ES2528491B1

ES2528491B1 - DEVICE FOR THE DETECTION OF A SINGLE MOLECULA IN A SITUATION OF NANOCONFINING AND IN DYNAMIC REGIME, MANUFACTURING AND USE PROCEDURE

Info

Publication number: ES2528491B1
Application number: ES201330922A
Authority: ES
Inventors: Resa Pablo Aitor Postigo; De Elguea Aratz Ortiz; Laskurain Aritz Juarros; Alvarez Santos Merino
Original assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC; Fundacion Tekniker
Current assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC; Fundacion Tekniker
Priority date: 2013-06-20
Filing date: 2013-06-20
Publication date: 2020-02-27
Anticipated expiration: 2033-06-20
Also published as: ES2528491A2; ES2528491R1

Description

DESCRIPCIÓNDESCRIPTION

DISPOSITIVO PARA LA DETECCIÓN DE UNA ÚNICA MOLÉCULA EN SITUACIÓN DE DEVICE FOR THE DETECTION OF A SINGLE MOLECULE IN SITUATION OF

NANOCONFINAMIENTO Y EN RÉGIMEN DINÁMICO, PROCEDIMIENTO DE NANOCONFINING AND IN DYNAMIC REGIME, PROCEDURE OF

FABRICACIÓN Y USOMANUFACTURE AND USE

SECTOR Y OBJETO DE LA INVENCIONSECTOR AND OBJECT OF THE INVENTION

El objeto de la presente invención se enmarca en el sector de la nanofotónica y micronanofluídica y está relacionado con un dispositivo que integra estructuras de cristal fotónico y micro-nanocanales para la manipulación y detección de moléculas de ADN y otras moléculas con marcadores luminiscentes. El dispositivo, basado en la capacidad de las guías fotónicas de direccionar las ondas electromagnéticas, concentra la señal de emisión de la molécula en respuesta a una señal de excitación en una dirección dada. Respecto a la invención, hay que destacar su gran nivel de miniaturización que permite diseños con tamaño reducido, la gran capacidad de concentración de la señal que permite su medida con detectores convencionales y su facilidad de fabricación mediante técnicas de alto rendimiento.The object of the present invention is part of the nanophotonics and micronanofluidics sector and is related to a device that integrates photonic and micro-nanochannel crystal structures for the manipulation and detection of DNA molecules and other molecules with luminescent markers. The device, based on the ability of the photonic guides to direct the electromagnetic waves, concentrates the emission signal of the molecule in response to an excitation signal in a given direction. Regarding the invention, it is necessary to highlight its high level of miniaturization that allows designs with reduced size, the great capacity of concentration of the signal that allows its measurement with conventional detectors and its ease of manufacture by means of high performance techniques.

ESTADO DE LA TÉCNICASTATE OF THE TECHNIQUE

Existen múltiples dispositivos o métodos de sensado para medir de manera rápida y fiable un gran número de parámetros, como por ejemplo, temperatura, presión, intensidad de campo eléctrico, etc. El interés se centra actualmente en el desarrollo de dispositivos o métodos de sensado para la detección, identificación y cuantificación de sustancias, como pueden ser gases, líquidos, proteínas, hormonas, bacterias o ADN, entre muchas otras. Estos dispositivos y métodos de sensado tienen aplicación en infinidad de campos, como por ejemplo, la investigación farmacéutica, el diagnóstico de enfermedades, la detección de contaminantes, o la guerra bacteriológica.There are multiple sensing devices or methods to quickly and reliably measure a large number of parameters, such as temperature, pressure, electric field strength, etc. The interest is currently focused on the development of sensing devices or methods for the detection, identification and quantification of substances, such as gases, liquids, proteins, hormones, bacteria or DNA, among many others. These sensing devices and methods have application in countless fields, such as pharmaceutical research, disease diagnosis, contaminant detection, or bacteriological warfare.

El interés en reducir el volumen de los procesos analíticos, combinado con los avances en micro y nanofluídica, están motivando el desarrollo de nuevos chips en los cuales los análisis pueden ser desarrollados más rápidamente y a un coste mucho menor que los tradicionalmente usados en laboratorios de biología molecular. Las nuevas aproximaciones en investigación están motivadas por la posibilidad de observar nuevos fenómenos u obtener información más detallada de sistemas activos biológicamente. Por este motivo, durante los últimos años la comunidad científica ha promovido una clase de investigación centrada en nuevas aproximaciones físicas y químicas al análisis biomolecular. La complejidad de los procesos de la vida y la riqueza de la biología molecular proporcionan un amplio camino con el estudio de estos nuevos dispositivos. El desarrollo de estos nuevos chips está cambiando la naturaleza de las cuestiones de las que podemos obtener respuestas experimentales a nivel molecular. Estos nuevos chips integran medidas eléctricas, ópticas y físicas combinadas con el guiado de fluidos para crear un nuevo concepto de biochips denominados dispositivos para el análisis de una única molécula (single molecule devices). En general, estos chips pueden permitir un análisis menos invasivo de fluidos biológicos complejos para diagnóstico médico y terapias avanzadas. Un amplio rango de tecnologías, incluida la fabricación, están siendo direccionadas hacia estos objetivos. El conjunto de herramientas denominadas lab-on-a-chip (dispositivo que integra funciones de un laboratorio en un chip), y particularmente, los chips para detección de una única molécula, pueden en el medio y largo plazo proporcionar sistemas funcionales para el diagnóstico de determinadas enfermedades diana y proporcionar sistemas eficientes en el avance de terapias asociadas a enfermedades crónicas.The interest in reducing the volume of analytical processes, combined with advances in micro and nanofluidics, are motivating the development of new chips in which the analyzes can be developed more quickly and at a much lower cost than those traditionally used in biology laboratories molecular. The new approaches in research are motivated by the possibility of observing new phenomena or obtaining more detailed information on biologically active systems. For this reason, in recent years the scientific community has promoted a research class focused on new physical and chemical approaches to biomolecular analysis. The The complexity of life processes and the richness of molecular biology provide a broad path with the study of these new devices. The development of these new chips is changing the nature of the questions from which we can get experimental answers at the molecular level. These new chips integrate electrical, optical and physical measurements combined with fluid guidance to create a new concept of biochips called devices for the analysis of a single molecule. In general, these chips may allow a less invasive analysis of complex biological fluids for medical diagnosis and advanced therapies. A wide range of technologies, including manufacturing, are being directed towards these goals. The set of tools called lab-on-a-chip (device that integrates functions of a laboratory into a chip), and particularly, chips for the detection of a single molecule, can in the medium and long term provide functional systems for diagnosis of certain target diseases and provide efficient systems in the advancement of therapies associated with chronic diseases.

El desarrollo de chips moleculares en los que interaccionar con las moléculas requiere no únicamente de técnicas de detección ultrasensibles sino que es necesario el control micro y nanofluídico a nivel de chip, integrando canales, celdas, válvulas, electrodos y funcionalización superficial que permita la interacción con moléculas específicas. No menos importante, es el desarrollo de procesos de fabricación que permitan la formación de canales, agujeros o rendijas de dimensiones en la escala de las moléculas que queremos detectar, es decir, en el orden de unos pocos nanómetros. Sin embargo, aunque necesario, esto no es suficiente, y el desarrollo de tecnologías maduras que permitan la fabricación de dispositivos con motivos en esta escala de una forma fiable y económica resulta fundamental para el éxito y llegada a la industria de este nuevo concepto de chip. La combinación exitosa de todos estos factores crea un rango de oportunidades enorme en el campo del análisis molecular.The development of molecular chips in which to interact with the molecules requires not only ultrasensitive detection techniques, but micro and nanofluidic control at the chip level is necessary, integrating channels, cells, valves, electrodes and surface functionalization that allows interaction with specific molecules Not less important, is the development of manufacturing processes that allow the formation of channels, holes or slits of dimensions in the scale of the molecules that we want to detect, that is, in the order of a few nanometers. However, although necessary, this is not enough, and the development of mature technologies that allow the manufacture of devices with motives on this scale in a reliable and economical way is essential for the success and arrival of this new chip concept in the industry. . The successful combination of all these factors creates a huge range of opportunities in the field of molecular analysis.

Los métodos usados en la actualidad para el análisis de ADN son costosos y lentos. Requieren cortar cada molécula en millones de fragmentos, replicar cada segmento, clasificarlos por tamaño y reconstruir la cadena de ADN original. Por el contrario, los métodos basados en información obtenida de una única molécula, como en el estiramiento de ADN, consisten en el estiramiento de moléculas individuales por confinamiento en los canales nanofluídicos, abriendo nuevas posibilidades para el análisis de ADN [F. Persson et al., Chem. Soc. Rev. 39 (2010) 985-999] y la detección bioquímica, lo que acelera el proceso y reduce el coste . Paralelamente, M. Wanunu et al. [M. Wanunu et al.. Nature Nanotechnology 5 (2010) 160-165.] detectaron concentraciones de ADN en el rango picomolar, capturando moléculas a través de nanoporos y un gradiente salino, mostrando la posibilidad de detectar ADN sin amplificarlo previamente y con un gran rendimiento en función del tiempo.The methods currently used for DNA analysis are expensive and slow. They require cutting each molecule into millions of fragments, replicating each segment, classifying them by size and reconstructing the original DNA chain. On the contrary, the methods based on information obtained from a single molecule, such as DNA stretching, consist of stretching individual molecules by confinement in the nanofluidic channels, opening up new possibilities for DNA analysis [F. Persson et al., Chem. Soc. Rev. 39 (2010) 985-999] and biochemical detection, which accelerates the process and reduce the cost. In parallel, M. Wanunu et al. [M. Wanunu et al. Nature Nanotechnology 5 (2010) 160-165.] Detected concentrations of DNA in the picomolar range, capturing molecules through nanopores and a salt gradient, showing the possibility of detecting DNA without amplifying it previously and with great performance function of time.

