ES2604538T5 - Solución de inyección para ARN - Google Patents

Description

DESCRIPCIÓN

Solución de inyección para ARN

La invención se refiere a la utilización de ARNm y de un tampón de inyección acuoso, que contiene una sal de sodio, una sal de calcio, una sal de potasio y en caso dado lactato, para la preparación de un medicamento, proporcionándose una solución de inyección para aumentar la transferencia de ARNm a un organismo huésped y/o la traducción de ARNm en un organismo huésped.

Algunos procedimientos de medicina molecular, como la terapia genética y la vacunación genética, tienen un papel importante en la terapia y la prevención de numerosas enfermedades. La base de estos procedimientos es la introducción de ácidos nucleicos en células o tejidos del paciente, seguida del procesamiento de las informaciones codificadas por los ácidos nucleicos introducidos, es decir, la traducción a los polipéptidos o proteínas deseados. En este contexto, como ácidos nucleicos a introducir se consideran tanto ADN como ARN.

Las vacunas genéticas, que consisten en la inyección de ADN plásmido desnudo, se demostraron por primera vez en ratones a principios de la década de los 90. Sin embargo, en estudios en las fases clínicas I/II se comprobó que, en humanos, esta tecnología no podía satisfacer las expectativas creadas por los estudios en ratones1. Desde entonces se han desarrollado numerosas vacunas genéticas basadas en ADN y procedimientos para introducir ADN en células (entre otros, transfección de fosfato de calcio, transfección de polipreno, fusión de protoplastos, electroporación, microinyección, lipofección, utilización de ADN-virus como vehículo de ADN).

Hace 15 años, Wolff y col. demostraron que la inyección de información genética desnuda en forma de ADN plásmido (ADNp) o ARNm en ratones puede conducir a una expresión proteínica2 Estos resultados condujeron a investigaciones que demostraron que se puede utilizar ADNp desnudo para la vacunación3-5. Sin embargo, a la utilización de ARNm para la vacunación se le prestó poca atención hasta finales de la década de los 90, hasta que se demostró que la transferencia de ARNm en células dendríticas provoca respuestas inmunitarias6. No obstante, la inyección directa de ARNm desnudo para la vacunación siguió siendo un asunto marginal y sólo se trató en cuatro artículos de tres grupos de trabajo diferentes7-10. Uno de los motivos principales para ello era la inestabilidad del ARNm debido a su rápida destrucción por ribonucleasas y la consiguiente limitación de su eficacia como herramienta genética in vivo. Sin embargo, en el estado actual de la técnica se han descrito desde entonces numerosos procedimientos para estabilizar ARNm, por ejemplo en los documentos EP-A-1083232, WO 99/14346, US 5.580.859 y US 6.214.804.

El ARN como ácido nucleico para un vehículo genético tiene numerosas ventajas con respecto al ADN, entre otras:

i. El ARN introducido en la célula no se integra en el genoma (mientras que el ADN se puede integrar en cierta medida en el genoma y así puede insertar un gen intacto del genoma de la célula huésped, con lo que este gen puede mutar y conducir a una pérdida parcial o total de la información genética o a una información errónea).

ii. Para la transcripción eficaz de ARN no se requiere ninguna secuencia viral, como promotores, etc. (mientras que para la expresión de ADN introducido en la célula se requiere un promotor fuerte (por ejemplo el promotor de CMV viral), y la integración de este tipo de promotores en el genoma de la célula huésped puede conducir a modificaciones no deseables en la regulación de la expresión genética).

iii. La degradación del ARN introducido tiene lugar en un tiempo limitado (unas horas)11, 12, de modo que se puede lograr una expresión genética transitoria que se puede interrumpir después del tiempo de tratamiento necesario (mientras que esto no es posible en el caso del ADN integrado en el genoma).

iv. El ARN no conduce a una inducción de anticuerpos anti-ARN patógenos en el paciente (mientras que, como es sabido, la inducción de anticuerpos anti-ADN provoca una respuesta inmunitaria no deseada).

v. El ARN se puede utilizar de modo muy versátil: se puede preparar cualquier ARN para cualquier proteína de interés a corto plazo, incluso sobre la base individual de un paciente.

En resumen, hay que señalar que el ARNm constituye una copia transitoria de la información genética codificada en todos los organismos, sirve como muestra para la síntesis de proteínas y, a diferencia del ADN, cumple todas las condiciones necesarias para preparar un vector adecuado para la transferencia de información genética exógena in vivo.

Un procedimiento especialmente adecuado para la transferencia descrita de ácidos nucleicos a un organismo huésped, en particular un mamífero, es su inyección. Mientras que para estas inyecciones el ADN normalmente se diluye en agua, NaCl o tampón de inyección PBS, el ARN normalmente sólo se diluye en un tampón de inyección. Como tampones de inyección de ARN se utilizan tampones estándar, como soluciones salinas tamponadas con fosfato, en particular PBS y solución salina tamponada con HEPES (HBS). En la transferencia de ARNm, dicha solución de inyección de ARN preferentemente se calienta brevemente antes de su administración, para eliminar estructuras secundarias del ARNm. Una desventaja de la utilización de estos tampones estándar para las soluciones de inyección de ARN es que la transferencia intradérmica del ARN tiene lugar de forma escasamente ineficaz. Otra desventaja radica en que la tasa de traducción del ARN transferido es muy baja. Otra desventaja es que el ARN en estos tampones estándar con frecuencia forma una estructura secundaria (por ejemplo la llamada estructura hairpin (horquilla), que puede reducir fuertemente la eficacia de la absorción del ARN en el citosol.

Carralot y col. investigaron la vacunación basada en ARNm estabilizado con globina en ratones13. Para ello inyectaron ARNm desnudo estabilizado con S-globina-UTR, que codifica S-galactosidasa, en tampón de inyección tamponado con HEPES (NaCl 150 mM, HEPES 10 mM) y detectaron una traducción in vivo. Dicha inyección provocó en los ratones una respuesta inmunitaria T-Helfer 2 (Th2) específica de antígeno.

Los documentos WO 2005/009346 A2, US 2003/143204 A1, US 2007/132788 A1 y US 2009/106567 A1 describen la administración de un ARNsi en una solución de Ringer.

El documento WO 2006/008154 describe una mezcla que contiene ARNm para la vacunación donde al menos un ARNm contiene una región codificadora de al menos un antígeno tumoral y al menos otro ARNm contiene una región codificadora de al menos una proteína inmunogénica (polipéptido). Una mezcla de ARNm-antígeno correspondiente en una solución de Ringer lactato se administró a pacientes. Además, a unos ratones se les inyectó ARNm codificador de luciferasa de Photinus pyralis en una solución de Ringer lactato.

Por consiguiente, el objetivo de la presente invención es proporcionar un sistema con el que, por un lado, se mejore la transferencia de ARNm en un organismo huésped y, por otro lado, se aumente la tasa de traducción del ARNm transmitido.

Este objetivo se resuelve mediante las formas de realización de la invención caracterizadas en las reivindicaciones.

Un objeto de la presente invención es la utilización de ARNm y un tampón de inyección acuoso que contiene una sal de sodio, preferentemente al menos 50 mM de una sal de sodio, una sal de calcio, preferentemente al menos 0,01 mM de una sal de calcio, y una sal de potasio, preferentemente al menos 3 mM de una sal de potasio, para la producción de un medicamento según la reivindicación 1. Una solución de inyección de ARNm en el tratamiento según la reivindicación 11 es el objeto de otro aspecto de la presente invención. Así, la solución de inyección resulta del tampón de inyección y el ARNm disuelto en el tampón de inyección.

De acuerdo con una forma de realización preferente, las sales de sodio, las sales de calcio y las sales de potasio contenidas en el tampón de inyección están en forma de haluros, por ejemplo cloruros, yoduros o bromuros, en forma de sus hidróxidos, carbonatos, bicarbonatos o sulfatos. A modo de ejemplo, aquí se pueden mencionar NaCl, Nal, NaBr, Na2CO3, NaHCO3 y Na2SO4 para la sal de sodio, KCl, KI, KBr, K2CO3, KHCO3 y K2SO4 para la sal de potasio contenida, y CaCh, Cah, CaBrg, CaCO3, CaSO4 y Ca(OH)2 para la sal de calcio. El tampón de inyección también puede contener aniones orgánicos con los cationes arriba mencionados.

En una forma de realización especialmente preferente de la utilización según la invención de ARNm y un tampón de inyección, un tampón de inyección utilizado según la invención contiene como sales cloruro de sodio (NaCl), cloruro de calcio (CaCh) y cloruro de potasio (KCl), pudiendo contener dicho tampón también otros aniones además de los cloruros. Normalmente, estas sales se encuentran en el tampón de inyección en una concentración de cloruro de sodio al menos 50 mM (NaCl), cloruro de potasio (KCl) al menos 3 mM y cloruro de calcio (CaCh) al menos 0,01 mM.

El tampón de inyección utilizado puede estar presente tanto en forma de tampón de inyección hipertónico como en forma de tampón de inyección isotónico o hipotónico. En relación con la presente invención, el tampón de inyección es hipertónico, isotónico o hipotónico, en cada caso con respecto al medio de referencia correspondiente, es decir, el tampón de inyección utilizado según la invención presenta un contenido de sal mayor, igual o menor que el del medio de referencia correspondiente, utilizándose preferentemente las concentraciones de las sales arriba mencionadas que no conducen a un deterioro de las células debido a ósmosis u otros efectos de concentración. Los medios de referencia son aquí, por ejemplo, líquidos presentes en procedimientos "in vivo", tales como sangre, linfa, líquidos citosólicos u otros líquidos presentes en el cuerpo, o líquidos o tampones utilizados normalmente en procedimientos in vitro. Los especialistas conocen líquidos y tampones de este tipo.

El tampón de inyección puede contener otros componentes, por ejemplo azúcares (mono-, di-, tri- o polisacáridos), en particular glucosa o manitol. Sin embargo, en una forma de realización preferente, el tampón de inyección empleado para el uso según la invención no incluye ningún azúcar. También preferentemente, el tampón utilizado según la invención no contiene precisamente ningún componente sin carga, por ejemplo azúcares. Por regla general, el tampón utilizado según la invención contiene exclusivamente cationes metálicos, en particular del grupo de los metales alcalinos o alcalinotérreos, y aniones, en particular los aniones arriba indicados.

El valor pH del tampón de inyección oscila preferentemente entre 1 y 8,5, preferiblemente entre 3 y 5, de forma especialmente preferente entre 5,5 y 7,5 y en particular entre 5,5 y 6,5. En caso dado, el tampón de inyección también puede contener un sistema tampón que ajusta el tampón de inyección a un valor pH tamponado. Por ejemplo, se puede tratar de un sistema de tampón fosfato, HEPES o Na²HPOVNaH²PO⁴. No obstante, de forma especialmente preferente el tampón de inyección utilizado según la invención no presenta ninguno de los sistemas tampón arriba mencionados o ningún sistema tampón en absoluto.

Tal como se ha descrito más arriba, el tampón de inyección utilizado según la invención contiene sales de sodio, calcio y potasio, estando presentes el sodio y el potasio en el tampón de inyección normalmente como cationes monovalentes (Na⁺, K⁺), y el calcio como catión divalente (Ca²⁺). De acuerdo con una forma de realización preferente, adicional o alternativamente a los cationes monovalentes y divalentes contenidos en el tampón de inyección utilizado según la invención, también puede haber un contenido de cationes divalentes, en particular del grupo de los metales alcalinotérreos, por ejemplo magnesio (Mg²⁺), o también hierro (Fe²⁺ ), y cationes monovalentes, en particular del grupo de los metales alcalinos, por ejemplo litio (Li⁺). Estos cationes monovalentes están presentes preferentemente en forma de sus sales, por ejemplo en forma de haluros, como cloruros, yoduros o bromuros, en forma de sus hidróxidos, carbonatos, bicarbonatos o sulfatos. A modo de ejemplo, aquí se pueden mencionar LiCl, Lil, LiBr, Li²CO³, UHCO³ y Li²SO⁴ para la sal de litio, MgC^h , Mg^h , MgBr² , MgCO³, MgSO⁴ y Mg(OH)² para la sal de magnesio, y FeC^h , FeBr², Fe^h , FeF² , Fe²O³, FeCO³, FeSO^{4 y} Fe(OH)² para la sal de hierro. También están incluidas todas las combinaciones de cationes di- y/o monovalentes, tal como se describe más arriba. Por ejemplo, están incluidos tampones de inyección utilizados según la invención que sólo contienen cationes divalentes, que sólo contienen cationes monovalentes o que contienen cationes divalentes y monovalentes. También están incluidos según la invención tampones de inyección que sólo contienen un tipo de cationes divalentes o monovalentes, de forma especialmente preferente, por ejemplo sólo cationes Ca²⁺ o una sal de los mismos, por ejemplo CaCl².

