ES2693380T3

ES2693380T3 - Nuevo método para concentrar el factor de von Willebrand o complejos de este

Info

Publication number: ES2693380T3
Application number: ES14859399.9T
Authority: ES
Inventors: Holger Lind; Sonja BECKMANN-SCHELD; Katharina PROPP
Original assignee: CSL Ltd
Current assignee: CSL Ltd
Priority date: 2013-11-08
Filing date: 2014-11-07
Publication date: 2018-12-11
Anticipated expiration: 2034-11-07
Also published as: WO2015066769A1; US20160289267A1; HK1224306A1; EP3066119B1; AU2014346343A1; US10246485B2; CN105705516B; AU2014346343B2; EP3066119A4; CN105705516A; DK3066119T3; EP3066119A1

Abstract

Un método para concentrar el Factor de von Willebrand (VWF) a partir de una solución acuosa que comprende los pasos de (a) precipitar el VWF proporcionando iones calcio e iones fosfato a la solución acuosa, (b) separar el precipitado formado en el paso (a) de la solución acuosa, (c) resolubilizar el precipitado aislado en el paso (b) por medio de una solución acuosa que comprende un agente de formación de complejos con calcio.

Description

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DESCRIPCION

Nuevo metodo para concentrar el factor de von Willebrand o complejos de este Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a un metodo para concentrar el factor de von Willebrand (VWF) a partir de una solucion acuosa que comprende la precipitacion del factor VWF proporcionando iones calcio e iones fosfato y la posterior resolubilizacion del VWF por medio de una solucion acuosa que comprende un compuesto que forma complejos con calcio.

Antecedentes de la invencion

Uno de los trastornos hemorragicos mas frecuentes es la enfermedad de von Willebrand (EvW), que esta provocada por la ausencia del factor de von Willebrand (VWF), niveles reducidos de VWF o la expresion de variantes de VWF con defectos funcionales.

El VWF es una de las protemas plasmaticas mas conocidas. El VWF es una glicoprotema adhesiva multimerica presente en el plasma de los mairnferos, que tiene multiples funciones fisiologicas. Durante la hemostasis primaria, el VWF actua como un mediador entre receptores espedficos sobre la superficie de las plaquetas y componentes de la matriz extracelular tales como el colageno. Ademas, el VWF sirve como portador y protema estabilizante para el Factor VIII procoagulante. El VWF se sintetiza en las celulas endoteliales y los megacariocitos como una molecula precursora de 2813 aminoacidos. La secuencia de aminoacidos y la secuencia de ADNc del VWF de origen natural se describen en Collins et al., 1987, Proc Natl. Acad. Sci. USA 84;4393-4397. El polipeptido precursor, pre-pro-VWF, consta de un peptido senal de 22 residuos, un propeptido de 741 residuos y el polipeptido de 2050 residuos que se encuentra en el VWF plasmatico maduro (Fischer et al., FEBS Lett. 351: 345-348, 1994). Despues de la escision del peptido senal en el retfculo endoplasmatico, se forma un puente disulfuro C terminal entre dos monomeros de VWF. Durante el transporte adicional a traves de la ruta de secrecion se anaden 12 cadenas laterales de carbohidratos unidas a N y 10 unidas a O. Cabe destacar que los dfmeros de VWF se multimerizan mediante puentes disulfuro N terminales y que el propeptido de 741 aminoacidos de longitud es eliminado mediante escision por la enzima PACE/furina en el aparato de Golgi tardfo. El propeptido, asf como los multfmeros de VWF de alto peso molecular (VWF-HMWM) se almacenan en los cuerpos de Weibel-Palade de las celulas endoteliales o en los granulos a de las plaquetas.

Una vez secretada en el plasma, la proteasa ADAMTS13 escinde el VWF dentro del dominio A1 del VWF. Por tanto, el VWF plasmatico consta de toda una gama de multimeros que vana desde dfmeros unicos de 500 kDa a multfmeros que constan de hasta mas de 20 dfmeros de un peso molecular superior a 10 000 kDa. El VWF-HMWM tiene de este modo la actividad hemostatica mas intensa, la cual se puede medir en actividad del cofactor de ristocetina (VWF:RCo). Cuanto mayor sea la relacion de VWF:RCo/antigeno de VWF, mayor sera la cantidad relativa de multimeros de alto peso molecular.

Los defectos en el VWF provocan la EvW 0, que se caracteriza por un fenotipo hemorragico mas o menos pronunciado. La EvW tipo 3 es la forma mas grave en la que el VWF esta completamente ausente, la EvW tipo 1 se relaciona con una perdida cuantitativa de WVF y su fenotipo puede ser muy leve. La EvW tipo 2 se refiere a defectos cualitativos del VWF y puede ser tan grave como la EvW tipo 3. La EvW tipo 2 tiene muchas subformas, algunas de las cuales estan asociadas con la perdida o la disminucion de multfmeros de alto peso molecular. La EvW tipo 2a se caracteriza por una perdida de multfmeros tanto grandes como intermedios. La EvW tipo 2B se caracteriza por una perdida de los multimeros de mas alto peso molecular.

La EvW es el trastorno hemorragico que se hereda de forma mas frecuente en seres humanos y se puede tratar mediante terapia de reemplazo con concentrados que contienen VWF de origen plasmatico o recombinante. El VWF se puede preparar a partir de plasma humano, por ejemplo, tal como se describe en el documento EP 0503991. El documento EP 0784632 describe un metodo para aislar VWF recombinante.

En el plasma el Factor VIII se une con una gran afinidad al VWF, donde la union protege al Factor VIII de un catabolismo prematuro y el VWF desempena, por tanto, ademas de su funcion en la hemostasis primaria, una funcion crucial para regular los niveles plasmaticos de Factor VIII y, en consecuencia, tambien es un factor central para controlar la hemostasis secundaria.

Se utilizan complejos de Factor VIII/VWF o VWF de origen plasmatico o recombinante para obtener preparados farmaceuticos con el fin de tratar la EvW y tambien se han utilizado complejos de Factor VIII/VWF para tratar la indicacion medica de la hemofilia A, enfermedad en la que el Factor VIII esta ausente o solamente disponible en concentraciones reducidas o como una variante del Factor VIII con funcionalidad reducida.

A fin de obtener dichos preparados farmaceuticos existe una necesidad de metodos de purificacion eficaces y que

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se puedan escalar para el VWF.

Debido a su enorme tamano, los mulffmeros de VWF son especialmente sensibles a la tension de cizalla. Ya a una tension de cizalla superior a 2000 s-1, los mulffmeros de VWF comienzan a desplegarse y el VWF desplegado es entonces proclive a la degradacion y la desnaturalizacion. Los metodos comunes para concentrar protemas terapeuticas en los procesos de fabricacion industriales como la ultrafiltracion no son adecuados para concentrar VWF en la fabricacion a escala industrial, porque ejercen demasiada tension de cizalla. El documento WO 2010/025278 ofrece una solucion tecnica para lograr la concentracion del VWF sin comprometer su actividad espedfica que utiliza membranas de fibra hueca, pero existe la necesidad de identificar tecnologfas alternativas para concentrar el VWF a partir de soluciones que comprenden VWF que sean mas sencillas, mas asequibles y que se puedan escalar, a la vez que preservan la integridad estructural y la actividad biologica de esta macromolecula compleja.

La precipitacion de protemas es una tecnica conocida en la tecnica anterior. Sin embargo, para cada protema concreta, se deben identificar el agente de precipitacion y los parametros de precipitacion optimos. Una manera en la que se puede conseguir la precipitacion es mediante procedimientos de precipitacion salina (por ejemplo, mediante el uso de sulfato amonico), donde los componentes ionicos de la sal utilizada para la precipitacion compiten con la protema diana por las moleculas de agua y si la concentracion de los iones salinos es suficientemente elevada, la protema diana llega a estar insuficientemente hidratada para mantenerse en solucion, lo que da lugar a la precipitacion de la protema diana. Sin embargo, los precipitados obtenidos mediante procedimientos de precipitacion salina son a menudo diffciles de resolubilizar. Por lo tanto, existe la necesidad de encontrar metodos para precipitar el VWF que permitan una resolubilizacion facil y suave, a la vez que preservan la integridad estructural y la actividad biologica del VWF.

La precipitacion tambien se lleva a cabo a menudo como coprecipitacion, donde el agente precipitante tambien precipita con la protema de interes. Dependiendo de la naturaleza del agente precipitante, la protema diana se debe purificar posteriormente del agente precipitante, de modo que la protema diana no este contaminada con el agente precipitante. Los agentes precipitantes potentes como los polielectrolitos sinteticos pueden ser muy diffciles o lentos de eliminar y liberar de la protema diana.

La precipitacion del VWF con una combinacion de glicina y cloruro sodico tambien se ha descrito en la tecnica anterior (documento EP1405863). Sin embargo, se requieren cantidades elevadas de sales y es diffcil evitar la precipitacion no deseada de otros componentes de la solucion aparte de la protema diana. Si, por ejemplo, la solucion de VWF contiene aun un tensioactivo como acido pluronico que se utiliza normalmente en los medios de cultivo celular, las condiciones de precipitacion descritas en el documento EP1405863 pueden dar lugar a la coprecipitacion de acido pluronico que puede incluso comprender la precipitacion de la protema diana.

El documento US 5 679 776 describe el uso de cloruro barico 80 mM para eliminar un complejo de protrombina de una solucion de VWF en forma de complejo con el Factor VIII mediante la precipitacion del complejo de protrombina, pero no del complejo VWF/Factor VIII. Se ha descubierto recientemente de forma sorprendente que se puede utilizar una combinacion de iones calcio, que es, como el bario, un metal alcalinoterreo, con iones fosfato para precipitar el VWF con un rendimiento elevado, donde el precipitado se puede resolubilizar posteriormente en condiciones suaves con un agente de formacion de complejos con calcio, a la vez que se mantiene la actividad biologica del VWF.

Descripcion de la invencion

Es un objetivo de esta invencion proporcionar un metodo para concentrar VWF a partir de una solucion acuosa que comprende los pasos de

(a) precipitar VWF proporcionando de iones calcio e iones fosfato a la solucion acuosa,

(b) separar el precipitado formado en el paso (a) de la solucion acuosa,

(c) resolubilizar el precipitado aislado en el paso (b) por medio de una solucion acuosa que comprende un agente de formacion de complejos con calcio.

