ES2505115T3

ES2505115T3 - Métodos para producir alcoholes grasos

Info

Publication number: ES2505115T3
Application number: ES09829536.3T
Authority: ES
Inventors: Zhihao Hu
Original assignee: LS9 Inc
Current assignee: LS9 Inc
Priority date: 2008-10-28
Filing date: 2009-10-07
Publication date: 2014-10-09
Anticipated expiration: 2029-10-07
Also published as: EP2367947A2; US9068201B2; CA3041892A1; KR101700296B1; EP2367947B1; MY194500A; CA3146669A1; ZA201103835B; US20190017081A1; US20100105963A1; US20210324430A1; CN102264910A; CA3041892C; KR20160083135A; WO2010062480A3; US8999686B2; US20160102327A1; US10961553B2; US20130115665A1; CN105154380B

Abstract

Método de producción de un alcohol graso, comprendiendo el método: cultivar una célula huésped modificada por ingeniería genética para comprender secuencias de polinucleótido que codifican polipéptidos individuales que tienen (a) actividad ácido carboxílico reductasa y al menos el 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; y (b) actividad tioesterasa, en el que se produce un alcohol graso a un rendimiento de desde al menos 25 mg/l por la célula huésped modificada por ingeniería genética cuando se cultiva en medio que contiene una fuente de carbono.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos para producir alcoholes grasos.

Antecedentes de la invención

El petróleo es un recurso natural limitado que se encuentra en la Tierra en formas líquida, gaseosa o sólida. El petróleo está compuesto principalmente por hidrocarburos, que están compuestos principalmente de carbono e 5 hidrógeno. También contiene cantidades significativas de otros elementos, tales como nitrógeno, oxígeno o azufre, en diferentes formas.

El petróleo es un recurso valioso, aunque los productos del petróleo se desarrollan a considerables costes, tanto financieros como medioambientales. En primer lugar, deben descubrirse fuentes de petróleo. La exploración de petróleo es una empresa cara y arriesgada. El coste de exploración de pozos de agua profundos puede exceder los 10 100 millones de dólares. Además, no hay ninguna garantía de que estos pozos contengan petróleo. Se estima que sólo el 40% de los pozos perforados conducen a pozos productores que generan hidrocarburos comerciales. Además del coste económico, la exploración de petróleo conlleva un alto coste medioambiental. Por ejemplo, la exploración mar adentro altera los entornos marinos circundantes.

Tras descubrirse un pozo productor, el petróleo debe extraerse de la Tierra con gran coste. Durante la recuperación 15 primaria, la presión natural subterránea es suficiente para extraer aproximadamente el 20% del petróleo en el pozo. A medida que esta presión natural desciende, se emplean métodos de recuperación secundarios, si son económicos. Generalmente, la recuperación secundaria implica aumentar la presión del pozo mediante, por ejemplo, inyección de agua, inyección de gas natural o levantamiento por gas. Usando métodos de recuperación secundarios, se recupera de un 5% a un 15% adicional de petróleo. Una vez que se agotan los métodos de recuperación 20 secundarios, pueden usarse métodos de recuperación terciarios, si son económicos. Los métodos terciarios implican reducir la viscosidad del petróleo para hacer que sea más fácil de extraer. Usando métodos de recuperación terciarios, se recupera de un 5% a un 15% adicional de petróleo. Por tanto, incluso en las mejoras circunstancias, sólo puede extraerse el 50% del petróleo en un pozo. La extracción de petróleo también conlleva un coste medioambiental. Por ejemplo, la extracción de petróleo puede dar como resultado grandes fugas de petróleo que 25 emerge a la superficie. Además, la perforación mar adentro implica dragar el lecho marino, lo que altera o destruye el entorno marino circundante.

Puesto que los depósitos de petróleo no se encuentran uniformemente por toda la Tierra, el petróleo debe transportarse a lo largo de grandes distancias desde regiones productoras de petróleo hasta regiones consumidoras de petróleo. Además de los costes de transporte, hay también el riesgo medioambiental de derrames de petróleo 30 devastadores.

En su forma natural, el petróleo crudo extraído de la Tierra tiene pocos usos comerciales. Es una mezcla de hidrocarburos (por ejemplo, parafinas (o alcanos), olefinas (o alquenos), alquinos, naftenos (o cicloalcanos), compuestos alifáticos, compuestos aromáticos, etc.) de longitud y complejidad variables. Además, el petróleo crudo contiene otros compuestos orgánicos (por ejemplo, compuestos orgánicos que contienen nitrógeno, oxígeno, azufre, 35 etc.) e impurezas (por ejemplo, azufre, sal, ácido, metales, etc.).

Por tanto, el petróleo crudo debe refinarse y purificarse antes de que pueda usarse comercialmente. Debido a su alta densidad de energía y su fácil transportabilidad, la mayoría del petróleo se refina en combustibles, tales como combustibles de transporte (por ejemplo, gasolina, diesel, combustible de aviación, etc.), gasóleo de calefacción, gas de petróleo licuado, etc. 40

El petróleo crudo es también una fuente primaria de materiales de partida para producir productos petroquímicos. Las dos clases principales de materiales de partida derivados del petróleo son olefinas de cadena corta (por ejemplo, etileno y propileno) y compuesto aromáticos (por ejemplo, isómeros de xileno y benceno). Estos materiales de partida se derivan de hidrocarburos de cadena más larga en petróleo crudo sometiéndolo a craqueo con un gasto considerable usando una variedad de métodos, tales como craqueo catalítico, craqueo con vapor o reformación 45 catalítica. Estos materiales de partida se usan para producir productos petroquímicos, que no pueden refinarse directamente del petróleo crudo, tales como monómeros, disolventes, detergentes o adhesivos.

Un ejemplo de un material de partida derivado de petróleo crudo es etileno. El etileno se usa para producir productos petroquímicos, tales como polietileno, etanol, óxido de etileno, etilenglicol, poliéster, glicol éter, etoxilato, acetato de vinilo, 1,2-dicloroetano, tricloroetileno, tetracloroetileno, cloruro de vinilo y poli(cloruro de vinilo). Un ejemplo adicional 50 de un material de partida es propileno, que se usa para producir alcohol isopropílico, acrilonitrilo, polipropileno, óxido de propileno, propilenglicol, glicol éteres, butileno, isobutileno, 1,3-butadieno, elastómeros sintéticos, poliolefinas, alfa-olefinas, alcoholes grasos, ácido acrílico, polímeros acrílicos, cloruro de alilo, epiclorohidrina y resinas epoxídicas.

Estos productos petroquímicos pueden usarse entonces para producir productos químicos especializados, tales 55 como plásticos, resinas, fibras, elastómeros, productos farmacéuticos, lubricantes o geles. Productos químicos especializados particulares que pueden producirse a partir de materiales de partida petroquímicos son ácidos

grasos, hidrocarburos (por ejemplo, de cadena larga, de cadena ramificada, saturados, insaturados, etc.), alcoholes grasos, ésteres, aldehídos grasos, cetonas, lubricantes, etc.

Los alcoholes grasos tienen muchos usos comerciales. Las ventas anuales en todo el mundo de alcoholes grasos y sus derivados superan los 1000 millones de dólares. Los alcoholes grasos de cadena más corta se usan en las industrias alimentaria y cosmética como emulsionantes, emolientes y espesantes. Debido a su naturaleza anfifílica, 5 los alcoholes grasos se comportan como tensioactivos no iónicos, que son útiles en productos domésticos y de cuidado personal, por ejemplo, detergentes. Además, los alcoholes grasos se usan en ceras, gomas, resinas, lociones y bálsamos farmacéuticos, aditivos de aceite lubricante, agentes de acabado y antiestáticos textiles, plastificantes, cosméticos, disolventes industriales y disolventes para grasas.

Los aldehídos se usan para producir muchos productos químicos especializados. Por ejemplo, los aldehídos se usan 10 para producir polímeros, resinas (por ejemplo, baquelita), colorantes, sabores, plastificantes, perfumes, productos farmacéuticos y otros productos químicos. Algunos se usan como disolventes, conservantes o desinfectantes. Algunos compuestos naturales y sintéticos, tales como vitaminas y hormonas, son aldehídos. Además, muchos azúcares contienen grupos aldehído.

La obtención de estos productos químicos especializados a partir de petróleo crudo requiere una inversión financiera 15 significativa así como un gran aporte de energía. También es un proceso ineficaz porque frecuentemente los hidrocarburos de cadena larga en petróleo crudo se someten a craqueo para producir monómeros más pequeños. Estos monómeros se usan entonces como material de partida para fabricar los productos químicos especializados más complejos.

Además de los problemas con la exploración, la extracción, el transporte y el refino del petróleo, el petróleo es un 20 recurso cada vez más escaso y limitado. Una estimación del consumo de petróleo mundial es de 30000 millones de barriles al año. Según algunas estimaciones, se predice que a los niveles de producción actuales, las reservas de petróleo mundiales podrían agotarse antes del año 2050.

Finalmente, la combustión de combustibles a base de petróleo libera gases invernadero (por ejemplo, dióxido de carbono) y otras formas de contaminación del aire (por ejemplo, monóxido de carbono, dióxido de azufre, etc.). A 25 medida que la demanda mundial de combustible aumenta, la emisión de gases invernadero y otras formas de contaminación del aire también aumenta. La acumulación de gases invernadero en la atmósfera puede conducir a un aumento del calentamiento global. Por tanto, además de dañar el medio ambiente localmente (por ejemplo, derrames de petróleo, dragado de entornos marinos, etc.), la combustión del petróleo también daña el medio ambiente globalmente. 30

Debido a los desafíos inherentes que plantea el petróleo, hay una necesidad de una fuente de petróleo renovable que no necesite explorarse, extraerse, transportarse a lo largo de grandes distancias o refinarse sustancialmente como el petróleo. Hay también una necesidad de una fuente de petróleo renovable que pueda producirse económicamente sin crear el tipo de daño medioambiental producido por la industria del petróleo y la combustión de combustibles a base de petróleo. Por motivos similares, hay también una necesidad de una fuente renovable de 35 productos químicos que se derivan normalmente del petróleo.

Un método de producción de petróleo renovable es mediante la modificación por ingeniería genética de microorganismos para producir productos de petróleo renovables. Algunos microorganismos tienen una capacidad natural para producir productos químicos. Por ejemplo, la levadura se ha usado durante siglos para producir etanol (por ejemplo, cerveza, vino, etc.). En los últimos años, a través del desarrollo de biotecnologías avanzadas, es 40 posible modificar por ingeniería genética metabólicamente un organismo para producir bioproductos que nunca se produjeron previamente. Los productos, tales como productos químicos, derivados de estas actividades celulares se conocen como bioproductos. Los combustibles producidos mediante estas actividades celulares se conocen como biocombustibles. Los biocombustibles son un combustible renovable alternativo a combustibles a base de petróleo. Los biocombustibles pueden sustituir a cualquier combustible a base de petróleo (por ejemplo, gasolina, diesel, 45 combustible de aviación, gasóleo de calefacción, etc.). Los biocombustibles pueden derivarse de fuentes renovables, tales como material vegetal, materia animal o incluso productos de desecho. Estas fuentes renovables se conocen colectivamente como biomasa. Una ventaja de los biocombustibles con respecto a los combustibles a base de petróleo es que no requieren una exploración o extracción cara y arriesgada. Además, los biocombustibles pueden producirse localmente. Por tanto, no requieren transporte a lo largo de grandes distancias. Además, los 50 biocombustibles pueden producirse directamente sin la necesidad de un refino caro y que consume mucha energía tal como es necesario con el refino de petróleo crudo. En otras circunstancias, el biocombustible puede requerir un nivel de refino limitado y económico. Además, el uso de biocombustibles mejora el medio ambiente al reducir la cantidad de emisiones perjudiciales para el medio ambiente (por ejemplo, gases invernadero, contaminación del aire, etc.) liberadas durante la combustión. Por ejemplo, los biocombustibles mantienen un ciclo del carbono 55 equilibrado porque los biocombustibles se producen a partir de biomasa, una fuente natural y renovable. Aunque la combustión de biocombustibles liberará carbono (por ejemplo, como dióxido de carbono), este carbono se reciclará durante la producción de biomasa (por ejemplo, el cultivo de cosechas), equilibrando de ese modo el ciclo del carbono a diferencia de los combustibles a base de petróleo.

Por motivos similares, los productos químicos derivados biológicamente ofrecen las mismas ventajas que los biocombustibles con respecto a los combustibles a base de petróleo. Los productos químicos derivados biológicamente son una alternativa renovable a los productos químicos. Los productos químicos derivados biológicamente, tales como hidrocarburos (por ejemplo, alcanos, alquenos o alquinos), alcoholes grasos, ésteres, ácidos grasos, aldehídos grasos y cetonas son superiores a los productos petroquímicos porque se producen 5 directamente sin refino extenso. A diferencia de los productos petroquímicos, los productos químicos derivados biológicamente no necesitan refinarse como el petróleo crudo para recuperar materiales de partida que entonces deben procesarse adicionalmente para preparar productos petroquímicos más complejos. Los productos químicos derivados biológicamente se convierten directamente a partir de biomasa en el producto químico deseado.

En el documento US 2004/0180400, se dan a conocer ácido carboxílico reductasas. Una de esas, SEQ ID NO: 2, es 10 aproximadamente idéntica al 59% con la presente SEQ ID NO: 22.

Sumario de la invención

La invención se basa, al menos en parte, en la identificación de genes que codifican polipéptidos biosintéticos de aldehídos grasos y polipéptidos biosintéticos de alcoholes grasos, que pueden usarse para producir aldehídos grasos que pueden convertirse posteriormente en alcoholes grasos. Por consiguiente, la invención presenta un 15 método de preparación de un alcohol graso según la reivindicación 1. El método incluye expresar en una célula huésped un gen que codifica un polipéptido biosintético de aldehídos grasos que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22, o una variante de la misma con al menos el 80% de identidad de secuencia y una tioesterasa. En algunas realizaciones, el método incluye además aislar el alcohol graso de la célula huésped. En algunas realizaciones, el alcohol graso está presente en el entorno extracelular. En determinadas realizaciones, el 20 alcohol graso se aísla del entorno extracelular de la célula huésped. En algunas realizaciones, el alcohol graso se secreta de la célula huésped. En realizaciones alternativas, el alcohol graso se transporta al entorno extracelular. En otras realizaciones, el alcohol graso se transporta de manera pasiva al entorno extracelular.

El polipéptido biosintético de aldehídos grasos según la reivindicación 1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 con una o más sustituciones, adiciones, inserciones o deleciones de aminoácidos, y el polipéptido 25 tiene actividad ácido carboxílico reductasa y al menos el 80% de identidad de secuencia. El polipéptido puede tener actividad ácido graso reductasa.

En algunas realizaciones, el polipéptido según la reivindicación 1 comprende una o más de las siguientes sustituciones de aminoácidos conservativas: reemplazo de un aminoácido alifático, tal como alanina, valina, leucina, y isoleucina, por otro aminoácido alifático; reemplazo de una serina por una treonina; reemplazo de una treonina por 30 una serina; reemplazo de un residuo ácido, tal como ácido aspártico y ácido glutámico, por otro residuo ácido; reemplazo de un residuo que lleva un grupo amida, tal como asparagina y glutamina, por otro residuo que lleva un grupo amida; intercambio de un residuo básico, tal como lisina y arginina, por otro residuo básico; y reemplazo de un residuo aromático, tal como fenilalanina y tirosina, por otro residuo aromático. En algunas realizaciones, el polipéptido de la reivindicación 1 tiene aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 35 100 o más sustituciones, adiciones, inserciones o deleciones de aminoácidos. El polipéptido tiene actividad ácido carboxílico reductasa. En algunas realizaciones, el polipéptido tiene actividad ácido graso reductasa.

En algunas realizaciones, el método incluye además modificar la expresión de un gen que codifica una ácido graso sintasa en la célula huésped. En determinadas realizaciones, la modificación de la expresión de un gen que codifica una ácido graso sintasa incluye expresar un gen que codifica una ácido graso sintasa en la célula huésped y/o 40 aumentar la expresión o actividad de una ácido graso sintasa endógena en la célula huésped. En realizaciones alternativas, la modificación de la expresión de un gen que codifica una ácido graso sintasa incluye atenuar un gen que codifica una ácido graso sintasa en la célula huésped y/o disminuir la expresión o actividad de una ácido graso sintasa endógena en la célula huésped. En algunas realizaciones, la ácido graso sintasa es una tioesterasa. En realizaciones particulares, la tioesterasa está codificada por tesA, tesA sin secuencia líder, tesB, fatB, fatB2, fatB3, 45 fatA, o fatA1.

En algunas realizaciones, el método incluye además expresar un gen que codifica un polipéptido biosintético de alcoholes grasos en la célula huésped. En realizaciones particulares, el polipéptido biosintético de alcoholes grasos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 94 o una variante de la misma (véase la reivindicación 3).

En otras realizaciones, la célula huésped se modifica por ingeniería genética para expresar un nivel atenuado de una 50 enzima de degradación de ácidos grasos en relación con una célula huésped silvestre. En algunas realizaciones (véase la reivindicación 4), la célula huésped se modifica por ingeniería genética para expresar un nivel atenuado de una acil-CoA sintasa en relación con una célula huésped silvestre. En realizaciones particulares, la célula huésped expresa un nivel atenuado de una acil-CoA sintasa codificada por fadD, fadK, BH3103, yhfL, Pfl-4354, EAV15023, fadD1, fadD2, RPC_4074, fadDD35, fadDD22, faa3p o el gen que codifica la proteína ZP_01644857. En 55 determinadas realizaciones, la célula huésped modificada por ingeniería genética comprende una desactivación de uno o más genes que codifican una enzima de degradación de ácidos grasos, tal como los genes de acil-CoA sintasa mencionados anteriormente.

Aún en otras realizaciones, la célula huésped se modifica por ingeniería genética para expresar un nivel atenuado de una enzima deshidratasa/isomerasa, tal como una enzima codificada por fabA o por un gen enumerado en la figura 15. En algunas realizaciones, la célula huésped comprende una desactivación de fabA o un gen enumerado en la figura 15. En otras realizaciones, la célula huésped se modifica por ingeniería genética para expresar un nivel atenuado de una cetoacil-ACP sintasa, tal como una enzima codificada por fabB o por un gen enumerado en la 5 figura 16. En determinadas realizaciones, la célula huésped comprende una desactivación de fabB o un gen enumerado en la figura 16. Aún en otras realizaciones, la célula huésped se modifica por ingeniería genética para expresar un nivel modificado de un gen que codifica una enzima desaturasa, tal como desA.

En esta descripción, el polipéptido es de una célula de mamífero, célula vegetal, célula de insecto, célula de levadura, célula de hongo, célula de hongos filamentosos, célula bacteriana o cualquier otro organismo descrito en el 10 presente documento. En algunas realizaciones, la bacteria es una micobacteria seleccionada del grupo que consiste en Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium abscessus, Mycobacterium avium, Mycobacterium bovis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Mycobacterium marinum y Mycobacterium ulcerans. En otras realizaciones, la bacteria es Nocardia sp. NRRL 5646, Nocardia farcinica, Streptomyces griseus, Salinispora arenicola o Clavibacter michiganenesis. 15

En las realizaciones de la invención, la ácido carboxílico reductasa de SEQ ID NO: 22 es de Mycobacterium smegmatis.

En algunas realizaciones, el método incluye además cultivar la célula huésped en presencia de al menos un sustrato biológico para el polipéptido biosintético de aldehídos grasos (véase la reivindicación 12).

En otro aspecto, la invención presenta un método de producción de un alcohol graso. El método incluye expresar en 20 una célula huésped un gen que codifica un polipéptido biosintético de aldehídos grasos que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 80%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 91%, al menos aproximadamente el 92%, al menos aproximadamente el 93%, al menos aproximadamente el 94%, al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 96%, al menos aproximadamente el 97%, al menos aproximadamente el 98% o al menos 25 aproximadamente el 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos es la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22.

En algunas realizaciones, el método incluye además aislar el alcohol graso de la célula huésped. En algunas realizaciones, el alcohol graso está presente en el entorno extracelular. En determinadas realizaciones, el alcohol graso se aísla del entorno extracelular de la célula huésped. En algunas realizaciones, el alcohol graso se secreta de 30 la célula huésped. En realizaciones alternativas, el alcohol graso se transporta al entorno extracelular. En otras realizaciones, el alcohol graso se transporta de manera pasiva al entorno extracelular.

En algunas realizaciones, el método incluye además modificar la expresión de un gen que codifica una ácido graso sintasa en la célula huésped. En determinadas realizaciones, la modificación de la expresión de un gen que codifica una ácido graso sintasa incluye expresar un gen que codifica una ácido graso sintasa en la célula huésped y/o 35 aumentar la expresión o actividad de una ácido graso sintasa endógena en la célula huésped. En realizaciones alternativas, la modificación de la expresión de un gen que codifica una ácido graso sintasa incluye atenuar un gen que codifica una ácido graso sintasa en la célula huésped y/o disminuir la expresión o actividad de una ácido graso sintasa endógena en la célula huésped. En algunas realizaciones, la ácido graso sintasa es una tioesterasa. En realizaciones particulares, la tioesterasa está codificada por tesA, tesA sin secuencia líder, tesB, fatB, fatB2, fatB3, 40 fatA o fatA1.

En otras realizaciones, la célula huésped se modifica por ingeniería genética para expresar un nivel atenuado de una 45 enzima de degradación de ácidos grasos en relación con una célula huésped silvestre. En algunas realizaciones, la célula huésped se modifica por ingeniería genética para expresar un nivel atenuado de una acil-CoA sintasa en relación con una célula huésped silvestre. En realizaciones particulares, la célula huésped expresa un nivel atenuado de una acil-CoA sintasa codificada por fadD, fadK, BH3103, yhfL, Pfl-4354, EAV15023, fadD1, fadD2, RPC_4074, fadDD35, fadDD22, faa3p o el gen que codifica la proteína ZP_01644857. En determinadas 50 realizaciones, la célula huésped modificada por ingeniería genética comprende una desactivación de uno o más genes que codifican una enzima de degradación de ácidos grasos, tal como los genes de acil-CoA sintasa mencionados anteriormente.

Aún en otras realizaciones, la célula huésped se modifica por ingeniería genética para expresar un nivel atenuado de una enzima deshidratasa/isomerasa, tal como una enzima codificada por fabA o por un gen enumerado en la figura 55 15. En algunas realizaciones, la célula huésped comprende una desactivación de fabA o un gen enumerado en la figura 15. En otras realizaciones, la célula huésped se modifica por ingeniería genética para expresar un nivel atenuado de una cetoacil-ACP sintasa, tal como una enzima codificada por fabB o por un gen enumerado en la

figura 16. En determinadas realizaciones, la célula huésped comprende una desactivación de fabB o un gen enumerado en la figura 16. Aún en otras realizaciones, la célula huésped se modifica por ingeniería genética para expresar un nivel modificado de un gen que codifica una enzima desaturasa, tal como desA.

En algunas realizaciones, el polipéptido es de una bacteria, una planta, un insecto, una levadura, un hongo o un mamífero. 5

En determinadas realizaciones, el polipéptido es de una célula de mamífero, célula vegetal, célula de insecto, célula de levadura, célula de hongo, célula de hongos filamentosos, célula bacteriana o cualquier otro organismo descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, la bacteria es una micobacteria seleccionada del grupo que consiste en Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium abscessus, Mycobacterium avium, Mycobacterium bovis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Mycobacterium marinum y Mycobacterium ulcerans. En otras 10 realizaciones, la bacteria es Nocardia sp. NRRL 5646, Nocardia farcinica, Streptomyces griseus, Salinispora arenicola o Clavibacter michiganenesis.

En algunas realizaciones, el método incluye además aislar el alcohol graso de la célula huésped. En algunas 15 realizaciones, el alcohol graso está presente en el entorno extracelular. En determinadas realizaciones, el alcohol graso se aísla del entorno extracelular de la célula huésped. En algunas realizaciones, el alcohol graso se secreta de la célula huésped. En realizaciones alternativas, el alcohol graso se transporta al entorno extracelular. En otras realizaciones, el alcohol graso se transporta de manera pasiva al entorno extracelular.

En algunas realizaciones, el método incluye además modificar la expresión de un gen que codifica una ácido graso 20 sintasa en la célula huésped. En determinadas realizaciones, la modificación de la expresión de un gen que codifica una ácido graso sintasa incluye expresar un gen que codifica una ácido graso sintasa en la célula huésped y/o aumentar la expresión o actividad de una ácido graso sintasa endógena en la célula huésped. En realizaciones alternativas, la modificación de la expresión de un gen que codifica una ácido graso sintasa incluye atenuar un gen que codifica una ácido graso sintasa en la célula huésped y/o disminuir la expresión o actividad de una ácido graso 25 sintasa endógena en la célula huésped. En algunas realizaciones, la ácido graso sintasa es una tioesterasa. En realizaciones particulares, la tioesterasa está codificada por tesA, tesA sin secuencia líder, tesB, fatB, fatB2, fatB3, fatA o fatA1.

En algunas realizaciones, el método incluye además expresar un gen que codifica un polipéptido biosintético de alcoholes grasos en la célula huésped. En realizaciones particulares, el polipéptido biosintético de alcoholes grasos 30 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 94 o una variante de la misma (véase la reivindicación 3).

En otras realizaciones, la célula huésped se modifica por ingeniería genética para expresar un nivel atenuado de una enzima de degradación de ácidos grasos en relación con una célula huésped silvestre. En algunas realizaciones, la célula huésped se modifica por ingeniería genética para expresar un nivel atenuado de una acil-CoA sintasa en relación con una célula huésped silvestre. En realizaciones particulares, la célula huésped expresa un nivel 35 atenuado de una acil-CoA sintasa codificada por fadD, fadK, BH3103, yhfL, Pfl-4354, EAV15023, fadD1, fadD2, RPC_4074, fadDD35, fadDD22, faa3p o el gen que codifica la proteína ZP_01644857. En determinadas realizaciones, la célula huésped modificada por ingeniería genética comprende una desactivación de uno o más genes que codifican una enzima de degradación de ácidos grasos, tal como los genes de acil-CoA sintasa mencionados anteriormente. 40

Aún en otras realizaciones, la célula huésped se modifica por ingeniería genética para expresar un nivel atenuado de una enzima deshidratasa/isomerasa, tal como una enzima codificada por fabA o por un gen enumerado en la figura 15. En algunas realizaciones, la célula huésped comprende una desactivación de fabA o un gen enumerado en la figura 15. En otras realizaciones, la célula huésped se modifica por ingeniería genética para expresar un nivel atenuado de una cetoacil-ACP sintasa, tal como una enzima codificada por fabB o por un gen enumerado en la 45 figura 16. En determinadas realizaciones, la célula huésped comprende una desactivación de fabB o un gen enumerado en la figura 16. Aún en otras realizaciones, la célula huésped se modifica por ingeniería genética para expresar un nivel modificado de un gen que codifica una enzima desaturasa, tal como desA.

En algunas realizaciones, el polipéptido es de una bacteria, una planta, un insecto, una levadura, un hongo o un mamífero. 50

En determinadas realizaciones, el polipéptido es de una célula de mamífero, célula vegetal, célula de insecto, célula de levadura, célula de hongo, célula de hongos filamentosos, célula bacteriana o cualquier otro organismo descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, la bacteria es una micobacteria seleccionada del grupo que consiste en Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium abscessus, Mycobacterium avium, Mycobacterium bovis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Mycobacterium marinum y Mycobacterium ulcerans. En otras 55 realizaciones, la bacteria es Nocardia sp. NRRL 5646, Nocardia farcinica, Streptomyces griseus, Salinispora arenicola o Clavibacter michiganenesis.

