ES2485384T3 - Plantas que tienen rasgos potenciados relacionados con el rendimiento y/o mayor resistencia al estrés abiótico y un procedimiento para fabricar las mismas - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para aumentar el rendimiento en plantas en condiciones de deficiencia de nitrógeno respecto a las plantas de control, que comprende introducir y expresar en una planta un ácido nucleico que codifica un polipéptido de tipo NAP-1, en el que el polipéptido de tipo NAP-1 comprende un dominio de NAP, en el que dicho polipéptido de tipo NAP-1 tiene una identidad de secuencia de al menos 80% o más con el polipéptido de tipo NAP-1 representado por la SEC ID Nº 2 y, además, en el que dicho polipéptido de tipo NAP-1 tiene sustancialmente la misma actividad biológica y funcional que la SEC ID Nº 2.

Description

Plantas que tienen rasgos potenciados relacionados con el rendimiento y/o mayor resistencia al estrés abiótico y un procedimiento para fabricar las mismas

La presente invención se refiere en general al campo de la biología molecular y se refiere a un procedimiento para potenciar varios rasgos relacionados con el rendimiento, económicamente importantes y mayor resistencia al estrés abiótico en plantas. Más específicamente, la presente invención se refiere a un procedimiento para potenciar los rasgos relacionados con el rendimiento en plantas cultivadas en condiciones de deficiencia de nitrógeno respecto a la planta control modulando la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de tipo 1 de la proteína del ensamblaje del nucleosoma (de tipo NAP1). La presente invención también se refiere a plantas que tienen expresión modulada de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de tipo NAP1, en el que las plantas tienen rasgos potenciados relacionados con el rendimiento respecto a las plantas control. También se divulga en el presente documento ácidos nucleicos codificados por YEP desconocidos hasta ahora y construcciones que comprenden los mismos, útiles en la realización de los procedimientos de la invención.

La población mundial en crecimiento y el suministro menguante de tierra arable disponible para agricultura está estimulando la investigación hacia el incremento de la eficiencia de la agricultura. Los medios convencionales para mejoras de cultivos y horticultura usan técnicas de siembra selectivas para identificar plantas que tengan características deseables. No obstante, dichas técnicas selectivas tienen varios inconvenientes, es decir, estas técnicas normalmente son muy laboriosas y dan lugar a plantas que a menudo contienen componentes genéticos heterogéneos que no siempre pueden hacer que el rasgo deseable se pase de las plantas parentales Los avances en biología molecular han permitido que la humanidad modifique el plasma germinal de los animales y las plantas. La modificación genérica de las plantas abarca el aislamiento y la manipulación de material genético (normalmente en forma de ARN o ARN) y la posterior introducción de dicho material genético en uAn planta. Dicha tecnología tiene la capacidad de liberar cultivos o plantas que tengan varios rasgos económicos, agronómicos u hortícolas mejorados. Un rasgo de interés económico concreto es el mayor rendimiento. El rendimiento normalmente se define como el producto mensurable de valor económico de un cultivo. Esto puede definirse en términos de cantidad y/o calidad.

El rendimiento depende directamente de varios factores, por ejemplo, del número y tamaño de los órganos, de la arquitectura de la planta (p. ej., el número de ramas), de la producción de semillas, de la senescencia de la hoja y más. El desarrollo de las raíces, la absorción de nutrientes, la tolerancia al estrés y el vigor temprano también pueden ser factores importantes para determinar el rendimiento. Por lo tanto, optimizar los factores mencionados anteriormente puede contribuir a incrementar el rendimiento de una cosecha.

El rendimiento de semillas es un rasgo particularmente importante, ya que las semillas de muchas plantas son importantes para la nutrición de seres humanos y animales. Cosechas tales como maíz, arroz, trigo, canola y soja representan más de la mitad del aporte calórico total de los seres humanos, ya sea a través del consumo directo de las propias semillas o a través del consumo de productos alimenticios generados con semillas procesadas. También son una fuente de azúcares, aceites y muchos tipos de metabolitos usados en procedimientos industriales. Las semillas contienen un embrión (la fuente de nuevos vástagos y raíces) y un endospermo (la fuente de nutrientes para el crecimiento del embrión durante la germinación y durante el crecimiento temprano de las plántulas). El desarrollo de una nueva semilla implica muchos genes y requiere la transferencia de metabolitos desde las raíces, las hojas y los tallos hasta la semilla en crecimiento. El endospermo, en particular, asimila los precursores metabólicos de carbohidratos, aceites y proteínas y los sintetiza como macromoléculas de almacenamiento para engordar el grano.

La biomasa de la planta es rendimiento para cultivos de forraje como la alfalfa, ensilaje y heno. Se han usado muchas aproximaciones para los cultivos de granos. Entre los principales se encuentran las estimaciones del tamaño de la planta. El tamaño de la planta se puede medir de muchos modos dependiendo de la especie y su estado de desarrollo, pero incluyen el peso total de la planta, el peso seco de la planta encima del suelo, el peso fresco de la planta encima del suelo, el área de la hoja, el volumen del tallo, la altura de la planta, el diámetro de la roseta, la longitud de la hoja, la longitud de la raíz, la masa de la raíz, el número de brotes y el número de hojas. Muchas especies mantienen una proporción conservada entre el tamaño de diferentes partes de la planta en un estadio del desarrollo dado. Estas relaciones alométricas se usan para extrapolar desde una de estas medidas del tamaño a la otra (p. ej., Tittonell et al 2005 Agric Ecosys & Environ 105: 213). El tamaño de la planta en una etapa del desarrollo temprana normalmente se correlacionará con el tamaño de la planta más tarde en el desarrollo. Una planta más grande con un área de la hoja más grande normalmente absorberá más luz y dióxido de carbono que una planta más pequeña y, por tanto, probablemente ganará mayor peso durante el mismo periodo (Fasoula & Tollenaar 2005 Maydica 50:39). Esto se añade a la potencial continuación del microambiente o la ventaja genética que la planta tenía que alcanzar el mayor tamaño inicialmente. Existe un fuerte componente genético para el tamaño de la planta y el índice de crecimiento (p. ej., ter Steege et al 2005 Plant Physiology 139:1078), y, por tanto, para una gama de diversos genotipos el tamaño de la planta en una condición ambiental es probable que se correlacione con el tamaño en otra (Hittalmani et al 2003 Theoretical Applied Genetics 107:679). De este modo se usa un ambiente estándar como aproximación para los diversos y dinámicos ambientes que se las cosechas en el campo se encuentran en diferentes localizaciones y tiempos.

El índice de recolección, la relación entre el rendimiento de semillas con respecto al peso seco por encima del suelo es relativamente estable en muchas condiciones ambientales y, de este modo, se puede obtener una muy buena correlación entre el tamaño de la planta y el rendimiento de los granos (por ejemplo, Rebetzke et al., 2002, Crop Science 42: 739. Estos procesos están intrínsecamente relacionados porque la mayor parte de la biomasa del grano depende de la productividad fotosintética presente o almacenada por las hojas y el tallo de la planta (Gardener et al., 1985, Physiology of Crop Plants. Iowa State University Press, pp68 -73). Por tanto, la selección del tamaño de la planta, incluso en etapas tempranas de desarrollo, se ha utilizado como un indicador del rendimiento potencial futuro (por ejemplo, Tittonell et al., 2005, Agric Ecosys & Environ 105: 213). Cuando se analiza el impacto de las diferencias genéticas sobre la tolerancia al estrés, la capacidad para estandarizar las propiedades del suelo, la temperatura, la disponibilidad de agua y de nutrientes y la intensidad de la luz es una ventaja intrínseca del invernadero o de los ambientes con cámaras de crecimiento de plantas en comparación con el campo. Sin embargo, las limitaciones artificiales en el rendimiento debido a una pobre polinización provocada por la ausencia de viento o de insectos, o insuficiente espacio para la maduración de la raíz o el desarrollo del follaje, pueden restringir el uso de estos ambientes controlados para analizar las diferencias de rendimiento. Por lo tanto, las mediciones del tamaño de la planta en el desarrollo temprano, en condiciones estándar en una cámara de crecimiento o invernadero, son prácticas estándar para proporcionar una indicación de las ventajas potenciales de rendimiento genético.

Otro rasgo importante para muchos cultivos es el vigor temprano. La mejora del vigor temprano es un importante objetivo de los modernos programas de cultivo del arroz en variedades cultivadas de arroz tanto templados como tropicales. Las raíces largas son importantes para el anclaje apropiado al suelo en arroz sembrado en agua. Cuando el arroz se siembra directamente en campos anegados y cuando las plantas deben emerger rápidamente a través del agua, los vástagos más largos se asocian al vigor. Cuando se practica la siembra en línea, los mesocotilos y los coleóptilos más largos son importantes para una buena emergencia de las plántulas. La capacidad para manipular genéticamente el vigor temprano en plantas sería de gran importancia en la agricultura. Por ejemplo, un vigor temprano escaso ha sido una limitación para la introducción de híbridos de maíz (Zea mays L.) basados en el germoplasma de Corn Belt en la Europa atlántica.

Un rasgo importante adicional es el de la tolerancia mejorada al estrés abiótico. El estrés abiótico es una causa principal de pérdida de cosechas en todo el mundo, reduciendo los rendimientos medios para la mayoría de las plantas de cultivo principales en más de 50% (Wang et ál., Planta (2003) 218: 1 -14). Los estreses abióticos pueden estar provocados por sequía, salinidad, extremos de temperatura, toxicidad química y estrés oxidativo. La capacidad para mejorar la tolerancia de las plantas al estrés abiótico sería de un gran beneficio económico para los agricultores de todo el mundo y permitiría el cultivo de cosechas en condiciones adversas y en territorios en los que el cultivo de las cosechas no es posible de otro modo.

Por lo tanto, el rendimiento de las cosechas puede incrementarse optimizando uno de los factores mencionados anteriormente.

Dependiendo del uso final, la modificación de ciertos rasgos de rendimiento puede favorecerse sobre otros. Por ejemplo, para aplicaciones tales como la producción de forraje o madera, o fuente de biocombustibles, puede ser deseable un incremento en las partes vegetativas de una planta, y para aplicaciones tales como producción de harina, almidón o aceite, puede ser particularmente deseable un incremento en los parámetros de las semillas. Incluso entre los parámetros de las semillas, algunos pueden ser favorecidos sobre otros, dependiendo de la aplicación. Diversos mecanismos pueden contribuir a incrementar el rendimiento de las semillas, ya sea en forma de tamaño incrementado de las semillas o en el número incrementado de semillas.

Un enfoque para incrementar el rendimiento (rendimiento de semillas y/o biomasa) en plantas puede ser a través de la modificación de los mecanismos de crecimiento inherentes de una planta, tales como el ciclo celular o diversas rutas de señalización implicadas en el crecimiento de las plantas o en mecanismos de defensa.

Sorprendentemente, actualmente se ha encontrado que modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica el polipéptido de tipo 1 de la proteína de ensamblaje del nucleosoma (de tipo NAP1) proporciona plantas con una mayor resistencia al estrés abiótico respecto a las plantas control.

Antecedentes

I. Polipéptido de tipo 1 de la proteína del ensamblaje del nucleosoma (de tipo NAP1)

Las proteínas NAP forman una familia de proteínas relacionadas que se conocen en animales y se ha comunicado que están implicadas en las actividades relacionadas con la cromatina. La familia de proteínas NAP se caracteriza por la presencia de una secuencia conservada conocida como el dominio NAP. El dominio NAP se describe en las bases de datos Pfam (acceso PF00956) e Interpro (acceso IPR002164). NAP es un componente de un complejo multifactorial que media en el empaquetamiento del ADN en nucleosomas (Krude, T. and Keller, C. (2001) Cell. Mol. Life Sci. 58, 665 -672). Durante la fase S del ciclo de división de las células eucariotas, el ADN replicado rápidamente se ensambla rápido en cromatina. Este proceso requiere la acción coordinada de varios factores, En las etapas iniciales, CAF1 (factor 1 de ensamblaje de cromatina) se une a las proteínas histonas H3 y H4 y las dirige al tridente de replicación mediante unión a PCNA. El posterior depósito de las proteínas histonas H2A y H2B está

mediado por las proteínas NAP1. La NAP1 fue descrita por primera vez en células HeLa (Lindern et al. (1992) Mol. Cell. Biol. 12, 3346 -3355) y después se encontró conservada en todos los eucariotas. Además, se piensa que las proteínas NAP regulan la transcripción génica y pueden influir en la diferenciación y desarrollo de las células.

Las proteínas SET están estrechamente relacionadas con las proteínas NAP y desempeñan un papel en varios procesos celulares en seres humanos. En las células humanas, se ha demostrado que las proteínas SET están asociadas con varios complejos de CDK-ciclina durante la regulación del ciclo celular, tal como la transición G2/M. SET es un potente inhibidor de la proteína fosfatasa 2A (PP2A), que está implicada en varias vías de señalización. La actividad inhibidora de SET podría atribuirse a un dominio C-terminal ácido (Canela et al. (2003) J. Biol. Chem. 278, 1158 -1164). Otros informes muestran la implicación de SET en la reparación y transcripción del ADN. SET es parte de un complejo que tiene actividades de unión al ADN y de plegamiento mediadas por la proteína HMG2 asociada a la cromatina. La HMG2 facilita el ensamblaje de estructuras de orden mayor de las nucleoproteínas doblando y i circulando el ADN o estabilizando el ADN no subenrollado. HMG2 coprecipita con SET (Fan et al, (2002) Mol. Cell. Biol. 22, 2810 -2820). También se ha notificado que SET inhibe la desmetilación activa del ADN (Cervoni et al. (2002) J. Biol. Chem. 277, 25026 -25031). La oncoproteína Set/TAF-I, implicada en la inhibición de la acetilación de las histonas también inhibe la desmetilación del ADN metilado ectópicamente que da lugar a silenciación génica. Se ha sugerido que Set/TAF-I desempeña un papel en la integración de estratos epigenéticos y ADN en la regulación génica,

La actividad de las proteínas NAP1 está regulada en parte por la fosforilación. Se ha demostrado que la localización subcelular de NAP1 en Drosophila depende de su estado de fosforilación, que puede estar controlada por la caseína quinasa II (Rodriguez at al (2000) J. Mol. Biol. 298, 225 -238). Se ha notificado que los mamíferos poseen varias proteínas NAP1, mientras que en las levaduras solo hay una proteína NAP1 conocida.

Los ortólogos de NPA1 vegetal siguen siendo muy desconocidos, aunque se ha notificado proteínas NAP1 de soja (Yoon et al (1995) Mol. Gen. Genet. 249, 465 -473), Arabidopsis, tabaco, maíz y arroz (Dong et al. (2003) Planta 216, 561 -570). El análisis filogenético de los genes de tipo NAP1 vegetales ha revelado que existen dos subgrupos, uno relacionado con NAP1 y otro para la proteína SET (Figura 1). Lo más probablemente, se puede haber producido una divergencia de secuencias tardía, ya que las dos secuencias de Arabidopsis, las dos de maíz y las dos de tabaco se agrupan apuntando a un efecto de duplicación génica más reciente. El genoma de Saccharomyces cerevisiae contiene solo un gen que codifica NAP, que combina las propiedades funcionales de los subgrupos NAP1 y SET. De un modo similar, el factor de activación del molde 1 (TAF-1), un homólogo de NAP1, combina la actividad de inhibición de PP2a (Saito et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 259, 471 -475, 1999) y la actividad de remodelado de la cromatina (Kawase et al., Genes Cells 1, 1045 -1056, 1996). Por consiguiente, es probable que las proteínas vegetales de la familia de NAP/SET sean considerablemente redundantes en función, particularmente en el grupo de proteínas SET, en el que se observa un menor grado de divergencia en comparación con el grupo NAP. Adicionalmente, existen pruebas estructurales de que las proteínas NAP y SET pertenecen a la misma familia, ya que comparten el dominio NAP, seguido de una región ácida en el extremo C.

Se conoce poco sobre la función de las proteínas de tipo NAP1 en plantas, aunque se ha propuesto un papel en la mitosis y en la citocinesis (Dong et al 2003). Los ortólogos vegetales de la proteína NAP1 muy probablemente desempeñan un papel diferente al de sus homólogos animales. En base a su localización nuclear y a las similitudes de secuencia con la proteína SET de mamífero, se puede esperar un papel en el remodelado de la cromatina para las proteínas vegetales. Adicionalmente, el grupo de proteínas vegetales NAP/SET podría estar implicado en la regulación de PP2A en plantas. PP2A es una de las principales fosfatasas en las plantas y actúa en gran medida sobre los factores de transcripción y proteínas quinasas y se ha propuesto que regulan la actividad de las proteínas implicadas en varios procesos celulares, incluyendo el ciclo celular (Ayaydin et al. (2000) Plant J. 23, 85 -96), las acciones hormonales tales como el movimiento de los estomas mediado por ABA, la germinación (Kwak et. al. (2002) Plant Cell 14, 2849 -2861), o el transporte de las euxinas y el desarrollo de las raíces (Garbers et al 1996 EMBO J. 15, 2115 -2124). La PP2A también se ha notificado que está implicada en la fotosíntesis y la señalización ligera (Sheen (1993) EMBO J. 12, 3497 -3505) y en la asimilación de nitrógeno (Hirose y Yamaya (1999) Plant Physiology 121, 805 -812). El documento WO 2005/094562 divulga el uso de proteínas de tipo NAP1 para aumentar el rendimiento, pero que permanecen silentes sobre los efectos de la expresión modulada de las proteínas de tipo NAP1 en plantas que sufren estrés abiótico.

Definiciones

Polipéptidos (s) / Proteína (s)

Los términos "polipéptido" y "proteína" se utilizan indistintamente en el presente documento y se refieren a aminoácidos en una forma polimérica de cualquier longitud, unidos por medio de enlaces peptídicos.

Polinucleótido (s) / Ácido (s) nucleico (s) / Secuencia (s) de ácido nucleico / Secuencia (s) de nucleótidos

Los términos "Polinucleótido (s)", "secuencia (s) de ácido nucleico", "secuencia (s) de nucleótidos", "acido (s) nucleico (s) ", “molécula de ácido nucleico” se utilizan indistintamente en el presente documento y se refieren a nucleótidos, ya sea ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos o una combinación de ambos, en una forma polimérica

no ramificada de cualquier longitud.

Planta (s) de control

La elección de plantas de control adecuadas es una parte habitual de un sistema experimental y puede incluir plantas silvestres correspondientes o plantas correspondientes sin el gen de interés. Típicamente, la planta de control es de la misma especie de planta o incluso de la misma variedad que la planta que va a evaluarse. La planta de control también puede ser un nulicigoto de la planta que va a evaluarse. Los nulicigotos son individuos que carecen del transgén por segregación. Una "planta de control" tal como se utiliza en el presente documento se refiere no solo a plantas enteras, sino también a partes de plantas, incluyendo semillas y partes de la semilla.

Homólogo (s)

Los "homólogos" de una proteína abarcan péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas y enzimas que tienen sustituciones, deleciones y/o inserciones con relación a la proteína no modificada en cuestión y que tienen una actividad biológica y funcional similar a la proteína no modificada de la que se derivan.

Una deleción se refiere a la eliminación de uno o más aminoácidos de una proteína.

Una inserción se refiere a que uno o más residuos de aminoácido se introducen en un sitio predeterminado en una proteína. Las inserciones pueden comprender fusiones N-terminales y/o C-terminales así como inserciones intrasecuenciales de uno solo o múltiples aminoácidos. Generalmente, las inserciones dentro de la secuencia de aminoácidos serán más cortas que las fusiones N-o C-terminales, del orden de aproximadamente 1 a 10 residuos. Ejemplos de proteínas o péptidos de fusión N-o C-terminales incluyen el dominio de unión o el dominio de activación de un activador de la transcripción que se usa en el sistema de dos híbridos de levadura, proteínas de recubrimiento de fagos, marcador de (histidina) -6, etiqueta de glutatión S-transferasa, proteína A, proteína de unión a maltosa, dihidrofolato reductasa, epítopo Tag01 0, epítopo de cmyc, epítopo FLAG®-, lacZ, CMP (péptido de unión a calmodulina), epítopo de HA, epítopo de proteína C y epítopo de VSV.

Una sustitución se refiere al reemplazo de aminoácidos de la proteína por otros aminoácidos que tienen propiedades similares (tales como hidrofobia, hidrofilia, antigenicidad, propensión a formar o romper estructuras α-helicoidales o estructuras de lámina β similares). Típicamente, las sustituciones de aminoácidos son de residuos individuales, pero pueden agruparse dependiendo de las restricciones funcionales impuestas al polipéptido; habitualmente las inserciones serán del orden de aproximadamente 1 a 10 residuos aminoácidos. Preferentemente, las sustituciones de aminoácidos son sustituciones conservadoras de aminoácidos. Las tablas de sustituciones conservadoras son muy conocidas en la técnica (véanse, por ejemplo, Creighton (1984) Proteins. W.H. Freeman and Company y la Tabla 1 a continuación).

Tabla 1: Ejemplos de sustituciones de aminoácidos conservadas

Residuo

Sustituciones conservadoras Residuo Sustituciones conservadoras

Ala

Ser Leu Ile; Val

Arg

Lys Lys Arg; Gln

Asn

Gln; His Met Leu; Ile

Asp

Glu Phe Met; Leu; Tyr

Gln

Asn Ser Thr; Gly

Cys

Ser Thr Ser; Val

Glu

Asp Trp Tyr

Gly

Pro Tyr Trp; Phe

His

Asn; Gln Val Ile; Leu

Ile

Leu, Val

Las sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos pueden realizarse fácilmente usando técnicas sintéticas para péptidos muy conocidas en la materia, tales como síntesis de péptidos en fase sólida y similares, o mediante manipulación de DNA recombinante. Procedimientos para la manipulación de secuencias de DNA para producir variantes de sustitución, inserción o deleción de una proteína son muy conocidos en la técnica. Por ejemplo, técnicas para realizar mutaciones de sustitución en sitios predeterminados del DNA son muy conocidas por los expertos en la materia e incluyen mutagénesis M13, mutagénesis in vitro T7-Gen (USB, Cleveland, OH),

mutagénesis dirigida QuickChange (Stratagene, San Diego, CA), mutagénesis dirigida mediada por PCR u otros protocolos de mutagénesis dirigida al sitio.

Derivados

Los "derivados" incluyen péptidos, oligopéptidos, polipéptidos que pueden, en comparación con la secuencia de aminoácidos de la forma presente en la naturaleza de la proteína, tal como la proteína de interés, comprender sustituciones de aminoácidos por residuos de aminoácido no presentes en la naturaleza, o adiciones de residuos de aminoácidos no presentes en la naturaleza. Los "derivados" de una proteína también abarcan péptidos, oligopéptidos, polipéptidos que comprenden residuos de aminoácidos alterados presentes en la naturaleza (glicosilados, acilados, prenilados, fosforilados, miristoilados, sulfatados etc.) o residuos de aminoácidos alterados no naturalmente en comparación con la secuencia de aminoácidos de una forma presente en la naturaleza del polipéptido. Un derivado también puede comprender uno o más sustituyentes o adiciones no aminoacídicas en comparación con la secuencia de aminoácidos de la que se deriva, por ejemplo una molécula indicadora u otro ligando, unido covalentemente o no covalentemente a la secuencia de aminoácidos, tal como una molécula indicadora que se une para facilitar su detección, y residuos de aminoácidos no presentes en la naturaleza con relación a la secuencia de aminoácidos de una proteína presente en la naturaleza. Además, "derivados" también incluye fusiones de la forma de origen natural de la proteína con péptidos marcadores tales como FLAG, HlS6 o tiorredoxina (para una revisión de los péptidos marcadores, véase Terpe, App. Microbiol. Biotechnol. 60, 523 -533, 2003).

Ortólogo (s) /Parálogo (s)

Los ortólogos y los parálogos abarcan conceptos evolutivos usados para describir las relaciones ancestrales de los genes. Los parálogos son genes dentro de la misma especie que se han originado a través de la duplicación de un gen ancestral, los ortólogos son genes procedentes de organismos diferentes que se han originado a través de especiación, y se derivan también de un gen ancestral común.

Dominio

El término "dominio" se refiere a un conjunto de aminoácidos conservado en posiciones específicas a lo largo de un alineamiento de secuencias de proteínas relacionadas evolutivamente. Aunque los aminoácidos en otras posiciones pueden variar entre homólogos, los aminoácidos que están muy conservados en posiciones específicas indican aminoácidos que probablemente son esenciales en la estructura, la estabilidad o la función de una proteína. Identificados por su alto grado de conservación en secuencias alineadas de una familia de homólogos de proteína, pueden usarse como identificadores para determinar si cualquier polipéptido en cuestión pertenece a una familia de polipéptidos identificada previamente.

Motivo/Secuencia de consenso/Firma

El término "motivo" o "secuencia de consenso" o "firma" se refiere a una región conservada corta en la secuencia de proteínas relacionadas evolutivamente. Los motivos son frecuentemente partes muy conservadas de dominios, pero también pueden incluir solo parte del dominio, o estar situados fuera del dominio conservado (si todos los aminoácidos del motivo están fuera de un dominio definido).

Hibridación

El término "hibridación", según se define en el presente documento es un procedimiento en el que secuencias de nucleótidos complementarias sustancialmente homólogas se reasocian entre sí. El procedimiento de hibridación puede producirse totalmente en solución, es decir ambos ácidos nucleicos complementarios están en solución. El

procedimiento

de hibridación también puede producirse con uno de los ácidos nucleicos complementarios

inmovilizado

a una matriz tal como cuentas magnéticas, cuentas de Sep harose y cualquier otra resina. El

procedimiento

de hibridación puede producirse además con uno de los ácidos nucleicos complementarios

inmovilizado a un soporte sólido tal como una membrana de nitrocelulosa o nailon o inmovilizado, p. ej., mediante fotolitografía en, por ejemplo, un soporte vítreo silíceo (posteriormente conocido como matrices o micromatrices de ácidos nucleicos o como chips de ácidos nucleicos). A fin de permitir que se produzca la hibridación, las moléculas de ácido nucleico generalmente se desnaturalizan térmicamente o químicamente para fundir una doble hebra en dos hebras simples y/o para eliminar las horquillas u otras estructuras secundarias de ácidos nucleicos monocatenarios.

El término "rigurosidad" se refiere a las condiciones en las cuales tiene lugar una hibridación. La rigurosidad de la hibridación está influenciada por condiciones tales como la temperatura, la concentración salina, la fuerza iónica y la composición del tampón de hibridación. En general, las condiciones de baja rigurosidad se seleccionan de modo que sean aproximadamente 30 ºC menos que el punto de fusión térmica (Tf) para la secuencia específica a un pH y fuerza iónica definidos. Las condiciones de rigurosidad media se dan en los casos en los que la temperatura está 20°C por debajo de la Tm, y las condiciones de alta rigurosidad se dan en los casos en los que la temperatura está 10°C por debajo de la Tm. Las condiciones de hibridación de alta rigurosidad se utilizan típicamente para aislar las secuencias de hibridación que tienen una gran similitud de secuencia con la secuencia del ácido nucleico diana. Sin embargo, las secuencias de ácido nucleico pueden desviarse en la secuencia e incluso codificar un polipéptido

sustancialmente idéntico, debido a la degeneración del código genético. Por lo tanto, a veces pueden ser necesarias condiciones de hibridación de rigurosidad media para identificar tales moléculas de ácido nucleico.

La Tm es la temperatura (a fuerza iónica y pH definidos) a la que el 50 % de una secuencia objetivo complementaria hibrida una sonda perfectamente apareada. La Tm depende de las condiciones de la solución y de la composición base y la longitud de la sonda. Por ejemplo, las secuencias más largas hibridan específicamente a temperaturas más elevadas. La velocidad máxima de hibridación se obtiene aproximadamente desde 16°C hasta 32°C por debajo de la Tm. La presencia de cationes monovalentes en la solución de hibridación reduce la repulsión electrostática entre las dos hebras de la secuencia de ácido nucleico promoviendo de ese modo la formación del híbrido; este efecto es visible para concentraciones de sodio de hasta 0,4 M (para concentraciones superiores, este efecto puede ignorarse). La formamida reduce la temperatura de fusión de los dúplex de ADN-ADN y ADN-ARN con de 0,6 a 0,7°C para cada porcentaje de formamida, y la adición de formamida al 50% permite que la hibridación se realice a de 30 a 45°C, aunque el grado de hibridación se reducirá. Las discordancias de pares de bases reducen el grado de hibridación y la estabilidad térmica de los dúplex. De media y para sondas grandes, la Tm disminuye aproximadamente 1°C por % de discordancia de bases. La Tm puede calcularse usando las siguientes ecuaciones, dependiendo de los tipos de híbridos:

1) Híbridos de ADN-ADN (Meinkoth y Wahl, Anal. Biochem., 138: 267 -284, 1984):

2) Híbridos de ADNA-ARN o ARNA-ARN:

3) Híbridos de oligo-ADN u oligo-ARNd.

Para <20 nucleótidos: Tm= 2 (In)

Para 20-35 nucleótidos: Tm= 22 + 1,46 (In)

a o para otro catión monovalente, pero solo exacto en el intervalo 0,01-0,4 M

b solo exacto para %GC en el intervalo de 30% a 75%.

c L = longitud del dúplex en pares de bases.

d Oligo, oligonucleótido; In, longitud efectiva de cebador = 2 (nº de G/C) + (nº de A/T).

La unión no específica puede controlarse usando una cualquiera de un número de técnicas conocidas tales como, por ejemplo, bloquear la membrana con soluciones que contienen proteínas, adiciones de heterólogos de ARN, ADN, y SDS al tampón de hibridación, y tratamiento con Rnasa. Para sondas no homólogas, puede realizarse una serie de hibridaciones al variar uno de (I) disminuir progresivamente la temperatura de reasociación (por ejemplo de 68°C a 42°C) o (II) disminuir progresivamente la concentración de formamida (por ejemplo de 50% a 0%). El experto conoce diversos parámetros que pueden alterarse durante la hibridación y que bien mantendrán o bien cambiarán las condiciones de rigurosidad.

Además de las condiciones de hibridación, la especificidad de la hibridación típicamente también depende de la función de los lavados posteriores a la hibridación. Para eliminar el fondo resultante de la hibridación no específica, las muestras se lavan con soluciones salinas diluidas. Factores críticos de tales lavados incluyen la fuerza iónica y la temperatura de la solución de lavado final: cuanto menor es la concentración de sal y mayor es la temperatura de lavado, mayor será la rigurosidad del lavado. Las condiciones de lavado se establecen típicamente en o por debajo de la rigurosidad de la hibridación. Una hibridación positiva da una señal que es al menos dos veces la del fondo. Generalmente, condiciones restrictivas adecuadas para los ensayos de hibridación de ácidos nucleicos o procedimientos de detección de amplificación génica son como se han indicado anteriormente. También pueden seleccionarse condiciones más o menos rigurosas. El experto conoce diversos parámetros que pueden alterarse durante la el lavado y que bien mantendrán o bien cambiarán las condiciones de rigurosidad.

