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ES2616749T3 - Mutantes degradantes del proteoglucano para el tratamiento del SNC - Google Patents

Mutantes degradantes del proteoglucano para el tratamiento del SNC Download PDF

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ES2616749T3
ES2616749T3 ES04776039.2T ES04776039T ES2616749T3 ES 2616749 T3 ES2616749 T3 ES 2616749T3 ES 04776039 T ES04776039 T ES 04776039T ES 2616749 T3 ES2616749 T3 ES 2616749T3
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ES
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seq
polypeptide
mutant
chondroitinase
polypeptides
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ES04776039.2T
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Elliott A. Gruskin
Anthony O. Caggiano
Gargi Roy
Rohini D'souza
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Original Assignee
Acorda Therapeutics Inc
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Abstract

Un polipéptido mutante de condroitinasa ABC de tipo I purificado que degrada un proteoglucano, seleccionándose dicho polipéptido entre la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 3 o la SEQ ID NO: 4, en donde el polipéptido retiene su actividad degradante de proteoglucanos.

Description

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Las moléculas degradantes de proteoglucano similares a condroitinasa AC (SEQ ID NO: 5), así como los mutantes de eliminación y/o sustitución de los polipéptidos degradantes de proteoglucano pueden clonarse en una serie de vectores de expresión bacterianos así como de mamífero. Los ejemplos no limitantes de estos vectores incluyen pET15b, pET14b, pGEX 6P1, pDNA4HisMax o pSECTag2b. Los polipéptidos mutantes de eliminación de la presente invención muestran la capacidad para degradar los proteoglucanos, tales como condroitina CS y DS, y tienen un tamaño y un peso molecular menor que los polipéptidos de enzima madura, lo que se espera que facilite su difusión en células, tejidos y a través de membranas. Los vectores de expresión pueden incluir la secuencia de ácido nucleico que expresa un polipéptido degradante de proteoglucano unido operablemente a una secuencia de control de la expresión. Unido operablemente puede referirse a un engarce entre una secuencia de control de la expresión y una secuencia codificante, donde el engarce permite que la secuencia de control de la expresión controle la expresión de la secuencia codificante.
Las propiedades de los mutantes de origen natural, sustituidos o de eliminación de las moléculas degradantes de proteoglucano pueden alterarse introduciendo una diversidad de mutaciones en la proteína. Dichas alteraciones se introducen de manera adecuada usando las técnicas de mutagénesis, por ejemplo, pero sin limitación, mutagénesis por PCR y las moléculas de polipéptidos mutados se sintetizan de manera adecuada usando los vectores de expresión.
Preferentemente, las eliminaciones incluyen cualesquiera dos aminoácidos separados y eliminaciones internas de aminoácidos en el polipéptido. La eliminación da como resultado polipéptidos mutantes degradantes de proteoglucano que son más pequeños que la enzima madura y conservan la capacidad degradante de proteoglucano. Pueden fusionarse o unirse los polipéptidos degradantes de proteoglucano a otro polipéptido. Polipéptido se usa para abarcar de manera unívoca secuencias de aminoácidos para mutantes de cualquier longitud que tienen actividad degradante de proteoglucano y mejorar la plasticidad, incluyendo aquellas menos la secuencia de señal que forma parte inicialmente del polipéptido cuando se traduce y que se escinde mediante una modificación traduccional del hospedador.
Los ácidos nucleicos mutantes incluyen eliminaciones y/o sustituciones de nucleótidos de genes que expresan los polipéptidos degradantes de proteoglucano maduros. A nivel de ADN, se usan mutaciones de eliminación y sustitución para introducir sustituciones y/o eliminaciones de aminoácidos en la proteína codificada. Estas eliminaciones y sustituciones de nucleótidos pueden usarse para introducir eliminaciones y/o sustituciones en regiones conformacionales o activas importantes del polipéptido. Un fragmento de ácido nucleico es un ácido nucleico que tiene menos nucleótidos que la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos completa de un polipéptido degradante de proteoglucano, aunque preferentemente codifica un polipéptido mutante que retiene cierta actividad biológica de la proteína de longitud completa, por ejemplo, el fragmento de polipéptido expresado conserva la capacidad para inducir degradación de proteoglucanos, promover la difusión de agentes terapéuticos en células y tejido o promover la regeneración de neuritas. También pueden usarse genes que codifican mutantes N o C-terminales de dominios de polipéptido degradante de proteoglucano unidos a otros polipéptidos en construcciones para la expresión de proteínas de fusión unidas a polipéptidos degradantes de proteoglucano mutantes.