En algunas realizaciones, el método incluye además cultivar la célula huésped en presencia de al menos un sustrato biológico para el polipéptido biosintético de aldehídos grasos.

En cualquiera de los aspectos de la invención descrita en el presente documento, los métodos pueden producir alcoholes grasos que comprenden un alcohol graso C6-C26 (véase las reivindicaciones 7 y 8). En algunas realizaciones, el alcohol graso comprende un alcohol graso C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, 5 C19, C20, C21, C22, C23, C24, C25 o C26. En realizaciones particulares, el alcohol graso es un alcohol graso C6, C8, C10, C12, C13, C14, C15, C16, C17 o C18. En determinadas realizaciones, el grupo hidroxilo del alcohol graso está en la posición primaria (C1).

En otras realizaciones, el alcohol graso comprende un alcohol graso de cadena lineal. En otras realizaciones, el alcohol graso comprende un alcohol graso de cadena ramificada. Aún en otras realizaciones, el alcohol graso 10 comprende un resto cíclico.

En algunas realizaciones, el alcohol graso es un alcohol graso insaturado. En otras realizaciones, el alcohol graso es un alcohol graso monoinsaturado. En determinadas realizaciones, el alcohol graso insaturado es un alcohol graso insaturado C6:1, C7:1, C8:1, C9:1, C10:1, C11:1, C12:1, C13:1, C14:1, C15:1, C16:1, C17:1, C18:1, C19:1, C20:1, C21:1, C22:1, C23:1, C24:1, C25:1 o C26:1. Aún en otras realizaciones, el alcohol graso está insaturado en la 15 posición omega-7. En determinadas realizaciones, el alcohol graso insaturado comprende un doble enlace cis.

Aún en otras realizaciones, el alcohol graso es un alcohol graso saturado.

En cualquiera de los aspectos de la invención descrita en el presente documento, un sustrato para un polipéptido biosintético de aldehídos grasos puede ser un ácido graso. En algunas realizaciones, el ácido graso comprende un ácido graso C6-C26. En algunas realizaciones, el ácido graso comprende un ácido graso C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, 20 C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21, C22, C23, C24, C25 o C26. En realizaciones particulares, el ácido graso es un ácido graso C6, C8, C10, C12, C13, C14, C15, C16, C17 o C18.

En otras realizaciones, el ácido graso comprende un ácido graso de cadena lineal. En otras realizaciones, el ácido graso comprende un ácido graso de cadena ramificada. Aún en otras realizaciones, el ácido graso comprende un resto cíclico. 25

En algunas realizaciones, el ácido graso es un ácido graso insaturado. En otras realizaciones, el ácido graso es un ácido graso monoinsaturado. Aún en otras realizaciones, el ácido graso es un ácido graso saturado.

En otro aspecto, la descripción presenta un alcohol graso producido mediante cualquiera de los métodos o cualquiera de los microorganismos descritos en el presente documento, o un tensioactivo que comprende un alcohol graso producido mediante cualquiera de los métodos o cualquiera de los microorganismos descritos en el presente 30 documento.

El alcohol graso puede tener una 13C de aproximadamente -15,4 o mayor, o el alcohol graso puede tener una 13C de aproximadamente -15,4 a aproximadamente -10,9, o de aproximadamente -13,92 a aproximadamente -13,84.

El alcohol graso puede tener una fM14C de al menos aproximadamente 1,003, o el alcohol graso tiene una fM14C de al menos aproximadamente 1,01 o al menos aproximadamente 1,5, o el alcohol graso puede tener una fM14C de 35 aproximadamente 1,111 a aproximadamente 1,124.

En cualquiera de los aspectos descritos en el presente documento, un alcohol graso se produce a un rendimiento de 25 mg/l, aproximadamente 50 mg/l, aproximadamente 75 mg/l, aproximadamente 100 mg/l, aproximadamente 125 mg/l, aproximadamente 150 mg/l, aproximadamente 175 mg/l, aproximadamente 200 mg/l, aproximadamente 225 mg/l, aproximadamente 250 mg/l, aproximadamente 275 mg/l, aproximadamente 300 mg/l, aproximadamente 40 325 mg/l, aproximadamente 350 mg/l, aproximadamente 375 mg/l, aproximadamente 400 mg/l, aproximadamente 425 mg/l, aproximadamente 450 mg/l, aproximadamente 475 mg/l, aproximadamente 500 mg/l, aproximadamente 525 mg/l, aproximadamente 550 mg/l, aproximadamente 575 mg/l, aproximadamente 600 mg/l, aproximadamente 625 mg/l, aproximadamente 650 mg/l, aproximadamente 675 mg/l, aproximadamente 700 mg/l, aproximadamente 725 mg/l, aproximadamente 750 mg/l, aproximadamente 775 mg/l, aproximadamente 800 mg/l, aproximadamente 45 825 mg/l, aproximadamente 850 mg/l, aproximadamente 875 mg/l, aproximadamente 900 mg/l, aproximadamente 925 mg/l, aproximadamente 950 mg/l, aproximadamente 975 mg/l, aproximadamente 1000 g/l, aproximadamente 1050 mg/l, aproximadamente 1075 mg/l, aproximadamente 1100 mg/l, aproximadamente 1125 mg/l, aproximadamente 1150 mg/l, aproximadamente 1175 mg/l, aproximadamente 1200 mg/l, aproximadamente 1225 mg/l, aproximadamente 1250 mg/l, aproximadamente 1275 mg/l, aproximadamente 1300 mg/l, aproximadamente 50 1325 mg/l, aproximadamente 1350 mg/l, aproximadamente 1375 mg/l, aproximadamente 1400 mg/l, aproximadamente 1425 mg/l, aproximadamente 1450 mg/l, aproximadamente 1475 mg/l, aproximadamente 1500 mg/l, aproximadamente 1525 mg/l, aproximadamente 1550 mg/l, aproximadamente 1575 mg/l, aproximadamente 1600 mg/l, aproximadamente 1625 mg/l, aproximadamente 1650 mg/l, aproximadamente 1675 mg/l, aproximadamente 1700 mg/l, aproximadamente 1725 mg/l, aproximadamente 1750 mg/l, aproximadamente 1775 55 mg/l, aproximadamente 1800 mg/l, aproximadamente 1825 mg/l, aproximadamente 1850 mg/l, aproximadamente 1875 mg/l, aproximadamente 1900 mg/l, aproximadamente 1925 mg/l, aproximadamente 1950 mg/l,

aproximadamente 1975 mg/l, aproximadamente 2000 mg/l, o más.

En otro aspecto, la invención presenta un método de preparación de un alcohol graso descrito en el presente documento. El método incluye cultivar una célula huésped descrita en el presente documento en un medio que tiene un bajo nivel de hierro, en condiciones suficientes para producir un alcohol graso, tal como se describe en el presente documento. En realizaciones particulares, el medio contiene menos de aproximadamente 500 M de hierro, 5 menos de aproximadamente 400 M de hierro, menos de aproximadamente 300 M de hierro, menos de aproximadamente 200 M de hierro, menos de aproximadamente 150 M de hierro, menos de aproximadamente 100 M de hierro, menos de aproximadamente 90 M de hierro, menos de aproximadamente 80 M de hierro, menos de aproximadamente 70 M de hierro, menos de aproximadamente 60 M de hierro, menos de aproximadamente 50 M de hierro, menos de aproximadamente 40 M de hierro, menos de aproximadamente 10 30 M de hierro, menos de aproximadamente 20 M de hierro, menos de aproximadamente 10 M de hierro o menos de aproximadamente 5 M de hierro. En determinadas realizaciones, el medio no contiene hierro.

En cualquiera de los aspectos descritos en el presente documento, se produce un alcohol graso en una célula huésped o un microorganismo descrito en el presente documento a partir de una fuente de carbono.

Las siguientes figuras se presentan para el fin de ilustración sólo. 15

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es una representación gráfica de alcoholes grasos producidos por cepas de E. coli recombinantes transformadas con diversos plásmidos.

La figura 2 es una representación gráfica de dos perfiles de CG/EM de compuestos orgánicos producidos por cepas de E. coli recombinantes transformadas con diversos plásmidos. 20

La figura 3 es un esquema de una nueva ruta para la producción de alcoholes grasos.

La figura 4 es una representación de un gel de productos de PCR de células silvestres MG1655, células fadD::cm y células fadD.

La figura 5A es un perfil de CG/EM de la producción de alcoholes grasos en células MG1655(DE3, fadD)/pETDUet-1-tesA+ pHZ1.140B. La figura 5B es un perfil de CG/EM de la producción de alcoholes grasos en células 25 MG16655(DE3, fadD, yjgB::kan)/pETDUet-1-tesA+ pHZ1.140B. La figura 5C es un perfil de CG/EM de la producción de alcoholes grasos en células MG16655(DE3, fadD,yjgB::kan)/pOF1+ pHZ1.140B. Las flechas en la figura 5A, figura 5B y figura 5C indican la ausencia de aldehídos grasos C12:0.

La figura 6 es una lista de la secuencia de nucleótidos y la correspondiente secuencia de aminoácidos del gen car de Nocardia sp. NRRL 5646. 30

La figura 7 es una lista de motivos de secuencia de aminoácidos para homólogos de CAR.

La figura 8 es una lista de secuencias de nucleótidos y aminoácidos de genes homólogos de car.

La figura 9 es una tabla que identifica genes a modo de ejemplo que pueden expresarse, sobreexpresarse o atenuarse para aumentar la producción de sustratos particulares.

La figura 10 es una lista de secuencias de nucleótidos y aminoácidos de genes de alcohol deshidrogenasa. 35

La figura 11 es una representación gráfica de la producción de alcoholes grasos en diversos mutantes de deleción de E. coli.

La figura 12 es una representación gráfica de la producción de alcoholes grasos en diversos mutantes de deleción de E. coli.

La figura 13 es un perfil de CG/EM de la producción de alcoholes grasos saturados en E. coli. 40

La figura 14A es una representación gráfica de la producción de alcoholes grasos en diversos medios de cultivo Hu9. La figura 14B es una representación gráfica de la producción de alcoholes grasos en diversos medios de cultivo Hu9.

La figura 15 es una lista de secuencias de nucleótidos y aminoácidos de genes relacionados con fabA.

La figura 16 es una lista de secuencias de nucleótidos y aminoácidos de genes relacionados con fabB. 45

La figura 17 es una lista de secuencias de nucleótidos y aminoácidos adicionales de la descripción.

Descripción detallada de la invención

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto habitual en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque pueden usarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la práctica o las pruebas de la presente invención, a continuación se describen métodos y materiales adecuados. Además, los materiales, métodos y ejemplos son ilustrativos. 5

Otras características y ventajas de la invención resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, y a partir de las reivindicaciones.

Definiciones

A lo largo de toda la memoria descriptiva, puede hacerse referencia usando un nombre de polipéptido o nombre de gen abreviado, pero se entiendo que tal nombre de polipéptido o nombre de gen abreviado representa el género de 10 genes o polipéptidos. Tales nombres de gen incluyen todos los genes que codifican el mismo polipéptido y polipéptidos homólogos que tienen la misma función fisiológica. Los nombres de polipéptido incluyen todos los polipéptidos que tienen la misma actividad (por ejemplo, que catalizan la misma reacción química fundamental).

A menos que se indique lo contrario, los números de registro a los que se hace referencia en el presente documento se derivan de la base de datos de NCBI (National Center for Biotechnology Information) mantenido por el National 15 Institute of Health, EE.UU. A menos que se indique lo contrario, los números de registro son tal como se proporcionan en la base de datos de octubre de 2008.

Los números EC se establecen por el Nomencalture Committee de la International Union of Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUBMB) (disponible en http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/). Los números EC a los que se hace referencia en el presente documento se derivan de la base de datos KEGG Ligand, mantenida por la 20 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomics, subvencionada en parte por la Universidad de Tokio. A menos que se indique lo contrario, los números EC son tal como se proporcionan en la base de datos en octubre de 2008.

Los artículos “un” y “una” se usan en el presente documento para referirse a uno o a más de uno (es decir, a al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, “un elemento” significa un elemento o más de un elemento. 25

El término “aproximadamente” se usa en el presente documento para significar un valor ± 20% de un valor numérico dado. Por tanto, “aproximadamente el 60%” significa un valor de entre 60 ± (20% de 60) (es decir, entre 48 y 70).

Tal como se usa en el presente documento, el término “alcohol deshidrogenasa” (EC 1.1.1.*) es un péptido que puede catalizar la conversión de un aldehído graso en un alcohol (por ejemplo, alcohol graso). Adicionalmente, un experto habitual en la técnica apreciará que algunas alcohol deshidrogenasas también catalizarán otras reacciones. 30 Por ejemplo, algunas alcohol deshidrogenasas aceptarán otros sustratos además de aldehídos grasos. Por tanto tales alcohol deshidrogenasas no específicas también están incluidas en esta definición. En la técnica se conocen secuencias de ácido nucleico que codifican alcohol deshidrogenasas, y tales alcohol deshidrogenasas están disponibles públicamente. En la figura 9 se proporcionan números de registro de GenBank a modo de ejemplo.

Tal como se usa en el presente documento, el término “atenuar” significa debilitar, reducir o disminuir. Por ejemplo, 35 un polipéptido puede atenuarse modificando el polipéptido para reducir su actividad (por ejemplo, modificando una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido).

Tal como se usa en el presente documento, el término “biodiesel” significa un biocombustible que puede ser un sustituto de diesel, que se deriva de petróleo. Pude usarse biodiesel en motores diesel de combustión interna o bien en forma pura, que se denomina biodiesel “no mezclado”, o como mezcla en cualquier concentración con diesel a 40 base de petróleo. Biodiesel puede incluir ésteres o hidrocarburos, tales como alcoholes.

Tal como se usa en el presente documento, el término “biocombustible” se refiere a cualquier combustible derivado a partir de biomasa. Los biocombustibles pueden sustituirse por combustibles a base de petróleo. Por ejemplo, los biocombustibles incluyen combustible para medios de transporte (por ejemplo, gasolina, diesel, combustible para motores a reacción, etc.), combustible para calefacción y combustibles para la generación de electricidad. Los 45 biocombustibles son una fuente de energía renovable.

Tal como se usa en el presente documento, el término “biomasa” se refiere a cualquier material biológico a partir del cual se deriva una fuente de carbono. En algunos casos, una biomasa se procesa para dar una fuente de carbono, que es adecuada para la bioconversión. En otros casos, la biomasa puede no requerir procesamiento adicional para dar una fuente de carbono. La fuente de carbono puede convertirse en un biocombustible. Una fuente de biomasa a 50 modo de ejemplo es materia vegetal o vegetación. Por ejemplo puede usarse maíz, caña de azúcar o césped como biomasa. Otro ejemplo no limitativo de biomasa son los desechos metabólicos, tales como materia animal, por ejemplo estiércol de vaca. Además, la biomasa puede incluir algas y otras plantas marinas. La biomasa también incluye productos de desecho de la industria, agricultura, silvicultura y desechos domésticos. Ejemplos de tales productos de desecho que pueden usarse como biomasa son desechos de fermentación, ensilado, paja, madera, 55 aguas residuales, basura, desechos urbanos celulósicos y restos de comida. La biomasa también incluye fuentes de

carbono, tales como hidratos de carbono (por ejemplo, monosacáridos, disacáridos o polisacáridos).

Tal como se usa en el presente documento, la expresión “fuente de carbono” se refiere a un sustrato o compuesto adecuado para usarse como fuente de carbono para el crecimiento de células procariotas o eucariotas simples. Las fuentes de carbono pueden estar en diversas formas, incluyendo, pero sin limitarse a polímeros, hidratos de carbono, ácidos, alcoholes, aldehídos, cetonas, aminoácidos, péptidos y gases (por ejemplo, CO y CO2). Estas 5 incluyen, por ejemplo, diversos monosacáridos, tales como glucosa, fructosa, manosa y galactosa; oligosacáridos, tales como fructo-oligosacárido y galacto-oligosacárido; polisacáridos tales como xilosa y arabinosa; disacáridos, tales como sacarosa, maltosa y turanosa; material celulósico, tal como metilcelulosa y carboximetilcelulosa de sodio; ésteres de ácidos grasos saturados o insaturados, tales como succinato, lactato y acetato; alcoholes, tales como etanol, metanol y glicerol, o mezclas de los mismos. La fuente de carbono también puede ser un producto de 10 fotosíntesis, incluyendo, pero sin limitarse a, glucosa. Una fuente de carbono preferida es biomasa. Otra fuente de carbono preferida es glucosa.

Una secuencia de nucleótidos es “complementaria” a otra secuencia de nucleótidos si cada una de las bases de las dos secuencias se aparea (es decir, puede formar pares de bases de Watson Crick). El término “hebra complementaria” se usa en el presente documento de manera intercambiable con el término “complemento”. El 15 complemento de una hebra de ácido nucleico puede ser el complemento de una hebra codificante o el complemento de una hebra no codificante.

Tal como se usa en el presente documento, un “aditivo que reduce el punto de turbidez” es un aditivo añadido a una composición para disminuir o reducir el punto de turbidez de una disolución.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión “punto de turbidez de un fluido” significa la temperatura a la 20 que los sólidos disueltos ya no son completamente solubles. Por debajo de esta temperatura, los sólidos empiezan a precipitar como una segunda fase dando al fluido una apariencia turbia. En la industria petrolera, el punto de turbidez se refiere a la temperatura por debajo de la cual un material solidificado u otro hidrocarburo pesado cristaliza para dar un aceite crudo, aceite refinado o combustible para formar una apariencia turbia. La presencia de materiales solidificados influye en el comportamiento de flujo del fluido, la tendencia del fluido a obstruir los filtros de 25 combustible, inyectores, etc., la acumulación de materiales solidificados sobre superficies frías (por ejemplo, incrustación de una tubería o un intercambiador de calor) y las características de emulsión del fluido con agua.

Tal como se usa en el presente documento, el término “condiciones suficientes para permitir la expresión” significa cualquier condición que permite a una célula huésped producir un producto deseado, tal como un polipéptido o aldehído graso descrito en el presente documento. Las condiciones adecuadas incluyen, por ejemplo, condiciones 30 de fermentación. Las condiciones de fermentación pueden comprender muchos parámetros, tales como intervalos de temperatura, niveles de aireación y composición de medios. Cada una de estas condiciones, individualmente y en combinación, permite que la célula huésped crezca. Los medios de cultivo a modo de ejemplo incluyen caldos o geles. Generalmente, el medio incluye una fuente de carbono, tal como glucosa, fructosa, celulosa, o similares, que puede metabolizarse por una célula huésped directamente. Además, pueden usarse enzimas en el medio para 35 facilitar la movilización (por ejemplo, la despolimerización de almidón o celulosa para dar azúcares fermentables) y el metabolismo posterior de la fuente de carbono.

Para determinar si las condiciones son suficientes para permitir la expresión, puede cultivarse una célula huésped, por ejemplo, durante aproximadamente 4, 8, 12, 24, 36 ó 48 horas. Durante y/o tras el cultivo, pueden obtenerse muestras y analizarse para determinar si las condiciones permiten la expresión. Por ejemplo, las células huésped en 40 la muestra o el medio en el que se hicieron crecer las células huésped pueden someterse a prueba para determinar la presencia de un producto deseado. Cuando se somete a prueba para determinar la presencia de un producto, pueden usarse ensayos, tales como, pero sin limitarse a, CCF, HPLC, CG/FID, CG/EM, CL/EM, EM.

Se entiende que los polipéptidos descritos en el presente documento pueden tener sustituciones de aminoácidos conservativas o no esenciales adicionales, que no tienen un efecto sustancial sobre las funciones del polipéptido. 45 Puede determinarse si una sustitución particular se tolerará (es decir, no afectará de manera adversa a las propiedades biológicas deseadas, tales como actividad de ácido carboxílico reductasa) tal como se describe en Bowie et al. Science (1990) 247:1306 1310. Una “sustitución de aminoácido conservadora” es una en la que el residuo de aminoácido se remplaza por un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. En la técnica se han definido las familias de residuos de aminoácido que tienen cadenas laterales similares. Estas familias 50 incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales ramificadas en beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). 55

Tal como se usa en el presente documento, “elemento de control” significa un elemento de control de la transcripción. Los elementos de control incluyen promotores y potenciadores. El término “elemento promotor”, “promotor” o “secuencia promotora” se refiere a una secuencia de ADN que funciona como interruptor que activa la expresión de un gen. Si se activa el gen, se dice que se transcribe o que participa en la transcripción. La

transcripción implica la síntesis de ARNm a partir del gen. Por tanto, un promotor sirve como un elemento regulador de la transcripción y también proporciona un sitio para el inicio de la transcripción del gen para dar ARNm. Los elementos de control interaccionan específicamente con proteínas celulares implicadas en la transcripción (Maniatis et al, Science 236:1237, 1987).

Tal como se usa en el presente documento, el término “ácido graso” significa un ácido carboxílico que tiene la 5 fórmula RCOOH. R representa un grupo alifático, preferiblemente un grupo alquilo. R puede comprender entre aproximadamente 4 y aproximadamente 22 átomos de carbono. Los ácidos grasos pueden estar saturados, monoinsaturados o poliinsaturados. En una realización preferida, el ácido graso se prepara a partir de una ruta de biosíntesis de ácidos grasos.

Tal como se usa en el presente documento, el término “ruta de biosíntesis de ácidos grasos” significa una ruta de 10 biosíntesis que produce ácidos grasos. La ruta de biosíntesis de ácidos grasos incluye ácido graso sintasas que pueden diseñarse por ingeniería genética, tal como se describe en el presente documento, para producir ácidos grasos, y en algunas realizaciones pueden expresarse con enzimas adicionales para producir ácidos grasos que tienen características de la cadena de carbono deseadas.

Tal como se usa en el presente documento, el término “enzima de degradación de ácidos grasos” significa una 15 enzima implicada en la descomposición o conversión de un ácido graso o derivado de ácido graso para dar otro producto. Un ejemplo no limitativo de una enzima de degradación de ácidos grasos es una acil-CoA sintasa. En el presente documento se describen ejemplos adicionales de enzimas de degradación de ácidos grasos.

Tal como se usa en el presente documento, el término “derivado de ácido graso” significa productos preparados en parte a partir de la ruta de biosíntesis de ácidos grasos del organismo huésped de producción. “Derivado de ácido 20 graso” también incluye productos preparados en parte a partir de acil-ACP o derivados de acil-ACP. La ruta de biosíntesis de ácidos grasos incluye enzimas ácido graso sintasa que pueden diseñarse por ingeniería genética tal como se describe en el presente documento para producir derivados de ácido graso, y en algunos ejemplos pueden expresarse con enzimas adicionales para producir derivados de ácido graso que tienen características de cadena de carbono deseadas. Los derivados de ácido graso a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, ácidos grasos, acil-CoA, 25 aldehído graso, alcoholes de cadena corta y larga, hidrocarburos, alcoholes grasos y ésteres (por ejemplo, ceras, ésteres de ácidos grasos o ésteres grasos).

Tal como se usa en el presente documento, el término “enzima de derivado de ácido graso” significa cualquier enzima que puede expresarse o sobreexpresarse en la producción de derivados de ácido graso. Estas enzimas pueden ser parte de la ruta de biosíntesis de ácidos grasos. Los ejemplos no limitativos de enzimas de derivado de 30 ácido graso incluyen ácido graso sintasas, tioesterasas, acil-CoA sintasas, acil-CoA reductasas, alcohol deshidrogenasas, alcohol aciltransferasas, acil-CoA que forma alcohol graso reductasas, ácido graso (ácido carboxílico) reductasas, acil-ACP reductasas, ácido graso hidroxilasas, acil-CoA desaturasas, acil-ACP desaturasas, acil-CoA oxidasas, acil-CoA deshidrogenasas, éster sintasas y polipéptidos biosintéticos de alcanos, etc. Las enzimas de derivado de ácido graso pueden convertir un sustrato en un derivado de ácido graso. En algunos 35 ejemplos, el sustrato puede ser un derivado de ácido graso que la enzima de derivado de ácido graso convierte en un derivado de ácido graso diferente.

Tal como se usa en el presente documento, “enzima de ácido graso” significa cualquier enzima implicada en la biosíntesis de ácidos grasos. Las enzimas de ácido graso pueden modificarse en células huésped para producir ácidos grasos. Los ejemplos no limitativos de enzimas de ácido graso incluyen ácido graso sintasas y tioesterasas. 40 En el presente documento se describen ejemplos adicionales de enzimas de ácido graso.

Tal como se usa en el presente documento, “ácido graso sintasa” significa cualquier enzima implicada en biosíntesis de ácidos grasos. Las ácido graso sintasas pueden expresarse o sobreespresarse en células huésped para producir ácidos grasos. Un ejemplo no limitativo de una ácido graso sintasa es una tioesterasa. En el presente documento se describen ejemplos adicionales de ácido graso sintasas. 45

Tal como se usa en el presente documento, “aldehído graso” significa un aldehído que tiene la fórmula RCHO caracterizado por un grupo carbonilo insaturado (C=O). En una realización preferida, el aldehído graso es cualquier aldehído preparado a partir de un ácido graso o derivado de ácido graso. En una realización, el grupo R tiene al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 carbonos de longitud.

R puede ser una cadena lineal o ramificada. Las cadenas ramificadas pueden tener uno o más puntos de 50 ramificación. Además, las cadenas ramificadas pueden incluir ramificaciones cíclicas.

Además, R puede estar saturado o insaturado. Si está insaturado, R puede tener uno o más puntos de insaturación.

En una realización, el aldehído graso se produce de manera biosíntetica.

Los aldehídos grasos tienen muchos usos. Por ejemplo, los aldehídos grasos pueden usarse para producir muchos productos químicos especializados. Por ejemplo, los aldehídos grasos se usan para producir polímeros, resinas, 55 tintes, saborizantes, plastificantes, perfumes, productos farmacéuticos y otros productos químicos. Algunos se usan

como disolventes, conservantes o desinfectantes. Algunos compuestos naturales y sintéticos, tales como vitaminas y hormonas, son aldehídos.

Los términos “polipéptido biosintético de aldehído graso”, “ácido carboxílico reductasa” y “CAR” se usan de manera intercambiable en el presente documento.

Tal como se usa en el presente documento, “alcohol graso” significa un alcohol que tiene la fórmula ROH. En una 5 realización preferida, el alcohol graso es cualquier alcohol preparado a partir de un ácido graso o derivado de ácido graso. En una realización, el grupo R tiene al menos aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 carbonos de longitud.

R puede ser una cadena lineal o ramificada. Las cadenas ramificadas pueden tener uno o más puntos de ramificación. Además, las cadenas ramificadas pueden incluir ramificaciones cíclicas. 10

En una realización, el alcohol graso se produce de manera biosintética.

Los alcoholes grasos tienen muchos usos. Por ejemplo, pueden usarse alcoholes grasos para producir muchos productos químicos especializados. Por ejemplo, se usan alcoholes grasos como un biocombustible; como disolventes para grasas, ceras, gomas y resinas; en ungüentos, emolientes y lociones farmacéuticos; como aditivos 15 de aceite lubricante; en detergentes y emulsionantes; como agentes antiestáticos y de acabado de material textil; como plastificantes; como tensioactivos no iónicos; y en cosméticos, por ejemplos como espesantes.