Preferentemente, las molaridades arriba indicadas para el Ca²⁺ (como catión divalente) y Na⁺ (como catión monovalente) (es decir, normalmente concentraciones de Na⁺ al menos 50 mM, Ca²⁺ al menos 0,01 M y K⁺ al menos 3 mM) en el tampón de inyección también se tienen en cuenta cuando en el tampón de inyección utilizado según la invención para preparar la solución de inyección se emplean parcial o totalmente, en lugar de Ca²⁺ y Na⁺ , otro catión di- o monovalente u otros cationes di- o monovalentes, en particular otros cationes del grupo de los metales alcalinotérreos o alcalinos. Aunque el Ca²⁺ o Na⁺ , como ya se ha mencionado más arriba, pueden ser sustituidos totalmente por otros cationes di- o monovalentes en el tampón de inyección utilizado según la invención, por ejemplo también por una combinación de otros cationes divalentes (en lugar de Ca²⁺) y/o una combinación de otros cationes monovalentes (en lugar de Na⁺) (en particular una combinación de otros cationes divalentes del grupo de los metales alcalinotérreos o de otros cationes monovalentes del grupo de los metales alcalinos), es preferible sustituir el Ca²⁺ o el Na⁺ en todo caso parcialmente, es decir, ocupar con Ca²⁺ o Na⁺ al menos un 20%, preferentemente al menos un 40%, de forma especialmente preferente al menos un 60% y de forma particularmente preferente al menos un 80% de las molaridades totales correspondientes de los cationes mono- o divalentes del tampón de inyección.

La preparación del tampón de inyección tiene lugar preferentemente a temperatura ambiente (25°C) y presión atmosférica. La preparación puede llevarse a cabo por cualquier método del estado actual de la técnica. Preferentemente, los iones o sales contenidos se diluyen en solución acuosa, debiendo elegirse las relaciones de concentración respectivas de acuerdo con las condiciones correspondientes (organismo huésped, en particular mamífero, al que se le inyecta la solución de inyección de ARN, estado de salud, edad, etc. del organismo huésped, así como condiciones de solubilidad e interferencia de los componentes, temperatura y tiempo de reacción, etc.).

La concentración de los componentes contenidos en el tampón de inyección acuoso, iones sodio, calcio y cloruro, así como iones potasio y en caso dado lactato (véanse las siguientes formas de realización), depende principalmente de su solubilidad en agua, de la interferencia de los componentes entre sí y también de la temperatura y presión de reacción durante la preparación del tampón de inyección o de la solución de inyección de ARN.

El tampón de inyección utilizado de acuerdo con la presente invención se basa en una solución acuosa, es decir, una solución consistente en agua y las sales utilizadas según la invención para la solución de inyección y en caso dado lactato. En caso dado, las sales de los cationes monovalentes o divalentes arriba mencionados pueden ser poco solubles o insolubles en dicha solución acuosa. La medida de la solubilidad de las sales correspondientes se puede calcular a partir del producto de solubilidad. Los especialistas conocen procedimientos para la determinación exacta de la solubilidad y del producto de solubilidad. Esta solución acuosa puede contener hasta un 30 mol% de las sales contenidas en la solución, preferentemente hasta un 25 mol%, preferiblemente hasta un 20 mol%, de forma especialmente preferente hasta un 15 mol%, de forma más preferente hasta un 10 mol%, de forma todavía más preferente hasta un 5 mol% y de forma particularmente preferente hasta un 2 mol% de sales insolubles o poco solubles. El concepto "poco soluble" en el sentido de la presente invención se refiere a aquellas sales cuyo producto de solubilidad es < 10-4 El concepto "muy soluble" se refiere a aquellas sales cuyo producto de solubilidad es > 10-4.

La solubilidad de una sal o de un ion o compuesto iónico en agua depende de su energía reticular y de la energía de hidratación, teniendo en cuenta los efectos de entropía producidos. También se habla del producto de solubilidad, más concretamente del equilibrio, que se ajusta al disolver una sal o un ion o compuesto iónico en agua. El producto de solubilidad se define en general como el producto de las concentraciones de los iones en la solución saturada de un electrolito. Por ejemplo, los metales alcalinos (como Na+, K+) son solubles en agua en concentraciones mayores que las sales alcalinotérreas (como sales de Ca2+), es decir, tienen un mayor producto de solubilidad. Esto significa que las sales de potasio y sodio contenidas en la solución acuosa del tampón de inyección utilizado según la invención son más solubles que las sales de calcio también contenidas en el mismo. Por tanto, al determinar la concentración de estos iones se debe tener en cuenta, entre otras cosas, la interferencia entre las sales de potasio, sodio y calcio.

Es preferible una utilización según la invención donde el tampón de inyección empleado contiene cloruro de sodio (NaCl) entre 50 mM y 800 mM, preferentemente entre 60 mM y 500 mM, de forma especialmente preferente entre 70 mM y 250 mM y de forma particularmente preferente entre 60 mM y 110 mM, cloruro de calcio (CaCh) entre 0,01 mM y 100 mM, preferentemente entre 0,5 mM y 80 mM y de forma especialmente preferente entre 1,5 mM y 40 mM, y cloruro de potasio (KCl) entre 3 mM y 500 mM, preferentemente entre 4 mM y 300 mM, de forma especialmente preferente entre 5 mM y 200 mM.

Además de los aniones inorgánicos arriba mencionados, por ejemplo haluros, sulfatos o carbonatos, también se pueden utilizar aniones orgánicos como aniones adicionales. Entre éstos se pueden mencionar succinato, lactobionato, lactato, malato, maleonato, etc., que también pueden estar contenidos de forma combinada. Preferentemente, un tampón de inyección para la utilización según la invención contiene lactato. De forma especialmente preferente, dicho tampón de inyección, si contiene un anión inorgánico, exclusivamente tiene lactato como anión inorgánico. En el sentido de la invención, el lactato puede ser cualquier lactato, por ejemplo L-lactato y D-lactato. En relación con la presente invención, como sales de lactato entran en consideración normalmente lactato de sodio y/o lactato de calcio, especialmente cuando el tampón de inyección sólo tiene Na+ como catión monovalente y Ca2+ como catión divalente.

En una forma de realización preferente de la utilización según la invención, un tampón de inyección utilizado según la invención contiene lactato preferentemente entre 10 mM y 500 mM, de forma especialmente preferente entre 15 mM y 200 mM y de forma particularmente preferente entre 15 mM y 100 mM.

De acuerdo con la invención, se ha comprobado que la utilización de un tampón de inyección con los componentes arriba descritos, opcionalmente con o sin lactato (en adelante: "tampón de inyección RL", cuando no contiene el componente lactato; o "tampón de inyección RL con lactato", cuando contiene el componente lactato), para soluciones de inyección de a Rn (es decir, soluciones de inyección que contienen ARN y que son adecuadas para la inyección de dicho ARN) aumenta significativamente tanto la transferencia del ARN a las células/tejido de un organismo huésped (mamífero) como la traducción del ARN en éstas, en comparación con tampones de inyección utilizados habitualmente en el estado actual de la técnica.

Una solución con los componentes arriba definidos, cloruro de sodio (NaCl), cloruro de calcio (CaCh), lactato, en particular lactato de sodio, y además cloruro de potasio (KCl), también se conoce como "solución de Ringer" o "Ringer lactato". El Ringer lactato es una solución completamente electrolítica cristaloide que se utiliza como solución para la reconstitución del volumen vascular normal y como solución de soporte, por ejemplo para medicamentos compatibles. Por ejemplo, en caso de pérdida de líquidos y electrolitos (por vómitos, diarrea, oclusión intestinal o quemaduras) se utiliza Ringer lactato como medio principal para reconstituir el volumen vascular normal, en particular en caso de lactantes y niños pequeños, y para mantener abiertos los accesos venosos periféricos y/o centrales. Sin embargo, la utilización según la invención de Ringer lactato como tampón de inyección en una solución de inyección de ARN no está descrita en el estado actual de la técnica.

El ARN puede ser cualquier ARN, por ejemplo ARNm, ARNt, ARNr, ARNsi, ARN monocatenario o bicatenario, ARN heterodúplex, etc. El ARN utilizado según la invención es ARNm y puede codificar cualquier proteína de interés. Preferentemente, el ARNm utilizado según la invención es ARNm desnudo.

En el sentido de la invención, por el concepto "ARNm desnudo" se entiende un ARNm que no está en forma de complejo, por ejemplo con moléculas policatiónicas. El ARNm puede ser monocatenario, pero también bicatenario, es decir, se puede presentar como estructura secundaria, por ejemplo como la llamada "hair pin structure" o estructura de horquilla. Estas formas bicatenarias aparecen dentro del ARNm desnudo sobre todo cuando la molécula tiene secuencias de ribonucleótidos complementarias.

No obstante, de acuerdo con la invención el ARNm también puede estar presente en forma de complejo. Mediante una complejación/condensación de este tipo del ARNm de la invención se puede mejorar la transferencia eficaz del ARN a las células a tratar o al tejido a tratar del organismo a tratar, mediante la asociación o la unión del ARNm con un polímero (poli)catiónico, péptido o proteína. Preferentemente, dicho ARNm se somete a complejación o condensación con al menos un agente catiónico o policatiónico. Preferiblemente, dicho agente catiónico o policatiónico es un agente seleccionado entre el grupo consistente en protamina, poli-L-lisina, poli-L-arginina, nucleolina, espermina e histonas o derivados de histonas o protaminas. La utilización de protamina como proteína policatiónica que se une a ácido nucleico es especialmente preferente. Este procedimiento para la estabilización del ARNm se describe por ejemplo en el documento EP-A-1083232.

Además, el ARNm utilizado según la invención puede estar modificado. Estas modificaciones sirven especialmente para aumentar la estabilidad del ARNm. Preferentemente, el ARNm presenta una o más modificaciones (naturales o no nativas), en particular modificaciones químicas, que por ejemplo contribuyen a aumentar el tiempo de vida media del ARN en el organismo o mejoran la eficiencia de traducción del ARNm en el citosol, en comparación con la eficiencia de traducción del ARNm no modificado en el citosol. Preferentemente, la eficiencia de traducción se mejora mediante una modificación según la invención al menos en un 10%, preferiblemente al menos en un 20%, igualmente de forma preferente al menos en un 40%, de forma especialmente preferente al menos en un 50%, de forma todavía más preferente al menos en un 60%, también de forma todavía más preferente al menos en un 75%, de forma particularmente preferente al menos en un 85% y de forma totalmente preferente al menos en un 100%, con respecto a la eficiencia de traducción de ARNm no modificado en el citosol. Por ejemplo, el contenido de G/C de la región codificadora de un ARNm modificado se puede aumentar en comparación con el contenido de G/C de la región codificadora del ARNm natural, permaneciendo la secuencia de aminoácidos codificada del ARNm modificado preferiblemente inalterada en comparación con la secuencia de aminoácidos codificada del ARNm natural. Esta modificación se basa en el hecho de que para una traducción eficiente de un ARNm es esencial la secuencia de la región del ARNm a traducir. En este contexto, la composición y la secuencia de los diferentes nucleótidos tienen mucha importancia. En particular, las secuencias con un alto contenido de G (guanosina)/C (citosina) son más estables que las secuencias con un alto contenido de A (adenosina)/U (uracilo). Por ello, resulta conveniente variar los codones con respecto al ARNm natural de modo que contengan más nucleótidos G/C, manteniendo la secuencia de aminoácidos traducida. Dado que varios codones codifican un mismo aminoácido (la denominada "degeneración del código genético"), es posible determinar los codones más favorables para la estabilidad, preferentemente con un contenido de G/C máximo. Como resultado, un ARN presente en el tampón de inyección preferentemente incluye un aumento del contenido de G/C de al menos un 30%, de forma especialmente preferente al menos un 50%, de forma todavía más preferente al menos un 70% y de forma particularmente preferente al menos un 80%, con respecto al contenido de G/C máximo (es decir, el contenido de G/C después de la modificación de todos los tripletes potenciales en la región codificada sin variación de la secuencia de aminoácidos codificada aprovechando la degeneración del código genético, partiendo de la secuencia natural, con el objetivo de la maximización del contenido de G/C) y de forma totalmente preferente el contenido máximo de G/C, estando predeterminado el contenido máximo de G/C por aquella secuencia cuyo contenido de G/C es máximo sin que por ello varíe la secuencia de aminoácidos codificada.

Dependiendo del aminoácido a codificar por el ARNm modificado, existen diferentes posibilidades para la modificación de la secuencia de ARNm con respecto a la secuencia natural. En caso de aminoácidos que son codificados por codones que contienen exclusivamente nucleótidos G o C no se requiere ninguna modificación del codón. Como ejemplos se pueden mencionar los codones para Pro (CCC o CCG), Arg (CGC o CGG), Ala (GCC o GCG) y Gly (GGC o GGG).

En cambio, los codones que contienen nucleótidos A y/o U se pueden modificar mediante la sustitución de otros codones que codifican los mismos aminoácidos, pero que no tienen ningún nucleótido A y/o U. Como ejemplos se mencionan:

- los codones para Pro pueden ser modificados de CCU o CCA a CCC o CCG;

- los codones para Arg pueden ser modificados de CGU o CGA o AGA o AGG a CGC o CGG;

- los codones para Ala pueden ser modificados de GCU o GCA a GCC o GCG;

- los codones para Gly pueden ser modificados de GGU o GGA a GGC o GGG.

En algunos casos no es posible eliminar los nucleótidos A o U del codón, pero sí es posible reducir el contenido de A y U utilizando codones que tienen una menor proporción de nucleótidos A y/o U. Como ejemplos se mencionan:

- los codones para Leu pueden ser modificados de UUA, UUG, CUU o CUA a CUC o CUG;

- los codones para Ser pueden ser modificados de UCU o UCA o AGU a UCC, UCG o AGC;

- el codón para Tyr puede ser modificado de UAU a UAC;

- el codón para Cys puede ser modificado de UGU a UGC;

- el codón para His puede ser modificado de CAU a CAC;

- el codón para Gln puede ser modificado de CAA a CAG;

- los codones para Ile pueden ser modificados de AUU o AUA a AUC;

- los codones para Thr pueden ser modificados de ACU o ACA a ACC o ACG;

- el codón para Asn puede ser modificado de AAU a AAC;

- el codón para Lys puede ser modificado de AAA a AAG;

- los codones para Val pueden ser modificados de GUU o GUA a GUC o GUG;

- el codón para Asp puede ser modificado de GAU a GAC;

- el codón para Glu puede ser modificado de GAA a GAG;

- el codón de parada UAA puede ser modificado a UAG o UGA.