El estiramiento de moléculas individuales de ADN en canales nanofluídicos se puede utilizar para el estudio de las propiedades físicas y biológicas de estas moléculas. Estos dispositivos nanofluídicos se han utilizado para mediciones en tiempo real del contorno de las moléculas de ADN estiradas [E. Abad et al.. Microelectronic Engineering 88 (2011) 300 304], estudios de interacción entre proteína y ADN, la organización ordenada usando endonucleasas, la identificación de moléculas individuales de ADN usando nanoranuras, estudios biológicos de conformación, movimiento entrópico y velocidad de moléculas de ADN estiradas en nanocanales [J.T. Mannion et al. Biophys. J. 90 (2006) 4538—4545], y espectroscopia de confinamiento de moléculas individuales de ADN en nanocanales [F. Persson et al., Nano Lett. 9 (4) (2009) 1382-1385].The stretching of individual DNA molecules in nanofluidic channels can be used to study the physical and biological properties of these molecules. These nanofluidic devices have been used for real-time contour measurements of stretched DNA molecules [E. Abad et al. Microelectronic Engineering 88 (2011) 300 304], studies of interaction between protein and DNA, the orderly organization using endonucleases, the identification of individual DNA molecules using nanoranuras, biological studies of conformation, entropic movement and molecule speed of DNA stretched in nanochannels [JT Mannion et al. Biophys J. 90 (2006) 4538-4545], and confinement spectroscopy of individual DNA molecules in nanochannels [F. Persson et al., Nano Lett. 9 (4) (2009) 1382-1385].

Por otro lado, la caracterización a gran escala de complejos proteicos requiere generalmente de la separación de complejas muestras de proteínas y la identificación de cada proteína de manera individual. Entre los métodos más utilizados para el análisis de proteínas se encuentra la electroforesis, la espectroscopía de masas y la secuenciación peptídica. Esta metodología es difícil de automatizar y por esta razón, las aproximaciones alternativas de identificación de proteínas como los microarrays, que evitan la necesidad de separación de las proteínas, han ganado popularidad en el campo de la proteómica [P. Bertone et al.. Febs J. 272, 21 (2005) 5400-5411]. Sin embargo, incluir proteínas en formato microarray supone un reto mucho mayor que incluir moléculas de ADN. La funcionalidad de las proteínas depende del estado de las proteínas, por ejemplo de las modificaciones conformacionales, formación de complejos con otras proteínas, localización subcelular y modificaciones covalente reversibles. Es también importante que en los chips de proteínas en los que se requiere plena funcionalidad de las proteínas sea posible mantenerlas en estado activo a altas densidades.On the other hand, large-scale characterization of protein complexes generally requires the separation of complex protein samples and the identification of each protein individually. Among the most used methods for protein analysis are electrophoresis, mass spectroscopy and peptide sequencing. This methodology is difficult to automate and for this reason, alternative approaches to protein identification such as microarrays, which avoid the need for protein separation, have gained popularity in the field of proteomics [P. Bertone et al. Febs J. 272, 21 (2005) 5400-5411]. However, including proteins in microarray format is a much greater challenge than including DNA molecules. The functionality of the proteins depends on the state of the proteins, for example on conformational modifications, complex formation with other proteins, subcellular localization and reversible covalent modifications. It is also important that in protein chips that require full protein functionality it is possible to keep them in an active state at high densities.

Paralelamente, los chips basados en detección de una única proteína están obteniendo resultados prometedores. De este modo, la combinación de un nanoporo (2-100 nm) acoplado a un campo eléctrico ha resultado ser una herramienta fundamental para estudiar translocaciones de proteínas y cambios conformacionales de proteínas [C. Merstorf et al.. ACS Chem. Biol. 7, 652-658 (2012).], o más recientemente, estudiar la presencia de proteínas nativas unidas covalentemente a aptámeros en las proximidades del nanoporo [M. Soskine,et al. Nanolett 12, 4895-4900 (2012).]. El principio de detección se basa en aplicar un campo eléctrico a ambos extremos del nanoporo, el cual separa dos cámaras aisladas, induciendo una corriente iónica a través de un único agujero en la presencia de una solución salina. De este modo, cuando una proteína pasa a través del agujero, induce un decrecimiento en la corriente eléctrica, consecuencia del bloqueo al que da lugar en el paso de iones. Esta señal dependerá de la naturaleza de la proteína y de las características del nanoporo: tamaño, estructura conformacional, carga neta, geometría e interacciones.In parallel, chips based on the detection of a single protein are obtaining promising results. Thus, the combination of a nanopore (2-100 nm) coupled to an electric field has proved to be a fundamental tool for studying protein translocations and conformational protein changes [C. Merstorf et al. ACS Chem. Biol. 7, 652-658 (2012).], Or more recently, to study the presence of native proteins covalently bound to aptamers in the vicinity of the nanopore [M. Soskine, et al. Nanolett 12, 4895-4900 (2012).]. The detection principle is based on applying an electric field to both ends of the nanopore, which separates two isolated chambers, inducing an ionic current through a single hole in the presence of a saline solution. Thus, when a protein passes through the hole, it induces a decrease in the electric current, a consequence of the blockage that leads to the passage of ions. This signal will depend on the nature of the protein and the characteristics of the nanopore: size, conformational structure, net charge, geometry and interactions.

En una gran parte de los dispositivos moleculares citados anteriormente se requiere el análisis de la señal de fluorescencia proveniente de una única molécula, bien sea como medida directa de detección molecular o como medida indirecta para estudiar el paso de una molécula a través de un nanoporo o nanocanal aun cuando se detecte una señal eléctrica. En este caso, la detección molecular requiere obtener ratios grandes de la señal óptica frente al ruido, lo que requiere de equipamiento avanzado para la recogida de las tenues señales de fluorescencia emitidas por una única molécula individual con su fluoróforo (u otro marcador luminiscente) intercalado. Las cámaras empleadas son de alta sensibilidad, tales como EMCCD (electrón multiplying charged coupled device). In a large part of the molecular devices mentioned above, the analysis of the fluorescence signal from a single molecule is required, either as a direct measure of molecular detection or as an indirect measure to study the passage of a molecule through a nanopore or nanochannel even when an electrical signal is detected. In this case, molecular detection requires obtaining large ratios of the optical signal against noise, which requires advanced equipment to collect the faint fluorescence signals emitted by a single individual molecule with its fluorophore (or other luminescent marker) interspersed . The cameras used are of high sensitivity, such as EMCCD ( electron multiplying charged coupled device).

La integración de estructuras que permitan aumentar la cantidad de luz emitida por el fluoróforo, como por ejemplo un cristal fotónico específicamente diseñado alrededor de las nanoestructuras sensoras, bien sean estas nanocanales o nanoporos, puede dar lugar a una mayor cantidad de luz recibida del fluoróforo circulante en la dirección perpendicular al chip. De este modo, las estructuras fotónicas, adecuadamente diseñadas, pueden reducir la pérdida de luz en el plano del chip y favorecer la emisión del fluoróforo en la dirección o direcciones de detección de la luz, que están definidas por el objetivo o lente utilizados para dicha detección. El uso de estructuras de cristal fotónico alrededor de geometrías con dimensiones nanométricas puede favorecer, mediante la recuperación de la luz emitida por el fluoróforo o marcador luminiscente, la detección de moléculas individuales sin la necesidad de usar sofisticados equipos de detección, facilitando el uso de estos dispositivos para detección en serie de biomoléculas. Además, esta simplificación facilitará su uso no sólo por aspectos económicos, sino también por mayor sencillez de uso y disminución del tiempo necesario para la detección y para el manejo del chip y el sistema de detección por parte de personal no especializado.The integration of structures that allow increasing the amount of light emitted by the fluorophore, such as a photonic crystal specifically designed around the sensor nanostructures, whether these are nanochannels or nanopores, can result in a greater amount of light received from the circulating fluorophore in the direction perpendicular to the chip. Thus, properly designed photonic structures can reduce the loss of light in the chip plane and favor the emission of fluorophore in the direction or directions of light detection, which are defined by the lens or lens used for said detection. The use of photonic crystal structures around geometries with nanometric dimensions can favor, by recovering the light emitted by the fluorophore or luminescent marker, the detection of individual molecules without the need to use sophisticated detection equipment, facilitating the use of these devices for serial detection of biomolecules. In addition, this simplification will facilitate its use not only for economic reasons, but also for greater simplicity of use and reduction of time required for the detection and for the handling of the chip and the detection system by non-specialized personnel.

