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ES2550060T3 - Proteínas de CTLA4 y sus usos - Google Patents

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ES2550060T3
ES2550060T3 ES11730113.5T ES11730113T ES2550060T3 ES 2550060 T3 ES2550060 T3 ES 2550060T3 ES 11730113 T ES11730113 T ES 11730113T ES 2550060 T3 ES2550060 T3 ES 2550060T3
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Spain
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ctla4
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kon
koff
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Yoshiko Akamatsu
Robert B. Dubridge
Veronica Juan
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AbbVie Biotherapeutics Inc
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Abstract

Un polipéptido variante de CTLA4 que tiene mayor afinidad para CD80 y/o CD86 que el dominio de unión de CTLA4 de los aminoácidos 21-112 de SEC ID Nº:1; comprendiendo dicho polipéptido variante de CTLA4 una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% de identidad de secuencia con respecto a dicho dominio de unión de CTLA4 y la sustitución de aminoácido K28H en comparación con SEC ID Nº:1.

Description

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contexto indique claramente lo contrario. Además, el término "o" se usa en la presente solicitud, como es común en las solicitudes de patentes, para referirse a la conjunción disyuntiva "o" o a la conjunción conjuntiva "y".
Cualquier explicación de los documentos, actos, materiales, dispositivos, artículos o similares que se ha incluido en
5 esta memoria descriptiva tiene solamente el fin de proporcionar un contexto de la presente divulgación. No se admitirá que ninguno de estos asuntos forma parte de la base de la técnica anterior o sea un conocimiento general común en el campo relevante de la presente divulgación en tanto existiera en algún lugar antes de la fecha de prioridad de esta solicitud.
Las características y ventajas de la divulgación serán más evidentes a partir de la siguiente descripción detallada de las realizaciones de la misma.
5. Breve descripción de las tablas y las figuras
15 La Tabla 1 muestra la numeración de los aminoácidos de los bucles similares a CDR de CTLA4-Ig de tipo silvestre.
La Tabla 2 muestra las mutaciones en los bucles similares a CDR del CTLA4 de tipo silvestre en las que el estudio de unión indica un aumento de afinidad para CD80 y CD86.
La Tabla 3 muestra las mutaciones en los bucles similares a CDR del CTLA4 de tipo silvestre en las que los estudios de unión indican un aumento de afinidad para CD80, y no tienen un impacto sustancial en la unión a CD86.
25 La Tabla 4 muestra las mutaciones candidatas que pueden incorporarse en los bucles similares a CDR del CTLA4 de tipo silvestre para aumentar la afinidad hacia CD80 mientras que no tienen un impacto sustancial en la unión a CD86.
La Tabla 5 muestra las mutaciones en los bucles similares a CDR del CTLA4 de tipo silvestre en las que los estudios de unión indican un aumento de afinidad para CD80 y una disminución de afinidad para CD86.
La Tabla 6 muestra las mutaciones candidatas que pueden incorporarse en los bucles similares a CDR del CTLA4 de tipo silvestre para aumentar la afinidad hacia CD80 y disminuir la afinidad hacia CD86.
35 La Tabla 7 muestra las mutaciones en los bucles similares a CDR del CTLA4 de tipo silvestre en las que los estudios de unión indican un aumento de afinidad para CD86 mientras que no tienen un impacto sustancial en la unión a CD860.
La Tabla 8 muestra las mutaciones candidatas que pueden incorporarse en los bucles similares a CDR del CTLA4 de tipo silvestre para aumentar la afinidad hacia CD86 mientras que no tienen un impacto sustancial en la unión a CD80.
La Tabla 9 muestra las mutaciones en los bucles similares a CDR del CTLA4 de tipo silvestre en las que los estudios de unión indican una disminución de afinidad para CD80 y un aumento de afinidad para CD86.
45 La Tabla 10 muestra las mutaciones en los bucles similares a CDR del CTLA4 de tipo silvestre en las que los estudios de unión no indican un impacto sustancial en la unión a CD80 o CD86.
La Tabla 11 muestra las mutaciones candidatas que pueden incorporarse en los bucles similares a CDR del CTLA4 de tipo silvestre y que no tienen un impacto sustancial en la unión a CD80 o CD86.
La Tabla 12 muestra las mutaciones en los bucles similares a CDR del CTLA4 de tipo silvestre en las que los estudios de unión indican una disminución de afinidad para CD86 mientras que no tienen un impacto sustancial en la unión a CD860.
55 La Tabla 13 muestra las mutaciones candidatas que pueden incorporarse en los bucles similares a CDR del CTLA4 de tipo silvestre para disminuir la afinidad hacia CD86 mientras que no tienen un impacto sustancial en la unión a CD80.
La Tabla 14 muestra las mutaciones candidatas que pueden incorporarse en los bucles similares a CDR del CTLA4 de tipo silvestre para disminuir la afinidad hacia CD80 mientras que no tienen un impacto sustancial en la unión a CD86.
La Tabla 15 muestra mutaciones conocidas en los bucles similares a CDR del CTLA4 de tipo silvestre que
65 pueden incorporarse en las proteínas de CTLA4 que se describen en el presente documento. La fila 1 muestra las mutaciones conocidas que pueden incorporarse en los bucles similares a CDR del CTLA4 de tipo silvestre
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6.2. Compañeros de Fusión de CTLA4
En determinados aspectos, el polipéptido de CTLA4 de la divulgación puede ser una proteína de fusión en la que la variante del dominio unión de CTLA4 está unida operativamente a la secuencia de aminoácidos de otro polipéptido,
5 mencionado en el presente documento como un "compañero de fusión". Tal como se usa en el presente documento, la expresión "compañero de fusión" se refiere a un polipéptido no CTLA4 que se une covalentemente al polipéptido variante de CTLA4, bien directamente o mediante una secuencia enlazadora. En determinadas realizaciones, el extremo C-terminal del dominio de unión de CTLA4 está unido al extremo N-terminal del compañero de fusión. En algunas realizaciones, el compañero de unión puede comprender un dominio transmembrana y/o un dominio citoplasmático. En estas realizaciones, la proteína de fusión de CTLA4 se expresa en la superficie de una célula. En realizaciones particulares, el compañero de fusión comprende un polipéptido que facilita la secreción, expresión y/o solubilidad del polipéptido de CTLA4.
En algunas realizaciones, las proteínas de fusión de CTLA4 de la divulgación son monoméricas. En otras
15 realizaciones, las proteínas de fusión de CTLA4 de la divulgación son diméricas, bien debido a un enlace covalente (por ejemplo, por enlaces disulfuro) entre las porciones de CTLA4 de dos monómeros y/o entre los polipéptidos del compañero de unión o debido a una asociación no covalente de las porciones de CTLA4 y/o el compañero de fusión de los monómeros.