Descripcion detallada de la invencion

La invencion se refiere a un metodo para concentrar VWF mediante la precipitacion de VWF a partir de una solucion acuosa poniendo en contacto dicha solucion acuosa con iones calcio e iones fosfato, lo que da lugar a la precipitacion del VWF y el fosfato de calcio. El precipitado que comprende el VWF se separa de la solucion acuosa y se resolubiliza en condiciones suaves que mantienen la actividad biologica del VWF mediante la adicion de una solucion acuosa al precipitado que comprende un agente de formacion de complejos con calcio.

En realizaciones preferidas, la invencion se refiere a

un metodo para concentrar el Factor de von Willebrand (VWF) a partir de una solucion acuosa, que comprende los

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pasos de

(a) precipitar el VWF proporcionando iones calcio e iones fosfato a la solucion acuosa,

(b) separar el precipitado formado en el paso (a) de la solucion acuosa,

En realizaciones preferidas de la invencion, se utiliza una concentracion de los iones fosfato de entre al menos 1 mM y hasta por debajo de 10 mM y una concentracion de los iones calcio de al menos 16 mM.

En otras realizaciones preferidas de la invencion, se utiliza una concentracion de los iones fosfato de al menos 10 mM y una concentracion de los iones calcio de al menos 10 mM.

En una realizacion preferida, la concentracion de los iones fosfato es de 5 mM y la concentracion de los iones calcio se selecciona a partir de un intervalo de entre 50 mM y 60 mM que incluye los extremos de ese intervalo.

Se pueden utilizar multiples combinaciones de ciertas concentraciones de fosfato junto con una cierta concentracion de calcio. Por ejemplo, y sin limitar la invencion, se pueden utilizar las siguientes combinaciones de concentraciones.

Una concentracion 1 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 16 mM/L de iones calcio.

Una concentracion 2 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 16 mM/L de iones calcio.

Una concentracion 3 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 16 mM/L de iones calcio.

Una concentracion 4 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 16 mM/L de iones calcio.

Una concentracion 5 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 16 mM/L de iones calcio.

Una concentracion 6 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 16 mM/L de iones calcio.

Una concentracion 7 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 16 mM/L de iones calcio.

Una concentracion 8 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 16 mM/L de iones calcio.

Una concentracion 9 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 16 mM/L de iones calcio.

Una concentracion 9.5 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 16 mM/L de iones calcio.

Una concentracion 9.9 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 16 mM/L de iones calcio.

Una concentracion 1 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 20 mM/L de iones calcio.

Una concentracion 2 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 20 mM/L de iones calcio.

Una concentracion 3 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 20 mM/L de iones calcio.

Una concentracion 4 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 20 mM/L de iones calcio.

Una concentracion 5 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 20 mM/L de iones calcio.

Una concentracion 6 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 20 mM/L de iones calcio.

Una concentracion 7 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 20 mM/L de iones calcio.

Una concentracion 8 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 20 mM/L de iones calcio.

Una concentracion 9 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 20 mM/L de iones calcio.

Una concentracion 9.5 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 20 mM/L de iones calcio. Una concentracion 9.9 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 20 mM/L de iones calcio.

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Una concentracion Una concentracion Una concentracion Una concentracion Una concentracion Una concentracion Una concentracion Una concentracion Una concentracion Una concentracion Una concentracion

1 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 30 mM/L de iones calcio.

2 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 30 mM/L de iones calcio.

3 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 30 mM/L de iones calcio.

4 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 30 mM/L de iones calcio.

5 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 30 mM/L de iones calcio.

6 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 30 mM/L de iones calcio.

7 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 30 mM/L de iones calcio.

8 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 30 mM/L de iones calcio.

9 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 30 mM/L de iones calcio.

9.5 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 30 mM/L de iones calcio.

9.9 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 30 mM/L de iones calcio.

1 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 40 mM/L de iones calcio.

2 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 40 mM/L de iones calcio.

3 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 40 mM/L de iones calcio.

4 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 40 mM/L de iones calcio.

5 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 40 mM/L de iones calcio.

6 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 40 mM/L de iones calcio.

7 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 40 mM/L de iones calcio.

8 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 40 mM/L de iones calcio.

9 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 40 mM/L de iones calcio.

10 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 40 mM/L de iones calcio. 10 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 40 mM/L de iones calcio.

1 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 50 mM/L de iones calcio.

2 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 50 mM/L de iones calcio.

3 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 50 mM/L de iones calcio.

4 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 50 mM/L de iones calcio.

5 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 50 mM/L de iones calcio.

6 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 50 mM/L de iones calcio.

7 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 50 mM/L de iones calcio.

8 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 50 mM/L de iones calcio.

9 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 50 mM/L de iones calcio.

9.5 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 50 mM/L de iones calcio.

9.9 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 50 mM/L de iones calcio.

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c 3 Q): concentracion 1 mM/L de iones 0 (/) oT 1 i o se puede combinar con una concentracion o CD mM/L de iones O Q) O o'

Una: concentracion 2 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 60 mM/L de iones calcio

c 3 Q): concentracion 3 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 60 mM/L de iones calcio

c 3 Q): concentracion 4 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 60 mM/L de iones calcio

Una: concentracion 5 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 60 mM/L de iones calcio

Una: concentracion 6 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 60 mM/L de iones calcio

c 3 Q): concentracion 7 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 60 mM/L de iones calcio

Una: concentracion 8 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 60 mM/L de iones calcio

Una: concentracion 9 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 60 mM/L de iones calcio

Una concentracion 9.5 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 60 mM/L de iones calcio. Una concentracion 9.9 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 60 mM/L de iones calcio. o

Una concentracion 1 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 80 mM/L de iones calcio.

Una concentracion 2 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 80 mM/L de iones calcio.

Una concentracion 3 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 80 mM/L de iones calcio.

Una concentracion 4 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 80 mM/L de iones calcio.

Una concentracion 5 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 80 mM/L de iones calcio.

Una concentracion 6 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 80 mM/L de iones calcio.

Una concentracion 7 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 80 mM/L de iones calcio.

Una concentracion 8 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 80 mM/L de iones calcio.

Una concentracion 9 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 80 mM/L de iones calcio.

Una concentracion 9.5 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 80 mM/L de iones calcio. Una concentracion 9.9 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 80 mM/L de iones calcio. o

Una concentracion 1 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 100 mM/L de iones calcio.

Una concentracion 2 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 100 mM/L de iones calcio.

Una concentracion 3 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 100 mM/L de iones calcio.

Una concentracion 4 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 100 mM/L de iones calcio.

Una concentracion 5 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 100 mM/L de iones calcio.

Una concentracion 6 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 100 mM/L de iones calcio.

Una concentracion 7 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 100 mM/L de iones calcio.

Una concentracion 8 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 100 mM/L de iones calcio.

Una concentracion 9 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 100 mM/L de iones calcio.

Una concentracion 9.5 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 100 mM/L de iones calcio.

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Una concentracion 9.9 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 100 mM/L de iones calcio. o

Una concentracion 1 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 200 mM/L de iones calcio.

Una concentracion 2 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 200 mM/L de iones calcio.

Una concentracion 3 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 200 mM/L de iones calcio.

Una concentracion 4 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 200 mM/L de iones calcio.

Una concentracion 5 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 200 mM/L de iones calcio.

Una concentracion 6 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 200 mM/L de iones calcio.

Una concentracion 7 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 200 mM/L de iones calcio.

Una concentracion 8 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 200 mM/L de iones calcio.

Una concentracion 9 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 200 mM/L de iones calcio.

Una concentracion 9.5 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 200 mM/L de iones calcio. Una concentracion 9.9 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 200 mM/L de iones calcio.

Una concentracion 1 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 500 mM/L de iones calcio.

Una concentracion 2 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 500 mM/L de iones calcio.

Una concentracion 3 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 500 mM/L de iones calcio.

Una concentracion 4 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 500 mM/L de iones calcio.

Una concentracion 5 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 500 mM/L de iones calcio.

Una concentracion 6 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 500 mM/L de iones calcio.

Una concentracion 7 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 500 mM/L de iones calcio.

Una concentracion 8 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 500 mM/L de iones calcio.

Una concentracion 9 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 500 mM/L de iones calcio.

Una concentracion 9.5 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 500 mM/L de iones calcio.

Una concentracion 9.9 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 500 mM/L de iones calcio.

En otras realizaciones de la invencion, por ejemplo, y sin limitar la invencion, se pueden utilizar las siguientes combinaciones de concentraciones:

Una concentracion 10 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 10 mM/L de iones calcio.

Una concentracion 10 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 15 mM/L de iones calcio.

Una concentracion 10 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 20 mM/L de iones calcio.

Una concentracion 10 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 25 mM/L de iones calcio.

Una concentracion 10 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 30 mM/L de iones calcio.

Una concentracion 10 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 35 mM/L de iones calcio.

Una concentracion 10 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 40 mM/L de iones calcio.

Una concentracion 10 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 45 mM/L de iones calcio.

Una concentracion 10 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 50 mM/L de iones calcio.

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c Q): concentracion 10 mM/L de iones 0 c/) oT 1 i o se puede combinar con una concentracion 60 mM/L de iones calcio.

c Q): concentracion 10 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 70 mM/L de iones calcio.

c Q): concentracion 10 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 80 mM/L de iones calcio.

c Q): concentracion 10 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 90 mM/L de iones calcio.

c Q): concentracion 10 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 100 mM/L de iones calcio

c Q): concentracion 10 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 125 mM/L de iones calcio

c Q): concentracion 10 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 150 mM/L de iones calcio

c Q): concentracion 10 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 175 mM/L de iones calcio

c Q): concentracion 10 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 200 mM/L de iones calcio

c Q): concentracion 10 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 300 mM/L de iones calcio

c Q): concentracion 10 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 400 mM/L de iones calcio

c Q): concentracion 10 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 500 mM/L de iones calcio

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c Q): concentracion cn mM/L de iones 0 (/) oT 1 i o se puede combinar con una concentracion 10 mM/L de iones calcio.

Una: concentracion 15 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 15 mM/L de iones calcio.

Una: concentracion 15 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 20 mM/L de iones calcio.

Una: concentracion 15 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 25 mM/L de iones calcio.

Una: concentracion 15 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 30 mM/L de iones calcio.

Una: concentracion 15 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 35 mM/L de iones calcio.

c Q): concentracion 15 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 40 mM/L de iones calcio.

c Q): concentracion 15 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 45 mM/L de iones calcio.

c Q): concentracion 15 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 50 mM/L de iones calcio.

Una: concentracion 15 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 60 mM/L de iones calcio.

c Q): concentracion 15 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 70 mM/L de iones calcio.