La amplificación de la luz emitida mediante cristales fotónicos ha sido reportada previamente en numerosos trabajos de investigación y patentes. Así por ejemplo la patente US6990259B2 describe un dispositivo biosensor basado en cavidades dispuestas periódicamente en un cristal fotónico. En este caso la detección se realiza mediante la iluminación del cristal fotónico con luz blanca y su posterior medida para obtener el espectro de reflectancia. La patente US7961315B2 describe un método para aumentar la detección de la fluorescencia usando las propiedades de un cristal fotónico para mejorar la extracción de luz. En este caso el cristal fotónico posee resonancias ópticas en el rango de la absorción óptica y de la emisión del fluoróforo para unos determinados ángulos de excitación y de colección de la luz. En dicha patente se utiliza la técnica conocida como "resonancia óptica evanescente" en la cual se usa como fuente de iluminación la luz de un láser que es concentrada en una superficie con periodicidad submicrónica. El cristal fotónico concentra dicha luz y permite una detección de un menor número de eventos sobre la superficie del cristal fotónico, con lo que se consigue aumentar la sensibilidad. El ángulo de iluminación y de detección son críticos en el caso explicado para obtener la mayor cantidad de luz detectada.The amplification of the light emitted by photonic crystals has been previously reported in numerous research papers and patents. Thus, for example, US6990259B2 describes a biosensor device based on cavities periodically arranged in a photonic crystal. In this case the detection is carried out by lighting the photonic crystal with white light and its subsequent measurement to obtain the reflectance spectrum. US7961315B2 describes a method to increase the detection of fluorescence using the properties of a photonic crystal to improve light extraction. In this case, the photonic crystal has optical resonances in the range of optical absorption and fluorophore emission for certain excitation and light collection angles. In said patent, the technique known as "evanescent optical resonance" is used in which the light of a laser that is concentrated on a surface with submicron periodicity is used as the source of illumination. The photonic crystal concentrates said light and allows a detection of a smaller number of events on the surface of the photonic crystal, thereby increasing sensitivity. The angle of illumination and detection are critical in the case explained to obtain the greatest amount of light detected.

El documento de solicitud de patente WO2008123927 hace referencia a un dispositivo con una estructura de capas similar al objeto de la presente invención, pero en el en el cual no existe ningún nanocanal o volumen de confinamiento donde se realice la detección de las moléculas, sino que esta se realiza por adsorción de las moléculas sobre la superficie de TiO2. En el caso del dispositivo objeto de la presente invención, la detección de la molécula se realiza en el interior del nanocanal. Esta es por tanto una diferencia fundamental.Patent application document WO2008123927 refers to a device with a layer structure similar to the object of the present invention, but in which there is no nanochannel or confinement volume where the detection of the molecules is performed, but rather This is done by adsorption of the molecules on the surface of TiO2. In the case of the device object of the present invention, the detection of the molecule is carried out inside the nanochannel. This is therefore a fundamental difference.

Se destaca que ninguna de estas patentes permite la detección de moléculas en movimiento. Además la patente US 6990259B2 precisa de una disposición periódica de cavidades fotónicas (formadas por un arreglo específico de nanoagujeros) en lugar de un cristal fotónico convencional como en el caso de la presente invención.It is emphasized that none of these patents allows the detection of moving molecules. In addition, US 6990259B2 requires a periodic arrangement of photonic cavities (formed by a specific arrangement of nano-holes) instead of a conventional photonic crystal as in the case of the present invention.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIONDESCRIPTION OF THE INVENTION

Constituye un primer objeto de la presente invención un dispositivo para la detección de una única molécula en situación de nanoconfinamiento y en régimen dinámico a través de la excitación de un emisor unido a la molécula o que forma parte de la misma y que comprende los siguientes elementos:A first object of the present invention is a device for the detection of a single molecule in a nanoconfining situation and in a dynamic regime through the excitation of an emitter attached to the molecule or that is part of it and comprising the following elements:

. un sustrato. a substrate

. una capa inferior de aislamiento óptico y baja absorción óptica a la longitud de onda de emisión del fluoróforo.. a lower layer of optical isolation and low optical absorption at the emission wavelength of the fluorophore.

. una capa central formada por un material dieléctrico y baja absorción óptica a la longitud de onda de emisión del fluoróforo.. a central layer formed by a dielectric material and low optical absorption at the emission wavelength of the fluorophore.

La capa central del dispositivo presenta al menos una estructura de cristal fotónico y al menos un nanocanal en el cual se confina la molécula a detectar, estando la capa central cubierta por una capa superior de aislamiento óptico que actúa como sello del nanocanal.The central layer of the device has at least one photonic crystal structure and at least one nanochannel in which the molecule to be detected is confined, the central layer being covered by an upper layer of optical isolation that acts as a seal of the nanochannel.

El emisor es un fluoróforo, punto cuántico, o molécula fluorescente, y la excitación se produce por iluminación mediante una lámpara de luz blanca o monocromática, preferentemente mediante láser.The emitter is a fluorophore, quantum dot, or fluorescent molecule, and the excitation is produced by illumination by a white or monochromatic light lamp, preferably by laser.

En sucesivos modos de realización del dispositivo objeto de la presente invención los elementos que comprende tienen las siguientes características:In successive embodiments of the device object of the present invention the elements it comprises have the following characteristics:

. el sustrato que otorga rigidez mecánica al dispositivo se fabrica en un material que se selecciona entre silicio, vidrio o polímero y tiene un grosor comprendido entre 50 pm y 3 mm;. The substrate that gives the device mechanical rigidity is made of a material that is selected from silicon, glass or polymer and has a thickness between 50 pm and 3 mm;

. la capa inferior de aislamiento óptico se fabrica en un material que se selecciona entre sílice o polímero y tiene un grosor comprendido entre 50 nm y 1500 pm;. The lower layer of optical isolation is made of a material that is selected from silica or polymer and has a thickness between 50 nm and 1500 pm;

. la capa central de material dieléctrico se fabrica en un material que se selecciona entre nitruro de silicio y óxido de titanio y tiene un grosor comprendido entre 30 y 1000 nm; . la capa central presenta entre 1 y 5000 nanocanales que tienen entre 5 y 2000 pm de longitud, entre 20 y 1000 nm de anchura y entre 20 y 1000 nm de profundidad;. the central layer of dielectric material is manufactured in a material that is selected from silicon nitride and titanium oxide and has a thickness between 30 and 1000 nm; . the central layer has between 1 and 5000 nanochannels that are between 5 and 2000 pm in length, between 20 and 1000 nm in width and between 20 and 1000 nm in depth;

. la capa central presenta entre 1 y 5000 estructuras de cristal fotónico formadas por una red periódica de cavidades de tamaño submicrónico ubicadas en ambos lados de al menos uno de los nanocanales con una simetría que se selecciona entre triangular, cuadrada o mezcla de ambas y un parámetro de red de separación entre las cavidades (a) comprendido entre 10nm y 1000 pm. Las cavidades pueden presentar:. the central layer has between 1 and 5000 photonic crystal structures formed by a periodic network of submicron size cavities located on both sides of at least one of the nanochannels with a symmetry that is selected from triangular, square or mixture of both and a parameter network separation between the cavities (a) between 10 nm and 1000 pm. The cavities can present:

. geometría cilíndrica coaxial perpendicular a la superficie plana de la capa con un tamaño de radio comprendido entre 10nm y 1000 pm. . Coaxial cylindrical geometry perpendicular to the flat surface of the layer with a radius size between 10nm and 1000 pm.

. geometría semiesférica con un tamaño de radio comprendido entre 10nm y 1000 pm.. hemispherical geometry with a radius size between 10nm and 1000 pm.

. geometría prismática coaxial perpendicular a la superficie plana de la capa con un tamaño de radio de la circunferencia circunscrita a la base comprendido entre 10nm y 1000 pm;. coaxial prismatic geometry perpendicular to the flat surface of the layer with a radius size of the circumference circumscribed to the base between 10nm and 1000 pm;

. la capa superior sellante de aislamiento óptico se fabrica en un material que se selecciona entre vidrio y polímero, tiene un espesor comprendido entre 100 y 1000 pm, e incluye una capa de un óxido conductor eléctrico transparente u, opcionalmente, incluye un electrodo metálico.. The top layer of optical insulation sealant is made of a material that is selected between glass and polymer, has a thickness between 100 and 1000 pm, and includes a layer of a transparent electrical conductive oxide or, optionally, includes a metal electrode.

Para la inyección y transporte de fluidos hasta los nanocanales, el dispositivo presenta entre 1 y 100 puertos de entrada y salida, así como entre 1 y 100 microcanales en forma de V, los cuales tienen una anchura comprendida entre 1 y 500 pm y una profundidad comprendida entre 0,5 y 50 pm .For the injection and transport of fluids to the nanochannels, the device has between 1 and 100 input and output ports, as well as between 1 and 100 V-shaped microchannels, which have a width between 1 and 500 pm and a depth between 0.5 and 50 pm.

En un modo de realización preferente, los materiales de las distintas capas que conforman el dispositivo se seleccionan en función de la longitud de onda del emisor de forma que: . el índice de refracción del material utilizado para el sustrato es arbitrario por estar minimizada su influencia sobre la luz emitida;In a preferred embodiment, the materials of the different layers that make up the device are selected based on the wavelength of the emitter so that:. the index of refraction of the material used for the substrate is arbitrary because its influence on the emitted light is minimized;

. el índice de refracción del material utilizado para la capa inferior es < 1, 5 para la longitud de onda del emisor;. The index of refraction of the material used for the lower layer is <1.5 for the wavelength of the emitter;

. el índice de refracción del material utilizado para la capa central es > 1, 5 para la longitud de onda del emisor;. The index of refraction of the material used for the central layer is> 1.5 for the wavelength of the emitter;

. el material de la capa central presenta en la región espectral del emisor un coeficiente de absorción k en el índice de refracción complejo n = n ik cuyo valor está comprendido entre 0 y 1.. The material of the central layer has an absorption coefficient k in the complex refractive index n = n ik in the spectral region of the emitter whose value is between 0 and 1.

