ES2330495B1 - Inhibidores de la enzima o6-alquilguanina-adn-metil-transferasa para el tratamiento del cancer. - Google Patents

Abstract

Inhibidores de la enzima O^{6}-alquilguanina-ADN-metil-
transferasa para el tratamiento del cáncer.

La presente invención se refiere al uso de compuesto derivados de piperadinil-metil-tetrazol-quinolinona como inhibidores de la acción reparadora de la ADN realizada por la enzima O^{6}-alquilguanina-ADN-alquiltransferasa y con composiciones farmacéuticas que los contienen, para la preparación de medicamentos coadyuvantes de la terapia antitumoral basada en agentes alquilantes.

Description

Inhibidores de la enzima O^{6}-alquilguanina-ADN-metil-transferasa para el tratamiento del cáncer.

Sector de la técnica

La presente invención se enmarca en el campo de la química médica, y más concretamente en el de compuestos inhibidores de enzimas para uso terapéutico aplicables en particular como adyuvantes del tratamiento del cáncer por quimioterapia, al disminuir los efectos negativos de dicha terapia.

Estado de la técnica

El tratamiento de la mayor parte de los tumores se basa en una aproximación múltiple que incluye la resección quirúrgica y la radioterapia, dirigidas al tumor principal, y la quimioterapia, que actúa en todo el organismo para prevenir y combatir la aparición de tumores en otras localizaciones (metástasis). Los principales compuestos usados en quimioterapia son los agentes alquilantes (ciclofosfamida, mecloretamina), antimetabolitos (6-mercaptopurina, 5-fluoruracilo), alcaloides derivados de plantas (vinblastina, vincristina), y diversas moléculas biológicas (antibióticos antitumorales, enzimas, hormonas, etc.).

Las nitrosoureas y los compuestos relacionados (procarbazina, estreptozina, temozolomida) son similares a los agentes alquilantes y su efectividad terapéutica se atribuye, en buena parte, al potencial citotóxico de las lesiones que inducen en el ADN [1]. Los tejidos tumorales, dada la mayor tasa de proliferación de sus células, sintetizan más ADN, por lo que son los más afectados por estas lesiones. En particular dichos compuestos provocan metilaciones del oxigeno en posición 6 de las moléculas de guanina del ADN, originando O^{6}-metilguanina (O^{6}-mG). La metilación de la guanina en esta posición provoca que se aparee con una timina (T) en vez de con una citosina (C), y también puede provocar entrecruzamientos G-C por lo que la replicación de la cadena con O^{6}-mG origina alteraciones en la nueva cadena de ADN que finalmente producen la inhibición tanto de la replicación como de la transcripción del ADN, conduciendo en ambos casos a muerte celular por apoptosis [1].

Sin embargo las células presentan mecanismos para reparar las lesiones de su ADN producidas en condiciones fisiológicas normales, ya sea por factores medioambientales o por metabolitos generados internamente. En particular la resistencia a los compuestos alquilantes de O^{6} está mediada por la enzima O^{6}-alquilguanina-ADN-alquiltransferasa (la enzima en humanos es conocida como hAGT, del inglés "human O^{6}-alkylguanine-DNA alkyltransferase"), que transfiere el grupo metilo de la O^{6}-mG a un aminoácido de su centro activo (un cisteína en posición 145), restaurando así la guanina original [1, 2]. La síntesis de la hAGT se encuentra aumentada en la mayoría de las células tumorales, por lo que a menudo los tumores son resistentes a la quimioterapia con agentes alquilantes [3, 4]. Así por ejemplo, la acción de la hAGT es la causa principal de la resistencia a quimioterapia en el glioblastoma, un tipo de tumor maligno que constituye aproximadamente el 50% de los tumores cerebrales.