Tal como se usa en el presente documento, “fracción de carbono moderno” o “fM” tiene el mismo significado que el definido por el National Institute of Standards and Technology (NIST), Standard Reference Materials (SRM) 4990B y 4990C, conocido como patrones de ácidos oxálicos HOxI y HOxII, respectivamente. La definición fundamental se 20 refiere a 0,95 veces la razón de isótopos 14C/12C de HOxI (en referencia a AD 1950). Esto es aproximadamente equivalente a madera anterior a la revolución industrial corregida para la descomposición. Para la biosfera viva actual (material vegetal), fM es de aproximadamente 1,1.

“Desactivación génica”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un procedimiento mediante el cual un gen que codifica una proteína diana se modifica o se inactiva para reducir o eliminar la función de la proteína 25 intacta. La inactivación del gen puede realizarse mediante métodos generales tales como mutagénesis mediante irradiación con UV o tratamiento con N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina, mutagénesis dirigida al sitio, recombinación homóloga, mutagénesis de inserción-deleción o “integración dirigida por Red” (Datsenko et al, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 97:6640-45, 2000). Por ejemplo, en una realización, se introduce un constructo en una célula huésped, de manera que es posible seleccionar acontecimientos de recombinación homóloga en la célula huésped. Un experto 30 en la técnica puede diseñar fácilmente un constructo de desactivación incluyendo genes de selección tanto positiva como negativa para seleccionar eficazmente células transfectadas que experimentan un acontecimiento de recombinación homóloga con el constructo. La alteración en la célula huésped puede obtenerse, por ejemplo, remplazando mediante una recombinación de cruzamiento individual o doble una secuencia de ADN silvestre por una secuencia de ADN que contiene la alteración. Para la selección conveniente de transformantes, la alteración 35 puede ser, por ejemplo, una secuencia de ADN que codifica un marcador de resistencia a antibióticos o un gen que complementa una posible auxotrofía de la célula huésped. Las mutaciones incluyen, pero no se limitan a, mutaciones de deleción-inserción. Un ejemplo de una alteración de este tipo incluye una alteración génica, es decir, una perturbación de un gen de manera que el producto que se produce normalmente a partir de este gen no se produce en una forma funcional. Esto puede deberse a una deleción completa, una deleción e inserción de un 40 marcador selectivo, una inserción de un marcador selectivo, una mutación por desplazamiento de marco, una deleción en el marco, o una mutación puntual que conduce a la terminación prematura. En algunos casos, todo el ARNm para el gen está ausente. En otras situaciones, la cantidad de ARNm producido varía.

Pueden realizarse cálculos de “homología” entre dos secuencias tal como sigue. Las secuencias se alinean con fines de comparación óptima (por ejemplo, pueden introducirse huecos en uno o ambos de una primera y una 45 segunda secuencia de aminoácidos o ácido nucleico para el alineamiento óptimo y puede no tenerse en cuenta las secuencias no homólogas con fines de comparación). La longitud de una secuencia de referencia que se alinea con fines de comparación es de al menos aproximadamente el 30%, preferiblemente al menos aproximadamente del 40%, más preferiblemente al menos aproximadamente del 50%, incluso más preferiblemente al menos aproximadamente del 60%, e incluso más preferiblemente al menos aproximadamente del 70%, al menos 50 aproximadamente del 80%, al menos aproximadamente del 90% o aproximadamente del 100% de la longitud de la secuencia de referencia. Entonces se comparan los residuos de aminoácido o nucleótidos en las posiciones de aminoácido o posiciones de nucleótido correspondientes. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición (tal como se usa en el presente documento, “identidad” de 55 aminoácido o ácido nucleico es equivalente a “homología” de aminoácido o ácido nucleico). El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas que comparten las secuencias, teniendo en cuenta el número de huecos y la longitud de cada hueco, que es necesario introducir para

el alineamiento óptimo de las dos secuencias.

La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de homología entre dos secuencias pueden lograrse usando un algoritmo matemático. El porcentaje de homología entre dos secuencias de aminoácidos se determina usando el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970), J. MoI. Biol. 48:444 453, que se ha incorporado en el programa GAP en el paquete de software GCG, usando o bien una matriz Blossum 62 o bien una matriz PAM250, 5 y un peso de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ó 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 ó 6. Aún en otra realización preferida, el porcentaje de homología entre dos secuencias de nucleótidos se determina usando el programa GAP en el paquete de software GCG, usando una matriz NWSgapdna.CMP y un peso de hueco de 40, 50, 60, 70 ó 80 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 ó 6. Un conjunto particularmente preferido de parámetros (y el que deberían usarse si el técnico no está seguro de que parámetros deben aplicarse para determinar si una molécula está dentro 10 de una limitación de homología de las reivindicaciones) son la matriz de puntuación Blossum 62 con una penalización de hueco de 12, una penalización de extensión de hueco de 4, y una penalización de hueco de desplazamiento de marco de 5.

Tal como se usa en el presente documento, una “célula huésped” es una célula usada para producir un producto descrito en el presente documento (por ejemplo, un alcohol graso descrito en el presente documento). Una célula 15 huésped puede modificarse para expresar o sobreexpresar genes seleccionados o para que tenga una expresión atenuada de genes seleccionados. Los ejemplos no limitativos de células huésped incluyen células vegetales, animales, humanas, de bacterias, levaduras u hongos filamentosos.

Tal como se usa en el presente documento, el término “se hibrida en condiciones de baja rigurosidad, rigurosidad media, alta rigurosidad o muy alta rigurosidad” describe condiciones para la hibridación y el lavado. Puede 20 encontrarse orientación para realizar reacciones de hibridación en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1 – 6.3.6. En esta referencia se describen métodos acuosos y no acuosos y puede usarse cualquiera de los métodos. Condiciones de hibridación específicas a las que se hace referencia en el presente documento son tal como siguen: 1) condiciones de hibridación de baja rigurosidad en 6X cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45ºC, seguido por dos lavados en 0,2X SSC, SDS al 0,1% al 25 menos a 50ºC (la temperatura de los lavados puede aumentarse hasta 55ºC para las condiciones de baja rigurosidad); 2) condiciones de hibridación de rigurosidad media en 6X SSC a aproximadamente 45ºC, seguido por uno o más lavados en 0,2X SSC, SDS al 0,1% a 60ºC; 3) condiciones de hibridación de alta rigurosidad en 6X SSC a aproximadamente 45ºC, seguido por uno o más lavados en 0,2X SSC, SDS al 0,1% a 65ºC; y preferiblemente 4) condiciones de hibridación de muy alta rigurosidad son fosfato de sodio 0,5 M, SDS al 7% a 65ºC, seguido por uno o 30 más lavados a 0,2X SSC, SDS al 1% a 65ºC. Las condiciones de muy alta rigurosidad (4) son las condiciones preferidas a menos que se especifique lo contrario.

El término “aislado” tal como se usa en el presente documento con respecto a ácidos nucleicos, tales como ADN o ARN, se refiere a moléculas separadas de otros ADN o ARN, respectivamente, que están presentes en la fuente natural del ácido nucleico. Además, por un “ácido nucleico aislado” se pretende incluir fragmentos de ácido nucleico, 35 que no se producen de manera natural como fragmentos y no se encuentran en el estado natural. El término “aislado” también se usa en el presente documento para referirse a polipéptidos, que se aíslan de otras proteínas celulares y se pretende que abarque polipéptidos tanto purificados como recombinantes. El término “aislado” tal como se usa en el presente documento también se refiere a un ácido nucleico o péptido que está sustancialmente libre de material celular, material viral o medio de cultivo cuando se produce mediante técnicas de ADN 40 recombinante. El término “aislado” tal como se usa en el presente documento también se refiere a un ácido nucleico o péptido que está sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente. El término “aislado”, tal como se usa en el presente documento con respecto a productos, tales como alcoholes grasos, se refiere a productos que se aíslan a partir de componentes celulares, medios de cultivo celulares, o precursores químicos o sintéticos. 45

Tal como se usa en el presente documento, el “nivel de expresión de un gen en una célula” se refiere al nivel de ARNm, transcripto(s) incipiente(s) pre-ARNm, productos intermedios de procesamiento de transcriptos, ARNm maduro(s) y productos de degradación codificados por el gen en la célula.

Tal como se usa en el presente documento, el término “microorganismo” significa especies microbianas procariotas y eucariotas de los dominios Archaea, Bacteria y Eucarya, incluyendo el último levaduras y hongos filamentosos, 50 protozoos, algas o protistas superiores. Los términos “células microbianas” (es decir, células de microbios) y “microbios” se usan de manera intercambiable y se refieren a células u organismos pequeños que sólo pueden observarse con la ayuda de un microscopio.

Tal como se usa en el presente documento, el término “ácido nucleico” se refiere a polinucleótidos, tales como ácido desoxirribonucleico (ADN), y cuando sea apropiado, ácido ribonucleico (ARN). También debe entenderse que el 55 término incluye, como equivalentes, análogos de cualquiera de ARN o ADN preparados a partir de análogos de nucleótidos, y tal como puede aplicarse a la realización que está describiéndose, polinucleótidos mono (sentido o antisentido) y bicatenarios, EST, cromosomas, ADNc, ARNm y ARNr.

Tal como se usa en el presente documento, el término “operativamente unido” significa que la secuencia de

nucleótidos seleccionada (por ejemplo, que codifica un polipéptido descrito en el presente documento) está en proximidad con un promotor para permitir que el promotor regule la expresión del ADN seleccionado. Además, el promotor se localiza en el sentido de 5’ de la secuencia de nucleótidos seleccionada en términos del sentido de transcripción y traducción. Por “operativamente unido” quiere decirse que una secuencia de nucleótidos y una(s) secuencia(s) reguladora(s) están conectadas de tal manera como para permitir la expresión génica cuando las 5 moléculas apropiadas (por ejemplo, proteínas activadoras de la transcripción) se unen a la(s) secuencia(s) reguladora(s).

El término “o” se usa en el presente documento para significar, y se usa de manera intercambiable con, el término “y/o”, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

Tal como se usa en el presente documento, “sobreexpresar” significa expresar o provocar que se exprese un ácido 10 nucleico, polipéptido o hidrocarburo en una célula a una concentración superior que la que se expresa normalmente en una célula silvestre correspondiente. Por ejemplo, un polipéptido puede “sobreexpresarse” en una célula huésped recombinante cuando el polipéptido está presente en una concentración superior en la célula huésped recombinante en comparación con su concentración en una célula huésped no recombinante de la misma especie.

Tal como se usa en el presente documento, “coeficiente de reparto” o “P”, se define como la concentración en 15 equilibrio de un compuesto en una fase orgánica dividida entre la concentración en equilibrio en una fase acuosa (por ejemplo, caldo de fermentación). En una realización de un sistema bifásico descrita en el presente documento, la fase orgánica se forma mediante el aldehído graso durante el procedimiento de producción. Sin embargo, en algunos ejemplos, puede proporcionarse una fase orgánica, tal como proporcionando una fase de octano, para facilitar la separación del producto. Cuando se describe un sistema de dos fases, las características de reparto de un 20 compuesto pueden describirse como logP. Por ejemplo, un compuesto con un logP de 1 se repartirá 10:1 en la fase orgánica. Un compuesto con un logP de -1 se repartirá 1:10 en la fase orgánica. Eligiendo un caldo de fermentación y una fase orgánica apropiados, un aldehído graso con un valor de logP alto puede separarse en la fase orgánica incluso a concentraciones muy bajas en el recipiente de fermentación.

Tal como se usa en el presente documento, el término “purificar”, “purificado” o “purificación” significa la retirada o el 25 aislamiento de una molécula de su entorno mediante, por ejemplo, asilamiento o separación. Las moléculas “sustancialmente purificadas” están libres al menos aproximadamente al 60%, preferiblemente libres al menos aproximadamente al 75%, y más preferiblemente libres al menos aproximadamente al 90% de otros componentes con los que están asociadas. Tal como se usa en el presente documento, estos términos también se refieren a la eliminación de contaminantes de una muestra. Por ejemplo, la eliminación de contaminantes puede dar como 30 resultado un aumento en el porcentaje de alcohol graso en una muestra. Por ejemplo, cuando se producen alcoholes grasos en una célula huésped, los alcoholes grasos pueden purificarse mediante la eliminación de proteínas de célula huésped. Tras la purificación, aumenta el porcentaje de alcoholes grasos en la muestra.

Los términos “purificar”, “purificado” y “purificación” no requieren pureza absoluta. Son términos relativos. Por tanto, por ejemplo, cuando se producen alcoholes grasos en células huésped, un alcohol graso purificado es uno que está 35 sustancialmente separado de otros componentes celulares (por ejemplo, ácidos nucleicos, polipéptidos, lípidos, hidratos de carbono u otros hidrocarburos). En otro ejemplo, una preparación de alcohol graso purificado es una en la que el alcohol graso está sustancialmente libre de contaminantes, tales como los que pueden estar presentes tras la fermentación. En algunas realizaciones, un alcohol graso está purificado cuando al menos aproximadamente el 50% en peso de una muestra está compuesto por el alcohol graso. En otras realizaciones, un alcohol graso está 40 purificado cuando al menos aproximadamente el 60%, el 70%, el 80%, el 85%, el 90%, el 92%, el 95%, el 98% o el 99% o más en peso de una muestra está compuesto por el alcohol graso.

Tal como se usa en el presente documento, el término “polipéptido recombinante” se refiere a un polipéptido que se produce mediante técnicas de ADN recombinante, en las que de manera general se inserta ADN que codifica la proteína expresada o ARN en un vector de expresión adecuado y que a su vez se usa para transformar una célula 45 huésped para producir el polipéptido o ARN.

Tal como se usa en el presente documento, el término “sustancialmente idéntico” (o “sustancialmente homólogo”) se usa para referirse a una primera secuencia de aminoácidos o de nucleótidos que contiene un número suficiente de residuos de aminoácido o nucleótidos idénticos o equivalentes (por ejemplo, con una cadena lateral similar, por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservadas) a una segunda secuencia de aminoácidos o de nucleótidos de 50 manera que la primera y la segunda secuencia de aminoácidos o de nucleótidos tienen actividades similares.

Tal como se usa en el presente documento, el término “sintasa” significa una enzima que cataliza un proceso de síntesis. Tal como se usa en el presente documento, el término sintasa incluye sintasas, sintetasas y ligasas.

Tal como se usa en el presente documento, el término “transfección” significa la introducción de un ácido nucleico (por ejemplo, mediante un vector de expresión) en una célula receptora mediante una transferencia de genes 55 mediada por ácido nucleico.

Tal como se usa en el presente documento, “transformación” se refiere a un proceso en el que se cambia el genotipo de una célula como resultado de la captación celular de ADN o ARN exógeno. Esto puede dar como resultado que la

célula transformada exprese una forma recombinante de un ARN o polipéptido. En el caso de expresión antisentido a partir del gen transferido, se altera la expresión de una forma que se produce de manera natural del polipéptido.

Tal como se usa en el presente documento, una “proteína de transporte” es un polipéptido que facilita el movimiento de uno o más compuestos al interior y/o al exterior de un orgánulo celular y/o una célula.

Tal como se usa en el presente documento, una “variante” de polipéptido X se refiere a un polipéptido que tiene la 5 secuencia de aminoácidos de péptido X en la que uno o más residuos de aminoácido están alterados. La variante puede tener cambios conservadores o cambios no conservadores. Puede encontrarse orientación en la determinación de qué residuos de aminoácido pueden sustituirse, insertarse o delecionarse sin afectar a la actividad biológica usando programas informáticos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, el software LASERGENE (DNASTAR). 10

El término “variante”, cuando se usa en el contexto de una secuencia de polinucleótido, puede abarcar una secuencia de polinucleótido relacionada con la de un gen o la secuencia codificante del mismo. Esta definición también puede incluir, por ejemplo, variantes “alélicas”, “de corte y empalme”, “de especies” o “polimórficas”. Una variante de corte y empalme puede tener identidad significativa con respecto a un polinucleótido de referencia, pero generalmente tendrá un número mayor o menor de polinucleótidos debido al corte y empalme alternativo de exones 15 durante el procesamiento de ARNm. El polipéptido correspondiente puede presentar dominios funcionales adicionales o una ausencia de dominios. Las variantes de especies son secuencias de polinucleótido que varían de una especie a otra. Los polipéptidos resultantes tendrán generalmente identidad de aminoácido significativa unos con respecto a otros. Una variante polimórfica es una variación en la secuencia de polinucleótido de un gen particular entre individuos de una especie dada. 20

Tal como se usa en el presente documento, el término “vector” se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Un tipo de vector útil es un episoma (es decir, un ácido nucleico que puede realizar replicación fuera de los cromosomas). Los vectores útiles son los que pueden realizar replicación y/o expresión autónoma de ácidos nucleicos a los que están unidos. Los vectores que pueden dirigir la expresión de genes a los que están operativamente unidos se denominan en el presente documento “vectores de 25 expresión”. En general, vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante están a menudo en forma de “plásmidos”, que se refieren generalmente a bucles de ADN bicatenario circular que, en su forma de vector, no están unidos al cromosoma. En la presente memoria descriptiva, “plásmido” y “vector” se usan de manera intercambiable, ya que el plásmido es la forma de vector más comúnmente usada. Sin embargo, también se incluyen otras formas de vectores de expresión que sirvan funciones equivalentes y que lleguen a conocerse en la técnica 30 posteriormente a esto.

La invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de una nueva ruta para la biosíntesis de alcoholes grasos en E. coli que utiliza, en parte, genes que codifican polipéptidos biosintéticos de aldehídos grasos. Los alcoholes grasos pueden producirse mediante una ruta de biosíntesis representada en la figura 3. En esta ruta, en primer lugar se activa un ácido graso mediante ATP y entonces se reduce mediante una enzima similar a ácido 35 carboxílico reductasa (CAR) para generar un aldehído graso. Entonces puede reducirse adicionalmente el aldehído graso para dar un alcohol graso mediante alcohol deshidrogenasa(s), tal(es) como alrAadp1 o yjgB. Tal como se demuestra en el presente documento, yjgB puede ser la alcohol deshidrogenasa supuesta, cuyos sustratos incluyen aldehídos grasos, por ejemplo aldehídos grasos con longitudes de cadena de carbono de desde C10 hasta C18.

Genes biosintéticos de aldehídos grasos, genes biosintéticos de alcoholes grasos y variantes (ilustración) 40

Los métodos descritos en el presente documento pueden usarse para producir alcoholes grasos, por ejemplo, a partir de aldehídos grasos. Puede producirse un aldehído graso expresando un gen biosintético de aldehído graso, por ejemplo, un gen de ácido carboxílico reductasa (gen car), que tiene una secuencia de nucleótidos indicada en las figuras 6 y 8, así como variantes de polinucleótido de la misma. En algunos casos, el gen biosintético de aldehído graso codifica uno o más de los motivos de aminoácido representados en la figura 7. Por ejemplo, el gen puede 45 codificar un polipéptido que comprende SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14; y/o SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11. SEQ ID NO: 7 incluye un dominio reductasa; SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 14 incluyen un dominio de unión a NADP; SEQ ID NO: 9 incluye un sitio de unión a fosfopanteteína; y SEQ ID NO: 10 incluye un dominio de unión a AMP. 50

En otros casos, se produce un alcohol graso expresando un gen biosintético de alcohol graso, por ejemplo, que tiene una secuencia de nucleótidos indicada en la figura 10, o una variante de la misma.

Las variantes pueden producirse de manera natural o crearse in vitro. En particular, tales variantes pueden crearse usando técnicas de ingeniería genética, tales como mutagénesis dirigida al sitio, mutagénesis química al azar, procedimientos de deleción con exonucleasa III o técnicas de clonación convencionales. Alternativamente, tales 55 variantes, fragmentos, análogos o derivados pueden crearse usando procedimientos de síntesis química o modificación.

En la técnica se conocen bien métodos de preparación de variantes. Estos incluyen procedimientos en los que se

modifican secuencias de ácido nucleico obtenidas a partir de aislados naturales para generar ácidos nucleicos que codifican polipéptidos que tienen características que potencian su valor en aplicaciones industriales o de laboratorio. En tales procedimientos, se generan y caracterizan un gran número de secuencias de variantes que tienen una o más diferencias de nucleótido con respecto a la secuencia obtenida a partir del aislado natural. Normalmente, estas diferencias de nucleótido dan como resultado cambios de aminoácido con respecto a los polipéptidos codificados por 5 los ácidos nucleicos a partir de aislados naturales.

Por ejemplo, pueden crearse variantes usando PCR propensa a errores (véase, por ejemplo, Leung et al., Technique 1:11-15, 1989; y Caldwell et al., PCR Methods Applic. 2:28-33, 1992). En PCR propensa a errores, se realiza PCR en condiciones en las que la fidelidad de copiado de la ADN polimerasa es baja, de manera que se obtiene una alta tasa de mutaciones puntuales a lo largo de toda la longitud del producto de PCR. En resumen, en tales 10 procedimientos, se mezclan ácidos nucleicos que van a mutagenizarse (por ejemplo, una secuencia de polinucleótido biosintético de aldehído graso), con cebadores de PCR, tampón de reacción, MgCl2, MnCl2, Taq polimerasa y una concentración apropiada de dNTP para lograr una alta tasa de mutación puntual a lo largo de toda la longitud del producto de PCR. Por ejemplo, puede realizarse la reacción usando 20 fmoles de ácido nucleico que va a mutarse (por ejemplo, una secuencia de polinucleótido biosintético de aldehído graso), 30 pmoles de cada 15 cebador de PCR, un tampón de reacción que comprende KCl 50 mM, Tris HCl 10 mM (pH 8,3) y gelatina al 0,01%, MgCl2 7 mM, MnCl2 0,5 mM, 5 unidades de Taq polimerasa, dGTP 0,2 mM, dATP 0,2 mM, dCTP 1 mM y dTTP 1 mM. Puede realizarse la PCR durante 30 ciclos de 94ºC durante 1 min, 45ºC durante 1 min y 72ºC durante 1 min. Sin embargo, se apreciará que estos parámetros pueden variarse según sea apropiado. Entonces se clonan los ácidos nucleicos mutagenizados en un vector apropiado y se evalúan las actividades de los polipéptidos codificados 20 por los ácidos nucleicos mutagenizados.

También pueden crearse variantes usando mutagénesis dirigida a oligonucleótidos para generar mutaciones específicas de sitio en cualquier ADN clonado de interés. La mutagénesis de oligonucleótidos se describe, por ejemplo, en Reidhaar-Olson et al, Science 241:53-57, 1988. En resumen, en tales procedimientos se sintetizan una pluralidad de oligonucleótidos bicatenarios que portan una o más mutaciones que van a introducirse en el ADN 25 clonado y se insertan en el ADN clonado que va a mutarse (por ejemplo, una secuencia de polinucleótido biosintético de aldehído graso). Se recuperan clones que contienen el ADN mutado, y se evalúan las actividades de los polipéptidos que codifican.

Otro método para generar variantes es PCR de ensamblaje. La PCR de ensamblaje implica el ensamblaje de un producto de PCR de una mezcla de fragmentos de ADN pequeños. Un gran número de diferentes reacciones de 30 PCR se producen en paralelo en el mismo vial, cebando los productos de una reacción a los productos de otra reacción. PCR de ensamblaje se describe, por ejemplo, en la patente estadounidense n.º 5.965.408.

Todavía otro método de generar variantes es mutagénesis mediante PCR sexual. En la mutagénesis mediante PCR sexual, se produce la recombinación homóloga forzada entre moléculas de ADN de secuencias de ADN diferentes, pero altamente relacionadas, in vitro como resultado de fragmentación al azar de la molécula de ADN basándose en 35 la homología de secuencia. Esto va seguido por la fijación del cruzamiento mediante extensión del cebador en una reacción de PCR. La mutagénesis mediante PCR sexual se describe, por ejemplo, en Stemmer, PNAS, USA 91:10747-10751, 1994.

También pueden crearse variantes mediante mutagénesis in vivo. En algunas realizaciones, se generan mutaciones al azar en una secuencia de ácido nucleico propagando la secuencia en una cepa bacteriana, tal como una cepa de 40 E. coli, que porta mutaciones en una o más de la rutas de reparación de ADN. Tales cepas “mutadoras” tienen una mayor tasa de mutación al azar que las de la cepa silvestre. La propagación de una secuencia de ADN (por ejemplo, una secuencia de polinucleótido biosintético de aldehído graso) en una de estas cepas generará finalmente mutaciones al azar dentro del ADN. Las cepas mutadoras adecuadas para su uso para la mutagénesis in vivo se describen, por ejemplo, en la publicación PCT n.º WO 91/16427. 45

También pueden generarse variantes usando mutagénesis de casete. En la mutagénesis de casete, se remplaza una región pequeña de un molécula de ADN bicatenario por un “casete” de oligonucleótido sintético que difiere de la secuencia nativa. El oligonucleótido a menudo contiene una secuencia completa y/o parcialmente al azar.

También puede usarse mutagénesis de conjunto recursivo para generar variantes. La mutagénesis de conjunto recursivo es un algoritmo para el diseño por ingeniería genética de proteínas (es decir, mutagénesis de proteínas) 50 desarrollado para producir diversas poblaciones de mutantes relacionados fenotípicamente cuyos miembros difieren en la secuencia de aminoácidos. Este método usa un mecanismo de retroalimentación para controlar las tandas sucesivas de mutagénesis de casete combinatoria. La mutagénesis de conjunto recursivo se describe, por ejemplo, en Arkin et al., PNAS, USA 89:7811-7815, 1992.

En algunas realizaciones, se crean variantes usando mutagénesis de conjunto exponencial. La mutagénesis de 55 conjunto exponencial es un procedimiento para generar bibliotecas combinatorias con un alto porcentaje de mutantes únicos y funcionales, en los que se aleatorizan pequeños grupos de residuos en paralelo para identificar, en cada posición alterada, aminoácidos que conducen a proteínas funcionales. La mutagénesis de conjunto exponencial se describe, por ejemplo, en Delegrave et al, Biotech. Res. 11: 1548-1552, 1993. La mutagénesis

dirigida al sitio y al azar se describen, por ejemplo, en Arnold, Curr. Opin. Biotech. 4:450-455, 1993.

En algunas realizaciones, se crean variantes usando procedimientos de intercambio en los que se fusionan entre sí porciones de una pluralidad de ácidos nucleicos que codifican distintos polipéptidos para crear secuencias de ácido nucleico quiméricas que codifican polipéptidos quiméricos tal como se describe, por ejemplo, en las patentes estadounidenses n.os 5.965.408 y 5.939.250. 5

Las variantes de polinucleótido también incluyen análogos de ácido nucleico. Los análogos de ácido nucleico pueden modificarse en el resto básico, resto azúcar o estructura principal de fosfato para mejorar, por ejemplo, la estabilidad, hibridación o solubilidad del ácido nucleico. Las modificaciones en el resto básico incluyen desoxiuridina para desoxitimidina y 5-metil-2’-desoxicitidina o 5-bromo-2’-doxicitidina para desoxicitidina. Las modificaciones del resto azúcar incluyen modificación del 2’-hidroxilo del azúcar ribosa para formar azúcares 2’-O-metilo o 2’-O-alilo. La 10 estructura principal de fosfato de desoxirribosa puede modificarse para producir ácidos morfolino-nucleicos, en los que cada resto básico está unido a un anillo morfolino de seis miembros, o ácidos nucleicos peptídicos, en los que la estructura principal de desoxifosfato se reemplaza por una estructura principal de pseudopéptido y se mantienen las cuatro bases. (Véase, por ejemplo, Summerton et al. , Antisense Nucleic Acid Drug Dev. (1997) 7:187-195; e Hyrup et al, Bioorgan. Med. Chem. (1996) 4:5-23). Además, la estructura principal de desoxifosfato puede remplazarse por, 15 por ejemplo, una estructura principal de fosforotioato o fosforoditioato, una fosforoamidita o una estructura principal de fosfotriéster de alquilo.