Opcionalmente puede eliminarse el sustrato que otorga rigidez mecánica al dispositivo. Constituye otro aspecto de la presente invención un procedimiento de fabricación del dispositivo que comprende:Optionally, the substrate that grants mechanical rigidity to the device can be removed. Another aspect of the present invention is a method of manufacturing the device comprising:

. una etapa en la que se proporciona un sustrato plano a escala submicrónica con una capa de un material que presenta un coeficiente de absorción k comprendido entre 0 y 1 y un índice de refracción inferior a 1,5 en el rango de longitud de onda del fluoróforo empleado; . a stage in which a flat substrate is provided on a submicron scale with a layer of a material having an absorption coefficient k between 0 and 1 and a refractive index of less than 1.5 in the fluorophore wavelength range employee;

. una etapa en la que se proporciona una capa con un coeficiente de absorción k comprendido entre 0 y 1 y un índice de refracción superior a 1,5 en el rango de longitud de onda del fluoróforo empleado;. a step in which a layer with an absorption coefficient k between 0 and 1 and a refractive index greater than 1.5 is provided in the wavelength range of the fluorophore used;

. una etapa de formación mediante litografía de nanoimpresión de una red periódica de cavidades de tamaño inferior a la micra sobre la superficie de dicho sustrato y de uno o varios canales para transportar un fluido también de dimensiones submicrónicas; . una etapa de deposición de un material transparente, que puede ser conductor o no, sobre dichas cavidades con el fin de sellarlas por su parte superior.. a nano-printing lithography formation stage of a periodic network of cavities smaller than micron on the surface of said substrate and of one or more channels to transport a fluid also of submicron dimensions; . a stage of deposition of a transparent material, which may or may not be conductive, on said cavities in order to seal them at the top.

Finalmente, constituye también un objeto de la presente invención el uso del dispositivo para la detección de una única molécula en situación de nanoconfinamiento y en régimen dinámico que comprende las siguientes etapas:Finally, it is also an object of the present invention to use the device for the detection of a single molecule in a nanoconfining situation and in a dynamic regime comprising the following steps:

. introducción del fluido que contiene las moléculas a través de los puertos de entrada del dispositivo;. introduction of the fluid that contains the molecules through the input ports of the device;

. circulación de las moléculas a través de los microcanales mediante presión o campo eléctrico hasta llegar a la zona de entrada a los nanocanales;. circulation of the molecules through the microchannels by means of pressure or electric field until arriving at the zone of entrance to the nanochannels;

. penetración y difusión de las moléculas en los nanocanales en ausencia de excitación externa;. penetration and diffusion of the molecules in the nanochannels in the absence of external excitation;

. excitación del fluoróforo ligado a las moléculas a través de la iluminación con fuente de luz monocromática o policromática;. excitation of fluorophore bound to molecules through illumination with monochromatic or polychromatic light source;

. detección de la emisión del fluoróforo a través de una cámara CCD.. detection of fluorophore emission through a CCD camera.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURASBRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES

Figura 1: Estructura de capas del dispositivo. Figure 1: Device layer structure.

Figura 2: Diagrama de bandas fotónicas para los modos transversal eléctrico (TE) y transversal magnético (TM) de una guía óptica con un cristal fotónico con simetría triangular de agujeros de sección circular, con un índice efectivo de 1.5 y un radio de agujeros cilíndricos rellenados de aire de 0.3 veces la periodicidad, a. Figure 2: Diagram of photonic bands for the electric transverse (TE) and magnetic transverse (TM) modes of an optical guide with a photonic crystal with triangular symmetry of circular section holes, with an effective index of 1.5 and a radius of cylindrical holes filled with air of 0.3 times the periodicity, a .

Figura 3: Diagrama de bandas para los modos TE y TM para un rango de frecuencias normalizadas cercanas al punto III (entre 0.6 y 1) para el mismo tipo de guía óptica con cristal fotónico, en este caso con un índice efectivo de 1.62 y un radio 0.25a. Figure 3: Band diagram for TE and TM modes for a range of normalized frequencies close to point III (between 0.6 and 1) for the same type of optical guide with photonic crystal, in this case with an effective index of 1.62 and a radius 0.25a.

Figura 4: Bandas fotónicas en las cercanías del punto III y para el cristal fotónico con índice efectivo neff=1.7 correspondiente a una guía óptica formada por una capa de SiO2 de 500nm (primera capa) y otra capa de Si3N4 de 170nm de espesor (segunda capa). La tercera capa está formada por una capa de pírex de espesor infinito en comparación con los espesores anteriores. Figure 4: Photonic bands near point III and for the photonic crystal with effective index neff = 1.7 corresponding to an optical guide formed by a layer of SiO2 of 500nm (first layer) and another layer of Si3N4 of 170nm thickness (second cap). The third layer It is formed by a layer of pyrex of infinite thickness compared to the previous thicknesses.

Figura 5: Imágenes del dispositivo en diferentes escalas. En el panel a) se muestra una imagen de microscopia óptica (500 aumentos) donde se observan los dos microcanales y los nanocanales situados entre ambos microcanales. El panel b) muestra una imagen de microscopia electrónica de barrido (SEM) de la zona de los nanocanales. El panel c) es otra imagen SEM del nanocanal número 2 sin cristal fotónico y del nanocanal número 3 con cristal fotónico a ambos lados. El panel d) es una imagen de microscopia de fuerzas atómicas (AFM) del nanocanal 3 con la estructura de cristal fotónica a ambos lados del mismo. Figure 5: Images of the device at different scales. Panel a) shows an image of optical microscopy (500 magnifications) showing the two microchannels and the nanochannels located between both microchannels. Panel b) shows an image of scanning electron microscopy (SEM) of the nanochannel area. Panel c) is another SEM image of nanochannel number 2 without photonic glass and nanochannel number 3 with photonic glass on both sides. Panel d) is an atomic force microscopy (AFM) image of nanochannel 3 with the photonic crystal structure on both sides of it.

Figura 6: Imagen del dispositivo con el fluoróforo inyectado tomada a través del software de control de la cámara EMCCD. En la imagen se observa el microcanal receptor y los nanocanales iluminados por el fluido luminiscente que circula entre el microcanal emisor y el receptor. Figure 6: Image of the device with the injected fluorophore taken through the EMCCD camera control software. The image shows the receiving microchannel and the nanochannels illuminated by the luminescent fluid that circulates between the emitting and receiving microchannel.

Figura 7: Representación de la intensidad de luz detectada por la cámara EMCCD en función del número de pixel correspondiente a la línea vertical amarilla. Esta curva posee una forma gaussiana correspondiente aproximadamente a la distribución de luz que proviene principalmente del microcanal donde se inyecta el fluido luminiscente. Sobre esta curva aparecen una serie de picos que coinciden en posición con la presencia de los nanocanales del dispositivo. Los picos de luz se deben a la luz emitida por las moléculas fluorescentes en el interior de los nanocanales, que se superpone a la luz de fondo (background) de distribución gaussiana mencionada anteriormente Figure 7: Representation of the light intensity detected by the EMCCD camera as a function of the pixel number corresponding to the yellow vertical line. This curve has a Gaussian shape corresponding approximately to the distribution of light that comes mainly from the microchannel where the luminescent fluid is injected. On this curve a series of peaks appear that coincide in position with the presence of the nanochannels of the device. The peaks of light due to the light emitted by the fluorescent molecules inside the nanochannel, which is superimposed on the background light (background) of Gaussian distribution aforementioned

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓNDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

En la presente invención, la detección se realiza mediante un dispositivo que permite el movimiento de moléculas a través de un canal de dimensiones submicrónicas, que también puede usarse para el estiramiento de moléculas como ADN. El dispositivo integra una red periódica de motivos, como una red de difracción o una red bidimensional de postes o agujeros, que proporcionan una resonancia óptica que coincide con la longitud de onda de emisión del fluoróforo, punto cuántico o molécula fluorescente que se mueve en el interior del nanocanal. Esta red periódica se dispone alrededor del nanocanal y su función es la de recuperar la luz que el emisor emite lateralmente y que queda confinada por el material en el que el nanocanal está embebido (típicamente un dieléctrico transparente en la longitud de onda del emisor). Esta luz lateralmente emitida se pierde y no puede ser detectada a no ser que se use la geometría periódica descrita en la presente invención. Esta disposición periódica o cristal fotónico está diseñada específicamente para permitir que la luz confinada en el material en el que está embebido el nanocanal pueda reflejarse para ser recuperada y se emita además en dirección perpendicular al nanocanal y con un bajo ángulo de divergencia en torno a la normal, de forma que pueda contribuir al aumento de la cantidad de luz detectada en la dirección vertical, que en este caso es la usada para la detección. Este diseño está basado en el efecto de “realimentación óptica distribuida” descrito en [H. Kogelnik and C. V. Shank, Appl. Phys. Lett. 18, 152 (1971)]. Este efecto se ha usado para numerosos dispositivos, por ejemplo en láseres de semiconductor comerciales monomodales. El efecto de realimentación óptica distribuida (DFB en inglés) en una dimensión consiste en la generación de uno o varios haces de luz mediante difracción de Bragg, como ocurre por ejemplo en una estructura periódica unidimensional como una red de difracción, y que resulta en un acoplamiento de dos ondas propagantes en dos direcciones opuestas (propagante y contrapropagante). El efecto también existe en dos dimensiones y ha sido utilizado para la fabricación de microláseres mediante cristales fotónicos bidimensionales. En estos dispositivos, y debido a la bidimensionalidad de la estructura periódica, la difracción de Bragg es multidireccional.La presente invención utiliza difracción de Bragg multidireccional (bidimensional) en el plano formado por el chip y que contiene al nanocanal y las estructuras fotónicas especialmente diseñadas para la recuperación de luz.In the present invention, the detection is carried out by means of a device that allows the movement of molecules through a channel of submicron dimensions, which can also be used for the stretching of molecules such as DNA. The device integrates a periodic network of motifs, such as a diffraction network or a two-dimensional network of posts or holes, which provide an optical resonance that coincides with the emission wavelength of the fluorophore, quantum dot or fluorescent molecule that moves in the nanochannel inside. This periodic network is arranged around the nanochannel and its function is to recover the light that the emitter emits laterally and that is confined by the material in which the nanochannel is embedded (typically a transparent dielectric in the emitter's wavelength). This laterally emitted light is lost and cannot be detected unless the periodic geometry described in the present invention is used. This arrangement Periodic or photonic crystal is specifically designed to allow the light confined in the material in which the nanochannel is embedded can be reflected to be recovered and is also emitted in the direction perpendicular to the nanochannel and with a low angle of divergence around the normal, so that it can contribute to the increase in the amount of light detected in the vertical direction, which in this case is used for detection. This design is based on the “distributed optical feedback” effect described in [H. Kogelnik and CV Shank, Appl. Phys. Lett. 18, 152 (1971)]. This effect has been used for numerous devices, for example in single-mode commercial semiconductor lasers. The effect of distributed optical feedback (DFB) in one dimension consists in the generation of one or more light beams by Bragg diffraction, as occurs for example in a one-dimensional periodic structure such as a diffraction network, and resulting in a coupling of two propagating waves in two opposite directions (propagating and counterpropagating). The effect also exists in two dimensions and has been used for the manufacture of microláseres by means of two-dimensional photonic crystals. In these devices, and due to the two-dimensionality of the periodic structure, Bragg diffraction is multidirectional. The present invention uses multidirectional (two-dimensional) Bragg diffraction in the plane formed by the chip and containing the nanochannel and specially designed photonic structures for light recovery.