Por ejemplo, las condiciones de hibridación de alta rigurosidad típicas para híbridos de ADN más largos de 50 nucleótidos abarcan la hibridación a 65°C en 1 x SSC o a 42°C en 1 x SSC y formamida al 50%, seguido de lavado a 65°C en 0,3 x SSC. Ejemplos de condiciones de hibridación de rigurosidad media típicas para híbridos de ADN más largos de 50 nucleótidos abarcan la hibridación a 50°C en 1 x SSC o a 40°C en 1 x SSC y formamida al 50%, seguido de lavado a 50°C en 0,3 x SSC. La longitud del híbrido es la longitud anticipada para el ácido nucleico que se hibrida. Cuando se hibridan ácidos nucleicos de secuencia conocida, la longitud del híbrido puede determinarse alineando las secuencias e identificando las regiones conservadas descritas en el presente documento. 1 x SSC es NaCl 0,15 M y citrato sódico 15 mM; la solución de hibridación y las soluciones de lavado pueden incluir adicionalmente 5 x reactivo de Denhardt, SDS al 0,5-1, 0%, 100 μg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado fragmentado, pirofosfato sódico al 0,5%.

Con el propósito de definir el nivel de rigurosidad, puede hacerse referencia a Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3ª Edición, Cold Spring Harbor Laborator y Press, CSH, Nueva York o a Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989 actualizaciones anuales).

Variante de corte y empalme

El término "variante de corte y empalme", según se usa en el presente documento, abarca variantes de una secuencia de ácido nucleico en la que intrones y/o exones seleccionados se han cortado, reemplazado, desplazado

o añadido, o en la que los intrones se han acortado o alargado. Tales variantes serán unas en las que la actividad biológica de la proteína se retiene sustancialmente; esto puede alcanzarse reteniendo selectivamente segmentos funcionales de la proteína. Tales variantes de corte y empalme pueden encontrarse en la naturaleza o pueden ser artificiales. Procedimientos para predecir y aislar tales variantes de corte y empalme son muy conocidos en la especialidad (véase, por ejemplo, Foissac y Schiex, BMC Bioinformatics 6: 25).

Variante alélica

Los alelos o variantes alélicas son formas alternativas de un gen dado, situadas en la misma posición cromosómica. Las variantes alélicas abarcan polimorfismos de un solo nucleótido (SNP), así como polimorfismos de inserción/deleción pequeña (INDEL). El tamaño de los INDEL es habitualmente menor de 100 pb. Los SNP y los INDEL forman el mayor conjunto de variantes de secuencia en cepas polimórficas presentes en la naturaleza de la mayoría de los organismos.

Redistribución génica/Evolución dirigida

La redistribución génica o evolución dirigida consiste en repeticiones de redistribución de ADN seguidas de la detección selectiva y/o selección adecuadas para generar variantes de ácidos nucleicos o porciones de los mismos que codifican proteínas que tienen una actividad biológica modificada (Castle et ál., (2004) Science 304 (5674) : 1151 -4 y las Patentes de Estados Unidos 6.395.547 y 6.395.547).

Elemento regulador/Secuencia de control/Promotor

Las expresiones "elemento regulador", "secuencia de control" y "promotor" se usan todos indistintamente en el presente documento y han de tomarse en un contexto amplio para referirse a secuencias de ácido nucleico reguladoras capaces de efectuar la expresión de las secuencias a las que están ligadas. El término "promotor" se refiere típicamente a una secuencia de control de ácido nucleico situada cadena arriba del inicio de la transcripción de un gen y que está implicada en el reconocimiento y la unión de la ARN polimerasa y otras proteínas, dirigiendo de ese modo la transcripción de un ácido nucleico unido operativamente. Los términos y expresiones mencionados anteriormente están abarcados por las secuencias reguladoras de la transcripción derivadas de un gen eucariótico clásico (incluyendo la "caja" TATA que se requiere para la iniciación exacta de la transcripción, con o sin una secuencia de caja CCAAT) y elementos reguladores adicionales (es decir, secuencias activadoras, estimuladores y silenciadores aguas arriba) que alteran la expresión génica en respuesta a estímulos de desarrollo y/o externos, o de un modo específico para un tejido. También se incluye dentro del término una secuencia reguladora de la transcripción de un gen procariótico clásico, en cuyo caso puede incluir una secuencia de caja -35 y/o secuencias reguladoras de la transcripción de la caja -10. La expresión "elemento regulador" también abarca una molécula de fusión o derivado sintético que confiere, activa o potencia la expresión de una molécula de ácido nucleico en una célula, un tejido o un órgano.

Un "promotor vegetal" comprende elementos reguladores, que median en la expresión de un segmento de secuencia codificante en células vegetales. De acuerdo con esto, un promotor vegetal no necesita ser de origen vegetal, sino que puede originarse a partir de virus o microorganismos, por ejemplo a partir de virus que atacan células vegetales. El "promotor vegetal" también puede originarse a partir de una célula vegetal, p. ej. procedente de la planta que se transforma con la secuencia de ácido nucleico que va a expresarse en el procedimiento de la invención y se describe en el presente documento. Esto también se aplica a otras señales reguladoras "vegetales", tales como terminadores "vegetales". Los promotores cadena arriba de las secuencias de nucleótidos útiles en los procedimientos de la presente divulgación pueden modificarse mediante una o más sustitución o sustituciones, inserción o inserciones y/o deleción o deleciones de nucleótidos sin interferir en la funcionalidad o la actividad de cualquiera de los promotores, el marco de lectura abierto (ORF) o la región reguladora en 3’ tales como terminadores u otras regiones reguladoras 3’ que están situados más allá del ORF. Por otra parte, es posible que la actividad de los promotores se incremente mediante la modificación de su secuencia, o que se reemplacen completamente por promotores más activos, incluso promotores procedentes de organismos heterólogos. Para la expresión en plantas, la molécula de ácido nucleico, según se ha descrito anteriormente, debe estar unida de forma operable o comprender un promotor adecuado que expresa el gen en el punto temporal correcto y con el patrón de expresión espacial requerido.

Para la identificación de promotores funcionalmente equivalentes, la fuerza del promotor y/o el patrón de expresión de un promotor candidato pueden analizarse, por ejemplo, uniendo de forma operable el promotor a un gen indicador y analizando el nivel de expresión y el patrón del gen indicador en diversos tejidos de la planta. Genes indicadores muy conocidos adecuados incluyen, por ejemplo, ß-glucuronidasa o ß-galactosidasa. La actividad del

promotor se analiza midiendo la actividad enzimática de la ß-glucuronidasa o la ß-galactosidasa. La fuerza y/o el patrón de expresión del promotor pueden compararse a continuación con los de un promotor de referencia (tal como el usado en los procedimientos divulgados en el presente documento). Alternativamente, la fuerza del promotor puede analizarse cuantificando los niveles de ARNm o comparando los niveles de ARNm del ácido nucleico usado 5 en los procedimientos de la presente invención con los niveles de ARNm de genes domésticos, tal como ARNr de 18S, usando procedimientos conocidos en la materia, tales como transferencia DE TIPO Northern con análisis densitométricos de autorradiogramas, PCR o RT-PCR cuantitativa en tiempo real (Held et ál., 1996 Genome Methods 6: 986 -994). Generalmente, por "promotor débil" se entiende un promotor que dirige la expresión de una secuencia codificante a bajo nivel. Por "bajo nivel" se entiende a niveles de aproximadamente 1/10.000 transcritos a

10 aproximadamente 1/100.000 transcritos, hasta aproximadamente 1/500.0000 transcritos por célula. Por el contrario, un "promotor fuerte" dirige la expresión de una secuencia codificante a alto nivel, o a de aproximadamente 1/10 transcritos a aproximadamente 1/100 transcritos a aproximadamente 1/1.000 transcritos por célula.

Operablemente unido

La expresión “operablemente unido” como se usa en el presente documento, se refiere a un enlace funcional entre la 15 secuencia promotora y el gen de interés, de modo que la secuencia promotora sea capaz de iniciar la transcripción del gen de interés.

Promotor constitutivo

Un "promotor constitutivo" se refiere a un promotor que es activo en la transcripción durante la mayoría de las fases de crecimiento y desarrollo, aunque no necesariamente en todas, y en la mayoría de las condiciones ambientales, 20 en al menos una célula, tejido u órgano. La Tabla 2a siguiente proporciona ejemplos de promotores constitutivos

Tabla 2a: Ejemplos de promotores constitutivos

Fuente del Gen

Referencia

Actina

McElroy et al, Plant Cell, 2: 163 -171, 1990

HMGP

Documento WO 2004/000660

CAMV 35S

Odell et al, Nature, 313: 810 -812, 1985

CaMV 19S

Nilsson et al., Physiol. Plant. 100:456 -462, 1997

GOS2

de Pater et al, Plant J Nov;2(6):837 -44, 1992, WO 2004/065596

Ubiquitina

Christensen et al, Plant Mol. Biol. 18: 675 -689, 1992

Ciclofilina del arroz

Buchholz et al, Plant Mol Biol. 25(5): 837 -43, 1994

Histona H3 del maíz

Lepetit et al, Mol. Gen. Genet. 231:276 -285, 1992

Histona H3 de la alfalfa

Wu et al. Plant Mol. Biol. 11:641 -649, 1988

Actina 2

An et al, Plant J. 10(1); 107 -121, 1996

34S FMV

Sanger et al., Plant. Mol. Biol., 14, 1990: 433 -443

Subunidad pequela de Rubisco

Documento US 4.962.028

OCS

Leisner (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85(5): 2553

SAD1

Jain et al., Crop Science, 39 (6), 1999: 1696

SAD2

Jain et al., Crop Science, 39 (6), 1999: 1696

nos

Shaw et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12(20):7831 -7846

V-ATPasa

Documento WO 01/14572

Promotor super

Documento WO 95/14098

Proteínas de la caja G

Documento WO 94/12015

Promotor ubicuo

Un promotor ubicuo es activo sustancialmente en todos los tejidos o células de un organismo.

Promotor regulado por desarrollo

Un promotor regulado por desarrollo es activo durante ciertas etapas del desarrollo o en partes de la planta que 5 experimentan cambios en el desarrollo.

Promotor inducible

Un promotor inducible tiene una iniciación de la transcripción inducida o incrementada en respuesta a un producto químico (para una revisión, véase Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48:89-108), un estímulo ambiental o físico, o puede ser "inducible por estrés", es decir activarse cuando una planta se expone a diversas

10 condiciones de estrés, o "inducible por patógenos", es decir activarse cuando una planta se expone a diversos patógenos.

Promotor específico de un órgano/específico de un tejido

Un promotor específico de un órgano o específico de un tejido es uno que es capaz de iniciar preferentemente la transcripción en ciertos órganos o tejidos, tales como las hojas, las raíces, el tejido seminal, etc. Por ejemplo, un 15 "promotor específico de las raíces" es un promotor transcripcionalmente activo predominantemente en raíces de plantas, sustancialmente hasta la exclusión de cualesquiera otras partes de una planta, aunque sin embargo se permite alguna expresión carente estas otras partes de la planta. Los promotores capaces de iniciar la transcripción únicamente en ciertas células se denominan en el presente documento "específicos de una célula". Un promotor específico de la semilla es transcripcionalmente activo predominantemente en el tejido seminal, pero no 20 necesariamente exclusivamente en el tejido seminal (en los casos de expresión con pérdidas). El promotor específico de la semilla puede estar activo durante el desarrollo de la semilla y/o durante la germinación. El promotor específico de la semilla puede ser específico del endospermo/aleurona/embrión. Ejemplos de promotores específicos de la semilla se muestran en las Tablas 2b, 2c, 2d y 2e a continuación. Otros ejemplos de promotores específicos de la semilla se proporcionan en Qing Qu and Takaiwa (Plant Biotechnol. J. 2, 113 -125, 2004), cuya

25 divulgación se incorpora por referencia en el presente documento como se establece completamente.

Tabla 2b: Ejemplos de promotores específicos de la semilla

Fuente del Gen

Referencia

genes específicos de la semilla

Simon et al., Plant Mol. Biol. 5: 191, 1985;

Scofield et al., J. Biol. Chem. 262: 12202, 1987;

Baszczynski et al., Plant Mol. Biol. 14: 633, 1990.

Albúmina de la nuez de Brasil

Pearson et al., Plant Mol. Biol. 18: 235 -245, 1992.

leguminosa

Ellis et al., Plant Mol. Biol. 10: 203 -214, 1988.

Glutelina (arroz)

Takaiwa et al., Mol. Gen. Genet. 208: 15 -22, 1986;

Takaiwa et al., FEBS Letts. 221: 43 -47, 1987.

zeína

Matzke et al Plant Mol Biol, 14(3):323 -32 1990

napA

Stalberg et al, Planta 199: 515 -519, 1996.

Glutenina-1 de trigo de BPM y APM

Mol Gen Genet 216:81 -90, 1989; NAR 17:461 -2, 1989

SPA del trigo

Albani et al, Plant Cell, 9: 171 -184, 1997

α, β, γ-gliadinas del trigo

EMBO J. 3:1409 -15, 1984

Promotor Itr1 de la cebada

Diaz et al. (1995) Mol Gen Genet 248(5):592 -8

Hordeína B1, C, D, de la cebada

Theor Appl Gen 98:1253 -62, 1999; Plant J 4:343 -55, 1993; Mol Gen Genet 250:750 -60, 1996

DOF de la cebada

Mena et al, The Plant Journal, 116(1): 53 -62, 1998

blz2

Documento EP99106056.7

(continuación)

Fuente del Gen

Referencia

promotor sintético

Vicente-Carbajosa et al., Plant J. 13: 629 -640, 1998.

Prolamina NRP33 del arroz

Wu et al, Plant Cell Physiology 39(8) 885 -889, 1998

a-globulin Glb-1 del arroz

Wu et al, Plant Cell Physiology 39(8) 885 -889, 1998

OSH1 del arroz

Sato et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117 -8122, 1996

α-globulina REB/OHP-1del arroz

Nakase et al. Plant Mol. Biol. 33: 513 -522, 1997

ADP-glucosa pirofosforilasa del arroz

Trans Res 6:157 -68, 1997

Familia del gen del ESR del maíz

Plant J 12:235 -46, 1997

α-kafirina del sorgo

DeRose et al., Plant Mol. Biol 32:1029 -35, 1996

KNOX

Postma-Haarsma et al, Plant Mol. Biol. 39:257 -71, 1999

Oleosina del arroz

Wu et al, J. Biochem. 123:386, 1998

Oleosina del girasol

Cummins et al., Plant Mol. Biol. 19: 873 -876, 1992

PRO0117, proteína ribosómica 40S del arroz

Documento WO 2004/070039

Alanina aminotransferasa PRO0136, del arroz

No publicada

PRO0147, inhibidor de la tripsina ITR1 (cebada)

No publicada

PRO0151, WSI18 de arroz

Documento WO 2004/070039

PRO0175, RAB21 de arroz

Documento WO 2004/070039

PRO005

Documento WO 2004/070039

PRO0095

Documento WO 2004/070039

α-amilasa (Amy32b)

Lanahan et al, Plant Cell 4:203 -211, 1992; Skriver et al, Proc Natl Acad Sci documento USA 88:7266 -7270, 1991

Gen de tipo catepsina β

Cejudo et al, Plant Mol Biol 20:849 -856, 1992

Ltp2 de cebada

Kalla et al., Plant J. 6:849 -60, 1994

Chi26

Leah et al., Plant J. 4:579 -89, 1994

B-Peru de maíz

Selinger et al., Genetics 149;1125 -38.1998

Tabla 2c: ejemplos de promotores específicos del endospermo

Fuente del Gen

Referencia

Glutelina (arroz)

Takaiwa et al. (1986) Mol Gen Genet 208:15 -22; Takaiwa et al. (1987) FEBS Letts. 221:43 -47

zeína

Matzke et al., (1990) Plant Mol Biol 14(3): 323 -32

Glutenina-1 de trigo de BPM y APM

Colot et al. (1989) Mol Gen Genet 216:81 -90, Anderson et al. (1989) NAR 17:461 -2

SPA del trigo

Albani et al. (1997) Plant Cell 9:171 -184

Gliadinas del trigo

Rafalski et al. (1984) EMBO 3:1409 -15

(continuación)

Fuente del Gen

Referencia

Promotor Itr1 de la cebada

Diaz et al. (1995) Mol Gen Genet 248(5):592 -8

Hordeína B1, C, D, de la cebada

Cho et al. (1999) Theor Appl Genet 98:1253 -62; Muller et al. (1993) Plant J 4:343 -55; Sorenson et al. (1996) Mol Gen Genet 250:750 -60

DOF de la cebada

Mena et al, (1998) Plant J 116(1): 53 -62

blz2

Onate et al. (1999) J Biol Chem 274(14):9175 -82

promotor sintético

Vicente-Carbajosa et al. (1998) Plant J 13:629 -640

Prolamina NRP33 del arroz

Wu et al, (1998) Plant Cell Physiol 39(8) 885 -889

Globulin Glb-1 del arroz

Wu et al. (1998) Plant Cell Physiol 39(8) 885 -889

globulina REB/OHP-1 del arroz

Nakase et al. (1997) Plant Molec Biol 33: 513 -522

ADP-glucosa pirofosforilasa del arroz

Russell et al. (1997) Trans Res 6:157 -68

Familia del gen del ESR del maíz

Opsahl-Ferstad et al. (1997) Plant J 12:235 -46

kafirina del sorgo

DeRose et al. (1996) Plant Mol Biol 32:1029 -35

Tabla 2d: Ejemplos de promotores específicos del embrión

Fuente del Gen

Referencia

OSH1 del arroz

Sato et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117 -8122, 1996

KNOX

Postma-Haarsma et al, Plant Mol. Biol. 39:257 -71, 1999

PRO0151

Documento WO 2004/070039

PRO0175

Documento WO 2004/070039

PRO005

Documento WO 2004/070039

PRO0095

Documento WO 2004/070039

Tabla 2e: Ejemplos de promotores específicos de la aleurona:

Fuente del Gen

Referencia

α-amilasa (Amy32b)

Lanahan et al, Plant Cell 4:203 -211, 1992; Skriver et al, Proc Natl Acad Sci documento USA 88:7266 -7270, 1991

Gen de tipo catepsina β

Cejudo et al, Plant Mol Biol 20:849 -856, 1992

Ltp2 de cebada

Kalla et al., Plant J. 6:849 -60, 1994

Chi26

Leah et al., Plant J. 4:579 -89, 1994

B-Peru de maíz

Selinger et al., Genetics 149;1125 -38.1998

Un promotor específico del tejido verde, según se define en el presente documento, es un promotor que es activo transcripcionalmente predominantemente en tejido verde, sustancialmente hasta la exclusión de cualesquiera otras partes de una planta, al tiempo que sigue permitiendo alguna expresión con pérdidas en estas otras partes de la 10 planta.

Otro ejemplo de promotor específico de tejido es un promotor específico del meristemo, que es activo transcripcionalmente predominantemente en el tejido meristemático, sustancialmente hasta la exclusión de cualesquiera otras partes de una planta, al tiempo que sigue permitiendo alguna expresión con pérdidas en estas otras partes de la planta.

Terminador

El término “terminador" ” abarca una secuencia control que es una secuencia de ADN al final de una unidad transcripcional, en la que las señales procesamiento en 3’ y poliadenilación de un transcrito primario y la terminación de la transcripción. El terminador puede derivarse del gen natural, de una variedad de otros genes de planta, o de T-ADN. El terminador que va a añadirse puede derivarse de, por ejemplo, los genes de la nopalina sintasa u la octopina sintasa, o alternativamente, de otro gen vegetal, o, menos preferiblemente, de cualquier otro gen eucariótico.

Modulación

El término "modulación" significa, en relación con la expresión o la expresión génica, un procedimiento en el que el nivel de expresión se cambia por dicha expresión génica en comparación con la planta de control, preferiblemente el nivel de expresión se incrementa o disminuye. La expresión no modulada original puede ser de cualquier tipo de expresión de un ARN estructural (ARNr, ARNt) o ARNm con traducción posterior. La expresión "modular la actividad" significará cualquier cambio de la expresión de las secuencias de ácido nucleico o las proteínas codificadas de la invención, lo que conduce a un rendimiento incrementado y/o un crecimiento incrementado de las plantas.

Expresión

La expresión "expresión" o "expresión génica" significa la transcripción de un gen específico o genes específicos o construcción genética específica. El término "expresión" o "expresión génica" significa en particular la transcripción de un gen o genes o una construcción genética en un ARN estructural (ARNr, ARNt) o ARNm con o sin traducción posterior de este último en una proteína. El proceso incluye la transcripción de ADN y el procesamiento del producto de ARNm resultante.

Expresión incrementada / sobreexpresión

El término "expresión incrementada" o "sobreexpresión" tal como se utiliza en el presente documento significa cualquier forma de expresión que sea adicional al nivel original de expresión de tipo silvestre.

Los procedimientos para incrementar la expresión de genes o productos génicos están bien documentados en la materia e incluyen, por ejemplo, sobreexpresión dirigida por promotores apropiados, el uso de potenciadores de la transcripción o potenciadores de la traducción. Los ácidos nucleicos aislados que sirven como elementos promotores o potenciadores pueden introducirse en una posición apropiada (típicamente cadena arriba) de una forma no heteróloga de un polinucleótido a fin de regular por aumento la expresión de un ácido nucleico que codifica el polipéptido de interés. Por ejemplo, los promotores endógenos pueden alterarse in vivo mediante mutación, deleción y/o sustitución (véanse, Kmiec, Pat. EE. UU. Nº 5.565.350; Zariing et ál., documento WO9322443), o pueden introducirse promotores aislados en una célula vegetal en la orientación y la distancia adecuadas desde un gen de la presente divulgación a fin de controlar la expresión del gen.

Si se desea la expresión de un polipéptido, generalmente es deseable incluir una región de poliadenilación en el extremo 3’ de una región codificante de un polinucleótido. La región de poliadenilación puede derivarse del gen natural, de una variedad de otros genes vegetales o de T-ADN. La secuencia del extremo 3’ que va a añadirse puede derivarse de, por ejemplo, los genes de la nopalina sintasa u la octopina sintasa, o alternativamente, de otro gen vegetal, o, menos preferiblemente, de cualquier otro gen eucariótico.

Una secuencia intrónica también puede añadirse a la región no traducida 5’ (UTR) o la secuencia codificante de la secuencia codificante parcial para incrementar la cantidad del mensaje maduro que se acumula en el citosol. Se ha demostrado que la inclusión de un intrón para corte y empalme en la unidad de transcripción en construcciones de expresión tanto de plantas como de animales incrementa la expresión génica a niveles tanto de ARNm como de proteína hasta 1000 veces (Buchman y Berg (1988) Mol. Cell biol. 8: 4395 -4405; Callis et al. (1987) Genes Dev 1:1183 -1200). Tal estimulación intrónica de la expresión génica es típicamente mayor cuando se coloca cerca del extremo 5’ de la unidad de transcripción. El uso de los intrones del maíz Adh1-S intrón 1, 2, and 6, el intrón Bronze-1 se conoce en la materia. Para una información general, véase: The Maize Handbook, Capítulo116, Freeling and Walbot, Eds., Springer, N.Y. (1994).

Gen endógeno

La referencia en el presente documento a un gen "endógeno" no solo se refiere al gen en cuestión según se encuentra en una planta en su forma natural (es decir, sin que haya intervención humana), sino que también se refiere al mismo gen (o un ácido nucleico/gen sustancialmente homólogo) en una forma aislada posteriormente (re) introducido en una planta (un transgén). Por ejemplo, una planta transgénica que contiene tal transgén puede

encontrar una reducción sustancial de la expresión del transgén y/o una reducción sustancial de la expresión del gen endógeno. El gen aislado se puede aislar de un organismo o ser elaborado por el hombre, por ejemplo por medio de síntesis química.

Expresión disminuida

Se considera que la referencia en el presente documento a “expresión disminuida” o "reducción o eliminación sustancial" de la expresión significa una disminución de la expresión de un gen endógeno y/o de los niveles de polipéptido y/o de la actividad de un polipéptido con relación a las plantas de control. La reducción o eliminación sustancial es en orden creciente de preferencia al menos 10%, 20%, 30%, 40% o 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%

o 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más reducida en comparación con la de plantas de control.

Para la reducción o eliminación sustancial de la expresión de un gen endógeno en una planta, se requiere una longitud suficiente de nucleótidos sustancialmente contiguos de una secuencia de ácido nucleico. A fin de realizar un silenciamiento génico, esto puede ser tan poco como 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 o menos nucleótidos, alternativamente, esto puede ser tanto como todo el gen (incluyendo la UTR 5’ y/o 3’, bien en parte o bien en su totalidad). El tramo de nucleótidos sustancialmente contiguos puede derivarse del ácido nucleico que codifica la proteína de interés (gen diana) o de cualquier ácido nucleico capaz de codificar un ortólogo, parálogo u homólogo de la proteína de interés. Preferiblemente, el tramo de nucleótidos sustancialmente contiguos es capaz de formar enlaces de hidrógeno con el gen diana (hebra sentido o antisentido), más preferiblemente, el tramo de nucleótidos sustancialmente contiguos tiene, en orden de preferencia creciente, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% de identidad de secuencias con el gen diana (hebra sentido o antisentido). Una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido (funcional) no es un requisito para los diversos procedimientos analizados en el presente documento para la reducción o la eliminación sustancial de la expresión de un gen endógeno.

Esta reducción o eliminación sustancial de la expresión puede alcanzarse usando herramientas y técnicas habituales. Un procedimiento preferido para la reducción o eliminación sustancial de la expresión del gen endógeno es introduciendo y expresando en una planta una construcción genética en la que el ácido nucleico (en este caso un tramo de nucleótidos sustancialmente contiguos derivados del gen interés, o de cualquier ácido nucleico capaz de codificar un ortólogo, parálogo u homólogo de una cualquiera de las proteínas de interés) se clona como una repetición invertida (en parte o completamente), separada por un espaciador (ADN no codificante)

En tal procedimiento preferido, la expresión del gen endógeno se reduce o se elimina sustancialmente a través de silenciamiento mediado por ARN usando una repetición invertida de un ácido nucleico o una parte del mismo (en este caso un tramo de nucleótidos sustancialmente contiguos derivados del gen de interés, o de cualquier ácido nucleico capaz de codificar un ortólogo, parálogo u homólogo de la proteína de interés), preferiblemente capaz de formar una estructura de horquilla. La repetición invertida se clona en un vector de expresión que comprende secuencias de control. Una secuencia de ácido nucleico de DNA no codificante (un espaciador, por ejemplo un fragmento de la región de enlace a la matriz (MAR), un intrón, un policonector, etc.) se sitúa entre los dos ácidos nucleicos invertidos formando la repetición invertida. Después de la transcripción de la repetición invertida, se forma un ARN quimérico con una estructura autocomplementaria (parcial o completa). Esta estructura de ARN bicatenario se denomina ARNA de horquilla (hpARN). La planta procesa el hpARN n ARNsi que se incorporan a un complejo silenciador inducido por ARN (RISC). El RISC segmenta además los transcritos de ARNm, reduciendo sustancialmente de ese modo el número de transcritos de ARNm que van a traducirse en polipéptidos. Para detalles adicionales generales, véanse, por ejemplo, Grierson et ál. (1998) documento WO 98/53083; Waterhouse et al. (1999) documento WO 99/53050).

El comportamiento de los procedimientos de la invención no se basa en introducir y expresar en una planta una construcción genética en el que el ácido nucleico se clona como una repetición invertida, sino que pueden usarse para alcanzar los mismos efectos uno cualquiera o más procedimientos de "silenciamiento génico" bien conocidos.

Uno de tales procedimientos para la reducción de la expresión de un gen endógeno es el silenciamiento mediado por ARNA de la expresión del gen (regulación por disminución). El silenciamiento en este caso es activado en una planta por una secuencia de ARN bicatenario (dsARN) que es sustancialmente similar al gen endógeno diana. La planta procesa adicionalmente este dsARN en de aproximadamente 20 a aproximadamente 26 nucleótidos denominados ARNA de interferencia cortos (siARN). Los siARN se incorporan en un complejo silenciador inducido por ARN (RISC) que escinde el transcrito de ARNm del gen diana endógeno, reduciendo sustancialmente de ese modo el número de transcritos de ARNm que van a traducirse en un polipéptido. Preferiblemente, la secuencia de ARN bicatenario corresponde a un gen diana.

Otro ejemplo de un procedimiento de silenciamiento por ARN implica la introducción de secuencias de ácido nucleico o partes de las mismas (en este caso, un tramo de nucleótidos sustancialmente contiguos derivados del gen de interés, o de cualquier ácido nucleico capaz de codificar un ortólogo, parálogo u homólogo de la proteína de interés) en una orientación con sentido en una planta. "Orientación sentido" se refiere a una secuencia de ADN que es homóloga a un transcrito de ARNm de la misma. introducido en una planta que por lo tanto sería al menos una copia de la secuencia de ácido nucleico. La secuencia de ácido nucleico adicional reducirá la expresión del gen endógeno, dando lugar a un fenómeno conocido como cosupresión. La reducción de la expresión génica será más

pronunciada si se introducen en la planta varias copias adicionales de una secuencia de ácido nucleico, ya que hay una correlación positiva entre los altos niveles de transcritos y la activación de la cosupresión.

Otro ejemplo de un procedimiento de silenciamiento por RNA implica el uso de secuencias de ácido nucleico antisentido. Una secuencia de ácido nucleico "antisentido" comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de ácido nucleico "sentido" que codifica una proteína, es decir complementaria a la hebra codificante de una molécula de ADNc bicatenario o complementaria a una secuencia de transcrito de ARNm. Preferiblemente, la secuencia de ácido nucleico antisentido es complementaria al gen endógeno que va a silenciarse. La complementariedad puede estar situada en la "región codificante" y/o en la "región no codificante" de un gen. La expresión "región codificante" se refiere a una región de la secuencia de nucleótidos que comprende codones que se traducen en residuos de aminoácido. La expresión "región no codificante" se refiere a secuencias 5’ y 3’ que flanquean la región codificante que se transcriben pero no se traducen en aminoácidos (también denominadas regiones no traducidas 5’ y 3’).

