ácido fosfórico o ácido sulfúrico, de modo apropiado. El pH se ajusta en general a un valor de 6,0 a 9,0, preferentemente 6,5 a 8. Para el control del espumado se pueden emplear agentes antiespumantes, como por ejemplo poliglicolésteres de ácidos grasos. Para el mantenimiento de la estabilidad de plásmidos se pueden añadir al medio substancias de acción selectiva apropiadas, como por ejemplo antibióticos. Para mantener condiciones aerobias se introducen oxígeno o mezclas gaseosas que contienen oxígeno, como por ejemplo aire, en el cultivo. El empleo de líquidos, que están enriquecidos con peróxido de hidrógeno, es igualmente posible. En caso dado, la fermentación se realiza en sobrepresión, a modo de ejemplo a una presión de 0,03 a 0,2 MPa. La temperatura del cultivo se sitúa normalmente en 20°C a 45°C, y preferentemente en 25°C a 40°C. En el procedimiento discontinuo, se prosigue el cultivo hasta que se ha formado un máximo del L-aminoácido deseado. Este objetivo se consigue normalmente en el intervalo de 10 horas hasta 160 horas. En el procedimiento continuo son posibles tiempos de cultivo más largo. Mediante la actividad de las bacterias se produce una concentración (acumulación) de L-aminoácido en el medio de fermentación y/o en las células bacterianas.

Se encuentran ejemplos de medios de fermentación apropiados, entre otros, en los documentos de patente 5,770,409, US 5,840,551 y US 5,990,350 o US 5,275,940.

El análisis de L-aminoácidos para la determinación de la concentración en uno o varios momentos en el transcurso de la fermentación se puede efectuar también mediante separación de L-aminoácidos por medio de cromatografía de intercambio iónico, preferentemente cromatografía de intercambio catiónico con subsiguiente derivatización en columna adicional bajo empleo de ninhidrina, como se describe en Spackman et al. (Analytical Chemistry 30: 1190­ 1206 (1958)). En lugar de ninhidrina, también se puede emplear orto-ftadialdehído para la derivatización en columna adicional. Se encuentra un artículo recopilatorio sobre cromatografía de intercambio iónico en Pickering (LCGC (Magazine of Chromatographic Science) 7(6), 484-487 (1989)).

Es igualmente posible efectuar una derivatización en columna previa, a modo de ejemplo bajo empleo de ortoftadialdehído o isocianato de fenilo, y separar los derivados de aminoácido producidos mediante cromatografía en fase inversa (RP), preferentemente en forma de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Tal método se describe, a modo de ejemplo, en Lindroth et al. (Analytical Chemistry 51: 1167-1174 (1979)).

La detección se efectúa mediante fotometría (absorción, fluorescencia).

Se encuentra una descripción general del análisis de aminoácidos, entre otros, en el manual "Bioanalytik" de Lottspeich y Zorbas (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Alemania 1998).

También es un aspecto especial de la divulgación un procedimiento para la producción de un L-aminoácido, caracterizado por que se llevan a cabo los siguientes pasos:

a) fermentación de microorganismos según la invención, en especial bacterias corineformes, preferentemente de la especie Corynebacterium, de modo especialmente preferente de tipo Corynebacterium glutamicum o Corynebacterium humireducens, en un medio nutriente apropiado, y

b) acumulación de L-aminoácido en el medio nutriente y/o en las células de las citadas bacterias.

A continuación se efectúa la puesta a disposición, o bien la producción u obtención de un producto que contiene L-aminoácido en forma líquida o sólida.

Mediante las medidas de fermentación se obtiene un caldo de fermentación que contiene el L-aminoácido en cuestión.

Se entiende por un caldo de fermentación un medio de fermentación, o bien medio nutriente, en el que se cultivó un microorganismo durante un cierto tiempo y a una cierta temperatura. El medio de fermentación, o bien los medios empleados durante la fermentación, contiene/contienen todas las sustancias, o bien componentes que aseguran una propagación del microorganismo y una formación del L-aminoácido deseado.