En el presente caso la excitación del emisor (fluoróforo, punto cuántico o molécula fluorescente) se realiza por iluminación mediante una lámpara de luz blanca o monocromática, o un láser con una energía e intensidad suficiente como para excitar dicha emisión. El emisor puede estar unido a una molécula o ser parte de la misma, que a su vez puede formar parte de un líquido o gas que circule por el nanocanal. El emisor proporciona luz en un rango espectral determinado, típicamente de una anchura de pocos nm. El cristal fotónico que rodea el nanocanal está específicamente diseñado para que proporcione un efecto DFB maximizado en el rango espectral de emisión del emisor, si bien puede proporcionar el efecto también en otros rangos espectrales. El cristal fotónico está formado por una red bidimensional de motivos periódicamente ordenados, como agujeros, cavidades o protuberancias (postes). Las dimensiones de estos motivos y las distancias entre ellos están optimizadas para que se alcance el máximo de efecto DFB y obtener la máxima cantidad de luz difractada en la dirección vertical, perpendicular al nanocanal. Para ello es necesario tener en cuenta la estructura de bandas del cristal fotónico bidimensional fabricado en la lámina de material dieléctrico transparente. Este material dieléctrico transparente debe de ser de baja o nula absorción óptica en la región espectral de emisión del emisor.In the present case the excitation of the emitter (fluorophore, quantum dot or fluorescent molecule) is carried out by illumination by means of a white or monochromatic light lamp, or a laser with sufficient energy and intensity to excite said emission. The emitter can be attached to a molecule or be part of it, which in turn can be part of a liquid or gas that circulates through the nanochannel. The emitter provides light in a given spectral range, typically a few nm wide. The photonic crystal surrounding the nanochannel is specifically designed to provide a maximized DFB effect in the emitter's spectral emission range, although it can also provide the effect in other spectral ranges. The photonic crystal is formed by a two-dimensional network of periodically arranged motifs, such as holes, cavities or protuberances (posts). The dimensions of these motifs and the distances between them are optimized so that the maximum DFB effect is reached and the maximum amount of light diffracted in the vertical direction is obtained, perpendicular to the nanochannel. For this, it is necessary to take into account the structure of bands of the two-dimensional photonic crystal manufactured in the sheet of transparent dielectric material. This dielectric material transparent must be of low or no optical absorption in the spectral region of emission of the emitter.

Las dimensiones de los motivos que forman el cristal fotónico bidimensional, como el radio de los agujeros r y la separación entre los mismos a, en el caso de una red bidimensional de agujeros rellenados por aire, están seleccionadas de acuerdo al diagrama de bandas, calculado para los valores de r y a que hacen que el punto de máximo efecto DFB corresponda a la energía de emisión del emisor. Debido a esta estructura se consigue un reciclado de fotones que de otra forma se perderían dentro del material del que está hecho el dispositivo. Además estos fotones se redirigen en una dirección perpendicular al plano del cristal fotónico, concentrándose muy cerca de la normal al mismo y aumentando la luz en esta dirección. Este aumento de luz es registrado por un sistema de detección como una cámara CCD o similar. Cuanto mayor es el porcentaje de luz recuperada, mayor es el incremento de luz detectada y menor es la sensibilidad necesaria para el sistema detector, o equivalentemente menor es el tiempo necesario para la detección. De esta manera y mediante el dispositivo objeto de la presente invención se puede usar una cámara de detección menos sensible y se puede reducir el tiempo de detección necesario para formar una imagen.The dimensions of the motifs that form the two-dimensional photonic crystal, such as the radius of the holes r and the separation between them a , in the case of a two-dimensional network of holes filled by air, are selected according to the band diagram, calculated for the values of r and a that make the point of maximum DFB effect correspond to the emitter's emission energy. Due to this structure a recycling of photons is achieved that would otherwise be lost within the material of which the device is made. In addition, these photons are redirected in a direction perpendicular to the plane of the photonic crystal, concentrating very close to normal to it and increasing the light in this direction. This increase in light is recorded by a detection system such as a CCD camera or similar. The higher the percentage of light recovered, the greater the increase in light detected and the lower the sensitivity needed for the detector system, or equivalently the time required for detection. In this way and by means of the device object of the present invention a less sensitive detection chamber can be used and the detection time necessary to form an image can be reduced.

El dispositivo se compone de una guía óptica formada por tres capas como muestra la Figura 1, que son: una primera capa central (capa 2), de elevado índice de refracción en la longitud de onda de emisión del emisor, una segunda capa inferior de aislamiento óptico o cladding (capa 1) y una tercera capa superior de aislamiento óptico o cladding que además actúa de sello del nanocanal fabricado en el dispositivo (capa 3). Estas tres capas delgadas se fabrican sobre un sustrato que otorga rigidez mecánica al dispositivo, si bien pueden fabricarse sin sustrato de forma que el dispositivo sea flexible. La capa 2 está formada por un material dieléctrico de baja o nula absorción óptica en el rango espectral de la emisión del emisor, cualquiera que sea el emisor (como un fluoróforo, molécula fluorescente o punto cuántico). En esta capa se fabrica un canal (nanocanal) de dimensiones submicrónicas en el que el emisor se moverá en forma aislada o bien enlazado a una molécula y dentro de un líquido o gas. El índice de refracción del material que compone la capa 2 es, para la longitud de onda de emisor del emisor, mayor que 1 y es el mayor posible mientras se cumplan los requisitos anteriores de baja o nula absorción para la longitud de onda del emisor, de forma que el material ofrezca un elevado confinamiento de la luz emitida por el emisor. La capa 2 está fabricada sobre una segunda capa, capa 1, situada inmediatamente por debajo como muestra la Figura 1. El material de la capa 1 debe de ser de un índice de refracción inferior al de la capa anterior, para la longitud de onda del emisor, A. La función de la capa 1 es triple, por un lado debe aumentar el confinamiento de la luz en la primera capa mediante un efecto de reflexión total interna y de aumento del índice efectivo. Por otro lado debe maximizar el aislamiento de la luz emitida por el emisor del material usado como sustrato. Finalmente, si dicho aislamiento no es perfecto, debe ayudar al confinamiento de la luz emitida por el emisor mediante un efecto de reflexión en la dirección cuasinormal. Típicamente el espesor que maximiza este último efecto es de A/2n donde n es el índice de refracción efectivo de la multicapa. El espesor la capa 2 debe ser tal que maximice el valor de n. Las capas 1 y 2 están fabricadas encima de un sustrato con un índice de refracción arbitrario ya que su influencia sobre la luz emitida por el emisor esta minimizada mediante el espesor de la capa 1.The device consists of an optical guide formed by three layers as shown in Figure 1, which are: a first central layer (layer 2), with a high index of refraction in the emission wavelength of the emitter, a second lower layer of optical isolation or cladding (layer 1) and a third upper layer of optical isolation or cladding that also acts as a nanochannel seal manufactured in the device (layer 3). These three thin layers are manufactured on a substrate that grants mechanical rigidity to the device, although they can be manufactured without a substrate so that the device is flexible. Layer 2 is formed by a low or no optical absorption dielectric material in the spectral range of the emitter emission, whatever the emitter (such as a fluorophore, fluorescent molecule or quantum dot). In this layer a channel (nanochannel) of submicron dimensions is manufactured in which the emitter will move in isolation or linked to a molecule and into a liquid or gas. The index of refraction of the material that composes the layer 2 is, for the emitter wavelength of the emitter, greater than 1 and is the largest possible while the previous requirements of low or no absorption for the emitter wavelength are met, so that the material offers a high confinement of the light emitted by the emitter. Layer 2 is manufactured on a second layer, layer 1, located immediately below as Figure 1 shows. The material of layer 1 must be of a refractive index lower than that of the previous layer, for the wavelength of the emitter, A. The function of layer 1 is threefold, on the one hand the confinement of light in the first layer must be increased by means of an effect of total internal reflection and an increase in the effective index. On the other hand, you must maximize the isolation of the light emitted by the emitter of the material used as a substrate. Finally, if such isolation is not perfect, it should help to confine the light emitted by the emitter by means of a reflection effect in the quasinormal direction. Typically, the thickness that maximizes this last effect is A / 2 n where n is the effective refractive index of the multilayer. The thickness of layer 2 should be such that it maximizes the value of n . Layers 1 and 2 are manufactured on top of a substrate with an arbitrary refractive index since its influence on the light emitted by the emitter is minimized by the thickness of layer 1.