Puede usarse cualquier secuencia de polinucleótido que codifica un homólogo indicada en las figuras 6 y 8, o una variante de la misma, como polinucleótido biosintético de aldehído graso en los métodos descritos en el presente documento. Puede usarse cualquier secuencia de polinucleótido indicada en la figura 10, o una variante, como 20 polinucleótido biosintético de alcohol graso.

Polipéptidos biosintéticos de aldehídos grasos, polipéptido biosintético de alcohol graso y variantes (ilustración)

También pueden usarse los métodos descritos en el presente documento para producir alcoholes grasos, por ejemplo, a partir de aldehídos grasos. El aldehído graso puede producirse mediante un polipéptido biosintético de aldehído graso que tiene una secuencia de aminoácidos indicada en las figuras 6 y 8, así como variantes de 25 polipéptido de las mismas. En algunos casos, un polipéptido biosintético de aldehído graso es uno incluye uno o más de los motivos de aminoácido representados en la figura 7. Por ejemplo, el polipéptido puede incluir las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10. En otras situaciones, el polipéptido incluye una o más de SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14. Aún en otros casos, el polipéptido incluye las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 y SEQ 30 ID NO: 11. SEQ ID NO: 7 incluye un dominio reductasa; SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 14 incluyen un dominio de unión a NADP; SEQ ID NO: 9 incluye un sitio de unión a fosfopanteteína; y SEQ ID NO: 10 incluye un dominio de unión a AMP.

En otros casos, los métodos descritos en el presente documento pueden usarse para producir alcoholes grasos usando un polipéptido biosintético de alcohol graso que tiene una secuencia de aminoácidos indicada en la figura 35 10, así como variantes de polipéptido de las mismas.

Variantes de polipéptido biosintético pueden ser variantes en las que uno o más residuos de aminoácido están sustituidos por un residuo de aminoácido conservado o no conservado (preferiblemente un residuo de aminoácido conservado). Tales residuos de aminoácido sustituidos pueden estar codificados o no por el código genético.

Las sustituciones conservadoras son las que sustituyen un aminoácido dado en un polipéptido por otro aminoácido 40 de características similares. Las sustituciones conservadoras típicas son los siguientes remplazos: remplazo de un aminoácido alifático, tal como alanina, valina, leucina e isoleucina, por otro aminoácido alifático; remplazo de una serina por una treonina o viceversa; remplazo de un residuo ácido, tal como ácido aspártico y ácido glutámico, por otro residuo ácido; remplazo de un residuo que porta un grupo amida, tal como asparagina y glutamina, por otro residuo que porta un grupo amida; intercambio de un residuo básico, tal como lisina y arginina, por otro residuo 45 básico; y remplazo de un residuo aromático, tal como fenilalanina y tirosina, por otro residuo aromático.

Otras variantes de polipéptido son aquellas en las que uno o más residuos de aminoácido incluyen un grupo sustituyente. Todavía otras variantes de polipéptido son aquellas en las que en el polipéptido está asociado con otro compuesto, tal como un compuesto para aumentar la semivida del polipéptido (por ejemplo, polietilenglicol).

Variantes de polipéptido adicionales son aquellas en las que aminoácidos adicionales están fusionados con el 50 polipéptido, tal como una secuencia líder, una secuencia secretora, una secuencia de proproteína o una secuencia que facilita la purificación, el enriquecimiento o la estabilización del polipéptido.

En algunos casos, las variantes de polipéptido mantienen la misma función biológica que un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos indicada en las figuras 6 y 8 (por ejemplo, mantiene actividad de biosíntesis de aldehídos grasos, tal como actividad ácido carboxílico o ácido graso reductasa), o indicada en la figura 10 (por 55 ejemplo, mantienen la actividad de biosíntesis de alcoholes grasos, tal como actividad alcohol graso deshidrogenasa) y tienen secuencias de aminoácidos sustancialmente idénticas a la misma.

En otros casos, las variantes de polipéptido tiene al menos aproximadamente el 50%, al menos aproximadamente el 55%, al menos aproximadamente el 60%, al menos aproximadamente el 65%, al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 75%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 95%, o más de aproximadamente el 95% de homología con una secuencia de aminoácidos indicada en las figuras 6, 8 y/o 10. En otra realización, las variantes 5 de polipéptido incluyen un fragmento que comprende al menos aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 ó 150 aminoácidos consecutivos de las mismas.

Las variantes de polipéptido o fragmentos de las mismas pueden obtenerse aislando ácidos nucleicos que codifican ellas usando técnicas descritas en el presente documento o expresando ácidos nucleicos sintéticos que codifican ellas. Alternativamente, pueden obtenerse variantes de polipéptido o fragmentos de las mismas a través de 10 procedimientos de enriquecimiento o purificación bioquímicos. La secuencia de variantes de polipéptido o fragmentos pueden determinarse mediante digestión proteolítica, electroforesis en gel y/o microsecuenciación. La secuencia de las variantes de polipéptido o fragmentos pueden compararse entonces con una secuencia de aminoácidos indicada en las figuras 6, 8 y/o 10 usando cualquiera de los programas descritos en el presente documento. 15

Las variantes de polipéptido y fragmentos de las mismas pueden someterse a ensayo para determinar la actividad productora de aldehído graso y/o actividad productora de alcohol graso usando métodos de rutina. Por ejemplo, las variantes de polipéptido o fragmento pueden ponerse en contacto con un sustrato (por ejemplo, un ácido graso, un sustrato de derivado de ácido graso, u otro sustrato descrito en el presente documento) en condiciones que permiten que la variante de polipéptido funcione. Puede medirse una disminución en el nivel del sustrato o un aumento en el 20 nivel de un aldehído graso para determinar la actividad productora de aldehído graso. Puede medirse una disminución en el nivel del sustrato o un aumento en el nivel de un alcohol graso para determinar la actividad productora de alcohol graso.

Anticuerpos frente a polipéptidos biosintéticos (ilustración)

Los polipéptidos biosintéticos de aldehídos grasos descritos en el presente documento también pueden usarse para 25 producir anticuerpos dirigidos frente a polipéptidos biosintéticos de aldehídos grasos. Pueden usarse tales anticuerpos, por ejemplo, para detectar la expresión de un polipéptido biosintético de aldehído graso o polipéptido biosintético de alcohol graso usando métodos conocidos en la técnica. El anticuerpo puede ser, por ejemplo, un anticuerpo policlonal; un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo; un anticuerpo modificado tal como un anticuerpo quimérico, anticuerpo reconformado, anticuerpo humanizado, o fragmento de los 30 mismos (por ejemplo, Fab’, Fab, F(ab’)2); o un anticuerpo biosintético, por ejemplo, un anticuerpo monocatenario, anticuerpo de un solo domino (DAB), Fv, Fv monocatenario (scFv), o similares.

Se describen métodos de preparación y uso de anticuerpos policlonales y monoclonales, por ejemplo, en Harlow et al., Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol I. Cold Spring Harbor Laboratory (1 de diciembre de 1998). En la técnica se conocen métodos para preparar anticuerpos modificados y fragmentos de anticuerpo (por 35 ejemplo, anticuerpos quiméricos, anticuerpos reconformados, anticuerpos humanizados, o fragmentos del los mismos, por ejemplo, fragmentos Fab’, Fab, F(ab’)2); o anticuerpos biosintéticos (por ejemplo, anticuerpos monocatenarios, anticuerpos de un solo dominio (DAB), Fv, Fv monocatenario (scFv), y similares), y pueden encontrarse, por ejemplo, en Zola, Monoclonal Antiobodies: Preparation and Use of Monoclonal Antibodies and Engineered Antibody Derivatives, Springer Verlag (15 de diciembre del 2000; 1ª edición). 40

Sustratos

Las composiciones y métodos descritos en el presente documento pueden usarse para producir alcoholes grasos, por ejemplo, a partir de aldehídos grasos, que a su vez pueden producirse a partir de un sustrato apropiado. Sin querer limitarse a la teoría, se cree que los polipéptidos biosintéticos de aldehídos grasos descritos en el presente documento producen aldehídos grasos a partir de sustratos mediante un mecanismo de reducción. En algunos 45 casos, el sustrato es un derivado de ácido graso (por ejemplo, un ácido graso), y puede producirse un aldehído graso que tiene patrones de ramificación y longitud de cadena de carbono particulares a partir de un derivado de ácido graso que tiene estas características que darán como resultado un aldehído graso particular. A través de un mecanismo de reacción adicional, el aldehído graso puede convertirse en el alcohol graso deseado (por ejemplo, mediante un polipéptido biosintético de alcohol graso descrito en el presente documento). 50

Por consiguiente, cada etapa dentro de una ruta de biosíntesis que conduce a la producción de un sustrato de derivado de ácido graso, puede modificarse para producir o sobreproducir el sustrato de interés. Por ejemplo, genes conocidos implicados en la ruta de biosíntesis de ácidos grasos o la ruta de aldehído graso, pueden expresarse, sobreexpresarse o atenuarse en células huésped para producir un sustrato deseado (véase, por ejemplo, el documento PCT/US08/058788 = documento WO 2008/119082). En la figura 9 se proporcionan genes a modo de 55 ejemplo.

Síntesis de sustratos

El ácido graso sintasa (FAS) es un grupo de polipéptidos que catalizan el inicio y la elongación de cadenas de acilo

(Marrakchi et al., Biochemical Society, 30:1050-1055, 2002). La proteína portadora de acilo (ACP) junto con las enzimas en la ruta de FAS controlan la longitud, el grado de saturación y la ramificación de los derivados de ácidos grasos producidos. La ruta de biosíntesis de ácidos grasos implica los precursores acetil-CoA y malonil-CoA. Las etapas en esta ruta se catalizan por enzimas de las familias de genes de la biosíntesis de ácidos grasos (fab) y acetil-CoA carboxilasa (acc) (véase, por ejemplo, Heath et al., Prog. Lipid Res. 40(6):467-97 (2001)). 5

Pueden diseñarse por ingeniería genética células huésped para expresar sustratos derivados de ácidos grasos expresando o sobreexpresando de manera recombinante uno o más genes de ácido graso sintasa, tales como genes de acetil-CoA y/o malonil-CoA sintasa. Por ejemplo, para aumentar la producción de acetil-CoA, puede expresarse uno o más de los siguientes genes en una célula huésped: pdh (un complejo multienzimático que comprende aceEF (que codifica el componente de deshidrogenasa E1p, el componente de dihidrolipoamida 10 aciltransferasa E2p de los complejos de piruvato y 2-oxoglutarato deshidrogenasa, y Ipd), panK, fabH, fabB, fabD, fabG, acpP, y fabF. Números de registro de GenBank a modo de ejemplo para estos genes son: pdh (BAB34380, AAC73227, AAC73226), panK (también conocido como CoA, AAC76952), aceEF (AAC73227, AAC73226), fabH (AAC74175), fabB (P0A953), fabD (AAC74176), fabG (AAC74177), acpP (AAC74178), fabF (AAC74179). Adicionalmente, los niveles de expresión de fadE, gpsA, ldhA, pflb, adhE, pta, poxB, ackA y/o ackB pueden 15 atenuarse o desactivarse en una célula huésped diseñada por ingeniería genética mediante transformación con plásmidos condicionalmente replicativos o no replicativos que contienen mutaciones nulas o por deleción de los genes correspondientes o sustituyendo secuencias de promotor o potenciador. Números de registro de GenBank a modo de ejemplo para estos genes son: fadE (AAC73325), gspA (AAC76632), ldhA (AAC74462), pflb (AAC73989), adhE (AAC74323), pta (AAC75357), poxB (AAC73958), ackA (AAC75356) y ackB (BAB81430). Las células huésped 20 resultantes tendrán niveles de producción de acetil-CoA aumentados cuando se hacen crecer en un entorno apropiado.

La sobreexpresión de malonil-CoA puede realizarse introduciendo accABCD (por ejemplo, número de registro AAC73296, EC 6.4.1.2) en una célula huésped. Los ácidos grasos pueden sobreexpresarse adicionalmente en células huésped introduciendo en la célula huésped una secuencia de ADN que codifica una lipasa (por ejemplo, 25 números de registro CAA89087, CAA98876).

Además, inhibir PIsB puede conducir a un aumento en los niveles de acil-ACP de cadena larga, lo que inhibirá las etapas iniciales en la ruta (por ejemplo, accABCD, fabH y fabl). Puede usarse la mutación D311E de plsB (por ejemplo, número de registro AAC77011) para aumentar la cantidad de ácidos grasos disponibles.

Además, puede diseñarse por ingeniería genética una célula huésped para sobreexpresar un gen sfa (supresor de 30 fabA, por ejemplo, número de registro AAN79592) para aumentar la producción de ácidos grasos monoinsaturados (Rock et al., J. Bacteriology 178:5382-5387, 1996).

La longitud de cadena de un sustrato derivado de ácidos grasos puede seleccionarse modificando la expresión de tioesterasas seleccionadas. La tioesterasa influye en la longitud de cadena de los ácidos grasos producidos. Por tanto, pueden diseñarse por ingeniería genética células huésped para expresar, sobreexpresar, tener expresión 35 atenuada o no expresar una o más tioesterasas seleccionadas para aumentar la producción de un sustrato derivado de ácidos grasos preferido. Por ejemplo, pueden producirse ácidos grasos C10 expresando una tioesterasa que tiene preferencia por la producción de ácidos grasos C10 y atenuando tioesterasas que tienen preferencia por la producción de ácidos grasos distintos de ácidos grasos C10 (por ejemplo, una tioesterasa que prefiere producir ácidos grasos C14). Esto dará como resultado una población relativamente homogénea de ácidos grasos que tienen 40 una longitud de cadena de carbono de 10. En otros casos, pueden producirse ácidos grasos C14 atenuando tioesterasas endógenas que producen ácidos grasos distintos de C14 y expresando las tioesterasas que usan C14-ACP. En algunas situaciones, pueden producirse ácidos grasos C14 expresando tioesterasas que usan C12-ACP y atenuando tioesterasas que producen ácidos grasos distintos de C12. Puede verificarse la sobreproducción de acetil-CoA, malonil-CoA y ácidos grasos usando métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, usando precursores 45 radiactivos, HPLC o CG-EM tras una lisis celular. En la tabla 1 se indican ejemplos no limitativos de tioesterasas que pueden usarse en los métodos descritos en el presente documento.

Tabla 1: Tioesterasas

Número de registro: Organismo fuente Gen

AAC73596: E. coli tesA sin secuencia líder

AAC73555: E. coli tesB

Q41635, AAA34215: Umbellularia california fatB

AAC49269: Cuphea hookeriana fatB2

Q39513; AAC72881: Cuphea hookeriana fatB3

Q39473, AAC49151: Cinnamonum camphorum fatB

CAA85388: Arabidopsis thaliana fatB [M141 T]*

NP 189147; NP 193041: Arabidopsis thaliana fatA

CAC39106: Bradyrhiizobium japonicum fatA

AAC72883: Cuphea hookeriana fatA

AAL79361: Helianthus annus fatA1

* Mayer et al., BMC Plant Biology 7:1-11, 2007

En otros casos, un polipéptido biosintético de aldehído graso, variante o un fragmento del mismo, se expresa en una célula huésped que contiene una mutación que se produce de manera natural que da como resultado un nivel aumentado de ácidos grasos en la célula huésped. En algunos casos, la célula huésped se diseña por ingeniería genética para aumentar el nivel de ácidos grasos en la célula huésped con respecto a una célula huésped silvestre 5 correspondiente. Por ejemplo, la célula huésped puede diseñarse por ingeniería genética para expresar un nivel reducido de una acil-CoA sintasa con respecto a una célula huésped silvestre correspondiente. En una realización, el nivel de expresión de uno o más genes (por ejemplo, un gen de acil-CoA sintasa) se reduce mediante diseño por ingeniería genética de una célula huésped “deficiente”.

Cualquier gen de acil-CoA sintasa conocido puede reducirse o desactivarse en una célula huésped. Los ejemplos no 10 limitativos de genes de acil-CoA sintasa incluyen fadD, fadK, BH3103, yhfL, Pfl-4354, EAV15023, fadD1, fadD2, RPC_4074, fadDD35, fadDD22, faa3p o el gen que codifica la proteína ZP_01644857. Los ejemplos específicos de genes de acil-CoA sintasa incluyen fadDD35 de M. tuberculosis H37Rv [NP_217021], fadDD22 de M. tuberculosis H37Rv [NP_217464], fadD de E. coli [NP_416319], fadK de E. coli [YP_416216], fadD de Acinetobacter sp. ADP1 [YP_045024], fadD de Haemophilus influenza RdkW20 [NP_438551], fadD de Rhodopseudomonas palustris Bis B18 15 [YP_533919], BH3101 de Bacillus halodurans C-125 [NP_243969], Pfl-4354 de Pseudomonas fluorescens Pfo-1 [YP_350082], EAV15023 de Comamonas testosterone KF-1 [ZP_01520072], yhfL de B. subtilis [NP_388908], fadD1 de P. aeruginosa PAO1 [NP_251989], fadD1 de Ralstonia solanacearum GM1 1000 [NP_520978], fadD2 de P. aeruginosa PAO1 [NP_251990], el gen que codifica la proteína ZP_01644857 de Stenotrophomonas maltophilia R551-3, faa3p de Saccharomyces cerevisiae [NP_012257], faa1p de Saccharomyces cerevisiae [NP_014962], lcfA 20 de Bacillus subtilis [CAA99571], o los descritos en Shockey et al., Plant. Physiol. 129:1710-1722, 2002; Caviglia et al., J. Biol. Chem. 279:1163-1169, 2004; Knoll et al., J. Biol. Chem. 269(23): 16348-56, 1994; Johnson et al., J. Biol. Chem. 269: 18037-18046, 1994; y Black et al., J. Biol Chem. 267: 25513-25520, 1992.

Formación de alcoholes grasos ramificados

Pueden producirse alcoholes grasos a partir de aldehídos grasos que contienen puntos de ramificación usando 25 derivados de ácidos grasos ramificados como sustratos para un polipéptido biosintético de aldehído graso descrito en el presente documento. Por ejemplo, aunque E. coli produce de manera natural ácidos grasos de cadena recta (sFA), puede diseñarse por ingeniería genética E. coli para producir ácidos grasos de cadena ramificada (brFA) introduciendo y expresando o sobreexpresando genes que proporcionan precursores ramificados en E. coli (por ejemplo, familias de genes bkd, ilv, icm y fab). Adicionalmente, puede diseñarse por ingeniería genética una célula 30 huésped para expresar o sobreexpresar genes que codifican proteínas para la elongación de brFA (por ejemplo, ACP, FabF, etc.) y/o para delecionar o atenuar los genes de la célula huésped correspondientes que conducen normalmente a sFA.

La primera etapa en la formación de brFA es la producción de los -ceto-ácidos correspondientes mediante un aminoácido de cadena ramificada aminotransferasa. Las células huésped pueden incluir de manera endógena genes 35 que codifican tales enzimas o pueden introducirse de manera recombinante tales genes. Por ejemplo, E. coli expresa de manera endógena una enzima de este tipo, IlvE (EC 2.6.1.42; registro de GenBank YP_026247). En algunas células huésped, no puede expresarse un aminoácido de cadena ramificada aminotransferasa heteróloga. Sin embargo, puede introducirse IlvE de E. coli o cualquier otro aminoácido de cadena ramificada aminotransferasa (por ejemplo, IlvE de Lactococcus lactis (registro de GenBank AAF34406), IlvE de Pseudomonas putida (registro de 40 GenBank NP_745648), o IlvE de Streptomyces coelicolor (registro de GenBank NP_629657)), si no es endógena.

En otra realización, la producción de -ceto-ácidos puede lograrse usando los métodos descritos en Atsumi et al., Nature 451: 86-89, 2008. Por ejemplo, puede producirse 2-cetoisovalerato sobreexpresando los genes que codifican IlvI, IlvH, IlvC o IlvD. En otro ejemplo, puede producirse 2-ceto-3-metil-valerato sobreexpresando los genes que codifican IlvA e IlvI, IlvH (o AIsS de Bacillus subtilis), IlvC, IlvD, o sus homólogos correspondientes. En una 45 realización adicional, puede producirse 2-ceto-4-metil-pentanoato sobreexpresando los genes que codifican IlvI, IlvH, IlvC, IlvD y LeuA, LeuB, LeuC, LeuD, o sus homólogos correspondientes.

La segunda etapa es la descarboxilación oxidativa de los -ceto-ácidos para dar la acil-CoA de cadena ramificada correspondiente. Esta reacción puede catalizarse mediante un complejo de -ceto-ácido de cadena ramificada deshidrogenasa (bkd; EC 1.2.4.4.) (Denoya et al., J. Bacteriol. 177:3504, 1995), que consiste en subunidades E1/ 50 (descarboxilasa), E2 (dihidrolipoil transacilasa) y E3 (dihidrolipoil deshidrogenasa). Estos complejos de -ceto-ácido de cadena ramificada deshidrogenasa son similares a complejos de piruvato y -cetoglutarato deshidrogenasa. Cualquier microorganismo que presenta brFA y/o crece con aminoácidos de cadena ramificada puede usarse como fuente para aislar genes bkd para la expresión en células huésped, por ejemplo, E. coli. Además, E. coli tiene el componente E3 como parte de su complejo de piruvato deshidrogenasa (Ipd, EC 1.8.1.4, registro de GenBank 55 NP_414658). Por tanto, puede ser suficiente expresar sólo los genes E1/ y E2 bkd. La tabla 2 indica ejemplos no limitativos de genes bkd de diversos microorganismos que pueden introducirse de manera recombinante y

expresarse en una célula huésped para proporcionar precursores de acil-CoA de cadena ramificada.

Tabla 2: Genes bkd de microorganismos seleccionados

Organismo: Gen N.º de registro de GenBank

Streptomyces coelicolor: bkdA1 (E1) bkdB1 (E1) bkdC1 (E2) NP_628006 NP_628005 NP_638004

Streptomyces coelicolor: bkdA2 (E1) bkdB2 (E1) bkdC2 (E2) NP_733618 NP_628019 NP_628018

Streptomyces avermitilis: bkdA (E1a) bkdB (E1b) bkdC (E2) BAC72074 BAC72075 BAC72076

Streptomyces avermitilis: bkdF(E1) bkdG (E1) bkdH (E2) BAC72088 BAC72089 BAC72090

Bacillus subtilis: bkdAA (E1) bkdAB (E1) bkdB (E2) NP_390288 NP_390288 NP_390288

Pseudomonas putida: bkdA1 (E1) bkdA2 (E1) bkdC (E2) AAA65614 AAA65615 AAA65617

En otro ejemplo, puede prepararse isobutiril-CoA en una célula huésped, por ejemplo en E. coli, mediante la coexpresión de una crotonil-CoA reductasa (Ccr, EC 1.6.5.5, 1.1.1.1) e isobutiril-CoA mutasa (subunidad grande IcmA, EC 5.4.99.2; subunidad pequeña IcmB, EC 5.4.99.2) (Han y Reynolds, J. Bacteriol. 179:5157, 1997). Crotonil-5 CoA es un producto intermedio en la biosíntesis de ácidos grasos en E. coli y otros microorganismos. En la tabla 3 se indican ejemplos no limitativos de genes ccr e icm de microorganismos seleccionados.

Tabla 3: Genes de ccr e icm de microorganismos seleccionados

Organismo: Gen N.º de registro de GenBank

Streptomyces coelicolor: ccr icmA icmB NP_630556 NP_629554 NP_630904

Streptomyces cinnamonensis: ccr icmA icmB AAD53915 AAC08713 AJ246005

Además de la expresión de los genes bkd, el inicio de la biosíntesis de brFA usa proteína portadora de -cetoacil-acilo sintasa III (FabH, EC 2.3.1.41) con especificidad por acil-CoA de cadena ramificada (Li et al., J. Bacteriol. 10 187:3795-3799, 2005). En la tabla 4 se indican ejemplos no limitativos de tales enzimas FabH. Pueden expresarse en una célula huésped genes fabH que están implicados en la biosíntesis de ácidos grasos de cualquier microorganismo que contiene brFA. Las enzimas Bkd y FabH de células huésped que no preparan de manera natural brFA no pueden respaldar la producción de brFA. Por tanto, bkd y fabH pueden expresarse de manera recombinante. Pueden insertarse vectores que contienen los genes bkd y fabH en una célula huésped de este tipo. 15 De manera similar, el nivel endógeno de la producción de Bkd y FabH puede no ser suficiente para producir brFA. En este caso, pueden sobreexpresarse. Adicionalmente, pueden expresarse o sobreexpresarse otros componentes de la ruta de biosíntesis de ácidos grasos, tales como proteínas portadoras de acilo (ACP) y proteína portadora de -cetoacil-acilo sintasa II (fabF, EC 2.3.1.41) (en la tabla 4 se indican ejemplos no limitativos de candidatos). Además de expresar estos genes, algunos genes en la ruta de biosíntesis de ácidos grasos endógena pueden atenuarse en 20 la célula huésped (por ejemplo, los genes de E. coli fabH (n.º de registro de GenBank NP_415609) y/o fabF (n.º de registro de GenBank NP_415613).

Tabla 4: Genes FabH, ACP y fabF de microorganismos seleccionados con brFA

Organismo: Gen N.º de registro de GenBank

Streptomyces coelicolor: fabH1 acp fabF NP_626634 NP_626635 NP_626636

Streptomyces avermitilis: fabH3 fabC3 (acp) fabF NP_823466 NP_823467 NP_823468

Bacillus subtilis: fabH_A NP_389015

fabH_B acp fabF: NP_388898 NP_389474 NP_389016

Stenotrophomonas maltophilia: SmalDRAFT_0818 (fabH) SmalDRAFT_0821 (acp) SmalDRAFT_0822 (fabF) ZP_01643059 ZP_01643063 ZP_01643064

Legionella pneumophila: fabH acp fabF YP_123672 YP_123675 YP_123676

Formación de alcoholes grasos cíclicos

Pueden producirse alcoholes grasos cíclicos a partir de aldehídos grasos cíclicos usando derivados de ácidos grasos cíclicos como sustratos para un polipéptido biosintético de aldehído graso descrito en el presente documento. Para producir sustratos de derivados de ácidos grasos cíclicos, pueden introducirse genes que proporcionan precursores cíclicos (por ejemplo, las familias de genes ans, chc y plm) en la célula huésped y expresarse para 5 permitir el inicio de la biosíntesis de ácidos grasos a partir de precursores cíclicos. Por ejemplo, para convertir una célula huésped, tal como E. coli, en una que puede sintetizar ácidos grasos -cíclicos (cyFA), puede introducirse un gen que proporciona el precursor cíclico ciclohexilcarbonil-CoA (CHC-CoA) (Cropp et al., Nature Biotech. 18:980-983, 2000) y expresarse en la célula huésped. Los ejemplos no limitativos de genes que proporcionan CHC-CoA en E. coli incluyen: ansJ, ansK, ansL, chcA y ansM de la agrupación de genes de ansatrienina de Streptomyces collinus 10 (Chen et al., Eur. J. Biochem. 261: 98-107, 1999) o plmJ, plmK, plmL, chcA y plmM de la agrupación de genes de foslactomicina B de Streptomyces sp. HK803 (Palaniappan et al., J. Biol. Chem. 278:35552-35557, 2003) junto con el gen chcB (Patton et al., Biochem. 39:7595-7604, 2000) de S. collinus, S. avermitilis o S. coelicolor (véase la tabla 5). Los genes indicados en la tabla 4 pueden expresarse entonces para permitir el inicio y la elongación de ácidos grasos -cíclicos. Alternativamente, pueden aislarse los genes homólogos de microorganismos que fabrican cyFA y 15 expresarse en una célula huésped (por ejemplo, E. coli).