Las secuencias de ácido nucleico antisentido pueden diseñarse según las reglas de apareamiento de bases de Watson y Crick. La secuencia de ácido nucleico antisentido puede ser complementaria a toda la secuencia de ácido nucleico (en este caso un tramo de nucleótidos sustancialmente contiguos derivados del gen de interés, o de cualquier ácido nucleico capaz de codificar un ortólogo, parálogo u homólogo de la proteína de interés), pero también puede ser un oligonucleótido que es antisentido a solo una parte de la secuencia de ácido nucleico (incluyendo la UTR 5’ y 3’ de ARNm). Por ejemplo, la secuencia oligonucleotídica antisentido puede ser complementaria a la región que circunda el sitio de comienzo de la traducción de un transcrito de ARNm que codifica un polipéptido. La longitud de una secuencia oligonucleotídica antisentido adecuada se conoce en la materia y puede comenzar desde aproximadamente 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15 o 10 nucleótidos de longitud o menos. Una secuencia de ácido nucleico antisentido según la presente memoria puede construirse usando síntesis química y reacciones de ligación enzimáticas usando procedimientos conocidos en la materia. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico antisentido (p. ej., una secuencia oligonucleotídica antisentido) puede sintetizarse químicamente usando nucleótidos presentes en la naturaleza o nucleótidos diversamente modificados diseñados para incrementar la estabilidad biológica de las moléculas o para incrementar la estabilidad física del dúplex formado entre las secuencias de ácido nucleico antisentido y sentido, p. ej., pueden usarse derivados de fosforotioato y nucleótidos sustituido con acridina. Ejemplos de nucleótidos modificados que pueden usarse para generar las secuencias de ácido nucleico antisentido son muy conocidos en la materia. Modificaciones de nucleótidos conocidas incluyen metilación, ciclación y ’protecciones' y la sustitución de uno o más de los nucleótidos presentes en la naturaleza con un análogo tal como inosina. Otras modificaciones de nucleótidos son muy conocidas en la técnica.

La secuencia de ácido nucleico antisentido puede producirse biológicamente usando un vector de expresión en el que una secuencia de ácido nucleico se ha subclonado en una orientación antisentido (es decir, el ARN transcrito a partir del ácido nucleico insertado será de una orientación antisentido con respecto a un ácido nucleico de interés diana). Preferiblemente, la producción de secuencias de ácido nucleico antisentido en plantas se produce por medio de una construcción de ácido nucleico integrado de forma estable que comprende un promotor, un oligonucleótido antisentido unido de forma operable y un terminador.

Las moléculas de ácido nucleico usadas para el silenciamiento en los procedimientos de la invención (ya se introduzcan en una planta o se generen in situ) se hibridan con o se unen a transcritos de ARNm y/o ADN genómico que codifica un polipéptido para inhibir de ese modo la expresión de la proteína, p. ej., inhibiendo la transcripción y/o la traducción. La hibridación puede ser mediante complementariedad de nucleótidos convencional para formar un dúplex estable, o, por ejemplo, en el caso de una secuencia de ácido nucleico antisentido que se une a dúplex de ADN, a través de interacciones específicas en la hendidura principal de la doble hélice. Las secuencias de ácido nucleico antisentido pueden introducirse en una planta mediante transformación o inyección directa en una zona de tejido específica. Alternativamente, las secuencias de ácido nucleico antisentido pueden modificarse para células diana seleccionadas y a continuación administrarse sistémicamente. Por ejemplo, para la administración sistémica, las secuencias de ácido nucleico antisentido pueden modificarse de modo que se unan específicamente a receptores o antígenos expresados sobre una superficie celular seleccionada, p. ej., uniendo la secuencia de ácido nucleico antisentido a péptidos o anticuerpos que se unen a receptores o antígenos de la superficie celular. Las secuencias de ácido nucleico antisentido también pueden liberarse en las células usando los vectores descritos en el presente documento.

Según un aspecto adicional, la secuencia de ácido nucleico antisentido es una secuencia de ácido nucleico aanomérica Una secuencia de ácido nucleico a-anomérica forma híbridos bicatenarios específicos con ARN complementario en el que, al contrario de las unidades b habituales, las hebras van paralelas entre sí (Gaultier et al. (1987) Nucl Ac Res 15: 6625 -6641). La secuencia de ácido nucleico antisentido también puede comprender un 2’o-metilribonucleótido (Inoue et al. (1987) Nucl Ac Res 15, 6131 -6148) o un análogo de ARN-ADN quimérico (Inoue et al. (1987) FEBS Lett. 215, 327 -330).

La reducción o la eliminación sustancial de la expresión de un gen endógeno también se puede realizar usando ribozimas. Las ribozimas son moléculas de ARN catalíticas con actividad de ribonucleasa que son capaces de escindir una secuencia de ácido nucleico monocatenaria, tal como un ARNm, con la que tienen una región complementaria. Así, las ribozimas (p. ej., las ribozimas de cabeza de martillo (descritas en Haselhoff y Gerlach

(1988) Nature 334, 585-591) pueden usarse para escindir catalíticamente transcritos de ARNm que codifican un polipéptido, reduciendo de ese modo sustancialmente el número de transcritos de ARNm que ha de traducirse en un polipéptido. Puede diseñarse una ribozima que tenga especificidad por una secuencia de ácido nucleico (véanse, por ejemplo: Cech et al. la Patente de EE. UU. 4.987.071; y Cech et al. la Patente de EE. UU. 5.116.742). Alternativamente, pueden usarse transcritos de ARNm correspondientes a un secuencia de ácido nucleico para seleccionar un ARN catalítico que tiene una actividad de ribonucleasa específica de un conjunto de moléculas de ARN (Bartel y Szostak (1993) Science 261, 1411-1418). El uso de ribozimas para el silenciamiento génico en plantas se conoce en la materia (p. ej., el documento WO 94/00012 de Atkins et al. (1994) documento WO 94/00012; Lenne et al. (1995) documento WO 95/03404; Lutziger et al., (2000) documento WO 00/00619; Prinsen et al. (1997) documento WO 97/13865 y Scott et al. (1997) documento WO 97/38116).

El silenciamiento génico también puede alcanzarse mediante mutagénesis de inserción (por ejemplo, inserción de T-ADN o inserción de un transposón) o mediante estrategias como las descritas por, entre otros, Angell y Baulcombe ( (1999) Plant J 20 (3): 357 -62), (Amplicon VIGS documento WO 98/36083), o Baulcombe (documento WO 99/15682).

El silenciamiento génico también puede producirse si hay una mutación sobre un gen endógeno y/o una mutación en un gen/ácido nucleico aislado introducido posteriormente en una planta. La reducción o la eliminación sustancial pueden estar provocadas por un polipéptido no funcional. Por ejemplo, el polipéptido puede unirse a diversas proteínas interactivas; una o más mutaciones y/o truncamientos pueden proporcionar, por lo tanto, un polipéptido que todavía es capaz de unirse a proteínas interactivas (tales como proteínas receptoras) pero que no puede exhibir su función normal (tal como ligando de señalización).

Un enfoque adicional para el silenciamiento génico es dirigiendo las secuencias de ácido nucleico complementarias a la región reguladora del gen (p. ej., el promotor y/o los potenciadores) para formar estructuras de triple hélice que evitan la transcripción del gen en células diana. Véanse Helene, C., Anticancer Drug Res. 6, 569 -84, 1991; Helene et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 660, 27 -36 1992; y Maher, L.J. Bioassays 14, 807 -15, 1992.

Otros procedimientos, tales como el uso de anticuerpos dirigidos a un polipéptido endógeno para inhibir su función en la planta, o la interferencia en la ruta de señalización en la que está implicado un polipéptido, serán muy conocidos para el experto. En particular, puede preverse que moléculas artificiales puedan ser útiles para inhibir la función biológica de un polipéptido diana, o para interferir con la ruta de señalización en la que está implicado el polipéptido diana.

Alternativamente, puede establecerse un programa de detección selectiva para identificar en una población de plantas variantes naturales de un gen, variantes que codifican polipéptidos con actividad reducida. Tales variantes naturales también pueden usarse, por ejemplo, para realizar recombinación homóloga.

Pueden usarse microARN (mIARN) artificiales y/o naturales para desactivar la expresión génica y/o la traducción de ARNm. Los Mirna endógenos son ARN pequeños monocatenarios típicamente de 19-24 nucleótidos de longitud. Funcionan principalmente para regular la expresión génica y/o la traducción de ARNm. La mayoría de los microARN (mIARN) vegetales tienen una complementariedad perfecta o casi perfecta con sus secuencias diana. Sin embargo, hay dianas naturales con hasta cinco apareamientos erróneos. Se procesan a partir de ARN no codificantes más largos con estructuras replegadas características mediante RNasas bicatenarias específicas de la familia Dicer. Tras el procesamiento, se incorporan en el complejo silenciador inducido por ARN (RISC) uniéndose a su componente principal, una proteína Argonauta. Los mIARN sirven como los componentes de especificidad de RISC, ya las bases se aparean con los ácidos nucleicos diana, principalmente ARNm, en el citoplasma. Episodios reguladores posteriores incluyen escisión y destrucción de ARNm diana y/o inhibición de la traducción. Los efectos de la sobreexpresión de miARN se reflejan, de este modo, a menudo en niveles de ARNm disminuidos de los genes diana

Los microARN artificiales (amIARN, que tienen típicamente 21 nucleótidos de longitud, pueden manipularse genéticamente de forma específica para regular negativamente la expresión génica de uno o varios genes de interés. Los determinantes de la selección como diana del microARN vegetal son muy conocidos en la materia. Se han definido parámetros empíricos para el reconocimiento de dianas y pueden usarse para ayudar en el diseño de amIARN específicos, (Schwab et al., Dev. Cell 8, 517 -527, 2005). También están disponibles para el público herramientas convenientes para el diseño y la generación de amIARN y sus precursores, publica (Schwab et al., Plant Cell 18, 1121 -1133, 2006).

Para un comportamiento óptimo, las técnicas de silenciamiento génico usadas para reducir la expresión en una planta de un gen endógeno requieren el uso de secuencias de ácido nucleico procedentes de plantas monocotiledóneas para la transformación de plantas monocotiledóneas, y procedentes de plantas dicotiledóneas para la transformación de plantas dicotiledóneas. Preferiblemente, una secuencia de ácido nucleico procedente de cualquier especie de planta dada se introduce en la misma especie. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico procedente de arroz se transforma en una planta de arroz. Sin embargo, no es un requisito absoluto que la secuencia de ácido nucleico que va a introducirse se origine de la misma especie de planta que la planta en la que se introduce. Es suficiente que haya una homología sustancial entre el gen diana endógeno y el ácido nucleico que va a introducirse.

En lo que antecede se han descrito ejemplos de diversos procedimientos para la reducción o la eliminación sustancial de la expresión en una planta de un gen endógeno. Un experto en la materia sería capaz de adaptarse fácilmente a los procedimientos mencionados anteriormente para el silenciamiento a fin de alcanzar la reducción de la expresión de un gen endógeno en una planta entera o en partes de la misma a través del uso de un promotor apropiado, por ejemplo.

(Gen) Marcador seleccionable/Gen indicador

“Marcador seleccionable", "gen marcador seleccionable" o "gen indicador" incluye cualquier gen que confiera un fenotipo a una célula en la que se expresa para facilitar la identificación y/o la selección de células que se transfectan o se transforman con una construcción de ácido nucleico de la presente divulgación. Estos genes marcadores permiten la identificación de una transferencia satisfactoria de las moléculas de ácido nucleico a través de una serie de diferentes principios. Los marcadores adecuados se pueden seleccionar de marcadores que confieren resistencia a antibióticos o herbicidas, que introducen un nuevo rasgo metabólico o que permiten la selección visual. Ejemplos de genes marcadores seleccionables incluyen genes que confieren resistencia a antibióticos (tales como nptII que fosforila neomicina y kanamicina, o hpt, que fosforila higromicina, o genes que confieren resistencia a, por ejemplo, bleomicina, estreptomicina, tetraciclina, cloranfenicol, ampicilina, gentamicina, geneticina (G418), espectinomicina o blasticidina), a herbicidas (por ejemplo bar que proporciona resistencia a Basta®; aroA o gox que proporcionan resistencia contra glifosato, o los genes que confieren resistencia a, por ejemplo, imidazolinona, fosfinotricina o sulfonilurea), o genes que proporcionan un rasgo metabólico (tales como manA que permiten que las plantas usen manosa como única fuente de carbono o xilosa isomerasa para la utilización de xilosa, o marcadores antinutritivos tales como la resistencia a 2-desoxiglucosa). La expresión de genes marcadores visuales da como resultado la formación de color (por ejemplo β-glucuronidasa, GUS β-galactosidasa con sus sustratos coloreados, por ejemplo X-Gal), luminiscencia (tal como el sistema luciferina/luciferasa) o fluorescencia (proteína fluorescente verde, GFP, y sus derivados). Esta lista representa solo un pequeño número de posibles marcadores. El trabajador experto está familiarizado con tales marcadores. Se prefieren marcadores diferentes, dependiendo del organismo y el procedimiento de selección.

Se sabe que con la integración estable o transitoria de ácidos nucleicos en células vegetales, solo una minoría de las células recoge el ADN extraño y, si se desea, se integra en su genoma, dependiendo del vector de expresión usado y la técnica de transfección usada. Para identificar y seleccionar estos integrantes, un gen que codifica un marcador seleccionable (tal como los descritos anteriormente) se introduce habitualmente en las células huésped junto con el gen de interés. Estos marcadores pueden usarse, por ejemplo, en mutantes en los que estos genes no son funcionales mediante, por ejemplo, deleción por procedimientos convencionales. Adicionalmente, las moléculas de ácido nucleico que codifican un marcador seleccionable se pueden introducir en una célula huésped en el mismo vector que comprende la secuencia que codifica los polipéptidos de la divulgación o se pueden usar en los procedimientos divulgados en el presente documento, o también en un vector separado. Las células que se han transfectado establemente con el ácido nucleico introducido pueden identificarse, por ejemplo, mediante selección (por ejemplo, células que han integrado el marcador seleccionable sobreviven mientras que las otras células mueren).

Puesto que los genes marcadores, particularmente los genes para resistencia a antibióticos y herbicidas, ya no se requieren más o no se desean en la célula huésped transgénica una vez que los ácidos nucleicos se han introducido satisfactoriamente, el procedimiento según la invención para introducir los ácidos nucleicos ventajosamente emplea técnicas que permiten la retirada o la escisión de estos genes marcadores. Uno de tales procedimientos es el que se conoce como cotransformación. El procedimiento de cotransformación emplea dos vectores simultáneamente para la transformación, portando un vector el ácido nucleico según la memoria y portando un segundo el gen o los genes marcadores. Una gran proporción de transformantes recibe o, en el caso de las plantas, comprende (hasta 40% o más de los transformantes), ambos vectores. En el caso de la transformación con Agrobacteria, los transformantes reciben habitualmente solo una parte del vector, es decir la secuencia flanqueada por el T-ADN, que habitualmente representa el casete de expresión. Los genes marcadores pueden retirarse posteriormente de la planta transformada realizando cruces. En otro procedimiento, se usan genes marcadores integrados en un transposón para la transformación junto con el ácido nucleico deseado (conocido como la tecnología Ac/Ds). Los transformantes pueden cruzarse con una fuente de transposasa o los transformantes se transforman con una construcción de ácido nucleico que confiere la expresión de una transposasa, transitoriamente o estable. En algunos casos (aprox. 10%), el transposón salta fuera del genoma de la célula huésped una vez que la transformación ha tenido lugar satisfactoriamente y se pierde. En un número adicional de casos, el transposón salta a una posición diferente. En estos casos, el gen marcador debe eliminarse realizando cruces. En microbiología, se desarrollaron técnicas que hacen posible, o facilitan, la detección de tales episodios. Un procedimiento ventajoso adicional se basa en lo que se conoce como sistemas de recombinación; cuya ventaja es que puede prescindirse de la eliminación mediante cruce. El sistema más conocido de este tipo es lo que se conoce como el sistema Cre/lox. Cre1 es una recombinasa que retira las secuencias situadas entre las secuencias loxP. Si el gen marcador está integrado entre las secuencias loxP, se retira una vez que la transformación ha tenido lugar satisfactoriamente, mediante la expresión de la recombinasa. Sistemas de recombinación adicionales son el sistema HIN/HIX, FLP/FRT y REP/STB (Tribble et al., J. Biol. Chem., 275, 2000: 22255 -22267; Velmurugan et al., J. Cell Biol., 149, 2000: 553 -566). Es posible una integración específica para el sitio en el genoma de la planta de las secuencias de ácido nucleico según la memoria. Naturalmente, estos procedimientos también se pueden aplicar a microorganismos tales como levaduras, hongos o

bacterias.

Transgénico/Transgén/Recombinante

Para los propósitos de la invención, "transgénico", "transgén" o "recombinante" significa con respecto a, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico, un casete de expresión, una construcción génica o un vector que comprende la secuencia de ácido nucleico o un organismo transformado con las secuencias de ácido nucleico, casetes o vectores de expresión según la memoria, todas esas construcciones realizadas mediante procedimientos recombinantes en los que bien

(a)

las secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas útiles en los procedimientos de la invención, o bien

(b)

una secuencia o secuencias de control genéticas que están unidas de forma operable con la secuencia de ácido nucleico según la memoria, por ejemplo un promotor, o bien

(c)

a) y b)

no están situadas en su ambiente genético natural o se han modificado mediante procedimientos recombinantes, siendo posible que la modificación tome la forma de, por ejemplo, una sustitución, adición, deleción, inversión o inserción de uno o más residuos de nucleótido. Se entiende que el ambiente genético natural significa el locus genómico o cromosómico natural en la planta original o la presencia en una biblioteca genómica. En el caso de una biblioteca genómica, el ambiente genético natural de la secuencia de ácido nucleico se retiene preferiblemente, al menos en parte. El ambiente flanquea la secuencia de ácido nucleico al menos en un lado y tiene una longitud de secuencia de al menos 50 pb, preferiblemente al menos 500 pb, de forma especialmente preferible al menos 1000 pb, lo más preferiblemente al menos 5000 pb. Un casete de expresión presente en la naturaleza, por ejemplo la combinación presente en la naturaleza del promotor natural de las secuencias de ácido nucleico con la secuencia de ácido nucleico correspondiente que codifica un polipéptido útil en los procedimientos de la presente invención, según se ha definido anteriormente, se convierte en un casete de expresión transgénico cuando este casete de expresión se modifica mediante procedimientos sintéticos no naturales ("artificiales") tales como, por ejemplo, tratamiento mutagénico. Procedimientos adecuados se describen, por ejemplo, en los documentos US 5.565.350 o WO 00/15815.

Se entiende así que una planta transgénica para los propósitos de la memoria significa, como anteriormente, que los ácidos nucleicos usados en el procedimiento de la invención no están en su locus natural en el genoma de dicha planta, siendo posible que los ácidos nucleicos se expresen de forma homóloga o heteróloga. Sin embargo, como se ha mencionado, transgénico también significa que, mientras que los ácidos nucleicos según la memoria o usados en el procedimiento de la invención están en su posición natural en el genoma de una planta, la secuencia se ha modificado con respecto a la secuencia natural, y/o que las secuencias reguladoras de las secuencias naturales se han modificado. Se entiende que transgénico significa preferiblemente la expresión de los ácidos nucleicos según la memoria en un locus no natural en el genoma, es decir tiene lugar una expresión homóloga o, preferiblemente, heteróloga, de los ácidos nucleicos. Plantas transgénicas preferidas se mencionan en el presente documento.

Transformación

El término "introducción" o "transformación", según se menciona en el presente documento, abarca la transferencia de un polinucleótido exógeno en una célula huésped, independientemente del procedimiento usado para la transferencia. Tejido vegetal capaz de una propagación clonal posterior, ya sea mediante organogénesis o embriogénesis, puede transformarse con una construcción genética de la presente memoria y regenerarse una planta entera a partir de este. El tejido particular elegido variará dependiendo de los sistemas de propagación clonal disponibles para., y más adecuados para, la especie particular que se transforma Dianas tisulares de ejemplo incluyen discos foliares, polen, embriones, cotiledones, hipocótilos, megagametofitos, tejido calloso, tejido meristemático existente (p. ej., meristemo apical, yemas axilares y meristemos radiculares) y tejido meristemático inducido (p. ej., meristemo de cotiledones y meristemo de hipocótilos). El polinucleótido puede introducirse de forma transitoria o estable en una célula huésped y puede mantenerse no integrado, por ejemplo, como un plásmido. Alternativamente, puede integrarse en el genoma huésped. La célula vegetal transformada resultante puede usarse a continuación para regenerar una planta transformada de un modo conocido para los expertos en la materia.

La transferencia de genes extraños al genoma de una planta se denomina transformación. La transformación de una especie de planta es ahora una técnica bastante habitual. Ventajosamente, puede usarse cualquiera de varios procedimientos de transformación para introducir el gen de interés en una célula antecesora adecuada. Los procedimientos descritos para la transformación y regeneración de plantas a partir de tejidos de planta o células vegetales pueden utilizarse para la transformación transitoria o estable. Los procedimientos de transformación incluyen el uso de liposomas, electroporación, productos químicos que incrementan la captación de ADN libre, inyección del ADN directamente en la planta, bombardeo con pistola de partículas, transformación usando virus o polen y microproyección. Los procedimientos pueden seleccionarse de los procedimientos de calcio/polietilenglicol para protoplastos (Krens, F.A. et ál., (1982) Nature 296, 72-74; Negrutiu I et al. (1987) Plant Mol Biol 8: 363 -373); electroporación de protoplastos (Shillito R.D. et al. (1985) Bio/Technol 3, 1099 -1102); microinyección en material vegetal (Crossway A et al., (1986) Mol. Gen Genet 202: 179 -185); bombardeo de partículas revestidas con ADN o ARN (Klein TM et al., (1987) Nature 327: 70) infección con virus (no integradores) y similares. Las plantas

transgénicas, incluyendo plantas de cultivo transgénicas, se producen preferiblemente a través de transformación mediada por Agrobacterium. Un procedimiento de transformación ventajoso es la transformación en plantas. A este fin, es posible, por ejemplo, permitir que las agrobacterias actúen sobre las semillas de planta o inocular el meristemo de la planta con agrobacterias. Ha resultado particularmente conveniente según la memoria permitir que una suspensión de agrobacterias transformadas actúe sobre la planta intacta o al menos sobre los primordios de las flores. La planta se hace crecer posteriormente hasta que se obtienen las semillas de la planta tratada (Clough y Bent, Plant J. (1998) 16, 735-743). Los procedimientos para la transformación mediada por Agrobacterium de arroz incluyen procedimientos muy conocidos para la transformación de arroz, tales como los descritos en cualquiera de los siguientes: solicitud de patente europea EP 1198985 A1, Aldemita y Hodges (Planta 199: 612 -617, 1996); Chan et al. (Plant Mol Biol 22 (3): 491 -506, 1993), Hiei et al. (Plant J 6 (2): 271 -282, 1994), divulgaciones que se incorporan por referencia en el presente documento como si se hubieran expuesto completamente. En el caso de la transformación del maíz, el procedimiento preferido es como el descrito en Ishida et ál. (Nat. Biotechnol 14(6): 745 50, 1996) o Frame et al. (Plant Physiol 129(1): 13 -22, 2002), divulgaciones que se incorporan por referencia en el presente documento como si se hubieran expuesto completamente. Dichos procedimientos se describen adicionalmente a modo de ejemplo en B. Jenes et ál., Techniques for Gene Transfer, en: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. S.D. Kung and R. Wu, Academic Press (1993) 128 -143 and in Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205 -225). Los ácidos nucleicos o la construcción que van a expresarse se clonan preferiblemente en un vector, que es adecuado para transformar Agrobacterium tumefaciens, por ejemplo pBin19 (Bevan et ál., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). Las agrobacterias transformadas por tal vector pueden usarse a continuación de manera conocida para la transformación de plantas, tales como plantas usadas como un modelo, como Arabidopsis (Arabidopsis thaliana dentro del alcance de la presente invención no se considera una planta de cultivo), o plantas de cultivo tales como, a modo de ejemplo, plantas de tabaco, por ejemplo sumergiendo hojas machacadas u hojas cortadas en una solución de agrobacterias y a continuación cultivándolas en un medio adecuado. La transformación de plantas por medio de Agrobacterium tumefaciens se describe en, por ejemplo, Höfgen y Willmitzer en Nucl. Acid Res. (1988) 16, 9877 o se conoce, entre otros, de F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; en Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. S.D. Kung y R. Wu, Academic Press, 1993, pp. 15-38. 15 -38.

Además de la transformación de células somáticas, que a continuación tienen que regenerarse en plantas intactas, también es posible transformar las células de meristemos de plantas y en particular las células que se desarrollan en gametos. En este caso, los gametos transformados siguen el desarrollo natural de la planta, dando lugar a plantas transgénicas. Así, por ejemplo, semillas de Arabidopsis se tratan con agrobacterias y se obtienen semillas de plantas en desarrollo de las que una cierta porción se transforma y, de este modo, son transgénicas [Feldman, KA y Marks MD (1987). Mol Gen Genet 208:274 -289; Feldmann K (1992). En: C Koncz, N-H Chua and J Shell, eds, Methods in Arabidopsis Research. Word Scientific, Singapore, pp. 274 -289]. Procedimientos alternativos se basan en la retirada repetida de las inflorescencias y la incubación de la zona de escisión en el centro de la roseta con agrobacterias transformadas, con lo que pueden obtenerse asimismo semillas transformadas en un punto temporal posterior (Chang (1994). Plant J. 5: 551 -558; Katavic (1994). Mol Gen Genet, 245: 363 -370). Sin embargo, un procedimiento especialmente eficaz es el procedimiento de infiltración al vacío con sus modificaciones, tal como el procedimiento del "inmersión floral". En el caso de la infiltración al vacío de Arabidopsis, plantas intactas a presión reducida se tratan con una suspensión agrobacteriana [Bechthold, N (1993) C R Acad Sci Paris Life Sci, 316: 1194 1199], mientras que en el caso del procedimiento del "inmersión floral" el tejido floral en desarrollo se incuba brevemente con una suspensión agrobacteriana tratada con tensioactivo [Clough, SJ und Bent, AF (1998). The Plant

J. 16, 735-743]. Una cierta proporción de semillas transgénicas se recoge en ambos casos, y estas semillas pueden distinguirse de semillas no transgénicas al crecer bajo las condiciones selectivas descritas anteriormente. Además, la transformación estable de plastidios es ventajosa debido a que los plastidios son hereditarios materialmente en la mayoría de las cosechas reduciendo o eliminando el riesgo de flujo de transgenes a través del polen. La transformación del genoma de los cloroplastos se alcanza generalmente mediante un procedimiento que ha sido presentado esquemáticamente en Klaus et ál., 2004 [Nature Biotechnology 22 (2), 225-229]. Brevemente, las secuencias que van a transformarse se clonan junto con un gen marcador seleccionable entre secuencias de flanqueo homólogas al genoma del cloroplasto. Estas secuencias de flanqueo homólogas dirigen la integración específica para el sitio en el plastoma. La transformación plastídica se ha descrito para muchas especies de plantas diferentes y una visión de conjunto se da en Bock (2001) Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology. J Mol Biol. 2001 Sep 21; 312 (3):425 -38 o Maliga, P (2003) Progress towards commercialization of plastid transformation technology. Trends Biotechnol. 21, 20 -28. Se ha presentado recientemente un avance biotecnológico adicional en forma de transformantes plastídicos libres de marcador, que pueden producirse mediante un gen marcador cointegrado transitorio (Klaus et ál., 2004, Nature Biotechnology 22 (2), 225-229).

Marcaje de activación con T-ADN

El marcaje de activación con T-ADN (Hayashi et ál. Science (1992) 1350 -1353), implica la inserción de T-ADN, que contiene habitualmente un promotor (también puede ser un potenciador de la traducción o un intrón), en la región genómica del gen de interés o 10 kb cadena arriba o abajo de la región codificante de un gen en una configuración tal que el promotor dirija la expresión del gen elegido como diana. Típicamente, la regulación de la expresión del gen elegido como diana mediante su promotor natural se interrumpe y el gen cae bajo el control del promotor recientemente introducido. El promotor está embebido típicamente en un T-AND. Este T-ADN se inserta

aleatoriamente en el genoma de la planta, por ejemplo, a través de infección con Agrobacterium, y conduce a una expresión modificada de los genes próximos al T-ADNA. Las plantas transgénicas resultantes muestran fenotipos dominantes debido a la expresión modificada de genes cerca del promotor introducido.

TILLNG

El término "TILLING” es una abreviatura de "Lesiones locales inducidas objetivo en los genomas" y se refiere a una tecnología de mutagénesis útil para generar y/o identificar secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas con expresión y/o actividad modificadas. El TILLING también permite la selección de plantas portadoras tales variantes mutantes. Estas variantes mutantes pueden exhibir una expresión modificada, bien en fuerza o bien en localización

o bien en cronología (si las mutaciones afectan al promotor, por ejemplo). Estas variantes mutantes pueden exhibir una actividad superior que la exhibida por el gen en su forma natural. TILLING combina mutagénesis de alta densidad con procedimientos de detección selectiva de alta productividad. Las etapas seguidas típicamente en TILLING son: a) mutagénesis con EMS (Redel GP y Koncz C (1992) en Methods in Arabidopsis Research, Koncz C, Chua NH, Schell J, eds. Singapore, World Scientific Publishing Co, pp. 16 -82; Feldmann et al., (1994) In Meyerowitz EM, Somerville CR, eds, Arabidopsis. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp 137 -172; Lightner J y Caspar T (1998) En J Martinez-Zapater, J Salinas, eds, Methods on Molecular Biology, Vol.

82. Humana Press, Totowa, NJ, pp 91 -104); (b) preparación de DNA y reunión de individuos; (c) amplificación por PCR de una región de interés; (d) desnaturalización y reasociación para permitir la formación de heterodúplex; (e) DHPLC, donde la presencia de un heterodúplex en un conjunto se detecta como un pico adicional en el cromatograma; (f) identificación del individuo mutante; y (g) secuenciación del producto de PCR mutante. Procedimientos para TILLING son muy conocidos en la materia (McCallum et ál., (2000) Nat Biotechnol 18: 455 457; revisado por Stemple (2004) Nat Rev Genet 5(2): 145 -50).

Recombinación homóloga

La recombinación homóloga permite la introducción en un genoma de un ácido nucleico seleccionado en una posición seleccionada definida. La recombinación homóloga es una tecnología estándar usada habitualmente en la ciencia biológica para organismos inferiores tales como levaduras o el moho Physcomitrella. Procedimientos para realizar la recombinación homóloga en plantas se han descrito no solo para plantas modélicas (Offringa et al. (1990) EMBO J 9(10): 3077 -84) sino también para plantas de cultivo, por ejemplo arroz (Terada et al. (2002) Nat Biotech 20(10): 1030 -4; lida and Terada (2004) Curr Opin Biotech 15(2): 132 -8), y existen enfoques que generalmente son aplicables con independencia del organismo diana (Miller et al, Nature Biotechnol. 25, 778 -785, 2007).