En algunas realizaciones, el compañero de fusión es una proteína o un dominio proteico que dimeriza, tal como el represor lambda, factor de unión aguas arriba y dominios de cremalleras de leucina (por ejemplo, fos/jun). En realizaciones particulares, el compañero de fusión es un polipéptido Fc de una inmunoglobulina (Ig), es decir, el dominio Fc de un polipéptido de Ig, o un fragmento del mismo. En determinadas realizaciones, el polipéptido o fragmento Fc puede derivar de diversas especies, incluyendo, por ejemplo, un ser humano, ratón, primate, etc., y
25 puede derivar de una especie distinta que el dominio de unión de CTLA4 al que se une. Por lo tanto, por ejemplo, en algunas realizaciones, el dominio de unión de CTLA4 deriva de una proteína humana y el compañero de fusión deriva de una proteína de ratón. En realizaciones particulares, tanto el polipéptido de CTLA4 como el compañero de fusión derivan de proteínas humanas.
En determinadas realizaciones, el polipéptido de Fc de Ig comprende una primera región constante (CH1), una región bisagra, una segunda región constante (CH2) y una tercera región constante (CH3) en el orden (del extremo N-terminal al C-terminal) CH1-bisagra-CH2-CH3. En algunas realizaciones, el compañero de fusión opcionalmente comprende una cuarta región constante (CH4). En algunas realizaciones, el compañero de fusión es un fragmento Fc de inmunoglobulina de la región bisagra, dominio CH2 y dominio CH3 del polipéptido de Ig. En aún otras
35 realizaciones, el fragmento Fc de Ig comprende un solo dominio constante, tal como la región bisagra y un dominio CH1, CH2 o CH3. En determinados aspectos, el Fc de Ig no tiene una bisagra, por ejemplo, una IgM. En algunas realizaciones, el polipéptido Fc de Ig comprende un polipéptido Fc de Ig de tipo silvestre. Los polipéptidos Fc ejemplares incluyen, pero sin limitación, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgD e IgM. En realizaciones particulares, el polipéptido Fc es una IgG.
Como alternativa, el compañero de fusión Fc de inmunoglobulina es un polipéptido de Ig modificado. En determinadas realizaciones, el polipéptido Fc tiene una o más sustituciones de aminoácidos en comparación con el de tipo silvestre. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, el polipéptido Fc es una IgG mutante en la que uno o más restos de cisteína se han sustituido por otro aminoácido (por ejemplo, un resto de serina) para eliminar uno o
45 más enlaces disulfuro formados entre dos cadenas de Ig. En otras realizaciones, el polipéptido Fc es un polipéptido de IgG en el que uno o más restos de aminoácidos se sustituye por otro aminoácido (por ejemplo, prolina) para reducir la función efectora (unión reducida al receptor de Fc). Véase la Publicación de Patente de EE.UU. n.º 2009/0258031.
En algunas realizaciones, el compañero de fusión Fc o un fragmento del mismo pueden modificarse para alterar al menos una función biológica efectora mediada por una región constante con respecto a la secuencia de tipo silvestre correspondiente. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el polipéptido Fc puede modificarse para reducir al menos una función biológica efectora mediada por una región constante con respecto a una región Fc no modificada, por ejemplo, unión reducida a un receptor de Fc (FcγR). La unión a FcγR puede reducirse mutando el segmento de la
55 región constante de la inmunoglobulina en regiones particulares necesarias para las interacciones de FcγR (Véase por ejemplo, Canfield y Morrison, 1991, J. Exp. Med. 173:1483-1491; y Lund et al., 1991, J. Immunol. 147:26572662). La reducción de la capacidad de unión a FcγR de la región Fc también puede reducir otras funciones efectoras que se basan en las interacciones de FcγR, tales como la opsonización, la fagocitosis y la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos ("ADCC").
En otras realizaciones, el polipéptido Fc puede modificarse para adquirir o mejorar al menos una función biológica efectora mediada por una región constante con respecto a una región Fc no modificada, por ejemplo, para potenciar las interacciones con FcγR (véase, por ejemplo, el documento US 2006/0134709). Por ejemplo, la región Fc puede modificarse para unirse a FcγRIIA, FcγRIIB y/o FcγRIIIA con mayor afinidad que la región constante de tipo silvestre
65 correspondiente.
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manipulan sustancialmente del mismo modo (por ejemplo, se almacenan en las mismas condiciones de temperatura y humedad durante el mismo periodo de tiempo).
En determinados aspectos, la estabilidad aumentada de un polipéptido de CTLA4 de la divulgación es un aumento
5 en la semivida. Una semivida aumentada puede ser el resultado de una oxidación de aminoácidos disminuida (por ejemplo debido a que un resto de aminoácidos susceptible a la oxidación, tal como metionina, cisteína o triptófano, en un bucle similar a CDR o en una región fuera de los bucles similares al dominio extracelular de CTLA4 se ha sustituido con respecto al CTLA4-Ig de tipo silvestre). Una semivida aumentada también puede ser el resultado de una ciclación de aminoácidos disminuida (por ejemplo debido a que un resto de aminoácidos susceptible a la ciclación, tal como asparaginas o ácido glutámico) en un bucle similar a CDR o en una región fuera de los bucles similares a CDR del dominio extracelular de CTLA4 se ha sustituido con respecto al CTLA4-Ig de tipo silvestre. Una semivida aumentada también puede ser el resultado de la eliminación de un motivo de aminoácidos que se reconoce por proteasas que pueden estar en purificaciones de proteínas a niveles residuales. Una semivida aumentada también puede ser el resultado de la eliminación de un motivo de aminoácidos que causa agregación de la proteína.
15 Una semivida aumentada también puede ser el resultado de un aumento en la estabilidad conformacional. La semivida aumentada o la estabilidad conformacional aumentada, o la disminución de los niveles de oxidación, ciclación, proteólisis o agregación con respecto al CTLA4 Ig de tipo silvestre pueden ser al menos 0,1 veces, al menos 0,2 veces, al menos 0,3 veces, al menos 0,4 veces, al menos 0,5 veces, al menos 0,6 veces, al menos 0,7 veces, al menos 0,8 veces, al menos 0,9 veces, al menos 1 veces, al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces o al menos 10 veces. En determinadas realizaciones, la semivida aumentada o la estabilidad conformacional aumentada, o la disminución de los niveles de oxidación, ciclación, proteólisis o agregación con respecto al CTLA4 Ig de tipo silvestre está en un intervalo entre cualquiera de los valores anteriores, por ejemplo, 0,1 veces a 2 veces, 5 veces a 10 veces, 0,9 veces a 6 veces o similares.