Tabla 5: Genes para la síntesis de CHC-CoA

Organismo: Gen N.º de registro de GenBank

Streptomyces collinus: ansJK ansL chcA ansM chcB U72144* AF268489

Streptomyces sp. HK803: pmlJK pmlL chcA pmlM AAQ84158 AAQ84159 AAQ84160 AAQ84161

Streptomyces coelicolor: chcB/caiD NP_629292

Streptomyces avermitilis: chcB/caiD NP_629292

*Sólo se indica chcA como entrada en GenBank U72144, ansJKLM son según Chen et al. (Eur. J. Biochem. 261:98-107, 1999).

Los genes indicados en la tabla 4 (fabH, acp y fabF) permiten el inicio y la elongación de ácidos grasos -cíclicos 20 porque tienen una amplia especificidad de sustrato. Si la coexpresión de cualquiera de estos genes con los genes indicados en la tabla 5 no proporciona cyFA, entonces pueden aislarse homólogos de fabH, acp y/o fabF de microorganismos que fabrican cyFA (por ejemplo, los indicados en la tabla 6) (por ejemplo, usando cebadores de PCR degenerados o sondas de secuencias de ADN heterólogas) y coexpresarse.

Tabla 6: Ejemplos no limitativos de microorganismos que contienen ácidos grasos -cíclicos 25

Organismo: Referencia

Curtobacterium pusillum: ATCC19096

Alicyclobacillus acidoterrestris: ATCC49025

Alicyclobacillus acidocaldarius: ATCC27009

Alicyclobacillus cycloheptanicus *: Moore, J. Org. Chem. 62: págs. 2173, 1997.

*Usa cicloheptilcarbonil-CoA y no ciclohexilcarbonil-CoA como precursor para la biosíntesis de cyFA.

Niveles de saturación de alcoholes grasos

El grado de saturación en ácidos grasos (que entonces pueden convertirse en aldehídos grasos y después en alcoholes grasos tal como se describe en el presente documento) puede controlarse regulando el grado de saturación de productos intermedios de ácidos grasos. Por ejemplo, las familias de genes sfa, gns y fab pueden 30

expresarse, sobreexpresarse o expresarse a niveles reducidos, para controlar la saturación de ácidos grasos. La figura 9 indica ejemplos no limitativos de genes en estas familias de genes que pueden usarse en los métodos y las células huésped descritos en el presente documento.

Por ejemplo, pueden diseñarse por ingeniería genética células huésped para producir ácidos grasos insaturados diseñando por ingeniería genética el huésped de producción para sobreexpresar fabB o haciendo crecer el huésped 5 de producción a bajas temperaturas (por ejemplo, inferiores a 37ºC). FabB tiene preferencia por cis-3decenoil-ACP y da como resultado la producción de ácidos grasos insaturados en E. coli. La sobreexpresión de fabB da como resultado la producción de un porcentaje significativo de ácidos grasos insaturados (de Mendoza et al., J. Biol. Chem. 258:2098-2101, 1983). El gen fabB puede insertarse y expresarse en células huésped que no tienen de manera natural el gen. Estos ácidos grasos insaturados pueden usarse entonces como productos intermedios en 10 células huésped que se diseñan por ingeniería genética para producir derivados de ácidos grasos, tales como aldehídos grasos.

En otros casos, puede delecionarse un represor de la biosíntesis de ácidos grasos, por ejemplo, fabR (registro de GenBank NP_418398), lo que también dará como resultado un aumento de la producción de ácidos grasos insaturados en E. coli (Zhang et al., J. Biol. Chem. 277:15558, 2002). Pueden realizarse deleciones similares en 15 otras células huésped. Puede lograrse un aumento adicional de ácidos grasos insaturados, por ejemplo, sobreexpresando fabM (trans-2, cis-3-decenoil-ACP isomerasa, registro de GenBank DAA05501) y controlando la expresión de fabK (trans-2-enoil-ACP reductasa II, registro de GenBank NP_357969) de Streptococcus pneumoniae (Marrakchi et al., J. Biol. Chem. 277: 44809, 2002), mientras se deleciona fabl de E. coli (trans-2-enoil-ACP reductasa, registro de GenBank NP_415804). En algunos ejemplos, puede atenuarse el gen fabF endógeno, 20 aumentando así el porcentaje de palmitoleato (C16:1) producido.

En aún otros ejemplos, pueden diseñarse por ingeniería genética células huésped para producir ácidos grasos saturados reduciendo la expresión de un gen sfa, gns y/o fab.

En algunos casos, puede diseñarse por ingeniería una célula huésped para expresar un nivel atenuado de una deshidratasa/isomerasa y/o una cetoacil-ACP sintasa. Por ejemplo, puede diseñarse por ingeniería una célula 25 huésped para expresar un nivel disminuido de fabA y/o fabB. En algunos casos, puede hacerse crecer la célula huésped en presencia de ácidos grasos insaturados. En otros casos, la célula huésped puede diseñarse adicionalmente por ingeniería para expresar o sobreexpresar un gen que codifica una enzima desaturasa. Un ejemplo no limitativo de una desaturasa es DesA de B. subtilis (AF037430). En la técnica se conocen otros genes que codifican enzimas desaturasas y pueden usarse en las células huésped y los métodos descritos en el presente 30 documento, tales como desaturasas que usan acil-ACP, tal como hexadecanoil-ACP u octadecanoil-ACP. Los ácidos grasos saturados pueden usarse para producir derivados de ácidos grasos, tales como aldehídos grasos, y posteriormente alcoholes grasos saturados, tal como se describe en el presente documento.

Producción de alcoholes grasos

Un aldehído graso descrito en el presente documento puede convertirse en un alcohol graso mediante un alcohol 35 deshidrogenasa. En algunos ejemplos, puede expresarse un gen que codifica un polipéptido biosintético de aldehído graso descrito en el presente documento en una célula huésped que expresa un alcohol deshidrogenasa endógena que puede convertir un aldehído graso producido por el polipéptido biosintético de aldehído graso en un alcohol graso correspondiente. En otros casos, puede expresarse un gen que codifica un polipéptido biosintético de alcohol graso descrito en el presente documento, tal como una secuencia de aminoácidos indicada en la figura 10 o una 40 variante de la misma, en una célula huésped. Los genes biosintéticos de alcohol graso a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, AIrA de Acenitobacter sp. M-I u homólogos de AIrA; y alcohol deshidrogenasas de E. coli endógenas tales como DkgA (NP_417485), DkgB (NP_414743), YjgB, (AAC77226), YdjL (AAC74846), YdjJ (NP_416288), AdhP (NP_415995), YhdH (NP_417719), YahK (NP_414859), YphC (AAC75598) e YqhD (Q46856). En otros casos, puede coexpresarse un gen que codifica un polipéptido biosintético de alcohol graso en una célula 45 huésped con un gen que codifica un polipéptido biosintético de aldehído graso descrito en el presente documento.

Diseño por ingeniería genética de células huésped para producir alcoholes grasos

Pueden usarse diversas células huésped para producir alcoholes grasos, tal como se describe en el presente documento. Una célula huésped puede ser cualquier célula procariota o eucariota. Por ejemplo, puede expresarse un gen que codifica un polipéptido descrito en el presente documento (por ejemplo, un polipéptido biosintético de 50 aldehído graso y/o un polipéptido biosintético de alcohol graso) en células bacterianas (tales como E. coli), células de insecto, levadura o células de mamífero (tales como células de ovario de hámster chino (CHO), células COS, células VERO, células BHK, células HeLa, células CvI, células MDCK, células 293, células 3T3 o células PC12). Otras células huésped a modo de ejemplo incluyen células de los miembros del género Escherichia, Bacillus, Lactobacillus, Rhodococcus, Pseudomonas, Aspergillus, Trichoderma, Neurospora, Fusarium, Humicola, 55 Rhizomucor, Kluyveromyces, Pichia, Mucor, Myceliophtora, Penicillium, Phanerochaete, Pleurotus, Trametes, Chrysosporium, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Yarrowia o Streptomyces. Aún otras células huésped a modo de ejemplo pueden ser una célula de Bacillus lentus, una célula de Bacillus brevis, una célula de Bacillus stearothermophilus, una célula de Bacillus licheniformis, una célula de Bacillus alkalophilus, una célula de Bacillus

coagulans, una célula de Bacillus circulans, una célula de Bacillus pumilis, una célula de Bacillus thuringiensis, una célula de Bacillus clausii, una célula de Bacillus megaterium, una célula de Bacillus subtilis, una célula de Bacillus amyloliquefaciens, una célula de Trichoderma koningii, una célula de Trichoderma viride, una célula de Trichoderma reesei, una célula de Trichoderma longibrachiatum, una célula de Aspergillus awamori, una célula de Aspergillus fumigates, una célula de Aspergillus foetidus, una célula de Aspergillus nidulans, una célula de Aspergillus niger, una 5 célula de Aspergillus oryzae, una célula de Humicola insolens, una célula de Humicola lanuginose, una célula de Rhizomucor miehei, una célula de Mucor miehei, una célula de Streptomyces lividans, una célula de Streptomyces murinus o una célula de Actinomycetes. Otras células huésped son células huésped de cianobacterias.

En una realización preferida, la célula huésped es una célula de E. coli, una célula de Saccharomyces cerevisiae o una célula de Bacillus subtilis. En una realización más preferida, la célula huésped es de las cepas de E. coli B, C, K 10 o W. Los expertos en la técnica conocen otras células huésped adecuadas.

En los documentos WO2009/111513 y WO2009/111672 se describen células huésped adicionales que pueden usarse en los métodos descritos en el presente documento.

Pueden usarse diversos métodos bien conocidos en la técnica para diseñar por ingeniería genética células huésped para producir alcoholes grasos. Los métodos pueden incluir el uso de vectores, preferiblemente vectores de 15 expresión, que contienen un ácido nucleico que codifica un polipéptido biosintético de aldehído graso y/o un polipéptido biosintético de alcohol graso descrito en el presente documento, variante de polipéptido o un fragmento del mismo. Los expertos en la técnica apreciarán una variedad de vectores virales (por ejemplo, vectores retrovirales, vectores lentivirales, vectores adenovirales y vectores virales adenoasociados) y vectores no virales que pueden usarse en los métodos descritos en el presente documento. 20

Los vectores de expresión recombinantes descritos en el presente documento incluyen un ácido nucleico descrito en el presente documento en una forma adecuada para la expresión del ácido nucleico en una célula huésped. Los vectores de expresión recombinantes pueden incluir una o más secuencias de control, seleccionadas basándose en la célula huésped que va a usarse para la expresión. La secuencia de control está operativamente unida a la secuencia de ácido nucleico que va a expresarse. Tales secuencias de control se describen, por ejemplo, en 25 Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Las secuencias de control incluyen aquéllas que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células huésped y aquéllas que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos sólo en determinadas células huésped (por ejemplo, secuencias reguladoras específicas de tejido). Los expertos en la técnica apreciarán que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la 30 célula huésped que va a transformarse, el nivel de expresión de proteína deseado, etc. Los vectores de expresión descritos en el presente documento pueden introducirse en células huésped para producir polipéptidos, incluyendo polipéptidos de fusión, codificados por los ácidos nucleicos tal como se describe en el presente documento.

Pueden diseñarse vectores de expresión recombinante para la expresión de un gen que codifica un polipéptido biosintético de aldehído graso (o variante) y/o un gen que codifica un polipéptido biosintético de alcohol graso en 35 células procariotas o eucariotas (por ejemplo, células bacterianas, tales como E. coli, células de insecto (por ejemplo, usando vectores de expresión de baculovirus), células de levadura o células de mamífero). Se comentan adicionalmente células huésped adecuadas en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Alternativamente, el vector de expresión recombinante puede transcribirse y traducirse in vitro, por ejemplo, usando secuencias reguladoras de promotor de T7 y polimerasa de 40 T7.

La expresión de genes que codifican polipéptidos en procariotas, por ejemplo, E. coli, se lleva a cabo con la mayor frecuencia con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión de polipéptidos o bien de fusión o bien no de fusión. Los vectores de fusión añaden varios aminoácidos a un polipéptido codificado en los mismos, habitualmente en el extremo amino-terminal del polipéptido recombinante. Tales vectores de fusión 45 sirven normalmente para tres fines: (1) aumentar la expresión del polipéptido recombinante; (2) aumentar la solubilidad del polipéptido recombinante; y (3) ayudar en la purificación del polipéptido recombinante actuando como ligando en la purificación por afinidad. Con frecuencia, en vectores de expresión de fusión, se introduce un sitio de escisión proteolítica en la unión del resto de fusión y el polipéptido recombinante. Esto permite la separación del polipéptido recombinante del resto de fusión tras la purificación del polipéptido de fusión. Los ejemplos de tales 50 enzimas, y sus secuencias de reconocimiento relacionadas, incluyen factor Xa, trombina y enterocinasa. Los vectores de expresión de fusión a modo de ejemplo incluyen pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith et al., Gene (1988) 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass.), y pRITS (Pharmacia, Piscataway, N.J.), que fusionan glutatión S-transferasa (GST), proteína de unión a maltosa E, o proteína A, respectivamente, al polipéptido recombinante diana. 55

Los ejemplos de vectores de expresión de E. coli, inducibles, no de fusión, incluyen pTrc (Amann et al., Gene (1988) 69:301-315) y pET 11d (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 60-89). La expresión génica diana a partir del vector pTrc se basa en la transcripción de ARN polimerasa del huésped a partir de un promotor de fusión de trp-lac híbrido. La expresión génica diana a partir del vector pET 11d se basa en la transcripción de un promotor de fusión de gn10-lac de T7 mediada por una ARN 60

polimerasa viral coexpresada (gn1 de T7). Esta polimerasa viral se suministra por cepas huésped BL21(DE3) o HMS174(DE3) a partir de un -profago residente que aloja un gen gn1 de T7 bajo el control transcripcional del promotor lacUV 5.

Una estrategia para maximizar la expresión de polipéptido recombinante es expresar el polipéptido en una célula huésped con una capacidad alterada para escindir proteolíticamente el polipéptido recombinante (véase Gottesman, 5 Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 119-128). Otra estrategia es alterar la secuencia de ácido nucleico que va a insertarse en un vector de expresión de modo que los codones individuales para cada aminoácido son los usados preferiblemente en la célula huésped (Wada et al., Nucleic Acids Res. (1992) 20:2111-2118). Tal alteración de secuencias de ácido nucleico puede llevarse a cabo mediante técnicas de síntesis de ADN convencionales. 10

En otra realización, la célula huésped es una célula de levadura. En esta realización, el vector de expresión es un vector de expresión de levadura. Los ejemplos de vectores para la expresión en levadura S. cerevisiae incluyen pYepSec1 (Baldari et al., EMBO J. (1987) 6:229-234), pMFa (Kurjan et al., Cell (1982) 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al., Gene (1987) 54:113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.) y picZ (Invitrogen Corp, San Diego, Calif.). 15

Alternativamente, puede expresarse un polipéptido descrito en el presente documento en células de insecto usando vectores de expresión de baculovirus. Los vectores de baculovirus disponibles para la expresión de proteínas en células de insecto en cultivo (por ejemplo, células Sf9) incluyen, por ejemplo, la serie pAc (Smith et al., Mol. Cell Biol. (1983) 3:2156-2165) y la serie pVL (Lucklow et al., Virology (1989) 170:31-39).

En aún otra realización, los ácidos nucleicos descritos en el presente documento pueden expresarse en células de 20 mamífero usando un vector de expresión de mamífero. Los ejemplos de vectores de expresión de mamífero incluyen pCDM8 (Seed, Nature (1987) 329:840) y pMT2PC (Kaufman et al., EMBO J. (1987) 6:187-195). Cuando se usan en células de mamífero, las funciones de control del vector de expresión pueden proporcionarse por elementos reguladores virales. Por ejemplo, los promotores habitualmente usados se derivan de polioma, adenovirus 2, citomegalovirus y virus del simio 40. Otros sistemas de expresión adecuados para células tanto procariotas como 25 eucariotas se describen en los capítulos 16 y 17 de Sambrook et al., eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2ª, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989.

Pueden introducirse vectores en células procariotas o eucariotas mediante técnicas de transformación o transfección convencionales. Tal como se usan en el presente documento, los términos “transformación” y “transfección” se refieren a una variedad de técnicas reconocidas en la técnica para introducir ácido nucleico foráneo (por ejemplo, 30 ADN) en una célula huésped, incluyendo coprecipitación con fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, lipofección o electroporación. Pueden encontrarse métodos adecuados para transformar o transfectar células huésped, por ejemplo, en Sambrook et al. (citado anteriormente).

Para la transformación estable de células bacterianas, se sabe que, dependiendo del vector de expresión y la técnica de transformación usados, sólo una pequeña fracción de células captarán y replicarán el vector de 35 expresión. Con el fin de identificar y seleccionar estos transformantes, puede introducirse un gen que codifica un marcador seleccionable (por ejemplo, resistencia a antibióticos) en las células huésped junto con el gen de interés. Los marcadores seleccionables incluyen los que confieren resistencia a fármacos, tales como ampicilina, canamicina, cloranfenicol o tetraciclina. Pueden introducirse ácidos nucleicos que codifican un marcador seleccionable en una célula huésped en el mismo vector que el que codifica un polipéptido descrito en el presente 40 documento o pueden introducirse en un vector separado. Pueden identificarse células transfectadas de manera estable con el ácido nucleico introducido mediante selección con fármaco (por ejemplo, las células que han incorporado el gen de marcador seleccionable sobrevivirán, mientras que las otras células morirán).

Para una transfección estable de células de mamífero, se sabe que, dependiendo del vector de expresión y la técnica de transfección usados, sólo una pequeña fracción de células puede integrar el ADN foráneo en su genoma. 45 Con el fin de identificar y seleccionar estos integrantes, puede introducirse un gen que codifica un marcador seleccionable (por ejemplo, resistencia a antibióticos) en las células huésped junto con el gen de interés. Los marcadores seleccionables preferidos incluyen aquéllos que confieren resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina y metotrexato. Pueden introducirse ácidos nucleicos que codifican un marcador seleccionable en una célula huésped en el mismo vector que el que codifica un polipéptido descrito en el presente documento o pueden 50 introducirse en un vector separado. Pueden identificarse las células transfectadas de manera estable con el ácido nucleico introducido mediante selección con fármaco (por ejemplo, las células que han incorporado el gen de marcador seleccionable sobrevivirán, mientras que las otras células morirán).

Proteínas de transporte

Las proteínas de transporte pueden exportar polipéptidos y compuestos orgánicos (por ejemplo, alcoholes grasos) 55 fuera de una célula huésped. Muchas proteínas de transporte y eflujo sirven para excretar una amplia variedad de compuestos y pueden modificarse de manera natural para ser selectivas para tipos particulares de hidrocarburos.

Ejemplos no limitativos de proteínas de transporte adecuadas son proteínas de transporte de casete de unión a ATP

(ABC), proteínas de eflujo y proteínas transportadoras de ácidos grasos (FATP). Los ejemplos no limitativos adicionales de proteínas de transporte adecuadas incluyen las proteínas de transporte de ABC de organismos tales como Caenorhabditis elegans, Arabidopsis thalania, Alkaligenes eutrophus y Rhodococcus erythropolis. En la figura 9 se indican proteínas de transporte de ABC a modo de ejemplo que pueden usarse (por ejemplo, CER5, AtMRP5, AmiS2 y AtPGP1). También pueden elegirse células huésped por su capacidad endógena para secretar compuestos 5 orgánicos. La eficacia de la producción de compuestos orgánicos y secreción en el entorno de la célula huésped (por ejemplo, medio de cultivo, caldo de fermentación) puede expresarse como una razón de producto intracelular con respecto a producto extracelular. En algunos ejemplos, la razón puede ser de aproximadamente 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4 ó 1:5.

Fermentación 10

La producción y el aislamiento de alcoholes grasos pueden potenciarse empleando técnicas de fermentación beneficiosas. Un método para maximizar la producción al tiempo que se reducen los costes es aumentar el porcentaje de la fuente de carbono que se convierte en productos hidrocarbonados.

Durante ciclos de vida celulares normales, se usa carbono en funciones celulares, tales como producción de lípidos, sacáridos, proteínas, ácidos orgánicos y ácidos nucleicos. Reducir la cantidad de carbono necesaria para 15 actividades relacionadas con el crecimiento puede aumentar la eficacia de conversión de la fuente de carbono en producto. Esto puede lograrse, por ejemplo, haciendo crecer en primer lugar células huésped hasta una densidad deseada (por ejemplo, una densidad que se alcanza al máximo de la fase de crecimiento logarítmica). En tal punto, pueden emplearse genes de punto de control de la replicación para detener el crecimiento de células. Específicamente, pueden usarse mecanismos de percepción de quórum (revisado en Camilli et al., Science 20 311:1113, 2006; Venturi FEMS Microbio. Rev. 30:274-291, 2006; y Reading et al., FEMS Microbiol. Lett. 254:1-11, 2006) para activar genes de punto de control, tales como p53, p21 u otros genes de punto de control.

Los genes que pueden activarse para detener la replicación y el crecimiento celular en E. coli incluyen genes umuDC. La sobreexpresión de genes umuDC detiene la progresión desde la fase estacionaria hasta el crecimiento exponencial (Murli et al., J. of Bact. 182: 1127, 2000). UmuC es una ADN polimerasa que puede llevar a cabo la 25 síntesis translesión sobre lesiones no codificantes (la base mecanística de la mayoría de las mutagénesis por UV y químicas). Los productos del gen umuDC están implicados en el proceso de síntesis translesión y también sirven como un punto de control de daño de la secuencia de ADN. Los productos del gen umuDC incluyen UmuC, UmuD, umuD’, UmuD’2C, UmuD’2 y UmuD2. Simultáneamente, pueden activarse genes que producen productos, minimizando así la necesidad de usar rutas de replicación y mantenimiento mientras se prepara un aldehído graso. 30 También pueden diseñarse por ingeniería células huésped para expresar umuC y umuD de E. coli en pBAD24 bajo el sistema del promotor prpBCDE mediante síntesis de novo de este gen con los genes de producción de producto final apropiados.

El porcentaje de carbonos introducidos convertidos en alcoholes grasos puede ser un impulsor de coste. Cuanto más eficaz es el proceso (es decir, mayor es el porcentaje de carbonos introducidos convertidos en alcoholes 35 grasos), menos caro será el proceso. Para fuentes de carbono que contienen oxígeno (por ejemplo, fuentes a basa de glucosa y otros hidratos de carbono), el oxígeno debe liberarse en forma de dióxido de carbono. Por cada 2 átomos de oxígeno liberados, también se libera un átomo de carbono conduciendo a una eficacia metabólica teórica máxima de aproximadamente el 34% (p/p) (para productos derivados de ácidos grasos). Sin embargo, esta cifra cambia para otros compuestos orgánicos y fuentes de carbono. Las eficacias típicas en la bibliografía son 40 aproximadamente inferiores al 5%. Las células huésped diseñadas por ingeniería genética para producir alcoholes grasos pueden tener una eficacia superior a aproximadamente el 1, 3, 5, 10, 15, 20, 25 y 30%. En un ejemplo, las células huésped pueden mostrar una eficacia de aproximadamente el 10% a aproximadamente el 25%. En otros ejemplos, tales células huésped pueden mostrar una eficacia de aproximadamente el 25% a aproximadamente el 30%. En otros ejemplos, las células huésped pueden mostrar una eficacia superior al 30%. 45

La célula huésped puede diseñarse por ingeniería genética adicionalmente para expresar celulosomas recombinantes, tales como los descritos en la solicitud de PCT número PCT/US2007/003736 (= documento WO 2008/100251). Estos celulosomas pueden permitir que la célula huésped use material celulósico como fuente de carbono. Por ejemplo, la célula huésped puede diseñarse por ingeniería genética adicionalmente para expresar invertasas (EC 3.2.1.26) de modo que puede usarse sacarosa como fuente de carbono. De manera similar, la célula 50 huésped puede diseñarse por ingeniería genética usando las enseñanzas descritas en las patentes estadounidenses n.os 5.000.000; 5.028.539; 5.424.202; 5.482.846 y 5.602.030; de modo que la célula huésped puede asimilar carbono eficazmente y usar materiales celulósicos como fuentes de carbono.

En un ejemplo, la cámara de fermentación puede encerrar una fermentación que está experimentando una reducción continua. En este caso, puede crearse un entorno reductor estable. El equilibrio electrónico puede 55 mantenerse mediante la liberación de dióxido de carbono (en forma gaseosa). Esfuerzos para aumentar el equilibrio de NAD/H y NADP/H también pueden facilitar la estabilización del equilibrio electrónico. También puede potenciarse la disponibilidad de NADPH intracelular diseñando por ingeniería genética la célula huésped para expresar una NADH:NADPH transhidrogenasa. La expresión de una o más NADH:NADPH transhidrogenasas convierte la NADH producida en la glicólisis en NADPH, lo que puede potenciar la producción de alcoholes grasos. 60

Para la producción a pequeña escala, las células huésped diseñadas por ingeniería genética pueden hacerse crecer en lotes de, por ejemplo, aproximadamente 100 mL, 500 mL, 1 L, 2 L, 5 L o 10 L; fermentarse; e inducirse para expresar genes biosintéticos de aldehídos grasos deseados y/o genes de alcohol deshidrogenasa basándose en los genes específicos codificados en los plásmidos apropiados. Para la producción a gran escala, las células huésped diseñadas por ingeniería genética pueden hacerse crecer en lotes de aproximadamente 10 L, 100 L, 1000 L, 5 10.000 L, 100.000 L, 1.000.000 L o más; fermentarse; e inducirse para expresar los genes biosintéticos de aldehídos grasos deseados y/o genes de alcohol deshidrogenasa basándose en los genes específicos codificados en los plásmidos apropiados o incorporados en el genoma de la célula huésped.

Por ejemplo, un huésped de producción adecuado, tal como células de E. coli, que aloja plásmidos que contienen los genes deseados o que tiene los genes integrados en su cromosoma, puede incubarse en un reactor adecuado, 10 por ejemplo un reactor de 1 L, durante 20 horas a 37ºC en medio M9 complementado con el 2% de glucosa, carbenicilina y cloranfenicol. Cuando la DO600 del cultivo alcanza 0,9, el huésped de producción puede inducirse con alcohol IPTG. Tras la incubación, pueden extraerse los medios gastados y puede examinarse la fase orgánica para determinar la presencia de alcoholes grasos usando GC-EM.