Los polipéptidos degradantes de proteoglucano mutantes de eliminación de la presente invención también pueden incluir derivados de estos polipéptidos que se han modificado química o enzimáticamente, pero que conservan su actividad biológica para degradar proteoglucanos. Puede controlarse la actividad degradante de proteoglucano de estos mutantes dependiendo de la eliminación o sustitución efectuada en el polipéptido o el ácido nucleico usado para expresar el polipéptido. Las variantes, fragmentos o análogos de los polipéptidos degradantes de proteoglucano maduro o los ácidos nucleicos y vectores usados para expresarlos incluyen polipéptidos mutantes y ácidos nucleicos que tienen una secuencia que difiere del polipéptido maduro o la secuencia de ácido nucleico en una o más eliminaciones, de tal forma que los polipéptidos degradantes de proteoglucano conservan su actividad biológica y pueden degradar proteoglucanos y preferentemente, degradan proteoglucanos de sulfato de condroitina.
Debido a la degeneración del código genético, un experto habitual en la materia reconocerá que un gran número de moléculas de ácido nucleico que tienen una secuencia al menos un 80%, preferentemente un 85% o 90%, aún más preferentemente un 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a una secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula degradante de proteoglucano mutante codificará un polipéptido mutante que tenga actividad degradante de proteoglucano y preferentemente actividad degradante de condroitina. Se reconocerá además que, para dichas moléculas de ácido nucleico que no son variantes degeneradas, un número razonable también codificará un polipéptido mutante que tenga actividad degradante de proteoglucano. Esto se debe a sustituciones de aminoácidos que o bien tienen menos probabilidad o no tienen probabilidad de afectar a la actividad del polipéptido (por ejemplo, reemplazando un aminoácido alifático con un segundo aminoácido alifático) para degradar proteoglucanos y preferentemente para degradar condroitina.
Las variantes incluidas en la invención pueden contener eliminaciones individuales en las secuencias de ácido nucleico o de polipéptido. Dichos cambios eliminarán un solo aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos en la secuencia codificada.
El descubrimiento acerca de que la actividad degradante de proteoglucano de los polipéptidos mutantes de
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eliminación de la presente invención puede controlarse para que sea menor, aproximadamente la misma o mayor que la de la molécula degradante de proteoglucano de longitud completa tiene otra ventaja potencial. Puede administrarse una composición farmacéutica que contiene las moléculas degradantes de proteoglucano por vía parenteral, intravenosa o subcutánea. El uso de un hidrogel compuesto de polímero biodegradable que encierra el polipéptido y que libera el polipéptido de manera continua está limitado por la cantidad de polipéptido que puede atraparse en el hidrogel. El uso de un mutante de eliminación del polipéptido con mayor actividad específica implica que, en base molar, puede atraparse más cantidad de la sustancia activa en el mismo volumen, aumentando de este modo el tiempo entre administraciones sucesivas o posiblemente evitando administraciones repetidas.
La purificación del polipéptido obtenido después de la expresión depende de la célula hospedadora y la construcción de expresión usada. En general, la purificación de los mutantes de eliminación o sustitución de proteoglucano puede efectuarse del mismo modo que la purificación de polipéptidos de longitud completa nativos, incluyendo el uso de etiquetas de histidina.