Una: concentracion 15 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 80 mM/L de iones calcio.

c Q): concentracion 15 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 90 mM/L de iones calcio.

c Q): concentracion 15 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 100 mM/L de iones calcio

c Q): concentracion 15 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 125 mM/L de iones calcio

Una: concentracion 15 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 150 mM/L de iones calcio

c Q): concentracion 15 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 175 mM/L de iones calcio

c Q): concentracion 15 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 200 mM/L de iones calcio

Una: concentracion 15 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 300 mM/L de iones calcio

c Q): concentracion 15 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 400 mM/L de iones calcio

c Q): concentracion 15 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 500 mM/L de iones calcio

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Una: concentracion o CM mM/L de iones 0 c/) oT 1 i o se puede combinar con una concentracion 10 mM/L de iones calcio.

Una: concentracion 20 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 15 mM/L de iones calcio.

Una: concentracion 20 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 20 mM/L de iones calcio.

c 3 Q): concentracion 20 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 25 mM/L de iones calcio.

c 3 Q): concentracion 20 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 30 mM/L de iones calcio.

Una: concentracion 20 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 35 mM/L de iones calcio.

Una: concentracion 20 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 40 mM/L de iones calcio.

c 3 Q): concentracion 20 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 45 mM/L de iones calcio.

c Q): concentracion 20 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 50 mM/L de iones calcio.

Una: concentracion 20 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 60 mM/L de iones calcio.

c Q): concentracion 20 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 70 mM/L de iones calcio.

Una: concentracion 20 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 80 mM/L de iones calcio.

c 3 Q): concentracion 20 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 90 mM/L de iones calcio.

c Q): concentracion 20 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 100 mM/L de iones calcio

c Q): concentracion 20 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 125 mM/L de iones calcio

c Q): concentracion 20 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 150 mM/L de iones calcio

Una: concentracion 20 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 175 mM/L de iones calcio

c Q): concentracion 20 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 200 mM/L de iones calcio

c 3 Q): concentracion 20 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 300 mM/L de iones calcio

Una: concentracion 20 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 400 mM/L de iones calcio

c Q): concentracion 20 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 500 mM/L de iones calcio

o

Una: concentracion LO CM mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 10 mM/L de iones O Q) O o'

c 3 Q): concentracion 25 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 15 mM/L de iones calcio

Una: concentracion 25 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 20 mM/L de iones calcio

Una: concentracion 25 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 25 mM/L de iones calcio

c 3 Q): concentracion 25 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 30 mM/L de iones calcio

Una: concentracion 25 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 35 mM/L de iones calcio

Una: concentracion 25 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 40 mM/L de iones calcio

Una: concentracion 25 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 45 mM/L de iones calcio

c 3 Q): concentracion 25 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 50 mM/L de iones calcio

c 3 Q): concentracion 25 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 60 mM/L de iones calcio

Una: concentracion 25 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 70 mM/L de iones calcio

c 3 Q): concentracion 25 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 80 mM/L de iones calcio

Una: concentracion 25 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 90 mM/L de iones calcio

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Una concentracion Una concentracion Una concentracion Una concentracion Una concentracion Una concentracion Una concentracion

25 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 100 mM/L de iones calcio.

25 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 125 mM/L de iones calcio.

25 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 150 mM/L de iones calcio.

25 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 175 mM/L de iones calcio.

25 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 200 mM/L de iones calcio.

25 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 300 mM/L de iones calcio.

25mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 400 mM/L de iones calcio.

Una: concentracion LO CM mM/L de iones 0 (/) oT 1 i o se puede combinar con una concentracion 500 mM/L de iones calcio

o Una: concentracion 30 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 10 mM/L de iones calcio.

c Q): concentracion 30 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 15 mM/L de iones calcio.

c Q): concentracion 30 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 20 mM/L de iones calcio.

c Q): concentracion 30 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 25 mM/L de iones calcio.

Una: concentracion 30 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 30 mM/L de iones calcio.

c Q): concentracion 30 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 35 mM/L de iones calcio.

c Q): concentracion 30 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 40 mM/L de iones calcio.

c Q): concentracion 30 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 45 mM/L de iones calcio.

c Q): concentracion 30 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 50 mM/L de iones calcio.

Una: concentracion 30 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 60 mM/L de iones calcio.

c Q): concentracion 30 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 70 mM/L de iones calcio.

c Q): concentracion 30 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 80 mM/L de iones calcio.

Una: concentracion 30 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 90 mM/L de iones calcio.

Una: concentracion 30 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 100 mM/L de iones calcio

c Q): concentracion 30 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 125 mM/L de iones calcio

c Q): concentracion 30 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 150 mM/L de iones calcio

c Q): concentracion 30 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 175 mM/L de iones calcio

c Q): concentracion 30 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 200 mM/L de iones calcio

Una: concentracion 30 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 300 mM/L de iones calcio

c Q): concentracion 30 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 400 mM/L de iones calcio

Una: concentracion 30 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 500 mM/L de iones calcio

o Una: concentracion 40 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 10 mM/L de iones calcio.

c Q): concentracion 40 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 15 mM/L de iones calcio.

c Q): concentracion 40 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 20 mM/L de iones calcio.

Una: concentracion 40 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 25 mM/L de iones calcio.

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Una: concentracion 40 mM/L de iones 0 c/) oT 1 i o se puede combinar con una concentracion 30 mM/L de iones calcio.

Una: concentracion 40 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 35 mM/L de iones calcio.

c 3 Q): concentracion 40 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 40 mM/L de iones calcio.

Una: concentracion 40 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 45 mM/L de iones calcio.

c 3 Q): concentracion 40 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 50 mM/L de iones calcio.

Una: concentracion 40 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 60 mM/L de iones calcio.

c Q): concentracion 40 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 70 mM/L de iones calcio.

Una: concentracion 40 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 80 mM/L de iones calcio.

c Q): concentracion 40 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 90 mM/L de iones calcio.

c 3 Q): concentracion 40 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 100 mM/L de iones calcio

Una: concentracion 40 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 125 mM/L de iones calcio

c Q): concentracion 40 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 150 mM/L de iones calcio

c Q): concentracion 40 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 175 mM/L de iones calcio

c Q): concentracion 40 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 200 mM/L de iones calcio

c Q): concentracion 40 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 300 mM/L de iones calcio

c 3 Q): concentracion 40 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 400 mM/L de iones calcio

Una: concentracion 40 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 500 mM/L de iones calcio

o

Una: concentracion cn o mM/L de iones 0 (/) oT 1 i o se puede combinar con una concentracion 10 mM/L de iones O Q) O o'

c 3 Q): concentracion 50 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 15 mM/L de iones calcio.

Una: concentracion 50 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 20 mM/L de iones calcio.

c 3 Q): concentracion 50 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 25 mM/L de iones calcio.

Una: concentracion 50 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 30 mM/L de iones calcio.

c 3 Q): concentracion 50 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 35 mM/L de iones calcio.

Una: concentracion 50 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 40 mM/L de iones calcio.

Una: concentracion 50 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 45 mM/L de iones calcio.

c 3 Q): concentracion 50 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 50 mM/L de iones calcio.

c 3 Q): concentracion 50 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 60 mM/L de iones calcio.

Una: concentracion 50 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 70 mM/L de iones calcio.

Una: concentracion 50 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 80 mM/L de iones calcio.

Una: concentracion 50 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 90 mM/L de iones calcio.

Una: concentracion 50 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 100 mM/L de iones calcio

c 3 Q): concentracion 50 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 125 mM/L de iones calcio

Una: concentracion 50 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 150 mM/L de iones calcio

Una: concentracion 50 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 175 mM/L de iones calcio

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Una concentracion 50 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 200 mM/L de iones calcio.

Una concentracion 50 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 300 mM/L de iones calcio.

Una concentracion 50 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 400 mM/L de iones calcio.

Una concentracion 50 mM/L de iones fosfato se puede combinar con una concentracion 500 mM/L de iones calcio.

La concentracion del agente de formacion de complejos con calcio utilizada en el paso (c) es menos cntica. Preferentemente, el intervalo esta por encima de 80 mM, o por encima de 100 mM, o por encima de 120 mM, o por encima de 150 mM, o por encima de 200 mM, o por encima de 250 mM, o hasta el lfmite de solubilidad superior del agente de formacion de complejos con calcio.

El experto en la tecnica optimizara el agente de formacion de complejos con calcio deseado de acuerdo con la cantidad de precipitado de fosfato calcico que comprende VWF formado y aumentara la concentracion hasta que el agente de formacion de complejos con calcio este lo suficientemente concentrado como para disolver mas o menos por completo el precipitado de fosfato calcico que comprende VWF. El unico lfmite superior es la solubilidad del agente de formacion de complejos con calcio a la temperatura concreta de la solucion.

La temperatura y el pH a los que se lleva a cabo la precipitacion no son cnticos. Por ejemplo, la temperatura puede ser de entre 21 °C y 37 °C y el pH de entre 5.3 y 7.5.

El termino “VWF” o la expresion “factor de von Willebrand” se utilizan indistintamente en la presente invencion. El termino, tal como utiliza en la presente, incluye tambien variaciones alelicas naturales que pueden existir y tener lugar de un individuo a otro. El termino “VWF” o la expresion “Factor de von Willebrand” dentro de la definicion anterior incluye ademas variantes de VWF. Dichas variantes pueden diferir en uno o mas residuos de aminoacidos de la secuencia de origen natural. Los ejemplos de dichas diferencias pueden incluir como sustituciones de aminoacidos conservadoras, es decir, sustituciones dentro de grupos de aminoacidos con caractensticas similares, por ejemplo, (1) aminoacidos de bajo peso molecular, (2) aminoacidos acidos, (3) aminoacidos polares, (4) aminoacidos basicos, (5) aminoacidos hidrofobos y (6) aminoacidos aromaticos. Algunos ejemplos de dichas sustituciones conservadoras se muestran en la siguiente tabla. Las variantes de VWF incluyen tambien protemas de fusion con VWF, por ejemplo, protemas de fusion con albumina o fusiones a fragmentos de anticuerpo que incluyen fusiones a la parte Fc, o fusiones con XTEN. Tambien se engloban VWF conjugados qmmicamente con otras moleculas como peptidos de union a albumina, PEG, HES y otros conjugados que aumentan la semivida. Tambien se engloban cualesquiera de los VWF anteriores en un complejo con FVIII, sea un complejo no covalente o una union covalente a FVIII.

Tabla 1:

(1): Alanina Glicina

(2): Acido aspartico Acido glutamico

(3): Asparagina Glutamina Serina Treonina

(4): Arginina Histidina Lisina

(5): Isoleucina Leucina Metionina Valina

(6): Fenilalanina Tirosina Triptofano

Un beneficio potencial adicional de esas realizaciones de la presente invencion es que la actividad biologica del VWF se mantiene.