En algunos casos, tras la primera hora de inducción, pueden extraerse alícuotas de no más de aproximadamente el 15 10% del volumen celular total cada hora y dejarlas reposar sin agitación para permitir que los alcoholes grasos suban hasta la superficie y experimenten una precipitación o separación de fases espontánea. Entonces puede recogerse el componente de alcohol graso y devolverse la fase acuosa a la cámara de reacción. La cámara de reacción puede hacerse funcionar de manera continua. Cuando la DO600 disminuye por debajo de 0,6, pueden sustituirse las células por un nuevo lote que se hizo crecer a partir de un cultivo de siembra. 20

Producción de alcoholes grasos usando métodos libres de células

En algunos métodos descritos en el presente documento, puede producirse un alcohol graso usando un polipéptido purificado (por ejemplo, un polipéptido biosintético de alcohol graso) descrito en el presente documento y un sustrato (por ejemplo, aldehído graso), producido, por ejemplo, mediante un método descrito en el presente documento. Por ejemplo, puede diseñarse por ingeniería genética una célula huésped para expresar un polipéptido biosintético de 25 alcohol graso o variante tal como se describe en el presente documento. La célula huésped puede cultivarse en condiciones adecuadas para permitir la expresión del polipéptido. Entonces pueden generarse extractos libres de células usando métodos conocidos. Por ejemplo, las células huésped pueden lisarse usando detergentes o mediante sonicación. Los polipéptidos expresados pueden purificarse usando métodos conocidos. Tras obtener los extractos libres de células, pueden añadirse sustratos descritos en el presente documento a los extractos libres de células y 30 mantenerse en condiciones para permitir la conversión de los sustratos (por ejemplo, aldehídos grasos) en alcoholes grasos. Entonces pueden separarse los alcoholes grasos y purificarse usando técnicas conocidas.

En algunos casos, un aldehído graso descrito en el presente documento puede convertirse en un alcohol graso poniendo en contacto el aldehído graso con un polipéptido biosintético de alcohol graso indicado en la figura 10, o una variante del mismo. 35

Procesamiento tras la producción

Los alcoholes grasos producidos durante la fermentación pueden separarse de los medios de fermentación. Puede usarse cualquier técnica conocida para separar alcoholes grasos de medios acuosos. Un procedimiento de separación a modo de ejemplo es un procedimiento de separación de dos fases (bifásico). Este procedimiento implica fermentar las células huésped diseñadas por ingeniería genética en condiciones suficientes para producir 40 alcoholes grasos, permitir que el alcohol graso se recoja en una fase orgánica y separar la fase orgánica del caldo de fermentación acuoso. Este método puede ponerse en práctica en procedimientos de fermentación tanto continuos como discontinuos.

La separación bifásica usa la relativa inmiscibilidad de los alcoholes grasos para facilitar la separación. Inmiscible se refiere a la relativa incapacidad de un compuesto de disolverse en agua y se define por el coeficiente de reparto del 45 compuesto. Un experto habitual en la técnica apreciará que eligiendo un caldo de fermentación y una fase orgánica, de tal manera que el alcohol graso que está produciéndose tiene un valor de logP alto, el alcohol graso puede separarse en la fase orgánica, incluso a concentraciones muy bajas, en el recipiente de fermentación.

Los alcoholes grasos producidos mediante los métodos descritos en el presente documento pueden ser relativamente inmiscibles en el caldo de fermentación, así como en el citoplasma. Por tanto, el alcohol graso puede 50 recogerse en una fase orgánica o bien de manera intracelular o bien extracelular. La recogida de los productos en la fase orgánica puede reducir el impacto del alcohol graso sobre la función celular y puede permitir que la célula huésped produzca más producto.

Los métodos descritos en el presente documento pueden dar como resultado la producción de compuestos homogéneos en los que al menos aproximadamente el 60%, el 70%, el 80%, el 90% o el 95% de los alcoholes 55 grasos producidos tendrán longitudes de cadena de carbono que varían en menos de aproximadamente 6 carbonos, menos de aproximadamente 4 carbonos o menos de aproximadamente 2 carbonos. Estos compuestos también pueden producirse con un grado de saturación relativamente uniforme. Estos compuestos pueden usarse

directamente como combustibles, aditivos para combustibles, materiales de partida para la producción de otros compuestos químicos (por ejemplo, polímeros, tensioactivos, plásticos, materiales textiles, disolventes, adhesivos, etc.), o aditivos para el cuidado personal. Estos compuestos también pueden usarse como materia prima para reacciones posteriores, por ejemplo, hidrogenación, craqueo catalítico (por ejemplo, mediante hidrogenación, pirólisis o ambas), para preparar otros productos. 5

En algunas realizaciones, los alcoholes grasos producidos usando métodos descritos en el presente documento pueden contener entre aproximadamente el 50% y aproximadamente el 90% de carbono; o entre aproximadamente el 5% y aproximadamente el 25% de hidrógeno. En otras realizaciones, los alcoholes grasos producidos usando métodos descritos en el presente documento pueden contener entre aproximadamente el 65% y aproximadamente el 85% de carbono; o entre aproximadamente el 10% y aproximadamente el 15% de hidrógeno. 10

Bioproductos y composiciones de tensioactivos y detergentes

Los alcoholes grasos descritos en el presente documento pueden usarse como, o convertirse en, una composición de tensioactivos o detergentes. Un experto habitual en la técnica apreciará que, dependiendo del propósito previsto del tensioactivo o detergente, pueden producirse y usarse diferentes alcoholes grasos. Por ejemplo, cuando los alcoholes grasos descritos en el presente documento se usan como materia prima para la producción de 15 tensioactivos o detergentes, un experto habitual en la técnica apreciará que las características de la materia prima de alcohol graso afectarán a las características del tensioactivo o detergente producido. Por tanto, las características del producto de tensioactivo o detergente pueden seleccionarse produciendo alcoholes grasos particulares para su uso como materia prima.

No se han producido bioproductos (por ejemplo, alcoholes grasos) que comprenden compuestos orgánicos 20 producidos biológicamente, particularmente alcoholes grasos producidos biológicamente usando la ruta de biosíntesis de ácidos grasos, a partir de fuentes renovables y, como tales, son composiciones de materia nuevas. Estos nuevos bioproductos pueden distinguirse de los compuestos orgánicos derivados del carbono petroquímico basándose en la identificación de la huella de carbono isotópico doble o la datación de 14C. Adicionalmente, la fuente específica de carbono de biofuentes (por ejemplo, glucosa frente a glicerol) puede determinarse mediante 25 identificación de la huella de carbono isotópico doble (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.º 7.169.588).

La capacidad de distinguir bioproductos de compuestos orgánicos a base de petróleo es beneficiosa en el seguimiento de estos materiales en el comercio. Por ejemplo, pueden distinguirse productos químicos o compuestos orgánicos que comprenden perfiles de isótopos de carbono tanto de base biológica como a base de petróleo de productos químicos y compuestos orgánicos preparados únicamente a partir de materiales a base de petróleo. Por 30 tanto, puede realizarse un seguimiento de los presentes materiales en el comercio basándose en su perfil de isótopos de carbono único.

Los bioproductos pueden distinguirse de los compuestos orgánicos a base de petróleo comparando la razón de isótopos de carbono estables (13C/12C) en cada combustible. La razón 13C/12C en un bioproducto dado es una consecuencia de la razón 13C/12C en el dióxido de carbono atmosférico en el momento de fijar el dióxido de carbono. 35 También refleja la ruta metabólica precisa. También se producen variaciones regionales. El petróleo, las plantas de C3 (de hoja ancha), las plantas de C4 (las hierbas) y los carbonatos marinos muestran diferencias significativas en 13C/12C y los valores de 13C correspondientes. Además, los análisis de materia lipídica de plantas C3 y C4 son diferentes de los materiales derivados de componentes de hidratos de carbono de las mismas plantas como consecuencia de la ruta metabólica. 40

Dentro de la precisión de la medición, 13C muestra grandes variaciones debido a efectos de fraccionamiento isotópico, el más significativo de los cuales para bioproductos es el mecanismo fotosintético. La principal causa de diferencias en la razón de isótopos de carbono en plantas está estrechamente asociada con diferencias en la ruta del metabolismo de carbono fotosintético en las plantas, particularmente la reacción que se produce durante la carboxilación primaria (es decir, la fijación inicial de CO2 atmosférico). Dos grandes clases de vegetación son las que 45 incorporan el ciclo fotosintético “C3”(o de Calvin-Benson) y las que incorporan el ciclo fotosintético “C4” (o de Hatch-Slack).

En las plantas C3, la reacción de carboxilación o fijación de CO2 principal implica la enzima ribulosa-1,5-difosfato carboxilasa, y el primer producto estable es un compuesto de 3 carbonos. Las plantas C3, tales como de madera dura y coníferas, son dominantes en las zonas de clima templado. 50

En las plantas C4, una reacción de carboxilación adicional que implica otra enzima, fosfoenol-piruvato carboxilasa, es la reacción de carboxilación principal. El primer compuesto de carbono estable es un ácido de 4 carbonos que posteriormente se descarboxila. El CO2 así liberado vuelve a fijarse en el ciclo C3. Ejemplos de plantas C4 son hierbas tropicales, maíz y caña de azúcar.

Tanto las plantas C4 como C3 muestran un intervalo de razones isotópicas 13C/12C, pero los valores normales son de 55 aproximadamente -7 a aproximadamente -13 por mil para plantas C4 y de aproximadamente -19 a aproximadamente -27 por mil para plantas C3 (véase, por ejemplo, Stuiver et al., Radiocarbon 19:355, 1977). El carbón y el petróleo se encuentran generalmente en este último intervalo. La escala de medición de 13C se definió originalmente por un

ajuste a cero por la caliza Pee Dee Belemnite (PDB), en la que los valores se facilitan en partes por mil desviaciones a partir de este material. Los valores de “13C” se expresan en partes por mil (por mil), abreviado, %o, y se calculan de la siguiente manera:

13C (%o) = [(13C/12C)muestra - (13C/12C)patrón]/ (13C/12C)patrón x 1000

Dado que el material de referencia (RM) PDB se ha agotado, se ha desarrollado una serie de RM alternativos en 5 colaboración con IAEA, USGS, NIST, y otros laboratorios de isótopos internacionales seleccionados. Las anotaciones para las desviaciones por mil a partir de PDB son de 13C. Las mediciones se realizan con CO2 mediante espectrometría de masas de razón estable de alta precisión (IRMS) con iones moleculares con masas de 44, 45 y 46.

Las composiciones descritas en el presente documento incluyen bioproductos producidos mediante cualquiera de 10 los métodos descritos en el presente documento. Específicamente, el bioproducto puede tener una 13C de aproximadamente -28 o superior, aproximadamente -27 o superior, -20 o superior, -18 o superior, -15 o superior, -13 o superior, -10 o superior o -8 o superior. Por ejemplo, el bioproducto puede tener una 13C de aproximadamente -30 a aproximadamente -15, de aproximadamente -27 a aproximadamente -19, de aproximadamente -25 a aproximadamente -21, de aproximadamente -15 a aproximadamente -5, de aproximadamente -13 a 15 aproximadamente -7 o de aproximadamente -13 a aproximadamente -10. En otros casos, el bioproducto puede tener una 13C de aproximadamente -10, -11, -12 o -12,3.

Los bioproductos también pueden distinguirse de compuestos orgánicos a base de petróleo comparando la cantidad de 14C en cada compuesto. Dado que 14C tiene una semivida nuclear de 5730 años, los combustibles a base de petróleo que contienen carbono “más antiguo” pueden distinguirse de los bioproductos que contienen carbono “más 20 reciente” (véase, por ejemplo, Currie, “Source Apportionment of Atmospheric Particles”, Characterization of Environmental Particles, J. Buffle y H. P. van Leeuwen, Eds., 1 de vol. I de IUPAC Environmental Analytical Chemistry Series (Lewis Publishers, Inc) (1992) 3-74).

La suposición básica en la datación de radiocarbono es que la constancia de la concentración de 14C en la atmósfera conduce a la constancia de 14C en los organismos vivos. Sin embargo, debido a pruebas nucleares atmosféricas 25 desde 1950 y al quemado de combustible fósil desde 1850, 14C ha adquirido una segunda característica temporal geoquímica. Su concentración en el CO2 atmosférico, y por tanto en la biosfera viva, aproximadamente se duplicó en el máximo de las pruebas nucleares, a mediados de la década de 1960. Desde entonces ha vuelto gradualmente a la tasa de isótopos (14C/12C) inicial cosmogénica (atmosférica) en estado estacionario de aproximadamente 1,2 x 10-12, con una “semivida” de relajación aproximada de 7-10 años. (Esta última semivida no debe interpretarse de 30 manera literal; en vez de eso, debe usarse la función de introducción/degradación nuclear atmosférica detallada para rastrear la variación de 14C atmosférico y biosférico desde el inicio de la era nuclear).

Esta última característica temporal de 14C biosférico es la que mantiene la promesa de una datación anual de carbono biosférico reciente. 14C puede medirse mediante espectrometría de masas con acelerador (AMS), con resultados facilitados en unidades de “fracción de carbono moderno” (fM). fM se define por el National Institute of 35 Standards and Technology (NIST) Standard Reference Materials (SRMs) 4990B y 4990C. Tal como se usa en el presente documento, la “fracción de carbono moderno” o “fM” tiene el mismo significado que el definido por el National Institute of Standards and Technology (NIST) Standard Reference Materials (SRMs) 4990B y 4990C, conocidos como patrones de ácidos oxálicos HOxI y HOxII, respectivamente. La definición fundamental se refiere a 0,95 veces la razón de isótopos 14C/12C de HOxI (denominado AD 1950). Esto es aproximadamente equivalente a la 40 madera previa a la revolución industrial corregida para la degradación. Para la biosfera viva actual (material vegetal), fM es de aproximadamente 1,1.

Las composiciones descritas en el presente documento incluyen bioproductos que pueden tener una fM de 14C de al menos aproximadamente 1. Por ejemplo, el bioproducto puede tener una fM de 14C de al menos aproximadamente 1,01, una fM de 14C de aproximadamente 1 a aproximadamente 1,5, una fM de 14C de aproximadamente 1,04 a 45 aproximadamente 1,18 o una fM de 14C de aproximadamente 1,111 a aproximadamente 1,124.

Otra medición de 14C se conoce como el porcentaje de carbono moderno, pMC. Para un arqueólogo o geólogo que usa dataciones de 14C, AD 1950 es igual a “cero años de edad”. Esto también representa 100 pMC. El “carbono bomba” en la atmósfera alcanzó casi el doble del nivel normal en 1963 en el máximo de las armas termonucleares. Su distribución dentro de la atmósfera se ha aproximado desde su aparición, mostrando valores que son superiores 50 a 100 pMC para plantas y animales vivos desde AD 1950. Ha disminuido gradualmente a lo largo del tiempo, siendo el valor actual próximo a 107,5 pMC. Esto significa que un material de biomasa reciente, tal como maíz, tendrá una firma de 14C próxima a 107,5 pMC. Los compuestos a base de petróleo tendrán un valor de pMC de cero. Combinar carbono fósil con carbono actual dará como resultado una dilución del contenido de pMC actual. Suponiendo que 107,5 pMC representa el contenido de 14C de los materiales de biomasa actuales y 0 pMC representa el contenido 55 de 14C de los productos a base de petróleo, el valor de pMC medido para ese material reflejará las proporciones de los dos tipos de componentes. Por ejemplo, un material derivado al 100% de semillas de soja actuales dará una firma de radiocarbono próxima a 107,5 pMC. Si ese material se diluyó al 50% con productos a base de petróleo, dará una firma de radiocarbono de aproximadamente 54 pMC.

Un contenido de carbono de base biológica se deriva asignando “el 100%” igual a 107,5 pMC y “el 0%” igual a 0 pMC. Por ejemplo, una muestra que mide 99 pMC dará un contenido de carbono de base biológica equivalente del 93%. Este valor se denomina el resultado de carbono de base biológica medio y supone que todos los componentes dentro del material analizado se originaron o bien de material biológico actual o bien de material a base de petróleo.

Un bioproducto descrito en el presente documento puede tener un pMC de al menos aproximadamente 50, 60, 70, 5 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 ó 100. En otros casos, un bioproducto descrito en el presente documento puede tener un pMC de entre aproximadamente 50 y aproximadamente 100; aproximadamente 60 y aproximadamente 100; aproximadamente 70 y aproximadamente 100; aproximadamente 80 y aproximadamente 100; aproximadamente 85 y aproximadamente 100; aproximadamente 87 y aproximadamente 98; o aproximadamente 90 y aproximadamente 95. En aún otros casos, un bioproducto descrito en el presente documento puede tener un pMC de 10 aproximadamente 90, 91, 92, 93, 94 ó 94,2.

Los aditivos para combustibles se usan para potenciar el rendimiento de un combustible o motor. Por ejemplo, pueden usarse aditivos para combustibles para alterar el punto de congelación/gelificación, el punto de turbidez, la lubricidad, la viscosidad, la estabilidad oxidativa, la calidad de ignición, el nivel de octanos y/o el punto de inflamación. En los Estados Unidos, todos los aditivos para combustibles deben registrarse en la Environmental 15 Protection Agency. Los nombres de aditivos para combustibles y las empresas que venden los aditivos para combustibles están disponibles al público poniéndose en contacto con la EPA o consultando la página web de la agencia. Un experto habitual en la técnica apreciará que los biocombustibles a base de alcoholes grasos descritos en el presente documento pueden mezclarse con uno o más aditivos para combustibles para conferir una calidad deseada. 20

Los tensioactivos y/o detergentes a base de alcoholes grasos descritos en el presente documento pueden mezclarse con otros tensioactivos y/o detergentes bien conocidos en la técnica.

En algunos ejemplos, la mezcla puede incluir al menos aproximadamente el 10%, el 15%, el 20%, el 30%, el 40%, el 50% o el 60% en peso del alcohol graso. En otros ejemplos, puede prepararse una composición de tensioactivos o detergentes que incluye al menos aproximadamente el 5%, el 10%, el 20%, el 30%, el 40%, el 50%, el 60%, el 70%, 25 el 80%, el 85%, el 90% o el 95% de un alcohol graso que incluye una cadena de carbono que tiene 8, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ó 22 carbonos de longitud. Tales composiciones de tensioactivos o detergentes pueden incluir adicionalmente al menos un aditivo seleccionado de un tensioactivo; una microemulsión; al menos aproximadamente el 5%, el 10%, el 15%, el 20%, el 30%, el 40%, el 50%, el 60%, el 70%, el 80%, el 85%, el 90% o el 95% de tensioactivo o detergente de fuentes no microbianas tales como aceites vegetales o petróleo. 30

La invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos. Los ejemplos se proporcionan únicamente con fines ilustrativos.

Ejemplos

EJEMPLO 1

Identificación de homólogos de ácido carboxílico reductasa (CAR) 35

La ácido carboxílico reductasa (CAR) de la cepa de Nocardia sp. NRRL 5646 puede reducir ácidos carboxílicos (por ejemplo, ácidos grasos) para dar sus correspondientes aldehídos sin utilizar enzimas activantes separadas, tales como acil-CoA sintasas (Li et al., J. Bacteriol. 179:3482-3487, 1997; He et al., Appl. Environ. Microbiol. 70:1874-1881, 2004)).

Una búsqueda BLAST usando la secuencia de aminoácidos de CAR de NRRL 5646 (n.º de registro de Genpept 40 AAR91681) (SEQ ID NO: 16) como secuencia de consulta identificó aproximadamente 20 secuencias homólogas. Se evaluaron tres homólogos, enumerados en la tabla 7, para determinar su capacidad para convertir ácidos grasos en aldehídos grasos in vivo cuando se expresan en E. coli.

Al nivel de la secuencia de nucleótidos, carA (SEQ ID NO: 19), carB (SEQ ID NO: 21) y fadD9 (SEQ ID NO: 17) demostraron una homología del 62,6%, el 49,4% y el 60,5%, respectivamente, con el gen car (AY495697) de 45 Nocardia sp. NRRL 5646 (SEQ ID NO: 15). Al nivel de aminoácidos, CARA (SEQ ID NO: 20), CARB (SEQ ID NO: 22) y FadD9 (SEQ ID NO: 18) demostraron una identidad del 62,4%, el 59,1% y el 60,7%, respectivamente, con CAR de Nocardia sp. NRRL 5646 (SEQ ID NO: 16).

Tabla 7: Proteína de tipo CAR y las correspondientes secuencias codificantes.

N.º de registro de Genpept: Locus_etiqueta Anotación en GenBank Nombre del gen

NP_217106: Rv 2590 Probable ácido graso-CoA ligasa (FadD9) fadD9

ABK75684: MSMEG 2956 Proteína de la familia de epimerasa/deshidratasa dependiente de NAD carA

YP_889972.1: MSMEG 5739 Proteína de la familia de epimerasa/deshidratasa dependiente de NAD carB

EJEMPLO 2

Identificación de genes de alcohol deshidrogenasa

Ingeniería inversa

E. coli contiene al menos una enzima que cataliza la oxidorreducción reversible de aldehídos grasos y alcoholes 5 grasos (es decir, aldehído graso reductasa / alcohol deshidrogenasa). Se usó ingeniería inversa para identificar tales aldehído graso reductasas / alcohol graso deshidrogenasas en células E. coli MG 1655 que expresan la acil-ACP reductasa YP 400611 de Synechococcus elongatus (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO: 196). Se hicieron crecer cuatro cultivos de 3 ml de LB durante la noche a 37ºC, y se usaron 55 l de cultivos en fase estacionaria para inocular cuatro cultivos independientes de 5,5 ml de LB. Entonces se hicieron crecer esos cultivos de 5,5 ml hasta 10 una DO600 de 0,8-1,0 y entonces se usaron para inocular un número correspondiente de frascos de agitación con deflectores de 2 l, cada uno con 500 ml de medio mínimo Hu-9. 20 h tras la inducción, se sedimentaron las células a 4.000 x g durante 20 min. Se resuspendió el sedimento celular en 30 ml de tampón fosfato 100 mM a pH 7,2 con 1x Bacterial Protease Arrest (G Biosciences). Se lisaron las células en una prensa francesa a 15.000 psi con dos pases a través del instrumento. Entonces se retiraron los residuos celulares centrifugando a 10.000 x g durante 20 min. Se 15 cargó el lisado celular sobre dos columnas HiTrapQ (GE Healthcare) conectadas en serie. Se usaron los siguientes tampones para eluir proteínas: (A) Tris 50 mM, pH 7,5 y (B) Tris 50 mM, pH 7,5 con NaCl 1 M. Se ejecutó un gradiente del 0% de B al 100% de B a lo largo de 5 volúmenes de columna a una velocidad de flujo de 3 ml/min mientras se recogían fracciones de 4 ml.

Se sometieron a ensayo las fracciones para determinar la actividad alcohol deshidrogenasa tomando 190 l de una 20 fracción de proteína y añadiendo 5 l de una disolución de NADPH 20 mM (Sigma) y 5 l de una disolución de dodecanal 20 mM (Fluka) en DMSO. Se incubaron las reacciones a 37ºC durante 1 h. Entonces se extrajeron con 100 l de acetato de etilo y se analizaron para determinar el dodecanol por medio de CG/EM. Las fracciones que eluían a aproximadamente NaCl 350 mM contenían actividad alcohol deshidrogenasa.

Se reunieron las fracciones que contenían actividad alcohol deshidrogenasa y se cargaron sobre una columna 25 ResourceQ (GE Healthcare) de 1 ml. Se usaron las mismas condiciones usadas para la columna HiTrapQ, excepto porque se recogieron fracciones de 0,5 ml. Entonces se reunieron las fracciones de proteína que demostraban actividad alcohol deshidrogenasa y se concentraron usando concentradores de proteína Amicon (Milipore) (puntos de corte de 10.000 kDa) hasta un volumen de 1 ml. Entonces se cargó la disolución sobre una columna de exclusión molecular HiPrep 200 (GE Healthcare). Se ejecutó una disolución tampón que contenía Tris 50 mM, pH 7,5 y NaCl 30 150 mM a través de la columna a una velocidad de 0,3 ml por min. Se recogieron fracciones de 2 ml. Dos fracciones de proteína contenían actividad alcohol deshidrogenasa. Se cargaron estas dos fracciones, más las fracciones antes y después de estas dos fracciones, sobre un gel de poliacrilamida y se tiñeron con tinción de Commassie SimplySafe (Invitrogen).

Comparando las bandas en las fracciones activas e inactivas, aparecía una banda de proteína en las fracciones 35 activas que no se observó en la fracción inactiva. Se cortó esta banda de proteína del gel y se envió a la instalación de espectroscopía de masas de Stanford para la secuenciación de proteínas mediante CL/EM/EM. Una de las proteínas identificadas en este análisis fue YahK.

Para verificar que YahK era de hecho una alcohol deshidrogenasa, se desactivó yahK en E. coli MG1655(DE3, fadD, yjgB) (cepa control) (descrita en el ejemplo 4). Se construyó la cepa con desactivación de yahK 40 MG1655(DE3, fadD, yjg,B yahK) usando el sistema de Lambda Red (descrito en el ejemplo 4) con los siguientes cebadores:

yahK_F

(CATATCAGGCGTTGCCAAATACACATAGCTAATCAGGAGTAAACACAATG) (SEQ ID NO: 197) y

yahK_R 45

(AATCGCACACTAACAGACTGAAAAAATTAATAAATACCCTGTGGTTTAAC) (SEQ ID NO: 198).

Se cultivaron esta cepa yahK y la cepa control, que expresan ambas la acil-ACP reductasa YP_400611, en las condiciones descritas anteriormente. Se prepararon lisados libres de células a partir de ambas cepas, y se sometió a ensayo cada lisado para determinar la actividad alcohol deshidrogenasa tal como se comentó anteriormente.

La cepa yahK no convertía dodecanal en dodecanol, mientras que la cepa silvestre tenía esta actividad. Para una 50 verificación adicional, se ejecutó cada lisado sobre una columna HiTrapQ tal como se describió anteriormente. El

lisado silvestre tenía actividad alcohol deshidrogenasa en fracciones que eluían a aproximadamente NaCl 350 mM, mientras que el lisado de yahK no tenía actividad alcohol deshidrogenasa en esta región.

Bioinformática

Se razonó que las posibles alcohol deshidrogenasas en E. coli eran miembros de cuatro familias de proteínas: alcohol deshidrogenasas dependientes de Zn (Pfam 00107 y 08240), alcohol deshidrogenasas dependientes de Fe 5 (Pfam 00465), aldo-ceto reductasas (Pfam 00248) y deshidrogenasas de cadena corta (Pfam 00106) (Pfam = familia de proteína según “pfam.sanger.ac.uk”). Usando los motivos de Pfam, se identificaron todos los miembros de estas cuatro familias de proteínas en E .coli (enumerados en la figura 10). A partir de esta lista, se eligieron los siguienets 8 candidatos para el análisis experimental: yahK, yjgB, adhP, dkgA, dkgB, yhdH, ydjL e yqhD.

Para determinar si estos genes podían reducir aldehídos grasos a alcoholes grasos, se clonaron estos 8 genes en 10 un vector pET-Duet junto con ‘tesA de E. coli. Entonces se transformaron estos genes en células E. coli (DE3) MG1655 yjgByahK. A continuación se hicieron crecer cultivos iniciadores durante la noche de 3 ml en LB con carbanecilina (100 mg/l) a 37ºC. También se incluyó una cepa control que carecía de una alcohol deshidrogenasa candidata en el experimento. Se usó 1 ml de cada cultivo durante la noche para inocular 50 ml de LB reciente con carbanecilina. Se agitaron los cultivos a 37ºC hasta que alcanzaron una DO600 de 0,8-1. Entonces se transfirieron los 15 cultivos a 18ºC, se indujeron con IPTG 1 mM y se agitaron durante la noche.

Se prepararon lisados libres de células centrifugando los cultivos a 4.000 x g durante 20 min. Entonces se resuspendieron los cultivos en 1 ml de Bugbuster (Novagen) y se agitaron suavemente a temperatura ambiente durante 5 min. Se retiraron los residuos celulares centrifugando a 15.000 x g durante 10 min. Se sometieron a ensayo los lisados resultantes para determinar la actividad alcohol deshidrogenasa mezclando 88 l de lisado, 2 l 20 de cis-11-hexadecenal 40 mM en DMSO y 10 l de NADPH 20 mM. Se incubaron las muestras a 37ºC durante 30 min y entonces se extrajeron con 100 l de acetato de etilo. Se analizaron los extractos usando CG/EM.