Los polipéptidos y proteínas degradantes de proteoglucano mutantes se administran en una cantidad eficaz para degradar los CSPG. Los polipéptidos pueden usarse para ayudar en la difusión de composiciones terapéuticas y diagnósticas a tejidos y pueden usarse para promover la recuperación de la función neurológica y el crecimiento de neuritas. Una vez que se han purificado las proteínas o polipéptidos degradantes de proteoglucano hasta un grado deseado, pueden suspenderse o diluirse en un vehículo fisiológico o excipiente adecuado para el tratamiento del SCI
o para ensayos de exploración de composiciones que promueven el crecimiento de neuritas in vitro en sustratos adecuados, tales como agrecano. En modelos de SCI, las dosis intratecales de las condroitinasas en ratas ha sido de aproximadamente 0,06 unidades en días alternos durante 14 días. Una dosis para un humano de 70 kilogramos puede ser de aproximadamente 17 unidades. Aproximadamente a 100 unidades/miligramo, esto podría ser aproximadamente igual a 170 microgramos. Las dosis de hasta 20 unidades parecen seguras en sujetos mamíferos, tales como ratas. Las composiciones pueden incluir un polipéptido degradante de proteoglucano del primer aspecto de la presente invención. Estas composiciones también pueden incluir otras moléculas degradantes de proteoglucano y mutantes de eliminación y/o sustitución de estas, moléculas que bloquean la acción de inhibidores del crecimiento de neuritas, moléculas que promueven la adhesión de neuritas o axones, diagnósticas, terapéuticas
o el mutante de molécula degradante de proteoglucano como parte de una proteína de fusión. Puede añadirse la mezcla de proteína de fusión a un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable, generalmente a concentraciones en el intervalo de 1 ug a 500 mg/kg de sujeto. La administración del agente puede ser por inyección de bolo, suministro intravenoso, infusión continua, liberación sostenida a partir de implantes o agentes farmacéuticos de liberación sostenida. La administración por inyección puede ser intramuscular, peritoneal, subcutánea, intravenosa o intratecal. La administración oral puede incluir comprimidos o cápsulas, preferentemente, la dosificación oral es una formulación de liberación sostenida para administración una o dos veces al día. La administración percutánea puede ser una vez al día y preferentemente, es una administración de menos de una vez al día. Puede continuarse la administración al paciente humano o a otro sujeto mamífero hasta que se logra una mejora medible en la función autónoma o motora en el paciente.
Los polipéptidos degradantes de proteoglucano mutantes o los polipéptidos de fusión que los incluyen también pueden expresarse o secretarse por células genéticamente modificadas. Pueden recogerse y purificarse los polipéptidos degradantes de proteoglucano de eliminación o los polipéptidos de fusión para una composición terapéutica, o pueden implantarse las células genéticamente modificadas, ya estén solas o en una cápsula en o próxima al sitio del daño en el SNC o un tejido en el que se desea la difusión controlada de moléculas terapéuticas o diagnósticas. Los ácidos nucleicos mutantes para expresar polipéptidos degradantes de proteoglucanos mutantes se ilustran por los ejemplos no limitantes de condroitinasa ABC I (SEQ ID NO: 22 y 28) que codifican polipéptidos de condroitinasa ABC I sustituidos y aquellos con secuencias de aminoácidos sin líder; ácido nucleico mutante de condroitinasa B (SEQ ID NO: 21) que codifica el polipéptido mutante NΔ120 CΔ120 de condroitinasa B (SEQ ID NO: 21); y ácido nucleico mutante de condroitinasa AC (SEQ ID NO: 19) que codifica un polipéptido mutante NΔ50 CΔ275 de condroitinasa AC (SEQ ID NO: 11). Un ejemplo no limitante de un ácido de nucleico de fusión incluye una construcción de ADN de fusión de TAT-mutante de eliminación de condroitinasa ABC I (SEQ ID NO: 41). Otro ejemplo podría ser un ácido nucleico para TAT-condroitinasa ABC I-NΔ60 (SEQ ID NO: 43) para el polipéptido expresado (SEQ ID NO: 44).