Una vez concluida la fermentación, el caldo de fermentación producido contiene correspondientemente

a) la biomasa (masa celular) de microorganismo producida debido a la propagación de las células de microorganismo,

b) el L-aminoácido formado en el transcurso de la fermentación,

c) los productos secundarios orgánicos formados en el transcurso de la fermentación, y

d) los componentes del medio de fermentación empleado, o bien de las sustancias de empleo, no consumidos por medio de la fermentación, como por ejemplo vitaminas, como biotina, o sales, como sulfato de magnesio. A los productos secundarios orgánicos pertenecen sustancias que se generan, y en caso dado se excretan por los microorganismos empleados en la fermentación, además del L-aminoácido deseado. A estos pertenecen también azúcares, como por ejemplo trehalosa.

El caldo de fermentación se extrae del recipiente de cultivo, o bien del depósito de fermentación, en caso dado se recoge y se emplea para poner a disposición un producto que contiene L-aminoácido en forma líquida o sólida. A tal efecto se emplea también la expresión "obtención del producto que contiene L-aminoácido". En el más sencillo de los casos, el caldo de fermentación que contiene L-aminoácido en sí mismo constituye el producto obtenido.

Mediante una o varias de las medidas seleccionadas a partir del grupo

a) eliminación parcial (> 0 % a < 80 %) a completa (100 %) o casi completa (> 80 %, > 90 %, > 95 %, > 96 %, > 97 %, > 98 %, > 99 %) de agua,

b) eliminación parcial (> 0 % a < 80 %) a completa (100 %) o casi completa (> 80 %, > 90 %, > 95 %, > 96 %, > 97 %, > 98 %, > 99 %) de la biomasa, desactivándose la misma, en caso dado, antes de la eliminación, c) eliminación parcial (> 0 % a < 80 %) a completa (100 %) o casi completa (> 80 %, > 90 %, > 95 %, > 96 %, > 97 %, > 98 %, > 99 %, > 99,3 %, > 99,7 %) de productos secundarios orgánicos formados en el transcurso de la fermentación, y

d) eliminación parcial (> 0 %) a completa (100 %) o casi completa (> 80 %, > 90 %, > 95 %, > 96 %, > 97 %, > 98 %, > 99 %, > 99,3 %, > 99,7 %) de componentes del medio de fermentación empleado, o bien de las sustancias de empleo, no consumidos mediante la fermentación,

a partir del caldo de fermentación se obtiene una concentración, o bien purificación de L-aminoácido. De este modo se aíslan productos que presentan un contenido deseado en L-aminoácido.

La eliminación parcial (> 0 % a < 80 %) a completa (100 %) o casi completa (> 80 % a < 100 %) de agua (medida a)) se denomina también secado.

Mediante eliminación completa o casi completa de agua, de biomasa, de productos secundarios orgánicos y de componentes no consumidos del medio de fermentación empleado se llega a formas de producto puras ((> 80 % en peso, > 90 % en peso) o altamente puras (> 95 % en peso, > 97 % en peso, > 99% % en peso) de L-aminoácido. Para las medidas según a), b), c) o d), en el estado de la técnica se encuentran disponibles un gran número de instrucciones técnicas.

Ejemplos de realización

Ejemplo 1: ensayo de rendimiento de L-alanina y L-valina

Para el ensayo de rendimiento de L-alanina/L-valina se cultivó la cepa del tipo de C. humireducens (DSM 45392) en la carga del matraz de agitación. A tal efecto se incubó la cepa C. humireducens en 10 ml de medio líquido BHI (infusión cerebro-corazón; Merck) (37 g/l de H²O) como cultivo previo a 37°C con 200 rpm durante 24 horas. A continuación se inocularon 10 ml de medio del matraz de agitación a una OD⁶⁶⁰ de 0,2, y se cultivó a 37°C con 200 rpm durante 48 horas. Para la producción de este medio se disolvieron 20 g de sulfato amónico, 0,4 g de MgSO⁴*7H²O, 0,6 g KH² PO⁴ y 10 g de extracto de levadura en 750 ml de H²O. El valor de pH de la disolución se ajustó a 7,8 con un 20 % de NH⁴OH, y a continuación se trató la disolución en autoclave. A continuación se añadieron 4 ml de una disolución de vitaminas (pH 7 con NH⁴OH), constituida por 0,25 g/l de tiamina, 50 mg/l de cianocobalamina, 25 mg/l de biotina y 1,25 g/l de piridoxina. Por lo demás se añadieron 140 ml de una disolución de glucosa al 50 % filtrada en medio estéril y 50 g de CaCO³ tratado en autoclave en seco, y a continuación se completó el medio a un litro.