Se ha estudiado por tanto el uso de inhibidores de la hAGT como coadyuvantes para los tratamientos de quimioterapia, ya que al potenciarse el efecto de los agentes alquilantes podría reducirse su dosis terapéutica, lo que a su vez supondría una disminución de sus efectos secundarios. La O^{6}-benzilguanina (O^{6}-bG) y sus análogos inactivan hAGT in vitro e in vivo [2], pero aunque se ha demostrado en ensayos clínicos que la O^{6}-BG mejora la eficacia de agentes quimio-terapéuticos [5], existen limitaciones considerables para su uso terapéutico: su toxicidad sobre la mielina de las células nerviosas, su escasa solubilidad en agua y su rápida degradación en el plasma celular [6]. Además, la hAGT tiene más afinidad por la O^{6}-mG que por la O^{6}-bG, por lo que se une preferentemente al ADN que presente O^{6}-mG, de modo que su actividad reparadora está más favorecida que la inhibición por O^{6}-bG.

Algunos estudios recientes han mostrado que los oligodesoxirribonucleótidos que contienen O^{6}-bG inactivan más eficazmente a la hAGT [7]. En concreto, se ha demostrado el potencial inhibidor in vitro de moléculas de 11 desoxirribonucleótidos que contienen O^{6}-bG modificadas con enlaces metilfosfonato terminales para protegerlas de la degradación por nucleasas. Sin embargo, en modelos celulares el potencial inhibidor de la hAGT por estas cadenas de desoxirribonucleótidos se redujo en una escala de unas 1000 veces en comparación a lo observado in vitro, sugiriendo que la incorporación de estas moléculas por las células es un factor limitante de su acción terapéutica.

Así pues, los inhibidores de la función reparadora de ADN de la hAGT descritos hasta ahora no son suficientemente efectivos. Los autores de la presente invención aplicaron por tanto la metodología del diseño de fármacos basado en la estructura tridimensional de las dianas terapéuticas para solventar este problema técnico. Para ello analizaron la estructura de la hAGT [8] y se fundamentaron en la hipótesis de que la unión del ADN no comporta un cambio conformacional significativo en esta enzima, al igual que se ha encontrado para la proteína Ada (que también repara alquilaciones del ADN). Esta hipótesis encaja asimismo con el mecanismo de inversión de la base alquilada que se plantea para este tipo de enzimas [9].

La aplicación de esta metodología, en el punto de confluencia entre la Química, la Biología y la Bioinformática ha permitido identificar dos familias de compuestos con gran afinidad por el centro activo de la proteína hAGT y que poseen la capacidad de inhibir su actividad biológica de forma relevante.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se relaciona con el uso de derivados de piperadinil-metil-tetrazol-quinolinona como inhibidores de la acción reparadora del ADN realizada por la enzima O^{6}-alquilguanina-ADN-alquiltransferasa y con composiciones farmacéuticas que los contienen, para la preparación de medicamentos coadyuvantes de la terapia antitumoral basada en agentes alquilantes.

El procedimiento para identificar familias de dichos compuestos se inició con el cribado virtual de la base de datos de compuestos químicos (quimioteca) ZINC [10], que contiene más de dos millones de compuestos. En dicho cribado se buscaron candidatos a interaccionar con el centro activo de la hAGT, particularmente compuestos que encajaran en el surco hidrofóbico que presenta la superficie de dicho centro activo y que está definido por los aminoácidos Metionina 134, Prolina 140 y el "lazo" del centro activo (comprendido entre los aminoácidos Valina 155 y Glicina 160, inclusive). La interacción o encaje molecular ("docking") de los compuestos de la quimioteca en dicho surco se analizó virtualmente según el proceso esquematizado en la Figura 1.

La estructura inicial de la hAGT se obtuvo de la base de datos PDB (RCSB Protein Data Bank, disponible en www.rcsb.org/pdb/ [11]). De dicha base se tomó un modelo de la proteína, del que se descartaron las moléculas de agua y ADN que aparecían interaccionando con la misma. A este modelo se le añadieron los átomos de hidrógeno con el programa protonate del paquete AMBER [12], y se le asignaron cargas y radios atómicos a todos los átomos de la proteína utilizando el mismo paquete. A continuación, se caracterizó energéticamente el centro activo mediante la combinación de tres programas propios desarrollados por los inventores:

\sqbulletCGRID [13], genera una malla tridimensional sobre el centro activo de la proteína y permite calcular tanto las interacciones electrostáticas como las de tipo van der Waals entre cada uno de los átomos de centro activo de la proteína con cada uno de los átomos principales (carbono, nitrógeno, oxígeno, azufre, hidrógeno, fósforo, flúor, cloro, bromo, yodo) de las moléculas de la quimioteca utilizada. Los bordes de la malla tridimensional para la hAGT se situaron a un mínimo de distancia de 5 \ring{A} de cualquier átomo del nucleótido metilado (tal como la O^{6}-mG) sobre el que actuará el centro activo de la enzima, y el espaciado entre cada punto de la malla fue de 0.5 \ring{A}.

\sqbulletCDOCK [13], un programa de análisis del encaje molecular o docking cuya función de asignación de valores se basa en las mallas calculadas con CGRID. Se utilizaron 3 sondas (moléculas prototipo): benceno para detectar zonas hidrofóbicas, y agua y metanol para detectar zonas susceptibles de formar puentes de hidrógeno.

\sqbulletGAGA [14], que comprime la información obtenida por CDOCK para una sonda en una serie de funciones gaussianas que actúan como puntos farmacofóricos.

La "preparación" de los compuestos de la quimioteca ZINC para su cribado basado en el posible encaje molecular con el centro activo de hAGT se inició con el cálculo de las coordenadas tridimensionales de todos los compuestos de esta quimioteca mediante el programa CORINA [Corina Molecular Networks, Erlangen, Alemania]. Este programa permite además generar todas las combinaciones tridimensionales de un determinado compuesto de la quimioteca a través de las diferentes conformaciones de sus anillos y estereoisómeros. Con las coordenadas tridimensionales se realizó un análisis conformacional de todos estas combinaciones mediante el programa ALFA, desarrollado por los autores de la presente invención. El análisis permitió obtener las conformaciones más estables energéticamente de cada compuesto, asignándoles a su vez radios tipo AMBER a todos sus átomos [12]. Por último, se calcularon las cargas parciales de cada átomo mediante el paquete MOPAC [15]. Este cálculo se realizó para cada una de las estructuras tridimensionales obtenidas con el programa CORINA. Toda la información que se fue generando (estructuras tridimensionales de las conformaciones con sus radios y cargas) se almacenó en una base de datos relacional en MySQL [disponible en www.mysql.com]. En total se obtuvo información de 2.288.455 compuestos en formato bidimensional (SMILES, Daylight Chemical Information Systems, Inc.), que fue procesada e incluida en la base de datos relacional.

Las posiciones más probables de estos compuestos en su encaje con el centro activo se obtuvieron después de la utilización de dos programas de filtros. El programa DOCK [16] se utilizó para asignar a cada geometría centro activo - compuesto un valor (ZScore) en función de los contactos entre ambas moléculas. Se seleccionaron aquellos compuestos que presentaban geometrías con valores de ZScore iguales o superiores a 5 para ser analizados exhaustivamente con el programa CDOCK [17]. De los 976 millones de conformaciones de los compuestos de ZINC se seleccionaron 4.787 para su cribado exhaustivo con CDOCK. Todos los resultados obtenidos, tanto del filtrado inicial como del filtrado exhaustivo se almacenaron en la base de datos relacional.

Para la identificación final de compuestos con potencial inhibidor de la hAGT se llevó a cabo una actualización de los valores energéticos de los resultados obtenidos con CDOCK incorporando una componente coulómbica más refinada y los términos necesarios para la desolvatación del centro activo y del compuesto (puesto que ambas moléculas inicialmente se encuentran en solución en la célula, deben dejar de reaccionar con el solvente en las regiones en las que interaccionan entre sí). La actualización se llevó a cabo mediante la resolución de la ecuación de Poisson implementada en el paquete DelPhi (http://wiki.c2b2.columbia.edu/honiglab_public/index.php/Software). También se añadió la componente no polar, calculada como un valor proporcional al área de superficie accesible al solvente (SASA) [18]. Así pues, fue posible realizar una reclasificación de los resultados en función de la suma de las energías de van der Waals, coulómbica, desolvatación del centro activo y del compuesto potencialmente inhibidor y componente no polar. A partir de esta nueva clasificación se inspeccionaron visualmente los resultados de los compuestos que presentaban los 100 mejores resultados y se seleccionaron 21 compuestos dentro de dicho grupo que mostraban la mayor afinidad frente al centro activo de la hAGT.