Las sustituciones arriba indicadas se pueden utilizar de forma individual y también en todas las combinaciones posibles para aumentar el contenido de G/C del ARNm modificado con respecto al del ARNm natural (de la secuencia original). Por ejemplo, preferentemente se utilizan combinaciones de combinaciones de las posibilidades de sustitución arriba indicadas:

- sustitución de todos los codones codificadores de Thr en la secuencia original (ARNm natural) a ACC (o ACG) y sustitución de todos los codones originalmente codificadores de Ser a UCC (o UCG o AGC); - sustitución de todos los codones codificadores de Ile en la secuencia original a AUC, sustitución de todos los codones originalmente codificadores de Lys a AAG y sustitución de todos los codones originalmente codificadores de Tyr a UAC;

- sustitución de todos los codones codificadores de Val en la secuencia original a GUC (o GUG), sustitución de todos los codones originalmente codificadores de Glu a GAG, sustitución de todos los codones originalmente codificadores de Ala a GCC (o GCG) y sustitución de todos los codones originalmente codificadores de Arg a CGC (o CGG);

- sustitución de todos los codones codificadores de Val en la secuencia original a GUC (o GUG), sustitución de todos los codones originalmente codificadores de Glu a GAG, sustitución de todos los codones originalmente codificadores de Ala a GCC (o GCG), sustitución de todos los codones originalmente codificadores de Gly a GGC (o GGG) y sustitución de todos los codones originalmente codificadores de Asn a AAC;

- sustitución de todos los codones codificadores de Val en la secuencia original a GUC (o GUG), sustitución de todos los codones originalmente codificadores de Phe a UUC, sustitución de todos los codones originalmente codificadores de Cys a UGC, sustitución de todos los codones originalmente codificadores de Leu a CUG (o CUC), sustitución de todos los codones originalmente codificadores de Gln a CAG y sustitución de todos los codones originalmente codificadores de Pro a CCC (o CCG);

etc.

En caso de una modificación del contenido de G/C de la región del ARNm modificado codificadora de la proteína, éste se aumenta al menos en un 7% de puntos, preferentemente al menos en un 15% de puntos, de forma especialmente preferente al menos en un 20% de puntos y de forma particularmente preferente al menos en un 30% de puntos, con respecto al contenido de G/C de la región codificada del ARNm natural codificador de la proteína. En este contexto es especialmente preferente aumentar el contenido de G/C del ARNm modificado, en particular en la región codificadora de la proteína, al máximo en comparación con la secuencia natural.

También es preferible un aumento del contenido de A/U en el entorno del sitio de unión de ribosomas del ARNm modificado en comparación con el contenido de A/U en el entorno del sitio de unión de ribosomas del ARNm natural correspondiente. Esta modificación aumenta la eficiencia de la unión de ribosomas al ARNm. Una unión eficaz de los ribosomas al sitio de unión de ribosomas (secuencia de Kozak: GCCGCCACCAUGG, el AUG constituye el codón de iniciación) produce a su vez una traducción eficiente del ARNm. El aumento consiste en la introducción de al menos una unidad de A/U adicional, normalmente al menos 3 en la región del sitio de unión, es decir -20 a 20 desde A del codón de iniciación AUG.

Una modificación también preferente se refiere a un ARNm en el que la región codificadora y/o la región 5' y/o 3' no traducida del ARNm modificado están cambiadas con respecto al ARNm natural de modo que no contienen ningún elemento de secuencia desestabilizador, y la secuencia de aminoácidos codificada del ARNm modificado preferentemente no cambia con respecto al ARNm natural. Como es sabido, por ejemplo en las secuencias de ARNm eucariotas aparecen elementos de secuencia desestabilizadores (ESD) que se unen a proteínas de señal y regulan la degradación enzimática del ARNm in vivo. Por tanto, para una mayor estabilización del ARNm modificado según la invención, en la región codificadora de la proteína se pueden realizar en caso dado uno o más de este tipo de cambios con respecto a la región correspondiente del ARNm natural, de modo que ésta no contenga ningún o esencialmente ningún elemento de secuencia desestabilizador. Con este tipo de cambios, de acuerdo con la invención también se pueden eliminar del ARNm ESD presentes en las regiones no traducidas (3'-URT y/o 5'-URT).

Este tipo de secuencias desestabilizadoras son, por ejemplo, secuencias ricas en AU ("AURES"), presentes en secciones 3'-UTR de numerosos ARNm inestables (Caput y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986, 83: 1670 a 1674) y motivos de secuencia reconocidos por endonucleasas (por ejemplo Binder y col., EMBO J. 1994, 13: 1969 a 1980).

También es preferente un ARNm modificado que presenta una estructura 5'-caperuza para la estabilización. Estructuras de caperuza a utilizar según la invención son, por ejemplo, m7G(5')ppp (5'(A,G(5')ppp(5')A y G(5')ppp(5')G.

Además, es preferible que el ARNm modificado tenga una cola de poli(A), preferentemente de al menos 25 nucleótidos, de forma especialmente preferente al menos 50 nucleótidos, de forma todavía más preferente al menos 70 nucleótidos, de forma particularmente preferente al menos 100 nucleótidos y de forma totalmente preferente al menos 200 nucleótidos.

También preferentemente, el ARNm modificado presenta al menos un IRES y/o al menos una secuencia de estabilización 5' y/o 3'. De acuerdo con la invención, en el ARNm modificado se pueden introducir uno o más, así llamados, IRES (en inglés "internal ribosomal entry side" - lado de entrada ribosómico interno). De este modo, un IRES puede actuar como único sitio de unión de ribosomas, pero también puede servir para proporcionar un ARNm que codifica varias proteínas, péptidos o polipéptidos que deben ser traducidos independientemente entre sí por los ribosomas ("ARNm multicistrónico"). Ejemplos de secuencias IRES a utilizar según la invención son aquellas de picornavirus (por ejemplo FMDV), pestivirus (CFFV), poliovirus (PV), virus de la encefalomiocarditis (ECMV), virus de la fiebre aftosa (FMDV), virus de la hepatitis C (VHC), virus de la peste porcina clásica (CSFV), virus de leucoma murino (MLV), virus de inmunodeficiencia en simios (VIS) o virus de la parálisis del grillo (CrPV).

También preferentemente, un ARNm modificado presenta al menos una secuencia de estabilización 5' y/o 3'. Estas secuencias de estabilización en las regiones 5' y/o 3' no traducidas producen un aumento de la vida media del ARNm en el citosol. Estas secuencias de estabilización pueden tener un 100% de homología de secuencia con las secuencias naturales presentes en virus, bacterias y eucariotas, pero también pueden ser de naturaleza parcial o totalmente sintética. Como ejemplo de secuencias estabilizadoras que se pueden utilizar en la presente invención se pueden mencionar las secuencias no traducidas (UTR) del gen de la globina, por ejemplo de Homo sapiens o Xenopus laevis. Otro ejemplo de secuencia de estabilización tiene la fórmula general (C/U)CCAN^xCCC(U/A)Py^xUC(C/U)CC, que está incluida en el 3'-UTR del ARNm muy estable que codifica globina, (I)-colágeno, 15-lipoxigenasa o tirosina-hidroxilasa (véase Holcik y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94: 2410 a 2414). Evidentemente, estas secuencias de estabilización se pueden utilizar de forma individual o en combinación entre sí, y también en combinación con otras secuencias de estabilización conocidas por los especialistas.

En una forma de realización preferente de la presente invención, el ARNm modificado presenta al menos un análogo de nucleótidos naturales. Este o estos análogos sirven para una mayor estabilización del ARNm modificado, basándose esto en el hecho de que las enzimas que degradan el a Rn y que están presentes en las células reconocen como sustrato preferentemente nucleótidos naturales. Por tanto, mediante la introducción de análogos de nucleótido en el ARNm se dificulta la degradación del ARNm, pudiendo influir la introducción de estos análogos, en particular en la región codificadora del ARNm, en la eficiencia de traducción de forma positiva o negativa. En una enumeración de ningún modo definitiva, como ejemplos de análogos de nucleótidos a utilizar según la invención se pueden emplear fosforamidatos, fosforotionatos, nucleótidos peptídicos, metilfosfonatos, 7-desazaguanosina, 5-metilcitosina e inosina. Los especialistas conocen la preparación de análogos de este tipo, por ejemplo de las patentes US 4.373.071, US 4.401.796, US 4.415.732, ^u S 4.458.066, US 4.500.707, US 4.668.777, US 4.973.679, US 5.047.524, US 5.132.418, US 5.153.319, US 5.262.530 y 5.700.642. Este tipo de análogos pueden estar presentes tanto en regiones no traducidas como en regiones traducidas del ARNm modificado.

En otra forma de realización preferente de la presente invención, el ARNm modificado además presenta una secuencia codificadora de un péptido señal. Esta secuencia codificadora de un péptido señal preferentemente tiene una longitud de 30 a 300 bases, que codifican de 10 a 100 aminoácidos. De forma especialmente preferente, la secuencia codificadora de un péptido señal tiene una longitud de 15 a 60 bases, que codifican de 15 a 60 aminoácidos. Por ejemplo, para la modificación de los ARNm utilizados según la invención se pueden utilizar las siguientes secuencias indicadas en la Tabla 1. También están incluidas aquellas secuencias indicadas en la Tabla 1 que presentan 1-20, preferentemente 1-10 y de forma especialmente preferente 1-5 intercambios de base por A, T, C o G en comparación con una de las secuencias indicadas en la Tabla 1.

Tabla 1: Ejemplos de secuencias de péptidos señal: secuencias de aminoácidos codificadas por el primer exón n MH l I MH l II li r ín mi lin li n r i .

Los especialistas están familiarizados con diferentes procedimientos para realizar las modificaciones anteriormente descritas. Por ejemplo, para la sustitución de codones en el ARNm modificado utilizado según la invención en caso de regiones codificadores cortas, el ARNm completo se puede sintetizar químicamente empleando técnicas estándar. Preferentemente se utilizan sustituciones, adiciones o eliminaciones de bases utilizando una matriz de ADN para producir el ARNm modificado con ayuda de técnicas de la mutagénesis dirigida usual (véase, por ejemplo, Maniatis y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3a Edición, Cold Spring Harbor, NY, 2001). En un procedimiento de este tipo, para la producción del ARNm se transcribe in vivo una molécula de ADN correspondiente. Esta matriz de ADN dispone de un promotor adecuado, por ejemplo un promotor T7 o SP6, para la transcripción in vivo, al que le siguen la secuencia de nucleótidos deseada para el ARNm a producir y una señal de terminación para la transcripción in vitro. La molécula de ADN que constituye la matriz del constructo de ARN a producir se puede preparar mediante reproducción fermentativa y aislamiento subsiguiente como parte de un plásmido replicable en bacterias. Por ejemplo, utilizando oligonucleótidos de ADN sintéticos cortos que presentan transiciones monocatenarias cortas en los puntos de corte producidos, o mediante genes producidos por síntesis química, es posible clonar la secuencia de nucleótidos deseada en un plásmido adecuado por métodos miológicos moleculares conocidos por los especialistas (véase Maniatis y col., supra). Después, la molécula de ADN se recorta del plásmido, en el que puede estar presente en una sola o en varias copias, mediante digestión con endonucleasas de restricción.

Las modificaciones del ARNm arriba descritas pueden estar presentes en el sentido de la invención de forma individual o en combinaciones entre sí. También es posible combinar una o más modificaciones con la complejación del ARNm arriba descrita.

La invención tiene por objetivo aumentar la transferencia de ARNm y/o de la traducción de ARNm en un organismo huésped. Por organismo huésped en el sentido de la invención se entiende cualquier organismo a cuyas células o tejidos se puede realizar una transferencia de ARNm, seguida por la traducción del mismo. Un organismo huésped en el sentido de la invención es en particular un mamífero seleccionado entre el grupo consistente en ratones, ratas, cerdos, vacas, caballos, perros, gatos, monos y en particular humanos.

Con la presente invención se demuestra que el ARNm codificador de luciferasa diluido en el tampón de inyección RL (con o sin lactato) utilizado según la invención da como resultado una tasa de traducción considerablemente más alta que el ARNm diluido en tampones estándar utilizados tradicionalmente para el ARN, como HBS o PBS (véase la Figura 1). Además, se demuestra que la eficiencia de la transferencia y la traducción de ARNm inyectado depende en gran medida de la presencia de iones calcio. En ensayos comparativos correspondientes con/sin iones calcio en el tampón de inyección RL (con o sin lactato) se comprobó que la ausencia de calcio reduce significativamente la eficiencia de la transferencia de ARNm a un nivel comparable con el de los tampones estándar PBS y HBS (véase la Figura 2).

Por tanto, se constató en primer lugar que un tampón de inyección RL (con o sin lactato) utilizado según la invención aumenta considerablemente la transferencia de ARNm, y en segundo lugar que esta transferencia de ARNm mejorada se aumenta todavía más mediante un tampón de inyección RL (con o sin lactato) utilizado según la invención con una alta concentración de calcio, de hasta 100 mM.