25 En el presente documento existen métodos para explorar los polipéptidos de CTLA4 con respecto a su estabilidad aumentada con respecto al CTLA4 Ig de tipo silvestre. Los métodos pueden comprender las etapas de: (a) determinar la cantidad del polipéptido de CTLA4 de longitud completa en una primera muestra; y (b) comparar la cantidad del polipéptido de CTLA4 de longitud completa en la primera muestra con una cantidad del polipéptido de CTLA4 Ig de tipo silvestre en una segunda muestra. Los métodos para ensayar la estabilidad proteica son conocidos en la técnica.
6.4. Inmunogenicidad Reducida de los polipéptidos de CTLA4
35 En determinados aspectos, la presente divulgación proporciona polipéptidos de CTLA4 que tienen una inmunogenicidad reducida con en comparación con belatacept o MAXY-4 (Maxygen). La presente divulgación proporciona polipéptidos de CTLA4 que tienen una sola o múltiples sustituciones de aminoácidos en sus regiones de bucles similares a CDR en comparación con los bucles similares a CDR del belatacept o MAXY-4 y/o en las regiones del dominio extracelular de CTLA4 que están fuera de los bucles similares a CDR y/o en el polipéptido del compañero de fusión, si está presente, donde al menos una sustitución da como resultado la inmunogenicidad reducida del polipéptido de CTLA4 en comparación con belatacept o MAXY-4. En determinadas realizaciones, la inmunogenicidad reducida da como resultado una o más sustituciones de aminoácidos que dan como resultado la eliminación o mitigación de uno o más epítopos de células T.
45 En determinados aspectos, las proteínas de CTLA4 que tienen inmunogenicidad reducida tienen una actividad biológica comparable o alterada en comparación con belatacept o MAXY-4, por ejemplo, afinidad hacia CD80 y/o CD86.
En determinadas realizaciones, la inmunogenicidad de un polipéptido de CTLA4 de la divulgación se reduce con respecto a belatacept o MAXY-4. Tales polipéptidos generalmente tienen secuencias variantes con respecto al dominio extracelular de CTLA4 y/o el compañero de fusión, si está presente. En determinadas realizaciones, los polipéptidos de CTLA4 generalmente tienen 1, 2 o 3 sustituciones de aminoácidos en una o ambas secuencias del dominio extracelular de CTLA4 y la secuencia del compañero de fusión, si está presente. En otras realizaciones, los polipéptidos de CTLA4 pueden tener 4, 5, 6, 7, 8, 9, 2 o 10 sustituciones de aminoácidos en una o ambas
55 secuencias del dominio extracelular de CTLA4 y la secuencia del compañero de fusión, si está presente. En aún otras realizaciones, los polipéptidos de CTLA4 pueden tener 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 2 o 20 sustituciones de aminoácidos en una o ambas secuencias del dominio extracelular de CTLA4 y la secuencia del compañero de fusión, si está presente.
Tal como se usa en la presente divulgación, una variante con una "inmunogenicidad reducida" se refiere a un polipéptido de CTLA4 que comprende una secuencia variante en comparación con belatacept o MAXY-4 que provoca una respuesta proliferativa reducida en células mononucleares de sangre periférica en comparación con belatacept o MAXY-4. Un ensayo de proliferación ejemplar que puede usarse para evaluar la respuesta proliferativa se expone en la Sección 5.6 más adelante. La respuesta proliferativa reducida puede reflejarse en términos del
65 porcentaje de respondedores, el índice de estimulación, o ambos.
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hospedadoras de mamíferos ejemplares para la expresión de proteínas recombinantes incluyen las células de Ovario de Hámster Chino (células CHO) (incluyendo células CHO DHFR-, descritas en Urlaub y Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, usadas con un indicador seleccionable de DHFR, por ejemplo, tal como se describe en Kaufman y Sharp, 1982, Mol. Biol. 159:601-621), células de mieloma NS0, células COS, células 293 y 5 células SP2/0. Cuando los vectores de expresión recombinante que codifican las proteínas de CTLA4 se introducen en células hospedadoras de mamíferos, las proteínas se producen cultivando las células hospedadoras durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la expresión de la proteína en las células hospedadoras o la secreción de la proteína en el medio de cultivo en el que crecen las células hospedadoras. Las proteínas de CTLA4 de la invención pueden recuperarse a partir del medio de cultivo usando métodos de purificación de proteínas
10 convencionales.
La tecnología de ADN recombinante también puede usarse para retirar algunos o todos los ADN que codifican las proteínas de CTLA4 que no son necesarios para la unión a un ligando de CTLA4. Las moléculas expresadas a partir de tales moléculas de ADN truncadas también se abarcan por las proteínas de la divulgación.
15 Una vez que se genera un ácido nucleico que codifica una o más porciones del abatacept de tipo silvestre o una proteína de CTLA4 con las secuencias similares a CDR relacionadas con las secuencias similares a CDR de abatacept, pueden introducirse alteraciones o mutaciones adicionales en la secuencia codificante, por ejemplo para generar ácidos nucleicos que codifican proteínas de CTLA4 con distintas secuencias similares a CDR, o proteínas
20 con afinidad reducida para el receptor de Fc.
Las proteínas de CTLA4 de la divulgación también pueden producirse por síntesis química (por ejemplo, mediante los métodos descritos en Solid Phase Peptide Synthesis, 2ª ed., 1984 The Pierce Chemical Co., Rockford, Ill.). También pueden generarse proteínas variantes usando una plataforma libre de células (véase, por ejemplo, Chu et
25 al., Biochemia n.º 2, 2001 (Roche Molecular Biologicals)).
Una vez que se ha producido una proteína de CTLA4 de la divulgación por expresión recombinante, puede purificarse por cualquier método conocido en la técnica para la purificación de proteínas, por ejemplo, usando anticuerpos reactivos con el dominio de unión de CTLA4 de una proteínas de la divulgación, o cromatografía (por
30 ejemplo, intercambio iónico, afinidad, tal como afinidad para CD80 y/o CD86, y tamaño de la columna de cromatografía), centrifugación, solubilidad diferencial, o por cualquier otra técnica convencional. Además, las proteínas de CTLA4 de la presente divulgación pueden fusionarse a secuencias de polipéptidos heterólogas descritas en el presente documento conocidas de otro modo en la técnica por facilitar la purificación.