La “actividad biologica” del VWF de origen natural puede ser determinada por el experto utilizando metodos para la actividad del cofactor de ristocetina (VWF:RCo, Federici AB et al., 2004, Haematologica 89:77-85), la union de VWF a GP Iba del complejo de glicoprotema plaquetaria Ib-V-IX (Sucker et al. 2006. Clin Appl Thromb Hemost. 12:305310), o un ensayo de union a colageno (Kallas & Talpsep. 2001. Annals of Hematology 80:466-471).

La relacion de la actividad biologica del VWF sobre el contenido de antfgeno del VWF (VWF:RCo/VWF:Ag) que se obtiene de acuerdo con la invencion es de al menos un 70%, preferentemente de al menos un 75%, preferentemente de al menos un 80%, preferentemente de al menos un 85%, preferentemente de al menos un 90%, preferentemente de al menos un 98%, mas preferentemente de al menos un 98% de la relacion correspondiente del material de partida, es decir, en la solucion acuosa utilizada en el paso (a) del metodo reivindicado. En el plasma, la relacion de VWF:RCo/VWF:Ag es de 1.0, sin embargo, el VWF recombinante puede tener tambien valores de 1.2 en el material

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de partida.

El rendimiento de VWF:RCo de acuerdo con el metodo de la invencion es de al menos un 50%, preferentemente de al menos un 60%, preferentemente de al menos un 70%, preferentemente de al menos un 75%, preferentemente de al menos un 80%, preferentemente de al menos un 85%, preferentemente de al menos un 90%, de la manera mas preferente de al menos un 95%.

La expresion “separar el precipitado” en el sentido de la invencion es cualquier medio para separar el precipitado de la solucion de precipitacion, es decir, la solucion acuosa utilizada en el paso (a) del metodo reivindicado, que engloba, por ejemplo, el uso de separadores o el uso de centnfugas. Si se utiliza un paso de centrifugacion, se elimina el sobrenadante y se mezcla el precipitado restante con una solucion acuosa que comprenda un agente de formacion de complejos con calcio.

La solucion acuosa utilizada en el paso (c) que comprende el agente de formacion de complejos con calcio es preferentemente un tampon, es decir, una solucion acuosa que comprende uno o mas agentes tamponantes que mantienen el pH a un nivel determinado.

En el sentido de la presente invencion, la expresion “agente de formacion de complejos con calcio” se refiere a un agente con la capacidad de formar un complejo entre el calcio y el agente de formacion de complejos. La formacion de un complejo engloba la formacion de dos o mas uniones separadas entre un ligando polidentado, es decir, el compuesto qmmico o el polipeptido de interes y un unico atomo central. Normalmente dichos compuestos qmmicos son compuestos qmmicos organicos y se denominan quelantes, quelatantes, agentes quelantes o agentes secuestrantes. El compuesto qmmico forma un complejo quelato con el unico ion de calcio central. Los complejos quelatos constrastan con los complejos de coordinacion con ligandos monodentados, los cuales forman solamente un enlace con un calcio central. A modo de ejemplos no limitantes, los siguientes agentes son compuestos qmmicos con la capacidad de formar complejos con calcio de acuerdo con la invencion:

a) compuestos qmmicos que comprenden un grupo pentaacetico y sus diversas sales, como acido dietilentriaminopentaacetico (DTPA o acido pentetico), Pentetide, Indo-1 y Fura-2;

b) compuestos qmmicos que comprenden un grupo tetraacetico y sus diversas sales, como acido 1,2- bis(o-etano-N,N,N'N'-tetraacetico (BAPTA), acido etilendiaminotetraacetico (EDTA) y sus diversas sales (como EDTA diamonico, EDTA dipotasico dihidratado: EDTA disodico; EDTA trisodico; EDTA tetrasodico y EDTA tetraamonico) y acido etilenglicoltetraacetico (EGTA);

c) compuestos qmmicos que comprenden un grupo triacetico y sus diversas sales, como acido N- (hidroxietil)etilendiaminotriacetico (HEDTA) y acido nitrilotriacetico (NTA);

d) compuestos qmmicos que comprenden un grupo diacetico y sus diversas sales, como acido Iminodiacetico (IDA), iminodisuccinato tetrasodico, citrato trisodico y

e) compuestos qmmicos que comprenden multiples grupos amino, como aminoetiletanolamina

(AEEA), 2,3-difeniletilendiamina, etilendiamina, acido etilendiamino-N,N'-bis(2-hidroxifenilacetico), acido etilendiamino-N,N'-disuccmico, tetrahidroxipropiletilendiamina, trietilentetramina y acido

poliaminocarboxflico

f) compuestos qmmicos que comprenden multiples grupos tioles, como dimeracprol, acido dimercaptosuccmico (DMSA), acido dimercapto-1-propanosulfonico (DMPS), dietilditiocarbamato sodico

g) acido fosfonico y derivados de este y sus diversas sales, como acido aminotris(metilenfosfonico) (ATMP), acido dietlentriaminopenta(metilenfosfonico), acido etilendiaminotetra(metilenfosfonico) (EDTMP), acido etidronico o acido 1-hidroxietano-1,1-difosfonico (HEDP).

Se ha de sobreentender que el hecho de enumerar un agente de formacion de complejos con calcio como un ion o una sal determinada engloba asimismo el ion en sales diferentes.

Los siguientes agentes de formacion de complejos tambien son compuestos qmmicos con la capacidad de formar complejos con calcio en el sentido de la invencion. Acido acetilacetonico, acetilacetona, benzotriazol, 2,2'-bipiridina, 4,4'-bipiridina, 1,2-bis(dimetilarsino)benceno, 1,2-bis(dimetilfosfino)etano, 1,2-bis(difenilfosfino)etano, benzotriazoles, clatroquelato, 2.2.2-criptando, catecol, corrol, eter corona, 18-corona-6, criptando, cicleno, ciclodextrinas, deferasirox, deferiprona, deferoxamina, dexrazoxano, diglima, dimetilglioxima, ditioleno, etanodiol, acido etildronico, ferricromo, acido gluconico, metalocorona, casema hidrolizada, hexafluoroacetilacetona, penicilamina, fenantrolina, fosfonato, fitoquelatina, porfina, porfirina, pirofosfato, ligando escorpionato, poli(aspartato) sodico. Terpiridina,

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tetrafenilporfirina, 1,4,7-triazaciclononano, trimetafosfatos Triphos y 1,4,7-tritiaciclononano.

Una realizacion especialmente preferida de la invencion son procesos que utilizan acido etilendiaminotetraacetico (EDTA) como el agente de formacion de complejos con calcio en el sentido de la invencion. El EDTA es un acido carboxflico poliammico con la formula [CH2N(CH2CO2H)2]2. Su utilidad surge debido a su funcion como agente quelante, es decir, su capacidad para “secuestrar” iones metalicos tales como Ca2+ y Fe3+. Despues de unirse al EDTA, los iones metalicos permanecen en solucion, pero muestran una reactividad reducida. El EDTA se produce en forma de varias sales, en especial EDTA disodico y EDTA disodico de calcio. El peso molecular es de 292.24 Da. En la qrnmica de coordinacion, el EDTA4- es un miembro de la familia de ligandos acidos carboxflicos poliammicos. El EDTA4- normalmente se une a un cation metalico a traves de sus dos aminas y cuatro carboxilatos. Muchos de los compuestos qmmicos de coordinacion resultantes adoptan una geometna octaedrica. El EDTA tambien puede unirse a cargas cationicas de matrices de AEX.

Tambien son realizaciones especialmente preferidas de la invencion procesos que utilizan acido etilenglicoltetraacetico (EGTA) como el compuesto qmmico.

El VWF, las protemas de VWF o un complejo de VWF y el Factor VIII tal como se describen en esta invencion se pueden formular en forma de preparados farmaceuticos para uso terapeutico. La protema o protemas purificadas se pueden disolver en soluciones tampon acuosas fisiologicamente compatibles convencionales a las que se pueden anadir, opcionalmente, excipientes farmaceuticos para obtener preparados farmaceuticos.

Dichos portadores y excipientes farmaceuticos, asf como las formulaciones farmaceuticas adecuadas son muy conocidos en la tecnica (remftase, por ejemplo, a “Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins”, Frokjaer et al., Taylor & Francis (2000) o “Handbook of Pharmaceutical Excipients”, 3.a edicion, Kibbe et al., Pharmaceutical press (2000)). En particular, la composicion farmaceutica que comprende la variante del polipeptido de la invencion se puede formular en forma liofilizada o lfquida estable. La variante del polipeptido se puede liofilizar mediante una serie de procedimientos conocidos en la tecnica. Las formulaciones liofilizadas se reconstituyen antes de su uso mediante la adicion de uno o mas diluyentes farmaceuticamente aceptables tales como agua esteril para inyeccion o solucion salina fisiologica esteril.

Las formulaciones de la composicion se suministran al individuo mediante cualquier medio de administracion farmaceuticamente adecuado. Se conocen varios sistemas de suministro y se pueden utilizar para administrar la composicion por cualquier via conveniente. Preferencialmente, las composiciones de la invencion se administran sistemicamente. Para el uso sistemico, las protemas de insercion de la invencion se formulan para suministro parenteral (por ejemplo, intravenoso, subcutaneo, intramuscular, intraperitoneal, intracerebral, intrapulmonar, intranasal o transdermico) o enteral (por ejemplo, oral, vaginal o rectal) de acuerdo con metodos convencionales. Las vfas de administracion mas preferenciales son la administracion intravenosa y la subcutanea. Las formulaciones se pueden administrar de forma continua mediante infusion o inyeccion en bolo. Algunas formulaciones engloban sistemas de liberacion lenta.

Los preparados farmaceuticos preparados mediante la invencion se administran a pacientes en una dosis terapeuticamente eficaz, lo que se refiere a una dosis que es suficiente para producir los efectos deseados, prevenir o disminuir la gravedad o extension de la afeccion o indicacion que se esta tratando sin alcanzar una dosis que produzca efectos secundarios adversos intolerables. La dosis exacta depende de muchos factores como, por ejemplo, la indicacion, formulacion, modo de administracion y se ha de determinar en ensayos preclmicos y clmicos para cada respectiva indicacion.

La composicion farmaceutica preparada mediante el metodo de la invencion se puede administrar sola o junto con otros agentes terapeuticos. Estos agentes se pueden incorporar como parte del mismo producto farmaceutico. Un ejemplo de dicho agente es la combinacion de Factor VIII modificado con VWF no modificado o la combinacion de Factor VIII no modificado con VWF modificado o la combinacion de Factor VIII modificado con VWF modificado.