La capa 2 contiene una cavidad de dimensiones submicrónicas (nanocanal) especialmente diseñada para el transporte de fluidos o gases en flujos de 10 fl/s. Además las dimensiones son tales que puede usarse como canal en el que moléculas estiradas de ADN se muevan. En esta capa y rodeando al nanocanal están fabricadas las estructuras de cristal fotónico que permiten el reciclado de fotones mediante el efecto DFB. Estas estructuras de cristal fotónico poseen la misma simetría y se disponen a ambos lados del canal, a una distancia inferior o igual a la distancia entre primeros vecinos del cristal fotónico. Las estructuras pueden estar formadas por motivos de forma arbitraria pero igual entre todos ellos, pudiendo ser cavidades o protuberancias rellenadas de un material de índice de refracción diferente al índice de la capa central. Como se ha mencionado el tamaño y separación de estas estructuras ha de ser tal que maximice el efecto DFB.Layer 2 contains a cavity of submicron dimensions (nanochannel) specially designed for the transport of fluids or gases in flows of 10 fl / s. In addition the dimensions are such that it can be used as a channel in which stretched DNA molecules move. In this layer and surrounding the nanochannel are made of photonic crystal structures that allow the recycling of photons through the DFB effect. These photonic crystal structures have the same symmetry and are arranged on both sides of the channel, at a distance less than or equal to the distance between first neighbors of the photonic crystal. The structures can be formed for reasons of arbitrary but equal to all of them, being able to be cavities or protuberances filled with a material of index of refraction different from the index of the central layer. As mentioned, the size and separation of these structures must be such that it maximizes the DFB effect.

En la presente invención, el cristal fotónico está formado por una red periódica de agujeros rellenados de aire u otro medio de índice menor que el índice efectivo n, perforados en la capa central. La Figura 2 muestra el diagrama de bandas fotónicas para los modos transversal eléctrico (TE) y transversal magnético (TM) de una guía óptica con un cristal fotónico con simetría triangular de agujeros de sección circular, con un índice efectivo de 1.5 y un radio de agujeros cilíndricos rellenados de aire de 0.3 veces la periodicidad, a.In the present invention, the photonic crystal is formed by a periodic network of holes filled with air or other means of index smaller than the effective index n , drilled in the central layer. Figure 2 shows the diagram of photonic bands for the electric transverse (TE) and magnetic transverse (TM) modes of an optical guide with a photonic crystal with triangular symmetry of holes of circular section, with an effective index of 1.5 and a radius of cylindrical holes filled with air of 0.3 times the periodicity, a .

En los puntos del diagrama de bandas (ver Figura 2) donde las bandas fotónicas se cruzan y se dividen cabe esperar un efecto de resonancia óptica, que ocurre especialmente en los bordes de la zona de Brillouin. En dichos puntos las ondas que se propagan se acoplan e incrementan significativamente la densidad de modos o estados ópticos. Este acoplamiento es diferente en cada punto de acuerdo a las condiciones de Bragg. En la presente invención se usan los modos transversal eléctrico y transversal magnético (TE y TM), lo que añade un mayor número de modos fotónicos que pueden usarse para la incentivación de la intensidad de emisión por efecto DFB. En el caso de que el emisor sea un pozo cuántico tensado, estos modos TM no contribuyen significativamente pero en el presente caso, el emisor puede ser una molécula o punto cuántico y por tanto los modos TM tienen que ser tenidos en cuenta.At the points of the band diagram (see Figure 2) where the photonic bands intersect and divide, an optical resonance effect can be expected, which occurs especially at the edges of the Brillouin area. At these points the waves that propagate are coupled and significantly increase the density of optical modes or states. This coupling is different at each point according to the Bragg conditions. In the present invention the electric transverse and magnetic transverse modes (TE and TM) are used, which adds a greater number of photonic modes that can be used for the incentive of the emission intensity by DFB effect. In the case that the emitter is a quantum well tensioned, these TM modes do not contribute significantly but in the present case, the emitter can be a molecule or quantum dot and therefore the TM modes have to be taken into account.

En la Figura 2 el punto I corresponde al acoplamiento de dos ondas únicamente, propagante y contrapropagante, que viajan en direcciones opuestas. Este tipo de acoplamiento es similar al que ocurre en los láseres DFB. Dado que hay 6 direcciones equivalentes del tipo r ^{-X, pueden formarse tres tipos de cavidades ópticas resonantes diferentes en tres}direcciones diferentes. El punto II en la Figura 2 tiene unas características de acoplamiento únicas que no pueden conseguirse en láseres DFB convencionales, como es el ^{acoplamiento de ondas propagándose en tres direcciones diferentes. La dirección} r ^{-J existe}también en cada una de las seis direcciones posibles de forma que sólo existen dos cavidades resonantes de tipo DFB independientes. La aplicabilidad de este modo es incierta porque la luz se emite en tres direcciones diferentes. El punto III corresponde a un acoplamiento de ondas propagándose en seis direcciones posibles. Esta es la mejor elección posible porque incluye el acoplo dentro del plano en las seis direcciones posibles: a 0°, ±60°, ±120° y 180°. Además la dirección del vector resultante del acoplo es perpendicular al plano del cristal fotónico. En el presente dispositivo este efecto se utiliza para la recuperación de luz emitida en estas seis direcciones del plano formado por el cristal fotónico y el nanocanal. Existen otros puntos a frecuencias más altas donde se da un acoplo multidireccional de ondas. Sin embargo los ángulos de acoplamiento con las direcciones salientes del plano del cristal fotónico no están cerca de la dirección perfectamente normal o cercanos a ésta. Por ejemplo en el punto IV la luz se acopla en un ángulo de salida de 54.7° además de a 90°. Por ello el punto más favorable para obtener un máximo de recuperación de luz debido al efecto DFB es el punto III.In Figure 2, point I corresponds to the coupling of only two waves, propagating and counterpropagating, traveling in opposite directions. This type of coupling is similar to what happens in DFB lasers. Since there are 6 equivalent addresses of the r- ^X type ^{, three different types of resonant optical cavities can be formed in three} different directions. Point II in Figure 2 has unique coupling characteristics that cannot be achieved in conventional DFB lasers, such as ^{wave coupling propagating in three different directions. The} r- ^J ^address also ^exists in each of the six possible addresses so that there are only two independent DFB type resonant cavities. The applicability of this mode is uncertain because the light is emitted in three different directions. Point III corresponds to a coupling of waves propagating in six possible directions. This is the best possible choice because it includes the coupling within the plane in the six possible directions: at 0 °, ± 60 °, ± 120 ° and 180 °. In addition, the direction of the resulting vector of the coupling is perpendicular to the plane of the photonic crystal. In the present device this effect is used for the recovery of light emitted in these six directions of the plane formed by the photonic crystal and the nanochannel. There are other points at higher frequencies where there is a multidirectional coupling of waves. However, the coupling angles with the protruding directions of the plane of the photonic crystal are not close to the perfectly normal direction or close to it. For example in point IV the light is coupled at an outlet angle of 54.7 ° in addition to 90 °. Therefore, the most favorable point to obtain a maximum recovery of light due to the DFB effect is point III.

La Figura 3 puede ser usada para definir el rango de energías útil para el dispositivo, ya que idealmente el rango de la energía de emisión del emisor debe quedar dentro del rango de energías definido por el menor y mayor valor de la energía de las bandas para k=0, esto es, ^{en el punto} r ^{, donde se da la emisión vertical, perpendicularmente al plano del cristal} fotónico. En la Figura 3 este rango va entre 0,7 y 0,925, en valor de la frecuencia normalizada. De aquí puede extraerse el valor de r y a para una determinada energía como se explica a continuación. Si la anchura de emisión del emisor está entre longitudes de onda A1 y A2, entonces el valor medio es A_max emisor =( A1 A2)/2 y es típicamente el valor aproximado de la longitud de onda con máxima intensidad de emisión en un emisor lorentziano. En nuestro dispositivo este valor debe coincidir con el valor medio del rango mencionado antes, en la Figura 3 (0,95+0,7)/2 = 0,825. Esto implica que el valor óptimo de frecuencia normalizada es 0,825 y de aquí puede extraerse el valor del parámetro de red necesario para fabricar el cristal fotónico, a, ya que w=a/ A_^maxemisor. Con el valor de a se deduce r ya que en el cálculo de bandas r=0.25 veces el valor de a.Figure 3 can be used to define the range of energies useful for the device, since ideally the range of emitter emission energy should be within the range of energies defined by the lowest and highest value of the energy of the bands for k = 0, that is, ^{at point} r ^{, where the vertical emission occurs, perpendicular to the plane of the crystal} Photonic In Figure 3 this range is between 0.7 and 0.925, in the normalized frequency value. From here you can extract the value of rya for a given energy as explained below. If the emission width of the emitter is between wavelengths A1 and A2, then the average value is A_max emitter = (A1 A2) / 2 and is typically the approximate value of the wavelength with maximum emission intensity in a Lorentzian emitter . In our device this value must match the average value of the range mentioned above, in Figure 3 (0.95 + 0.7) / 2 = 0.825. This implies that the optimum normalized frequency value is 0.825 and from here the value of the network parameter necessary to manufacture the photonic crystal can be extracted, a, since w = a / A_ ^max emitter. With the value of a, r is deduced since in the calculation of bands r = 0.25 times the value of a.

Todos los modos fotónicos que aparecen en la Figura 3 son susceptibles de radiar verticalmente, mediante el efecto DFB explicado anteriormente, en las energías definidas por el corte de dichos modos con el punto r (k=0). Por esta razón estos son los modos fotónicos que se utilizan en el dispositivo dela presente invención.All photonic modes that appear in Figure 3 are capable of radiating vertically, by means of the DFB effect explained above, in the energies defined by the cutting of said modes with the point r (k = 0). For this reason these are the photonic modes that are used in the device of the present invention.