35 Una vez aislada, una proteína de CTLA4 puede, si se desea, purificarse adicionalmente, por ejemplo, por cromatografía líquida de alto rendimiento (Véase, por ejemplo, Fisher, Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology (Work y Burdon, eds., Elsevier, 1980)), o por cromatografía de filtración en gel en una columna SuperdexTM 75 (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suecia).
40 6.6. Actividades Biológicas de Proteínas CTLA4
En diversas realizaciones, las proteínas de CTLA4 de la divulgación tienen determinadas actividades biológicas, tales como competir con abatacept por la unión a CD80 y/o CD86, o bloquear la respuesta de células T.
45 Por consiguiente, en determinadas realizaciones, las proteínas de CTLA4 de la divulgación compiten con abatacept para la unión de CD80 o CD86. La capacidad de competir para la unión a CD80 o CD86 puede ensayarse usando un ensayo competitivo. En un ejemplo de un ensayo competitivo, el ensayo AlphaLISA® (Luminiscencia Homogénea de Proximidad Amplificada) o AlphaScreen® puede usarse como una alternativa al ELISA sin lavados. En el ensayo AlphaLISA®, el ligando, CD80 o CD86 fusionado con un marcador (por ejemplo, Cλ-HA) se une a las esferas
50 aceptoras AlphaLISA® conjugadas con un anticuerpo anti-marcador (por ejemplo, anti Cλ humano de cabra) y abatacept biotinilado se une a esferas donantes recubiertas de estreptavidina AlphaScreen® (PerkinElmer, Waltham, MA). En ausencia de variantes de competición de CTLA4, el abatacept interacciona con CD80 o CD86 y produce una señal a 615 nm. La adición de la variante de CTLA4 no marcada compite con la interacción abatacept/CD80 o CD86, reduciendo la fluorescencia cuantitativamente para permitir la determinación de las afinidades de unión
55 relativas. Abatacept puede biotinilarse con Sulfo-NHS-Biotina usando métodos convencionales y dializarse con PBS. La conjugación de esferas aceptoras AlphaLISA® se realiza siguiendo la "AlphaLISA® Assay Development Guide" (PerkinElmer). Se realiza la unión en una AlphaPlate de 384 pocillos (PerkinElmer) en tampón de ensayo (por ejemplo, BSA al 1%, Tween20 al 0,01% en PBS (pH 7,1)). Cada pocillo contiene abatacept 0,5 nM biotinilado, en diluciones seriadas 1:4 de CTLA4 competidor comenzando desde 40 nM, 0,078 µg/ml de CD80, y 5 µg/ml de esferas
60 aceptoras conjugadas con anti-Cλ humano de cabra. La placa se incuba en la oscuridad durante 1 h a temperatura ambiente. Después se añaden esferas donantes de estreptavidina a cada pocillo a 5 µg/ml. La placa se incuba en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 min adicionales, después de lo cual se lee en un lector EnVision (PerkinElmer). Los datos se ajustan usando regresión no lineal con el programa informático GRAPHPAD PRISM (GraphPad, San Diego).
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mayor que o igual que la respuesta de fondo promedio más tres desviaciones típicas, se considera un epítopo de célula T CD4+ potencial.
En otros aspectos, un polipéptido de CTLA4 de la divulgación inhibe la actividad de CD80 y/o CD86 en una gama de 5 ensayos in vitro, tales como de proliferación celular, de producción de citocinas (por ejemplo, IL-2) y adhesión celular.
En algunas realizaciones, la actividad ensayada es la actividad inmunosupresora de los polipéptidos de CTLA4 de la divulgación. En particular, sangre humana reciente a recogida partir de donantes se diluye con un volumen igual de PBS y se fracciona para aislar PBMC usando un gradiente de Ficoll Histopaque (Sigma) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los PBMC se diluyen en medio RPMI (Sigma) complementado con FBS al 10% (Hyclone) y PSG 1x (penicilina, estreptomicina y glutamina) (Invitrogen) y se añaden a placas de cultivo de 96 pocillos (BD Biosciences) a una densidad de of 1 x 105 células/pocillo. Las proteínas de CTLA4 a ensayar se diluyen en serie en el mismo medio y se añaden a los pocillos por cuadruplicado. Se inicia la proliferación celular por adición
15 del antígeno PPD (derivado de la purificación de proteínas de Mycobacterium tuberculosis, Mycos) a una concentración final de 5 µl/ml. Después de la incubación a 37 °C durante 5 días, se añade 3H timidina (GE Healthcare) a 1 µCi/pocillo y se incuban las placas a 37 °C durante 18 horas adicionales. Se recogen las células con un recolector celular (Recolector FilterMate Omnifilter-96, Perkin Elmer) usando las condiciones recomendadas por el fabricante y se mide la incorporación de 3H timidina usando un contador de centelleo (Wallac Trilux). Los datos de la proliferación celular se analizan con un programa informático GraphPad Prism 5 usando un modelo de curva de regresión no lineal (dosis respuesta sigmoidal, pendiente variable) y el método de ajuste de los mínimos cuadrados. Los parámetros de CI50 para cada variante y se determinan sus intervalos de confianza al 95% asociados.
En determinadas realizaciones, la actividad ensayada es la inhibición de la proliferación de células T primarias y
25 secundarias alo-estimuladas. En particular, la actividad puede medirse por la proliferación de las células T-CD4+ humanas de sangre periférica, por ejemplo, tal como se describe por Larsen et al., 2005, Am. J. Transplant. 5:443
453. En los ensayos de alo-respuesta primaria, las células T-CD4+ humanas (3-10 x 104/pocillo) se aíslan con líneas celulares de linfoblastos B humanos irradiados que expresan cantidades equivalentes de CD80 y CD86 (por ejemplo, células PM, 8,0 x 103/pocillo), junto con concentraciones variables de proteínas de CTLA4-Ig de tipo silvestre o proteínas de CTLA4 de la divulgación. Los ensayos de estimulación primaria alogénica se desarrollaron durante 6 días antes de la adición de 0,5 µCi/pocillo de [3H]-timidina durante las 7 h finales de cultivo. Para los ensayos de estimulación secundaria alogénica, se aíslan las células viables de las células T primarias alo-estimuladas por centrifugación de densidad diferencial y se dejan en reposo durante 24 horas. Las células T se re-estimulan después (estimulación secundaria) añadiendo células PM en la misma proporción que anteriormente en presencia de
35 cantidades tituladas de CTLA4-Ig de tipo silvestre o proteínas de CTLA4 de la divulgación. Las células T se estimulan durante 3 días, se pulsan con [3H]-timidina durante las 7 h finales de cultivo y se recogen como se hizo anteriormente. Como alternativa, la proliferación de las células T primarias y secundarias alo-estimuladas puede ensayarse tal como se describe en el Ejemplo 2 más adelante.