Todas las proteínas mostraban una conversión significativamente mejor de cis-11-hexadecenal en cis-11-hexadecanol en comparación con el único control de ‘TesA (véase la tabla 8). Se confirmaron estos resultados en ensayos que usaban dodecanal en lugar de cis-11-hexadecenal como sustrato (véase la tabla 8). 25

Para investigar cómo contribuyen estas enzimas a la actividad alcohol graso deshidrogenasa en E. coli en condiciones de producción, en primer lugar se sometió a prueba la cepa con desactivación doble de yjgB yahK en MG1655(DE3, fadD) (descrita anteriormente) transformándola con un plásmido que expresa la acil-ACP reductasa YP_400611 y analizando los títulos de aldehído graso y alcohol graso. La cepa de prueba también contenía un plásmido que expresa una descarbonilasa. Este mutante con desactivación doble mostraba títulos de aldehído graso 30 ligeramente superiores en varios experimentos (véase, por ejemplo, la figura 11), confirmando que estas dos supuestas alcohol deshidrogenasas contribuyen a la actividad alcohol graso deshidrogenasa en E. coli en condiciones de producción (véase también el ejemplo 4 para resultados similares a partir de una cepa MG1655(DE3, fadD yjgB)). A continuación, se delecionaron dos genes adicionales, yncB y ydjA, en el mutante doble de yjgB yahK. YdjA, que no es un miembro de las cuatro familias de proteínas mencionadas anteriormente, demostró unos 35 niveles de aldehído graso ligeramente elevados (véase la figura 11), lo que indica que puede contribuir también a la actividad alcohol graso deshidrogenasa en E. coli en condiciones de producción.

Adicionalmente, se delecionaron también las alcohol graso deshidrogenasas activas de la tabla 8 en MG1655 (DE3, fadD, yjg,B yahK) y se sometieron a prueba tal como se describió anteriormente. Varias de estas cepas con deleción mostraban niveles de aldehído graso ligeramente elevados, lo que sugiere que estos también pueden 40 contribuir a la actividad alcohol graso deshidrogenasa en E. coli en condiciones de producción (véase la figura 12).

Tabla 8: Sobreexpresión de supuestos genes de alcohol graso deshidrogenasa

: Ensayo de CG/EM Ensayo de NADPH

: % de conversión en el correspondiente alcohol velocidad inicial (pendiente)

sustrato: dodecanal cis-11-hexadecenal cis-11-hexadecenal

Sobreexpresión:

ninguno: 9 12 0,2

YJgB,: 54 89 24,8

YahK: 47 87 28,3

AdhP: 52 45 4,1

YdjL: 51 23 0,14

YhdH: 59 74 13,7

YqhD: 55 23 7,3

yafB (dkgB): 52 65 9,4

YqhE (dkgA): 45 50 9,6

EJEMPLO 3

Expresión de homólogos de CAR y alcohol deshidrogenasa en E. coli

A. Construcción de plásmido de CAR

Se construyeron tres plásmidos de expresión en E. coli para expresar los genes que codifican los homólogos de CAR enumerados en la tabla 7. En primer lugar, se amplificó fadD9 a partir de ADN genómico de Mycobacterium tuberculosis H37Rv (obtenida de la Universidad de Columbia Británica, y Vancouver, BC Canadá) usando los 5 cebadores fadD9F y FadDR (véase la tabla 9). En primer lugar se clonó el producto de PCR en PCR-blunt (Invitrogen) y entonces se liberó como un fragmento de Ndel-AvrII. Entonces se clonó el fragmento de Ndel-AvrII entre los sitios de Ndel y Avrll de pACYCDuet-1 (Novogen) para generar pACYCDuet-l-fadD9.

Se amplificó el gen carA a partir de ADN genómico de Mycobacterium smegmatis MC2 155 (obtenida de la ATCC (ATCC 23037D-5)) usando los cebadores CARMCaF y CARMCaR (véase la tabla 9). Se amplificó el gen carB a 10 partir del ADN genómico de Mycobacterium smegmatis MC2 155 (obtenida de la ATCC (ATCC 23037D-5)) usando los cebadores CARMCbF y CARMCbR (véase la tabla 9). Se clonó en primer lugar cada producto de PCR en PCR-blunt y entonces se liberó como un fragmento de Ndel-AvrII. Entonces se subclonó cada uno de los dos fragmentos entre los sitios de Ndel y Avrll de pACYCDuet-1 (Novogen) para generar pACYCDuet-1-carA y pACYCDuet-1-carB.

Tabla 9. Cebadores usados para amplificar genes que codifican homólogos de CAR 15

fadD9F: cat ATGTCGATCAACGATCAGCGACTGAC (SEQ ID NO: 1)

fadD9R: cctagg TCACAGCAGCCCGAGCAGTC (SEQ ID NO: 2)

CARMCaF: cat ATGACGATCGAAACGCG (SEQ ID NO: 3)

CARMCaR: cctagg TTACAGCAA TCCGAGCATCT (SEQ ID NO: 4)

CARMCbF: cat ATGACCAGCGATGTTCAC (SEQ ID NO: 5)

CARMCbR: cctagg TCAGATCAGACCGAACTCACG (SEQ ID NO: 6)

B. Construcción de plásmido de alcohol deshidrogenasa

El plásmido pETDuet-1-‘tesA-yjgB porta ‘tesA y yjgB (una supuesta alcohol deshidrogenasa; número de registro de GenBank, NP 418690; número de registro de GenPept AAC77226) de la cepa E. coli K12.

Se amplificó el gen yjgB (número de registro de GenBank, NP 418690) a partir del ADN genómico de E. coli K-12 usando los siguientes cebadores. 20

Se generó el insertó de yjgB mediante PCR usando los siguientes cebadores:

Ncol YjgB directo:

aatccTGGCATCGATGATAAAAAGCTATGCCGCAAAAG (SEQ ID NO: 199)

HindIII YjgB inverso:

ataaaagctTTC AAAAATCGGCTTTCAAC ACC ACGCGG (SEQ ID NO: 200) 25

Entonces se subclonó el producto de PCR en los sitios de Ncol y HindIII de pETDuet-1-‘tesA para generar pETDuet-1-‘tesA-yjgB.

El plásmido pETDuet-1-‘tesA-alrAadp1 porta ‘tesA y alrAadp1 (número de registro de GenPept CAG70248.1) de Acinetobacter baylyi ADP1.

Se amplificó el gen alrAadp1 a partir del ADN genómico de Acinetobacter baylyi ADP1 mediante un procedimiento 30 de PCR de dos etapas. El primer conjunto de reacciones de PCR eliminó un sitio de Ncol interno en las pb 632-636 con los siguientes pares de cebadores:

ADP1 Alr mut1 inverso:

5’-GACCACGTGATCGGCCCCCATAGCTTTGAGCTCATC (SEQ ID NO: 201)

ADP1 Alr1 mut1 directo: 35

5’-GATGAGCTCAAAGCTATGGGGGCCGATCACGTGGTC (SEQ ID NO: 202)

Entonces se aislaron los productos de PCR, se purificaron usando el kit de extracción de gel de Qiagen y se usaron como entradas para una segunda reacción de PCR con los siguientes cebadores para producir AlrAadp1 de longitud completa con una mutación CT en la posición 633:

Ncol ADP1 Alr1 directo: 40

5’-AATACCATGGCAACAACTAATGTGATTCATGCTTATGCTGCA (SEQ ID NO: 203)

Hindlll ADP1 Alr1 inverso:

5’-ATAAAAGCTTTTAAAAATCGGCTTTAAGTACAATCCGATAAC (SEQ ID NO: 204)

Se preparó el plásmido pETDuet-1-‘tesA-alrAadp1 insertando el gen alrAadp1 (locus génico-etiqueta = “ACIAD3612”), un homólogo de Acinetobacter baylyi ADP1, en los sitios de Ncol y HindIll de pETDuet-1-‘tesA.

B. Evaluación de la producción de aldehídos grasos y alcoholes grasos 5

Con el fin de evaluar el efecto de ácido carboxílico reductasas y alcohol deshidrogenasas sobre la producción de alcoholes grasos, se transformaron diversas combinaciones de los plásmidos preparados en la cepa de E. coli C41 (DE3, fadE) (descrita en el documento PCT/US08/058788).

Por ejemplo, se cotransformó el plásmido pACYCDuet-1-carA, que codifica el homólogo de CAR carA, con pETDuet-1-’tesA-alrAadp1 (véase, por ejemplo, la figura 1). 10

Se cotransformó el plásmido pACYCDuet-1-carB, que codifica el homólogo de CAR carB, con pETDuet-1-’tesA. Además, también se cotransformó por separado pACYCDuet-1-carB con pETDuet-1-’tesA-yjgB y pETDuet-1-’tesA-alrAadp1. Como control, se cotransformó pACYCDuet-1-carB con el vector vacío pETDuet-1 (véase, por ejemplo, la figura 1).

Se cotransformó el plásmido pACYCDuet-1-fadD9, que codifica el homólogo de CAR fadD9, con pETDuet-1-’tesA. 15 Además, también se cotransformó por separado pACYCDuet-1-fadD9 con pETDuet-1-’tesA-yjgB y pETDuet-1-’tesA-alrAadp1. Como control, se cotransformó pACYCDuet-1-fadD9 con el vector vacío pETDuet-1 (véase, por ejemplo, la figura 1).

Como control adicional, se cotransformó pETDuet-1-’tesA-yjgB con el vector vacío pACYCDuet-1.

Se hicieron crecer los transformantes de E. coli en 3 ml de medio LB complementado con carbenicilina (100 mg/l) y 20 cloranfenicol (34 mg/l) a 37ºC. Tras un crecimiento durante la noche, se transfirieron 15 l de cultivo a 2 ml de medio LB reciente complementado con carbenicilina y cloranfenicol. Tras 3,5 horas de crecimiento, se transfirieron 2 ml de cultivo a un frasco de 125 ml que contenía 20 ml de medio M9 con el 2% de glucosa y con carbenicilina y cloranfenicol. Cuando la DO600 del cultivo alcanzó 0,9, se añadió 1 mM de IPTG a cada frasco. Tras 20 horas de crecimiento a 37ºC, se añadieron 20 ml de acetato de etilo (con el 1% de ácido acético, v/v) a cada frasco para 25 extraer los alcoholes grasos producidos durante la fermentación. Se analizó directamente el extracto de acetato de etilo bruto con CG/EM tal como se describe en el presente documento.

Los tiempos de retención medidos fueron de 6,79 minutos para cis-5-dodecen-1-ol, 6,868 minutos para 1-dodecanol, 8,058 minutos para cis-7-tetradecen-1-ol, 8,19 minutos para 1-tetradecanol, 9,208 minutos para cis-9-hexadecen-1-ol, 9,30 minutos para 1-hexadecanol y 10,209 minutos para cis-11-octadecen-1-ol. 30

La coexpresión de tesA sin secuencia líder y de cualquiera de los tres genes car en E. coli dio como resultado altos títulos de alcoholes grasos y producción de aldehídos grasos detectable (figuras 1, 2, 5). La expresión de car A o carB con alrAadp1 y tesA sin secuencia líder dio como resultado títulos de alcoholes grasos superiores a 700 mg/l y producción de aldehídos grasos reducida. Asimismo, fadD9 coexpresado con alrAadp1 y tesA sin secuencia líder produjo más de 300 mg/l de alcoholes grasos. Cuando se expresaron sin tesA sin secuencia líder, ni car B ni fadD9 35 produjeron más de 10 mg/l de alcoholes grasos (posiblemente resultante de la acumulación de ácidos grasos libres en la célula debido a tesA endógeno). Tomados en conjunto, estos datos indican que los ácidos grasos son los sustratos para estos homólogos de CAR y que la sobreexpresión de una tioesterasa, tal como ‘tesA (para liberar ácidos grasos de acil-ACP) logra una producción de alcoholes grasos significativa.

En una fermentación, la cepa de E. coli C41 (DE3, fadE) cotransformada con pACYCDuet-1-carB+ pETDuet-1-tesA 40 produjo un promedio de 695 mg/l de alcoholes grasos y 120 mg/l de aldehídos grasos. La presencia de grandes cantidades de aldehídos grasos concuerda con que CAR es una ácido graso reductasa generadora de aldehído (AFAR). Este mecanismo es diferente de las acil graso-CoA reductasas generadoras de alcohol (FAR), representadas por JjFAR, y las acil graso-CoA reductasas, representadas por Acr1.

La producción de alcoholes grasos a partir de aldehídos grasos en las cepas de E. coli descritas anteriormente 45 puede haberse catalizado por una(s) alcohol deshidrogenasa(s) endógena(s). E. coli produce una(s) alcohol deshidrogenasa(s) (por ejemplo, yjgB) que puede(n) convertir aldehídos grasos de diversas longitudes de cadena en alcoholes grasos (Naccarato et al., Lipids 9: 419-428 (1974); Reiser et al, J. Bacteriol. 179: 2969-2975 (1997); Venkitasubramanian et al., J. Biol. Chem. 282:478-485 (2007)).

Por tanto, las alcohol deshidrogenasas también pueden desempeñar un papel en la ruta de biosíntesis de alcoholes 50 grasos además de las ácido carboxílico reductasas. Por ejemplo, la expresión de o bien yjgB o bien alrAadp1 con carB y tesA sin secuencia líder redujo significativamente la acumulación de aldehídos grasos, en comparación con cepas que no sobreexpresaban yjgB o alrAadp1 (figura 2).

Tras las fermentaciones en las que se transformó pACYCDuet-1-carB en la cepa de E. coli C41 (DE3, fadE), se observó un depósito blanco, redondo, de tipo disco, en el centro del fondo de los frascos usados para la producción de alcoholes grasos con cepas de E. coli recombinantes. En cambio, no se observaron tales depósitos en el fondo de los frascos de control que no expresaron homólogos de car. El análisis de CG/EM del depósito disuelto en acetato de etilo (con el 1% de ácido acético, v/v) reveló que el depósito era un depósito de alcohol graso. 5

C. Tipos de alcoholes grasos producidos mediante diferentes homólogos de CAR

Dependiendo del homólogo de CAR expresado en la cepa de E. coli C41 (DE3, fadE), se produjeron diferentes mezclas de alcoholes grasos. Se observaron diferentes composiciones de alcoholes grasos entre los tres homólogos de CAR evaluados (véase la tabla 10). FadD9 produjo más alcoholes grasos C12 con respecto a otros alcoholes grasos con longitudes de cadena de carbono superiores a 12. Tanto CarA y CarB produjeron un intervalo más 10 amplio en cuanto a la longitud de cadena de los alcoholes grasos que el observado cuando se expresó FadD9.

Tabla 10. Composición de acilo de alcoholes grasos producidos mediante cepas de E. coli recombinantes

Expreasdo con TesA* y AlrAadp1: Composición de acilo de alcoholes grasos (%)

C10:0: C12 C14:1 C14:0 C16:1 C16:0 C18:1

CarA: trazas 38 13 27 16 4 3

FadD9: trazas 63 14 16 7 trazas trazas

CarB: trazas 32 11 41 12 trazas trazas

* TesA sin secuencia líder. C12, incluyendo alcohol graso C12:0 y C12:1.

D. Cuantificación e identificación de alcoholes grasos

Se realizó CG-EM usando un sistema Agilent 5975B MSD equipado con una columna DB-5 de 30 m x 0,25 mm 15 (película de 0,10 m). La temperatura de la columna fue isotérmica durante 3 min a 100ºC. Se programó la columna para aumentar desde 100ºC hasta 320ºC a una velocidad de 20ºC/min. Cuando se alcanzó la temperatura final, se mantuvo la columna isotérmica durante 5 minutos a 320ºC. El volumen de inyección fue de 1 L. El gas portador, helio, se liberó a 1,3 ml/min. El espectrómetro de masas se equipó con una fuente de ionización por impacto electrónico. La temperatura de la fuente de ionización se fijó a 300ºC. 20

Antes de la cuantificación, se identificaron diversos alcoholes usando dos métodos. En primer lugar, se comparó el tiempo de retención de CG de cada compuesto con el tiempo de retención de patrones conocidos, tales como alcohol cetílico, dodecanol, tetradecanol, octadecanol y cis-9-octadecenol. En segundo lugar, se confirmó la identificación de cada compuesto haciendo coincidir el espectro de masas del compuesto con el espectro de masas de un patrón en la biblioteca de espectros de masas (por ejemplo, alcoholes C12:0, C12:1, C13:0, C14:0, C14:1, 25 C15:0. C16:0, C16:1, C17:0, C18:0 y C18:1).

EJEMPLO 4

Producción de alcoholes grasos mediante expresión heteróloga de homólogos de CAR en E. coli MG1655 (DE3. fadD)

Construcción de la cepa de deleción de fadD 30

Se delecionó el gen fadD de E. coli MG1655 usando el sistema de lambda red (Datsenko et al, 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97: 6640-6645) tal como sigue: Se amplificó el gen de cloranfenicol acetiltransferasa de pKD3 con los cebadores fad1 (5-TAACCGGCGTCTGACGACTGACTTAACGCTCAGGCTTTATTGTCCACT TTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3) (SEQ ID NO: 205) y fad2 (5-CATTTGGGGTTGCGATGACGACGAACACGCATTTTAGAGGTGAAGAATTGCATATGAATATCCTCCTTTAGTTCC-35 3) (SEQ ID NO: 206). Se sometió el producto de PCR a electroporación en E. coli MG1655 (pKD46). Se sembraron en placa las células sobre L-cloramfenicol (30 g/ml)(L-Cm) y se hicieron crecer durante la noche a 37ºC. Se llevaron colonias individuales a otra placa de L-Cm y se hicieron crecer a 42ºC. Entonces se sembraron en zonas estas colonias en placas de L-Cm y L-carbenicilina (100 mg/ml) (L-Cb) y se hicieron crecer a 37ºC durante la noche. Se evaluaron adicionalmente las colonias que eran CmR y Cbs mediante PCR para garantizar que el producto de 40 PCR se insertó en el sitio correcto. Se realizó la verificación por PCR en lisados de colonias de estas bacterias usando los cebadores fadF (5-CGTCCGTGGTAATCATTTGG-3) (SEQ ID NO: 207) y fadR (5-TCGCAACCTTTTCGTTGG-3) (SEQ ID NO:208). El tamaño esperado de la deleción de fadDv.Cm fue de aproximadamente 1200 pb (figura 4). Se eliminó el gen de resistencia a cloramfenicol usando un plásmido FLP cooperador tal como se describe en Datsenko et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6640-6645 (2000). Se realizó la 45 verificación por PCR de la deleción con los cebadores fadF y fadR (figura 4). No pudo hacerse crecer la cepa MG 1655 fadD en placas de agar M9 + oleato (oleato como fuente de carbono). Tampoco pudo hacerse crecer en medios líquidos M9 + oleato. El defecto de crecimiento se complementó mediante un gen fadD de E. coli suministrado en trans (en pCL1920-Ptrc).

Construcción de la cepa MG1655(DE3, fadD)

Para generar una cepa que respondiera a T7, se utilizó el kit de lisogenización DE3 (Novagen), que está diseñado para la integración específica de sitio del profago DE3 en un cromosoma huésped de E. coli, de manera que pueda usarse el huésped lisogenizado para expresar genes diana clonados en vectores de expresión de T7. DE3 es un fago recombinante que porta el gen clonado para la ARN polimerasa de T7 bajo el control de lacUV5. Brevemente, 5 se cultivó la cepa huésped en medio LB complementado con maltosa al 0,2%, MgSO4 10 mM y antibióticos a 37ºC hasta una DO600 de 0,5. A continuación, se incubaron 108 ufp de DE3, 108 ufp del fago cooperador y 108 ufp del fago de selección con 10 l de células huésped. Se incubó la mezcla de huésped/fago a 37ºC durante 20 min para permitir que el fago se adsorbiera al huésped. Finalmente, se pipeteó la mezcla a una placa con LB complementado con antibióticos. Se extendió la mezcla de manera uniforme usando perlas de siembra en placa y se invirtieron las 10 placas y se incubaron a 37ºC durante la noche.

Se evaluaron candidatos del lisogén DE3 mediante su capacidad para soportar el crecimiento del fago de prueba T7. El fago de prueba T7 es un mutante de deleción del fago T7 que es completamente defectuoso a menos que se proporcione ARN polimerasa de T7 activa por parte de la célula huésped. El fago de prueba T7 crea placas de lisis muy grandes con lisogenes DE3 auténticos en presencia de IPTG, mientras que se observan placas de lisis mucho 15 más pequeñas en ausencia de inductor. El tamaño relativo de las placas de lisis en ausencia de IPTG es una indicación de la expresión del nivel basal de ARN polimerasa de T7 en el lisogén, y puede variar ampliamente entre diferentes contextos de células huésped.

Se usó el siguiente procedimiento para determinar la presencia de lisogenia de DE3. En primer lugar, se hicieron crecer colonias candidatas en LB complementado con maltosa al 0,2%, MgSO4 10 mM y antibióticos a 37ºC hasta 20 una DO600 de 0,5. Entonces se diluyó una alícuota del fago de prueba T7 en tampón de dilución de fago 1X hasta un título de 2 x 103 ufp/ml. En tubos por duplicado, se mezclaron 100 L de células huésped con 100 L de fago diluido. Se incubó la mezcla de huésped/fago a temperatura ambiente durante 10 min para permitir que el fago se adsorbiera al huésped. A continuación, se añadieron 3 ml de agarosa superior fundida a cada tubo que contenía huésped y fago. Se sembró el contenido de un duplicado sobre una placa de LB y el otro duplicado sobre una placa 25 de LB complementado con IPTG 0,4 mM (isopropil-b-tiogalactopiranósido) para evaluar la inducción de ARN polimerasa de T7. Se dejaron reposar las palcas sin alterarlas durante 5 min hasta que la agarosa superior se endureció. Entonces se invirtieron las placas a 30ºC durante la noche.

Construcción de la cepa MG1655(DE3, fadD, yjgB::kan)

Se construyó la cepa con desactivación de yjgB, MG1655(DE3, fadD, yjgB::kan) usando el siguiente sistema de 30 lambda red (Datsenko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6640-6645 (2000)):

Se amplificó el gen resistente a kanamicina de pKD 13 con los cebadores yjgBRn (5’-GCGCCTCAGATCAGCGCTGCGAATGATTTTCAAAAATCGGCTTTCAACACTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3’) (SEQ ID NO: 209), y yjgBFn (5’-CTGCCATGCTCTACACTTCCCAAACAACACCAGAGAAGGACCAAAAAATGATTCCGGGGATCCGTCGACC-3’) 35 (SEQ ID NO: 210). Entonces se sometió el producto de PCR a electroporación en E. coli MG1655 (DE3, fadD)/pKD46. Se sembraron las células en placas sobre kanamicina (50 g/ml) (L-Kan) y se hicieron crecer durante la noche a 37ºC. Se llevaron colonias individuales a otra placa de L-Kan y se hicieron crecer a 42ºC. Entonces se sembraron en zonas estas colonias en placas de L-Kan y carbenicilina (100 mg/ml) (L-Cb) y se hicieron crecer a 37ºC durante la noche. Se evaluaron adicionalmente las colonias que eran kanR y Cbs mediante PCR para garantizar 40 que el producto de PCR se insertó en el sitio correcto. Se realizó la verificación por PCR en lisados de colonias de estas bacterias usando los cebadores BF (5’-gtgctggcgataCGACAAAACA-3’) (SEQ ID NO: 211) y BR (5’-CCCCGCCCTGCCATGCTCTACAC-3’) (SEQ ID NO: 212). El tamaño esperado de la desactivación de yjgB::kan fue de aproximadamente 1450 pb.

Evaluación de FadD sobre la producción de alcoholes grasos usando la cepa MG 1655 (DE3, fadD) 45

En el ejemplo 3, se usó una cepa con deleción de fadE para la producción de aldehídos grasos y alcoholes grasos a partir de ‘TesA, homólogos de CAR y alcohol deshidrogenasa(s) endógena(s) en E. coli. Para demostrar que los homólogos de CAR usaban ácidos grasos en vez de acil-CoA como sustrato, se delecionó el gen que codificaba para acil-CoA sintasa en E. coli (fadD) de modo que los ácidos grasos producidos no se activaban con CoA. Se transformó la cepa de E. coli MG1655(DE3, fadD) con pETDuet-l-‘tesA y pACYCDuet-1-carB . Se evaluaron los 50 transformantes para determinar la producción de alcoholes grasos usando los métodos descritos en el presente documento. Estos transformantes produjeron aproximadamente 360 mg/l de alcoholes grasos (dodecanol, dodecenol, tetredecanol, tetredecenol, cetilo, hexadecenol y octadecenol).

YjgB es una alcohol deshidrogenasa

Para confirmar que YjgB era una alcohol deshidrogenasa responsable de convertir aldehídos grasos en sus 55 alcoholes grasos correspondientes, se cotransformaron pETDuet-l-‘tesA y pACYCDuet-l-fadD9 o bien en MG1655(DE3, fadD) o bien en MG1655(DE3, fadD, yjgB::kan). Al mismo tiempo, se transformó MG1655(DE3,

fadD, yjgB::kan) tanto con pETDuet-l-‘tesA-yjgB como con pACYCDuet-l-fadD9.

Se hicieron crecer los transformantes de E. coli en 3 ml de medio LB complementado con carbenicilina (100 mg/l) y cloranfenicol (34 mg/l) a 37ºC. Tras un crecimiento durante la noche, se transfirieron 15 L de cultivo a 2 ml de medio LB reciente complementado con carbenicilina y cloranfenicol. Tras 3,5 h de crecimiento, se transfirieron 2 ml de cultivo a un frasco de 125 ml que contenía 20 ml de medio M9 con glucosa al 2%, carbenicilina y cloranfenicol. 5 Cuando la DO60O del cultivo alcanzó 0,9, se añadió 1 mM de IPTG a cada frasco. Tras 20 h de crecimiento a 37ºC, se añadieron 20 ml de acetato de etilo (con el 1% de ácido acético, v/v) a cada frasco para extraer los alcoholes grasos producidos durante la fermentación. Se analizó directamente el extracto de acetato de etilo bruto con CG/EM tal como se describe en el presente documento.

La cepa con desactivación de yjgB dio como resultado una acumulación significativa de dodecanal y un título de 10 alcoholes grasos inferior (figura 5). La expresión de yjgB de plásmido pETDuet-l-‘tesA-yjgB en la cepa con desactivación de yjgB eliminó eficazmente la acumulación de dodecanal (figura 5). Los datos muestran que YjgB estaba implicada en convertir dodecanal en dodecanol y que puede haber otra(s) alcohol deshidrogenasa(s) presente(s) en E. coli para convertir otros aldehídos en alcoholes. Se acumuló dodecanal en la cepa con desactivación de yjgB, pero no se observó ni en la cepa silvestre (MG 1655 (DE3, fadD)) o la cepa con 15 desactivación de yjgB con el plásmido de expresión de yjgB. Las flechas (en la figura 5) indican el perfil de CG de dodecanal (aldehído C12:0).

EJEMPLO 5

Producción de alcoholes grasos saturados en E. coli

Los alcoholes grasos para usos comerciales están saturados. Sin embargo, E. coli tiene normalmente una cierta 20 cantidad (aproximadamente el 20-25%) de ácidos grasos insaturados en su membrana para mantener fluidez. Se diseñó por ingeniería genética una cepa de E. coli que podía producir exclusivamente ácidos grasos saturados en un medio no complementado con ácido graso insaturado o ácido ciclopropano-graso y podía producir alcoholes grasos saturados.