Rendimiento

El término "rendimiento" significa en general un producto mensurable de valor económico, típicamente relacionado con una cosecha especificada, con un área y con un período de tiempo. Partes de plantas individuales contribuyen directamente al rendimiento basándose en su número, tamaño y/o peso, o el rendimiento real es el rendimiento por metro cuadrado para una cosecha y año, que se determina dividiendo la producción total (incluye tanto producción recogida como evaluada) por metros cuadrados plantados. El término "rendimiento" de una planta puede relacionarse con biomasa vegetativa (biomasa de raíz y/o de brotes), con órganos reproductivos, y/o con propágulos (tales como semillas) de esa planta.

Vigor temprano

El “vigor temprano” se refiere a un crecimiento bien equilibrado, activo y sano, especialmente durante las etapas tempranas del crecimiento de la planta, y puede resultar de una mayor aptitud de la planta, debido, por ejemplo, a que las plantas se adaptan mejor a su ambiente (es decir, la optimización del uso de los recursos energéticos y al reparto entre brote y raíz). Las plantas que tienen vigor temprano también muestran una supervivencia incrementada de las plántulas y un mejor establecimiento de la cosecha, lo que a menudo da como resultado campos muy uniformes (con la cosecha creciendo de un modo uniforme, es decir con la mayoría de las plantas alcanzando las diversas fases de desarrollo sustancialmente en el mismo momento), y a menudo un rendimiento mejor y superior. Por lo tanto, el vigor temprano puede determinarse midiendo diversos factores, tales como el peso de mil granos, el porcentaje de germinación, el porcentaje de emergencia, el crecimiento de las plántulas, la altura de las plántulas, la longitud de las raíces, la biomasa de las raíces y los vástagos y muchos más.

Incrementar/Mejorar/Potenciar

Los términos "incrementar", "mejorar" o "potenciar" son intercambiables y significarán en el sentido de la solicitud al menos un 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 % o 10 %, preferiblemente al menos 15% o 20%, más preferiblemente 25%, 30%, 35% o 40% más rendimiento y/o crecimiento en comparación con las plantas de control según se define en el presente documento.

Rendimiento de semillas

Un rendimiento de semillas incrementado puede manifestarse como uno o más de los siguientes: a) un incremento en la biomasa de semillas (peso total de las semillas) que puede ser sobre una base de semillas individuales y/o por

planta y/o por metro cuadrado; b) número incrementado de flores por planta; c) número incrementado de semillas (llenas) ; d) grado incrementado de llenado de semillas (que se expresa como la relación entre el número de semillas llenas dividido por el número total de semillas); e) índice de recolección incrementado, que se expresa como la relación del rendimiento de las partes recolectables, tales como semillas, dividido por la biomasa total; y f) peso de mil granos (TKW) incrementado, que se extrapola del número de semillas llenas contadas y su peso total. Un TKW incrementado puede ser el resultado de un tamaño de semillas y/o un peso de las semillas incrementado y también puede ser el resultado de un incremento en el tamaño de los embriones y/o los endospermos.

Un incremento en el rendimiento de las semillas también puede manifestarse como un incremento en el tamaño de las semillas y/o el volumen de las semillas. Adicionalmente, un incremento en el rendimiento de las semillas también puede manifestarse como un incremento en el área de las semillas y/o la longitud de las semillas y/o la anchura de las semillas y/o el perímetro de las semillas. Un rendimiento incrementado también puede dar como resultado una arquitectura modificada, o puede producirse debido a la arquitectura modificada.

Índice de verdor

El "índice de verdor" tal como se utiliza en el presente documento se calcula a partir de las imágenes digitales de las plantas. Para cada píxel perteneciente a la planta objetivo sobre la imagen, se calcula la relación entre el valor verde versus el valor rojo (en el modelo RGB para codificación del color). El índice de verdor se expresa como el porcentaje de píxeles para los cuales la relación verde con respecto a rojo excede un umbral dado. En condiciones normales de crecimiento, en condiciones de crecimiento con estrés por salinidad y en condiciones de crecimiento con una disponibilidad reducida de nutrientes, el índice de verdor de las planta se mide en la última imagen antes de la floración. Por el contrario, bajo condiciones de crecimiento con estrés por sequía, el índice de verdor de las plantas se mide en la primera imagen después de la sequía.

Planta

El término "planta", según se usa en el presente documento, abarca plantas enteras, antecesores y progenie de las plantas y partes de plantas, incluyendo semillas, vástagos, tallos, hojas, raíces (incluyendo tubérculos), flores y tejidos y órganos, donde cada uno de los mencionados anteriormente comprende el gen/ácido nucleico de interés. El término “planta” también abarca células vegetales, cultivos en suspensión, tejido calloso, embriones, regiones meristemáticas, gametofitos, esporofitos, polen y microesporas, en las que, de nuevo, cada uno de los mencionados anteriormente comprende el gen/ácido nucleico de interés.

Plantas que son particularmente útiles en los procedimientos de la invención incluyen todas las plantas que pertenecen a la superfamilia Viridiplantae, en particular plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas, incluyendo legumbres para pasto o forraje, plantas ornamentales, cosechas alimenticias, árboles o arbustos seleccionados de la lista que comprende Acer spp., Actinidia spp., Abelmoschus spp., Agave sisalana, Agropyron spp., Agrostis stolonifera, Allium spp., Amaranthus spp., Ammophila arenaria, Ananas comosus, Annona spp., Apium graveolens, Arachis spp, Artocarpus spp., Asparagus officinalis, A vena spp) (p. ej.,. A vena sativa, A vena fatua, Avena byzantina, A vena fatua var., sativa, A vena hybrida), A verrhoa carambola, Bambusa sp., Benincasa hispida, Bertholletia excelsea, Beta vulgaris, Brassica spp. (p.ej., Brassica napus, Brassica rapa ssp. [Canola, colza, nabo]), Cadaba farinosa, Camellia sinensis, Canna indica, Cannabis sativa, Capsicum spp., Carex elata, Carica papaya, Carissa macrocarpa, Carya spp., Carthamus tinctorius, Castanea spp., Ceiba pentandra, Cichorium endivia, Cinnamomum spp., Citrullus lanatus, Citrus spp., Cocos spp., Coffea spp., Colocasia esculenta, Cola spp., Corchorus sp., Coriandrum sativum, Corylus spp., Crataegus spp., Crocus sativus, Cucurbita spp., Cucumis spp., Cynara spp., Daucus carota, Desmodium spp., Dimocarpus longan, Dioscorea spp., Diospyros spp., Echinochloa spp., Elaeis (e.g. Elaeis guineensis, Elaeis oleifera), Eleusine coracana, Eragrostis tef, Erianthus sp., Eriobotrya japonica, Eucalyptus sp., Eugenia uniflora, Fagopyrum spp., Fagus spp., Festuca arundinacea, Ficus carica, Fortunella spp., Fragaria spp., Ginkgo biloba, Glycine spp. (p.ej. Glycine max, Soja hispida o Soja max), Gossypium hirsutum, Helianthus spp. (p.ej., Helianthus annuus), Hemerocallis fulva, Hibiscus spp., Hordeum spp. (p. ej., Hordeum vulgare), Ipomoea batatas, Juglans spp., Lactuca sativa, Lathyrus spp., Lens culinaris, Linum usitatissimum, Litchi chinensis, Lotus spp., Luffa acutangula, Lupinus spp., Luzula sylvatica, Lycopersicon spp. (p.ej., Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum, Lycopersicon pyriforme), Macrotyloma spp., Malus spp., Malpighia emarginata, Mammea americana, Mangifera indica, Manihot spp., Manilkara zapota, Medicago sativa, Melilotus spp., Mentha spp., Miscanthus sinensis, Momordica spp., Morus nigra, Musa spp., Nicotiana spp., Olea spp., Opuntia spp., Ornithopus spp., Oryza spp. (p ej., Oryza sativa, Oryza latifolia), Panicum miliaceum, Panicum virgatum, Passiflora edulis, Pastinaca sativa, Pennisetum sp., Persea spp., Petroselinum crispum, Phalaris arundinacea, Phaseolus spp., Phleum pratense, Phoenix spp., Phragmites australis, Physalis spp., Pinus spp., Pistacia vera, Pisum spp., Poa spp., Populus spp., Prosopis spp., Prunus spp., Psidium spp., Punica granatum, Pyrus communis, Quercus spp., Raphanus sativus, Rheum rhabarbarum, Ribes spp., Ricinus communis, Rubus spp., Saccharum spp., Salix sp., Sambucus spp., Secale cereale, Sesamum spp., Sinapis sp., Solanum spp. (p. ej,.Solanum tuberosum, Solanum integrifollum of Solanum /ycopersicum), Sorghum bicolor, Spinacia spp., Syzygium spp., Tagetes spp., Tamarindus indica, Theobroma cacao, Trifolium spp., Tripsacum dactyloides, Triticosecale rimpaui, Triticum spp. (p ej., Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum, Triticum monococcum or Triticum vulgare), Tropaeolum minus, Tropaeolum majus, Vaccinium spp., Vicia spp., Vigna spp., Viola odorata, Vitis spp., Zea mays, Zizania palustris, Ziziphus spp., entre

otras.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a los siguientes puntos:

1.

Un procedimiento para aumentar en plantas en condiciones de deficiencia de nitrógeno respecto a las plantas de control, que comprende introducir y expresar en una planta un ácido nucleico que codifica un polipéptido de tipo NAP-1, en el que el polipéptido de tipo NAP-1 comprende un dominio de NAP, en el que dicho polipéptido de tipo NAP-1 tiene una identidad de secuencia de al menos 80% o más con el polipéptido de tipo NAP-1 representado por la SEC ID Nº 2 y, además, en el que dicho polipéptido de tipo NAP-1 tiene sustancialmente la misma actividad biológica y funcional que la SEC ID Nº 2.

2.

Procedimiento de acuerdo con el punto 1, en el que dicho ácido nucleico que codifica un polipéptido de tipo NAP-1 está representado por uno cualquier del ácido nucleico de las SEC ID Nº dadas en la Tabla A o una porción del mismo, o una secuencia capaz de hibridar con uno cualquiera de los ácidos nucleicos de SEC ID Nº dadas en la tabla A.

3.

Procedimiento de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 o 2, en el que dicha secuencia de ácido nucleico codifica un ortólogo o parálogo de cualquiera de las SEC lD Nº presentadas en la Tabla A.

4.

El procedimiento de acuerdo con cualquier punto precedente, en el que dicho aumento del rendimiento es aumento de la biomasa y/o aumento del rendimiento de semillas.

5.

Procedimiento de acuerdo con el punto 4, en el que dicho aumento del rendimiento comprende al menos un incremento del peso total de las semillas y/o un incremento del número de semillas llenas.

6.

Procedimiento de acuerdo con cualquier punto procedente, en el que dicho ácido nucleico está unido operablemente a un promotor constitutivo, preferiblemente a un promotor GOS2.

7.

Procedimiento de acuerdo con cualquier punto precedente, en el que dicho ácido nucleico que codifica un polipéptido de tipo NAP1 es de origen vegetal, preferiblemente de una planta dicotiledónea, adicionalmente preferiblemente de la familia Brassicaceae, más preferentemente del género Arabidopsis, lo más preferentemente del género Arabidopsis thaliana.

8.

Uso de una construcción para aumentar el rendimiento en plantas cultivadas en condiciones de deficiencia de nitrógeno con respecto a las plantas de control, en el que dicha construcción comprende

a.

un ácido nucleico que codifica una polipéptido de tipo NAP1 como se define en uno cualquiera de los puntos 1 a 3;

b.

una o más secuencias de control capaces de dirigir la expresión de la secuencia de ácido nucleico de (a) ; y opcionalmente

c.

una secuencia de terminación de la transcripción,

y en el que una de dichas secuencias control es un promotor constitutivo, preferentemente un promotor GOS2.

9. Uso de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de tipo NAP1 en un procedimiento para aumentar el rendimiento en plantas cultivadas en condiciones de deficiencia de nitrógeno respecto a las plantas de control, en el que dicho polipéptido de tipo NAP1 es como se ha definido en uno cualquiera de los puntos 1 a 3.

De acuerdo con una primera realización, la presente invención proporciona un procedimiento para incrementar la tolerancia al estrés abiótico en plantas respecto a las plantas de control, que comprende modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de tipo NAP1.

En la presente invención, el ácido nucleico que codifica un polipéptido de tipo NAP1 se modula introduciendo y expresando en una planta un ácido nucleico que codifica un polipéptido de tipo NAP1.

Se considera que cualquier referencia en lo sucesivo en el presente documento a una "proteína útil en los procedimientos de la invención" significa un polipéptido de tipo NAP1 como se define en el presente documento. Se considera que cualquier referencia en lo sucesivo en el presente documento a un "ácido nucleico útil en los procedimientos de la invención" significa un ácido nucleico capaz de codificar tal polipéptido de tipo NAP1. El ácido nucleico que va a introducirse en una planta (y por lo tanto es útil para realizar los procedimientos de la invención) es cualquier ácido nucleico que codifique el tipo de proteína que se describirá a continuación, en lo sucesivo en el presente documento también llamado "ácido nucleico de tipo NAP1” o "gen de tipo NAP1”.

La expresión de “proteína de tipo NAP1” como se define en el presente documento hace referencia a cualquier proteína que comprende un dominio NAP y una región ácida en el extremo C. La expresión “dominio NAP”, como se usa en el presente documento, es como se define en la base de datos Pfam con el número de acceso PF00956 (base de datos alojada por el Sanger Institute, UK; Bateman et al., Nucleic Acids Research 30(1):276 -280 (2002),

véase, por ejemplo, la Tabla 3). Preferentemente, las secuencias de las proteínas de tipo NAP1 útiles en la presente invención tienen un dominio NAP que comprenden una firma (T/S)FF(T/N/S/E/D)(W/F)(L/F) (SEC ID Nº 33) y/o la secuencia de aminoácidos conservada como se presenta en la SEC ID Nº 34. Preferentemente, la firma de la SEC ID Nº 33 es SFF(T/N/S)(W/F)F. Preferentemente, el dominio NAP de una proteína de tipo NAP útil en los procedimientos de la presente invención tiene el orden creciente de preferencia de una identidad de secuencia de al menos 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 % con la SEC ID Nº 32. Más preferentemente, el dominio NAP de una proteína de tipo NAP1 útil en los procedimientos de la presente invención tiene, en orden creciente de preferencia, una identidad de secuencia de al menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % con la SEC ID Nº 32. Lo más preferentemente, el dominio NAP es como se representa en la SEC ID Nº

32. La expresión “región ácida en el extremo C” o “extremo C ácido” como se usa en el presente documento hace referencia al extremo carboxi de la proteína, con el extremo carboxi es de una longitud de aproximadamente 20 a 25 aminoácidos, de los cuales al menos 13 residuos son ácido glutámico y/o ácido aspártico.

Tabla 3: Ejemplos de proteínas de Arabidopsis que comprenden el dominio NAP1

ID del gen.

Perfil de Pfam Posición Puntuación Valor e SEC ID Nº:

at1g18800

PF00956 27 -224 147,7 2 e-40 20, 21

at1g74560

PF00956 31 -229 135,0 1,3 e-36 1,2

at2g19480

PF00956 52 -300 457,4 1,2 e-133 26, 27

at5g56950

PF00956 52 -300 473,2 2,2 e-138 28, 29

at4g26110

PF00956 52 -301 503,4 1,7 e-147 24, 25

at3g 13782

PF00956 69 -311 300,7 1,7 e-86 30, 31

Adicionalmente, los polipéptidos de tipo NAP1 (al menos en su forma nativa) tienen actividad inhibidora de la PP2a fosfatasa. Herramientas y técnicas para medir la actividad inhibidora de la PP2a fosfatasa son bien conocidas en la materia, véase, por ejemplo, Li et al, J. Biol. Chem. 271, 11059 – 11062, y referencias en el mismo. Las actividades de remodelado de la cromatina se pueden analizar de varios modos, tales como medición de la actividad de unión al ADN en un ensayo de retardo en gel (Fan et al., 2002) o medición de la actividad de unión de la histona usando ELISA (Rodriguez et al. (1997) Genomics 44, 253 -265). La actividad de plegado el ADN se puede determinar en un ensayo de circularización mediada por ligasa (Fan et al., 2002) o en un ensayo de superenrrollamiento (Fujii-Nakata et al.(1992) J. Biol. Chem. 267, 20980 -20986; Yoon et al. (1995), Mol. Gen. Gen. 249, 465 -473). Otras guías para caracterizar las proteínas de tipo NAP1 se proporcionan en el ejemplo 6.

Preferentemente, la secuencia de polipéptidos que cuando se usan en la construcción de un árbol filogenético, tal como el representado en la Figura 4, los conjuntos con el grupo de polipéptidos de tipo NAP1 que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº 2 en lugar de con cualquier otro grupo.

Los términos "dominio" y "motivo" se definen en el presente documento en la sección de "definiciones". Existen bases de datos especializadas para la identificación de dominios, por ejemplo, SMART (Schultz et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857 -5864; Letunic et al. (2002) Nucleic Acids Res 30, 242 -244, InterPro (Mulder et al., (2003) Nucl. Acids. Res. 31, 315 -318, Prosite (Bucher and Bairoch (1994), A generalized profile syntax for biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequence interpretation. (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Eds., pp53 -61, AAAIPress, Menlo Park; Hulo et al., Nucl. Acids. Res. 32:D134-D137, (2004), o Pfam (Bateman et al., Nucleic Acids Research 30(1): 276 -280 (2002). Un conjunto de herramientas para el análisis en silico de secuencias de proteínas está disponible en el servidor de protómicos ExPASI (alojado por el Swiss institute of Bioinformatics (Gasteiger et al., ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis, Nucleic Acids Res. 31:3784 -3788(2003)). Los dominios pueden también identificarse usando técnicas de rutina, tales como mediante alineación de secuencia.

El análisis de la secuencias de polipéptidos de la SEC ID Nº 2 en la base de datos SMART reveló que había un dominio NAP (entrada PFAM PF0059, Fig. 1). Este dominio es específico de las proteínas NAP, que se ha postulado que están implicadas en el desplazamiento de las histonas al núcleo, el ensamblaje del nucleosoma y la fluidez de la cromatina. Alineando la secuencia de SEC ID Nº 2 con secuencias de otras proteínas de tipo NAP1, se puede determinar la localización del dominio NAP.

Procedimientos para el alineamiento de 45 secuencias para comparación son muy conocidos en la materia, tales procedimientos incluyen GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA. GAP usa el algoritmo de Needleman y Wunsch ( (1970) J Mol Biol 48: 443 -453) para encontrar el alineamiento global (es decir, que abarca las secuencias completas) de dos secuencias completas que maximiza el número de concordancias y minimiza el número de

huecos. El algoritmo BLAST (Altschul et al. (1990) J Mol Biol 215: 403 -10) calcula el porcentaje de identidad de secuencias y realiza un análisis estadístico de la similitud entre las dos secuencias. El software para realizar análisis BLAST está disponible para el público a través del National Center for Biotechnology Information (NCBI). Los homólogos pueden identificarse fácilmente usando, por ejemplo, el algoritmo de alineamiento de secuencias múltiple ClustalW (versión 1.83), con los parámetros de alineamiento por parejas por defecto, y un procedimiento de puntuación en porcentaje. Los porcentajes generales de similitud e identidad también se pueden determinar usando uno de los procedimientos disponible en el paquete de software MatGAT (Campanella et ál., BMC Bioinformatics. 2003 Jul 10;4: 29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences.). Puede realizarse una pequeña edición manual para optimizar el alineamiento entre motivos conservados, como será evidente para un experto en la materia. Además, en lugar de utilizar secuencias de longitud completa para la identificación de homólogos, también se pueden utilizar dominios específicos. Para alineamientos locales, el algoritmo de Smith-Waterman es particularmente útil (Smith TF, Waterman MS (1981) J. Mol. Biol 147(1); 195 -7). Los valores de identidad de secuencias, que se indican más adelante en el ejemplo 3 como un porcentaje, se determinaron a lo largo de todo el ácido nucleico o secuencia de aminoácidos y/o sobre dominios seleccionados o motivo(s) conservados usando los programas mencionados anteriormente con los parámetros por defecto.

La presente invención se ilustra transformando plantas con la secuencia de ácido nucleico representada por la SEC ID Nº 1, que codifica la secuencia de polipéptidos de la SEC ID Nº 2. No obstante, el rendimiento de la invención no está restringido a estas secuencias, los procedimientos de la invención se pueden realizar ventajosamente usando cualquier ácido nucleico que codifica proteínas de tipo NAP1 o polipéptidos de tipo NAP1 como se define en las reivindicaciones.

Ejemplos de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de tipo NAP1 se proporcionan en la Tabla A del ejemplo 1 en el presente documento. Dichos ácidos nucleicos son útiles en la realización de los en los procedimientos de la memoria. Las secuencias de aminoácidos proporcionadas en la Tabla A del Ejemplo 1 son ejemplos de secuencias de ortólogos y parálogos de polipéptidos de tipo NAP1 representados por la SEC ID Nº 2, siendo los términos "ortólogos" y "parálogos" como se definen en el presente documento. Otros ortólogos y parálogos pueden ser fácilmente identificados llevando a cabo una búsqueda denominada blast reciproco. Típicamente, esto implica un primer BLAST que implica someter una secuencia de consulta a BLAST (por ejemplo utilizando cualquiera de las secuencias indicadas en la Tabla A del Ejemplo 1) contra cualquier base de datos de secuencias, tal como la base de datos del NCBl disponible al público. BLASTN o TBLASTX (que utilizan valores estándar predeterminados) se utilizan generalmente cuando se parte de una secuencia nucleotídica, y BLASTP o TBLASTN (que utilizan valores estándar predeterminados) cuando se parte de una secuencia proteica. Los resultados de BLAST opcionalmente se pueden filtrar. Las secuencias de longitud completa ya sea de los resultados filtrados o de los resultados no filtrados se someten luego nuevamente a BLAST (segundo BLAST) contra las secuencias del organismo a partir de las cuales deriva la secuencia de consulta (donde la secuencia de consulta es la SEC ID Nº 1 o la SEC ID Nº 2, el segundo BLAST seria por lo tanto contra las secuencias de Arabidopsis thaliana). Después se comparan los resultados del primero y el segundo BLAST. Se identifica un parálogo si una respuesta pertinente de alto rango del primer blast es de la misma especie que aquella de la cual se deriva la secuencia de consulta, un BLAST posterior resulta idealmente luego en la secuencia de consulta como una respuesta pertinente más alta; se identifica un ort6logo si una respuesta pertinente de alto rango en el primer BLAST no proviene de la misma especie que aquella de la cual se deriva la secuencia de consulta, y preferiblemente resulta del BLAST posterior estando la secuencia de consulta entre las respuestas pertinentes más altas.

Las respuestas pertinentes de alto rango son aquellas que tienen un valor E bajo. Cuanto más bajo es el valor E, más significativo es la puntuación (o, en otras palabras, es más baja la posibilidad de que la respuesta pertinente se halle por casualidad). La computación del valor E es bien conocida en la técnica. Además de los valores E, las comparaciones también se puntúan mediante la identidad porcentual. La identidad porcentual se refiere al número de nucleótidos idénticos (o aminoácidos) entre las dos secuencias de ácidos nucleicos (o polipéptidos) comparadas sobre una longitud particular. En el caso de grandes familias, se puede utilizar Clustal, seguido de un árbol filogenético, para ayudar a visualizar el agrupamiento de genes relacionados y para identificar ortólogos y parálogos.

Las variantes de ácido nucleico también pueden ser útiles para llevar a la práctica los procedimientos de la invención. Ejemplos de tales variantes incluyen ácidos nucleicos que codifican homólogos y derivados de una cualquiera de las secuencias de aminoácidos presentadas en la Tabla A del Ejemplo 1, siendo los términos "homólogo" y "derivado" como se definieron en el presente documento. También son útiles en los procedimientos de la invención los ácidos nucleicos que codifican homólogos y derivados de ortólogos o parálogos de una cualquiera de las secuencias de aminoácidos indicadas en la Tabla A del Ejemplo 1. Los homólogos y derivados útiles en los procedimientos de la presente invención tienen sustancialmente la misma actividad biológica y funcional que la proteína no modificada de la cual derivan.

Otras variantes de ácido nucleico útiles en la práctica de los procedimientos de la invención incluyen porciones de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de tipo NAP1, ácidos nucleicos que hibridan con ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de tipo NAP1, variantes de corte y empalme de secuencias de ácidos nucleico que codifican polipéptidos de tipo NAP1, variantes alélicas de secuencias de ácidos nucleico que codifican polipéptidos de tipo NAP1 y variantes de ácidos nucleico que codifican polipéptidos de tipo NAP1 obtenidos por medio redistribución de genes. Los términos secuencias de hibridación, variante de corte y empalme, variante alélica y redistribución de

genes son como se describe en el presente documento.

Los ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de tipo NAP1 no necesitan ser ácidos nucleicos de longitud completa, ya que el desempeño de los procedimientos de la invención no confía en el uso de secuencias de ácido nucleico de longitud completa. Divulgado en la presente invención, se proporciona un procedimiento para aumentar la resistencia al estrés abiótico, que comprende la introducción y la expresión en una planta de una porción de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico presentadas en la Tabla A del Ejemplo 1, o una porción de una secuencia de ácido nucleico que codifica un ortólogo, parálogo u homólogo de cualquiera de las secuencias de aminoácidos presentadas en la Tabla A del Ejemplo 1.

Una porción de un ácido nucleico se puede preparar, por ejemplo, haciendo una o más deleciones en el ácido nucleico. Las porciones se pueden utilizar en forma aislada o se pueden fusionar a otras secuencias codificadoras (o no codificadoras) con el propósito de producir, por ejemplo, una proteína que combina varias actividades. Cuando se fusionan a otras secuencias codificadoras, el polipéptido resultante producido después de la traducción puede ser más grande que el predicho para la porción de proteína.

Las porciones útiles en los procedimientos de la invención codifican un polipéptido de tipo NAP1 como se define en las reivindicaciones y tienen sustancialmente la misma actividad biológica que las secuencias de aminoácidos proporcionadas en las reivindicaciones. La porción puede ser una porción de uno cualquiera de los ácidos nucleicos presentados en la Tabla A del Ejemplo 1, o puede ser una porción de un ácido nucleico que codifica un ortólogo o un parálogo de una cualquiera de las secuencias de aminoácidos presentadas en la Tabla A del Ejemplo 1. En el presente documento se divulgan porciones que son, en orden creciente de preferencia, de al menos 400, 500, 600 or 700 nucleótidos consecutivos de longitud, siendo los nucleótidos consecutivos de una cualquiera de las secuencias de ácido nucleico presentadas en la Tabla A del Ejemplo 1, o de un ácido nucleico que codifica un ortólogo o un parálogo de una cualquiera de las secuencias de aminoácidos presentadas en la Tabla A del Ejemplo

1. Lo más preferiblemente, la porción es una porción del ácido nucleico de SEC lD Nº 1. La porción puede codificar una secuencia de aminoácidos que comprende (uno cualquiera o más de los dominios o motivos definidos en el presente documento). Preferentemente, la porción codifica una secuencia de aminoácidos que cuando se usan en la construcción de un árbol filogenético, tienden al agrupamiento con el grupo de polipéptidos de tipo NAP1 que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº 2 en lugar de con cualquier otro grupo.

Otra variante de la secuencia de ácido nucleico divulgada en el presente documento es un ácido nucleico capaz de hibridar, en condiciones de rigurosidad reducida, preferiblemente en condiciones rigurosas, con un ácido nucleico que codifica un polipéptido de tipo NAP como se define en el presente documento o con una porción como se define en el presente documento.

Divulgado en la presente invención, se proporciona un procedimiento para aumentar la resistencia al estrés abiótico, que comprende la introducción y la expresión en una planta de un ácido nucleico capaz de hibridar con uno cualquiera de los ácidos nucleicos presentados en la Tabla A del Ejemplo 1, o que comprende introducir y expresar en una planta un ácido nucleico capaz de hibridar con un ácido nucleico que codifica un ortólogo, parálogo u homólogo de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos presentadas en la Tabla A del Ejemplo 1.

Las secuencias de hibridación en los procedimientos de la invención codifican un polipéptido de tipo NAP1 como se define en el presente documento y tienen sustancialmente la misma actividad biológica que las secuencias de aminoácidos proporcionadas en las reivindicaciones. La secuencia de hibridación puede ser capaz de hibridar con una cualquiera de los ácidos nucleicos presentados en la Tabla A del Ejemplo 1, o a una porción de cualquiera de estas secuencias, siendo una porción como se definió anteriormente, o en el que la secuencia de hibridación es capaz de hibridar con un ácido nucleico que codifica un ortólogo o parálogo de una cualquiera de las secuencias de aminoácidos presentadas en la Tabla A del Ejemplo 1. La secuencia de hibridación puede ser capaz de hibridar con un ácido nucleico representada por la SEC lD Nº 1 o una porción de la misma. La secuencia de hibridación puede codificar una secuencia de aminoácidos que comprende uno o más de los dominios o motivos definidos en el presente documento. La secuencia de hibridación puede codificar una secuencia de aminoácidos que cuando se usan en la construcción de un árbol filogenético, tienden al agrupamiento con el grupo de polipéptidos de tipo NAP1 que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº 2 en lugar de con cualquier otro grupo.

Otra variante del ácido nucleico divulgado en el presente documento es una variante de corte y empalme que codifica un polipéptido de tipo NAP1 como se define en el presente documento anteriormente, siendo una variante de corte y empalme como se definió en el presente documento.

Divulgado en el presente documento, se proporciona un procedimiento para aumentar la resistencia al estrés abiótico, que comprende la introducción y la expresión en una planta una variante de corte y empalme de una cualquiera de las secuencias de ácido nucleico presentadas en la Tabla A del Ejemplo 1, o una variante de corte y empalme de un ácido nucleico que codifica un ortólogo, parálogo u homólogo de cualquiera de las secuencias de aminoácidos presentadas en la Tabla A del Ejemplo 1.

Variantes de corte y empalme preferidas son variantes de corte y empalme de un ácido nucleico representado por la SEC lD Nº 1 o una variante de corte y empalme de que codifica un ortólogo o un parálogo de la SEC lD Nº 2.

Preferentemente, la secuencia de aminoácidos codificada por la variante de corte y empalme comprende uno o más de los dominios o motivos definidos en el presente documento. Preferentemente, secuencia de aminoácidos codificada por la variante de corte y empalme cuando se usa en la construcción de un árbol filogenético, tiende al agrupamiento con el grupo de polipéptidos de tipo NAP1 que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº 2 en lugar de con cualquier otro grupo.