Una vez se administran los polipéptidos degradantes de proteoglucano mutantes a células o a un tejido con CSPG, la degradación de los CSPG elimina las moléculas inhibidoras que bloquean el crecimiento de neuritas y permite la regeneración de neuritas en el área afectada. La eliminación de CSPG también promueve la plasticidad en el SNC. Por ejemplo, los polipéptidos de longitud completa de condroitinasa AC (SEQ ID NO: 5), y condroitinasa B, (SEQ IDNO: 12), degradan a CS y DS, respectivamente, dando como resultado disacáridos sulfatados no saturados. La condroitinasa AC, (SEQ ID NO: 5), escinde a CS en los engarces 1, 4 glucosídico entre la N-acetilgalactosamina y el ácido glucurónico en la cadena principal de polisacárido del CS. La escisión se produce mediante eliminación beta con un patrón de acción endolítico aleatorio. La condroitinasa AC, (SEQ ID NO: 12) escinde el engarce de ácido idurónico de 1, 4 galactosamina en la cadena principal de polisacárido de DS. La escisión tanto de CS como de DS se produce mediante un proceso de beta-eliminación que diferencia estos mecanismos enzimáticos de las enzimas degradantes de GAG de mamífero. La condroitinasa ABC I, (SEQ ID NO: 1), la condroitinasa ABC II (SEQ ID NO: 27), también son exo y endo liasas que escinden tanto a CS como a DS. La retirada de CS y DS de una cicatriz glial permite la regeneración de los crecimientos de neuritas en el área dañada y promueve la plasticidad. Por ejemplo,
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regeneración de neuritas u otros agentes terapéuticos en el área afectada. La regeneración y la plasticidad de las células nerviosas en el área del SNC afectada puede permitir la recuperación de la función motora y sensorial. Las mejoras clínicamente relevantes variaran entre una mejora detectable hasta una restauración completa de una función nerviosa deteriorada o perdida, variando según los pacientes y los daños individuales.
Ejemplo 3
Este ejemplo muestra que los mutantes de eliminación de condroitinasa son biológicamente activos.
Las condroitinasas AC y B producidas de manera recombinante han mostrado eficacia in vitro al superar la barrera de una frontera de sustrato inhibidor, tal como agrecano y dan como resultado una extensión de neuritas para neuronas corticales de rata. Para facilitar un transporte eficaz de las enzimas anteriores al sitio del daño, se prepararon mutantes de eliminación de estas condroitinasas para determinar los polipéptidos de tamaño mínimo capaces de degradar los CSPG. Se ha explorado la actividad de escisión de estos mutantes in vitro mediante un ensayo zimográfico usando agrecano como sustrato. Se observó que un polipéptido truncado de condroitinasa AC (nΔ50-cΔ275) (SEQ ID NO:11) que carece de los aminoácidos 50 y 275 desde los extremos amino y carboxilo termina, respectivamente, que tiene un peso molecular de 38 kDa en comparación con los 75 kDa de la proteína de longitud completa, tenía aproximadamente el tamaño mínimo de condroitinasa AC mutante que conserva actividad, según se evaluó mediante el ensayo zimográfico, FIG. 4(B). Sin embargo, también se ha demostrado que un mutante aún más pequeño, el mutante de eliminación de condroitinasa B (nΔ 120-cΔ 120) (SEQ ID NO:17) que carece de 120 aminoácidos desde cada uno de los extremos amino y carboxilo terminal, que tiene un peso molecular de 26 kDa en comparación con los 52 kDa de la proteína de longitud completa, conserva la actividad en el ensayo zimográfico, FIG. 6(B). Podrían usarse estos y otros mutantes de eliminación aún más pequeños como agentes terapéuticos potenciales con menor inmunogenicidad y una capacidad de penetración en tejidos similar o mayor en comparación con la enzima madura y pueden usarse para el tratamiento del daño en la médula espinal.
Se generaron una serie de mutantes de eliminación de condroitinasa AC y B mediante PCR usando los ADNc de longitud completa para las condroitinasas AC y B como moldes y se clonaron en el vector de expresión pET15b en los sitios de Ndel y BamHI. Se construyeron mutantes de eliminación con etiquetas de histidina para facilitar la detección y purificación. Cada uno de estos ADNc se indujo mediante isopropil-β-D-tiogalactopiranósido (IPTG) y se confirmó la expresión mediante transferencia de Western usando anticuerpo anti-His (Novagen). La FIG. 3(A) muestra de manera esquemática varios mutantes de eliminación no limitantes, y la FIG. 3(B) muestra la confirmación de la expresión de estos polipéptidos mutantes de condroitinasa AC mediante transferencia de Western con antietiqueta de histidina. Las figuras 5 y 6 muestran la misma información para las eliminaciones de condroitinasa B. Las transferencias de Western demuestran proteínas del tamaño predicho. La PAGE zimográfica de los mutantes de eliminación muestra bandas intensas de digestión de sustrato (claro) y tinción de carbohidratos negativa.