Mediante el cálculo de bandas fotónicas puede obtenerse el parámetro de red, a, que determina la separación entre los agujeros que están situados en la capa delgada que contiene el cristal fotónico y el nanocanal. Esta separación es crítica para la fabricación del nanocanal ya que el nanocanal debe tener una anchura inferior a esta separación. En función de la simetría de la red de cristal fotónico (cuadrada o triangular u otra) la distancia de separación entre el nanocanal y la fila de agujeros más próxima variará. Para un máximo efecto DFB en el nanocanal, la separación entre el nanocanal y los agujeros más cercanos debe ser un múltiplo del valor de a.By calculating photonic bands, the network parameter, a, can be obtained, which determines the separation between the holes that are located in the thin layer that contains the photonic crystal and the nanochannel. This separation is critical for the manufacture of the nanochannel since the nanochannel must have a width less than this separation. Depending on the symmetry of the photonic crystal network (square or triangular or other), the separation distance between the nanochannel and the nearest row of holes will vary. For maximum DFB effect in the nanochannel, the separation between the nanochannel and the nearest holes must be a multiple of the value of a.

Una de las características diferenciales del dispositivo objeto de la presente invención es la combinación de un nanocanal con una estructura de cristal fotónico, dispuesta a ambos lados del mismo y especialmente diseñada para recuperar o reciclar la luz que se emite por el emisor contenido en el nanocanal. En el interior del nanocanal puede moverse un fluido o un gas con emisores luminiscentes, como moléculas fluorescentes o puntos cuánticos, y que permite además el estiramiento de moléculas de elevado interés como ADN u otras biomoléculas. El nanocanal queda integrado dentro de una estructura fotónica que se comporta como una guía óptica de capa delgada con un cristal fotónico específicamente diseñado para recuperar la luz mediante la maximización del efecto DFB en dirección vertical al chip, que es donde tiene lugar la detección. Aproximadamente la mitad de la luz es difractada en dirección opuesta hacia el sustrato de silicio por la estructura fotónica. Gracias a una adecuada separación entre la primera capa de SiO2 y el sustrato de silicio, este último puede actuar como un eficiente reflector y recuperar parte de esta luz reflejándola en dirección opuesta. La distancia óptima debe ser un múltiplo de A_max emisor /2nS¡o2 donde n S¡O2 es el índice de refracción efectivo del SiO2 para la longitud de onda del emisor (en este caso, nS¡O2=1.47). Un valor superior al óptimo para esta distancia es admisible sin que el dispositivo pierda una eficiencia significativa.One of the differential characteristics of the device object of the present invention is the combination of a nanochannel with a photonic crystal structure, arranged on both sides thereof and specially designed to recover or recycle the light emitted by the emitter contained in the nanochannel. . Inside the nanochannel, a fluid or gas can be moved with luminescent emitters, such as fluorescent molecules or quantum dots, and which also allows the stretching of molecules of high interest such as DNA or other biomolecules. The nanochannel is integrated into a photonic structure that behaves like a thin layer optical guide with a photonic crystal specifically designed to recover light by maximizing the DFB effect in a vertical direction to the chip, which is where the detection takes place. Approximately half of the light It is diffracted in the opposite direction to the silicon substrate by the photonic structure. Thanks to an adequate separation between the first layer of SiO2 and the silicon substrate, the latter can act as an efficient reflector and recover part of this light reflecting it in the opposite direction. The optimal distance should be a multiple of A_max emitter / 2 n S¡o2 where n S¡O2 is the effective refractive index of SiO2 for the emitter wavelength (in this case, n S¡O2 = 1.47). A higher than optimal value for this distance is permissible without the device losing significant efficiency.

MODO DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓNEMBODIMENT OF THE INVENTION

Para ilustrar el método y el dispositivo de sensado propuestos en esta invención, escogemos la configuración que se representa en la Figura 1. En este caso se ha escogido una red de simetría cuadrada para facilitar la fabricación del nanocanal entre las estructuras de cristal fotónico.To illustrate the method and sensing device proposed in this invention, we choose the configuration shown in Figure 1. In this case, a square symmetry network has been chosen to facilitate the manufacturing of the nanochannel between the photonic crystal structures.

El dispositivo se ha fabricado a partir de una oblea de silicio sobre la que se depositan una capa de oxido de silicio (SiO2) de 500nm y otra capa de nitruro de silicio (Si3N4) de 170nm de espesor, ambas por PECVD (Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition). Cada dispositivo consta de 4 puertos de entrada y salida para la inyección de los fluidos, y 2 microcanales en forma de V para su transporte hasta la entrada de los nanocanales. Los microcanales, de 200pm de anchura y 3pm de profundidad, han sido fabricados a partir de una máscara de acetato por técnicas de fotolitografía y ataques DRIE (Deep Reactive Ion Etching). El dispositivo en este ejemplo contiene un total de 6 nanocanales de 500pm de longitud, anchura w = 100nm y profundidad h = 100nm. El canal 1 posee una estructura fotónica en ambos lados con simetría de una red cuadrada y parámetro de red a=354nm, y radio de los agujeros r=71nm. El canal 2 no tiene estructura fotónica. El 3 es igual que el 1 con a=400nm, r=100nm. El 4 posee una estructura fotónica en ambos lados con simetría de una red triangular y parámetro de red a=447nm, r=89nm. El canal 5 no tiene estructura fotónica. El canal 6 posee una estructura fotónica en ambos lados con simetría de una red triangular y parámetro de red a=467nm, r=93nm. El número de periodos de cristal fotónico (filas de agujeros) está entre 4 y 5 en cada lado del nanocanal. Todos los nanocanales y las estructuras fotónicas han sido mecanizados por FIB (Focused Ion Beam). El dispositivo está sellado por pegado anódico con una oblea de pírex de 500pm de espesor, a la que previamente se han mecanizado 4 agujeros pasantes de diámetro 1mm con un láser de femtosegundo. The device has been manufactured from a silicon wafer on which a 500nm silicon oxide (SiO2) layer and another 170nm thick silicon nitride (Si3N4) layer are deposited, both by PECVD ( Plasma Enhanced Chemical Steam Deposition). Each device consists of 4 inlet and outlet ports for the injection of fluids, and 2 V-shaped microchannels for transport to the entrance of the nanochannels. The microchannels, 200pm wide and 3pm deep, have been manufactured from an acetate mask by photolithography techniques and DRIE ( Deep Reactive Ion Etching) attacks . The device in this example contains a total of 6 nanochannels of 500pm in length, width w = 100nm and depth h = 100nm. Channel 1 has a photonic structure on both sides with symmetry of a square network and network parameter a = 354nm, and hole radius r = 71nm. Channel 2 has no photonic structure. 3 is the same as 1 with a = 400nm, r = 100nm. The 4 has a photonic structure on both sides with symmetry of a triangular network and network parameter a = 447nm, r = 89nm. Channel 5 has no photonic structure. Channel 6 has a photonic structure on both sides with symmetry of a triangular network and network parameter a = 467nm, r = 93nm. The number of photonic crystal periods (rows of holes) is between 4 and 5 on each side of the nanochannel. All nanochannels and photonic structures have been machined by FIB ( Focused Ion Beam). The device is sealed by anodic bonding with a 500pm thick pyrex wafer, to which 4 through holes of 1mm diameter have previously been machined with a femtosecond laser.

En la Figura 4 se observan 8 modos fotónicos de polarización TE y TM que en las cercanías del punto III contribuyen al efecto DFB en el nanocanal y posibilitan la recuperación de luz en la guía óptica y su redireccionamiento en la vertical. El dispositivo consta de una capa de Si3N4 de alto índice de refracción n=2 para A=550nm (la longitud de onda de máxima emisión de la molécula luminiscente YOYO-1) sobre una capa de SiO2 de índice menor que el anterior, y una capa superior de pírex, normalmente formada por una oblea de pírex pegada por wafer-bonding. Las dos primeras capas están depositadas sobre un sustrato compuesto por una oblea de silicio. Mediante esta disposición se consigue que la luz esté mayormente confinada en la capa de alto índice de refracción, el Si3N4, que es la capa que contiene el nanocanal y el cristal fotónico a ambos lados del nanocanal.Figure 4 shows 8 photonic modes of polarization TE and TM that in the vicinity of point III contribute to the DFB effect in the nanochannel and enable the recovery of light in the optical guide and its redirection in the vertical. The device consists of a Si3N4 layer with a high refractive index n = 2 for A = 550nm (the maximum emission wavelength of the YOYO-1 luminescent molecule) on a SiO2 layer with a lower index than the previous one, and a top layer of pyrex, usually formed by a wafer of pyrex stuck by wafer-bonding. The first two layers are deposited on a substrate composed of a silicon wafer. Through this arrangement it is achieved that the light is mostly confined in the high refractive index layer, the Si3N4, which is the layer that contains the nanochannel and the photonic crystal on both sides of the nanochannel.