Otra variante del ácido nucleico divulgado en el presente documento es una variante alélica que codifica un polipéptido de tipo NAP1 como se define en el presente documento anteriormente, siendo una variante alélica como se definió en el presente documento.

Divulgado en el presente documento, se proporciona un procedimiento para aumentar la resistencia al estrés abiótico, que comprende la introducción y la expresión en una planta una variante alélica de una cualquiera de los ácidos nucleicos presentados en la Tabla A del Ejemplo 1, o que comprende introducir y expresar en una planta una variante alélica de un ácido nucleico que codifica un ortólogo, parálogo u homólogo de cualquiera de las secuencias de aminoácidos presentadas en la Tabla A del Ejemplo 1.

Las variantes alélicas divulgadas en el presente documento tienen sustancialmente la misma actividad biológica que el polipéptido de tipo NAP-1 de SEC ID Nº 2 y cualquiera de los aminoácidos representados en la Tabla A del Ejemplo 1. Existen variantes alélicas en la naturaleza y abarcado dentro de los procedimientos de la presente invención está el uso de estos alelos naturales. Preferentemente, la variante alélica es una variante alélica de la SEC ID Nº 1 o una variante alélica que codifica un ortólogo o un parálogo de la SEC lD Nº 2. Preferentemente, los aminoácidos codificados por la variante alélica comprenden uno o más de los dominios o motivos definidos en el presente documento. Preferentemente, secuencia de aminoácidos codificada por la variante alélica cuando se usa en la construcción de un árbol filogenético, tiende al agrupamiento con el grupo de polipéptidos de tipo NAP1 que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº 2 en lugar de con cualquier otro grupo.

La redistribución de genes o evolución dirigida también se puede utilizar para generar variantes de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de tipo NAP1 como se ha definido anteriormente; siendo el término "redistribución de genes" como se define en el presente documento.

Divulgado en el presente documento, se proporciona un procedimiento para aumentar la resistencia al estrés abiótico, que comprende la introducción y la expresión en una planta una variante de una cualquiera de las secuencias de ácido nucleico presentados en la Tabla A del Ejemplo 1, o que comprende introducir y expresar en una planta una variante de un ácido nucleico que codifica un ortólogo, parálogo u homólogo de cualquiera de las secuencias de aminoácidos presentadas en la Tabla A del Ejemplo 1, variante de ácido nucleico que se obtiene por medio de redistribución de genes.

Preferentemente, el ácido nucleico variante obtenido mediante redistribución de genes codifica una secuencia de aminoácidos que comprende uno cualquiera o más de los motivos o dominios como se define en el presente documento. Preferentemente, secuencia de aminoácidos codificada por la variante de ácido nucleico obtenida mediante redistribución génica cuando se usa en la construcción de un árbol filogenético, tiende al agrupamiento con el grupo de polipéptidos de tipo NAP1 que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº 2 en lugar de con cualquier otro grupo.

Además, también se pueden obtener variantes de ácido nucleico mediante mutagénesis dirigida al sitio. Se dispone de varios procedimientos para lograr una mutagénesis dirigida al sitio, siendo los más frecuentes los procedimientos basados en PCR (Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Eds.).

Los ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de tipo NAP1 pueden derivarse de cualquier fuente natural o artificial. El ácido nucleico puede modificarse a partir de su forma nativa en composición y/o ambiente genómico a través de manipulación humana deliberada. Preferiblemente, el ácido nucleico que codifica un polipéptido de tipo NAP1 procede de una planta, preferiblemente además de una planta monocotiledónea, más preferiblemente de la familia Brassicaceae, más preferentemente del género Arabidopsis, lo más preferentemente de Arabidopsis thaliana.

El desempeño de los procedimientos de la invención produce plantas que tienen una mayor resistencia al estrés abiótico (o tolerancia al estrés abiótico, términos que se usan de forma intercambiable), como se define en las reivindicaciones, efectuados como rasgos potenciados relacionados con el rendimiento en comparación con las plantas de control cuando se cultivan en condiciones de estés abiótico como se define en las reivindicaciones. En particular, el desempeño de los procedimientos de la invención produce plantas que tienen un incremento del rendimiento, especialmente un rendimiento incrementado de las semillas en relación con las plantas de control. Los términos "rendimiento" y "rendimiento de semillas" se describen con más detalle en la sección de "definiciones" en el presente documento". No obstante, cabe destacar que el término “rasgos relacionados con el rendimiento" no abarca el contenido en metabolitos de las células vegetales y que los rasgos relacionados con el rendimiento potenciados son el resultado del incremento de la resistencia al estrés como se define en las reivindicaciones.

Como referencia en el presente documento a los rasgos relacionados con el rendimiento potenciado se considera que significa un aumento de la biomasa (peso) de una o más partes de una planta, que puede incluir partes aéreas (cosechables) y / o partes por debajo del suelo (cosechables). En particular, tales partes cosechables son semillas, y

el rendimiento de los procedimientos de la invención resulta en plantas que tienen mayor rendimiento de semillas con relación al rendimiento de semillas de las plantas de control.

Tomando el maíz como ejemplo, un incremento de rendimiento se puede manifestar como uno o más de lo siguiente: incremento en el número de plantas establecidas por hectárea o área, un incremento en el número de espigas por planta, un incremento en el número de surcos, el número de granos por surco, el peso del grano, el peso de mil granos, la longitud/diámetro de las espigas, un incremento en el grado de llenado de las semillas (que es el número de semillas llenas dividido por el número total de semillas y multiplicado por 100), entre otros. Tomando el arroz como un ejemplo, un incremento del rendimiento puede manifestarse a través de un incremento en uno o más de los siguientes: número de plantas por hectárea o área, número de panículos por planta, número de espiguillas por panículo, número de flores (flósculos) por panículo (que se expresa como una relación del número de semillas llenas al número de panículos primarios), incremento en el grado de llenado de semillas (que es el número de semillas llenas dividido por el número total de semillas y multiplicado por 100), incremento en el peso de mil granos, entre otros.

La presente invención proporciona un procedimiento como se define en las reivindicaciones para aumentar la resistencia al estrés abiótico de las plantas, que da como resultado un rendimiento incrementado, espacialmente un rendimiento de semillas de plantas, con relación a plantas de control, cuando se cultivan en condiciones de estrés abiótico, en el que el procedimiento comprende modular la expresión, preferentemente incrementar la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de tipo NAP1 como se define en las reivindicaciones.

Puesto que las plantas transgénicas divulgadas en el presente documento tienen un rendimiento incrementado, es probable que estas plantas exhiban una velocidad de crecimiento incrementada (durante al menos parte de su ciclo vital), con relación a la velocidad de crecimiento de plantas de control en una fase correspondiente de su ciclo vital. Además del incremento en la capacidad del rendimiento, una mayor eficiencia de captación de nutrientes también puede contribuir a un incremento del rendimiento. Se observa que las plantas divulgadas en el presente documento muestran una mayor eficiencia en la captación de nutrientes. El incremento en la eficiencia en la captación de nutrientes permite un mejor crecimiento de la planta cuando está bajo estrés.

La velocidad de crecimiento incrementada puede ser específica para una o más partes de una planta (incluyendo las semillas), o puede ser sustancialmente en toda la planta. Las plantas que tienen una velocidad de crecimiento incrementada pueden tener un ciclo vital más corto. Puede considerarse que el ciclo vital de una planta significa el tiempo necesario para que crezca desde una semilla madura seca hasta la fase en la que la planta ha producido semillas maduras secas, similares al material de partida. Este ciclo vital puede estar influenciado por factores tales como el vigor temprano, la velocidad de crecimiento, el índice de verdor, la época de floración y la velocidad de maduración de las semillas. El incremento en la velocidad de crecimiento puede tener lugar en una o más fases del ciclo vital de una planta o sustancialmente durante todo el ciclo vital de la planta. La velocidad de crecimiento incrementada durante las fases tempranas del ciclo vital de una planta puede reflejar un vigor estimulado. El incremento en la velocidad de crecimiento puede alterar el ciclo de recolección de una planta permitiendo que las plantas se siembren más tarde y/o se recolecten antes de lo que sería posible de otro modo (un efecto similar puede obtenerse con una época de floración más temprana). Si la velocidad de crecimiento se incrementa suficientemente, puede permitir la siembra adicional de semillas de la misma especie de planta (por ejemplo la siembra y la recolección de plantas de arroz seguida por la siembra y la recolección de plantas de arroz adicionales todo dentro de un período de crecimiento convencional). De forma similar, si la velocidad de crecimiento se incrementa suficientemente, puede permitir la siembra adicional de semillas de especies de plantas diferentes (por ejemplo la siembra y la recolección de plantas de maíz después de, por ejemplo, la siembra y la recolección opcional de soja, patata o cualquier otra planta adecuada). También son posibles épocas adicionales de recolección del mismo patrón en el caso de algunas plantas de cultivo. Alterar el ciclo de recolección de una planta puede conducir a un incremento en la producción de biomasa anual por área (debido a un incremento en el número de veces (pongamos por caso en un año) que cualquier planta particular puede desarrollarse y recolectarse). Un incremento en la velocidad de crecimiento también puede permitir el cultivo de plantas transgénicas en un área geográfica más amplia que sus homólogos silvestres, ya que las limitaciones territoriales para desarrollar una cosecha a menudo están determinadas por condiciones ambientales adversas bien en la época de plantación (principio de temporada) o bien en la época de recolección (final de temporada). Tales condiciones adversas pueden evitarse si se acorta el ciclo de recolección. La velocidad de crecimiento se puede determinar derivando diversos parámetros de las curvas de crecimiento, tales parámetros pueden ser: T-Medio (el tiempo empleado por las plantas para alcanzar 50% de su tamaño máximo) y T-90 (el tiempo empleado por las plantas para alcanzar 90% de su tamaño máximo), entre otros.

En el presente documento se divulgan plantas que tienen una mayor velocidad de crecimiento frente a las plantas de control cuando crecen en condiciones de estrés abiótico. Por tanto, divulgado en el presente documento, se proporciona un procedimiento para aumentar la velocidad de crecimiento de las plantas en condiciones de estrés abiótico, procedimiento que comprende modular la expresión, preferentemente aumentar la expresión, en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de tipo NAP-1 como se define en el presente documento.

Un incremento en el rendimiento de semillas y/o la velocidad de crecimiento se produce si la planta se expone a varias condiciones de estrés abiótico en comparación con plantas de control Típicamente, las plantas responden a una exposición a estrés creciendo más lentamente. En condiciones de estrés riguroso, la planta puede incluso

detener totalmente el crecimiento. Por otra parte, el estrés suave se define en el presente documento como cualquier estrés al que se expone una planta que no da como resultado que la planta deje de crecer totalmente sin la capacidad de reanudar el crecimiento. El estrés suave en el sentido de la invención conduce a una reducción en el crecimiento de las plantas estresadas de menos de 40%, 35% o 30%, preferiblemente menos de 25%, 20% o 15%, más preferiblemente menos de 14%, 13%, 12%, 11% o 10% o memos en comparación con la planta de control bajo condiciones libres de estrés. Debido a los avances en las prácticas agrícolas (irrigación, fertilización, tratamientos con plaguicidas) no se encuentras estreses rigurosos en plantas cultivadas. Como consecuencia, el crecimiento comprometido inducido por estrés suave a menudo es una característica no deseable para la agricultura. Los estreses suaves (como se usan en el presente documento) son los estreses abióticos (ambientales) diarios a los que está expuesta una planta. Los estreses abióticos pueden deberse a sequía o exceso de agua, estrés anaerobio, estrés salino, toxicidad química, estrés oxidativo y temperaturas cálidas, frías o de congelación. El estrés abiótico puede ser un estrés osmótico provocado por un estrés hídrico (particularmente debido a la sequía), estrés salino, estrés oxidativo o un estrés iónico.

Otro ejemplo de estrés abiótico ambienta es la capacidad reducida de uno o más nutrientes que tienen que ser asimilados por las plantas para su crecimiento y desarrollo. Debido a la fuerte influencia de la eficiencia de la utilización de la nutrición sobre el rendimiento de la planta y la calidad del producto, se vierte una enorme cantidad de fertilizante en los campos para optimizar el crecimiento y calidad de las plantas. La productividad de las plantas en general está limitada por tres nutrientes principales, fósforo, potasio y nitrógeno, que normalmente es el elemento limitante de la velocidad de crecimiento de las plantas. Por lo tanto el elemento nutricional principal requerido para el crecimiento de las plantas es el nitrógeno (N). Es un constituyente de numerosos compuestos importantes hallados en las células vivas, incluidos aminoácidos, proteínas (enzimas), ácidos nucleicos y clorofila. Del 1, 5% al 2% de la materia seca de una planta es nitrógeno y aproximadamente 16% de la proteína total de la planta. Por lo tanto, la disponibilidad de nitrógeno es un factor limitante principal para el crecimiento y producción de las plantas de cultivo (Frink et al. (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96(4): 1175 -1180),, y tiene también un impacto principal en la acumulación de proteínas y composición de los aminoácidos. Por lo tanto, son de gran interés las plantas de cultivo con un mayor rendimiento cuando se cultivan en condiciones limitantes de nitrógeno.

Los estreses bióticos son típicamente los estreses provocados por patógenos, tales como bacterias, virus, hongos e insectos.

En particular, los procedimientos de la presente invención pueden realizarse en condiciones libres de estrés como se define en las reivindicaciones, para dar plantas que tienen un rendimiento incrementado con relación a plantas de control. Como se indica en Wang et al. (Planta (2003) 218: el estrés abiótico conduce a una serie de cambios morfológicos, fisiológicos, bioquímicos y moleculares que afectan adversamente al crecimiento y la productividad de las plantas. Se sabe que la sequía, la salinidad, las temperaturas extremas y el estrés oxidativo están interconectados y pueden inducir daños en el crecimiento y celulares a través de mecanismos similares. Rabbani et al. (Plant Physiol (2003) 133: 1755 -1767) describe un grado particularmente alto de "réplica" entre el estrés por sequía y el estrés por alta salinidad. Por ejemplo, la sequía y/o la salinización se manifiestan principalmente como estrés osmótico, dando como resultado la ruptura de la homeostasis y la distribución iónica en la célula. El estrés oxidativo, que con frecuencia acompaña a la temperatura alta o baja, el estrés por salinidad o sequía, puede provocar la desnaturalización de proteínas funcionales y estructurales. Como consecuencia, estos diversos estreses ambientales a menudo activan rutas de señalización celulares y respuestas celulares similares, tales como la producción de proteínas de estrés, la regulación por aumento de antioxidantes, la acumulación de solutos compatibles y la interrupción del crecimiento. El término condiciones "libres de estrés", según se usa en el presente documento, se refiere a las condiciones ambientales que permiten el crecimiento óptimo de las plantas. Los expertos en la materia conocen las condiciones del suelo y las condiciones climáticas normales para una zona dada.

La realización de los procedimientos de la invención da plantas cultivadas en condiciones de estrés abiótico como se ha definido en las reivindicaciones incrementaron el rendimiento con relación a plantas de control adecuadas cultivadas bajo condiciones comparables. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se proporciona un procedimiento para incrementar el rendimiento en plantas cultivadas en condiciones de abiótico como se define en las reivindicaciones, en el que el procedimiento comprende incrementar la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de tipo NAP1. La mayor tolerancia al estrés abiótico es mayor tolerancia a la reducida disponibilidad de nutrientes como se define en las reivindicaciones.

También se divulga en el presente documento plantas o partes de las mismas (incluidas las semillas) obtenibles por los procedimientos de acuerdo con la presente invención. Las plantas o partes de las mismas comprenden un transgén de ácido nucleico que codifica un polipéptido de tipo NAP1 como se ha definido anteriormente.

También se divulgan en el presente documento construcciones génicas y vectores para facilitar la introducción y/o la expresión en plantas de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de tipo NAP1. Las construcciones génicas pueden insertarse en vectores que pueden encontrarse comercialmente disponibles, adecuados para la transformación en plantas y para la expresión del gen de interés en las células transformadas. La invención también proporciona el uso de una construcción génica como se define en los procedimientos de la invención.

Más específicamente, la presente memoria proporciona una construcción que comprende:

(a)

un ácido nucleico que codifica un polipéptido de tipo NAP1 como se ha definido en lo que antecede;

(b)

una o más secuencias de control capaces de dirigir la expresión de la secuencia de ácido nucleico de (a) ; y opcionalmente

(c)

una secuencia de terminación de la transcripción.

Preferentemente, el ácido nucleico que codifica un polipéptido de tipo NAP1 es como se ha definido en lo que antecede. El término "secuencia control" y "secuencia de terminación" son como se definen en el presente documento.

Las plantas se transforman con un vector que comprende cualquiera de los ácidos nucleicos descritos anteriormente. El experto en la técnica conoce bien los elementos genéticos que deben estar presentes en el vector con el fin de transformar con éxito, seleccionar y propagar células huésped que contienen la secuencia de interés. La secuencia de interés esta operablemente unida a una o más secuencias de control (al menos a un promotor)

De forma ventajosa se puede utilizar cualquier tipo de promotor para dirigir la expresión de la secuencia de ácido nucleico. Un promotor constitutivo es particularmente útil en los procedimientos de la invención, preferiblemente el promotor promotor constitutivo fuerte. Debe quedar claro que la aplicabilidad de la presente invención no está restringida al ácido nucleico que codifica el polipéptido de tipo NAP1 representado por la SEC ID Nº 1 ni está la aplicabilidad de la invención restringida a la expresión de un ácido nucleico que codifica el polipéptido de tipo NAP1 cuando está dirigido por un promotor constitutivo.

El promotor constitutivo es preferiblemente un promotor GOS2, más preferiblemente el promotor GOS2 de arroz. Lo más preferiblemente el promotor como se representa en la SEC lD Nº 39. Véase la Tabla 2 en la sección de "Definiciones" en el presente documento para otros ejemplos de promotores constitutivos. Preferentemente, la construcción comprende un casete de expresión como se representa con la SEC ID Nº 3.

Opcionalmente, una o más secuencias de terminación se pueden usar en la construcción introducida en una planta. Los elementos reguladores adicionales pueden incluir potenciadores de la transcripción así como también de traducción. Los expertos en la técnica conocerán las secuencias terminadoras y potenciadoras que puedan ser adecuadas para uso en la realización de la invención. Tales secuencias serian conocidas o pueden ser fácilmente obtenidas por un experto en la técnica.

Una secuencia intrónica también puede añadirse a la región no traducida 5’ (UTR) o en la secuencia codificante para incrementar la cantidad del mensaje maduro que se acumula en el citosol, descrito en la sección de definiciones.

Otras secuencias de control (además de las secuencias promotoras, potenciadoras, silenciadoras, intrónicas, las regiones 3’UTR y/o 5’UTR) pueden ser elementos estabilizantes de proteínas y/o ARN. Tales secuencias serian conocidas o pueden ser fácilmente obtenidas por un experto en la técnica.

Las construcciones de expresión divulgados en el presente documento pueden incluir además una secuencia origen de replicación que se requiere para el mantenimiento y/o replicación en un tipo celular específico. Un ejemplo es cuando se requiere mantener una construcción génica en una célula bacteriana como un elemento genético episomal (p. ej., una molécula de plásmido o cósmico) en una célula. Orígenes de replicación preferidos incluyen, entre otros, f1-ori y colE1 ori.

Para la detección y/o la selección de la transferencia satisfactoria de las secuencias de ácido nucleico en los procedimientos de la invención y/o selección de plantas transgénicas que comprende estos ácidos nucleicos, es conveniente utilizar genes marcadores (o genes indicadores). Por lo tanto, la construcción genética puede comprender opcionalmente un gen marcador seleccionable. Los marcadores seleccionables se describen en más detalle en la sección "definiciones" en el presente documento". Los genes marcadores pueden eliminarse o escindirse de la célula transgénica una vez que ya no se necesiten. Las técnicas para la retirada del marcador se conocen en la materia. Se describen técnicas útiles anteriormente en la sección de definiciones.

Se sabe que con la integración estable o transitoria de ácidos nucleicos en células vegetales, solo una minoría de las células recoge el ADN extraño y, si se desea, se integra en su genoma, dependiendo del vector de expresión usado y la técnica de transfección usada. Para identificar y seleccionar estos integrantes, un gen que codifica un marcador seleccionable (tal como los descritos anteriormente) se introduce habitualmente en las células huésped junto con el gen de interés. Estos marcadores pueden usarse, por ejemplo, en mutantes en los que estos genes no son funcionales mediante, por ejemplo, deleción por procedimientos convencionales. Adicionalmente, las moléculas de ácido nucleico que codifican un marcador seleccionable se pueden introducir en una célula huésped en el mismo vector que comprende la secuencia que codifica los polipéptidos de la invención o se pueden usar en los procedimientos de la invención, o también en un vector separado. Las células que se han transfectado establemente con el ácido nucleico introducido pueden identificarse, por ejemplo, mediante selección (por ejemplo, células que han integrado el marcador seleccionable sobreviven mientras que las otras células mueren).

La presente memoria también proporciona un procedimiento para la producción de plantas transgénicas que tienen rasgos relacionados con el rendimiento potenciado con relación a las plantas control, cuando se cultivan n condiciones de estrés abiótico, que comprenden la introducción y expresión en una planta de cualquier ácido nucleico que codifique un polipéptido de tipo NAP1, como se ha definido en presente documento anteriormente.

Más específicamente, la presente memoria proporciona un procedimiento para la producción de plantas transgénicas que tienen mayor rendimiento, en el que el procedimiento comprende:

(i)

introducir y expresar en una planta o célula vegetal un ácido nucleico que codifica un polipéptido de tipo NAP1; y

(ii)

cultivar la célula vegetal en condiciones que estimulan el crecimiento y el desarrollo de la planta.

El ácido nucleico puede introducirse directamente en una célula vegetal o en la propia planta (incluyendo la introducción en un tejido, un órgano o cualquier otra parte de una planta). Según una característica preferida de la presente invención, el ácido nucleico se introduce preferiblemente en una planta mediante transformación. El término "transformación" se describe en forma más detallada, en la sección "definiciones" en el presente documento.

Las células vegetales genéticamente modificadas se pueden regenerar mediante todos los procedimientos con los cuales está familiarizado el experto en la técnica. Procedimientos adecuados pueden encontrarse en las publicaciones antes mencionadas por S.D. Kung and R. Wu, Potrykus o Höfgen y Willmitzer

En general después de la transformación, las células vegetales o los agrupamientos celulares se seleccionan para determinar la presencia de uno o más marcadores que están codificados por genes que pueden expresarse en una planta transferidos junto con el gen de interés, después de lo cual se regenera el material transformado en una planta entera. Para seleccionar las plantas transformadas, el material vegetal obtenido en la transformación se somete, como regla general, a condiciones selectivas de modo que las plantas transformadas puedan distinguirse de las plantas no transformadas. Por ejemplo, las semillas obtenidas en la forma antes descrita se pueden plantar y, después de un periodo de crecimiento inicial, someter a una selección adecuada por medio de rociado. Otra posibilidad adicional consiste en el crecimiento de las semillas, si procede después de esterilización, sobre placas de agar utilizando un agente de selección adecuado de modo que únicamente las semillas transformadas pueden convertirse en plantas. Como alternativa, se seleccionan las plantas transformadas para determinar la presencia de un marcador seleccionable tal como las descritas anteriormente.

Después de la transferencia y la regeneración de ADN, pueden evaluarse plantas transformadas putativamente, por ejemplo usando análisis de tipo Southern, con respecto a la presencia del gen de interés, el número de copias y/o la organización genómica. Alternativamente o adicionalmente, los niveles de expresión del ADN recientemente introducido pueden verificarse usando análisis de tipo Northern y/o de tipo Western, técnicas todas que son muy conocidas para los expertos normales en la materia.

Las plantas transformadas generadas pueden propagarse mediante una variedad de medios, tales como propagación clonal o técnicas de cultivo clásicas. Por ejemplo, una planta transformada de primera generación (o T1) puede autofecundarse para dar transformantes de segunda generación homocigóticos (o T2), y las plantas T2 pueden propagarse adicionalmente a través de técnicas de cultivo clásicas.

Los organismos transformados generados pueden tomar una variedad de formas. Por ejemplo, pueden ser quimeras de células transformadas y células no transformadas; transformantes clonales (p. ej., todas las células transformadas para contener el casete de expresión) ; injertos de tejidos transformados y no transformados (p. ej., en plantas, un patrón transformado injertado en un esqueje no transformado).

La presente invención se extiende claramente a cualquier célula vegetal o planta producida mediante cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, y a todas las partes de planta y sus propágulos. La presente invención se extiende además a abarcar la progenie de una célula, un tejido, un órgano o una planta entera transformados o transfectados primarios que se han producido mediante cualquiera de los procedimientos mencionados anteriormente, siendo el único requisito que la progenie exhiba la misma característica o características genotípicas y/o fenotípicas que las producidas por el progenitor en los procedimientos según la invención.

También se describen en el presente documento células huésped que contienen un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido de tipo NAP1 como se ha definido anteriormente en el presente documento. Preferentemente, las células huésped son células vegetales. Las plantas huésped para los ácidos nucleicos o el vector utilizado en el procedimiento de acuerdo con la invención, el casete de expresión o la construcción o el vector están, en principio, en forma conveniente en todas las plantas, las cuales son capaces de sintetizar los polipéptidos utilizados en el procedimiento de la invención

Los procedimientos de la invención se aplican convenientemente a cualquier planta.

Las plantas que son particularmente útiles en los procedimientos de la invención incluyen todas las plantas que pertenecen a la superfamilia Viridiplantae, en particular plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas que incluyen

forraje o leguminosas forrajeras, plantas ornamentales, cultivos alimenticios, árboles o arbustos. De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, planta es una planta de cultivo. Los ejemplos de plantas de cultivo incluyen soja, girasol, canola, alfalfa, colza, algodón, tomate, patata y tabaco. Preferiblemente además, la planta es una planta monocotiledónea, ejemplos de plantas monocotiledóneas incluyen la caña de azúcar. Más preferiblemente la planta es un cereal. Ejemplos de cereales incluyen arroz, maíz, trigo, cebada mijo, centeno, triticale, sorgo, trigo almidonero, escanda, cereal de centeno, escanda menor, tef, y avena.

En el presente documento también se divulgan partes recolectables de una planta tales como, pero no limitadas a, semillas, hojas, frutos, flores, tallos, rizomas, tubérculos y bulbos. La memoria se refiere además a productos derivados, preferiblemente derivados directamente, de una parte recolectable de tal planta, tales como pellas o polvos secos, aceite, grasa y ácidos grasos, almidón o proteínas.

De acuerdo con una característica preferida de la invención, la expresión modulada es expresión incrementada. La expresión incrementada o sobreexpresión debe entenderse como cualquier expresión que es adicional al nivel de expresión original silvestre. Procedimientos para incrementar la expresión ácidos nucleicos o genes o productos génicos están bien documentados en la materia y se incluyen ejemplos en la sección de definiciones.

Como se ha mencionado anteriormente, un procedimiento preferido para modular (preferentemente aumentar) la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de tipo NAP1 es mediante la introducción y expresión en una planta un ácido nucleico que codifica un polipéptido de tipo NAP1; no obstante, los efectos de realizar el procedimiento, es decir potenciar los rasgos relacionados con el rendimiento también se pueden ligar usando otras técnicas bien conocidas. Una descripción de algunas de estas técnicas se proporcionará a continuación.

Una de estas técnicas es el marcaje de activación con T-ADN (Hayashi et ál. Science (1992) 1350 -1353), que implica la inserción de T-ADN, que contiene habitualmente un promotor (también puede ser un potenciador de la traducción o un intrón), en la región genómica del gen de interés o 10 kb cadena arriba o abajo de la región codificante de un gen en una configuración tal que el promotor dirija la expresión del gen elegido como diana. Típicamente, la regulación de la expresión del gen elegido como diana mediante su promotor natural se interrumpe y el gen cae bajo el control del promotor recientemente introducido. El promotor está embebido típicamente en un T-AND. Este T-ADN se inserta aleatoriamente en el genoma de la planta, por ejemplo, a través de infección con Agrobacterium, y conduce a una expresión modificada de los genes próximos al T-ADNA. Las plantas transgénicas resultantes muestran fenotipos dominantes debido a la expresión modificada de genes cerca del promotor introducido.

Los efectos de la presente divulgación también se pueden reproducir usando la técnica de TILLING (lesiones locales inducidas orientadas en genomas); para una descripción de la misma véase la sección “definiciones".

Los efectos de la presente divulgación también se pueden reproducir usando recombinación homóloga: para una descripción de la misma véase la sección “definiciones".

Como se especifica en las reivindicaciones, la presente invención también abarca el uso de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de tipo NAP1 como se describe en el presente documento y el uso del polipéptido de tipo NAP1 en la potenciación de cualquiera de los rasgos relacionados con el rendimiento mencionados anteriormente en plantas cuando se cultivan en condiciones de estrés abiótico.

Los ácidos nucleicos que codifican polipéptido de tipo NAP1 descrito en el presente documento, o los propios polipéptidos de tipo NAP1, pueden ser útiles en programas de cultivo en los que un marcador de ADN que puede estar unido genéticamente a un gen que codifica un polipéptido de tipo NAP1. Los ácidos nucleicos/genes o los polipéptidos de tipo NAP1 pueden usarse para definir un marcador molecular. Este marcador de ADN o proteína puede usarse a continuación en programas de cultivo para seleccionar plantas que tienen rasgos relacionados con el rendimiento potenciado como se ha definido anteriormente en el documento.

Las variantes alélicas de un ácido nucleico/gen que codifica un polipéptido de tipo NAP1 también pueden encontrar uso en programas de cultivo asistidos por marcadores. A veces, tales programas de cultivo requieren la introducción de variación alélica mediante el tratamiento mutagénico de las plantas, usando por ejemplo mutagénesis con EMS; alternativamente, el programa puede comenzar con una recolección de variantes alélicas del denominado origen "natural" producida involuntariamente. La identificación de variantes alélicas tiene lugar a continuación, por ejemplo, mediante PCR. Esto es seguido por una etapa de selección de variantes alélicas superiores de la secuencia en cuestión y que dan un rendimiento incrementado. La selección se lleva a cabo típicamente verificando el comportamiento de crecimiento de plantas que contienen diferentes variantes alélicas de la secuencia en cuestión. El comportamiento de crecimiento puede verificarse en un invernadero o en el campo. Etapas opcionales adicionales incluyen cruzar plantas en las que la variante alélica superior se identificaba con otra planta. Esto podría usarse, por ejemplo, para realizar una combinación de características fenotípicas interesantes.