Todos los ejemplos se evaluaron utilizando el coagulometro de Behring (BCT, por sus siglas en ingles) y los kits de reactivos de Siemens Healtthcare Diagnostics para VWF:Ag (antfgeno) y VWF:RCo (actividad). La relacion calculada de RCo/Ag es un indicador de la calidad del VWF. Un descenso de ese valor durante el proceso indicana una perdida de calidad del VWF, lo que implica una perdida de actividad biologica del VWF purificado en relacion con la cantidad de antfgeno de VWF purificado.

El material de partida para los Ejemplos 1 a 11 fue protema de fusion de albumina y VWF recombinante tal como se describe en el documento WO 2009/156137 en celulas CHO, pero producida en medio PowerCHO-3CD sintetico (N.° de cat. de Lonza BESP1073Q). El sobrenadante del cultivo celular se recogio de un fermentador de perfusion de 5 litros, que estuvo en funcionamiento hasta 26 dfas con un factor de perfusion de 1.5 (se recogieron aproximadamente 10 litros de sobrenadante por recoleccion cada dos dfas comenzando el dfa seis). Las recolecciones filtradas se dividieron en almuotas y se congelaron a -80 °C. Una solucion patron de 250 mM/L de solucion salina tamponada con fosfato (PBS) se preparo disolviendo un sobre de PBS listo para su uso (Sigma; P5368) en 40 mL de H2O. El EDTA utilizado en todos los experimentos fue EDTA disodico dihidratado, pero

14

posteriormente denominado solo EDTA. El CaCl2 utilizado fue CaCl2 dihidratado.

Ejemplo 1: Precipitacion de rVWF-FP a partir de sobrenadante de cultivo utilizando diferentes concentraciones de fosfato

Se prepararon cuatro preparados de un sobrenadante de 40 mL y se anadio solucion patron de fosfato tal como se 5 muestra en la Tabla 2 a continuacion.

Tabla 2:

: concentracion de fosfato final (mM/L) PL

preparado 1: 1.0 160

preparado 2: 2.5 400

preparado 3: 5.0 800

preparado 4: 7.5 1200

Despues de mezclar, se anadieron 1.663 mL de una solucion de 1 mol/L CaCh*2H2O al preparado con agitacion a una temperatura de 30 °C a 37 °C en un bano de agua. Por consiguiente, la concentracion final de calcio fue de 10 aproximadamente 40 mM/L. Se anadio el calcio en dos minutos con mezclado y despues un tiempo de espera de seis minutos adicionales sin mezclado. El precipitado resultante se separo mediante una centrifugacion de 30 minutos a 3000 xg. El precipitado separado se redisolvio en un tampon compuesto por HEPES 20 mM/L + EDTA 120 mM/L a pH 7.2 y a 37 °C.

Los datos en la Tabla 3 muestran que el fosfato 5 mM proporciono el mejor rendimiento en el pellet disuelto. Al 15 parecer, la concentracion total de fosfato que se evaluo tambien funcionaba y no tema influencia negativa sobre la relacion de VWF:RCo/VWF:Ag.

Tabla 3:

: volumen (mL) VWF:Ag VWF:RCo relacion

conc. (IU/mL): total (IU) rendi- miento (%) conc. (IU/mL) total (IU) rendi miento (%) RCo/Ag (IU/IU)

solucion inicial: 40 4.5 180 100% 4.9 197 100% 1.09

pellet disuelto 1.0 mM: 3 17.9 54 30% 21.1 63 32% 1.18

pellet disuelto 2.5 mM: 3 37.2 112 62% 41.9 126 64% 1.13

pellet disuelto 5.0 mM: 3 49.5 149 83% 57.4 172 87% 1.16

pellet disuelto 7.5 mM: 3 45.9 138 77% 46.5 140 71% 1.01

Ejemplo 2: Precipitacion de rVWF-FP a partir de sobrenadante de cultivo celular con diferentes concentraciones de 20 calcio

Se prepararon cuatro preparados de un sobrenadante de 40 mL y en cada caso se anadieron 800 pL de solucion patron de fosfato, lo que dio lugar a una concentracion de fosfato de 5 mM. Despues de preparar una solucion de 1 mol/L de CaCh*2H2O, se anadieron diferentes cantidades de esta solucion al preparado con agitacion a una temperatura de 30 °C a 37 °C en un bano de agua para obtener cuatro concentraciones diferentes tal como se 25 muestra en la Tabla 4.

Tabla 4:

: concentracion final de calcio mM/L mL

preparado 1: 20 0.730

preparado 2: 40 1.487

preparado 3: 60 2.280

preparado 4

80

3.105

La adicion de la solucion de calcio llevo dos minutes con mezclado seguidos de un tiempo de espera de seis minutes adicionales sin mezclado. El precipitado resultante se separo mediante una centrifugacion de 30 minutes a 3000 xg. El precipitado separado se redisolvio en un tampon compuesto por HEPES 20 mM/L + EDTA 120 mM/L a pH 7.2 y a 5 37 °C.

Los datos en la Tabla 5 muestran que una concentracion de CaCl2 +2H2O 60 mM proporciono el mejor rendimiento. No existe diferencia real en la relacion de VWF:RCo/VWF:Ag para todos los preparados y solamente un ligero descenso despues de la precipitacion.

Tabla 5:

descripcion: volumen (mL) VWF:Ag VWF:RCo relacion

conc. (IU/mL): total (IU) rendimiento (%) con c. (IU/ mL) total (IU) rendimiento (%) RCo/Ag (IU/IU)

solucion inicial: 35 3.6 127 100% 49 170 100% 1.34

pellet disuelto 20 mM: 2.3 38.4 88 70% 47.7 110 65% 1.24

pellet disuelto 40 mM: 2.3 43.2 99 78% 54.9 126 74% 1.27

pellet disuelto 60 mM: 2.3 47.1 108 85% 60.4 139 82% 1.28

pellet disuelto 80 mM: 2.3 47.4 109 86% 57.6 132 78% 1.21

10

Ejemplo 3: Preparacion de rVWF-FP a partir de sobrenadante de cultivo celular a diferentes valores de pH

Se prepararon cuatro preparados de un sobrenadante de 40 mL y en cada caso se anadieron 800 pL de solucion patron de fosfato, lo que dio lugar a una concentracion de fosfato de 5 mM. Despues de mezclar, se anadieron 1.663 15 mL de una solucion de 1 mol/L de CaCl2*2H2O a diferentes valores de pH a los diferentes sobrenadantes, lo que porto las soluciones a una concentracion de aproximadamente 40 mM/L de calcio a los diferentes valores de pH mostrados en la Tabla 6 a continuacion con agitacion a una temperatura de 30 °C a 37 °C en un bano de agua.

Tabla 6:

: pH

preparado 1: 5.3

preparado 2: 6.5

preparado 3: 7.0

preparado 4: 7.5

20 La adicion tuvo lugar durante dos minutos con mezclado seguidos de un tiempo de espera de seis minutos adicionales sin mezclado. El precipitado se separo mediante una centrifugacion de 30 minutos a 3000 xg. El precipitado separado se redisolvio en un tampon compuesto por HEPES 20 mM/L + EDTA 120 mM/L a pH 7.2 y a 37 °C.

Los datos en la Tabla 7 muestran que el pH del CaCl2*2H2O no tuvo influencia en el resultado de la precipitacion. Lo 25 mas probable es que las ligeras diferencias se deban a la variabilidad de la prueba. El pH 5.3 representa una solucion de CaCl2*2H2O que no tema el pH ajustado y por tanto, se mantuvo el pH 5.3 durante los siguientes Ejemplos.

descripcion: volumen (mL) VWF:Ag VWF:RCo relacion

conc. (lU/mL ): total (IU) rendimiento (%) conc. (IU/mL) total (IU) rendimiento (%) RCo/Ag (IU/IU)

solucion inicial: 40 4.5 180 100% 4.9 197 100% 1.09

pellet disuelto a pH 5.3: 3 51.0 153 85% 54.2 163 83% 1.06

pellet disuelto a pH 6.0: 3 48.3 145 81% 52.3 157 80% 1.08

pellet disuelto a pH 6.5: 3 51.3 154 86% 53.0 159 81% 1.03

pellet disuelto a pH 7.0: 3 52.2 157 87% 56.8 170 87% 1.09

Ejemplo 4: Precipitacion de rVWF-FP a partir de sobrenadante de cultivo celular y redisolucion con tampones de diferentes valores de pH

5 Se prepararon cuatro preparados de un sobrenadante de 40 mL y en cada caso se anadieron 800 pL de solucion patron de fosfato, lo que dio lugar a una concentracion de fosfato de 5 mM. Despues de mezclar, se anadieron 1.663 mL de una solucion de 1 mol/L de CaCh*2H2O al preparado con agitacion a una temperatura de 30 °C - 37 °C en un bano de agua, lo que porto la solucion a una concentracion de aproximadamente 40 mM/L de calcio. La adicion tuvo lugar en dos minutos con mezclado seguidos de un tiempo de espera de seis minutos adicionales sin mezclado. El 10 precipitado se separo entonces mediante una centrifugacion de 30 minutos a 3000 xg.

El precipitado separado se redisolvio en un tampon compuesto por HEPES 20 mM/L + EDTA 120 mM/L a 37 °C y a diferentes valores de pH tal como se muestra en la Tabla 8 a continuacion.

Tabla 8:

: pH

preparado 1: 6.4

preparado 2: 6.8

preparado 3: 7.2

preparado 4: 7.6

15 Los datos en la Tabla 9 muestran que el pH del tampon en solucion no tuvo influencia en el resultado de la precipitacion. Lo mas probable es que las ligeras diferencias se deban a la variabilidad de la prueba. Para experimentos futuros se selecciono un pH de 7.2.