En diversas realizaciones, la actividad de las variantes de CTLA4 de la divulgación puede medirse por inhibición de la producción de citocinas. Por ejemplo, en realizaciones específicas, la citocina es IL-2 producida por células T de Jurkat (Cox et al., 1999, Protein Expr. Purif. 17(1):26-32). Las células de Jurkat (1,0 x 105/pocillo) se estimulan con 10 µg/ml de PHA-L y células (por ejemplo, CHO-K1, 2.5 x104/pocillo) que expresan CD80 o C86 recombinante en presencia de cantidades tituladas de CTLA4-Ig de tipo silvestre o proteínas de CTLA4 de la divulgación. Después de
45 24 horas de cultivo, se mide la concentración de IL-2 en el sobrenadante de cultivo usando, por ejemplo, un kit AlphaLISA® para IL-2 Humana (Perkin Elmer). Como alternativa, la concentración de IL-2 puede medirse por métodos conocidos en la técnica (por ejemplo, ELISA).
Como alternativa, en otra realización, la inhibición de la producción de citocinas puede medirse en los medios de cultivo de las células T secundarias alo-estimuladas (Larsen et al., 2005, Am. J. Transplant. 5:443-453). Las alícuotas de los sobrenadantes de cultivo de células T alo-estimuladas durante 3 días tal como se describe en el ensayo de alo-estimulación secundaria anterior se retiran antes de la adición de [3H]-timidina. El nivel de producción de citocinas (por ejemplo, IFNγ, IL-2, IL-4) se mide usando ensayos basados en esferas tales como Luminex® (Invitrogen) u otros métodos conocidos en la técnica (por ejemplo, ELISA).
55 En determinadas realizaciones, la actividad ensayada es la adhesión celular. En particular, células (por ejemplo, células CHO) que expresan recombinantemente CD80 o CD86 en la superficie celular se diluyen en medio, por ejemplo, FBS al 10% en RPMI, y se siembran en placas de 96 pocillos y crecen hasta la confluencia. Cuando están confluentes, las células se incuban con una proteína de CTLA4 de la divulgación o abatacept o se usan como un control negativo. La proteína no unida se retira de las células lavando con medio caliente. Las células T purificadas son bien no estimuladas o se pre-estimulan con 1 µg/ml de anticuerpo monoclonal anti-CD3 (30 min a 37 °C). Las células T (1 x 105 células/pocillo en 100 ml de medio) se siembran en sobre las células que expresan CD80 o CD86 y se permite que se adhieran durante 30 min a 37 °C. Se retiran las células no adherentes lavando cada pocillo tres veces con medio caliente y se cuentan (por ejemplo, por exclusión en azul de tripano) por triplicado. La adherencia
65 de las células CHO se calcula como (el número de células no adherentes/número de células totales de entrada) X 100%. Como alternativa, Las células T pueden incubarse con un colorante fluorescente tal como calceína AM
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(Molecular Probes, Eugene OR) de acuerdo con las instrucciones del fabricante antes de que se siembren en los pocillos. Después de la incubación de las células T, la retirada del medio que contiene las células T no adherentes y el lavado, se leen las placas por un lector de fluorescencia de placas de pocillos múltiples. El porcentaje de adhesión de las células T deriva de la fórmula: (adhesión específica en presencia de la proteína de fusión de ensayo adhesión de fondo)/(adhesión específica en presencia de abatacept -adhesión de fondo).
6.7. Propiedades cinéticas de Proteínas de Fusión CTLA4
En determinadas realizaciones, las proteínas de CTLA4 de la divulgación tienen alta afinidad para CD80 y CD86. Tal como se usa en el presente documento, las proteínas variantes con "alta afinidad" para CD80 y/o CD86 tienen al menos una mejora de 1,5 veces en la afinidad de unión en comparación con abatacept. En otras realizaciones, las proteínas de CTLA4 de la divulgación tienen alta afinidad para CD80 y afinidad neutra para CD86. En diversas realizaciones, las proteínas de CTLA4 de la divulgación tienen alta afinidad para CD80 y baja afinidad para CD86. En aún otras realizaciones, las proteínas de CTLA4 de la divulgación tienen alta afinidad para CD86 y afinidad neutra para CD80. Tal como se usa en el presente documento, las proteínas variantes con "alta afinidad" para CD80 y/o CD86 tienen al menos una mejora de 0,5 veces pero menor de 1,5 veces en la afinidad de unión en comparación con abatacept. En diversas realizaciones, las proteínas de CTLA4 de la divulgación tienen baja afinidad para CD80 y alta afinidad para CD86. También se describen proteínas de CTLA4 que tienen afinidad neutra tanto para CD80 como para CD86. También se describen proteínas de CTLA4 que tienen afinidad neutra para CD80 y baja afinidad para CD86. También se describen proteínas de CTLA4 que tienen baja afinidad para CD80 y afinidad neutra para CD86. Tal como se usa en el presente documento, una variante con "baja afinidad" para CD80 y/o CD86 tiene una mejora de menos de 0,5 veces la afinidad de unión en comparación con abatacept.
En realizaciones específicas, las proteínas de CTLA4 de la presente divulgación tienen constantes de tasa de asociación específica (valores de kon o ka), constantes de tasa de disociación (valores de koff o kd), constantes de afinidad (valores de KA), constantes de disociación (valores de KD) y/o valores de CI50. En diversas realizaciones, las constantes de unión para la interacción de las proteínas de CTLA4 con el dominio extracelular bien de CD80 o de CD86 pueden determinarse usando resonancia de plasmones de superficie de acuerdo con el método divulgado en Karlsson et al., 1991, J. Immunol. Methods 145:229-240. En determinados aspectos, tales valores se seleccionan de las siguientes realizaciones.
En realizaciones específicas, las proteínas CTLA4 de la divulgación se unen a CD80 con una kon de al menos 102 M1s-1, al menos 5 X 102 M-1s-1, al menos 103 M-1s-1, al menos 5 X 103M-1s-1, al menos 104 M-1s-1, al menos 5 X 104M-1s1, al menos 105M-1s-1, al menos 5 X 105M-1s-1, al menos 106 M-1s-1, al menos 5 X 106M-1s-1, al menos 107 M-1s-1, al menos 5 X 107M-1s-1, al menos 108 M-1s-1, al menos 5 X 108M-1s-1, al menos 109M-1s-1, al menos 5 X 109 M-1s-1 o con una kon en cualquier intervalo de cualquier par de los valores anteriores (por ejemplo, 5 X 104 M-1s-1 a 106 M-1s-1 o 102 M-1s-1 a 5 X 105 M-1s-1).