Los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de tipo NAP1 también pueden usarse como sondas para cartografiar genéticamente y físicamente los genes de los que es parte, y como marcadores para rasgos unidos a esos genes. Tal información puede ser útil en el cultivo de plantas a fin de desarrollar líneas con fenotipos deseados. Tal uso de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de tipo NAP1 requiere solo una secuencia de ácido nucleico

de al menos 15 nucleótidos de longitud. Los ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de tipo NAP1 pueden usarse como marcadores de polimorfismo de fragmentos de restricción (RFLP). Transferencias de tipo Southern (Sambrook J, Fritsch EF y Maniatis T (1989) Molecular Cloning, A Laborator y Manual) de ADN genómico de planta digerido con enzimas de restricción pueden sondarse con los ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de tipo NAP1. Los patrones de bandeo pueden someterse a continuación a análisis genéticos usando programas informáticos tales como MapMaker (Lander et al. (1987) Genomics 1: 174 -181) a fin de construir un mapa genético. Además, los ácidos nucleicos pueden usarse para sondar transferencias de tipo Southern que contienen ADN genómicos tratados con endonucleasas de restricción de un grupo de individuos que representan el progenitor y la progenie de un cruce genético definido. Se observa segregación de los polimorfismos de ADN y se usan para calcular la posición del ácido nucleico que codifican polipéptidos de tipo NAP1 en el mapa genético previamente obtenido usando esta población (Botstein et al. (1980) Am. J. Hum. Genet. 32:314 -331).

La producción y el uso de sondas derivadas de genes de planta para el uso en cartografía genética se describen en Bernatzky y Tanksley (1986) Plant Mol. Biol. Reporter 4: 37 -41. Numerosas publicaciones describen la cartografía genética de clones de ADNc específicos usando la metodología esbozada anteriormente o variaciones de la misma. Por ejemplo, poblaciones entrecruzadas F2, poblaciones retrocruzadas, poblaciones cruzadas al azar, líneas isogénicas cercanas y otros grupos de individuos pueden usarse para la cartografía. Tales metodologías son muy conocidas para los expertos en la materia.

Las sondas de ácido nucleico también pueden usarse para la cartografía física (es decir, disposición de secuencias en mapas físicos; véanse Hoheisel et al. En: Non-mammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic press 1996, pp. 319 -346, y las referencias citadas en la misma).

Las sondas de ácido nucleico pueden usarse en la cartografía por hibridación in situ con fluorescencia directa (FISH) (Trask (1991) Trends Genet. 7:149 -154). Aunque los procedimientos actuales de cartografía por FISH favorecen el uso de clones grandes (de varias kb a varios cientos de kb; véase Laan et al. (1995) Genome Res. 5:13 -20), las mejoras en la sensibilidad pueden permitir la realización de la cartografía por FISH usando sondas más cortas.

Puede llevarse a cabo una variedad de procedimientos basados en amplificación de ácidos nucleicos para la cartografía genética y física usando los ácidos nucleicos. Ejemplos incluyen la amplificación específica de alelos (Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med 11:95-96), el polimorfismo de fragmentos amplificados por PCR (CAPS; Sheffield et al. (1993) Genomics 16:325 -332), la ligación específica de alelos (Landegren et al. (1988) Science 241:1077 1080), reacciones de extensión de nucleótidos (Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18:3671), Radiation Hybrid Mapping (Walter et al. (1997) Nat. Genet. 7:22 -28) y Happy Mapping (Dear and Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17:6795 -6807). Para estos procedimientos, la secuencia de un ácido nucleico se usa para diseñar y producir pares de cebadores para el uso en la reacción de amplificación o en reacciones de extensión de cebador. El diseño de tales cebadores es muy conocido para los expertos en la materia. En procedimientos que emplean cartografía genética basada en PCR, puede ser necesario identificar diferencias de secuencias de DNA entre los progenitores del cruce cartográfico en la región correspondiente a la presente secuencia de ácido nucleico. Sin embargo, esto generalmente no es necesario para los procedimientos cartográficos.

Los procedimientos según la presente invención dan como resultado plantas que tienen rasgos relacionados con el rendimiento potenciado, como se especifica en las reivindicaciones. Estos rasgos se pueden combinarse con otros rasgos económicamente ventajosos, tales como otros rasgos potenciadores del rendimiento, la tolerancia a otros estreses abióticos y bióticos, rasgos que modifican diversas características arquitectónicas y/o características bioquímicas y/o fisiológicas.

Descripción de las figuras

La presente invención se describirá ahora con referencia a las siguientes figuras, en las que:

La Fig. 1 muestra la secuencia de SEC ID Nº 2 (A) y la SEC ID Nº 27 (B), con el dominio NAP1 en negrita y subrayado.

La Fig. 2 muestra el vector binario para la expresión incrementada en Oryza sativa de un ácido nucleico que codifica la proteína de tipo NAP1 de Arabidopsis bajo el control de un promotor GOS2.

La Fig. 3 muestra un alineamiento múltiple de un número de secuencias CLUSTAL W de polipéptidos de tipo NAP1 de varias especies de plantas. SEC ID Nº: 2 (AtNAP1-like, At1g74560) se indica en negrita y el dominio NAP conservado está subrayado.

La Fig. 4 es un árbol filogenético que representa las relaciones entre las proteínas NAP y SET de levaduras, seres humanos y plantas. Las referencias indicadas en el árbol son números de acceso en GenBank y MIPS (para Arabidopsis thaliana) de las secuencias En: Arabidopsis thaliana, Gm: Glycine max, Nt: Nicotiana tabacum (secuencias derivadas del documento WO 03/085115), Os: Oryza sativa, Ps: Pisum sativum, Zm: Zea mays, Hs: Homo sapiens, Sc: Saccharomyces cerevisiae.

La Fig. 5 La proteína de tipo NAP1 de Medicago se expresó en E. coli y se purificó en extracto celular crudo mediante cromatografía de afinidad mediante marcador 6xHIS. La elución de la proteína de 34 kD a diferentes concentraciones de imidazol de la resina del gel de níquel-agarosa se visualiza mediante transferencia de tipo Western usando el anticuerpo anti-6xHIS (Sigma, St Louis, USA).

La Fig. 6 La proteína de tipo NAP1 tiene una localización nuclear en plantas. A) Se ha demostrado que la proteína de tipo NAP1 Medicago se localiza en el núcleo de células de alfalfa cultivadas mediante inmunofluorescencia indirecta usando un anticuerpo producido contra la proteína purificada (imagen izquierda del panel A). Para confirmar la localización nuclear, los núcleos se tiñeron en paralelo con el colorante fluorescente DAPI (imagen derecha del panel A). En el inserto, la flecha apunta a una célula en metafase. Una débil fluorescencia indica baja abundancia de la proteína de tipo NAP1 alrededor de los cromosomas en las células en metafase sin un compartimento nuclear. B) la proteína de tipo NAP1 expresada transitoriamente en Arabidopsis, condensada a GFP, se localiza en el núcleo en las células de Arabidopsis tras una captación mediada por PEG de la construcción génica en los protoplastos.

La Fig. 7. La proteína de tipo NAP1 purificada Medicago inhibe la actividad de desfosforilación de la fosfo-histona H2B in vitro de la PP2A (purificada de músculo esquelético de conejo), pero no tiene influencia sobre la defosforilación de la glucógeno fosforilasa por la misma enzima.

La Fig. 8 Ejemplos de secuencias útiles en la realización de los procedimientos de acuerdo con la presente memoria.

Ejemplos

La presente invención se describirá ahora con referencia a los siguientes ejemplos, que solo están a modo de ilustración. Los siguientes ejemplos no están destinados a definir completamente o limitar de otro modo el alcance de la invención.

Manipulación de DNA: a menos que se indique otra cosa, las técnicas de ADN recombinante se realizan según protocolos estándar descritos en (Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3ª Edición Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York) o en los Volúmenes 1 y 2 de Ausubel et al. (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols. Materiales y procedimientos estándar para el trabajo molecular de las plantas se describen en Plant Molecular Biology Labfax (1993) by R.D.D. Croy, publicado por BIOS Scientific Publications Ltd (UK) and Blackwell Scientific Publications (UK)

Ejemplo 1: Identificación de secuencias relacionadas con la SEC ID Nº 1 y SEC ID Nº 2

Se identificaron secuencias (ADNc de longitud completa, EST o genómicas) relacionadas con la SEC ID Nº 1 y/o las secuencias proteicas relacionadas con la SEC ID Nº 2 entre las mantenidas en la base de datos Entrez Nucleotides en the National Center for Biotechnology Information (NCBI) usando herramientas de búsqueda de secuencias en bases de datos, tales como la Basic Local Alignment Tool (BLAST) (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403 -410; and Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389 -3402). El programa se usa para encontrar regiones de similitud local entre secuencias comparando secuencias de ácido nucleico o polipéptido con bases de datos de secuencias y calculando la significación estadística de las concordancias. El polipéptido codificado por la SEC ID Nº: 1 se usó para el algoritmo TBLASTN, con establecimientos por defectos y el filtro para ignorar secuencias de baja complejidad exploradas. Los resultados del análisis se observaron mediante comparación por pares, y se valoraron según la puntuación de probabilidad (valor E), donde la puntuación refleja la probabilidad de que se produzca un alineamiento particular por casualidad (cuanto menor es el valor de E, más significativo es el acierto) Además de los valores de E, las comparaciones también se puntuaron mediante el porcentaje de identidad. La identidad porcentual se refiere al número de nucleótidos idénticos (o aminoácidos) entre las dos secuencias de ácidos nucleicos (o polipéptidos) comparadas sobre una longitud particular. En algunos casos, los parámetros por defecto pueden ajustarse para modificar la restricción de la búsqueda.

La Tabla A proporciona una lista de secuencias de ácido nucleico relacionadas con la secuencia de ácido nucleico como se representa por la SEC ID Nº 1 y la secuencia de la proteína representada por la SEC ID Nº 2.

Tabla A: Secuencias de ácido nucleico que codifican los polipéptidos de tipo NAP1 y polipéptidos de tipo NAP-1

Nombre/Identificador

Fuente del organismos Ácido nucleico SEC ID Nº Polipéptido de SEC ID Nº:

AtNAP1

Arabidopsis thaliana 1 2

NtNAP1a

Nicotiana tabacum 6 7

NtNAP1b

Nicotiana tabacum 8 9

Ms10,1

Medicago sativa 10 11

(continuación)

Nombre/Identificador

Fuente del organismos Ácido nucleico SEC ID Nº Polipéptido de SEC ID Nº:

nfa104

Zea mays 12 13

OsNAP1a

Oryza sativa 14 15

OsNAP1b

Oryza sativa 16 17

nfa103

Zea mays 18 19

De tipo NAP1

Arabidopsis thaliana 20 21

LeNAP1

Lycopersicon esculentum 22 23

De tipo NAP1

Arabidopsis thaliana 24 25

De tipo NAP1

Arabidopsis thaliana 26 27

De tipo NAP1

Arabidopsis thaliana 28 29

De tipo NAP1

Arabidopsis thaliana 30 31

NAP1Ps

Pisum sativum 35 36

SNAP-1

Glycine max 37 38

Ejemplo 2: Alineación de secuencias de polipéptidos de tipo NAP1

La alineación de secuencias de polipéptidos se lleva a cabo utilizando el programa AlignX del paquete Vector NTl (lnvitrogen), que se basa en el algoritmo popular Clustal ( de alineación progresiva (Thompson et al (1997) Nucleic Acids Res 25:4876 -4882; Chenna et al. (2003). Nucleic Acids Res 31:3497 -3500). Los valores predeterminados son para la penalización por abertura de espacio de 10, para penalización por extensión de espacio de 0,1 y la matriz de peso seleccionada es Blosum 62 (si se alinean polipéptidos). Los resultados en la figura 3 muestran que los polipéptidos de tipo 3 comparan las regiones de conservación de secuencia alta.

Un árbol filogenético que representa las relaciones entre las proteínas NAP y SET de levaduras, seres humanos y plantas se proporciona en la Figura 4. El árbol se estableció mediante el programa AlignX de VNTI Suite 5,5 (Informax). La matriz usada para generar la alineación múltiple es Blosum62 y los parámetros de alineación usados fueron: Penalización por abertura de hueco= 10, parámetro por extensión de hueco = 0,5; Intervalo de por Penalización por separación de hueco = 8; %Identidad para retraso de alineación= 40. El árbol se construyó usando el método Neighbor Joining de Saitou y Nei

Ejemplo 3: Calculo del porcentaje global de identidad entre secuencias de polipéptidos útiles en la realización de los procedimientos de la invención

Se determinaron los porcentajes globales de similitud e identidad entre secuencias de polipéptidos de longitud completa útiles para llevar a cabo los procedimientos de la invención utilizando uno de los procedimientos disponibles en la técnica, el software MatGAT (Matrix Global Alignment Tool) (BMC Bioinformatics. 2003 4:29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences.). Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J). El software MatGAT genera matrices de similitud/identidad para secuencias de ADN o de proteína sin necesidad de una alineación previa para los datos. El programa realiza una serie de alineaciones de pares utilizando el algoritmo de alineación global de Myers y Miller (con una penalización por apertura de brecha de 12, y una penalización por extensión de brecha de 2), calcula la similitud y la identidad utilizando por ejemplo Blosum 62 (para polipéptidos), y luego coloca los resultados en una matriz de distancia. La similitud de secuencia se muestra en la mitad inferior de la línea divisoria y la identidad de la secuencia se muestra en la mitad superior de la línea divisoria en diagonal.

Los parámetros utilizados en la comparación fueron:

Matriz de puntuación: Blosum62

Primera abertura: 12

Extensión de hueco: 2

Los resultados del analisis del software se muestran en la Tabla B para la similitud e identidad global sobre la longitud completa de las secuencias de polipéptidos (excluyendo las secuencias parciales de polipéptidos). El porcentaje de identidad se presenta encima de la diagonal y el porcentaje de similitud se presenta debajo de la

diagonal

El porcentaje de identidad entre las secuencias de polipéptidos útiles en la realización de los procedimientos de la invención puede ser tan bajo como un 22% de identidad de aminoácidos comparado con la SEC ID Nº 2. Dado que el dominio NAP cubre la parte más grande de la secuencia de proteínas, la identidad de secuencia solo es ligeramente mayor cuando se comparan los dominios.

Tabla B1: Resultados de MatGAT para la similitud e identidad globales sobre la longitud completa de las secuencias de polipéptidos

1

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

1. SEC ID Nº 2

69,5 65,9 71,6 59,5 54,8 63,7 61,6 84,7 65,7 22,5 23,4 22,9 22,4 23,4 23,7

2. SEC ID Nº 7

84,8 83,5 69,7 64,8 59,7 64,4 63,3 72,2 80,9 25,7 23,9 24,3 21,7 26,8 26,7

3. SEC ID Nº 9

81,9 92,7 66,4 57,5 53,6 59,9 57,7 65,6 83,3 23,3 23,4 24,2 24,7 25,2 25,8

4. SEC ID Nº 11

85,8 84,2 81,9 60,5 56,9 60,4 59,3 68,8 67,0 21,4 21,8 21,9 25,1 22,9 23,4

5. SEC ID Nº 13

79,1 79,5 75,0 76,2 63,9 78,2 89,9 62,7 57,8 22,3 21,6 21,7 23,7 22,1 22,6

6. SEC ID Nº 15

74,5 76,4 73,5 73,5 78,8 65,2 61,8 56,3 52,3 23,6 23,2 23,2 22,0 24,3 24,8

7. SEC ID Nº 17

79,7 79,3 75,0 75,4 88,0 80,7 80,3 64,4 55,2 21,7 21,5 21,6 21,2 21,0 22,6

8. SEC ID Nº 19

78,9 77,7 73,5 74,6 93,4 76,1 89,3 63,7 57,1 21,0 22,4 20,9 22,3 21,0 21,8

9. SEC ID Nº 21

92,2 84,8 81,9 84,2 80,2 76,1 80,5 78,1 69,8 24,9 24,5 24,8 23,5 25,1 26,4

10. SEC ID Nº 23

83,9 90,4 92,0 82,8 75,9 72,8 74,3 73,6 84,3 26,0 25,0 27,4 26,5 26,8 26,2

11. SEC ID Nº 25

40,3 41,9 41,4 41,9 39,5 41,7 38,2 38,2 41,1 43,3 75,1 84,0 44,2 69,8 70,2

12. SEC ID Nº 27

39,8 40,6 40,9 41,4 39,8 40,1 39,1 38,3 39,6 42,7 87,9 76,3 45,9 71,5 70,0

13. SEC ID Nº 29

40,4 41,4 41,7 43,0 38,8 40,1 37,4 38,8 40,4 42,8 92,8 88,7 43,8 74,1 72,2

14. SEC ID Nº 31

41,9 42,6 43,8 45,3 41,3 42,9 42,6 41,0 42,2 44,1 61,8 61,2 61,8 47,2 46,4

15. SEC ID Nº 36

41,8 42,3 42,1 41,8 39,6 39,1 37,7 38,0 42,6 43,2 85,8 85,2 86,1 62,8 79,4

16. SEC ID Nº 38

41,1 43,3 43,9 43,9 42,2 41,6 41,3 40,5 41,9 45,3 85,2 84,4 84,8 63,7 89,3

36 37 5

Tabla B2: Resultados de MatGAT para la similitud e identidad globales sobre el dominio NAP de las secuencias de polipéptidos

1

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

1. SEC ID Nº 2

73,8 70,9 77,0 64,3 59,3 68,3 64,3 88,5 73,7 23,8 27,1 25,9 25,4 25,6 25,0

2. SEC ID Nº 7

88,6 85,9 76,2 70,1 67,2 70,1 69,7 77,7 84,8 29,0 28,7 28,7 26,7 31,3 29,9

3. SEC ID Nº 9

84,9 93,7 72,3 63,4 59,5 65,9 63,4 71,7 87,8 27,0 27,5 26,7 29,2 30,5 28,3

4. SEC ID Nº 11

89,4 88,6 84,4 63,6 62,1 65,2 63,6 74,5 73,7 24,1 23,8 25,0 24,9 26,0 25,3

5. SEC ID Nº 13

83,4 82,1 78,5 80,8 70,6 83,8 94,4 68,3 62,7 25,1 26,0 24,8 24,5 24,6 24,3

6. SEC ID Nº 15

80,4 82,1 77,1 78,3 83,2 72,6 68,5 62,3 58,8 27,4 27,5 27,1 24,2 27,0 26,2

7. SEC ID Nº 17

83,9 84,1 80,0 81,3 92,3 87,3 84,3 70,4 63,2 25,0 25,9 24,3 22,8 23,7 24,2

8. SEC ID Nº 19

81,9 80,6 77,6 80,3 97,4 82,7 91,8 67,8 62,7 25,1 26,0 24,8 24,1 24,2 24,7

9. SEC ID Nº 21

94,0 89,1 86,3 88,4 83,4 82,4 86,4 81,9 75,1 27,4 29,1 28,3 26,3 27,8 28,7

10. SEC ID Nº 23

86,8 93,1 95,6 85,3 78,9 77,5 79,9 77,9 87,3 27,8 29,6 29,6 30,8 31,3 29,5

11. SEC ID Nº 25

45,7 49,4 48,6 46,2 45,7 45,7 46,2 44,9 46,2 49,0 78,9 87,4 57,4 73,7 75,7

12. SEC ID Nº 27

46,3 48,8 48,4 47,6 47,2 45,1 47,6 46,3 46,7 50,0 90,3 80,9 59,6 75,6 78,0

13. SEC ID Nº 29

45,9 48,8 47,6 46,7 45,5 45,1 45,1 45,1 45,9 49,6 93,9 91,1 58,0 77,6 78,0

14. SEC ID Nº 31

45,8 48,3 48,3 47,1 43,3 44,2 44,2 43,3 46,3 50,0 75,7 76,4 76,0 61,8 60,3

15. SEC ID Nº 36

48,3 50,4 49,2 47,1 44,6 44,2 44,6 44,2 47,5 50,8 84,6 86,6 86,2 75,8 84,0

16. SEC ID Nº 38

46,1 50,2 49,4 48,1 46,5 44,4 47,3 46,1 47,3 51,4 87,4 88,2 88,6 76,5 91,4

Ejemplo 4: identificación de dominios comprendidos en las secuencias de polipéptidos útiles en la realización de los procedimientos de la invención

La base de datos de Recursos lntegrados de Familias de Proteínas, Dominios y Sitios (lnterPro) es una interfaz integrada para las bases de datos de firma comúnmente utilizadas para búsquedas con base en textos y secuencias. La base de datos lnterPro combina estas bases de datos, que utilizan diferentes metodologías y diferentes grados de información biológica sobre proteínas bien caracterizadas para derivar firmas de proteína. Las bases de datos colaboradoras incluyen S (lSS-PROT, PROSlTE, TrEMBL, PRlNTS, Panther, ProDom y Pfam, Smart y TlGRFAMs. lnterPro se encuentra alojada en el European Bioinformatics lnstitute en el Reino Unido.

Los resultados del barrido con lnterPro de la secuencia de polipéptidos representadas por la SEC ID Nº 2 se presentan en la Tabla C.

Tabla C Resultados del barrido con lnterPro de la secuencia de polipéptidos como la representada por la SEC ID Nº 2

Base de datos

Número de acceso Nombre de acceso

PANTHER

PTHR11875 NAP_family

PANTHER

PTHR11875:SF9 PTHR11875:SF9

PFAM

PF00956 NAP

Ejemplo 5: Predicción de la topología de las secuencias de polipéptidos útiles para llevar a cabo los procedimientos de la invención (localización subcelular, transmembrana)

TargetP 1.1 predice la localización subcelular de las proteínas eucariotas. La asignación de ubicación se basa en la presencia predicha de cualquiera de las secuencias previas del terminal N: péptido de tránsito al cloroplasto (cTP), péptido mitocondrial objetivo (mTP) o péptido señal de la ruta secretora (SP). Las puntuaciones sobre las que se basa la predicción final no son realmente probabilidades, y no necesariamente se añaden a uno. Sin embargo, la ubicación con el puntaje más alto es la más probable de acuerdo con TargetP, y la relación entre las puntuaciones (la clase de fiabilidad) puede ser una indicación de que tan cierta es la predicción. La clase de fiabilidad (RC) varía de 1 a 5, donde 1 indica la predicción más fuerte. TargetP se mantiene en el servidor de la Universidad Técnica de Dinamarca.

Para las secuencias que se predice que contienen una secuencia previa en el terminal N se puede predecir también un sitio de escisión potencial.

Se seleccionaron una cantidad de parámetros, tales como el grupo del organismo (vegetal o no vegetal), conjuntos de puntos de corte (ninguno, conjuntos de puntos de corte predefinidos, o conjunto de puntos de corte especificados por el usuario), y el cálculo de la predicción de los sitios de escisión (sí o no).

Los resultados del analisis con TargetP 1.1 de la secuencia polipeptídica como la representada por la SEC ID Nº 2 se presentan en la Tabla D7. El grupo del organismo "planta" ha sido seleccionado, y no se definieron puntos de corte. La localización subcelular predicha de la secuencia polipeptídica como la representada por la SEC ID Nº 2 puede ser e citoplasma o el núcleo, no se predice ningún péptido de tránsito.

Tabla D Análisis con TargetP 1.1 de la secuencia de polipéptidos como la representada por la SEC ID Nº 2 5

Longitud (AA)

256

Péptido de tránsito en el cloroplasto

0,108

Péptido de tránsito en la mitocondria

0,079

Péptido sefal de la ruta secretora

0,134

Otro objetivo subcelular

0,908

Ubicación predicha

/

Clase de fiabilidad.

2

Longitud del péptido de tránsito predicho

/

Se pueden utilizar muchos algoritmos para llevar a cabo los analisis, incluyendo

 ChloroP 1,1 alojado en el servidor de la Universidad Técnica de Dinamarca;  Protein Prowler Subcellular Localisation Predictor versión 1.2 alojado en el servidor del lnstitute de Biociencia

Molecular, Universidad de Queensland, Brisbane, Australia  PENCE Proteome Analyst PA-GOSUB 2.5 alojado en el servidor de la Universidad de Alberta, Edmonton,

Alberta, Canadá  TMHMM, alojado en el servidor de la Universidad Técnica de Dinamarca

Ejemplo 6: Caracterización de una proteína de tipo NAP1 de Medicago sativa Materiales y procedimientos

Aislamiento del clon del ADNc de longitud completa del inhibidor putativo de la PP2A de alfalfa

Se ha usado un fragmento de ADNc aislado que codifica una parte de una proteína de tipo NAP1 de alfalfa (Medicago sativa) para aislar el clon de longitud completa de una biblioteca de ADNc del fago λ-ZAP del nódulo de raíz de alfalfa (Savoure et al. Plant Mol. Biol. 27, 1059 -1070; 1995) usando procedimientos de detección selectiva estándar como describe el fabricante (Stratagene). Se seleccionaron 400.000 placas, se retuvieron 20 clones,18 de los cuales eran positivos en la segunda selección de hibridación. 8 de estos clones se seleccionaron para su trabajo adicional y se convirtieron en fagemidos de fagos individuales. Se secuenciaron cuatro clones y dos de ellos se demostró que eran clones de ADNc de longitud completa de la proteína de tipo NAP1 putativa. Uno de los clones (Ms10,1) se usó para trabajos posteriores (SEC ID Nº 10, que codifica la proteína de SEC ID Nº: 11).

Producción y purificación de la proteína de tipo NAP1 de Medicago sativa

La secuencia de ADNc que codifica la proteína de tipo NAP1 Medicago sativa se insertó en el sitio NcoI/XhoI del vector pENTRY4 GATEWAY® (Invitrogen) y después se introdujo en el vector de expresión bacteriana pDEST17. El vector pDEST17 permitió la expresión de la proteína de tipo NAP1 en células BL21 E. coli como una proteína marcada con 6xHIS. La proteína de tipo NAP1 de 34 kDa se purificó mediante cromatografía de afinidad usando una resina de agarosa níquel (Sigma) (Figura 5)

Mediciones de la actividad fosfatasa

La potencial actividad de inhibición de la fosfatasa de la proteína de tipo NAP1 de Medicago sativa se analizó in Vitro en las subunidades catalíticas de la proteína fosfatasa 2A (PP2A) purificada de músculo esquelético de conejo usando la glucógeno fosforilasa marcada con el isótopo 32P y las proteínas histonas H2A como sustratos de acuerdo con Ulloa et al. (1993).

Localización intracelular de las proteínas de tipo MsNAP1 y de tipo AtNAP1

Se produjeron anticuerpos policlonales anti-de tipo MsNAP1 en conejos contra la proteína purificada marcada con 6xHIS usando un protocolo de inmunización estándar.

Se aislaron los protoplastos de la suspensión de células de alfalfa (Medicago sativa) cultivadas y se fijaron con 6% de formaldehído. Las células se unieron después a portaobjetos de vidrio recubiertos con L-lisina y se expusieron al antisuero anti-proteína de tipo MsNAP1 (diluido 200 x en PBS), se lavaron y se expusieron a anticuerpo secundario de cabra anti-conejo conjugado con FITC (SIGMA, dilución 100 x). Los núcleos se tiñeron con DAPI (0,02 mg/ml) en paralelo y se fotografiaron con un microscopio fluorescente Nikon TE300 y una cámara a color SPOT II CCD.

La región codificante del ortólogo de Arabidopsis thaliana de la proteína de tipo NAP1 de Medicago sativa (SEC ID Nº 1) se insertó en el marco con la proteína fluorescente verde (GFP) en el vector de expresión en plantas compatible con GATEWAY@. Los protoplastos se aislaron y se transfectaron con el ADN plasmídico purificado usando procedimientos estándar. La expresión transitoria se registró uno o dos días después de la transfección con microscopia de fluorescencia.

Resultados

Proteínas de tipo NAP1 de Arabidopsis and Medicago se localizan en el núcleo

Usando los anticuerpos anti-proteína de tipo MsNAP1, la inmunofluorescencia indirecta reveló que los anticuerpos reconocían una proteína que se localizaba en los núcleos de células de alfalfa cultivadas en suspensión. Esta localización se verificó mediante la tinción nuclear, DAPI. La fluorescencia leve se asoció con los cromosomas en las células en metafase (Figura 6.A, inserto).

La proteína de tipo NAP1 de Arabidopsis marcada con GFP también se localizada casi exclusivamente en el núcleo de las células de Arabidopsis cultivadas en suspensión.

La proteína de tipo NAP1 de alfalfa inhibe la actividad fosfatasa PP2A in Vitro en un sustrato de fosfo-histona

La proteína tipo NAP1 de alfalfa purificada se añadió a varias concentraciones a las mezclas de reacción que contienen las subunidades catalíticas de músculo esquelético de conejo PP2A y la histona fosforilada H2A, o la glucógeno fosforilasa como sustrato. Se observó que la proteína tipo NAP1 no tenía influencias sobre a defosforilación de la glucógeno fosforilasa, incluso a una concentración de 500 mM, pero ya a una concentración de 2,5 mM de la proteína tipo NAP1 inhibió con eficiencia la actividad PP2A del sustrato fosfo-histona-G2a (disminución de un 50% de la actividad) (Figura 7).

Conclusión

Las proteínas tipo NAP1 de Medicago sativa y Arabidopsis thaliana muestran ambas semejanzas estructurales y funcionales. Las proteínas tipo NAP1 de planta inhiben in Vitro la actividad fosfatasa (PP2A) sobre histonas sustratos, lo que indica un posible papel in vivo sobre la organización de la cromatina y la transcripción génica

Ejemplo 7: Construcción del vector de expresión usando la secuencia de ácido nucleico representada por laSEC ID Nº

A menos que se indique otra cosa, las técnicas de ADN recombinante se realizan según protocolos estándar descritos en (Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3ª Edición Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York) o en los Volúmenes 1 y 2 de Ausubel et al. (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols. Materiales y procedimientos estándar para el trabajo molecular de las plantas se describen en Plant Molecular Biology Labfax (1993) by R.D.D. Croy, publicado por BIOS Scientific Publications Ltd (UK) and Blackwell Scientific Publications (UK)

El ácido nucleico de la proteína de tipo NAP1 de Arabidopsis se amplificó mediante PCR usando como molde una biblioteca de ADNc de plántulas de Arabidopsis thaliana (Invitrogen, Paisley, UK). Después de la transcripción inversa del ARN extraído de las plántulas, los ADNc se clonaron en pCMV Sport 6,0. El tamaño medio del inserto en el banco fue de 1,5 kb y el número original de los clones fue de 1,59x107 ufc. Se determinó que el título original era 9,6x105 ufc/ml, después de la primera amplificación de of 6x1011 ufc/ml. Después de la extracción del plásmido se usaron 200 ng del molde en una mezcla de 50 µl de PCR. Los cebadores rm1505 (SEC ID Nº 4) y prm1506 (SEC ID Nº 5), que incluyen los sitios AttB para la recombinación de Gateway se usaron para la amplificación por PCR. Se llevó a cabo la PCR utilizando Taq ADN polimerasa Hifi en condiciones estándar. Se amplificó y purificó también un fragmento de PCR de 771 pb empleando procedimientos estándar. Luego se llevó a cabo la primera etapa del procedimiento Gateway, la reacción BP, durante la cual el fragmento de la PCR recombinado in vivo con el plásmido pDONR201 para producir, de acuerdo con la terminología Gateway, un "clon de entrada". Se adquirió el plásmido pDONR201 a través de lnvitrogen, como parte de la tecnología Gateway®.