Tras el cultivo, del sobrenadante de cuatro cultivos paralelos se llevó a cabo respectivamente un análisis por HPLC para la determinación del contenido en alanina, glicina y valina con un límite de identificación de >0,01 g/l.

Después de 48 horas de cultivo en medio de matraz de agitación a 37°C, 200 rpm, la cepa del tipo de C. humireducens produce en la medida del matraz de agitación alrededor de 0,81 g/l de alanina (rendimiento neto: 0,011 g^alanina/g^glucosa) y 1,6 g/l de valina (rendimiento neto: 0,022 g^valina/g^glucosa) (Tab. 1).

Tab. 1: valores analíticos de un ensayo en matraz de agitación con la cepa tipo de C. humireducens. Se indican los valores medidos tras el cultivo con células y los del medio vacío.

Ejemplo 2: ensayo de rendimiento de glutamato

Para el ensayo de rendimiento de L-glutamato se cultivó la cepa del tipo de C. humireducens (DSM 45392) en la carga del matraz de agitación. A tal efecto se incubó la cepa C. humireducens en 10 ml de medio líquido BHI (infusión cerebro-corazón; Merck) (37 g/l H²O) como cultivo previo a 37°C con 200 rpm durante 24 horas. A continuación se inocularon 10 ml de medio del matraz de agitación a una OD⁶⁶⁰ de 0,2, y se cultivaron a 37°C con 200 rpm, durante 48 horas. Para la producción de este medio se disolvieron 20 g de sulfato amónico, 0,4 g de MgSO⁴*7H²O, 0,6 g de KH² PO⁴ y 10 g de extractp de levadura en 750 ml de H²O. El valor de pH de la disolución se ajustó a 7,8 con un 20 % de NH⁴OH, y a continuación se trató la disolución en autoclave. A continuación se añadieron 4 ml de una disolución de vitaminas (pH 7 con NH⁴OH), constituida por 0,25 g/l de tiamina, 50 mg/l de cianocobalamina, 25 mg/l de biotina y 1,25 g/l de piridoxina. Por lo demás se añadieron 140 ml de una disolución de glucosa al 50 % filtrada en medio estéril y 50 g de CaCO³ tratado en autoclave en seco. A continuación se añadieron otros 5 ml de una disolución madre de treonina 400 mM filtrada en medio estéril, y a continuación se completó el medio a un litro.

Tras el cultivo, se llevó a cabo un análisis por HPLC del sobrenadante de cuatro cultivos paralelos respectivamente para la determinación del contenido en glutamato con un límite de identificación de > 0,01 g/l.

Después de 48 horas de cultivo en medio de matraz de agitación a 37°C, 200 rpm en la medida del matraz de agitación, la cepa del tipo de C. humireducens produjo 1,8 (+/-0,6) g/l de L-glutamato. La concentración inicial de L-glutamato en el medio se situaba en 0,78 (+/-0,1) g/l.

Ejemplo 4: análisis de AEC

Se cultivaron diez clones individuales de la cepa de tipo salvaje C. humireducens (DSM 45392) respectivamente en 10 ml de medio de cultivo BHI (infusión cerebro-corazón; Merck) (37 g/l de H²O) en matraces de agitación durante la noche a 37°C con 200 rpm. A continuación se sembraron respectivamente 100 pl de cultivo nocturno en placas de agar de medio mínimo con S-2-aminoetil-L-cisteína 25 mM (AEC) (MW = 164 g/mol) y se incubaron durante tres días a 37°C. Para la producción del medio mínimo se disolvieron 5 g de (NH⁴)²SO⁴ , 5 g de urea, 2 g de KH² PO⁴ , 2 g de K²HPO⁴ , 10 g de MOPS en 750 ml de H²O, se ajustó el valor de pH a 7,6 con KOH 1 M, y se trató en autoclave. Los componentes restantes se elaboraron por separado y se filtraron en medio estéril. En este caso se añadieron al medio 20 ml de glucosa al 50 % (w/v), 1 ml de CaCl² al 1 % (w/v), 1 ml de MgSO⁴ 1 M, 1 ml de biotina al 0,02 % y 1 ml de disolución de oligoelementos (1 g de FeSÜ⁴ x 7 H²O, 1 g de MnSÜ⁴7 x H²O, 0,1 g de ZnSÜ⁴ x 7 H²O, 0,021 g de CuSO⁴ x 5 H²O, 0,002 g de NiCl² x 6 H²O en 100 ml de H²O), y a continuación se completaron a 1000 ml con H²O estéril. Para el cultivo en placas de medio sólido se añadieron al medio 15 g/l de agar-agar (Merck). Las colonias individuales visibles se sembraron de nuevo en placas de agar de medio mínimo frescas con AEC 25 mM y treonina 12,5 mM como exudado fraccionado y se incubaron tres días a 37°C. Después se inocularon respectivamente 10 ml de medio líquido BHI (infusión cerebro-corazón: Merck) (37 g/l de H²O) en el matraz de agitación con un clon individual, y se incubaron bajo agitación durante la noche a 37°C con 200 rpm, a continuación se mezclaron con 10 % de glicerina y se almacenaron a -80°C como muestra de elementos de ensayo.