En determinadas realizaciones, las proteínas CTLA4 de la divulgación se unen a CD86 con una kon de al menos 102 M-1s-1, al menos 5 X 102M-1s-1, al menos 103 M-1s-1, al menos 5 X 103M1s1, al menos 104 M-1s-1, al menos 5 X 104M-1s-1, al menos 105M-1s-1, al menos 5 X 105 M-1s-1, al menos 106 M-1s-1, al menos 5 X 106M-1s-1, al menos 107 M1s-1, al menos 5 X 107M-1s-1, al menos 108 M-1s-1, al menos 5 X 108M-1s-1, al menos 109M-1s-1, al menos 5 X 109 M-1s-1
o con una kon en cualquier intervalo entre cualquier par de los valores anteriores (por ejemplo, 5 X 104 M-1s-1 a 106 M1s-1 o 103 M-1s-1 a 5 X 105 M-1s-1).
En determinadas realizaciones, las proteínas CTLA4 de la divulgación se unen a CD80 con una koff de 10-1 M-1s-1 o menos, 1,5 s-1 o menos, 1 s-1 o menos, 0,5 s-1 o menos, 0,1 s-1 o menos, 5 x 10-2 s-1 o menos, 10-2s-1 o menos, 5 x 103 s-1 o menos, 10-3s-1 o menos, 5 x 10-4 s-1 o menos, 10-4 s-1 o menos, 5 x 10-5 s-1 o menos, 10-5s-1 o menos, 5 x 10-6 s-1
o menos, 10-6s-1 o menos, 5 x 10-7 s-1 o menos, 10-7s-1 o menos, 5 x 10-8 s-1 o menos, 10-8s-1 o menos, al menos 5 X 109 M-1s-1 o con una kon en cualquier intervalo entre cualquier par de los valores anteriores (por ejemplo, 1 s-1 a 5 X 10-3 s-1, o 5 X 10-5 s-1 a 10-8 s-1).
En algunas realizaciones, las proteínas de CTLA4 de la divulgación se unen a CD86 con una koff de 10 s-1 o menos, 5 s-1 o menos, 1 s-1 o menos, 0,5 s-1 o menos, 0,1 s-1 o menos, 5 X 10-2 s-1 o menos, 10-2 s-1 o menos, 5 X 10-3 s-1 o menos, 10-3s-1 o menos, 5 X 10-4 s-1 o menos, 10-4s-1 o menos, 5 X 10-5 s-1 o menos, 10-5s-1 o menos, 5 X 10-6 s-1 o menos, 10-6s-1 o menos, 5 X 10-7 s-1 o menos, 10-7s-1 o menos, 5 X 10-8 s-1 o menos, 10-8s-1 o menos, al menos 5 X 109 M-1s-1 o con una kon en cualquier intervalo entre cualquier par de los valores anteriores (por ejemplo, 1 s-1 a 5 X 10-3 s-1, o 5 X 10-5 s-1 a 10-8 s-1).
En algunas realizaciones, una proteína de CTLA4 de la divulgación se une a CD80 con una KA (kon/koff) de al menos 5 X 105 M-1, al menos 105 M-1, al menos 5 X 106 M-1, al menos 106 M-1, al menos 5 X 107 M-1, al menos 107 M1, al menos 108 M-1, al menos 5 X 108 M-1, al menos 109 M-1, al menos 5 X 109 M-1, al menos 5 X 1010 M-1, al menos 1010 M-1, al menos 5 X 1011 M-1, al menos 1011 M-1, al menos 5 X 1012 M-1, al menos 1012 M-1, al menos 5 X 1013 M-1 , al menos 1013 M-1, al menos 5 X 1014 M-1, al menos 1014 M-1, al menos 5 X 1015 M-1, al menos 1015 M-1, o al menos con una KA en cualquier intervalo entre cualquier par de los valores anteriores (por ejemplo, 5 X 105M-1 a 5 X 1013 M-1 o 5 X 108 M-1 a 5 X 1015 M-1).
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En algunas realizaciones, una proteína de CTLA4 de la divulgación se une a CD86 con una KA (kon/koff) de al menos 5 X 104 M-1, al menos 104 M-1, al menos 5 X 105M-1, al menos 105 M-1, al menos 5 X 106 M-1, al menos 106 M1, al menos 107 M-1, al menos 5 X 107 M-1, al menos 108 M-1, al menos 5 X 108M-1, al menos 5 X 109M-1, al menos 109 M-1, al menos 5 X 1010M-1, al menos 1010 M-1, al menos 5 X 1011M-1, al menos 1011 M-1, al menos 5 X 1012 M-1, al
5 menos 1012 M-1, al menos 5 X 1013 M-1, al menos 1013 M-1, al menos 5 X 1014 M-1, al menos 1014 M-1, o al menos con una KA en cualquier intervalo entre cualquier par de los valores anteriores (por ejemplo, 5 X 104 M-1 a 1013M-1 o 5 X 107 M-1 a 5 X 1013 M-1).
En diversas realizaciones, una CTLA4 de la divulgación se une a CD80 con una KD (koff/kon) de 5 X 10-6 M o menos, 10-6 M o menos, 5 X 10-7 M o menos, 10-7 M o menos, 5 X 10-8 M o menos, 10-8 M o menos, 5 X 10-9 M o menos, 109 M o menos, 5 X 10-10 M o menos, 10-10 M o menos, 5 X 10-11 M o menos, 10-11 M o menos, 5 X 10-12 M o menos, 10-12 M o menos, 5 X 10-13 M o menos, 10-13 M o menos, 5 X 10-14 M o menos, 10-14 M o menos, 5 X 10-15 M o menos, 10-15 M o menos, o una KD que varía entre un par cualquiera de los valores anteriores (por ejemplo, de 107 M a 5 X 10-13 M, o de 10-9 Ma 10-15 M).