Tabla 9:

: volumen (mL) VWF:Ag VWF:RCo relacion

conc. (lU/mL): total (IU) rendimiento (%) conc. (lU/mL) total (IU) rendimiento (%) RCo/Ag (IU/IU)

solucion inicial: 40 4.5 179 100% 4.5 178 100% 0.99

pellet disuelto a pH 6.4: 3 48.9 147 82% 49.8 149 84% 1.02

pellet disuelto a pH 6.8: 3 44.1 132 74% 42.7 128 72% 0.97

pellet disuelto a pH 7.2: 3 48.6 146 81% 53.5 161 90% 1.10

pellet disuelto a pH 7.6: 3 51.9 156 87% 52.1 156 88% 1.00

Ejemplo 5: Precipitacion de rVWF-FP a partir de sobrenadante de cultivo celular y redisolucion con diferente concentracion de EDTA del tampon en solucion

5 Se prepararon cuatro preparados de un sobrenadante de 40 mL y en cada caso se anadieron 800 pL de solucion patron de fosfato, lo que dio lugar a una concentracion de fosfato de 5 mM. Despues de mezclar, se anadieron 1.663 mL de una solucion de 1 mol/L de CaCl2*2H2O al preparado con agitacion a una temperatura de 30 - 37 °C en un bano de agua, lo que porto la solucion a una concentracion de aproximadamente 40 mM/L de calcio. La adicion tuvo lugar en dos minutos con mezclado seguidos de un tiempo de espera de seis minutos adicionales sin mezclado. El 10 precipitado se separo entonces mediante una centrifugacion de 30 minutos a 3000 xg.

El precipitado separado se redisolvio en un tampon compuesto por HEPES 20 mM/L a un pH de 7.2 a 37 °C y a diferentes concentraciones de EDTA tal como se muestra en la Tabla 10 a continuacion.

15 Tabla 10:

: mM/L de EDTA

preparado 1: 80

preparado 2: 120

preparado 3: 160

preparado 4: 200

20

Los datos en la Tabla 11 muestran que una concentracion de EDTA 120 mM proporciono el mejor rendimiento, aunque todas las demas concentraciones evaluadas funcionaron practicamente igual de bien. No hubo ninguna diferencia real en la relacion entre todos los preparados.

Tabla 11:

: volumen (mL) VWF:Ag VWF:RCo relacion

solucion inicial: 40 4.6 185 100% 4.5 178 100% 0.96

pellet disuelto 80 mM: 3 41.2 124 67% 44.8 135 76% 1.09

pellet disuelto 120 mM: 3 48.3 145 78% 52.8 158 89% 1.09

pellet disuelto 160 mM: 3 47.1 141 76% 49.1 147 83% 1.04

5

10

15

20

25

30

35

pellet disuelto: 3 46.8 140 76% 47.0 141 79% 1.01

200 mM

Ejemplo 6: Precipitacion de rVWF-FP a partir de sobrenadante de cultivo celular a diferentes temperaturas

Se prepararon cuatro preparados de un sobrenadante de 40 mL y en cada caso se anadieron 800 pL de solucion patron de fosfato, lo que dio lugar a una concentracion de fosfato de 5 mM. Despues de mezclar, se anadieron 1.663 mL de una solucion de 1 mol/L de CaCh*2H2O al preparado, lo que porto la solucion a una concentracion de aproximadamente 40 mM/L de calcio con agitacion a cuatro temperaturas diferentes tal como se muestra en la Tabla 12 en un bano de agua.

Tabla 12:

: temperatura

preparado 1: 21 °C

preparado 2: 25 °C

preparado 3: 30 °C

preparado 4: 37 °C

La adicion tuvo lugar en dos minutos con mezclado seguidos de un tiempo de espera de seis minutos adicionales sin mezclado. El precipitado se separo entonces mediante una centrifugacion de 30 minutos a 3000 xg.

El precipitado separado se redisolvio en un tampon compuesto por HEPES 20 mM/L y EDTA 120 mM a un pH de 7.2 a 37 °C.

Los datos en la Tabla 13 muestran que se pudo conseguir un ligero aumento en el rendimiento y la relacion precipitando a una temperatura de 37 °C.

Tabla 13:

descripcion: volumen (mL) VWF:Ag VWF:RCo relacion

conc. (lU/mL): total (IU) rendimiento (%) conc. (IU=mL) total (IU) rendimiento (%) RCo/Ag (IU/IU)

solucion inicial: 40 4.6 185 100% 4.8 190 100% 1.03

pellet disuelto a 21 °C: 3 50.7 152 82% 50.6 152 80% 1.00

pellet disuelto a 25 °C: 3 51.6 155 84% 51.6 155 81% 1.00

pellet disuelto a 30 °C: 3 52.2 157 85% 54.4 163 86% 1.04

pellet disuelto a 37 °C: 3 52.5 158 85% 56.3 169 89% 1.07

Ejemplo 7: Precipitacion de rVWF-FP a partir de sobrenadante de cultivo celular con centrifugacion de diferente extension

Se prepararon cuatro preparados de un sobrenadante de 35 mL y en cada caso se anadieron 800 pL de solucion patron de fosfato, lo que dio lugar a una concentracion de fosfato de 5 mM.

Despues de mezclar, se anadieron 1.663 mL de una solucion de 1 mol/L de CaCl2*2H2O al preparado con agitacion a 37 °C en un bano de agua, lo que porto la solucion a una concentracion de aproximadamente 40 mM/L de calcio. La adicion tuvo lugar en dos minutos con mezclado seguidos de un tiempo de espera de seis minutos adicionales sin mezclado. El precipitado se separo entonces mediante centrifugacion a 3000 xg durante varias extensiones de tiempo tal como se indica en la Tabla 14.

: tiempo de centrifugacion (minutos)

preparado 1: 10

preparado 2: 20

preparado 3: 30

preparado 4: 40

El precipitado aislado se redisolvio en un tampon compuesto por HEPES 20 mM/L y EDTA 120 mM a un pH de 7.2 a 37 °C.

5

Los datos en la Tabla 15 muestran que el tiempo de centrifugacion no tiene influencia en el resultado de la precipitacion. Lo mas probable es que las ligeras diferencias se deban a la variabilidad de la prueba. No obstante, un tiempo de centrifugacion mas corto podna ser de interes para reducir el tiempo del proceso global.

10 Tabla 15:

descripcion: volumen (mL) VWF:Ag VWF:RCo relacion

solucion inicial: 35 3.6 127 100% 5.0 173 100% 1.36

pellet disuelto 10 min: 2.3 48.0 110 87% 65.7 151 87% 1.37

pellet disuelto 20 min: 2.3 48.9 112 89% 69.3 159 92% 1.42

pellet disuelto 30 min: 2.3 47.7 110 86% 62.9 145 83% 1.32

pellet disuelto 40 min: 2.3 47.4 109 86% 61.6 142 82% 1.30

Ejemplo 8: Precipitacion de rVWF-FP a partir de sobrenadante de cultivo celular con diferente fosfato y redisolucion del precipitado con diferentes concentraciones de EDTA

15 Se prepararon seis preparados de un sobrenadante de 40 mL y se anadio solucion patron de fosfato para obtener una concentracion de fosfato final tal como se muestra en la Tabla 16.

Tabla 16:

: conc. de fosfato final mM/L PL

preparado 1: 5.0 800

preparado 2: 5.0 800

preparado 3: 7.5 1200

preparado 4: 7.5 1200

preparado 5: 10 1600

preparado 6: 10 1600

20 Despues de mezclar, se anadieron 1.663 mL de una solucion de 1 mol/L de CaCl2*2H2O al preparado con agitacion a 37 °C en un bano de agua, lo que porto la solucion a una concentracion de aproximadamente 40 mM/L de calcio. La adicion tuvo lugar en dos minutos con mezclado seguidos de un tiempo de espera de seis minutos adicionales sin mezclado.

25 Los precipitados aislados de los preparados 1/3/5 se redisolvieron a 37 °C en tampon de HEPES 20 mM/L + EDTA 120 mM/L a pH 7.2 y los preparados 2/4/6 se redisolvieron a 37 °C en tampon de HEPES 20 mM/L + EDTA 160 mM/L a pH 7.2.

Los datos en la Tabla 17 muestran que el fosfato 5 mM proporciona el mejor rendimiento con ambas 30 concentraciones de EDTA en el pellet disuelto. Los rendimientos de la otra combinacion de tampon disminuyen, aunque aun proporcionan rendimientos satisfactorios.

5

10

15

20

25

descripcion: volumen (mL) VWF:Ag VWF:RCo relacion

solucion inicial: 40 4.4 176 100% 4.8 193 100% 1.10

pellet disuelto 5.0/120 mM: 3 54.0 162 92% 55.4 166 86% 1.03

pellet disuelto 5.0/160 mM: 3 54.0 162 92% 56.6 170 88% 1.05

pellet disuelto 7.5/120 mM: 3 43.2 130 74% 46.9 141 73% 1.09

pellet disuelto 7.5/160 mM: 3 48.0 144 82% 52.1 156 81% 1.09

pellet disuelto 10/120 mM: 3 36.0 108 61% 36.3 109 56% 1.01

pellet disuelto 10/160 mM: 3 41.7 125 71% 48.8 147 76% 1.17

Ejemplo 9: Precipitacion de rVWF-FP a partir de sobrenadante de cultivo celular y disolucion con tampon que contiene EGTA

Se anadieron 800 pL de solucion patron de fosfato a un sobrenadante de 40 mL, lo que porto la solucion a una concentracion de fosfato 5 mM. Despues de mezclar, se anadieron 1.663 mL de solucion de 1 mol/L de CaCl2 + 2H2O al preparado con agitacion a 37 °C en un bano de agua, lo que porto la solucion a una concentracion de aproximadamente 40 mM/L de CaCl2 *2H2O. La adicion tuvo lugar durante dos minutos con mezclado seguidos de un tiempo de espera de seis minutos adicionales sin mezclado. El precipitado se aislo mediante una centrifugacion de 30 minutos a 3000 xg. El precipitado aislado se redisolvio a 37 °C con un tampon compuesto por HEPES 20 mM/L y EGTA 120 mM/L a pH 7.2.

Los datos en la Tabla 18 muestran que se puede utilizar EGTA en lugar de EDTA para redisolver el pellet con un rendimiento comparable.

Tabla 18:

descripcion: volumen (mL) VWF:Ag VWF:RCo relacion

solucion inicial: 40 3.9 156 100% 3.8 152 100% 0.98

pellet disuelto: 3 36.0 108 69% 40.2 121 79% 1.12

Ejemplo 10: Precipitacion de rVWF-FP a partir de sobrenadante de cultivo celular con diferente concentracion de fosfato, calcio, y redisolucion del precipitado con diferentes concentraciones de EDTA

Este ejemplo debena evaluar si una concentracion aumentada 4 o 10 veces de los tres componentes del tampon funciona aun y si un aumento de 4 o 10 veces de la concentracion de fosfato sola tiene algun impacto sobre la precipitacion. Como control se evaluaron tambien las concentraciones estandar (preparado 1).