Dichos compuestos demostraron capacidad inhibidora de la hAGT in vitro e in vivo, resultando en el último caso en una mayor eficacia de los agentes alquilantes para controlar la proliferación celular (Ejemplo 2). Los compuestos identificados pueden agruparse según su estructura química: compuestos con la fórmula I (derivados de piperadinil-metil-tetrazol-quinolinona), en adelante "compuestos de la invención".

Así, un primer aspecto de la presente invención se refiere al uso de un compuesto capaz de inhibir la acción de la O^{6}-alquilguanina-ADN-alquiltransferasa caracterizado porque es un derivado de piperadinil-metil-tetrazol-quinolona con la fórmula general (en adelante fórmula I):

1

en la que:

- X es un átomo de carbono (C) o nitrógeno (N), indistintamente;

- R^{1}, R^{2}, R^{3} y R^{4} son iguales o diferentes y están independientemente seleccionados del grupo constituido por: hidrógeno, alquilo lineal, alquilo ramificado, cicloalquilmetil, cicloalquiletil, aminocarbonilalquil, alquiloxi lineal, alquiloxi ramificado, furilmetil, imidazolilmetil, imidazoliletil, imidazolilpropil, R^{7}, metil-R^{7}, etil-R^{7}, propil-R^{7}, metoxi-R^{7}, etoxi-R^{7}, propoxi-R^{7}, donde R^{7} es un arilo en el que cada una de sus cinco posiciones restantes está sustituida por un grupo independientemente seleccionado entre hidrógeno, fluor, cloro, bromo, trifluorometilo, hidroxi, alcoxi (alquilóxido de 1 a 4 átomos de C), alquilcarbonil, alquilamino, y sulfonilamino.

En una realización particular de la presente invención X es nitrógeno, R^{1} es 2,5-dimetilfenil, R^{2} es hidrógeno, R^{3} es metoxi y R^{4} es fenil-metil, originando la 3-[[4-(2,5-dimetilfenil)-1-piperazinil][1-(fenilmetil)-1H-tetrazol-5-il]metil]-6-metoxi-2(1H)-quinolinona (en adelante, compuesto Ia o Pibetina, según denominación dada por los inventores), con la fórmula:

2

En otra realización particular de la presente invención, X es carbono, R^{1} es fenil-metil, R^{2} es metil, R^{3} es hidrógeno y R^{4} es fenil-metil, originando la 3-[(4-bencil-1-piperadinil)-(1-bencil-1H-5-tetrazolil)]metil-7-metil-2(1H)quinolino-
na (en adelante compuesto Ib), con la fórmula:

3

Los modelos tridimensionales de unión entre los compuestos de la invención descritos en las realizaciones particulares (compuestos Ia - o Pibetina- y Ib) con el centro activo de la hAGT se muestran en la Figura 4. El análisis de los efectos de dichos compuestos sobre la hAGT demostró que los mismos son capaces de inhibir competitivamente la actividad reparadora de esta enzima en presencia de su sustrato natural, la cadena de ADN metilada.

Asimismo, según se muestra en el Ejemplo 2, el tratamiento de cultivos de células derivadas de carcinomas con dichos compuestos potenció la acción terapeútica de la carmustina (1,3-Bis(2-cloroetil)1-nitrosourea), un agente alquilante empleado frecuentemente para combatir el mieloma múltiple, tumores del cerebro, enfermedad de Hodgkin's, y linfomas no Hodgkin's, mostrando el potencial terapéutico del uso de los compuestos de la invención como co-adyuvantes de agentes quimio-terapéuticos en el tratamiento de tumores.