15 En diversas realizaciones, una proteína de CTLA4 de la divulgación se une a CD86 con una KD (koff/kon) de 10-5 M o menos, 5 X 10-6 M o menos, 10-6 M o menos, 5 X 10-7 M o menos, 10-7 M o menos, 5 X 10-8 M o menos, 10-8 M o menos, 5 X 10-9 M o menos, 10-9 M o menos, 5 X 10-10 M o menos, 10-10 M o menos, 5 X 10-11 M o menos, 10-11 M o menos, 5 X 10-12 M o menos, 10-12 M o menos, 5 X 10-13 M o menos, 10-13 M o menos, 5 X 10-14 M o menos, 10-14 M o menos, 5 X 10-15 M o menos, 10-15 M o menos, o una KD que varía entre un par cualquiera de los valores anteriores (por ejemplo, de 10-6 M a 5 X 10-10 M, o de 10-9 M a 10-15 M).
En algunas realizaciones, la proteína de CTLA4 de la divulgación se une a CD80 e inhibe la unión de CD80 a abatacept en un ensayo de unión (por ejemplo, un ensayo competitivo AlphaLISA®) a un valor de CI50 de menos de
25 1000 nM, menos de 750 nM, menos de 500 nM, menos de 100 nM, menos de 50 nM, menos de 10 nM, menos de 5 nM, menos de 1 nM, menos de 0,75 nM, menos de 0,5 nM, menos de 0,25 nM, menos de 0,1 nM, menos de 5 X 10-2 nM, menos de 10-2 nM, menos de 5 X 10-3 nM, menos de 10-3 nM, menos de 5 X 10-4 nM, o menos de 10-4 nM, o con una CI50 en cualquier intervalo entre cualquier par de los valores anteriores (por ejemplo, 100 nM a 5 X 10-2 nMo 0,5nMy 5 X 10-4 nM).
En algunas realizaciones, la proteína de CTLA4 de la divulgación se une a CD86 e inhibe la unión de CD86 a abatecept en un ensayo de unión (por ejemplo, un ensayo de competición AlphaLISA®) a un valor de CI50 de menos de 1000 nM, menos de 500 nM, menos de 100 nM, menos de 50 nM, menos de 10 nM, menos de 5 nM, menos de 1 nM, menos de 0,75 nM, menos de 0,5 nM, menos de 0,25 nM, menos de 0,1 nM, menos de 5 X 10-2 nM, menos de
35 10-2 nM, menos de 5 X 10-3 nM, menos de 10-3 nM, menos de 5 X 10-4 nM, o menos de 10-4 nM, o con una CI50 en cualquier intervalo entre cualquier par de los valores anteriores (por ejemplo, 100 nM a 5 X 10-2 nM o 0,5nM y 5 X 10-4 nM).
En determinadas realizaciones, las propiedades cinéticas de una proteínas de fusión de la divulgación son comparables a, o mejoradas con respecto a, abatacept en un ensayo comparable. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, una proteína CTLA4 de la divulgación se une a CD80 y/o CD86 con una tasa de kon que varía de aproximadamente 0,05x a aproximadamente 1000x la kon de abatacept, por ejemplo una kon de 0,06x de la kon de abatacept, una kon de 0,08x la kon de abatacept, una kon de 0,1x la kon de abatacept, una kon de 0,5x la kon de abatacept, una kon de 1x la kon de abatacept, una kon de 1,1x la kon de abatacept, una kon de 1,2x la kon de abatacept, 45 una kon de 1,3x la kon de abatacept, una kon de 1,4x la kon de abatacept, una kon de 1,5x la kon de abatacept, una kon de 1,6x la kon de abatacept, una kon de 1,6x la kon de abatacept, una kon de 1,7x la kon de abatacept, una kon de 1,8x la kon de abatacept, una kon de 1,9x la kon de abatacept, una kon de 2x la kon de abatacept, una kon de 2,25x la kon de abatacept, una kon de 2,5x la kon de abatacept, una kon de 2,75x la kon de abatacept, una kon de 3x la kon de abatacept, una kon de 4x la kon de abatacept, una kon de 5x la kon de abatacept, una kon de 6x la kon de abatacept, una kon de 7x la kon de abatacept, una kon de 8x la kon de abatacept, una kon de 9x la kon de abatacept, una kon de 10x la kon de abatacept, una kon de 15x la kon de abatacept, una kon de 20x la kon de abatacept, una kon de 50x la kon de abatacept, una kon de 75x la kon de abatacept, una kon de 100x la kon de abatacept, una kon de 150x la kon de abatacept, una kon de 200x la kon de abatacept, o una kon que varía entre un par cualquiera de los valores anteriores, por ejemplo, una kon de 0,1x-75x la kon de abatacept, una kon de 5x-100x la kon de abatacept, una kon de 0,05x
55 1000x la kon de abatacept, una kon de 0,75x-250x la kon de abatacept, etc.
En diversas realizaciones, una proteína CTLA4 de la divulgación se une a CD80 y/o CD86 con una tasa de koff que varía de aproximadamente 0,001x a aproximadamente 3x la koff de abatacept, por ejemplo una koff de 0,002x la koff de abatacept, una koff de 0,003x la koff de abatacept, una koff de 0,004x la koff de abatacept, una koff de 0,005x la koff de abatacept, una koff de 0,006x la koff de abatacept, una koff de 0,0075x la koff de abatacept, una koff de 0,01x la koff de abatacept, una koff de 0,025x la koff de abatacept, una koff de 0,05x la koff de abatacept, una koff de 0,075x la koff de abatacept, una koff de 0,1x la koff de abatacept, una koff de 0,25x la koff de abatacept, una koff de 0,5x la koff de abatacept, una koff de 0,75x la koff de abatacept, una koff de 1x la koff de abatacept, una koff de 1,25x la koff de abatacept, una koff de 1,5x la koff de abatacept, una koff de 1,75x la koff de abatacept, una koff de 2x la koff de 65 abatacept, una koff de 2,25x la koff de abatacept, una koff de 2,5x la koff de abatacept, una koff de 3x la koff de abatacept, una koff de 4x la koff de abatacept, una koff de 5x la koff de abatacept, o una koff que varía entre un par
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cualquiera de los valores anteriores, por ejemplo, una koff de 0,01x a 1,25x de la koff de abatacept, una koff de 0,05x a 2,5x de la koff de abatacept, o una koff de 0,006x a 0,1x de la koff de abatacept, etc.