El tampón de inyección utilizado según la invención se emplea en combinación con ARNm en una solución de inyección de ARN. Así, otro objeto de la invención es una solución de inyección de ARN que incluye ARNm y un tampón de inyección que contiene cloruro de sodio (NaCl) al menos 50 mM, cloruro de calcio (CaCh) al menos 0,01 mM y cloruro de potasio (KCl) al menos 3 mM, para la utilización según la reivindicación 11 con el fin de aumentar la transferencia de ARNm y/o la traducción de ARNm en células. Preferentemente se utiliza una solución de inyección de ARN según la invención donde el tampón de inyección contiene cloruro de sodio (NaCl) al menos entre 50 mM y 800 mM, preferentemente al menos entre 60 mM y 500 mM, de forma especialmente preferente al menos entre 70 mM y 250 mM y de forma particularmente preferente entre 60 mM y 110 mM, cloruro de calcio (CaCh) al menos entre 0,01 mM y 100 mM, preferentemente al menos entre 0,5 mM y 80 mM y de forma especialmente preferente al menos entre 1,5 mM y 40 mM, y cloruro de potasio (KCl) al menos entre 3 mM y 500 mM, preferentemente al menos entre 4 mM y 300 mM, y de forma especialmente preferente al menos entre 5 mM y 200 mM.

Preferentemente, el tampón de inyección de la solución de inyección de ARN según la invención contiene además lactato. Preferiblemente, dicho tampón de inyección de la solución de inyección de ARN según la invención contiene lactato al menos 15 mM. Es especialmente preferente una solución de inyección de ARN según la invención en la que el tampón de inyección contiene lactato entre 15 mM y 500 mM, preferiblemente entre 15 mM y 200 mM, y de forma particularmente preferente entre 15 mM y 100 mM.

La preparación de la solución de inyección de ARN puede realizarse de acuerdo con cualquier procedimiento del estado actual de la técnica. Preferentemente, el ARNm del tampón de inyección RL o el tampón de inyección RL se diluyen con lactato. También es posible disponer primero el ARNm como ARNm seco (por ejemplo liofilizado) y añadir después el tampón de inyección de ARN o el tampón de inyección RL con lactato, opcionalmente bajo con un aumento de temperatura, agitación, ultrasonido, etc. para acelerar la disolución. Las relaciones de concentración correspondientes se deben elegir en función de las respectivas condiciones previas (organismo huésped, en particular mamífero, al que se le inyecta la solución de inyección de ARN, estado de salud, edad, etc. del organismo huésped, etc.).

El ARNm de la solución de inyección de ARN según la invención preferentemente es ARNm desnudo.

Tal como se ha descrito, la solución de inyección de ARN según la invención se puede utilizar en particular para aumentar la transferencia de ARN a un organismo huésped y la traducción de ARN en dicho organismo huésped.

Por consiguiente, otro objeto (no reivindicado) es la utilización de la solución de inyección de ARN anteriormente descrita para aumentar la transferencia de ARN a un organismo huésped y/o la traducción de ARN en dicho organismo huésped.

También se investigó la dosificación (en cuanto a la cantidad y la duración en particular para aplicaciones clínicas) del ARNm a transferir en el tampón de inyección RL (con o sin lactato). Estas investigaciones dieron como resultado un aumento de la expresión de luciferasa con cantidades crecientes de ARNm hasta 0,1 |jg (en 100 j l de volumen de inyección) en ratones y hasta 3 mg (en 150 j l de volumen de inyección) en humanos. La traducción de ARNm tiene lugar de forma transitoria y se regula de forma consecuente, de modo que para una expresión uniforme y persistente de la molécula extraña (proteína) se debería llevar a cabo una repetición de la inyección, dependiendo de diversos factores, como la molécula extraña a expresar y el efecto buscado, el organismo que recibe la inyección y el estado (de salud) del mismo, etc., aproximadamente cada tres días, pero también cada dos días o también a diario. La cantidad de ARNm puede oscilar, también en función de diferentes factores, entre otros los factores arriba mencionados, entre 0,01 jg y 1,000 jg , preferentemente entre 1 jg y 800 jg , de forma igualmente preferente entre 2 jg y 500 jg , de forma especialmente preferente entre 5 jg y 100 jg , de forma particularmente preferente entre 10 jg y 90 jg y de forma totalmente preferente entre 20 jg y 80 jg en 100 j l de volumen de inyección. De forma especialmente preferente, la cantidad de ARNm es de 60 jg en 100 j l de volumen de inyección.

Algunas utilizaciones según la invención del ARNm y del tampón de inyección RL o el tampón de inyección RL con lactato o de la solución de inyección de ARN consisten en la utilización para el tratamiento y/o la profilaxis o para la producción de un medicamento para el tratamiento y/o la profilaxis de enfermedades cancerosas o tumorales, por ejemplo melanoma, como melanoma maligno, melanoma de piel, carcinoma, como carcinoma de colon, carcinoma de pulmón, como carcinoma de pulmón de células pequeñas, adenocarcinoma, carcinoma de próstata, carcinoma de esófago, carcinoma de mama, carcinoma de riñón, sarcoma, mieloma, leucemia, en particular AML (leucemia mieloide aguda), glioma, linfomas y blastomas, alergias, enfermedades autoinmunes, como esclerosis múltiple, infecciones virales y/o bacterianas.

La presente invención también incluye la utilización tanto del ARNm y el tampón de inyección RL o el tampón de inyección RL con lactato como de la solución de inyección de ARN, entre otras cosas, para la terapia genética y la vacunación, por ejemplo para la vacunación antiviral o tumoral, o para la prevención de las enfermedades arriba mencionadas.

En el sentido de la presente invención, una "terapia genética" significa especialmente restablecer una función que falta del cuerpo o de la célula mediante la introducción de un gen funcional en las células enfermas, o inhibir una función perjudicial mediante una información genética correspondiente. Por ejemplo, en caso de falta de un gen supresor tumoral, por ejemplo p53, o si éste solo es expresado en cantidades pequeñas, se puede introducir en forma de su ARNm en la célula, insertar en el ADN y así generar la proteína expresada originalmente de forma deficiente de nuevo en cantidades fisiológicamente relevantes. Ejemplos de genes supresores tumorales en el sentido de la presente invención son p53 TP53, RB1, APC, WT1, NF1, NF2, VHL, BRCA1, BRCA2, DCC, MEN 1, MEN 2, PTCH, p57/KIP2, MSH2, MLH1, FMS1, FMS2, MET, p16/INK4a/CDKN2, CDK4, RET, EXT1, EXT2, EXT3, PTEN/MMAC1, ATM, BLM, XPB, XPD, XPA, XPG, FACC, FACA, SMAD4/DPC4, p14Art(p19Art), DPC4, E-CAD, LKB1/STK1, TSC2, PMS1, PMS2, MSH6, TGF-p Tipo II R, BAX, a-CAT, MADR2/SMAD2, CDX2, MKK4, PP2R1B, MCC, etc.

Una vacunación en el sentido de la invención significa la introducción de información genética en forma de ARNm en un organismo, en particular en una o más células o tejidos de dicho organismo. El ARNm así administrado se traduce en el organismo en la molécula diana (por ejemplo péptido, polipéptido, proteína), es decir, la molécula diana codificada por el ARNm se expresa y provoca una respuesta inmunitaria. Ya es sabido que las células presentadoras de antígenos (APC) tienen un papel clave obligatorio durante la provocación de una respuesta inmunitaria, ya que representan el único tipo de célula que al ser activada dispara todas las señales necesarias para la iniciación de la proliferación de inmunocitos específicos de antígeno. Una vacunación en el sentido de la presente invención puede tener lugar, por ejemplo, utilizando ARNm codificador de un antígeno, pudiendo tratarse de antígenos tumorales en caso de una vacunación tumoral o de un antígeno extraño en caso de una vacuna contra agentes patógenos extraños. Antígenos tumorales de acuerdo con la presente invención son, por ejemplo, antígenos tumorales definidos de células T, por ejemplo antígenos de "cáncer testicular", por ejemplo MAGE, RAGE, NY-ESO-1, antígenos de diferenciación, por ejemplo MART-1/Melan-A, tirosinasa, gp100, PSA, CD20, genes mutados de epítopo antigénico, por ejemplo CDK4, caspasa-8 o antígenos oncofetales, por ejemplo CEA, AF. Otros antígenos tumorales son, por ejemplo, los antígenos tumorales CD5 y CAMPATH-1 (CDw52) que aparecen en linfomas de células B, antígenos ^c D20 que aparecen en linfomas de células B no Hodkin, los antígenos tumorales que aparecen en caso de tumores sólidos, en particular en caso de tumores epiteliales (mama, intestino y pulmón), CEA (antígeno carcinoembriogénico), mucina, CA-125, así como FAP-a, tenascina y metaloproteinasa, que aparecen adicionalmente en caso de tumores glioblastomas. Otros antígenos tumorales son, por ejemplo, los antígenos tumorales que aparecen en caso de tumores de pulmón, mama, cabeza y cuello, y también en caso de tumores de células T y células B, EGF (factor de crecimiento epidérmico), p185HER2 y el receptor IL-2, o el antígeno tumoral SV40, etc.

También es posible utilizar un ARNm que codifique varios de estos antígenos. De este modo se puede combatir eficazmente un melanoma, carcinoma, AML o glioma, ya que una combinación de diferentes antígenos específicos del tumor correspondiente presenta un espectro de acción extremadamente amplio. El ARNm utilizado según la invención también puede codificar una proteína inmunogénica. Dicha proteína inmunogénica puede facilitar la reactivación de una respuesta inmunitaria. Esta reactivación se basa en el conocimiento de que prácticamente cada organismo dispone de las llamadas "memorias de respuestas inmunitarias" contra determinadas moléculas extrañas, por ejemplo proteínas, en particular proteínas virales, antígenos. Esto significa que un organismo ya ha sido infectado con una molécula extraña de este tipo en un momento anterior, y que a causa de esta infección ya se ha provocado una respuesta inmunitaria contra dicha molécula extraña, por ejemplo una proteína viral, permanece en la "memoria" del sistema inmunitario, es decir que éste la almacena en memoria. En caso de una nueva infección con la misma molécula extraña, dicha respuesta inmunitaria se reactiva. De acuerdo con la invención, dicha reactivación de la respuesta inmunitaria puede tener lugar mediante la vacunación con un ARNm que contiene al menos una región codificadora de al menos una proteína inmunogénica. Es preferible un ARNm que codifique tanto uno o más antígenos como una o más proteínas inmunogénicas.

Preferentemente, proteínas inmunogénicas en el sentido de la invención son proteínas estructurales virales, en particular proteínas de matriz, proteínas de cápside y proteínas superficiales de la membrana lipídica. Otros ejemplos de estas proteínas virales son proteínas de adenovirus, rinovirus, virus corona, retrovirus. En este contexto son especialmente preferentes el antígeno superficial de la hepatitis B ("Hepatitis B Surface Antigen", en adelante designado como "antígeno HBS") y proteínas de matriz de la gripe, en particular la proteína de matriz de la gripe M1.

También se describe (no se reivindica) la utilización de ARN y del tampón de inyección RL o el tampón de inyección RL con lactato arriba descritos, así como del tampón de inyección RL o el tampón de inyección RL con lactato arriba descritos, o de la solución de inyección de ARN arriba descrita, para aumentar la transferencia de ARN y/o la traducción de ARN en procedimientos in vitro, por ejemplo para análisis de expresión genética o para procedimientos de cribado in vitro, por ejemplo por ^h T^s (High Throughput Screening - cribado de alto rendimiento).

De acuerdo con la invención, la utilización de una solución de inyección de ARN tiene lugar en un procedimiento para aumentar la transferencia de ARNm y/o la traducción de ARNm de ARN en un organismo huésped, para el tratamiento y/o la profilaxis de enfermedades cancerosas o tumorales, por ejemplo melanoma, como melanoma maligno, melanoma de piel, carcinoma, como carcinoma de colon, carcinoma de pulmón, como carcinoma de pulmón de células pequeñas, adenocarcinoma, carcinoma de próstata, carcinoma de esófago, carcinoma de mama, carcinoma de riñón, sarcoma, mieloma, leucemia, en particular AML (leucemia mieloide aguda), glioma, linfomas y blastomas, alergias, enfermedades autoinmunes, como esclerosis múltiple, infecciones virales y/o bacterianas, y para la terapia genética y/o vacunación, en caso dado para la vacunación antiviral, o para la prevención de las enfermedades arriba mencionadas. El procedimiento incluye los siguientes pasos:

a) preparar una solución de inyección de ARN de la presente invención y

b) administrar la solución de inyección de ARN del paso a) en un organismo huésped.

La preparación de la solución de inyección del paso a) puede realizarse como se describe más arriba, es decir, de acuerdo con cualquier procedimiento del estado actual de la técnica, preferentemente por dilución del ARNm en el tampón de inyección RL o en el tampón de inyección RL con lactato. Las relaciones de concentración correspondientes también se deben elegir aquí en función de las condiciones previas arriba descritas (por ejemplo organismo huésped, en particular mamífero, al que se le inyecta la solución de inyección de ^a Rⁿ , estado de salud, edad, etc. del organismo huésped, etc.). La administración de la solución de inyección de ARN puede realizarse por ejemplo con una jeringuilla para inyecciones (por ejemplo Sub-Q, Becton Dickinson, Heidelberg, Alemania). La solución de inyección de ARN se administra según la invención vía intradérmica, intraepitelial, intraperitoneal o intranodal (por ejemplo en los ganglios linfáticos).