Un segundo aspecto de la presente invención incluye el uso de isómeros o mezclas de isómeros de los compuestos de la invención, incluyendo los isómeros de los compuestos Ia y Ib descritos en la presente invención, como coadyuvantes de agentes quimio-terapéuticos. Dichos isómeros comprenden:

- isómeros en disposición Z o E definidos por la posición de los sustituyentes respecto a los enlaces múltiples que presentan los compuestos,

- isómeros ópticos o enantiómeros, originados por la presencia de centros quirales (átomos unidos a cuatro sustituyentes diferentes) que provocan la diferenciación entre enantiómeros respecto a su actividad óptica (rotación de la luz polarizada al pasar a través de una solución del enantiómero),

- diastereoisómeros, isómeros con al menos dos centros quirales, estando los sustituyentes de uno de dichos centros dispuestos igual en ambos diastereoisómeros y los sustituyentes de al menos otro de los centros dispuestos de forma distinta entre ambos.

Un tercer aspecto de la presente invención se refiere al uso de profármacos de los compuestos de la invención como coadyuvantes de agentes quimio-terapéuticos. El término "profármaco", tal como aquí se utiliza comprende cualquier compuesto derivado de fórmula I tal y como se definen en la presente invención (por ejemplo, ésteres, carbamatos, amidas etc.), que, cuando se administra a un individuo, es capaz de proporcionarle, directa o indirectamente, uno o varios de los compuestos de la invención.

En una realización preferente de la presente invención, dicho profármaco es un compuesto que, en comparación con los compuestos de la invención aumenta su biodisponibilidad cuando se administra a un individuo, o que potencia la liberación de los compuestos de la invención en un compartimiento biológico (por ejemplo, en el cerebro o el tejido particular afectado por el tumor o la metástasis). La preparación de dicho profármaco puede llevarse a cabo mediante métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia, que pueden encontrarse por ejemplo en "Textbook of Drug Design and Discovery" (Krogsgaard-Larsen P, Liljefors T y Madsen U; editorial Taylor and Francis, 2002, 3ª Edición).

Un cuarto aspecto de la presente invención se refiere al uso de las formas cristalinas de los compuestos de la invención en estado libre o como solvatos, como coadyuvantes de agentes quimio-terapéuticos. El término "solvato", tal como aquí se utiliza, incluye tanto solvatos que puedan ser utilizados en la composición de un medicamento, como solvatos útiles en la preparación de dicho medicamento. Los solvatos pueden obtenerse por métodos convencionales de solvatación bien conocidos por los técnicos en la materia.

Un quinto aspecto de la presente invención se refiere al uso de sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos de la invención como coadyuvantes de agentes quimio-terapéuticos. Las sales de los compuestos de la invención que no sean farmacéuticamente aceptables pueden ser útiles asimismo en la preparación de fármacos, por lo que todas las sales de los compuestos de la invención, sean o no farmacéuticamente aceptables están incluidas en el ámbito de la presente invención.

Un sexto aspecto de la presente invención se refiere al uso como coadyuvantes de agentes quimio-terapéuticos, de compuestos de la invención que contengan uno o más átomos isotópicamente enriquecidos. Por ejemplo, compuestos con una de fórmula I en las que uno o varios átomos de hidrógeno han sido sustituidos por átomos de deuterio o de tritio, uno o varios átomos de de carbono han sido sustituidos por átomos de ^{13}C o ^{14}C o uno o varios átomos de nitrógeno han sido sustituidos por ^{15}N.