En el experimento de detección de moléculas luminiscentes se introduce en el dispositivo anteriormente descrito el compuesto fluoróforo 46960 Fluka Fluorescein sodium salt (Aex 490 nm; Aem 514 nm en 0.1 M Tris pH 8.0) por los puertos con ayuda de una jeringa. El compuesto fluoróforo llena los microcanales fácilmente por capilaridad hasta llegar a la entrada de los nanocanales, momento en el que se aplica una presión de 1 bar con una bomba de inyección externa, para que el compuesto fluoróforo atraviese los nanocanales con un caudal aproximado de 10 fl/s. A continuación se coloca el dispositivo sobre la mesa de un microscopio para caracterizar los resultados. El setup utilizado consiste en un microscopio de reflexión Zeiss, objetivos de 10x y 50X aumentos, juego de filtros (BPexc 470/40 (HE), FT 495 (HE), BPem 525/50 (HE)) y una cámara EMCCD de alta sensibilidad (Photometrics Evolve). La luz de la lámpara de mercurio del microscopio pasa a través del juego de filtros 38HE e ilumina la zona de los nanocanales y estructuras fotónicas que los rodean en un rango de longitudes de onda A = 450nm a 490nm, excitando el compuesto fluoróforo que en respuesta emite una señal de excitación con A = 514nm.In the luminescent molecule detection experiment, the fluorophore compound 46960 Fluka Fluorescein sodium salt (Aex 490 nm; Aem 514 nm at 0.1 M Tris pH 8.0) is introduced into the ports with the aid of a syringe. The fluorophore compound fills the microchannels easily by capillarity until reaching the entrance of the nanochannels, at which time a pressure of 1 bar is applied with an external injection pump, so that the fluorophore compound crosses the nanochannels with an approximate flow rate of 10 fl / s The device is then placed on the table of a microscope to characterize the results. The setup used consists of a Zeiss reflection microscope, 10x and 50X magnification lenses, filter set ( BPexc 470/40 ( HE), FT 495 ( HE), BPem 525/50 ( HE)) and a high EMCCD camera sensitivity ( Photometrics Evolve). The light of the microscope's mercury lamp passes through the 38HE filter set and illuminates the area of the nanochannels and photonic structures that surround them in a range of wavelengths A = 450nm to 490nm, exciting the fluorophore compound that in response emits an excitation signal with A = 514nm.

En la imagen de la Figura 7 se observa el microcanal receptor y los nanocanales iluminados por el fluido luminiscente que circula entre el microcanal emisor y el receptor. En el interior de la Figura 7 aparece la representación de la intensidad de luz detectada por la cámara EMCCD en función del número de pixel correspondiente a la línea vertical amarilla. Esta curva posee una forma gaussiana correspondiente aproximadamente a la distribución de luz que proviene principalmente del microcanal donde se inyecta el fluido luminiscente. Sobre esta curva aparecen una serie de picos que coinciden en posición con la presencia de los nanocanales del dispositivo. Los picos de luz se deben a la luz emitida por las moléculas fluorescentes en el interior de los nanocanales, que se superpone a la luz de fondo (background) de distribución gaussiana mencionada anteriormente. La Figura 7 muestra varias de estas curvas obtenidas en diferentes secciones paralelas a la línea amarilla de la Figura 6 y por tanto perpendiculares a los nanocanales. Como se observa la intensidad de luz proveniente de los nanocanales 1, 3, 4 y 6, que poseen estructura de cristal fotónico, es mayor que la intensidad de los canales 2 y 5 que no poseen estructura fotónica. La intensidad en los canales con estructura fotónica puede llegar a ser hasta 2,5 veces mayor que la de los nanocanales sin estructura fotónica. Este aumento de la intensidad de luz esta por tanto correlacionado con la presencia de la estructura de cristal. Este aumento de la luz detectada puede aportar beneficios como el uso de una cámara CCD menos sensible o el uso de un tiempo de detección menor. The image of Figure 7 shows the receiving microchannel and the nanochannels illuminated by the luminescent fluid that circulates between the emitting and receiving microchannel. Inside the Figure 7 appears the representation of the light intensity detected by the EMCCD camera as a function of the pixel number corresponding to the yellow vertical line. This curve has a Gaussian shape corresponding approximately to the distribution of light that comes mainly from the microchannel where the luminescent fluid is injected. On this curve a series of peaks appear that coincide in position with the presence of the nanochannels of the device. The light peaks are due to the light emitted by the fluorescent molecules inside the nanochannels, which overlaps the backlight ( background) of Gaussian distribution mentioned above. Figure 7 shows several of these curves obtained in different sections parallel to the yellow line of Figure 6 and therefore perpendicular to the nanochannels. As the intensity of light from nanochannels 1, 3, 4 and 6, which have a photonic crystal structure, is observed, is greater than the intensity of channels 2 and 5 that do not have a photonic structure. The intensity in the channels with photonic structure can be up to 2.5 times greater than that of the nanochannels without photonic structure. This increase in light intensity is therefore correlated with the presence of the crystal structure. This increase in the detected light can bring benefits such as the use of a less sensitive CCD camera or the use of a shorter detection time.

Claims

1. - Device for the detection of a single molecule in a situation of nanoconfinement and in a dynamic regime through the excitation of an emitter attached to the molecule or that is part of it and comprising the following elements:

. a substrate,

. a lower layer of optical isolation and low optical absorption at the emission wavelength of the fluorophore,

. a central layer formed by a dielectric material and low optical absorption at the emission wavelength of the fluorophore characterized in that the central layer has at least one photonic crystal structure and at least one nanochannel in which the molecule to be detected is confined and because The central layer is covered by an upper layer of optical isolation that acts as a nanochannel seal.

2. - Device according to claim 2, characterized in that the emitter is a fluorophore, quantum dot, or fluorescent molecule.

3. - Device according to any one of claims 1 or 2, characterized in that the excitation is produced by illumination by means of a white or monochromatic light lamp.

4. - Device according to any one of claims 1 or 2, characterized in that the excitation is produced by laser.

5. - Device according to any one of claims 1 to 4, characterized in that the substrate that grants mechanical rigidity to the device is made of a material that is selected from silicon, glass or polymer and has a thickness between 50 pm and 3 mm.

6. - Device according to any one of claims 1 to 5, characterized in that the lower layer of optical isolation is made of a material that is selected from silica or polymer and has a thickness between 50 nm and 1500 pm.

7. - Device according to any one of claims 1 to 6, characterized in that the central layer of dielectric material is manufactured in a material that is selected from silicon nitride, and titanium oxide and has a thickness between 30 and 1000 nm.

8. - Device according to claim 7, characterized in that the central layer has between 1 and 5000 nanochannels that are between 5 and 2000 pm in length, between 20 and 1000 nm in width and between 20 and 1000 nm in depth.

9. - Device according to claim 8, characterized in that the central layer has between 1 and 5000 photonic crystal structures formed by a periodic network of submicron size cavities located on both sides of at least one of the nanochannels with:. a symmetry that is selected from triangular, square or mixture of both,

. a parameter of network of separation between the cavities (a) between 10nm and 1000 pm.

10. - Device according to claim 9, characterized in that the cavities have coaxial cylindrical geometry perpendicular to the flat surface of the layer with a radius size between 10 nm and 1000 pm.

11. - Device according to claim 9, characterized in that the cavities have hemispherical geometry with a radius size between 10nm and 1000 pm.

12. - Device according to claim 9, characterized in that the cavities have coaxial prismatic geometry perpendicular to the flat surface of the layer with a radius size of the circumference circumscribed to the base between 10 nm and 1000 pm.

13. - Device according to any one of claims 1 to 13, characterized in that the upper sealing layer of optical insulation is made of a material that is selected between glass and polymer and has a thickness between 100 and 1000 pm.

14. - Device according to claim 13, characterized in that the upper layer includes a layer of a transparent electrical conductor oxide.

15. - Device according to claim 13, characterized in that the upper layer includes a metal electrode.

16. - Device according to any one of claims 1 to 15, characterized in that it has between 1 and 100 input and output ports for fluid injection.

17. - Device according to any one of claims 1 to 16, characterized in that it has between 1 and 100 V-shaped microchannels for the transport of fluids to the entrance of the nanochannels.

18. - Device according to claim 17, characterized in that the microchannels have a width between 1 and 500 pm and a depth between 0.5 and 50 pm.

19. - Device according to any one of claims 1 to 18, characterized in that the materials of the different layers that comprise it are selected according to the wavelength of the emitter so that:

. The index of refraction of the material used for the substrate is arbitrary because its influence on the emitted light is minimized.

. The index of refraction of the material used for the lower layer is <1.5 for the wavelength of the emitter.

. The index of refraction of the material used for the central layer is> 1.5 for the wavelength of the emitter.

20. - Device according to claim 19, characterized in that the material of the central layer has an absorption coefficient k in the complex refractive index n = n ik in the spectral region whose value is between 0 and 1.

21. - Device according to any one of claims 1 to 20, characterized in that the substrate that grants mechanical rigidity to the device is removed.

22. - Method of manufacturing a device according to claims 1 to 21, characterized in that it comprises:

. a stage in which a flat substrate is provided on a submicron scale with a layer of a material having an absorption coefficient k between 0 and 1 and a refractive index of less than 1.5 in the fluorophore wavelength range employee,

. a stage in which a layer with an absorption coefficient k between 0 and 1 and a refractive index greater than 1.5 is provided in the wavelength range of the fluorophore used,

. a stage of formation by means of nano-printing lithography of a periodic network of cavities smaller than micron on the surface of said substrate and of one or several channels for transporting a fluid also of submicron dimensions,. a step of deposition of a transparent material on said cavities in order to seal them at the top.

23.- Use of a device according to claims 1 to 21 for the detection of a single molecule in a nanoconfining situation and in a dynamic regime comprising the following steps:

. introduction of the fluid that contains the molecules through the input ports of the device.

. circulation of the molecules through the microchannels by means of pressure or electric field until arriving at the zone of entrance to the nanochannels.

. penetration and diffusion of the molecules in the nanochannels in the absence of external excitation

. excitation of fluorophore bound to molecules through illumination with monochromatic or polychromatic light source.

. detection of fluorophore emission through a CCD camera.