El organismo huésped del procedimiento según la invención preferentemente es un mamífero seleccionado entre el grupo consistente en ratones, ratas, cerdos, vacas, caballos, perros, gatos, monos y en particular humanos.

En un aspecto no reivindicado, la solución de inyección preparada se puede utilizar para la transfección in vitro de células con ARN, en particular ARNm. Esta transfección in vitro puede ser adecuada para su uso en laboratorio o puede formar parte de una terapia genética ex vivo, es decir, una toma de células de un paciente, una transfección ex vivo de ARN contenido en una solución de inyección y retrasplante subsiguiente en un paciente. La transfección se puede llevar a cabo con ayuda de un procedimiento de electroporación, en caso dado aplicando también impulsos de tensión con una intensidad de campo de como máximo 2 a 10 kVcirr1 y duraciones de impulso de 10 a 200 ps y una densidad de corriente de al menos 2 Acirr2 No obstante, si no es necesario para la transfección también se pueden utilizar duraciones de impulso más largos, de 1 a 100 ms. Si la solución de inyección se utiliza para trabajos de laboratorio, se pueden someter a transfección con ARN todas las líneas celulares de laboratorio imaginables. Para la terapia genética ex vivo entran en consideración numerosos tipos de células para la transfección, en particular células sanguíneas humanas primarias, células sanguíneas progenitoras pluripotentes, pero también fibroblastos, neuronas, células endoteliales o células musculares. Esta enumeración se da a modo de ejemplo y no tiene ningún carácter limitativo.

Las siguientes figuras y ejemplos sirven para aclarar e ilustrar adicionalmente la presente invención, sin limitar ésta a los mismos.

Figuras

En los experimentos mostrados en las Figuras 1 a 5 se inyectó un volumen de 100 pl del tampón indicado en cada caso (las composiciones de los tampones se indican más adelante bajo el punto Materiales, 1. Tampón de Inyección), que contenía ARNm (Figura 4, ADNp en 100 pl de PBS) que codifica luciferasa de Photinus pylaris, en el pabellón auditivo de ratones BALB/c14 Después se analizó la actividad de luciferasa de una oreja de ratón completa. Ésta se indica en millones de moléculas de luciferasa. El límite de detección se indica en los diagramas con una línea gruesa en la que está indicado un número. Cada punto de los diagramas indica la expresión de luciferasa de una oreja individual. Las barras cortas con números indican los valores medios de los diferentes grupos. También se indican valores p para los grupos cuyo valor medio se desvía de forma significativa (de acuerdo con la prueba de Mann-Whitney). En los experimentos de las Figuras 1, 2 y 5, las orejas se extirparon 15 horas después de la inyección. Los datos mostrados son el resultado de al menos tres experimentos independientes para cada grupo.

En la Figura 1 se muestra una comparación de diferentes tampones de inyección para ARNm: solución salina tampón de fosfato (PBS) y solución salina tamponada con HEPES (HBS) y tampón de inyección RL con lactato (RL). Como control negativo se utilizó ARNm lacZ. De acuerdo con la invención se demostró que el ARNm diluido en tampón de inyección RL con lactato dio como resultado una expresión de luciferasa considerablemente más alta (p < 0,001) que el ARNm diluido en HBS o PBS (Figura 1A).

En la Figura 2 se muestra la influencia de la falta de calcio (-CaCl), potasio (-KCl) o lactato de sodio (-NaLa) en el tampón de inyección RL (con lactato o sin lactato y con o sin calcio o potasio) en la eficiencia de la absorción de ARNm. La principal diferencia entre PBS y HBS con respecto al tampón de inyección RL o el tampón de inyección RL con lactato (con o sin calcio) es la ausencia de lactato y calcio (en HBS o PBS). Por ello se realizaron investigaciones en las que se compararon la transferencia y la traducción de ARNm codificador de luciferasa utilizando por un lado tampón de inyección RL completo (tampón de inyección RL con lactato) y por otro lado formulaciones de tampones de inyección RL sin calcio o sin potasio o sin lactato. Estas investigaciones demostraron que la falta de lactato daba como resultado una expresión de luciferasa comparable a la expresión obtenida utilizando tampón de inyección RL completo (tampón de inyección RL con lactato). A diferencia de ello, la ausencia de calcio en el tampón de inyección RL o en el tampón de inyección RL con lactato reducía significativamente la eficiencia de la transferencia de ARN (p = 0,004), a un nivel comparable al obtenido con PBS y HBS.

En las Figuras 3 y 4 se muestra la cinética de la traducción de ARNm directamente in vivo. Se realizaron y compararon experimentos de cinética paralelos con ARN en RL con lactato y con ADN en tampón estándar PBS. Durante diez días después de la inyección se registró la traducción de ARNm (en tampón de inyección RL con lactato) (Figura 3) o ADNp (en PBS) (Figura 4), que se muestra en los diagramas. En las dos realizaciones de ensayo (ARN y ADN) se registró la actividad de luciferasa en ratones vivos. Se muestran los resultados de una oreja representativa. La expresión de luciferasa detectada después de la inyección de ARNm (codificador de luciferasa) en tampón de inyección RL con lactato alcanzó muy pronto (17 horas) su valor máximo y después de nueve días ya no era detectable (Figura 3). En cambio, la inyección de ADNp (codificador de luciferasa) en PBS dio como resultado una expresión proteínica posterior, que alcanzó su valor máximo tres días después de la inyección y que se mantuvo durante más de nueve días (Figura 4). Estos resultados demuestran de nuevo no sólo la eficiencia del tampón de inyección RL con lactato según la invención, sino también que el ARN como vehículo para una expresión genética transitoria en organismos huésped, en particular mamíferos, es mucho más adecuado que el ADN. El ARN es expresado más rápidamente y además de forma transitoria, con lo que la expresión genética deseada se puede provocar más a tiempo y de forma limitada en el tiempo y, en consecuencia, de forma más selectiva y diferenciada. Con estas investigaciones se pudo demostrar tanto la transferencia de ARN con éxito e incrementada, como la traducción posterior eficaz.

En la Figura 5 se muestra el efecto de diferentes cantidades de ARNm en la expresión de luciferasa. Estos experimentos se realizaron sobre todo para establecer con mayor precisión la cantidad y la duración de la dosificación del ARN a transferir en el tampón de inyección RL con lactato, en particular para aplicaciones clínicas. Para ello, a varios ratones se les inyectaron cantidades crecientes de ARN. Se determinó un aumento de la expresión de luciferasa con cantidades crecientes de ARNm hasta 5 |jg (en 100 j l de volumen de inyección). Las dosis mayores de 5 jg no conducían a una mejora adicional de la expresión. En experimentos correspondientes en humanos (no mostrados) se utilizó una cantidad de 120 jg de ARNm que se aumentó hasta 200 jg y que condujo a una mejor expresión. La cantidad de 200 jg de ARNm en humanos en comparación con 5 jg en ratones se deduce, entre otras cosas, del tamaño del sitio de inyección, que en los humanos es aproximadamente 40 veces más grande. Los experimentos humanos se realizaron con voluntarios sanos después de aclarar el trasfondo y las posibles consecuencias de las investigaciones y tras obtener su consentimiento. En cuanto a la dosificación temporal se debe señalar que la traducción de ARNm es transitoria (tal como muestra la Figura 3, después de 12 horas alcanza su valor máximo y después de nueve días ya no es detectable) y se regula en consecuencia. Por ello, para lograr una traducción uniforme y persistente de la molécula extraña (proteína) es apropiado administrar una repetición de la inyección aproximadamente cada día, cada dos o cada tres días (dependiendo de factores tales como por ejemplo la molécula extraña o el organismo en el que se inyecta el ARNm).

La Figura 6 muestra de nuevo la influencia del CaCh en la actividad de luciferasa. Para ello se preparó una serie de diluciones de CaCh en tampón de lisis de luciferasa (las concentraciones finales están indicadas en el diagrama) y a todas las muestras se le añadió la misma cantidad definida de proteína-luciferasa recombinante (concentración final aproximadamente 4,7 pM). Las mezclas se analizaron con un luminómetro en cuanto a su emisión de luz (después de añadir ATP y luciferina). A continuación, se calculó la influencia de la concentración de CaCl2 en la actividad de luciferasa aplicando la siguiente fórmula:

% de actividad relativa de luciferasa (ARL) = (ARL de la muestra con concentración definida de CaCh - ARL del tampón de lisis puro) / (ARL de la muestra sin CaCh - ARL del tampón de lisis puro) x 100%.

La presencia de iones Ca2+ en una mayor concentración (a partir de aproximadamente 2 mM) no aumentó la actividad enzimática de la luciferasa.

La Figura 7 representa de nuevo la influencia de la concentración de CaCh en la transferencia de ARNm in vivo. Aquí se utilizaron diferentes concentraciones de tampón de inyección RL con lactato para preparar soluciones de inyección de ARN (100 pl) con la misma cantidad de ARNm codificador de luciferasa de Photinus pyralis (20 pg), pero con diferentes osmolaridades (osmol.). Las soluciones de inyección de ARN se inyectaron en el pabellón auditivo de ratones BALB/c. Quince horas después, los ratones fueron sacrificados y se prepararon lisados de las orejas. En la figura se indica la cantidad total calculada de moléculas de luciferasa producidas por oreja, el valor medio de los diferentes grupos (barras con número), el tamaño de cada grupo (n) y el límite de detección del ensayo (línea gruesa con número). Como resultado se constata que una transferencia eficiente, y con ello una traducción subsiguiente eficiente, de ARNm in vivo requiere una concentración iónica mínima de 170 mOsm.

Las Figuras 8A-E representan la caracterización de células que expresan in vivo el ARNm suministrado. En este caso se inyectaron 20 pg de ARNm codificador de p-galactosidasa de Escherichia coli, diluidos en un volumen total de 100 pl de una solución de inyección de ARN que contenía tampón de inyección RL con lactato. Catorce horas después de la inyección, los ratones fueron sacrificados, se extirparon las orejas y se prepararon criosecciones transversales. Las secciones representadas en las Figuras 8A y 8C a 8E están caracterizadas por colores. Además, se examinó una expresión genética dirigida de ARN en tampón de inyección RL (con o sin lactato). Para ello se definió qué tipos de células absorben y traducen el ARN exógeno transferido en tampón de inyección RL (con o sin lactato) (véase también el Ejemplo 5, Figuras 8 A-E, y análogamente las Figuras 11, 12, 16 y 17). A continuación, se analizó cómo, en el marco de una vacunación basada en ARNm según la invención, es posible provocar una respuesta inmunitaria mediante la traducción de ARN exógeno, transferido en tampón de inyección RL (con o sin lactato), en células diana definidas del sistema inmunitario. En los experimentos representados en la Figura 8A, una de cada cinco secciones individuales se tiñó con una solución que contenía X-gal. En criosecciones sucesivas de 20 pm de espesor se detectaron hasta 10 células positivas en p-galactosidasa. El campo de la expresión, es decir, células positivas en p-galactosidasa (indicadas mediante flechas) abarcaba de uno a dos milímetros en la dirección longitudinal y la dirección sagital de la oreja y estaba localizada en una capa delgada entre la epidermis y el cartílago del pabellón auditivo. De acuerdo con la invención, también se examinó si las APC presentan un antígeno extraño mediante absorción directa y autotraducción del ARNm transferido, o mediante la absorción del producto de traducción del ARN transferido de otras células (denominada "cross presentation" - presentación cruzada). En base a la localización de las células, su forma y su fenotipo MHC clase II se pudo deducir que las células que absorben y expresan ARNm desnudo exógeno en el sitio de inyección son principalmente células musculares y/o fibroblastos (Figura 8A). Los resultados coinciden con la "cross presentation" arriba mencionada de antígenos traducidos por otras células. Dicho proceso también explicaría la formación de anticuerpos contra las proteínas codificadas por la vacuna de ácidos nucleicos. De este modo, de acuerdo con la invención se pudo determinar por vez primera que la provocación de la respuesta inmunitaria tiene lugar por lo tanto a través de un, así llamado, "cross priming" (cebado cruzado), en el que las células musculares o células dérmicas (fibroblastos) absorben y expresan el ARN de transferencia, y que estas células activan las APC. El histograma de la Figura 8B muestra la cantidad de las células positivas en p-galactosidasa en secciones sucesivas. Cada barra representa una sección. En los experimentos de las Figuras 8C a 8E se tiñó una de cada cinco secciones individuales, en concreto para la expresión de MHC clase II (detectada mediante tinción de inmunofluorescencia Alexa 546, verde) y expresión de p-galactosidasa (detectada mediante tinción con magenta-gal, violeta). Las ilustraciones de la columna izquierda muestran una tinción con magenta-gal sola con células positivas en p-galactosidasa en violeta = áreas (muy) oscuras. En la columna central y la columna derecha se muestra la superposición de una tinción con magenta-gal (representada mediante regiones de interés en la columna central y la columna derecha) y una tinción con MHC clase II -sola-(naranja = áreas claras en la columna central) (verde = áreas claras en la columna derecha). Como se puede ver, la mayor parte de las células positivas en p-galactosidasa aparecen claramente como MHC clase II negativa.