En un séptimo aspecto, la presente invención se relaciona con composiciones farmacéuticas con una cantidad terapéuticamente efectiva de uno o más compuestos de la invención, sus isómeros, profármacos, solvatos o sales, tanto presentes en forma esencialmente pura como en mezcla con agentes auxiliares, aditivos o portadores farmacéuticamente aceptables y, eventualmente, otros agentes terapéuticos. Los agentes auxiliares, aditivos o portadores deben ser compatibles con los demás componentes de la composición y no causar perjuicios a sus receptores. Las composiciones farmacéuticas incluyen aquéllas que son adecuadas para administración oral, rectal, nasal, tópica (incluidas la bucal, sublingual y epicutánea), o parenteral (incluidas la subcutánea, intramuscular, intravenosa e intradérmica). Los métodos para la preparación de dichas composiciones así como los agentes auxiliares, aditivos o portadores (diluyentes, solventes, disgregantes, emulgentes, absorbentes, antioxidantes, lubricantes, colorantes, edulcorantes, humectantes, etc) son bien conocidos en la técnica de la farmacia, y ejemplos de ambos pueden encontrarse en "Textbook of Drug Design and Discovery" (Krogsgaard-Larsen P, Liljefors T y Madsen U; editorial Taylor and Francis, 2002, 3ª Edición).

Los compuestos de la invención, sus isómeros, profármacos, solvatos o sales, así como las composiciones farmacéuticas que los contienen pueden ser utilizados junto con otros fármacos para proporcionar terapia de combinación, ya sea formando parte de la misma composición farmacéutica o como composiciones separadas, administradas simultánea o no simultáneamente.

En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad de uno o más compuestos de la invención, sus isómeros, profármacos, solvatos o sales, capaz de desarrollar en el receptor el efecto terapéutico mediado por la inhibición de la actividad reparadora de ADN de la hAGT. Dicha cantidad o dosis vendrá determinada, entre otras causas, por las características propias de los compuestos y sus isómeros, profármacos, solvatos o sales, así como por la composición farmacéutica que los contengan, la vía y frecuencia de administración, y la edad y condición del sujeto individual al que se le administra.

Una realización particular de la presente invención lo constituye el uso de un compuesto de la invención de fórmula I, sus isómeros, profármacos, solvatos o sales, o sus mezclas, en la elaboración de un medicamento o composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer, incluyendo, pero no limitado, al tratamiento de carcinomas incluyendo los de próstata, mama, pulmón, páncreas, colorrectal, gástrico, esofágico, laríngeo, tiroideo, hepático, de vejiga urinaria, renal, uterino, y de cérvix, cualquier tipo de sarcomas incluyendo osteosarcomas, sarcomas de partes blandas y angiosarcomas, cualquier tipo de tumor hematopoyético incluyendo leucemias y linfomas, cualquier tipo de tumor del sistema nervioso incluyendo neuroblastomas, glioblastomas y astrocitomas, cualquier cáncer dermatológico incluyendo melanomas, carcinomas de células basales y carcinomas de células escamosas. En una realización preferente de la presente invención, dicho uso se lleva a cabo en combinación con otros tratamientos antitumorales, sean éstos mediante la administración de medicamentos, sustancias radiactivas, radioterapia, quimioterapia, cirugía o cualquier procedimiento médico.

Descripción del contenido de las figuras

Figura 1. Metodologías para la identificación de pequeñas moléculas inhibidoras de la actividad de la enzima O^{6}-alquilguanina-ADN-metil-transferasa. El proceso se inició por dos vías paralelas, consistentes en el análisis virtual, mediante medios informáticos, de la estructura tridimensional, conformaciones más estables energéticamente y distribución de cargas, radios y cargas de los átomos que se encuentran en la superficie de las moléculas de una quimioteca de compuestos (ZINC) y del centro activo de la enzima. Los datos resultantes de dicho análisis para los más de tres millones de compuestos de la quimioteca se almacenaron en una base de datos (BBDD) relacional en entorno MySQL. Las posiciones más probables de los compuestos en su encaje con el centro activo de la enzima se obtuvieron asignando a cada par geométrico centro activo - compuesto un valor (ZScore) en función de los contactos entre ambas moléculas, calculado mediante un programa informático (DOCK). Las parejas geométricas con valores de ZScore superiores a 5 se re-analizaron con el programa CDOCK, diseñado específicamente por los autores de la invención. Posteriormente se llevo a cabo una reclasificación de los resultados en función de la suma de las energías de van der Waals, componente coulómbica, desolvataciones del centro activo y del compuesto potencialmente inhibidor (pérdida de interacción con moléculas del disolvente para que puedan interaccionar entre sí) y componente no polar. A partir de esta nueva clasificación se inspeccionaron visualmente los resultados y se seleccionaron 21 compuestos que mostraban la mayor probabilidad de interacción estable con el centro activo de la hAGT.