Ensayo zimográfico. Se vertieron geles de SDS-poliacrilamida con agrecano (85 μg/ml) polimerizado en los mismos. Se corrieron extractos en bruto de mutantes de eliminación de condroitinasas AC y B y se renaturalizaron a 37 °C durante una noche. Después de la separación, el gel se incuba en cetilpiridinio al 0,2% durante 90 minutos a temperatura ambiente. La digestión de los proteoglucanos por las condroitinasas se visualiza tiñendo el gel con azul de toluidina al 0,2% en etanol-H2O-ácido acético (50:49:1 v/v/v) durante 30 minutos y destiñendo con etanol-H2Oácido acético (50:49:1 v/v/v). Después de la destinción, se incuba el gel durante una noche en una solución de Stains-all a 50 µg/ml en etanol al 50% en la oscuridad y se destiñe con H2O. La aparición de bandas claras en el gel muestra la digestión por las condroitinasas del CSPG que dejan a la proteína central, que permanece sin teñir (FIG. 4 y FIG. 6).
Ejemplo 4
Este ejemplo describe la unión de una etiqueta de His a un polipéptido degradante de proteoglucano mutante.
Pueden generarse mutantes de eliminación de la enzima condroitinasa ABC I, donde el mutante carece de un número determinado de aminoácidos respecto del extremo N-terminal y mantiene actividad degradante de proteoglucano (SEQ ID NO: 2-4). Esta eliminación N-terminal mantiene una etiqueta de histidina, que está unida al extremo N-terminal; sin embargo la condroitinasa ABC I de longitud completa (SEQ ID NO:1) etiquetada de manera similar no mantuvo la etiqueta de histidina después de la expresión.
Pueden prepararse mutantes de eliminación catalíticamente activos de condroitinasa ABC I, por ejemplo, pero sin limitación, eliminando 20 y 60 aminoácidos, respectivamente, desde el extremo N-terminal de la proteína ABC I madura, tal como se muestra en la FIG. 7. También puede producirse un polipéptido mutante con eliminaciones tanto N como C-terminales, tal como condroitinasa ABC I-NΔ60-CΔ80 (SEQ ID NO:4).
Estos mutantes de eliminación de condroitinasa y mutantes de otras moléculas degradantes de proteoglucano pueden usarse para la construcción de proteína quimérica de fusión en N-terminal. El ensayo prueba estos polipéptidos de fusión respecto de la degradación de condroitina y puede usarse para determinar la eficacia de ABC I madura frente a varios mutantes de eliminación en composiciones y proteínas de fusión respecto de la especificidad de sustrato, la unión a sustrato y la penetración en tejidos. Puede llevarse este ensayo funcional para caracterizar la actividad del polipéptido de proteoglucano mutante o de polipéptidos de fusión que los incluyen. En
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este ensayo funcional, pueden emplacarse neuronas de los ganglios de la raíz dorsal (DRG) sobre agrecano o agrecano tratado con un polipéptido degradante de proteoglucano mutante o un polipéptido de fusión que incluye el mutante. Se espera que las neuronas emplacadas sobre agrecano no logren adherirse a la placa y extiendan los axones. Por el contrario, cabría expresar que las neuronas emplacadas en agrecano tratado con un polipéptido degradante de proteoglucano mutante o un polipéptido de fusión que incluye el mutante en una composición o como parte de un polipéptido de fusión se adhieran a la superficie y extiendan axones. Se cree que el crecimiento axonal extenso, que se observa para un sustrato de agrecano tratado con una condroitinasa, tal como condroitinasa ABC I (SEQ ID NO: 1 o 37) se debe a la digestión de los carbohidratos en la proteína central de agrecano, que crea un sustrato más permisivo para el crecimiento de axones.