Se prepararon cinco preparados de un sobrenadante de 35 mL y se anadio solucion patron de fosfato para obtener una concentracion de fosfato final tal como se muestra en la Tabla 19. Se anadieron diferentes cantidades de esa disolucion de 1 mol/L de CaCl2*2H2O tal como se muestra en la Tabla 19 al preparado con agitacion a 37 °C en un bano de agua. La adicion tuvo lugar en dos minutos con mezclado seguidos de un tiempo de espera de seis minutos

adicionales sin mezclado. El precipitado se aislo mediante una centrifugacion de 30 minutos a 3000 xg. El precipitado aislado se redisolvio a 37 °C con un tampon compuesto por HEPES 20 mM/L y diferente concentracion de EDTA tal como se muestra en la Tabla 19 a pH 7.2.

5 Tabla 19:

: fosfato mM/L calcio mM/L EDTA mM/L

preparado 1: 5 50 120

preparado 2: 20 200 480

preparado 3: 50 500 667

Los datos en la Tabla 20 muestran que un aumento de 4 veces en la concentracion de tampon (preparado 2) proporciona aun buenos resultados, pero el aumento de 10 veces (preparado 3) no funciono a causa del hecho de que la concentracion de EDTA 667 mM (en lugar de la concentracion de 1200 mM deseada) es el lfmite de 10 solubilidad superior y parece ser que la cantidad no es suficientemente elevada para conseguir disolver el pellet. El hecho de aumentar solamente la concentracion de fosfato en 4 o 10 veces no funciono. La precipitacion sf funciono, lo que se muestra por el peso de pellet mayor, pero la redisolucion no funciono. La concentracion estandar del preparado 1 daba los buenos resultados esperados.

15 Tabla 20:

descripcion: volumen (mL) VWF:Ag VWF:RCo relacion pellet

conc. (lU/mL): total (IU) rendimiento (%) conc. (lU/mL) total (IU) rendimiento (%) RCo/Ag (IU/IU) peso gramos

solucion inicial: 35 0.71 25 100% 0.85 30 100% 1.20

pellet disuelto 1 5/50/120: 3.5 7.7 27 108% 7.7 27 91% 1.00 0.43

pellet disuelto 2 20/200/480: 6.0 4.1 25 100% 4.2 25 85% 1.02 2.95

pellet disuelto 3 50/500/667: 6.0 0.47 3 11% < 0.099 3.85

Ejemplo 11: Precipitacion de rVWF-FP a partir de sobrenadante de cultivo celular con diferente concentracion de fosfato, calcio, y redisolucion del precipitado con diferentes concentraciones de EDTA.

20 Este ejemplo evaluo si las concentraciones de calcio o EDTA solos aumentadas 4 o 10 veces aun funcionan y si la concentracion disminuida 1/5 de los tres componentes del tampon aun funciona. Como control, se evaluaron tambien las concentraciones estandar (preparado 1).

Se prepararon seis preparados de un sobrenadante de 35 mL y se anadio solucion patron de fosfato para obtener 25 una concentracion de fosfato final tal como se muestra en la Tabla 21. Se anadieron al preparado diferentes cantidades de una solucion de 1 mol/L de CaCl2*2H2O tal como se muestra en la Tabla 21 con agitacion a 37 °C en un bano de agua. La adicion tuvo lugar en dos minutos con mezclado seguidos de un tiempo de espera de seis minutos adicionales sin mezclado. El precipitado se aislo mediante una centrifugacion de 30 minutos a 3000 xg. El precipitado aislado se redisolvio a 37 °C con un tampon compuesto por HEPES 20 mM/L y diferente concentracion 30 de EDTA tal como se muestra en la Tabla 21 a pH 7.2.

Tabla 21:

: fosfato mM/L calcio mM/L EDTA mM/L

preparado 1: 5 50 120

preparado 2: 5 200 120

preparado 3: 5 500 120

preparado 4: 5 50 667

preparado 5: 5 50 120

preparado 6: 1 10 24

Los datos en la Tabla 22 muestran que aumentar la concentracion de calcio 4 y 10 veces tiene practicamente un 35 impacto nulo sobre el tamano de pellet, pero el rendimiento disminuye claramente en funcion de la concentracion de calcio. El aumento solamente de la concentracion de EDTA en 4 o 10 veces funciono muy bien. El rendimiento fue el mismo que con la concentracion estandar, pero la calidad mejoraba. Desafortunadamente, una concentracion de EDTA elevada que da como resultado una conductividad elevada no es preferible para el pellet disuelto, de modo

que estas concentraciones de EDTA elevadas se prefieren menos. La disminucion de la concentracion de sales en 1/5 veces no funciono. Practicamente todo el material se encontraba en el sobrenadante del preparado 6 y el pellet era muy pequeno. La concentracion estandar del preparado 1 daba los buenos resultados esperados.

5 Tabla 22:

descripcion: volumen (mL) VWF:Ag VWF:RCo relacion pellet

conc. (lU/mL): total (IU) rendimi ento (%) conc. (lU/mL) total (IU) rendimi ento (%) RCo/Ag (IU/IU) peso gramos

solucion inicial: 35 1.87 65 100% 2.17 76 100% 1.16

sobrenadante 1 5/50//120 mM: 37 <0.09

sobrenadante 2 5/200/120: 44 <0.09

sobrenadante 3 5/500/120: 70 <0.09

sobrenadante 4 5/50/480: 37 <0.09

sobrenadante 5 5/50/667: 37 <0.09

sobrenadante 6 1/10/24: 36 1.66 59 90%

pellet disuelto 1: 2.7 24.0 64 97% 22.9 61 80% 0.95 0.50

pellet disuelto 2: 2.5 18.6 47 71% 18.0 45 59% 0.97 0.52

pellet disuelto 3: 2.3 13.8 32 49% 11.4 26 35% 0.83 0.53

pellet disuelto 4: 2.6 24.6 64 98% 25.0 65 86% 1.02 0.43

pellet disuelto 5: 2.6 24.4 63 97% 25.1 65 86% 1.03 0.43

pellet disuelto 6: 2.4 2.7 6 10% 2.8 7 9% 1.04 0.08

Ejemplo 12: Precipitacion de rVWF-FP a partir de sobrenadante de cultivo celular con diferente concentracion de fosfato, calcio y redisolucion del precipitado con diferentes concentraciones de EDTA.

10 Este ejemplo evaluo si el hecho de aumentar las concentraciones de fosfato y calcio con la misma relacion de 1:1 aun funciona. La concentracion de EDTA solamente se aumento para garantizar que el precipitado se pudiese redisolver. Como control, se evaluaron tambien las concentraciones estandar (preparado 1).

Se prepararon seis preparados de un sobrenadante de 30 mL y se anadio solucion patron de fosfato para obtener 15 una concentracion de fosfato final tal como se muestra en la Tabla 23. Se anadieron al preparado diferentes cantidades de una solucion de 1 mol/L de CaCl2*2H2O tal como se muestran en la Tabla 23 con agitacion a 37 °C en un bano de agua. La adicion tuvo lugar en dos minutos con mezclado seguidos de un tiempo de espera de seis minutos adicionales sin mezclado. El precipitado se aislo mediante una centrifugacion de 30 minutos a 3000 xg. El precipitado aislado se redisolvio a 37 °C con un tampon compuesto por HEPES 20 mM/L y diferente concentracion 20 de EDTA tal como se muestra en la Tabla 23 a pH 7.2.

Tabla 23:

: fosfato mM/L calcio mM/L EDTA mM/L

preparado 1: 5 50 120

preparado 2: 2 2 120

preparado 3: 5 5 120

preparado 4: 10 10 480

5

10

15

20

25

preparado 5: 25 25 667

preparado 6: 50 50 667

Los datos en la Tabla 24 muestran que al aumentar la concentracion de calcio y fosfato en 5 (preparado 5) o 10 (preparado 6) veces la concentracion de fosfato estandar, el rendimiento es comparable al preparado estandar, pero el tamano de pellet precipitado sea aumenta significativamente. El preparado 4 con dos veces la cantidad de fosfato proporciona un rendimiento ligeramente reducido, pero el pellet precipitado es de un tamano cercano al doble del preparado estandar. Los preparados 2 y 3 acabaron teniendo practicamente todo el VWF aun en el sobrenadante y, por lo tanto, un rendimiento muy insatisfactorio. La concentracion estandar del preparado 1 daba los buenos resultados esperados.

Tabla 24:

description: volumen (mL) VWF:Ag VWF:RCo relation pellet

conc. (lU/m L): total (IU) rendimiento (%) conc. (lU/mL) total (IU) rendimiento (%) RCo/Ag (IU/IU) peso gramos

solucion inicial: 30 3.96 119 100% 5.58 167 100% 1.41

sobrenadante 1 5/50//120 mM: 31 <0.09

sobrenadante 2 2/2/120: 30 3.52 104 87%

sobrenadante 3 5/5/120: 30 3.04 91 77%

sobrenadante 4 10/10/480: 30 0.59 18 15%

sobrenadante 5 25/25/667: 30 <0.09

sobrenadante 6 50/50/667: 30 <0.09

pellet disuelto 1: 2.4 44.7 107 90% 57.2 137 82% 1.28 0.42

pellet disuelto 2: 2.0 1.3 3 2% 1.8 4 2% 1.41 0.03

pellet disuelto 3: 2.3 8.4 19 16% 9.9 23 14% 1.18 0.17

pellet disuelto 4: 2.9 34.5 100 84% 43.8 127 76% 1.27 0.90

pellet disuelto 5: 4.6 24.6 113 95% 29.9 138 82% 1.22 2.80

pellet disuelto 6: 4.9 23.0 112 95% 28.8 141 84% 1.25 3.18

Ejemplo 13: Precipitacion de rVWF-FP a partir de sobrenadante de cultivo celular con concentracion de fosfato baja fija, diferentes concentraciones con calcio y redisolucion del precipitado con EDTA 120 mM.

Este ejemplo evaluo si el hecho de aumentar las concentraciones de calcio por concentracion de fosfato constante baja puede funcionar. Como control, se evaluaron tambien la concentracion estandar (preparado 1).

Se prepararon seis preparados de un sobrenadante de 30 mL y se anadio solucion patron de fosfato para obtener una concentracion de fosfato final de 2 mM/L. Se anadieron diferentes cantidades de una solucion de 1 mol/L de CaCl2*2H2O tal como se muestra en la Tabla 25 al preparado con agitacion a 37 °C en un bano de agua. La adicion tuvo lugar en dos minutos con mezclado seguidos de un tiempo de espera de seis minutos adicionales sin mezclado. El precipitado se aislo mediante una centrifugacion de 30 minutos a 3000 xg. El precipitado aislado se redisolvio a 37 °C con un tampon compuesto por HEPES 20 mM/L y EDTA 120 mM/L tal como se muestra en la Tabla 25 a pH 7.2.