Figura 2. Fórmulas generales de los compuestos de la invención. Se muestran las fórmulas generales de los compuestos de la invención (fórmula I).

Figura 3. Fórmulas de realizaciones específicas de compuestos de la invención. Se muestran las fórmulas químicas de cuatro compuestos que constituyen realizaciones específicas de la invención: dos compuestos que tienen la fórmula general I. Compuesto Ia, 3-[[4-(2,5-dimetilfenil)-1-piperazinil][1-(fenilmetil)-1H-tetrazol-5-il]metil]-6-metoxi-2(1H)-quinolinona (denominado Pibetina por los inventores); compuesto Ib, 3-[(4-bencil-1-piperadinil)-(1-bencil-1H-5-tetrazolil)]metil-7-metil-2(1H)quinolinona.

Figura 4. Modelos estructurales del encaje molecular entre compuestos de la invención y el centro activo de la enzima hAGT. Las ilustraciones muestran representaciones de la superficie de hAGT, junto a modelos de varillas de compuestos Ia y Ib de la invención, ilustrando el encaje óptimo entre el centro activo de la hAGT y dichos compuestos según resultados obtenidos mediante el programa CDOCK.

Figura 5. Inhibición por los compuestos Ia, Ib de la actividad reparadora de ADN de la enzima hAGT in vitro . La actividad remanente de la hAGT tras pre-incubarse con distintas concentraciones en el intervalo de 0 a 100 \muM de los compuestos de la invención se representa como el porcentaje de dicha actividad durante la posterior incubación de la mezcla utilizando [^{3}H]-metil-ADN como sustrato, respecto a la actividad medida en el control positivo. Como control negativo de la reacción se utilizó proteína hAGT mutante (C145S, representado por un círculo, \bigcirc), y como control positivo se sustituyeron los compuestos por la misma concentración del disolvente utilizado para su disolución, el DMSO (representado por un cuadrado negro, \ding{110}).

La figura superior muestra la actividad remanente de la hAGT frente a las distintas concentraciones del compuesto Ia (rombo negro, \ding{117}) y Ib (rombo gris, 4).

Figura 6. Inhibición por el compuesto Ia de la actividad reparadora de ADN de la enzima hAGT in vivo . Se muestra el efecto de distintos compuestos de la invención en concentraciones en el intervalo de 0 a 100 \muM sobre la formación de colonias de células tumorales de adenocarcinoma colorectal humano sin tratar con el agente quimioterapeútico carmustina (columnas en negro) o tratadas con una concentración de 40 \muM de dicho agente (columnas en gris). El número de colonias se representa como porcentaje de las mismas respecto al número observado en el control negativo: células incubadas con el medio utilizado para disolver los distintos compuestos de la invención (concentración = 0 \muM) y no tratadas con carmustina (columnas en negro en el extremo izquierdo de todas las gráficas).

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Ejemplos de modos de realización de la invención

Ejemplo 1

Inhibición de la actividad reparadora de ADN de la hAGT in vitro por los compuestos Ia y Ib

El análisis computacional descrito en la presente invención permitió identificar dos compuestos particulares para la fórmula general I (compuestos la y Ib) que encajaban con buena afinidad en el centro activo de la enzima hAGT (veáse la Figura 4) y por tanto podían interferir competitivamente con la interacción entre dicha enzima y su sustrato, el ADN metilado. Para demostrarlo experimentalmente, se analizó la capacidad de dichos compuestos de inhibir la actividad reparadora de ADN de la enzima hAGT mediante un ensayo in vitro utilizando hAGT sintetizada en cultivos de E. coli recombinantes. Como control negativo en dicho ensayos se utilizó hAGT de un mutante, el hAGT-\DeltaC177-C145S (en adelante, hAGT-C145S) donde la cisteína 145 responsable de la actividad reparadora de esta enzima es sustituida por una serina, provocando la pérdida de su actividad.