Análisis secuencial de la zona de secuencia lysC

Para el análisis de las zonas de secuencia lysC de los clones individuales aislados se amplificó la correspondiente zona génica de lysC por medio de cebadores (lysC_for: 5'AGACGAAAGGCGGCCTACAC3' y lysC_rev: 5TCCAGGATCGAGCGCATCAC3') y técnica PCR. Las secuencias de ADN obtenidas se analizaron con ayuda del software Clone Manager. Mediante el análisis de la secuencia lysC de los clones de C. humireducens aislados resistentes a AEC treonina se identificaron las siguientes mutaciones puntuales:

Tab. 2: modificaciones identificadas en el gen lysC de clones de C. humireducens resistentes a AEC treonina e intercambios de aminoácidos provocados de este modo.

Ejemplo 5: ensayo de rendimiento de L-lisina

Se cultivaron la cepa de tipo C. humireducens y los clones individuales aislados del análisis de ACE treonina en matraces de agitación, y se sometieron a un ensayo de rendimiento respecto a su síntesis de lisina en la medida del matraz de agitación. A tal efecto se incubó la cepa C. humireducens y los clones de C. humireducens aislados, resistentes a AEC treonina, en 10 ml de medio líquido BHI (infusión cerebro-corazón; Merck) (37 g/1H²O) como cultivo previo a 37°C con 200 rpm durante 24 horas. A continuación se inocularon 10 ml de medio del matraz de agitación a una OD⁶⁶⁰ de 0,2, y se cultivaron a 37°C con 200 rpm, durante 48 horas. Para la producción de este medio se disolvieron 7,5 g de licor fuerte de maíz (50 %), 20 g de ácido morfolinopropanosulfónico (MOPS), 25 g de (NH⁴)²SO⁴ , 0,1 g de KH² PO⁴ , 1 g de MgSO⁴*7H²O, 0,01 g de CaCl²*2 H²O, 0,01 g de FeSO⁴*7H²O, 0,005 g de MnSO⁴*H²O en 750 ml de H²O, se ajustó el valor de pH a 7,0 con agua amoniacal, y se trató en autoclave. A continuación se añadieron 25 g de CaCO³ anhidro tratado en autoclave. Los componentes restantes se elaboraron por separado y se filtraron en medio estéril. En este caso se añadieron al medio 90 ml de glucosa al 50 % (w/v) y 10 ml de una disolución de 30 mg/l de tiamina y 20 mg/l de biotina, y a continuación se completaron a 1000 ml con H²O estéril.

Tras el cultivo se realizó un análisis por HPLC para la determinación de contenidos en L-lisina con un límite de identificación de > 0,01 g/l del residuo de dos cultivos paralelos respectivamente. El título final de lisina y los rendimientos de los cultivos se representan en la siguiente tabla.

Tab. 3: valores medios y desviación estándar de títulos finales de lisina de dos cultivos paralelos con clones de C. humireducens resistentes a AEC treonina tras 48 horas de cultivo en medio de matraz de agitación a 37°C, 200 rpm.

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. - Procedimiento para la sobreproducción de un L-aminoácido, caracterizado por que en este procedimiento se emplea Corynebacterium humireducens.

2. - Alanina deshidrogenasa, caracterizada por que presenta una identidad secuencial de al menos 85 % respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 72.