: fosfato mM/L calcio mM/L EDTA mM/L

preparado 1: 5 50 120

preparado 2: 2 2 120

preparado 3: 2 4 120

preparado 4: 2 8 120

preparado 5: 2 16 120

preparado 6: 2 32 120

Los datos en la Tabla 26 muestran que el hecho de aumentar la concentracion de calcio doblando la concentracion de calcio cada experimento consecutivo puede dar como resultado un rendimiento bueno comparable con el 5 preparado estandar (preparado 6, 32 mM/L de calcio) incluso con una concentracion de fosfato baja que no funcione con una relacion 1:1 respecto a la concentracion de calcio (como en el Ejemplo 12 tambien). Una concentracion de calcio baja, inferior a l6 mM/L como en el preparado 2, 3 y 4 que contiene practicamente todo el VWF en el sobrenadante y el tamano de pellet es muy pequeno. El preparado 5 con una concentracion de 16 mM/L de calcio proporciona un rendimiento aceptable que es mucho mas bajo que el preparado estandar. La concentracion 10 estandar del preparado 1 daba los buenos resultados esperados.

Tabla 26:

descripcion: volumen (mL) VWF:Ag VWF:RCo relacion pellet

solucion inicial: 30 3.87 116 100% 5.61 168 100% 1.45

sobrenada nte 1 5/50//120 mM: 32 <0.09

sobrenada nte 2 2/2/120: 31 3.70 115 99%

sobrenada nte 3 2/4/120: 30 3.60 108 93%

sobrenada nte 4 2/8/120: 30 3.03 91 78%

sobrenada nte 5 2/16/120: 31 1.51 47 40%

sobrenada nte 6 2/32/120: 31 0.22 7 6%

pellet disuelto 1: 2.4 45.50 109 94% 58.8 141 84% 1.29 0.46

pellet disuelto 2: 2.1 1.10 2 2% 1.7 3 2% 1.52 0.03

pellet disuelto 3: 2.1 3.14 7 6% 4.4 9 5% 1.39 0.04

pellet disuelto 4: 2.1 10.70 22 19% 15.6 33 19% 1.46 0.11

pellet disuelto 5: 2.2 30.75 68 58% 42.4 93 55% 1.38 0.17

pellet disuelto 6: 2.2 50.05 110 95% 64.7 142 85% 1.29 0.19

Ejemplo 14: Precipitacion de rVWF-FP a partir de sobrenadante a una escala mayor 15

Se produjo una protema de fusion de albumina y factor de von Willebrand recombinante en un medio de CD-CHO sintetico que contema fosfato con celulas CHO tal como se describe en el documento WO 2009/156137. Se estimo que la concentracion de fosfato era de aproximadamente 4 mM/L.

20 Se anadieron 440 mL de una solucion de 1 mol/L de CaCh + 2H2O a 10 500 mL de sobrenadante exento de celulas

5

10

15

20

25

30

35

40

45

con agitacion a una temperature de 25 °C - 30 °C en un bano de agua. Por consiguiente, la concentracion de calcio final fue de aproximadamente 40 mM/L. La adicion tuvo lugar en dos minutos con mezclado seguidos de un tiempo de espera de seis minutos adicionales sin mezclado. El precipitado se separo mediante una centrifugacion de 30 minutos a 3000 xg.

El precipitado separado se redisolvio a 37 °C en un tampon compuesto por HEPES 20 mM/L + EDTA 100 mM/L. La solucion resultante de 800 mL se diluyo con una solucion de HEPES 10 mM/L + EDTA 3 mM/L para alcanzar una conductividad de 8 mS/cm para la cromatograffa posterior.

Sorprendentemente, los resultados en la Tabla 27 muestran que los rendimientos de esa purificacion son muy elevados con un 96% tanto en antfgeno como en actividad y mantiene la relacion VWF:RCo/VWF:Ag durante la precipitacion. La rVWF-FP final tiene aun muy buena calidad.

Tabla 27:

: volumen (mL) VWF:Ag VWF:RCo relacion

conc. (lU/m L): total (IU) rendimiento (%) conc. (lU/mL) total (IU) rendimiento (%) RCo/Ag (IU/IU)

solucion inicial: 10500 2.5 26250 100% 2.75 2887 5 100% 1.10

pellet disuelto, diluido: 2140 11.8 25252 96% 12.95 2771 3 96% 1.10

Ejemplo 15: Precipitacion de vWF de origen natural a partir de sobrenadante a mayor escala

Se produjo factor de von Willebrand recombinante de origen natural en un medio de CD-CHO sintetico que conterna fosfato con celulas CHO tal como se describe en el documento WO 2009/156137. Se estimo que la concentracion de fosfato era de aproximadamente 4 mM/L.

Se anadieron 380 mL de una solucion de 1 mol/L de CaCl2*2H2O a 9000 mL de sobrenadante exento de celulas con agitacion a una temperatura de 25 °C - 30 °C en un bano de agua. Por consiguiente, la concentracion de calcio final fue de aproximadamente 40 mM/L. La adicion de calcio tuvo lugar en dos minutos con mezclado seguidos de un tiempo de espera de seis minutos adicionales sin mezclado. El precipitado se separo mediante una centrifugacion de 30 minutos a 3000 xg.

El precipitado separado se disolvio a 37 °C en un tampon compuesto por HEPES 20 mM/L y EDTA 120 mM/L. La solucion resultante de 630 mL se diluyo con una solucion de HEPES 10 mM/L + EDTA 3 mM/L para llegar a una conductividad de 8 mS/cm para la cromatograffa posterior.

Sorprendentemente, los datos en la Tabla 28 muestran que los rendimientos de antfgeno de esa purificacion son muy elevados con un 98% y el rendimiento de actividad es aun elevado con un 91%. La relacion de WVF:RCo/VWF:Ag disminuyo ligeramente durante la precipitacion. La rVWF-WT tiene aun buena calidad.

El Ejemplo 15 tambien muestra que la invencion funciona para ambas protemas de fusion de VWF asf como para el VWF de origen natural.

Tabla 28:

: volumen (mL) VWF:Ag VWF:RCo relacion

conc. (lU/m L): total (IU) rendimiento (%) conc. (lU/m L) total (IU) rendimiento (%) RCo/Ag (IU/IU)

solucion inicial: 9000 1.8 15840 100% 1.60 14400 100% 0.91

pellet disuelto, diluido: 2000 7.7 15460 98% 6.6 13140 91% 0.85

Ejemplo 16: Precipitacion de WVF procedente del plasma

Se disuelve VWF plasmatico en forma de precipitado con NaCl de 300 mg en 300 mL de PBS a pH 7.2 que contiene una concentracion de 10 mM/L de fosfato. El precipitado con NaCl se obtuvo mediante crioprecipitacion de plasma humano. Tras disolver el crioprecipitado, se llevo a cabo un paso de adsorcion a hidroxido de aluminio para eliminar eficazmente la protrombina y cualesquiera otros factores de complejos de protrombina. Tras ello, la impureza

26

principal, fibrinogeno, se elimino mediante precipitacion con glicina. El sobrenadante resultante se precipita con cloruro sodico y ese precipitado se utilizo para este ejemplo.

Se anadieron 12.5 mL de una solucion de 1 mol/L de CaCl2 + 2H2O a los 300 mL de solucion de VWF con agitacion 5 a una temperatura de 25 °C - 30 °C en un bano de agua. Por consiguiente, la concentracion de calcio final fue de aproximadamente 40 mM/L. La adicion de calcio llevo aproximadamente dos minutos con mezclado seguidos de un tiempo de espera de seis minutos adicionales sin mezclado. El precipitado se separo mediante una centrifugacion de 30 minutos a 3000 xg. El precipitado separado se redisolvio con 30 mL de un tampon compuesto por HEPES 20 mM/L y EDTA 80 mM/L a 37 °C.

10

Sorprendentemente, los resultados en la Tabla 29 muestran que el rendimiento de esa purificacion es muy elevado con un 95% para el antfgeno y un 93% para la actividad. La relacion de VWF:RCo/VWF:Ag durante la precipitacion disminuyo muy ligeramente. El pVWF final tiene aun la misma calidad.

15 Tabla 29:

: volumen (mL) VWF:Ag VWF:RCo relacion

materia l inicial: 300 4.3 1.284 100% 3.61 1.084 100% 0.84

pellet disuelto: 34 35.9 1.221 95% 29.7 1.008 93% 0.83

El Ejemplo 16 muestra asimismo que la invencion funciona tambien para un VWF plasmatico que aun comprende FVIII en forma de complejo con vWf en cuanto a ambas protemas de fusion de vWf y a VWF de origen natural.

Claims

5

10

15

20

25

30

REIVINDICACIONES

1. Un metodo para concentrar el Factor de von Willebrand (VWF) a partir de una solucion acuosa que comprende los pasos de

(a) precipitar el VWF proporcionando iones calcio e iones fosfato a la solucion acuosa,

(b) separar el precipitado formado en el paso (a) de la solucion acuosa,

(c) resolubilizar el precipitado aislado en el paso (b) por medio de una solucion acuosa que comprende un agente de formacion de complejos con calcio.
2. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, donde

(i) a una concentracion de los iones fosfato de entre al menos 1 mM y hasta por debajo de 10 mM, la concentracion de los iones calcio es de al menos 16 mM,

(ii) a una concentracion de iones fosfato de al menos 10 mM, la concentracion de los iones calcio es de al menos 10 mM.
3. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 2, donde la concentracion de los iones fosfato es como maximo 50 mM.
4. El metodo de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3, donde la concentracion de los iones fosfato es 5 mM y la concentracion de los iones calcio se selecciona a partir de un intervalo de entre 50 mM y 60 mM que incluye los extremos de ese intervalo.
5. El metodo de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 4, donde la concentracion del agente de formacion de complejos con calcio es de al menos 120 mM hasta el lfmite de solubilidad del agente de formacion de complejos con calcio.
6. El metodo de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 5, donde el compuesto de formacion de complejos con calcio es EDTA o EGTA.
7. El metodo de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 6, donde la solucion acuosa utilizada en el paso (c) es un tampon.
8. El metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la temperatura del paso de precipitacion se selecciona de un intervalo de 21 °C a 37 °C.
9. El metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la relacion de VWF:RCo/VWF:Ag en el precipitado resolubilizado es superior a un 80% de la relacion VWF:RCo/VWF:Ag en la solucion de partida acuosa en el paso (a).
10. El metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el rendimiento de VWF:RCo en el precipitado resolubilizado es de al menos un 75%.