Las Figuras 9A-B muestran la transferencia in vivo de ARNm desnudo en ratones y en humanos. En este caso se preparó ARNm codificador de luciferasa y se disolvió en solución de inyección de ARN que contenía tampón de inyección RL. El límite de detección se indica en los diagramas con una línea gruesa con un número. En los experimentos mostrados en la Figura 9A se inyectó una cantidad total de 100 j l que contenía 20 |jg de ARNm en el pabellón auditivo de ratones. Catorce horas después de la inyección, los ratones fueron sacrificados, las células de las orejas se sometieron a lisis y el lisado se analizó en cuanto a la expresión de luciferasa. Luego se calculó la cantidad de moléculas de luciferasa por oreja (como patrón se utilizó luciferasa recombinante). Los datos proceden de al menos tres experimentos independientes por cada grupo. En los experimentos mostrados en la Figura 9B se inyectó el mismo ARNm (120 jg ) en un volumen total de 200 j l en piel humana (en la piel de un voluntario). Dieciséis horas después se realizaron biopsias con un diámetro de 2 mm (troqueladas) bajo anestesia local, en concreto en el centro del sitio de inyección ("ARNm") y a distancia del sitio de inyección ("mock"). Sólo se pudo detectar una actividad de luciferasa en el centro del sitio de inyección. Se muestra uno de dos experimentos independientes. Con estos resultados se pudo demostrar la transferencia directa de ARNm desnudo in vivo en piel humana. Por lo tanto, de acuerdo con la invención se posibilita una vacunación basada en ARNm dirigida eficiente en humanos.

Las Figuras 10 A-D muestran la integridad y la capacidad de traducción del ARNm inyectado en tampón de inyección RL con lactato. La integridad se comprobó con electroforesis en gel de formaldehído-agarosa (1,2% p/v). Para ello se separó 1 jg de ARNm codificador de luciferasa de Photinus pylaris (luc, 1,9 kB, Figura 10A) o de p-galactosidasa de Escherichia coli (lacZ 3,5 kB, Figura 10C). No se ha detectado ninguna diferencia en la integridad del ARNm (antes de la inyección) antes de la dilución en el tampón de inyección correspondiente (solución madre) y después de la dilución en el tampón de inyección correspondiente. En cambio, cuando se recogen los restos de la solución de inyección de ARN de la jeringuilla para inyecciones se puede constatar una degradación completa visible del ARNm (después de la inyección). Evidentemente, estos restos se han contaminado con ribonucleasas por el contacto de la jeringuilla para inyecciones con el tejido del ratón o del humano. La capacidad de traducción del ARNm inyectado se comprobó mediante electroporación de células BHK21 con 10 jg de ARNm. Como control se utilizaron 10 jg de ARNm irrelevante o no se utilizó nada de ARNm (mock). A continuación, las células se sometieron a lisis y se examinaron en cuanto a su actividad de luciferasa con un luminómetro (Figura 10B) o se tiñeron con X-gal y se examinaron en cuanto a su actividad de luciferasa con un microscopio óptico (Figura 10D).

La Figura 11 representa la identificación de la transferencia de ARNm a nivel celular. El esquema muestra una vista de un ratón. En el esquema, la cara exterior (dorsal) es directamente visible para el observador. Al ratón se le inyectó en el pabellón auditivo ARNm en tampón de inyección RL con lactato. Después se realizaron secciones transversales sucesivas de la oreja (1, 2, 3, 4). Las secciones se reunieron en diferentes grupos (1, 2, 3, 4), se secaron al aire y se conservaron a -20°C hasta los diferentes procesos de tinción.

Las Figuras 12A-C muestran la transferencia del ARNm a nivel celular. En una oreja de un ratón se inyectaron 5 jg de ARNm codificador de p-galactosidasa de Escherichia coli en tampón de inyección RL con lactato. Quince horas después de la inyección, la oreja se introdujo en medio TissueTek O.C.T. y se prepararon criosecciones de 60 jm de espesor. Las secciones se tiñeron con X-gal a lo largo de la noche. La Figura 12A representa criosecciones de una oreja negativa en relación con la transferencia de ARNm. No se puede detectar ninguna célula positiva en cuanto a lacZ. La Figura 12B muestra una vista de conjunto. La Figura 12C muestra una vista detallada de una oreja positiva en relación con la transferencia de ARNm. Las células positivas en lacZ aparecen en color azul oscuro y están indicadas con flechas.

La Figura 13 muestra la compatibilidad de la señal Alexa Fluor 546 con el color de las células positivas magentagal. Para determinar si es posible la detección de Alexa Fluor 546 en células positivas magenta-gal, unas células BHK se sometieron a transfección con combinaciones de ARNm de eGFP (eGFP = enhanced green fluorescence protein - proteína de fluorescencia verde mejorada) o ARNm de lacZ. Se analizaron las siguientes combinaciones de células sometidas a transfección:

- transfecciones individuales solo con ARNm de eGFP o solo con ARNm de lacZ; una mezcla de dichas células sometidas a transfección individual (eGFP/lacZ); y

- células sometidas a transfección doble (eGFP+lacZ).

Las células se tiñeron con un anticuerpo anti-eGFP con detección Alexa Fluor 546 y a continuación con magenta-gal. Se detectaron células positivas teñidas con magenta-gal (que expresan lacZ) con microscopía óptica de campo amplio (línea superior) y células positivas teñidas con Alexa Fluor 546 (que expresan eGFP) con microscopía de fluorescencia (línea media). También se realizaron superposiciones de los dos resultados (línea inferior) para obtener resultados exactos de la localización de las células entre sí, aunque en esta representación la señal de Alexa 546 cubre la reproducción del microscopio óptico. No se pudo excluir la posibilidad de que la absorción directa y autotraducción del ARNm suministrado hubiera tenido lugar en las APC y hubiera sido suficiente para provocar una respuesta inmunitaria. En algunas APC podrían haber tenido lugar procesos de una traducción pequeña o incompleta no detectable que (en caso de una traducción incompleta) podrían haber provocado el procesamiento y la presentación del antígeno extraño.

Las Figuras 14 A-B muestran la especificidad de tinciones de criosecciones con MHC clase II. En este caso se inyectaron 20 |jg de ARNm codificador de p-galactosidasa de Escherichia coli en un volumen total de 100 |jl de tampón de inyección RL con lactato. Catorce horas después de la inyección, los ratones fueron sacrificados y se les extirparon las orejas. Se prepararon criosecciones transversales. Las criosecciones se tiñeron primero con un anticuerpo anti-MHC clase II (Figura 14A) o con el anticuerpo de control de isotipo correspondiente (Figura 14B) y se detectaron con tinción inmunofluorescente con Alexa 546. Después, las criosecciones se tiñeron con Magenta-gal (para expresión de p-galactosidasa). Las ilustraciones muestran tinciones con magenta-gal (columna izquierda), tinciones con MHC clase II (columna media, la posición de células positivas en lacZ están indicadas con rebordes) y una superposición de las dos tinciones (columna derecha, las células positivas en lacZ están indicadas mediante rebordes, las áreas claras de la ilustración representan las células positivas en MHC clase II).

La Figura 15 representa la compatibilidad de células positivas en colorante X-gal y colorante AEC. Con el fin de determinar si el precipitado X-gal es compatible con la detección de células positivas en AEC, unas células BHK se sometieron a cotransfección con ARNm de eGFP y con ARNm de lacZ. Las células se tiñeron con una inmunotinción anti-eGFP con AEC (rojo: células positivas, expresan eGFP), con una solución de X-gal (verde azulado: células positivas, expresan lacZ) o con una combinación de AEC y X-gal. Las células teñidas se analizaron con microscopía óptica amplia. Las células doblemente positivas aparecen en negro (flechas negras). La diferenciación de células positivas con tinción individual (flechas verdes y rojas) resulta difícil si la tinción individual experimenta una fuerte precipitación y por ello aparece más bien en negro.

Las Figuras 16 A-B muestran la colocalización de células positivas en MHC clase II y células positivas en transferencia de ARNm. En este caso se inyectaron 20 jg de ARNm codificador de p-galactosidasa en un volumen total de 100 j l de tampón de inyección RL con lactato. Catorce horas después de la inyección, los ratones fueron sacrificados y se les extirparon las orejas. Se prepararon criosecciones transversales, que se tiñeron en primer lugar con un anticuerpo anti-MHC clase II (Figura 16A+B) o con el anticuerpo de control de isotipo correspondiente (Figura 16C) (detectado con tinción Alexa 546), y después con X-gal (para la expresión de p-galactosidasa). Las células positivas en transferencia de ARNm aparecen en color azul verdoso; las células positivas en MHC clase II aparecen en rojo; y las células doblemente positivas aparecen en negro. Las células positivas en transferencia de ARNm se indican mediante una flecha independientemente de la expresión de MHC clase II.

La Figura 17 muestra la transferencia de ARNm y la morfología del pabellón auditivo. En este caso se inyectaron 20 jg de ARNm codificador de p-galactosidasa en un volumen total de 100 j l de tampón de inyección RL con lactato. Catorce horas después de la inyección, los ratones fueron sacrificados y se les extirparon las orejas. Se prepararon criosecciones transversales, que se tiñeron en primer lugar con X-gal (para la expresión de pgalactosidasa), y después con hematotoxilina y eosina. Las células positivas en transferencia de ARNm están indicadas mediante flechas y están establecidas cerca de la capa de células parenquimatosas.

Ejemplos

Materiales

1. Tampón de inyección

Se utilizaron los siguientes tampones:

- 2x solución salina tampón de fosfato (PBS)

(PBS cloruro de sodio 274 mM, cloruro de potasio 5,4 mM, disodiohidrogeno-fosfato 20 mM, dihidrógeno fosfato de potasio 4 mM, pH 7,3 a 20,8°C);

- 2x solución salina tamponada con HEPES (HBS)

(HBS: cloruro de sodio 300 mM, Hepes 20 mM, pH 7,4 a 20,8°C); y

- 1x tampón de inyección RL (sin lactato)

(cloruro de sodio 82,2 mM, cloruro de potasio 4,3 mM, cloruro de calcio 1,44 mM, si no se ha indicado otra composición y concentración).

- 1x tampón de inyección RL con lactato

(cloruro de sodio 102,7 mM, cloruro de potasio 5,4 mM, cloruro de calcio 1,8 mM, lactato de sodio 20 mM, si no se ha indicado otra composición y concentración).

- 1x tampón de inyección RL con lactato, sin cloruro de sodio

(cloruro de potasio 4,3 mM, cloruro de calcio 1,44 mM, lactato de sodio 22,4 mM, si no se ha indicado otra composición y concentración).

- 1x tampón de inyección RL con lactato, sin cloruro de potasio

(cloruro de sodio 82,2 mM, cloruro de calcio 22,4 mM, lactato de sodio 22,4 mM, si no se ha indicado otra composición y concentración).

- 1x tampón de inyección RL con lactato, sin cloruro de calcio

(cloruro de sodio 82,2 mM, cloruro de potasio 4,3 mM, lactato de sodio 22,4 mM, si no se ha indicado otra composición y concentración).

Con 2x PBS y 2x HBS, todos los componentes se disolvieron en agua y se ajustó el pH. Después se añadió pirocarbonato de dietilo (DEPC, Sigma, Schnelldorf, Alemania) hasta una concentración del 0,1% (v/v). Los tampones se incubaron durante una hora a 37°C. A continuación, los tampones se trataron en autoclave. El 1x tampón de inyección RL con lactato se preparó a partir de 20x una solución madre de las cuatro sales diferentes (cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio y lactato de sodio). El 1x tampón de inyección RL también se preparó a partir de 20x una solución madre de las tres sales diferentes (cloruro de sodio, cloruro de potasio y cloruro de calcio). En otros experimentos se suprimió el cloruro de sodio, el cloruro de potasio o el cloruro de calcio, sin compensar la baja osmolaridad. Estos tampones de inyección RL con lactato y sin NaCl, KCl o CaCl2 también se prepararon a partir de 20x una solución madre. A excepción de la solución de lactato de sodio-racemato (Fluka, Schnelldorf, Alemania), cada uno de estos componentes se trató con DEPC y se sometió a autoclave, tal como se ha descrito para 2x PBS y 2x HBS.

Todos los tampones y componentes de tampones se analizaron en cuanto a la actividad de ribonucleasa incubando 1 |jg de ARNm en 1x tampón durante más de dos horas a 37°C. En el análisis del ARNm por electroforesis en gel de formaldehído-agarosa se utilizaron tampones donde no se observó degradación. 2. Ratones

Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de conformidad con las directrices institucionales y nacionales. Se utilizaron ratones BALB/c hembra con una edad de 8 -15 semanas de Charles River (Sulzfeld, Alemania).

Antes de la inyección intradérmica, los ratones fueron anestesiados y el pabellón auditivo se trató con isopropanol. Con el fin de analizar la absorción y traducción de ARNm, después de un tiempo determinado los ratones fueron sacrificados y se les extirparon las orejas, que se rasuraron con una cuchilla de afeitar para eliminar pelos molestos.

3. Humanos

Los experimentos con humanos se llevaron a cabo con hombres sanos voluntarios que fueron informados sobre el trasfondo y las posibles consecuencias de las investigaciones y que dieron su consentimiento.

Ejemplo 1: Preparación de los ácidos nucleicos

ARNm

Se preparó ARNm "capped" (con caperuza) mediante transcripción "run-off" in vitro con ARN polimerasa (T7-Opti mRNA kits, CureVac, Tübingen, Alemania).

La secuencia codificada de este ARNm (bien p-galactosidasa de Escherichia coli [lacZ] clonada a partir de Acc. U02445, bien luciferasa de Photinus pyralis [luc], clonada a partir de Acc. U47295) se flanqueó en sus extremos 3' con una región no traducida de alfa-globina y una cola de poli A sintética (n = 70). Para los experimentos con ratones, el ARNm se extrajo con fenol/cloroformo/alcohol isoamílico y se precipitó con cloruro de litio. A continuación, el ARNm se resuspendió en agua y el rendimiento se determinó por espectrometría a 260 nm. Finalmente, el ARNm se precipitó con acetato de amonio y se resuspendió de forma estéril en agua.