3. - Polinucleótido, que codifica para una alanina deshidrogenasa seleccionada a partir del grupo constituido por:

a) polinucleótidos que codifican para una alanina deshidrogenasa según la reivindicación 2;

b) polinucleótidos que presentan una identidad secuencial de al menos 90 % respecto a la secuencia de posición 301 a 1365 según SEQ ID NO: 71;

c) polinucleótidos que son complementarios a polinucleótidos según (a) o (b).

4. - Enzimas del clúster hut, seleccionadas a partir de

a) una urocanato hidratasa (hutU), caracterizada por que presenta una identidad secuencial de al menos 85 % respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 190;

b) una imidazolona propionasa (hutl), caracterizada por que presenta una identidad secuencial de al menos 85 % respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 192;

c) una histidina amonialiasa (hutH), caracterizada por que presenta una identidad secuencial de al menos 85 % respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 194; y

d) una formididoil glutamasa, caracterizada por que presenta una identidad secuencial de al menos 85 % respecto a la secuencia según SEQ ID NO: 196.

5. - Polinucleótidos, que codifican para enzimas del clúster hut, seleccionados a partir de

a) polinucleótido, que codifica para una uroconato hidratasa (hutU) según la reivindicación 4(a) y presenta preferentemente una identidad secuencial de al menos 70 % respecto a la secuencia de posición 301 a 1983 según SEQ ID NO: 189;

b) polinucleótido, que codifica para una imidazolona propionasa (hutl) según la reivindicación 4(b) y presenta preferentemente una identidad secuencial de al menos 70 % respecto a la secuencia de posición 301 a 1509 según SEQ ID NO: 191;

c) polinucleótido, que codifica para una histidina amonialiasa (hutH) según la reivindicación 4(c) y presenta preferentemente una identidad secuencial de al menos 70 % respecto a la secuencia de posición 301 a 1851 según SEQ ID NO: 193; y

d) polinucleótido, que codifica para una formididoil glutamasa (hutG) según la reivindicación 4(d) y presenta preferentemente una identidad secuencial de al menos 70 % respecto a la secuencia de posición 301 a 1209 según SEQ ID NO: 195;

e) polinucleótidos, que son complementarios a los polinucleótidos según (a) a (d).

6. - Microorganismo recombinante, caracterizado por que contiene al menos una alanina deshidrogenasa según la reivindicación 2 y/o al menos un polinucleótido según la reivindicación 3.

7. - Microorganismo recombinante según la reivindicación 6, caracterizado por que, en este microorganismo, la alanina deshidrogenasa según la reivindicación 2 y/o el polinucleótido según la reivindicación 3 se presentan en forma sobreexprimida.

8. - Microorganismo recombinante, caracterizado por que contiene al menos una enzima, preferentemente todas las enzimas del clúster hut según la reivindicación 4 y/o al menos un polinucleótido, preferentemente todos los polinucleótidos que codifican para enzimas del clúster hut según la reivindicación 5.

9. - Microorganismo recombinante según la reivindicación 8, caracterizado por que al menos una enzima, preferentemente todas las enzimas del clúster hut según la reivindicación 4 y/o al menos un polinucleótido, preferentemente todos los polinucleótidos que codifican para enzimas del clúster hut según la reivindicación 5 se presentan en forma sobreexprimida.

10. - Microorganismo recombinante según una de las reivindicaciones 6 a 9, caracterizado por que, en el caso del microorganismo, se trata de una corinebacteria, preferentemente de tipo C. humireducens o C. glutamicum.

1 1 Procedimiento para la sobreproducción de un L-aminoácido en un microorganismo, caracterizado por que en este procedimiento se emplea un polipéptido según la reivindicación 2 o 4 y/o un polinucleótido según la reivindicación 3 o 5 y/o un microorganismo recombinante según una de las reivindicaciones 6 a 10.

12. - Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado por que el L-aminoácido sobreproducido se selecciona a partir de L-alanina, L-valina, ácido L-glutámico, L-glutamina, L-prolina, L-arginina, ácido L-aspártico, L-asparagina, L-metionina, L-lisina, L-isoleucina y L-treonina.

13. - Procedimiento según la reivindicación 12, caracterizado por que el L-aminoácido sobreproducido se selecciona a partir de L-alanina, L-valina, ácido L-glutámico y L-lisina.