El clon de entrada de la proteína de tipo pNAP1 se usó después en una reacción LR con un vector de destino usado para la transformación de Oryza sativa que comprende como elementos funcionales dentro de los bordes del T-ADN: Un marcador seleccionable en plantas; un casete de expresión marcador visual y un casete Gateway destinado a la recombinación in vivo por LR con la secuencia de interés ya clonada en el clon de entrada. Un promotor GOS2 para la expresión constitutiva se localiza cadena arriba de este casete Gateway Después de la etapa de recombinación por LR, el vector de expresión resultante pGOS2::NAP1-like (Figura 2) se transformó en la cepa de Agrobacterium LBA4044 y posteriormente en plantas de Oryza sativa usando procedimientos bien conocidos en la técnica.

Ejemplo 8: Transformación plantas

Transformación de arroz

Se usó Agrobacterium que contiene los vectores de expresión para transformar plantas Oryza sativa. Se descascarillaron semillas secas maduras de la variedad de cultivo Japónica de arroz Nipponbare. Se realizó la esterilización incubando durante un minuto en etanol al 70%, seguido por 30 minutos en HgCl2 al 0,2%, seguido de 6 lavados durante 15 minutos con agua destilada estéril. Las semillas estériles germinaron después en un medio que contenía 2, 4-D (medio de inducción de callos). Después de la incubación en la oscuridad durante cuatro semanas, se cortaron y propagaron los callos embriogénicos derivados de escutelo sobre el mismo medio. Al cabo de dos semanas, los callos se multiplicaron o propagaron mediante un subcultivo en el mismo medio durante otras 2 semanas. Se subcultivaron piezas de callo sobre medio fresco 3 días antes del cocultivo (para reforzar la actividad de la división celular).

Se utilizó la cepa LBA4404 de Agrobacterium que contenía del vector de expresión para el cocultivo. Se inoculó Agrobacterium sobre medio AB con los antibióticos apropiados y se cultivó durante 3 días a 28°C. Se recolectaron luego las bacterias y se suspendieron en un medio de cocultivo líquido hasta una densidad (DO600) de aproximadamente 1. Se transfirió luego la suspensión a una placa de Petri y se sumergieron los callos en la suspensión durante 15 minutos. Los tejidos de los callos se transfirieron secos sobre un papel de filtro y transferidos a un medio de cocultivo solidificado e incubados durante 3 días en la oscuridad a 25°C. Durante este período, se desarrollaron islotes callosos resistentes que crecen rápidamente. Después de la transferencia de este material a un

medio de regeneración y la incubación a la luz, el potencial embriogénico se liberó y se desarrollaron vástagos en las siguientes cuatro a cinco semanas. Los vástagos se cortaron de los callos y se incubaron durante de 2 a 3 semanas sobre un medio que contenía auxina desde el que se transfirieron a la tierra. Se hicieron crecer vástagos endurecidos bajo alta humedad y días cortos en un invernadero.

Se generaron aproximadamente 35 transformantes de arroz T0 independientes por una construcción. Los transformantes primarios se transfirieron desde una cámara de cultivo tisular hasta un invernadero. Después de un analisis por PCR cuantitativo para verificar la cantidad de copias del inserto de ADN-T, se conservaron únicamente copias simples de plantas transgénicas que exhibieron tolerancia al agente de selección para la cosecha de semillas T1. A continuación cosecharon las semillas tres a cinco meses después de ser trasplantadas. El procedimiento produjo transformantes de un solo locus en una proporción superior al 50 % (Aldemita y Hodges1996, Chan et al. 1993, Hiei et al. 1994).

Almidón de maíz

La transformación de maíz (Zea mays) se realiza con una modificación del procedimiento descrito por Ishida et al. (1996) Nature Biotech 14(6): 745 -50. La transformación depende del genotipo del maíz y solo genotipos específicos son susceptibles de transformación y regeneración. La línea endogámica A188 (University of Minnesota) o híbridos con A188 como progenitor son buenas fuentes de material donante para la transformación, pero también pueden usarse satisfactoriamente otros genotipos. Las espigas se recolectan de la planta de maíz aproximadamente 11 días después de la polinización (DAP) cuando la longitud del embrión inmaduro es de aproximadamente 1 a 1, 2 mm. Los embriones inmaduros se cocultivaron con Agrobacterium tumefaciens que contenía el vector de expresión, y se recuperaron plantas transgénicas a través de organogénesis. Los embriones cortados se cultivaron sobre medio de inducción de callos, y a continuación medio de regeneración de maíz, que contiene el agente de selección (por ejemplo imidazolinona, aunque pueden usarse diversos marcadores de selección). Las placas Petri se incuban a la luz a 25°C durante 2-3 semanas, o hasta que se desarrollan los vástagos. Los vástagos verdes se transfieren desde cada embrión a medio de enraizamiento de maíz y se incuban a 25°C durante 2-3 semanas, hasta que se desarrollan raíces. Los vástagos con raíz se trasplantan a tierra en el invernadero. Se producen semillas T1 a partir de plantas que exhiben tolerancia al agente de selección y que contienen una sola copia del inserto de T-DNA.

Transformación de trigo

La transformación de trigo se realiza con el procedimiento descrito por Ishida et al. (1996) Nature Biotech 14(6): 745 -50. Habitualmente, en la transformación se usa la variedad cultivada Bobwhite (disponible de CIMMYT, México). Los embriones inmaduros se cocultivan con Agrobacterium tumefaciens que contienen el vector de expresión y se recuperan plantas transgénicas a través de organogénesis. Después de la incubación con Agrobacterium, los embriones cortados se cultivaron in Vitro sobre medio de inducción de callos, y a continuación medio de regeneración, que contiene el agente de selección (por ejemplo imidazolinona, aunque pueden usarse diversos marcadores de selección). Las placas Petri se incuban a la luz a 25°C durante 2-3 semanas, o hasta que se desarrollan los vástagos. Los vástagos verdes se transfieren desde cada embrión a medio de enraizamiento y se incuban a 25°C durante 2-3 semanas, hasta que se desarrollan raíces. Los vástagos con raíz se trasplantan a tierra en el invernadero. Se producen semillas T1 a partir de plantas que exhiben tolerancia al agente de selección y que contienen una sola copia del inserto de T-DNA.

Transformación de soja

La soja se transforma según una modificación del procedimiento descrito en la patente de Texas A&M US 5.164.310. Diversas variedades de soja comerciales son susceptibles a la transformación mediante este procedimiento. Habitualmente, en la transformación se usa la variedad cultivada Jack (disponible en la Illinois Seed foundation) Se esterilizan semillas de soja para la siembra in vitro. El hipocótilo, la radícula y un cotiledón se cortan de plántulas jóvenes de siete días. El epicótilo y el cotiledón restante se cultivan adicionalmente hasta desarrollar nudos axilares. Estos nudos axilares se cortan y se incuban con Agrobacterium tumefaciens que contiene el vector de expresión. Después del tratamiento de cocultivo, los explantes se lavan y se transfieren a medio de selección. Los vástagos regenerados se cortan y se introducen en un medio de elongación de vástagos. Los vástagos no mayores de 1 cm se introducen medio de enraizamiento hasta que se desarrollan raíces. Los vástagos con raíz se trasplantan a tierra en el invernadero. Se producen semillas T1 a partir de plantas que exhiben tolerancia al agente de selección y que contienen una sola copia del inserto de T-DNA.

Transformación de colza/canola

Peciolos e hipocótilos cotiledonares de plántulas jóvenes de 5-6 días se usan como explantes para cultivo tisular y se transforman según Babic et al. (1998, Plant Cell Rep 17: 183 -188). La variedad cultivada comercial Westar (Agriculture Canadá) es la variedad estándar usada para la transformación, pero también pueden usarse otras variedades. Semillas de canola se esterilizan superficialmente para la siembra in vitro. in vitro. Los explantes de peciolo cotiledonar con el cotiledón unido se cortan de las plántulas in vitro, y se inoculan con Agrobacterium (que contienen el vector de expresión) sumergiendo el extremo cortado del explante de peciolo en la suspensión bacteriana. Los explantes se cultivan a continuación durante 2 días en medio MSBAP-3 que contiene 3 mg/l de BAP,

3% de sacarosa, 0,7% de Phytagar a 23°C, 16 horas de luz. Después de dos días de cocultivo con Agrobacterium, los explantes de peciolo se transfieren a medio MSBAP-3 que contiene 3 mg/l de BAP, cefotaxima, carbenicilina o timentina (300 mg/l) durante 7 días, y a continuación se cultivan en medio MSBAP-3 con cefotaxima, carbenicilina o timentina y agente de selección hasta la regeneración de vástagos. Cuando los vástagos tienen 5 -10 mm de longitud, se cortan y se transfieren a medio de elongación de vástagos (MSBAP-0.5, que contiene 0,5 mg/l de BAP). Los vástagos de aproximadamente 2 cm de longitud se transfieren al medio de enraizamiento (MS0) para la inducción de las raíces. Los vástagos con raíz se trasplantan a tierra en el invernadero. Se producen semillas T1 a partir de plantas que exhiben tolerancia al agente de selección y que contienen una sola copia del inserto de T-DNA.

Transformación de alfalfa

Un clon regenerador de alfalfa (Medicago sativa) se transforma usando el procedimiento de (McKersie et al., 1999 Plant Physiol 119: 839 -847). La regeneración y la transformación de la alfalfa dependen del genotipo y por lo tanto se requiere una planta regenerativa. Se han descrito procedimientos para obtener plantas regenerativas. Por ejemplo, estas pueden seleccionarse de la variedad cultivada Rangelander (Agriculture Canadá) o cualquier otra variedad de alfalfa comercial según describen Brown DCW y A Atanassov (1985. Plant Cell Tissue Organ Culture 4: 111 -112). Alternativamente, la variedad RA3 (University of Wisconsin) se ha seleccionado para el uso en el cultivo tisular (Walker et ál., 1978 Am J Bot 65:654-659) Se cocultivan explantes de peciolo con un cultivo nocturno de pMP90 de Agrobacterium tumefaciens C58C1 (McKersie et ál., 1999 Plant Physiol 119: 839 -847) o LBA4404 que contiene el vector de expresión. Los explantes se cocultivan durante 3 días en la oscuridad sobre medio de inducción SH que contiene 288 mg/l de Pro, 53 mg/l de tioprolina, 4, 35 g/l de K2SO4 y 100 μm de acetosiringinona. Los explantes se lavan en medio de Murashige-Skoog de fuerza media (Murashige y Skoog, 1962) y se cultivan en placa sobre el mismo medio de inducción SH sin acetosiringinona pero con un agente de selección adecuado y un antibiótico adecuado para inhibir el crecimiento de Agrobacterium. Después de varias semanas, embriones somáticos se transfieren a medio de desarrollo BOi2Y que no contiene reguladores del crecimiento, ni antibióticos, y 50 g/l de sacarosa. Posteriormente, los embriones somáticos se germinan sobre medio de Murashige-Skoog de fuerza media. Las plántulas enraizadas se trasplantaron a macetas y se cultivaron en un invernadero. Se producen semillas T1 a partir de plantas que exhiben tolerancia al agente de selección y que contienen una sola copia del inserto de T-DNA.

Transformación de algodón

La transformación del algodón (se lleva a cabo utilizando Agrobacterium tumefaciens de acuerdo con el procedimiento descrito en US 5.159.135. Las semillas de algodón se esterilizan en la superficie en una solución de hipoclorito sódico al 3% durante 20 minutos y se lavaron en agua destilada con 500 µg/ml de cefotaxima. Después, las semillas se transfieren a medio SH con 50µg/ml de benomilo para su germinación. Hipocótilos de plántulas de 4 a 6 días se retiran, se cortan en piezas de 0,5 cm y se introducen en agar al 0,85. Para la inoculación de los explantes de los hipocótilos se usa una suspensión de Agrobacterium (aprox. 108 células por ml. diluida de un cultivo durante la noche transformado con el gen de interés y los marcadores de selección adecuados. Tras 3 días a temperatura ambiente y luz, los tejidos se transfieren a un medio sólido (,6 g/l de Gelrite) con sales de Murashige and Skoog con vitamina B5 (Gamborg et al., Exp Cell Res. 50:151 -158 (1968)), 0,1 mg/l 2,4-D, 0,1 mg/l DE 6furfurilaminopurina y 750 µg/ml de MgCl2 y con de 50 a 100 µg/ml de cefotaxima y 400 -500 µg/ml de carbenicilina para matar las bacterias residuales. Las líneas de células individuales se aíslan tras dos o tres meses (con subcultivos cada cuatro a seis semanas) y después se cultivan en medio selectivo para la amplificación del tejido (30ºC, 16 horas de fotoperiodo). Los tejidos transformados se cultivan después en medio no selectivo durante de 2 a 3 meses, dando lugar a embriones somáticos. Los embriones de aspecto sano de al menos 4 mm de longitud se transfieren a tubos con medio SH en vermiculita fina, se suplementan con 0,1 mg/l de ácido indol acético, de furfurilaminopurina y ácido giberélico. Los embriones se cultivan a 30ºC con un fotoperiodo de 16 horas y los plantones en el estadio de 2 a 3 hojas se transfieren a macetas con vermiculita y nutrientes. Las plantas se endurecen y después de pasan al invernadero para su posterior cultivo.

Ejemplo 9: Procedimiento de evaluación fenotípica

9.1. Establecimiento de la evaluación

Se generaron aproximadamente 35 transformantes de arroz T0 independientes. Los transformantes primarios se transfirieron desde una cámara de cultivo tisular hasta un invernadero para cultivar y recolectar las semillas T1. Se retuvieron seis casos, de los que la progenie T1 segregaba 3:1 para la presencia/ausencia del transgén. Para cada uno de estos casos, aproximadamente 10 plántulas T1 que contenían el transgén (hetero y homocigotos) y aproximadamente 10 plántulas T1 que carecían del transgén (nulicigotos) se seleccionaron verificando la expresión de marcadores visuales. Las plantas transgénicas y los nulicigotos correspondientes se cultivaron en paralelo en posiciones aleatorias. Las plantas de arroz se cultivaron en suelo para macetas en condiciones normales a excepción de la solución de nutrientes. Las macetas se regaron desde el transplante a la maduración con una solución de nutrientes específica que contenía un contenido reducido en nitrógeno (N), normalmente entre 7 a 8 veces menos. El resto del cultivo (maduración de la planta, recolección de semillas) fue igual que para las plantas ni cultivadas en estrés abiótico. Las condiciones del invernadero eran de días cortos (12 horas de luz), 28°C a la luz y 22°C en la oscuridad, y una humedad relativa de 70%. Después se midieron los parámetros relacionados con las

semillas.

Cuatro casos T1 se evaluaron adicionalmente en la generación T2 después del mismo procedimiento de evaluación que para la generación T1 pero con más individuos por caso. Desde la fase de siembra hasta el estado de madurez las plantas se hicieron pasar varias veces a través de una cabina de obtención de imágenes digitales. En cada punto temporal se tomaron imágenes digitales (2048x1536 píxeles, 16 millones de colores) de cada planta desde al menos 6 ángulos diferentes.

Criba por estrés salino

Las plantas se cultivan en un sustrato elaborado a base de fibras de coco y Argex (relación 3 a 1). Se utiliza una solución nutriente normal durante las dos primeras semanas después del trasplante de las plántulas en el invernadero. Después de las dos primeras semanas, se añade 25 mM de sal (NaCl) a la solución nutriente, hasta que se cosechan las plantas. Después se midieron los parámetros relacionados con las semillas.

9.2 Análisis estadístico: prueba de la F:

Se usó un ANOVA (análisis de variantes) de dos factores como un modelo estadístico para la evaluación general de las características fenotípicas de plantas. Se llevó a cabo una prueba de la F sobre todos los parámetros medidos de todas las plantas de todos los casos transformados con el gen de la presente invención. La prueba de la F se llevó a cabo para comprobar un efecto del gen sobre todos los casos de transformación y para verificar un efecto general del gen, también conocido como efecto global del gen El umbral de significación para un efecto global del gen se estableció en un nivel de probabilidad del 5% para la prueba de la F. Un valor de la prueba de la F significativo apunta a un efecto del gen, significando que no es solo la mera presencia o posición del gen lo que está provocando las diferencias en el fenotipo.

9.3 Parámetros medidos

Medición del parámetro relacionado con la biomasa

Desde la fase de siembra hasta el estado de madurez las plantas se hicieron pasar varias veces a través de una cabina de obtención de imágenes digitales. En cada punto temporal se tomaron imágenes digitales (2048x1536 píxeles, 16 millones de colores) de cada planta desde al menos 6 ángulos diferentes.

La región aérea de a planta (por biomasa folial, áreamax) se determinó contando el número total de píxeles en las imágenes digitales de las partes aéreas de la planta discriminadas con respecto del fondo. Este valor se promedió para las imágenes tomadas en el mismo punto de tiempo desde diferentes ángulos y se convirtió en un valor de la superficie física expresado en mm cuadrados mediante calibración. Los experimentos muestran que la región aérea de la planta medida de este modo se correlaciona con la biomasa de las partes aéreas de la planta. La región aérea de la planta es el área medida en el punto en el cual la planta había alcanzado su biomasa folial máxima. El vigor temprano es la región aérea de la planta (plántula) tres semanas después de la germinación. El incremento en la biomasa de la raíz se expresa como un incremento en la biomasa de la raíz total (medida como la biomasa máxima de las raíces observada durante el ciclo de vida de una planta) o como un incremento en el índice de raíz/vástago (medido como la proporción entre la masa de la raíz y la masa del vástago en el periodo de crecimiento activo de la raíz y el vástago).

Medición del parámetro relacionado con la semilla

Los panículos primarios maduros se recolectaron, se contaron, se introdujeron en bolsas, se marcaron con códigos de barras y a continuación se secaron durante tres días en un horno a 37°C. A continuación, los panículos se trillaron y todas las semillas se recogieron y se contaron. Las cáscaras llenas se separaron de las vacías usando un dispositivo de soplado de aire. Las cáscaras vacías se descartaron y la fracción restante se contó de nuevo. Las cáscaras llenas se pesaron en una balanza analítica. El número de cáscaras llenas se determinó contando el número de cáscaras llenas que permanecían después de la etapa de separación. El rendimiento total de semillas se midió pesando todas las cáscaras llenas recolectadas de una planta. El número total de semillas por planta se midió contando el número de cáscaras recolectadas de una planta. El peso de mil granos (TKW) se extrapola del número de cáscaras llenas contadas y su peso total. El índice de recolección (HI) en la presente invención se define como la relación entre el rendimiento total de semillas y el área de las partes aéreas (mm2), multiplicado por un factor 106. El número total de flores por panículo según se define en la presente invención es la relación entre el número total de semillas y el número de panículos primarios maduros. El grado de llenado de las semillas, según se define en la presente invención, es la proporción (expresada como un %) del número de semillas llenas sobre el número total de semillas (o florecillas).

Ejemplo 10: Resultados de la evaluación fenotípica de las plantas transgénicas

Un incremento en la biomasa y el rendimiento de las semillas, como se muestra en la Tabla F, se observó para las plantas transgénicas en comparación con los correspondientes nulicigotos (controles), en cada caso, el valor de p fue inferior a 0,05.

Parámetro

Incremento (en %)

Áreamax (biomasa)

17,0

Peso total de las semillas

35,9

Número de semillas llenas

34,7

Tasa de llenado de semillas

11,6

Índice de recolección

17,1

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> BASF Plant Science GmbH

5 <120> Plantas que tienen rasgos potenciados relacionados con el rendimiento y/o mayor resistencia al estrés abiótico y un procedimiento para fabricar las mismas

<130> PF58787 10 <160> 416

<170> PatentIn versión 3.3

<210> 1 15 <211> 1075

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 1 20

<210>2

<211> 256

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 2

<210>3

<211> 3561 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> casete de expresión 10

<400> 3

5

<210>4 <211>51 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> cebador: prm1505

10

<400> 4 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cacaatggtc gcggacaaga g 51

15

<210>5 <211> 48 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador: prm1506

20

<400> 5 ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc ccatcattcc tcaccatc 48

25

<210>6 <211> 1101 <212> ADN <213> Nicotiana tabacum

<400> 6

<210>7

<211> 256

<212> PRT

<213> Nicotiana tabacum

<400> 7

<210>8

<211> 1061

<212> ADN

<213> Nicotiana tabacum

<400> 8

<210>9

<211> 260

<212> PRT

<213> Nicotiana tabacum

<400> 9

5 <210> 10

<211> 1210

<212> ADN

<213> Medicago sativa

10 <220>

<221> misc_feature

<222> (1014)..(1014)

<223> n es a, c, go t 15

<400> 10

<210> 11

<211> 260

<212> PRT

<213> Medicago sativa

<400> 11

<210> 12

<211> 907

<212> ADN

<213> Zea mays

<400> 12

<210> 13

<211> 258

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 13

<210> 14

<211> 780

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 14

<210> 15

<211> 259

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 15

5 <210> 16

<211> 1315

<212> ADN

<213> Oryza sativa

10 <400> 16

<210> 17

<211> 252

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 17

<210> 18

<211> 958

<212> ADN

<213> Zea mays

<400> 18

<210> 19

<211> 251

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 19

5 <210> 20

<211> 1257

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

10 <400> 20

15 <210>21

<211> 256

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 21

<210> 22

<211> 1003

<212> ADN

<213> Lycopersicon esculentum

<400> 22

<210> 23

<211> 261

<212> PRT

<213> Lycopersicon esculentum

<400> 23

10 <210> 24

<211> 1557

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

15 <400> 24

<210> 25

<211> 372

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 25

<210> 26

<211> 1575

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 26

<210> 27

<211> 379

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 27

<210> 28

<211> 1624

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 28

<210> 29

<211> 374

<212> PRT

<213> Arabidopsis thalian

<400> 29

<210> 30

<211> 990

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 30

<210>31

<211> 329

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 31

<210> 32

<211> 199 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> NAP dominio of SEC ID Nº: 2 10

<400> 32 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> firma

<220>

<221> VARIANTE

<222> (1)..(1)

<223> /sustituir = "Ser"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (4)..(4)

<223> /sustituir= "Asn" /sustituir= "Ser" /sustituir= "Glu" /sustituir= "Asp"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (5)..(5)

<223> /sustituir= "Phe"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (6)..(6)

<223> /sustituir= "Phe"

<400> 33

<210> 34

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

5

<220>

<223> Secuencia artificial

<400> 34

10

<210> 35

<211> 1597

<212> ADN

<213> Pisum sativum

<400> 35 <210> 37

20

<210> 36

<211> 366

<212> PRT

<213> Pisum sativum

25

<400> 36

<211> 1442

<212> ADN

<213> Glycine max

<400> 37 <210> 38

<211> 358

<212> PRT

<213> Glycine max

<400> 38 <210> 39

<211> 2194

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 39

<210> 40

<211> 739

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 40

<210>41

<211> 128

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 41

5 <210> 42

<211> 922

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

10 <400> 42

<210> 43 15 <211> 128

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 43 20

<210> 44

<211> 282

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 44

<210> 45

<211> 93

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 45

<210> 46

<211> 652

<212> ADN

<213>

Arabidopsis thaliana 25

<400> 46

<210> 47

<211> 97

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 47

<210> 48

<211> 297

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 48

<210> 49

<211> 98

<212> PRT

<213>

Arabidopsis thaliana 25

<400> 49

<210> 50

<211> 865

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 50

<210>51

<211> 129

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 51

<210> 52

<211> 267

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 52

10 <210> 53

<211> 88

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

15 <400> 53

<210> 54 20 <211> 625

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 54 25

<210> 55 <211>91

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 55

<210> 56

<211> 781

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 56

<210> 57 <211>91

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 57

<210> 58

<211> 599

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana 25

<400> 58

<210> 59

<211> 99

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 59

<210> 60

<211> 650

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 60

20 <210>61

<211> 98

<212> PRT

<213>

Arabidopsis thaliana 25

<400> 61

<210> 62

<211> 387

<212> ADN

<213> Medicago truncatula

<400> 62

<210> 63

<211> 128

<212> PRT

<213> Medicago truncatula

<400> 63

<210> 64

<211> 387

<212> ADN

<213>

Populus trichocarpa 25

<400> 64

<210> 65

<211> 128

<212> PRT

<213> Populus trichocarpa

<400> 65

<210> 66

<211> 824

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 66

<210> 67

<211> 129

<212> PRT

<213>

Oryza sativa 25

20 20

<400> 67

5 <210> 68

<211> 579

<212> ADN

<213> Oryza sativa

10 <400> 68

<210> 69 15 <211> 104

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 69 20

<210> 70

<211> 954

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 70

10 <210>71

<211> 147

<212> PRT

<213> Oryza sativa

15 <400> 71

<210> 72 20 <211> 681

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 72 25

<210> 73

<211> 89

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 73

<210> 74

<211> 548

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 74

<210> 75

<211> 97

<212> PRT

<213>

Oryza sativa 25

<400> 75

<210> 76

<211> 586

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 76

<210> 77

<211> 98

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 77

<210> 78

<211> 718

<212> ADN

<213>

Oryza sativa 25

<400> 78

<210> 79

<211> 99

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 79

<210> 80

<211> 411

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 80

20 <210>81

<211> 136

<212> PRT

<213>

Oryza sativa 25

<400> 81

<210> 82

<211> 297

<212> ADN

<213> Linum usitatissimum

<400> 82

<210> 83

<211> 98

<212> PRT

<213> Linum usitatissimum

<400> 83

<210> 84

<211> 288

<212> ADN

<213>

Brassica napus 25

<400> 84

<210> 85

<211> 95

<212> PRT

<213> Brassica napus

<400> 85

<210> 86

<211> 387

<212> ADN

<213> Brassica napus

<400> 86

<210> 87

<211> 128

<212> PRT

<213>

Brassica napus 25

20 20

<400> 87

<210> 88

<211> 375

<212> ADN

<213> Brassica napus

<400> 88

<210> 89

<211> 128

<212> PRT

<213> Brassica napus

<400> 89

<210> 90

<211> 390

<212> ADN

<213> Brassica napus

<400> 90

<210>91

<211> 129

<212> PRT

<213> Brassica napus

<400> 91

<210> 92

<211> 390

<212> ADN

<213> Brassica napus 20

<400> 92

25 <210> 93

<211> 129

<212> PRT

<213> Brassica napus

30 <400> 93

<210> 94

<211> 390

<212> ADN

<213> Brassica napus

<400> 94

<210> 95

<211> 129

<212> PRT

<213> Brassica napus

<400> 95

<210> 96

<211> 450

<212> ADN

<213> Glycine max

<400> 96

5 <210> 97

<211> 149

<212> PRT

<213> Glycine max

10 <400> 97

<210> 98 15 <211> 450

<212> ADN

<213> Glycine max

<400> 98 20

<210> 99

<211> 149

<212> PRT

<213> Glycine max

<400> 99

5 <210> 100

<211> 450

<212> ADN

<213> Glycine max

10 <400> 100

<210> 101 15 <211> 149

<212> PRT

<213> Glycine max

<400>

101 20

<212> ADN

<213> Glycine max

<400>

102 10

<210> 103

<211> 87

<212> PRT

<213> Glycine max

<400> 103

<210> 104

<211> 387

<212> ADN

<213> Hordeum vulgare

<400> 104

<210> 105

<211> 128

<212> PRT

<213> Hordeum vulgare

<400> 105

<210> 106

<211> 432

<212> ADN

<213> Hordeum vulgare 20

<400> 106

25 <210> 107

<211> 143

<212> PRT

<213> Hordeum vulgare

30 <400> 107

<210> 108

<211> 387

<212> ADN

<213> Triticum aestivum

<400> 108

<210> 109

<211> 128

<212> PRT

<213> Triticum aestivum

<400> 109

<210> 110

<211> 432

<212> ADN

<213> Triticum aestivum

<400> 110

<210> 111

<211> 143

<212> PRT

<213> Triticum aestivum

<400> 111

15

<210> 112

<211> 432

<212> ADN

<213> Triticum aestivum

20

<400> 112

25 <210> 113

<211> 143

<212> PRT

<213> Triticum aestivum

30 <400> 113 <212> ADN

<213> Zea mays

<400> 114 10

<210> 115

<211> 128

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 115

<210> 116

<211> 441

<212> ADN

<213> Zea mays

<400> 116

<210> 117

<211> 146

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 117

<210> 118

<211> 82

<212> PRT 20 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> dominio

25 <220>

<221> DUDOSO

<222> (4)..(4)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

30 <220>

<221> DUDOSO

<222> (10)..(10)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

35 <220>

<221> DUDOSO

<222> (13)..(14)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<220>

<221> DUDOSO

<222> (18)..(18)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<220>

<221> DUDOSO

<222> (21)..(21)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<220>

<221> DUDOSO

<222> (24)..(24)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<220>

<221> DUDOSO

<222> (26)..(26)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<220>

<221> DUDOSO

<222> (28)..(28)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<220>

<221> DUDOSO

<222> (30)..(31)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<220>

<221> DUDOSO

<222> (41)..(41)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<220>

<221> DUDOSO

<222> (44)..(44)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<220>

<221> DUDOSO

<222> (46)..(46)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<220>

<221> DUDOSO

<222> (48)..(49)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<220>

<221> DUDOSO

<222> (52)..(62)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<220>

<221> DUDOSO

<222> (64)..(64)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<220>

<221> DUDOSO

<222> (66)..(67)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<220>

<221> DUDOSO

<222> (72)..(73)

<223>

Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural 5

<220>

<221> DUDOSO

<222> (76)..(76)

<223>

Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural 10

<220>

<221> DUDOSO

<222> (79)..(81)

<223>

Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural 15

<400> 118

20 <210> 119

<211> 92

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

25 <220>

<223> dominio

<220>

<221>

DUDOSO 30 <222> (1)..(7)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<220>

<221>

DUDOSO 35 <222> (10)..(10)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<220>

<221>

DUDOSO 40 <222> (12)..(17)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<220>

<221>

DUDOSO 45 <222> (21)..(21)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<220>

<221>

DUDOSO 50 <222> (26)..(27)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural <220>