En otras realizaciones, una proteína CTLA4 de la divulgación se une a CD80 y/o CD86 con una tasa de KA (kon/koff)
5 que varía de aproximadamente 0,1x a aproximadamente 1000x la KA de abatacept, por ejemplo una KA de 0,2x la KA de abatacept, una KA de 0,25x la KA de abatacept, una KA de 0,5x la KA de abatacept, una KA de 0,75x la KA de abatacept, una KA de 1x la KA de abatacept, una KA de 2x la KA de abatacept, una KA de 3x la KA de abatacept, una KA de 4x la KA de abatacept, una KA de 5x la KA de abatacept, una KA de 10x la KA de abatacept, una KA de 15x la KA de abatacept, una KA de 20x la KA de abatacept, una KA de 30x la KA de abatacept, una KA de 40x la KA de abatacept, una KA de 50x la KA de abatacept, una KA de 75x la KA de abatacept, una KA de 100x la KA de abatacept, una KA de 200x la KA de abatacept, una KA de 250x la KA de abatacept, una KA de 300x la KA de abatacept, una KA de 350x la KA de abatacept, una KA de 400x la KA de abatacept, una KA de 500x la KA de abatacept, una KA de 750x la KA de abatacept, una KA de 1000x la KA de abatacept, o una KA que varía entre un par cualquiera de los valores anteriores, por ejemplo, una KA de 0,1x a 100x la KA de abatacept, una KA de 10x a 50x la KA de abatacept, una KA
15 de 5x a 50x la KA de abatacept, etc.
En aún otras realizaciones, una proteína CTLA4 de la divulgación se une a CD80 y/o CD86 con una tasa de KD (koff/kon) que varía de aproximadamente 0,001x a aproximadamente 10x la KD de abatacept, por ejemplo una KD de 0,001x la KD de abatacept, una KD de 0,002x la KD de abatacept, una KD de 0,003x la KD de abatacept, una KD de 0,004x la KD de abatacept, una KD de 0,005x la KD de abatacept, una KD de 0,0075x la KD de abatacept, una KD de 0,01x la KD de abatacept, una KD de 0,025x la KD de abatacept, una KD de 0,05x la KD de abatacept, una KD de 0,075x la KD de abatacept, una KD de 0,1x la KD de abatacept, una KD de 0,2x la KD de abatacept, una KD de 0,3x la KD de abatacept, una KD de 0,4x la KD de abatacept, una KD de 0,5x la KD de abatacept, una KD de 0,75x la KD de abatacept, una KD de 1x la KD de abatacept, una KD de 1,5x la KD de abatacept, una KD de 2x la KD de abatacept,
25 una KD de 3x la KD de abatacept, una KD de 4x la KD de abatacept, una KD de 5x la KD de abatacept, una KD de 6x la KD de abatacept, una KD de 7x la KD de abatacept, una KD de 8x la KD de abatacept, una KD de 9x la KD de abatacept, una KD de 10x la KD de abatacept, o una KD que varía entre un par cualquiera de los valores anteriores, por ejemplo, una KD de 0,001x a 0,5x la KD de abatacept, una KD de 0,1x a 0,4x la KD de abatacept, una KD de 0,05,1x a 1x la KD de abatacept, etc.
En determinadas realizaciones, una proteína de CTLA4 de la divulgación se une a CD80 y/o CD86 e inhibe el crecimiento celular o la producción de IL2 a un valor de CI50 que varía de aproximadamente 0,001x a aproximadamente 10x de la CI50 de abatacept, por ejemplo una CI50 de 0,005 la CI50 de abatacept, a una CI50 de 0,01x la CI50 de abatacept, a una CI50 de 0,05x la CI50 de abatacept, a una CI50 de 0,1x la CI50 de abatacept, a una 35 CI50 de 0,2x la CI50 de abatacept, a una CI50 de 0,3x la CI50 de abatacept, a una CI50 de 0,4x la CI50 de abatacept, a una CI50 de 0,5x la CI50 de abatacept, a una CI50 de 0,6x la CI50 de abatacept, a una CI50 de 0,7x la CI50 de abatacept, a una CI50 de 0,8x la CI50 de abatacept, a una CI50 de 0,9x la CI50 de abatacept, a una CI50 de 1x la CI50 de abatacept, a una CI50 de 1,5x la CI50 de abatacept, a una CI50 de 2x la CI50 de abatacept, a una CI50 de 3x la CI50 de abatacept, a una CI50 de 4x la CI50 de abatacept, a una CI50 de 5x la CI50 de abatacept, a una CI50 de 6x la CI50 de abatacept, a una CI50 de 7x la CI50 de abatacept, a una CI50 de 8x la CI50 de abatacept, a una CI50 de 9x la CI50 de abatacept, a una CI50 de 10x la CI50 de abatacept, a una CI50 de 100x la CI50 de abatacept, a una CI50 de 500x la CI50 de abatacept, a una CI50 de 1000x la CI50 de abatacept, o una CI50 que varía entre un par cualquiera de los valores anteriores, por ejemplo, a una CI50 de 0,005 a 0,2 la CI50 de abatacept, a una CI50 de 0,1 a 1,5x la CI50 de abatacept, a una CI50 de 0,2x a 2x la CI50 de abatacept, etc. En determinadas realizaciones, una sola sustitución en los bucles
45 similares a CDR puede dar como resultado las diferencias anteriores en la CI50 en comparación con abatacept, donde la proteína de fusión CTLA4-Ig de la divulgación puede comprender tal sustitución y hasta 5 sustituciones adicionales, hasta 10 sustituciones adicionales, hasta 15 sustituciones adicionales o hasta 20 sustituciones adicionales en los bucles similares a CDR en comparación con abatacept.
6.8. Conjugados de Proteínas de CTLA4
Las proteínas de CTLA4 de la divulgación incluyen conjugados que se modifican, por ejemplo, por unión covalente de cualquier tipo de molécula a la proteína, de tal modo que la unión covalente no interfiere con la unión a CD80 o CD86.
55 En determinados aspectos, una proteína de CTLA4 de la divulgación puede conjugarse con una fracción efectora o una marca. La expresión "fracción efectora" tal como se usa en el presente documento, por ejemplo, incluye agentes antineoplásicos, fármacos, toxinas, proteínas biológicamente activas, por ejemplo enzimas, anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, polímeros de origen sintético o natural, ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN o ARN), radionúclidos, particularmente yodo radiactivo, radioisótopos, metales quelados, nanopartículas y grupos indicadores tales como compuestos fluorescentes o compuestos que pueden detectarse por RMN o espectroscopía RSE.
En un ejemplo, las proteínas de CTLA4 pueden conjugarse con una fracción efectora, tal como un agente citotóxico, un radionúclido o una fracción de un fármaco para modificar una respuesta biológica dada. La fracción efectora 65 puede ser una proteína un polipéptido, tal como, por ejemplo sin limitación, una toxina (tal como abrina, ricina A, exotoxina de Pseudomonas, o toxina diftérica), una molécula de señalización (tal como interferón α, interferón β,
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