ADNp

Se preparó ADN de pCMV-luc libre de endotoxinas con el EndoFree Plasmid Maxi Kit (Qiagen, Hilden, Alemania). El ADNp se precipitó con acetato de amonio y finalmente se resuspendió de forma estéril en agua. El plásmido pCMV-luc se modificó mediante inserción de un fragmento Xba I-(embotado con fragmento de Klenow) Hind III de pGL3 (Acc. U47295) en el plásmido Nsi I-(embotado con fragmento de Klenow) digerido con Hind III de pCMV-HB-S (Acc. A44171). El gen indicador del ADNp estaba bajo el control del promotor CMV. Soluciones madre

Se prepararon soluciones madre diluyendo ARNm o ADN en agua estéril y determinando la concentración y pureza por espectrometría (a 260, 280 y 320 nm).

Control de calidad

En todas las muestras de ácido nucleico, la concentración se determinó por espectrometría y la integridad se comprobó mediante electroforesis en gel de formaldehído-agarosa (ARNm) o digestión de restricción y electroforesis en gel de TBE-agarosa (ADN) (Figura 10). Además de la integridad también se analizó la capacidad de traducción de todas las muestras de ácido nucleico por electroporación de células BHK21. Para ello, 1-3 millones de células se sometieron a electroporación en 200 j l de p Bs con 10 |jg de ácido nucleico a 300 V y 150 jF en cubetas de 0,4 cm. Las células transfectadas se analizaron 8-24 horas después de la electroporación en cuanto a la expresión proteínica mediante un procedimiento de detección adecuado (tinción con X-gal o detección de luminiscencia) (Figura 10). Para los experimentos in vivo sólo se inyectaron muestras de ácido nucleico que presentaban una expresión proteínica en células BHK21 y una integridad adecuada en la electroforesis en gel.

Ejemplo 2: Preparación de las soluciones de inyección de ARN

En el caso de la HBS y la PBS, el ARNm se diluyó en 1x tampón concentrado. En el caso del tampón de inyección RL con o sin lactato y las variaciones individuales de éstos (ausencia de uno de los iones Ca2+, K+, Na+) (para las composiciones y concentraciones véase el punto Materiales, 1. Tampón de Inyección), el ARNm se diluyó en 0,8x tampón concentrado. Siempre que no se indique otra cosa se utilizaron 20 jg de ARNm en 100 j l de tampón de inyección por cada oreja de ratón. Para eliminar estructuras secundarias en el ARNm, las soluciones de inyección de ARN se calentaron a 80 °C durante 5 minutos. Después, las soluciones se dispusieron sobre hielo durante otros 5 minutos. Por último, la solución de inyección de ARN se introdujo en jeringuillas para inyección Sub-Q (Becton Dickinson, Heidelberg, Alemania). Para cada inyección se utilizó una jeringuilla individual. El ADN plásmido (ADNp) se diluyó en 1x PBS concentrada.

Ejemplo 3: Detección de la actividad de luciferasa ex vivo

Para detectar la expresión de luciferasa ex vivo se prepararon lisados tisulares. Para ello, el tejido se trituró con mortero y mano bajo nitrógeno líquido y el resto de los "grumos" se homogeneizaron con 800 j l de tampón de lisis (Tris HCl 25 mM, EDTA 2 mM, 10% (p/v) glicerina, 1% (p/v) Triton X-100 más DTT 2 mM recién añadido y PMSF 1 mM). El sobrenadante del homogeneizado se obtuvo después de centrifugarlo (10 min, 13.000 rpm, 4°C) en una minicentrífuga. Después se conservaron partes alícuotas de 110 j l de este lisado a -80°C.

Para medir la actividad de luciferasa se descongelan partes alícuotas sobre hielo y se mide la emisión de luz de 50 j l de lisado durante 15 segundos con un luminómetro (LB 9507, Berthold, Bad Wildbad, Alemania). Antes de la medición, el luminómetro suministraba automáticamente al lisado 300 j l de tampón A (glicil-glicina 25 mM, sulfato de magnesio 15 mM, ATP 5 mM recién añadido, pH 7,8) y 100 j l de tampón B (luciferina 250 jM en agua).

Para la estandarización, en todas las mediciones se utilizaron series de diluciones de proteína-luciferasa recombinante (QuantiLum®, Promega, Madison, USA). Por medio de este patrón se calculó la cantidad de moléculas de luciferasa para cada medición individual. Para cada lisado se midió dos veces la actividad de luciferasa en dos días diferentes y se calculó el valor medio de la actividad de luciferasa. El coeficiente de variación (n = 4) para la cantidad de moléculas de luciferasa era inferior al 10% para todos los lisados con actividad de luciferasa por encima del límite de detección. Este límite de detección (indicado mediante una línea gruesa con números en todos los diagramas) se calculó en base al valor medio de las mediciones solo con tampón de lisis más tres veces la desviación estándar de estos valores (n = 80).

Ejemplo 4: Detección de bioluminiscencia in vivo

Para detectar una inyección de luciferasa en animales vivos, unos ratones fueron anestesiados en un momento concreto después de la inyección de ácido nucleico. Los ratones se dividieron en tres grupos diferentes: al grupo I de ratones se le inyectaron 100 j l de tampón de inyección RL en la oreja izquierda y 20 jg de ARNm codificador de luciferasa en 100 j l de tampón de inyección RL en la oreja derecha. Al grupo II se le inyectaron tanto en la oreja izquierda como en la oreja derecha 20 |jg de ARNm codificador de luciferasa en 100 |jl de tampón de inyección RL. Al grupo III de ratones se le inyectaron 100 j l de tampón de inyección RL en la oreja derecha y 20 jg de ARNm codificador de luciferasa en 100 j l de tampón de inyección r L en la oreja izquierda. Después, a los ratones se les inyectaron vía i.p. 200 j l de 20 mg/ml de luciferina (Synchem, Kassel, Alemania) en PBS (filtrada de forma estéril). Cinco minutos después de la inyección de luciferina se recogió la emisión de luz de los ratones durante un período de 20 minutos. Para ello, los ratones fueron colocados sobre una placa precalentada (37°C) en una caja oscurecida (grupo I a la izquierda, grupo II en el centro, grupo III a la derecha). La caja estaba equipada con una Aequoria Macroscopic Imaging Kamera (Hamamatsu, Japón). La emisión de luz se representó en una imagen en falso color que tiene superpuesta una imagen en escala de grises del ratón que representa ratones con luz normal. El mismo experimento se llevó a cabo análogamente utilizando 20 jg de ARNm codificador de luciferasa en tampón de inyección RL con lactato o en tampón de inyección RL con lactato y sin cloruro de sodio, tampón de inyección RL con lactato y sin cloruro de potasio, o tampón de inyección RL con lactato y sin cloruro de calcio.

Ejemplo 5: Actividad e histología de p-galactosidasa

Unas orejas de ratón rasuradas se diseccionaron, se introdujeron en un medio que contenía el compuesto Tissue-Tek® O.C.TTm (Sakura, Zoeterwuode, Holanda) y se conservaron a -80°C. A partir de estos bloques se realizaron 20 criosecciones transversales sucesivas de 20 jm de espesor, que se colocaron sobre portaobjetos SuperFrost® plus (Langenbrinck, Emmendingen, Alemania) de modo que la distancia vertical entre dos secciones de un grupo era de aproximadamente 100 jm . Después, las secciones se secaron al aire y se conservaron a -20°C hasta su tinción. Para un primer cribado, en cuyo campo ha sido absorbido y traducido el ARNm transferido (codificador de p-galactosidasa de Escherichia coli), un grupo de secciones se tiñó con X-gal. Para ello, los portaobjetos se sometieron a temperatura ambiente y se redibujaron con un ImmEdge™ Pen (Vektor, Burlingame, USA). Después, las secciones se fijaron durante 15 minutos con 2% formalina en PBS. A continuación, los portaobjetos se lavaron 3 veces durante 2 minutos con PBS y luego se tiñeron a lo largo de la noche a 37°C en una cámara húmeda con solución de tinción X-gal (1 mg/ml de X-gal recién añadido, ferricianuro de potasio 5 mM, ferrocianuro de potasio 5 mM, cloruro de magnesio 1 mM, cloruro de sodio 15 mM, disodiohidrogenofosfato 60 mM, dihidrogenofosfato de sodio 40 mM). La tinción se concluyó lavando los portaobjetos 2 veces durante 2 minutos y tratándolos con medio Hydro-Matrix®- (Micro-Tech-Lab, Graz, Austria, diluido dos veces en agua.

Con el fin de obtener información sobre la morfología tisular, en otro grupo de secciones la tinción con X-gal se combinó con una tinción de hematoxilineosina(HE). Para ello, después de la tinción con X-gal, las secciones se lavaron 3 veces durante 2 minutos en PBS y adicionalmente 5 minutos en agua bidestilada, antes de llevar a cabo una tinción de 2 segundos de duración con Mayers Hamalaun (Merck, Darmstadt, Alemania). La tinción se desarrolló durante 10 minutos bajo con agua del grifo, antes de llevar a cabo la contratinción durante 10 minutos con 0,1% de Eosin Y (Sigma, Schnelldorf, Alemania) en agua. La tinción se detuvo mediante un breve lavado en agua bidestilada, seguido por una deshidratación con concentraciones crecientes de alcohol (2 minutos 80% etanol, 2 minutos 95% etanol, 2 minutos 100% etanol, 5 minutos 100% xileno). Por último, las secciones secas se trataron con medio Roti®-Histokitt (Roth, Karlsruhe, Alemania).

Para comprobar si las células diana transfectadas con el ARNm eran células presentadoras de antígenos se llevó a cabo una tinción doble para moléculas de MHC clase II (expresadas mediante APC) y transferencia de ARNm (en relación con la expresión de p-galactosidasa). Después se realizó tanto una detección inmunohistoquímica como una detección inmunofluorescente de las moléculas MHC clase II. En los dos protocolos, entre todos los pasos las secciones se lavaron 3 veces durante 2 minutos con PBS. Para el procedimiento inmunohistoquímico, las secciones se fijaron con 1% (p/v) de formalina (Fluka) en PBS. Después se eliminaron los lípidos mediante 30 segundos de incubación en acetona pura. Inmediatamente después se llevó a cabo un bloqueo durante 30 minutos a temperatura ambiente con un 4% de sangre de cabra (Vektor Laboratories Inc., Burlingame, CA) y 50 mg/ml de Avidin D (Vektor Laboratories Inc., Burlingame, CA) en PBS. Los lados de unión de biotina restantes se bloquearon con 50 jg/m l de Biotin (AppliChem, Darmstadt, Alemania) y al mismo tiempo se llevó a cabo una tinción para moléculas MHC clase II con el anticuerpo monoclonal 2G9 (Becton Dickinson, Heidelberg, Alemania) o con el anticuerpo de control de isotipo adecuado (IgG de rata 2a, R35-95, Becton Dickinson, Heidelberg, Alemania), en cada caso diluido a 1 jg/m l (todos en PBS). Después, las secciones se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente con vector de IgG de cabra/antirrata biotinilada (3 jg/m l) y un 2% de suero de ratón (CCPro, Neustadt, Alemania) en PBS. A continuación se añadió complejo ^a B^c (1:100 de los reactivos A y B en PBS (Vektor Laboratories Inc., Burlingame, CA) durante 30 minutos a temperatura ambiente. La tinción con MHC clase II se completó mediante detección con solución de sustrato de 3-amino-9-etilcarbazol (AEC, Sigma) (0,5 mg/ml AEC, 0,015% de peróxido de hidrógeno, acetato de sodio 50 mM, pH 5,5) recién preparado y filtrado a través de 0,45 jm . La reacción de sustrato se interrumpió con dos lavados de 5 minutos con agua y tres lavados de 5 minutos con PBS. A continuación, se llevó a cabo una tinción con X-gal, tal como se describe más arriba.

Para la detección inmunofluorescente se utilizó un protocolo de tinción similar. Después del paso de acetona, las secciones se bloquearon durante 50 minutos a temperatura ambiente en tampón de bloqueo (1% de seroalbúmina bovina en PBS). Las secciones se incubaron después durante 40 minutos con anticuerpos primarios (2G9 o anticuerpos de control de isotipo), diluidos a 1 pg/ml en tampón de bloqueo. Luego se llevó a cabo una incubación durante 40 minutos a temperatura ambiente con Alexa Fluor 546 IgG de cabra/antirrata (1:400; Molecular Probes, Leiden, Holanda) en tampón de bloqueo. Por último, se llevó a cabo una tinción con magenta-gal. Para ello, el X-gal de la solución de tinción se sustituyó por 0,1 mg/ml de magenta-gal (Peqlab, Erlangen, Alemania).

Las secciones se analizaron con un microscopio Axioplan 2 de Zeiss (Oberkochen, Alemania), equipado con una cámara Axiocam HRc y el software Axiovision 4.0. Los colores y el contraste de las fotografías se ajustaron de forma lineal.

Ejemplo 6: Transferencia y traducción de ARN en humanos

Este experimento se llevó a cabo con hombres sanos voluntarios. Los sitios de inyección se rasuraron, se desinfectaron y se trataron con RNaseZap (Ambion, Austin, USA). Después, en una carga se inyectaron 120 pg de ARNm en 0,8x tampón de inyección RL en un volumen total de 200 pl. En otras cargas análogas, en lugar de tampón de inyección RL se inyectaron:

- tampón de inyección RL con lactato, sin cloruro de sodio;

- tampón de inyección RL con lactato, sin cloruro de potasio; y

- tampón de inyección RL con lactato, sin cloruro de calcio.