<221> DUDOSO

<222> (29)..(29)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<220>

<221> DUDOSO

<222> (31)..(31)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<220>

<221> DUDOSO

<222> (33)..(34)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<220>

<221> DUDOSO

<222> (37)..(37)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<220>

<221> DUDOSO

<222> (39)..(39)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<220>

<221> DUDOSO

<222> (44)..(64)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<220>

<221> DUDOSO

<222> (66)..(78)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<220>

<221> DUDOSO

<222> (85)..(85)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<220>

<221> DUDOSO

<222> (89)..(89)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<220>

<221> DUDOSO

<222> (91)..(92)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<400> 119

<210> 120

<211> 83 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> dominio 10

<400> 120

15 <210> 121

<211> 83

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> dominio

<400> 121

<210> 122

<211> 74

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

5

<220>

<223> dominio

<400> 122

10

<210> 123

<211> 84 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> dominio 20

<400> 123

25 <210> 124

<211> 84

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

30 <220>

<223> dominio

<400> 124

<210> 125

<211> 73 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> dominio 10

<400> 125

15 <210> 126

<211> 82

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> dominio

<400> 126

<210> 127

<211> 84

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> dominio

<400> 127

<210> 128

<211> 84 10 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> dominio 15

<400> 128

20 <210> 129

<211> 84

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

25 <220>

<223> dominio

<400> 129

<210> 130

<211> 76 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> dominio 10

<400> 130

<210> 131 15 <211> 44

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 20 <223> dominio

<400> 131 <210> 133

25

<210> 132

<211>51

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

30

<220>

<223> dominio

<400> 132

35

<211> 84 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> dominio 10

<400> 133

15 <210> 134 <211>91

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> dominio

<400> 134

<210> 135

<211> 84

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> dominio <400> 135

5 <210> 136

<211> 73

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

10 <220>

<223> dominio

<400> 136

<210> 137

<211> 83

<212> PRT 20 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> dominio

25 <400> 137

<210> 138 30 <211> 90

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> dominio

<400> 138

<210> 139

<211> 77 10 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> dominio 15

<400> 139

20 <210> 140

<211> 74

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

25 <220>

<223> dominio

<400> 140

<210> 141

<211> 76

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

5

<220>

<223> dominio

<400> 141

10

<210> 142

<211> 50 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> dominio 20

<400> 142

25 <210> 143

<211> 83

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

30 <220>

<223> dominio

<400> 143

<210> 144

<211> 83

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> dominio

<400> 144

<210> 145

<211> 73

<212> PRT 15 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> dominio

20 <400> 145

<210> 146 25 <211> 73

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 30 <223> dominio

<400> 146 <210> 147

<211> 73 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> dominio 10

<400> 147

15 <210> 148

<211> 73

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> dominio

<400> 148

<210> 149

<211> 73

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> dominio

<400> 149

<210> 150

<211> 73 10 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> dominio 15

<400> 150

20 <210> 151

<211> 82

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

25 <220>

<223> dominio

<400> 151

<210> 152

<211> 83

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

5

<220>

<223> dominio

<400> 152

10

<210> 153

<211> 73 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> dominio 20

<400> 153

25 <210> 154

<211> 83

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

30 <220>

<223> dominio

<400> 154

<210> 155

<211> 73 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> dominio 10

<400> 155

15 <210> 156

<211> 73

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> dominio

<400> 156

<210> 157

<211> 83

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> dominio <400> 157

5 <210> 158

<211> 73

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

10 <220>

<223> dominio

<400> 158

<210> 159

<211> 46

<212> PRT 20 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> motivo 1

<220>

25 <221> DUDOSO

<222> (4)..(4)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<220>

30 <221> DUDOSO

<222> (15)..(15)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<400> 159 35

<210> 160

<211> 23

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

5

<220>

<223> motivo 2

<400> 160

10

<210> 161

<211> 1828

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 161

<210> 162

<211> 53

<212> ADN 25 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador en sentido

30 <400> 162 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt aaacaatgtc ttgggctgct cct53

<210> 163 5 <211> 50

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 10 <223> cebador antisentido

<400> 163 ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt ttctacaatg ctgcaacaca 50

15 <210> 164

<211> 1827

<212> ADN

<213> Oryza sativa

20 <400> 164

<210> 165 25 <211> 975

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 165 30

<210> 166

<211> 217

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 166

<210> 167

<211> 54

<212> ADN 15 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador: prm02688

20 <400> 167 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cacaatggcg gattttcaga catc 54

<210> 168

<211> 49

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador: prm02689

<400> 168 ggggaccact ttgtacaaga aagctgggta aactcaacct atgggtggc 49

<210> 169 <211>8

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> motivo conservado

<220>

<221> VARIANTE

<222> (1)..(1)

<223> /sustituir= "Val" /sustituir= "Ile"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (2).. (2)

<223> /sustituir= "Arg"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (3)..(3) <223> /sustituir= "Asp"

<220>

<221> DUDOSO

<222> (6)..(6)

<400> 169

<210> 170

<211> 1236

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 170

<210> 171

<211> 1828

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 171

<210> 172

<211> 1011

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 172

5 <210> 173

<211> 336

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

10 <400> 173

<210> 174

<211> 1204

<212> ADN

<213> Populus tremula x Populus tremuloides

<400> 174

<210> 175

<211> 332

<212> PRT

<213> Populus tremula x Populus tremuloides

<400> 175

<210> 176

<211> 1593

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 176 <210> 177

<211> 330

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 177

<210> 178

<211> 1434

<212> ADN

<213> Lycopersicon esculentum

<400> 178

5 <210> 179

<211> 328

<212> PRT

<213> Lycopersicon esculentum

10 <400> 179

<210> 180

<211> 1600

<212> ADN

<213> Zea mays

<400> 180

<210> 181

<211> 329

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 181

<210> 182

<211> 1578

<212> ADN

<213> Triticum aestivum

<400> 182

<210> 183

<211> 332

<212> PRT

<213> Triticum aestivum

<400> 183

<210> 184

<211> 1564

<212> ADN

<213> Aquilegia formosa

<400> 184

<210> 185

<211> 334

<212> PRT

<213> Aquilegia formosa

<400> 185

<210> 186

<211> 1225

<212> ADN

<213> Solanum tuberosum

<400> 186

<210> 187

<211> 305

<212> PRT

<213> Solanum tuberosum

<400> 187

<210> 188

<211> 1187

<212> ADN

<213> Saccharum officinarum

<400> 188

<210> 189

<211> 308

<212> PRT

<213> Saccharum officinarum

<400> 189

<210> 190

<211> 969

<212> ADN

<213> Ostreococcus tauri

<400> 190

<210> 191

<211> 322

<212> PRT

<213> Ostreococcus tauri

<400> 191

<210> 192

<211> 1244

<212> ADN

<213> Drosophila melanogaster

<400> 192

<210> 193

<211> 324

<212> PRT

<213> Drosophila melanogaster

<400> 193

<210> 194

<211> 1150

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 194 <210> 195

<211> 323

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 195

<210> 196

<211> 1311

<212> ADN

<213> Phaeodactylum tricornutum

<400> 196

<210> 197

<211> 436

<212> PRT

<213> Phaeodactylum tricornutum

<400> 197

<210> 198

<211> 1254

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 198

<210> 199

<211> 296

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 199

<210> 200

<211> 923

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 200

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 201 10

<210> 202

<211> 878

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 202

<210> 203

<211> 212

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 203

<210> 204

<211> 2356

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 204

<210> 205

<211> 190

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 205

<210> 206

<211> 642

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 206

<210> 207

<211> 202

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 207

<210> 208

<211> 969

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 208

<210> 209

<211> 202

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 209

<210> 210

<211> 959

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 210

<210> 211

<211> 201

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 211

<210> 212

<211> 609

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 212

<210> 213

<211> 202

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 213

<210> 214

<211> 528

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 214

<210> 215

<211> 175

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 215

<210> 216

<211> 847

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 216

<210> 217

<211> 190

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 217

<210> 218

<211> 351

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 218

<210> 219

<211> 116

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 219

<210> 220

<211> 609

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 220

<210> 221

<211> 202

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 221

<210> 222

<211> 485

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 222

<210> 223

<211> 123

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 223

<210> 224

<211> 363

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 224

<210> 225

<211> 120

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 225

<210> 226

<211> 1299

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 226

5 <210> 227

<211> 308

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

10 <400> 227

<210> 228

<211> 1298

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 228

<210> 229

<211> 347

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 229

<210> 230

<211> 792

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 230

<210> 231

<211> 263

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 231

<210> 232

<211> 1495

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 232

5 <210> 233

<211> 274

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

10 <400> 233

<210> 234

<211> 1038

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 234

<210> 235

<211> 345

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 235

10 <210> 236

<211> 1284

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

15 <400> 236

<210> 237

<211> 427

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 237

<210> 238

<211> 1421

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 238

<210> 239

<211> 442

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 239

<210> 240

<211> 1734

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 240

<210> 241

<211> 509

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 241

<210> 242

<211> 2020

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 242

<210> 243

<211> 555

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 243

<210> 244

<211> 1652

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 244

<210> 245

<211> 486

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 245

<210> 246

<211> 351

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 246

<210> 247

<211> 116

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 247

<210> 248

<211> 636

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 248

<210> 249

<211> 211

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana 25

<400> 249

<210> 250

<211> 537

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 250

<210> 251

<211> 178

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 251

<210> 252

<211> 639

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 252

<210> 253

<211> 212

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 253

<210> 254

<211> 528

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 254

<210> 255

<211> 175

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 255

<210> 256

<211> 771

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 256

<210> 257

<211> 256

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 257

<210> 258

<211> 1044

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 258

<210> 259

<211> 347

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 259

<210> 260 10 <211> 825

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 260 15

<210> 261

<211> 274

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 261

<210> 262

<211> 1071

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 262

10 <210> 263

<211> 356

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

15 <400> 263

<210> 264

<211> 540 5 <212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 264 10

<210> 265

<211> 179

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 265 <210> 266

<211> 612

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 266

<210> 267

<211> 203

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 267 <210> 268

<211> 1013

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 268

<210> 269

<211> 206

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 269 <210> 270

<211> 1021

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 270

<210> 271

<211> 153

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 271 <210> 272

<211> 981

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 272

<210> 273

<211> 262

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 273 <210> 274

<211> 1031

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 274 <210> 275

<211> 175

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 275

<210> 276

<211> 1526

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 276 <210> 277

<211> 316

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 277 <210> 278

<211> 1234

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 278

<210> 279

<211> 284

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 279 <210> 280

<211> 717

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 280

<210> 281

<211> 238

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 281

5 <210> 282

<211> 1242

<212> ADN

<213> Oryza sativa

10 <400> 282

<210> 283

<211> 340

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 283 <210> 284

<211> 1653

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 284 <210> 285

<211> 399

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 285 <210> 286

<211> 1578

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 286

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 287 10

<210> 288

<211> 1873

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 288

<210> 289

<211> 510

<212> PRT

<213> Oryza sativa 10

<400> 289

<210> 290

<211> 1108

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 290

<210> 291

<211> 284

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 291 <210> 292

<211> 1452

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 292

<210> 293

<211> 427

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 293

<210> 294

<211> 1739

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 294

5 <210> 295

<211> 493

<212> PRT

<213> Oryza sativa

10 <400> 295

<210> 296

<211> 1261

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 296 <210> 297

<211> 357

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 297

10 <210> 298

<211> 2845

<212> ADN

<213> Oryza sativa

15 <400> 298

<210> 299

<211> 620

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 299

<210> 300

<211> 2200

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 300 <210> 301

<211> 602

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 301

<210> 302

<211> 1953

<212> ADN 213> Oryza sativa

<400> 302

<210> 303

<211> 423

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 303

<210> 304

<211> 1824

<212> ADN

<213> Zea mays

<400> 304

<210> 305

<211> 607

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 305

<210> 306

<211> 946

<212> ADN

<213> Solanum tuberosum

<400> 306

<210> 307

<211> 198

<212> PRT

<213> Solanum tuberosum

<400> 307

<210> 308

<211> 1581

<212> ADN

<213> Glycine max

<400> 308 <210> 309

<211> 526

<212> PRT

<213> Glycine max

<400> 309

<210> 310

<211> 840

<212> ADN

<213> Medicago truncatula

<400> 310

5 <210> 311

<211> 279

<212> PRT

<213> Medicago truncatula

10 <400> 311

<210> 312

<211> 1863

<212> ADN

<213> Medicago truncatula

<400> 312

<210> 313

<211> 620

<212> PRT

<213> Medicago truncatula

<400> 313

<210> 314

<211> 1392

<212> ADN

<213> Medicago truncatula

<400> 314

<210> 315

<211> 463

<212> PRT

<213> Medicago truncatula

<400> 315

<210> 316

<211> 594

<212> ADN

<213> Lycopersicon esculentum

<400> 316

<210> 317

<211> 197

<212> PRT

<213> Lycopersicon esculentum 15

<400> 317

20 <210> 318

<211> 525

<212> ADN

<213> Lycopersicon esculentum

25 <400> 318

<210> 319

<211> 174

<212> PRT

<213> Lycopersicon esculentum

<400> 319

<210> 320

<211> 402

<212> ADN

<213> Medicago truncatula

<400> 320

<210> 321

<211> 133

<212> PRT

<213> Medicago truncatula 25

<400> 321 <212> ADN

<213> Musa acuminata

<400> 322 10

<210> 323

<211> 272

<212> PRT

<213> Musa acuminata

<400> 323

<210> 324

<211> 867

<212> ADN

<213> Medicago truncatula

<400> 324

<210> 325

<211> 288

<212> PRT

<213> Medicago truncatula

<400> 325

10 <210> 326

<211> 111

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

15 <220>

<223> dominio de la remorina comprendido en SEC ID Nº: 2

<400> 326 <210> 327

<211> 56

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador: prm09186

<400> 327 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt aaacaatgtt gactttgtac ggtcaa 56

<210> 328 <211>51

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador: prm09187

<400> 328 ggggaccact ttgtacaaga aagctgggta gcttagctag gaaagagaga a 51

<210> 329

<211> 2194

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 329

<210> 330

<211> 1130

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 330 <210> 331

<211> 1130

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 331

<210> 332

<211> 1242

<212> ADN

<213> Zea mays

<400> 332

<210> 333

<211> 266

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 333

<210> 334

<211> 111 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> secuencia en C-terminal de SEC ID Nº: 333 10

<400> 334

<210> 335

<211> 920

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 335

10 <210> 336

<211> 238

<212> PRT

<213> Oryza sativa

15 <400> 336 <210> 337

<211> 52

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador 1

<400> 337 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt aaacaatgtg cgggatcaag ca 52

<210> 338 <211>51

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador 2

<400> 338 ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtg gcaaaattgt acagttgatt g 51

<210> 339

<211> 2194

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 339

<210> 340

<211> 74

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> secuencia consensor de un dominio AP2

<220>

<221> DUDOSO

<222> (1)..(1)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<220>

<221> VARIANTE

<222> (2)..(2)

<223> /sustituir= "His" /sustituir= "Trp" /sustituir= "Tyr"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (3)..(3)

<223> /sustituir= "Lys" /sustituir= "Arg" <220>

<221> VARIANTE

<222> (6)..(6)

<223> /sustituir= "Asp" /sustituir= "Glu" /sustituir= "His" /sustituir= "Lys" /sustituir= "Lys" /sustituir= "Asn" Gln" /sustituir= "Arg" /sustituir= "Ser" /sustituir= "Thr"

<220>

<221> DUDOSO

<222> (7)..(7)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<220>

<221> VARIANTE

<222> (8)..(8)

<223> /sustituir= "Lys" /sustituir= "Arg"

<220>

<221> DUDOSO

<222> (9)..(9)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<220>

<221> VARIANTE

<222> (10)..(10)

<223> /sustituir= "Cys" /sustituir= "Phe" /sustituir= "Gly" /sustituir= "His" /sustituir= "Ile" /sustituir= "Lys" /sustituir= "Leu" /sustituir= "Met" /sustituir= "Arg" /sustituir= "Thr" /sustituir= "Val" /sustituir= "Trp" /sustituir= "Tyr"

<220>

<221> DUDOSO

<222> (12)..(12)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<220>

<221> VARIANTE

<222> (13)..(13)

<223> /sustituir= "Lys" /sustituir= "Arg"

<220>

<221> DUDOSO

<222> (15)..(15)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<220>

<221> VARIANTE

<222> (16)..(16)

<223> /sustituir= "Gly" /sustituir= "Ser"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (17)..(17)

<223> /sustituir= "Glu" /sustituir= "His" /sustituir= "Lys" /sustituir= "Arg"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (19)..(19)

<223> /sustituir= "Cys" /sustituir= "Asp" /sustituir= "Glu" /sustituir= "His" /sustituir= "Lys" /sustituir= "Asn" /sustituir= "Gln" /sustituir= "Arg" /sustituir= "Ser" /sustituir= "Thr"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (20)..(20)

<223> /sustituir= "Glu" /sustituir= "His" /sustituir= "Lys" /sustituir= "Arg"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (21)..(21)

<223> /sustituir= "Cys" /sustituir= "Asp" /sustituir= "Gly" /sustituir= "Asn" /sustituir= "Pro" /sustituir= "Ser" /sustituir= "Thr" /sustituir= "Val"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (21)..(21)

<223> /sustituir= "Cys" /sustituir= "Asp" /sustituir= "Gly" /sustituir= "Asn" /sustituir= "Pro" /sustituir= "Ser" /sustituir= "Thr" /sustituir= "Val"

<220>

<221> DUDOSO

<222> (22)..(31)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<220>

<221> VARIANTE

<222> (32)..(33)

<223> /sustituir= "Cys" /sustituir= "Asp" /sustituir= "Glu" /sustituir= "His" /sustituir= "Lys" /sustituir= "Asn" /sustituir= "Gln" /sustituir= "Arg" /sustituir= "Ser" /sustituir= "Thr"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (34)..(34)

<223> /sustituir= "Glu" /sustituir= "His" /sustituir= "Lys" /sustituir= "Arg"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (35)..(35)

<223> /sustituir= "Leu" /sustituir= "Val"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (36)..(36)

<223> /sustituir= "His" /sustituir= "Trp" /sustituir= "Tyr"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (39)..(39)

<223> /sustituir= "Thr"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (42)..(42)

<223> /sustituir= "Thr"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (43)..(43)

<223> /sustituir= "Cys" /sustituir= "Asp" /sustituir= "Glu" /sustituir= "His" /sustituir= "Lys" /sustituir= "Asn" /sustituir= "Gln" /sustituir= "Arg" /sustituir= "Ser" /sustituir= "Thr"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (44)..(44)

<223> /sustituir= "Glu"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (45)..(45)

<223> /sustituir= "Cys" /sustituir= "Asp" /sustituir= "Glu" /sustituir= "His" /sustituir= "Lys" /sustituir= "Asn" /sustituir= "Gln" /sustituir= "Arg" /sustituir= "Ser" /sustituir= "Thr"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (48)..(48)

<223> /sustituir= "Cys" /sustituir= "Phe" /sustituir= "Gly" /sustituir= "His" /sustituir= "Ile" /sustituir= "Lys" /sustituir= "Leu" /sustituir= "Met" /sustituir= "Arg" /sustituir= "Thr" /sustituir= "Val" /sustituir= "Trp" /sustituir= "Tyr"

<220>

<221>

DUDOSO 5 <222> (52)..(52)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<220>

<221>

VARIANTE 10 <222> (55)..(58)

<223> /sustituir= "Cys" /sustituir= "Phe" /sustituir= "Gly" /sustituir= "His" /sustituir= "Ile" /sustituir= "Lys" /sustituir= "Leu" /sustituir= "Met" /sustituir= "Arg" /sustituir= "Thr" /sustituir= "Val" /sustituir= "Trp" /sustituir= "Tyr"

<220>

15 <221> DUDOSO

<222> (60)..(61)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<220>

20 <221> VARIANTE

<222> (63)..(63)

<223> /sustituir= "Asp" /sustituir= "Glu" /sustituir= "His" /sustituir= "Lys" /sustituir= "Lys" /sustituir= "Asn" Gln" /sustituir= "Arg" /sustituir= "Ser" /sustituir= "Thr"

25 <220>

<221> VARIANTE

<222> (64)..(65)

<223> /sustituir= "Cys" /sustituir= "Phe" /sustituir= "Gly" /sustituir= "His" /sustituir= "Ile" /sustituir= "Lys" /sustituir=

"Leu" /sustituir= "Met" /sustituir= "Arg" /sustituir= "Thr" /sustituir= "Val" /sustituir= "Trp" /sustituir= "Tyr" 30

<220>

<221> VARIANTE

<222> (68)..(68)

<223> /sustituir= "Cys" /sustituir= "Asp" /sustituir= "Gly" /sustituir= "Asn" /sustituir= "Pro" /sustituir= "Ser" 35 /sustituir= "Thr" /sustituir= "Val"

<220>

<221> DUDOSO

<222> (69).. (72) 40 <223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<220>

<221> VARIANTE

<222> (73)..(74)

45 <223> /sustituir= "Cys" /sustituir= "Asp" /sustituir= "Glu" /sustituir= "His" /sustituir= "Lys" /sustituir= "Asn" /sustituir= "Gln" /sustituir= "Arg" /sustituir= "Ser" /sustituir= "Thr"

<400> 340

<210> 341

<211> 72

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> secuencia consenso del dominio AP2 de SEC ID Nº: 2

<400> 341

10

<210> 342 <211>6 <212> ADN <213> Secuencia artificial

15 20 25

<220> <223> DRE element <220> <221> variation <222> (1)..(1) <223> /sustituir= "a" <220> <221> variation <222> (2)..(2) <223> /sustituir= "t" <400> 342 gccgac 6

30

<210> 343 <211> 29 <212> PRT <213> Secuencia artificial

35

<220> <223> motivo CMIII-1

<400> 343

40 <210> 344

<211> 32

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

45 <220>

<223> motivo CMIII-2

<400> 344

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> motivo CMIII-3

<400> 345

15 <210> 346

<211> 26

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> motivo CMIII-4

<220>

<221> DUDOSO 25 <222> (18)..(18)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<220>

<221> DUDOSO

<222> (21)..(21)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<400> 346

<210> 347

<211> 16

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> region I del motivo CMIII-3

45 <220>

<221> VARIANTE

<222> (3)..(3)

<223> /sustituir= "Arg"

<220>

<221> DUDOSO

<222> (8)..(8)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<220>

<221> DUDOSO

<222> (11)..(11)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<400> 347

<210> 348 <211>5

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> motivo CMIII-3 region II

<400> 348

<210> 349 <211>8

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> motivo CMIV-1

<220>

<221> VARIANTE

<222> (1)..(1)

<223> /sustituir= "Arg"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (7)..(7)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<400> 349

<210> 350 <211>41

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> motivo CMIV-2

<400> 350

<210> 351 <211> 756

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 351

<210> 352 10 <211> 251

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 352 15

<210> 353 <211> 741

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 353

<210> 354 10 <211> 246

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 354 15

<210> 355

<211> 729

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 355

10 <210> 356

<211> 182

<212> PRT

<213> Oryza sativa

15 <400> 356

<210> 357 20 <211> 904

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 357 25

<210> 358

<211> 253

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 358

<210> 359

<211> 897

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 359

<210> 360

<211> 218

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 360

<210> 361

<211> 1272

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 361

5 <210> 362

<211> 224

<212> PRT

<213> Oryza sativa

10 <400> 362

<210> 363

<211> 764

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 363

<210> 364

<211> 214

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 364 <210> 365

<211> 862

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 365

<210> 366

<211> 218

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 366

<210> 367

<211> 699

<212> ADN

<213> Zea mays

<400> 367

<210> 368

<211> 232

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 368

<210> 369

<211> 696

<212> ADN

<213> Zea mays

<400> 369

<210> 370

<211> 231

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 370

<210> 371

<211> 1085

<212> ADN

<213> Zea mays

<400> 371

<210> 372

<211> 267

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 372

<210> 373

<211> 846

<212> ADN

<213> Zea mays

<400> 373

<210> 374

<211> 281

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 374

<210> 375

<211> 1455

<212> ADN

<213> Zea mays

<400> 375

<210> 376

<211> 246

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 376

<210> 377

<211> 800

<212> ADN

<213> Triticum aestivum

<400> 377

<210> 378

<211> 212

<212> PRT

<213> Triticum aestivum

<400> 378

<210> 379 10 <211> 945

<212> ADN

<213> Triticum aestivum

<400> 379 15

<210> 380

<211> 225

<212> PRT

<213> Triticum aestivum

<400> 380

<210> 381

<211> 1971

<212> ADN

<213> Triticum monococcum

<400> 381

<210> 382

<211> 246

<212> PRT

<213> Triticum monococcum

<400> 382

<210> 383

<211> 639

<212> ADN

<213> Triticum monococcum

<400> 383

<210> 384

<211> 212

<212> PRT

<213> Triticum monococcum

<400> 384

<210> 385

<211> 2148

<212> ADN

<213> Triticum monococcum

<400> 385

<210> 386

<211> 210

<212> PRT

<213> Triticum monococcum

<400> 386

<210> 387

<211> 912

<212> ADN

<213> Gossypium hirsutum

<400> 387

<210> 388

<211> 221

<212> PRT

<213> Gossypium hirsutum

<400> 388

<210> 389

<211> 1064

<212> ADN

<213> Gossypium hirsutum

<400> 389

<210> 390

<211> 226

<212> PRT

<213> Gossypium hirsutum

<400> 390

5 <210> 391

<211> 1102

<212> ADN

<213> Gossypium hirsutum

10 <400> 391

<210> 392

<211> 216

<212> PRT

<213> Gossypium hirsutum

<400> 392

10 <210> 393

<211> 888

<212> ADN

<213> Gossypium hirsutum

15 <400> 393

<210> 394

<211> 216

<212> PRT

<213> Gossypium hirsutum

<400> 394

10 <210> 395

<211> 1049

<212> ADN

<213> Gossypium hirsutum

15 <400> 395

<210> 396

<211> 216

<212> PRT

<213> Gossypium hirsutum

<400> 396

<210> 397

<211> 480

<212> ADN

<213> Glycine max 15

<400> 397

20 <210> 398

<211> 159

<212> PRT

<213> Glycine max

25 <400> 398

<210> 399

<211> 1026

<212> ADN

<213> Glycine max

<400> 399

<210> 400

<211> 211

<212> PRT

<213> Glycine max

<400> 400 <210> 401

<211> 1077

<212> ADN

<213> Glycine max

<400> 401

<210> 402

<211> 312

<212> PRT

<213> Glycine max

<400> 402

<212> ADN

<213> Glycine max

<400>

403 10

<210> 404

<211> 198

<212> PRT

<213> Glycine max

<400> 404

<210> 405

<211> 923

<212> ADN

<213> Glycine soja

<400> 405

<210> 406

<211> 234

<212> PRT

<213> Glycine soja

<400> 406

<210> 407

<211> 1185

<212> ADN

<213> Brassica napus

<400> 407

<212> PRT

<213> Brassica napus

<400>

408 10

<210> 409

<211> 945

<212> ADN

<213> Brassica napus

<400> 409

<210> 410

<211> 215

<212> PRT

<213> Brassica napus 15

<220>

<221> DUDOSO

<222> (185)..(185)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural 20

<400> 410

<210> 411

<211> 1061

<212> ADN

<213> Brassica napus

<400> 411

<210> 412

<211> 214

<212> PRT

<213> Brassica napus

<220>

<221> DUDOSO

<222> (54)..(54)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<400> 412

<210> 413

<211> 879

<212> ADN

<213> Brassica napus

<400> 413

<210> 414

<211> 214 5 <212> PRT

<213> Brassica napus

<220>

<221>

DUDOSO 10 <222> (200)..(200)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<220>

<221>

DUDOSO 15 <222> (208)..(208)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<400> 414

<210> 415

<211> 753

<212> ADN

<213> Brassica oleracea

<400> 415

<210> 416

<211> 250

<212> PRT

<213> Brassica oleracea

<400> 416

Claims (9)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un procedimiento para aumentar el rendimiento en plantas en condiciones de deficiencia de nitrógeno respecto a las plantas de control, que comprende introducir y expresar en una planta un ácido nucleico que codifica un polipéptido de tipo NAP-1, en el que el polipéptido de tipo NAP-1 comprende un dominio de NAP, en el que dicho polipéptido de tipo NAP-1 tiene una identidad de secuencia de al menos 80% o más con el polipéptido de tipo NAP-1 representado por la SEC ID Nº 2 y, además, en el que dicho polipéptido de tipo NAP-1 tiene sustancialmente la misma actividad biológica y funcional que la SEC ID Nº 2.

2. 2.

   Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho ácido nucleico que codifica un polipéptido de tipo NAP-1 está representado por uno cualquier del ácido nucleico de las SEC ID Nº dadas en la Tabla A o una porción del mismo, o una secuencia capaz de hibridar con uno cualquiera de los ácidos nucleicos de SEC ID Nº dadas en la tabla A.

3. 3.

   Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en el que dicha secuencia de ácido nucleico codifica un ortólogo o parálogo de cualquiera de las SEC lD Nº presentadas en la Tabla A.

4. 4.

   El procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que dicho aumento del rendimiento es aumento de la biomasa y/o aumento del rendimiento de semillas.

5. 5.

   Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, en el que dicho aumento del rendimiento comprende al menos un incremento del peso total de las semillas y/o un incremento del número de semillas llenas.

6. 6.

   Procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que dicho ácido nucleico esta unido operablemente a un promotor constitutivo, preferiblemente a un promotor GOS2.

7. 7.

   Procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que dicho ácido nucleico que codifica un polipéptido de tipo NAP1 es de origen vegetal, preferiblemente de una planta dicotiledónea, adicionalmente preferiblemente de la familia Brassicaceae, más preferentemente del género Arabidopsis, lo más preferentemente del género Arabidopsis thaliana.

8. 8.

   Uso de una construcción para aumentar el rendimiento en plantas cultivadas en condiciones de deficiencia de nitrógeno con respecto a las plantas de control, en el que dicha construcción comprende

   (a)

   un ácido nucleico que codifica una polipéptido de tipo NAP1 como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3;

   (b)

   una o más secuencias de control capaces de dirigir la expresión de la secuencia de ácido nucleico de (a); y opcionalmente

   (c)

   una secuencia de terminación de la transcripción,

   y en el que una de dichas secuencias control es un promotor constitutivo, preferentemente un promotor GOS2.
9. 9. Uso de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de tipo NAP1 en un procedimiento para aumentar el rendimiento en plantas cultivadas en condiciones de deficiencia de nitrógeno respecto a las plantas de control, en el que dicho polipéptido de tipo NAP1 es como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

   FIGURA 3

   FIGURA 3 (continuación)

   FIGURA 3 (continuación) FIGURA 3 (continuación) FIGURA 3 (continuación)

   FIGURA 3 (continuación)

   FIGURA 3 (continuación)

   FIGURA 14

   FIGURA 24

   SEC ID Nº: 377, Triticum aestivum -ADN

   SEC ID Nº: 378, Triticum aestivum -proteína

   SEC ID Nº: 379, Triticum aestivum -ADN

   SEC ID Nº: 380, Tritictam aestivum -proteína