Dos enzimas, una deshidratasa/isomerasa y una cetoacilsintasa I (KASI), codificadas por fabA y fabB, 25 respectivamente, están implicadas en la biosíntesis de ácidos grasos insaturados. Habitualmente, una cepa de E. coli que carece o bien de FabA o bien de FabB no sobrevive sin complementación de ácidos grasos insaturados, tales como oleato. Para superar esto, se desactivó el gen fabB de una cepa huésped de E. coli, y la cepa podía crecer sin complementación de ácidos grasos insaturados diseñando por ingeniería genética las células para expresar un gen de desaturasa recombinante (AF037430, que codifica DesA) a partir de Bacillus subtilis. Aunque la 30 primera generación de la cepa que expresa desA requirió oleato para un crecimiento normal, la siembra en placa posterior de la cepa sobre placas de L-Agar varias veces dio como resultado que la cepa no requirió oleato para el crecimiento.

Materials

Se obtuvieron células E. coli JWC280 (descritas en Campbell et al., MoI. Microbiol. 47:793-805 (2003)) y células E. 35 coli GRT23 (descritas en Morgan-Kiss et al., Arch. Microbiol. 190:427-437 (2008)) de John Cronan.

Construcción de plásmido

Se amplificó el gen desA (también denominado 5des) con cebadores delta5Fn y delta5Rn (enumerados en la tabla 11) a partir del ADN genómico de Bacillus subtilis, cepa 168 y se digirió con AvrII y EcoRl. Entonces se clonó el gen desA en pET-21(a), que se había linealizado con Avrll-EcoRl, para producir pET-21a-5. Entonces se retiró el gen 40 desA como un fragmento de Ndel-EcoRl de pET-21a-5 y se insertó entre los sitios de Ndel y EcoRl de OP 180, un plásmido derivado de pACYC que lleva un promotor de trc. El plásmido resultante se denominó pACYC-5.

Se clonó un casete génico desA_kan entre los sitios de AvrIl-BamHl de CDFDuet-1. Se produjo un casete génico kan mediante digestión con EcoRl y BamHl de un producto de PCR que se amplificó con cebadores kanF y kanR (véase la tabla 11) de pKD13 como molde (se obtuvo pKD13 de The CoIi Genetic Stock Center, Yale University, y se 45 describe en Datsenko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6640-6645 (2000)). Se digirió el gen desA amplificado (descrito anteriormente) con AvrII y EcoRI. Entonces se insertaron el fragmento de AvrII-EcoRI del gen desA y el fragmento de EcoRI-BamHI del gen kan entre los sitios de Avrll-BamHI de pCDFDuet-1 (de EMD Chemicals, Gibbstown, NJ) para producir un plásmido que se denominó pCDFDuet-l-5-kan.

Se construyó un plásmido p84.17fabB5kan para sustituir a fabB con el casete desA_kan mediante varis etapas de 50 subclonación. En primer lugar, se amplificó un fragmento de ADN (L-fabB) que flanqueaba la región en el sentido de 5’ de fabB con cebadores fabBLF y fabBLR (véase la tabla 11), y se amplificó un fragmento de ADN (R-fabB) que flanqueaba la región en el sentido de 3’ de fabB con cebadores fabBRF y fabBRR (véase la tabla 11) del ADN genómico de E. coli MG 1655. En segundo lugar, se digirió L-fabB con XbaI y BgIII, y se digirió R-fabB con Notl y BgIII. Se purificaron los fragmentos de L-fabB y R-fabB digeridos a partir de gel de agarosa y se ligaron con pKOV 55

linealizado con Xbal-Notl. El plásmido resultante se denominó pHZl.186. A continuación, se retiró el casete génico desA_kan de pCDFDuet-l-5-kan como un fragmento de Avrll-BamHI y se insertó entre los sitios de AvrII y BgIII de pHZ1.186, dando como resultado que el casete génico desA_kan estaba intercalado entre L-fabB y R-fabB. Finalmente, se amplificó el fragmento de L-fabB-desA_kan-R-fabB con fabBLF y fabBRR (véase la tabla 11) de pHZl.186 y se clonó en los dos sitios de PvuII de pMOD-4-MCS (Epicentre Biotechnologies, Madison, WI). El 5 plásmido final se denominó p84.17fabB.

Se amplificó el ADN que abarcaba desde aproximadamente 1 kb en el sentido de 5’ hasta aproximadamente 1 kb en el sentido de 3’ de fabB::cm a partir del genoma de células GRT23 usando los cebadores fabBup y fabBdowm (véase la tabla 11). Entonces se digirió el fragmento de ADN amplificado con PvuII y se insertó entre los dos sitios de PvuII de pMOD-4-MCS. El plásmido resultante se denominó p84.15. 10

Se clonaron los genes que codifican una tioesterasa (‘TesA) y una ácido graso reductasa (CarB) como un operón, y se colocó el operón bajo el promotor de trc y el vector pCL1920. El plásmido final se denominó pCL-Ptrc-carB_’tesA (la secuencia se enumera en la figura 17 como SEQ ID NO: 213).

Tabla 11: Secuencias de cebador

ID de cebador: Secuencia

delta5Fn

delta5Rn

kanF

kanR

fabBLF

fabBLR

fabBRF

fabBRR

fabBup

fabBdown

Construcción de cepa 15

Se construyó una cepa de E. coli MG1655 (fadEfhuAfabB::cm)/pACYC-5 transformando p84.15fabB en MG1655 (fadEfhuA)/pACYC-5. Se transformó el plásmido p84.17fabB en MG1655 (fadEfhuAfabB::cm)/pACYC-5 para producir MG1655 (fadEfhuAfabB::desA_kan)/pACYC-5. Tras cada transformación, se sembró la mezcla transformante sobre placas de L-agar complementado con IPTG 1 mM y antibióticos apropiados (17 mg/l de cloranfenicol o 50 mg/l de kanamicina). 20

MG1655 (fadEfhuAfabB::desA_kan)/pACYC-5 creció normalmente en caldo L complementado con oleato (sal de potasio, 50 mg/l). Se sembraron las células sobre placas de L-agar complementado con 50 mg/l de oleato y se incubaron a 37ºC durante 2 días. Entonces se sembraron en zonas colonias sobre placas de L-agar complementado con 50 mg/l de oleato y 100 mg/l de carbenicilina. Una de las colonias, que perdió resistencia a la carbenicilina pero conservó resistencia a la kanamicina, se cultivó en línea sobre una placa de L-agar complementado con 50 mg/l de 25 kanamicina, pero sin oleato. Se seleccionó una de las colonias de la placa y se denominó ALC119A.

ALC119 A con una ruta de alcohol graso produjo alcohol graso saturado casi exclusivo

Se transformó el plásmido pCL-Ptrc-carB_’tesA en la cepa ACL 119A. Se hicieron crecer tres transformantes de

ALC119A/pCL-Ptrc-carB_’tesA en 3 ml de caldo L con 100 mg/l de espectinomicina en un agitador a 37ºC durante la noche. Se transfirieron 15 L del cultivo durante la noche a 2 ml de caldo L reciente con 100 mg/l de espectinomicina y 2 L de oleato de potasio al 70%. Se colocó la inoculación reciente en un agitador a 37ºC durante aproximadamente 3 h. Entonces se transfirió el cultivo de 2 ml a 20 ml de medio V9 (medio Hu-9 sin cloruro férrico) en un frasco con deflectores de 125 ml. Cuando la DO600 del cultivo alcanzó aproximadamente 0,9, se añadieron 5 1 mM de IPTG a cada frasco. Tras 20 h de crecimiento a 37ºC, se añadieron 20 ml de acetato de etilo (con el 1% de ácido acético, v/v) a cada frasco para extraer los alcoholes grasos producidos durante la fermentación. Se analizó directamente el extracto de acetato de etilo bruto con CG/EM tal como se describe en el documento WO 2008/119082. Se usó alcohol cetílico como referencia para la cuantificación de alcohol graso.

Tal como se muestra en la figura 13, la cepa ALC119A/pCL-Ptrc-carB_’tesA produjo casi exclusivamente alcoholes 10 grasos saturados, incluyendo dodecanol, tetradecanol y hexadecanol.

EJEMPLO 6

Producción de alcoholes grasos en la cianobacteria Synechococcus sp. PCC7002

Este ejemplo describe el uso de bacterias fotoautotróficas para producir alcoholes grasos a partir de dióxido de carbono (en lugar de glucosa) usando la ruta de carB-‘tesA-yahK. En primer lugar, se construye un vector para la 15 recombinación homóloga en el plásmido pAQl de Synechococcus sp. PCC7002 (registro de Genbank NC 0050525) usando regiones homólogas de 500 pb correspondientes a las posiciones 3301-3800 y 3801-4300 de pAQl. Como marcador seleccionable, se añade un casete de resistencia a la espectinomicina que contiene aminoglicósido 3’-adenililtransferasa, aad, promotor, gen y terminador (del plásmido pCL1920) entre las regiones homólogas. Para la expresión génica, se añade el promotor y sitio de unión al ribosoma de aminoglicósido fosfotransferasa, aph (del 20 plásmido pACYC177), seguido por los sitios de clonación únicos de Ndel y EcoRI para la inserción de un gen heterólogo u operón. Este casete de integración completo se construye mediante síntesis génica y se clona en pUC19 para el mantenimiento y suministro. El plásmido resultante, pLS9-7002, permite (i) la clonación y expresión de un gen foráneo, y (ii) el suministro y la integración in vivo estable en el plásmido pAQl de Synechococcus sp. PCC7002. 25

La ruta de alcohol graso para la expresión en Synechococcus sp. PCC7002 se construye de la siguiente manera. Se extiende el operón carB-‘tesA de pCL-Ptrc-carB-’tesA (descrito en el ejemplo 4) añadiendo yahK en el sentido de 3’ de ‘tesA y después clonando en los sitios de Ndel y EcoRI de pLS9-7002 en el sentido de 3’ del promotor de aph y el sitio de unión al ribosoma. Se transforma el plásmido resultante en Synechococcus sp. PCC7002 tal como se describe por Stevens et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77:6052-6056 (1980)). Se seleccionan integrantes estables 30 en medio ATCC 1047 complementado con espectinomicina 15 g/ml. 1 L de medio ATCC 1047 contiene 40 mg de MgSO4 x 7 H2O, 20 mg de CaCl2 x 2 H2O, 750 mg de NaNO3, 2 mg de K2HPO4, 3,0 mg de ácido cítrico, 3,0 mg de citrato de amonio férrico, 0,5 mg de EDTA, 20 mg de Na2CO3, 2,86 mg de H3BO3, 1,81 mg de MnCl2, 0,22 mg de ZnSO4, 0,04 mg de Na2MoO4, 0,08 mg de CuSO4, 0,05 mg de Co(NO3)2, 0,02 mg de vitamina B12, 10 g de agar y 750 ml de agua de mar. 35

Vuelven a cultivarse en línea las colonias resistentes a espectinomicina varias veces sobre medio ATCC 1047 con espectinomicina y se someten a prueba para determinar la integración isogénica del operón carB-‘tesA-yahK mediante PCR con cebadores pAQl-U (atgtctgacaaggggtttgacccct) (SEQ ID NO: 224) y pAQl-D (gcacatccttatccaattgctctag) (SEQ ID NO: 225). Entonces se hacen crecer los integrantes de carB-‘tesA-yahK isogénicos completos en 50 ml de medio ATCC 1047 líquido con espectinomicina en frascos de agitación de 500 ml 40 con aireación e iluminación apropiadas a 30ºC durante de cinco a siete días. Se extraen alícuotas de cultivo en diversos puntos de tiempo con un volumen igual de acetato de etilo y se analizan los extractos para determinar la producción de alcoholes grasos tal como se describe en el ejemplo 3. Se producen alcoholes grasos.

EJEMPLO 7

Producción de alcoholes grasos en la cianobacteria Synechococcus elongatus PCC7942 45

Este ejemplo describe un segundo método de uso de bacterias fotoautotróficas para producir alcoholes grasos a partir de dióxido de carbono (en lugar de glucosa) usando la ruta de carB-‘tesA-yahK. En primer lugar, se construye un vector para la recombinación homóloga en el genoma de Synechococcus elongatus PCC7942 (registro de Genbank CP_000100) usando regiones homólogas de 800 pb correspondientes a las posiciones 2577844-2578659 y 2578660-2579467 de CP_000100. Se sabe que esta ubicación cromosómica es el sitio neutro uno (NSl) (Mackey 50 et al., MetH. MoI. Biol. 362:115-129 (2007)). Como marcador seleccionable, se añade un casete de resistencia a la espectinomicina que contiene el aminoglicósido 3’-adenililtransferasa, aad, promotor, gen y terminador (del plásmido pCL1920), entre las regiones homólogas. Adicionalmente, se añaden los sitios de clonación únicos de Ndel y EcoRl para la inserción de un gen heterólogo u operón. Este casete de integración se construye mediante síntesis génica y se clona en pUC19 para el mantenimiento y el suministro. El plásmido resultante, pLS9-7942_NSl, permite (i) la 55 clonación y la expresión de un gen foráneo y (ii) el suministro y la integración in vivo estable en el genoma de Synechococcus elongatus PCC7942.

Se clona el operón de carB-‘tesA-yahK completo (descrito en el ejemplo 6), incluyendo su promotor de ptrc y sitio de unión al ribosoma, en el sitio de Ndel o EcoRl de pLS9-7942_NSl. Se transforma el plásmido resultante en S. elongatus PCC7942 tal como se describe por Mackey et al., Meth. MoI. Biol. 362:115-129 (2007). Se seleccionan integrantes estables en medio BG-11 complementado con espectinomicina 4 g/ml. 1 L de medio BG-11 contiene 75 mg de MgSO4 x 7 H2O, 36 mg de CaCl2 x 2 H2O, 1,5 g de NaNO3, 40 mg de K2HPO4, 6,0 mg de ácido cítrico, 6,0 mg 5 de citrato de amonio férrico, 1,0 mg de EDTA, 20 mg de Na2CO3, 2,86 mg de H3BO3, 1,81 mg de MnCl2, 0,22 mg de ZnSO4, 0,04 mg de Na2MoO4, 0,08 mg de CuSO4, 0,05 mg de Co(NO3)2 y 10 g de agar. Vuelven a cultivarse en línea las colonias resistentes a espectinomicina varias veces sobre medio BG-11 con espectinomicina y se someten a prueba para determinar la integración isogénica del operón carB-‘tesA-yahK mediante PCR con cebadores NSl-U (gatcaaacaggtgcagcagcaactt) (SEQ ID NO: 226) y NSl-D (attcttgacaagcgatcgcggtcac) (SEQ ID NO: 227). Entonces 10 se hacen crecer los integrantes de carB-‘tesA-yahK isogénicos completos en 50 ml de medio BG-11 líquido con espectinomicina en frascos de agitación de 500 ml con aireación e iluminación apropiadas a 30ºC durante hasta siete días. Se extraen alícuotas de cultivo en diversos puntos de tiempo con un volumen igual de acetato de etilo y se analizan los extractos para determinar la producción de alcoholes grasos tal como se describe en el ejemplo 3. Se producen alcoholes grasos. 15

EJEMPLO 8

Producción de alcoholes grasos independiente de malonil-CoA en E. coli

Determinados protistas tales como Euglena gracilis pueden realizar la biosíntesis de ácidos grasos independiente de malonil-CoA. La maquinaria biosintética para esta ruta se encuentra ubicada en las mitocondrias y se piensa que invierte el sentido de -oxidación usando acetil-CoA como sustratos de cebado así como de elongación para 20 producir ácidos grasos de C8 a C18 (Inui et al., Eur. J. Biochem. 142:121-126 (1984)). Las enzimas implicadas son trans-2-enoil-CoA reductasas (TER), que catalizan la reducción irreversible de trans-2-enoil-CoA para dar acil-CoA y de ese modo impulsan la ruta, de otro modo reversible, en el sentido reductor (mientras que lo contrario es cierto para la -oxidación, en la que la acil-CoA deshidrogenasa irreversible, FadE, impulsa la reacción en el sentido oxidante). Se conoce un gen de TER de E. gracilis así como otros homólogos eucariotas y procariotas (Hoffmeister 25 et al., J. Biol. Chem. 280:4329-4338 (2005); Tucci et al., FEBS Lett. 581:1561 - 1566 (2007)). Se ha mostrado in vitro que la única enzima de TER conocida de E. gracilis reduce trans-2-butenoil-CoA (C4) y trans-2-hexenoil-CoA (C6) para dar las respectivas acil-CoA (no se han sometido a prueba trans-2-enoil-CoA de cadena más larga). Actualmente, se sabe muy poco sobre las otras enzimas de la ruta en E. gracilis.

Puede diseñarse por ingeniería genética una ruta que crea un flujo exclusivamente desde precursores de acetil-CoA 30 hacia acil-CoA (como en las mitocondrias de Euglena gracilis) en E. coli usando diferentes conjuntos de enzimas con las cuatro actividades enzimáticas siguientes: (i) tiolasa condensadora, no descarboxilante, (ii) 3-cetoacil-CoA reductasa (o 3-hidroxiacil-CoA deshidrogenasa), (iii) 3-hidroxiacil-CoA hidratasa (o enoil-CoA deshidratasa) y (iv) trans-2-enoil-CoA reductasa. Las cuatro enzimas pueden tener especificidad de longitudes de cadena suficientemente relajada como para permitir la síntesis de acil-CoA con una longitud de cadena mayor, por ejemplo, 35 C12 o C14.

Se construye un plásmido que codifica las cuatro actividades de la siguiente manera. Se construye un operón sintético de fadA (YP_026272) (mostrado en la figura 17 como SEQ ID NO:229) (tiolasa no descarboxilante) y fadB de E. coli (NP_418288) (mostrado en la figura 17 como SEQ ID NO: 231) (3-hidroxiacil-CoA deshidrogenasa y enoil-CoA deshidratasa) y ter de E. gracilis (Q5EU90) (mostrado en la figura 17 como SEQ ID NO: 228) (trans-2-enoil-CoA 40 reductasa, optimizado para codones sin su secuencia en 5’ que codifica un péptido transitorio) y se clona en el sentido de 3’ de un promotor de ptrc en un plásmido pACYC con un gen de resistencia a carbenicilina o cloranfenicol. Alternativamente, en vez de los genes fadA y fadB de E. coli, se usan los genes fadl (NP_416844) (mostrado en la figura 17 como SEQ ID NO: 223) y fadJ (NP_416843) (mostrado en la figura 17 como SEQ ID NO: 235) de E. coli (o los ortólogos correspondientes de otros organismos). Como alternativa al gen ter de E. gracilis, se 45 usan los ortólogos correspondientes de otros organismos o el gen fabl (NP_415804) (mostrado en la figura 17 como SEQ ID NO: 237) de E. coli. Aunque Fabl normalmente reduce trans-2-enoil-ACP, también es activo con trans-2-enoil-CoA (Bergler et al., J. Biol. Chem. 269:5493-5496 (1993)).

Se cotransforma el plásmido pACYC-ptrc_fadAB-ter o el plásmido pACYC-ptrc_fadAB-fabl con el plásmido pCL-ptrc_carB-‘tesA (descrito en el ejemplo 4) en una cepa de E. coli fadE. Se cultivan estas cepas, se extraen y se 50 analizan para determinar la producción de alcoholes grasos tal como se describe en el ejemplo 3. Las dos cepas diferentes producen alcoholes grasos con diferente distribución de longitud de cadena.

Dado que estas cepas expresan ‘TesA, una parte de los alcoholes grasos producidos se derivan de precursores de acil-ACP dependientes de malonil-CoA. ‘TesA hidroliza eficazmente acil-ACP cuando se sobreexpresan en E. coli, aunque tiene una actividad específica superior para acil-CoA en comparación con acil-ACP. Para aumentar la 55 proporción o producir exclusivamente alcoholes grasos derivados de la ruta independiente de malonil-CoA, se usan tioesterasas alternativas que tienen actividad hidrolítica inferior frente a acil-ACP en lugar de ‘TesA. Un ejemplo es TesB de E. coli (NP_414986), que prefiere acil-CoAs con respecto a acil-ACP (Spencer et al., J. Biol. Chem. 253:5922-5926 (1978)) y cuando se sobreexpresa en E. coli no hidroliza acil-ACP (Zheng et al., App. Environ. Microbiol. 70:3807-3813 (2004)). En métodos alternativos, se usan ortólogos de TesA y TesB o tioesterasas de otras 60

familias de proteínas que hidrolizan acil-CoA con alta eficacia al tiempo que hidrolizan acil-ACP con baja eficacia.

En un método, se construye un plásmido pCL-ptrc_carB-‘tesB tal como se describe en el ejemplo 4 sustituyendo el gen ‘tesA por el gen tesB (NP_414986) (mostrado en la figura 17 como SEQ ID NO: 239). Se cotransforma el plásmido con el plásmido pACYC-ptrc_fadAB-ter o el plásmido pACYC-ptrc_fadAB_fabI en una cepa de E. coli fadE. Se cultivan estas cepas, se extraen y se analizan para determinar la producción de alcoholes grasos tal como 5 se describe en el ejemplo 3.

En otro método, se sustituye el plásmido pCL-ptrc_carB-‘tesA por un plásmido pCL-ptrc_acr1, que expresa la acil-CoA reductasa Acr1 de Acinetobacter baylyi ADPl (YP_047869) (mostrado en la figura 17 como SEQ ID NO: 241). Esta reductasa reduce específicamente acil-CoA pero no acil-ACP para dar los alcoholes grasos correspondientes (Reiser et al., J. Bacteriol. 179:2969-2975 (1997)). Se cotransforma el plásmido con el plásmido pACYC-ptrc_fadAB-10 ter o el plásmido pACYC-ptrc_fadAB-fabI en una cepa de E. coli fadE. Se cultivan estas cepas, se extraen y se analizan para determinar la producción de alcoholes grasos tal como se describe en el ejemplo 3. Las cepas producen alcoholes grasos de manera independiente de malonil-CoA.

EJEMPLO 9

Identificación de hierro como inhibidor de la producción de alcoholes grasos 15

El medio Hu9 es un medio de fermentación conocido, que contiene Na2HPO4 6 g/L, KH2PO4 3 g/L, NaCl 0,5 g/L, NH4Cl 1 g/L, CaCl2 0,1 mM, MgSO4 1 mM, agar 15 g/L, glucosa 10 mM, uracilo 50 mg/l, y minerales traza que contienen FeCl3 100 M, ZnCl2 500 M, Na2Mo4 200 M, CuSO4 200 M, H3BO3 200 M. Sin embargo, se observó que la producción de alcoholes grasos se reducía completamente cuando se hicieron crecer cepas de E. coli recombinantes, que podían por lo demás producir alcoholes grasos, en medio Hu9. Tal como se describe en detalle 20 a continuación, se midió la incapacidad de cepas de E. coli para producir alcoholes grasos en diversos medios Hu9 incompletos, y se encontró que las bacterias recombinantes no podían producir alcoholes grasos cuando estaba presente hierro en el medio. Sin embargo, la adición de hierro no inhibió el crecimiento de las bacterias.

Con el fin de identificar el/los componente(s) implicado(s) en la inhibición de la producción de alcoholes grasos, se prepararon diferentes versiones de medio Hu9 incompleto, algunos de los cuales carecían de un componente 25 dispensable, y después se evaluó la producción de alcoholes grasos.

En la primera etapa se prepararon los siguientes medios: medio Hu9 completo, medio Hu9 incompleto que carecía de uracilo y medio Hu9 incompleto que carecía de elementos traza. Se cultivaron células K6 (una cepa bacteriana recombinante C41 (DE3, fadE) que lleva pACYCDuet-1-carB, que codifica el homólogo de CAR carB y pETDuet-l-’tesA) en 2 ml de LB que contenía antibióticos apropiados. Tras alcanzar una DO de 1,0, se ampliaron a escala los 30 cultivos de 2 ml en frascos de agitación de 125 ml (que contenían uno de los medios Hu9 descritos anteriormente) hasta un volumen 22 ml. Se indujeron los cultivos añadiendo IPTG hasta una concentración final de 1 mM. Tras hacerlos crecer durante 20 h a 37ºC, se añadieron 22 ml de acetato de etilo (con el 1% de ácido acético, v/v) a cada frasco para extraer los alcoholes grasos producidos durante la fermentación. Se analizó directamente el extracto de acetato de etilo bruto con CG/EM y se cuantificaron los títulos de alcoholes grasos totales. 35

Tal como se representa en la figura 14 A, se inhibió la producción de alcoholes grasos en gran medida mediante la adición de elementos traza en comparación con la adición de uracilo al medio Hu9 incompleto. Esto indicó que el/los componente(s) inhibidor(es) eran una parte de la disolución de minerales traza.

Con el fin de hallar qué elemento traza era responsable de la inhibición de la producción de alcoholes grasos, se prepararon los siguientes medios Hu9: medio Hu9 completo; Hu9 que carecía de FeCl3; Hu9 que carecía de ZnCl2; 40 Hu9 que carecía de Na2Mo4; Hu9 que carecía de CuSO4; y Hu9 que carecía de H3BO3. Se evaluó la producción de alcoholes grasos de células K6 que se hicieron crecer en estos medios Hu9 diferentes usando el método descrito anteriormente.

Tal como se muestra en la figura 14B, la producción de alcoholes grasos se inhibió principalmente mediante la adición de hierro al medio. Por tanto, eliminando o reduciendo la presencia de hierro (por ejemplo, citrato férrico, 45 cloruro férrico o sulfato ferroso) en el medio de cultivo, pueden producirse alcoholes grasos.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Método de producción de un alcohol graso, comprendiendo el método:

cultivar una célula huésped modificada por ingeniería genética para comprender secuencias de polinucleótido que codifican polipéptidos individuales que tienen (a) actividad ácido carboxílico reductasa y al menos el 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; y (b) 5 actividad tioesterasa, en el que se produce un alcohol graso a un rendimiento de desde al menos 25 mg/l por la célula huésped modificada por ingeniería genética cuando se cultiva en medio que contiene una fuente de carbono.
2. Método según la reivindicación 1, que comprende además una secuencia de polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad alcohol deshidrogenasa. 10
3. Método según la reivindicación 2, en el que la alcohol deshidrogenasa comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 94.
4. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la célula huésped se modifica por ingeniería genética para expresar un nivel atenuado de una enzima de degradación de ácidos grasos en 15 relación con una célula huésped silvestre.
5. Método según la reivindicación 4, en el que la enzima de degradación de ácidos grasos tiene actividad acil-CoA sintasa.
6. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que una o más de dichas secuencias de polinucleótido 20

a) son secuencias de plásmido; o

b) están integradas en el genoma de dicho microorganismo modificado por ingeniería genética.
7. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el alcohol graso comprende un alcohol graso C6-C26.
8. Método según la reivindicación 7, en el que el alcohol graso es un alcohol graso C6, C8, C10, C12, C13, C14, 25 C15, C16, C17 o C18.
9. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende además cultivar la célula huésped en presencia de al menos un sustrato biológico para el polipéptido.
10. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el polipéptido comprende el aminoácido de SEQ ID NO: 22. 30
11. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende además aislar el alcohol graso del entorno extracelular del cultivo de células huésped.
12. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que dicho alcohol graso se produce por medio de una ruta independiente de malonil-CoA.
13. Método para preparar un tensioactivo, que comprende el procedimiento según la reivindicación 1. 35