Ejemplo 5
Este ejemplo predictivo describe un mutante de condroitinasa ABC I que tiene estructura de proteína nativa, pero que carece de actividad catalítica degradante de proteoglucano.
Este mutante puede prepararse en forma de un control nulo o negativo para bioensayos y estudios SCI. Basándose en la estructura cristalina de la condroitinasa ABC I, pueden prepararse un mutante de sitio específico, denominado H501a y Y508a (SEQ ID NO: 36) para eliminar la actividad catalítica en el sitio activo putativo. Pueden ensayarse dichos mutantes respecto de la inactivación de la actividad catalítica y SEC para comparar la enzima de tipo silvestre. También puede usarse el mutante de actividad nula para proporcionar un control negativo para las diversas proteínas de fusión degradantes de proteoglucano para su uso en bioensayos y en última instancia, en estudios en animales SCI.
Este ejemplo ilustra ejemplos de polipéptidos degradantes de proteoglucano mutantes que incluyen tanto sustituciones como eliminaciones en los polipéptidos; aquellos relacionados con la condroitinasa ABC I y las SEQ ID NO: 2, 3 y 4 conforman el primer aspecto de la presente invención.
La secuencia de condroitinasa ABC I (SEQ ID NO: 37) es una secuencia publicada para un péptido de condroitinasa ABC I maduro e incluye la secuencia líder. La secuencia de condroitinasa ABC I (SEQ ID NO: 37) es similar a (SEQ ID NO: 1 o 29), aunque la (SEQ ID NO: 1) no tiene los primeros 25 aminoácidos de la (SEQ ID NO: 37), y los aminoácidos en las posiciones 154 y 195 de la (SEQ ID NO: 37) difieren de aquellas (sustituciones) encontradas en posiciones similares cuando la (SEQ ID NO: 1) y la (SEQ ID NO: 37) se alinean.
La (SEQ ID NO: 38-40) ilustra eliminaciones desde el extremo N o C-terminal del polipéptido de la (SEQ ID NO: 37) y sustituciones en relación con la (SEQ ID NO: 1). Estos polipéptidos mutantes son NΔ20 (SEQ ID NO: 38), NΔ60 (SEQ ID NO: 39) y NΔ60 CΔ80 (SEQ ID NO: 40).
Ejemplo 7
Este ejemplo presenta ilustraciones no limitantes de polipéptidos mutantes, incluyendo aquellos de la presente invención fusionados con un polipéptido de transducción de membrana, tal como, pero sin limitación, la porción polipeptídica de la proteína TAT del VIH. En el listado de secuencias incluido en la memoria descriptiva se proporcionan listados de secuencias completos para los polipéptidos de fusión mutantes.
Una secuencia de nucleótidos para TAT-condroitinasa ABC I-nΔ20 (SEQ ID NO: 41), una porción de la cual se ilustra a continuación, muestra los nucleótidos de la secuencia de TAT resaltados mediante subrayado unidos a los nucleótidos de condroitinasa.
1 ggtc gtaaaaagcg tcgtcaacgt cgtcgtcctc ctcaatgcgc acaaaataac
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Los nucleótidos subrayados en esta porción de la secuencia del ácido nucleico indican una secuencia de TAT unida al 5' del ácido nucleico de condroitinasa ABC I-NΔ20 (SEQ ID NO. 47).
Una secuencia de aminoácidos para TAT-condroitinasa ABC I-nΔ20 (SEQ ID NO: 42), una porción de la cual se muestra a continuación, ilustra los aminoácidos de la secuencia de TAT resaltados mediante subrayado en el extremo N-terminal de la condroitinasa ABC I-NΔ20 (SEQ ID NO. 2).
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Una secuencia de nucleótidos para TAT-ABCI-NΔ60 (SEQ ID NO: 43), una porción de la cual se ilustra a continuación, muestra los nucleótidos N-terminales de TAT (SEQ ID NO. 49) resaltados mediante subrayado.
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