Quince horas después de la inyección se realizaron biopsias con un diámetro de 4 mm (troqueladas) bajo anestesia local. Las biopsias se sometieron a congelación ultrarrápida en nitrógeno líquido y se prepararon tal como se describe más arriba (Ejemplo 3). Las biopsias molidas se resuspendieron en 600 pl de tampón de lisis.

Evaluación estadística

Los valores medios de dos grupos diferentes se compararon con el llamado "nonparametric Mann-Whitney rank sum test" (prueba de suma de rangos de Mann-Whitney no paramétrica). Un valor p < 0,05 se consideró como diferencia significativa y se representa en los diagramas.

Ejemplo 7: Observaciones con respecto a los diferentes procedimientos de tinción realizados

Para identificar el tipo de célula que absorbe y expresa el ARNm in vivo se utilizó un procedimiento histológico que posibilita la detección de la transferencia de ARNm junto con una tinción específica de tipo de célula.

Dado que la transferencia de ARNm no se pudo detectar con sondas fluorescentes, se llevó a cabo un procedimiento en el que se utilizó el ARNm codificador de p-galactosidasa de Escherichia coli en combinación con diferentes colorantes índigo (X-gal o magenta-gal).

1. Características especiales del sistema de detección de p-galactosidasa

Con el fin de asegurar que todas las células se encontraban en una sola capa para el procedimiento de tinción con índigo, se prepararon secciones finas de la oreja de ratón. La preparación de estas secciones resultó muy difícil teniendo en cuenta la morfología del pabellón auditivo de los ratones (una capa fina con un grosor de aproximadamente 0,5-1 mm), el hecho de que sólo se pueden utilizar criosecciones (la p-galactosidasa se inactiva por calor durante algunos pasos necesarios para preparar secciones de parafina), y el requisito de secciones y a ser posible numerosas subsecciones de alta calidad. No obstante, fue posible preparar varios grupos de secciones de buena calidad con un espesor de 20 pm. Se utilizaron dos colorantes diferentes para detectar la actividad de p-galactosidasa. En el caso del X-gal (las células positivas se teñían de verde azulado) se obtuvieron resultados con un mejor contraste que con magenta-gal (las células positivas se teñían de violeta). Sin embargo, en el caso de la tinción con X-gal se podían observar al mismo tiempo fuertes coloraciones de fondo no específicas, por ejemplo provocadas por folículos pilosos. No obstante, existía una diferencia clara con respecto a la transferencia de ARNm. En el caso del magenta-gal no se observó ninguna coloración de fondo no específica.

2. Requisitos para una tinción con índigo y una inmunotinción combinadas

La combinación de una tinción de transferencia de ARNm (colorante índigo) y una tinción marcadora específica de células (anticuerpo específico) requirió varias adaptaciones en relación con el agente fijador y el orden de las tinciones combinadas (la tinción con índigo incluyó 14 horas de incubación a 37°C). Los mejores resultados para la tinción con anticuerpos (contra moléculas MHC II) se obtuvieron realizando primero una fijación con acetona y la tinción con anticuerpos. En cambio, los mejores resultados para la actividad de p-galactosidasa se obtuvieron realizando primero una fijación con una mezcla de formaldehído y glutaraldehído y la tinción con índigo. Teniendo en cuenta estos hechos se eligió el siguiente procedimiento: fijación con formaldehído, pero sin glutaraldehído y la tinción con anticuerpos. El glutaraldehído tuvo que omitirse porque aumenta drásticamente la autofluorescencia del tejido, mientras que solo tenía un ligero efecto, si es que tenía alguno, en la calidad de la tinción con índigo. La fijación con formaldehído se utilizó por varios motivos:

1. la morfología del tejido se protegía mejor de este modo que con acetona;

2. una tinción nítida y fuerte requiere una fijación con formaldehído; y

3. no obstante, la calidad de la tinción con anticuerpos anti MHC II era aceptable con formaldehído.

Con el fin de eliminar lípidos y grasas se llevó a cabo una breve incubación en acetona pura. Esto posibilitó una mayor calidad (pocas o ninguna burbuja de aire) con el medio hidrosoluble utilizado. Por último, sólo se obtuvieron tinciones con anticuerpos de buena calidad cuando dicha tinción se realizó en primer lugar. El orden de tinción (fijación con formaldehído) solo tuvo un ligero efecto en la calidad de la tinción con índigo.

3. Compatibilidad de colorantes en las tinciones con índigo e inmunotinciones combinadas

La combinación de dos tinciones diferentes no sólo requería la compatibilidad de los diferentes pasos de los dos protocolos, sino también la compatibilidad de las sondas utilizadas para la detección. En principio es posible realizar una inmunotinción con colorantes precipitantes (sonda enzimática) o con colorantes fluorescentes (sonda marcada). Con el fin de combinar la tinción con índigo con un colorante precipitante se utilizan X-gal y AEC. En esta tinción, las células doblemente positivas aparecen en negro (Figura 15). En este contexto puede resultar difícil la diferenciación de células positivas individuales con una tinción intensa. Por ello era preferible la combinación de magenta-gal con el colorante fluorescente Alexa Fluor 546. La utilización de magenta-gal en lugar de X-gal era preferible por dos motivos:

1. la intensidad de la tinción con magenta-gal era generalmente más débil (incluso cuando el colorante se añadía en cantidades saturadas);

2. el color de las células positivas en magenta-gal coincidía más con la longitud de onda de emisión del colorante fluorescente Alexa Fluor 546.

Los dos factores reducen al mínimo la extinción de la señal fluorescente de Alexa Fluor 546. Esta combinación de colorantes posibilitaba realmente la detección de las dos señales (Figura 13), al menos cuando la tinción con índigo no era demasiado fuerte (esto ocurría generalmente en el caso de las células positivas en transferencia de ARNm en las secciones).

Lista Bibliográfica

1. Ulmer J.B., Curr. Opin. DrugDiscov. Devel., 2001, 4:192-197

2. J. A. Wolff y col., Science 247, 1465-1468 (1990).

3. H. L. Robinson, L. A. Hunt, R. G. Webster, Vaccine 11, 957-960 (1993).

4. J. B. Ulmer y col., Science 259, 1745-1749 (1993).

5. J. A. Wolff y col., Science 247, 1465-1468 (1990).

6. D. Boczkowski, S. K. Nair, D. Snyder, E. Gilboa, J. Exp. Med. 184, 465-472 (1996).

7. J. P. Carralot y col., Cell Mol. Life Sci. (2004).

8. R. M. Conry y col., Cancer Res. 55, 1397-1400 (1995).

9. R. D. Granstein, W. Ding, H. Ozawa, J Invest Dermatol 114, 632-636 (2000).

10. I. Hoerr, R. Obst, H. G. Rammensee, G. Jung, Eur. J Immunol. 30, 1-7 (2000).

11. J. Donnelly, K. Berry, J. B. Ulmer, Int J Parasitol. 33, 457-467 (2003).

12. D. M. Klinman y col., Springer Semin. Immunopathol. 19, 245-256 (1997).

13. J.-P. Carralot y col., CMLS Cell. Mol. Life Sci. 61,2418-2424 (2004).

14. P. Forg, P. von Hoegen, W. Dalemans, V. Schirrmacher, Gene Ther. 5, 789-797 (1998).

Claims (16)

1. REIVINDICACIONES

   i. Utilización de ARNm y un tampón de inyección acuoso que contiene una sal de sodio, una sal de calcio y una sal de potasio, para la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades cancerosas y tumorales, alergias, enfermedades autoinmunes, infecciones virales y/o bacterianas, para la terapia génica o para la vacunación, en particular la vacunación antiviral, para la prevención de las enfermedades arriba indicadas, donde el medicamento contiene una solución de inyección de ARNm para aumentar la transferencia de ARNm a un organismo huésped y/o la traducción de ARNm en un organismo huésped, y donde la solución de inyección de ARNm se administra vía intradérmica, intraepitelial, intraperitoneal o intranodal.
2. 2. Utilización según la reivindicación 1, caracterizada porque el tampón de inyección contiene sales con aniones seleccionados entre el grupo consistente en cloruros, yoduros, bromuros, hidróxidos, carbonatos, bicarbonatos o sulfatos, en particular el tampón de inyección contiene como sales NaCl, CaCl² y KCl.
3. 3. Utilización según la reivindicación 2, caracterizada porque el tampón de inyección contiene cloruro de sodio al menos 50 mM (NaCl), cloruro de calcio (CaCh) al menos 0,01 mM y cloruro de potasio (KCl) al menos 3 mM.
4. 4. Utilización según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque el tampón de inyección contiene cloruro de sodio (NaCl) entre 50 mM y 800 mM, preferentemente entre 60 mM y 500 mM, de forma especialmente preferente entre 70 mM y 250 mM y de forma particularmente preferente entre 60 mM y 110 mM, cloruro de calcio (CaCh) entre 0,01 mM y 100 mM, preferentemente entre 0,5 mM y 80 mM y de forma especialmente preferente entre 1,5 mM y 40 mM, y cloruro de potasio (KCl) entre 3 mM y 500 mM, preferentemente entre 4 mM y 300 mM, de forma especialmente preferente entre 5 mM y 200 mM.
5. 5. Utilización según una de las reivindicaciones 1 - 4, caracterizada porque el tampón de inyección contiene un sistema tampón.
6. 6. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 5, caracterizada porque el ARNm es ARNm desnudo o ARNm complejado con un policatión.
7. 7. Utilización según la reivindicación 6, caracterizada porque el ARNm está complejado con protamina.
8. 8. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 6 o 7, caracterizada porque el ARNm presenta al menos una modificación natural o no natural, seleccionándose esta modificación en particular entre el grupo consistente en el aumento del contenido de G/C en la región codificadora del ARNm sin variación de la secuencia de aminoácidos codificada, la introducción de al menos un análogo de ribonucleótido, la eliminación de secuencias desestabilizadoras en la secuencia WT o el aumento del contenido de A/U en la región del sitio de unión de ribosomas.
9. 9. Solución de inyección de ARNm para aumentar la transferencia de ARNm a un organismo huésped y/o la traducción de ARNm en un organismo huésped, que contiene ARNm y un tampón de inyección acuoso que contiene una sal de sodio, una sal de calcio y una sal de potasio, para su uso en el tratamiento y/o la prevención de enfermedades cancerosas y tumorales, alergias, enfermedades autoinmunes, infecciones virales y/o bacterianas, para la terapia o la vacunación génica, en particular la vacunación antiviral, administrándose la solución de inyección de ARNm vía intradérmica, intraepitelial, intraperitoneal o intranodal.
10. 10. Solución de inyección de ARNm para su uso según la reivindicación 9, caracterizada porque el tampón de inyección contiene sales con aniones seleccionados entre el grupo consistente en cloruros, yoduros, bromuros, hidróxidos, carbonatos, bicarbonatos o sulfatos, en particular el tampón de inyección contiene como sales NaCl, CaCh y KCl.
11. 11. Solución de inyección de ARNm para su uso según la reivindicación 10, caracterizada porque el tampón de inyección contiene cloruro de sodio al menos 50 mM (NaCl), cloruro de calcio (CaCh) al menos 0,01 mM y cloruro de potasio (KCl) al menos 3 mM.
12. 12. Solución de inyección de ARNm para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, caracterizada porque el tampón de inyección contiene cloruro de sodio (NaCl) entre 50 mM y 800 mM, preferentemente entre 60 mM y 500 mM, de forma especialmente preferente entre 70 mM y 250 mM y de forma particularmente preferente entre 60 mM y 110 mM, cloruro de calcio (CaCl²) entre 0,01 mM y 100 mM, preferentemente entre 0,5 mM y 80 mM y de forma especialmente preferente entre 1,5 mM y 40 mM, y cloruro de potasio (KCl) entre 3 mM y 500 mM, preferentemente entre 4 mM y 300 mM, de forma especialmente preferente entre 5 mM y 200 mM.
13. 13. Solución de inyección de ARNm para su uso según una de las reivindicaciones 9 a 12, caracterizada porque el ARNm es ARNm desnudo o ARNm complejado con un policatión.
14. 14. Solución de inyección de ARNm para su uso según la reivindicación 13, caracterizada porque el ARNm está complejado con protamina.
15. 15. Solución de inyección de ARNm para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 13 o 14, caracterizada porque el ARNm presenta al menos una modificación natural o no natural, seleccionándose esta modificación en particular entre el grupo consistente en el aumento del contenido de G/C en la región codificadora del ARNm sin variación de la secuencia de aminoácidos codificada, la introducción de al menos un análogo de ribonucleótido, la eliminación de secuencias desestabilizadoras en la secuencia WT o el aumento del contenido de A/U en la región del sitio de unión de ribosomas.
16. 16. Solución de inyección de ARNm para su uso según la reivindicación 9, caracterizada porque la enfermedad cancerosa o tumoral se selecciona entre el grupo consistente en melanoma, melanoma de piel, carcinoma, como carcinoma de colon, carcinoma de pulmón, adenocarcinoma, carcinoma de próstata, carcinoma de esófago, carcinoma de mama, carcinoma de riñón, sarcoma, mieloma, leucemia, en particular AML (leucemia mieloide aguda), glioma, linfomas y blastomas.