Síntesis y purificación de hAGT y hAGT-C145S. Se transformaron células de E. coli con vectores derivados de los plásmidos pet2l y pet28, incluyendo en el primer caso una secuencia de la hAGT (plásmido pet21-hAGT) y en el segundo la secuencia mutante (originando el vector pet28-hAGT-\DeltaC177-C145S). Se seleccionaron las bacterias transformadas mediante crecimiento en medio LB-agar con ampicilina (100 \mug/ml) para seleccionar las colonias bacterianas conteniendo el vector pet21-hAGT o con kanamicina (50 \mug/ml) para seleccionar aquellas conteniendo el vector pet28-hAGT-T-\DeltaC177-C145S. Se transfirieron colonias individuales a 0,6 litros de medio LB, conteniendo el antibiótico correspondiente a las mismas concentraciones antes indicadas y se incubaron en agitación a 37ºC durante 16 h. A continuación se realizaron diluciones de 150 mL de dicho cultivo en 1,5 litros de LB conteniendo el antibiótico correspondiente, pero a una concentración dos veces menor que la inicial. Estas diluciones de los cultivos se incubaron de nuevo en agitación a 37ºC hasta que alcanzaron la fase de crecimiento exponencial (D.O._{600 \ nm} \sim 0,6), momento en que la temperatura se redujo a 30ºC. Cuando se estabilizó esta temperatura para todo el cultivo se le añadió 1 mM de isopropil \alpha-D-tiogalactopiranósido (Calbiochem A) para inducir la expresión de la hATG. Tras 4 horas de incubación se centrifugaron los cultivos durante 15 min, resuspendiendo los sedimentos en una solución tampón de 50 mM Tris pH=8,0 y 20% sacarosa. Estas resuspensiones se congelaron por inmersión en nitrógeno líquido y se conservaron a -80ºC hasta la purificación de la hAGT.

Para dicha purificación se descongelaron las resuspensiones celulares y se les añadió solución tampón para la lisis celular: 350 mM cloruro de sodio; 20 mM Imidazol; 0,2% IGEPAL; 1 \mul \beta-mercaptoetanol, 20% sacarosa, y 50 mM Tris pH=8,0. La rotura celular se llevó a cabo en un sonicador Fisher Bioblock Scientific 75042, tras lo que las disoluciones se centrifugaron a 185844 g durante 45 min. El sobrenadante se filtró a través de filtros de acetato de celulosa con poros de 45 \muM de diámetro (Sarstedt) y se aplicó el filtrado a una columna HiTrap^{TM} FF (Amersham Biosciences). La proteína unida específicamente a dicha columna a través de la cola de histidinas fue eluída mediante el flujo de una solución tampón de Imidazol en gradiente de 10 mM a 500 mM, y 350 mM NaCl, 20 mM Tris pH=8,0 y 1 mM \beta-mercaptoetanol. Las fracciones proteicas obtenidas se concentraron mediante centrifugación con dispositivos Amicon Ultra-15 (Millipore) y se purificaron mediante cromatografía de tamiz molecular en una columna Superdex 75 16/60 (Amersham Biosciences), utilizando como solución tampón 150 mM NaCl, 10 mM ditiotreitol (DTT) y 0,1 mM etilen-diamino-tetra-acetato (EDTA). Las fracciones correspondientes a la proteína eluída de esta columna se volvieron a concentrar mediante dispositivos Amicon Ultra-15 y se llevaron a una concentración de 2 mg/ml en el mismo tampón en presencia de 40% de glicerol, para su conservación a -20ºC hasta su posterior utilización.

Preparación del ADN metilado. Se metiló ADN de timo de ternera (Sigma) con [^{3}H]-metilnitrosourea (Amersham Biosciences) siguiendo el protocolo descrito en [19]. Se resuspendió 1 mg de ADN en 1 ml de solución tampón de 10 mM cacodilato sódico pH=7,0 durante 24 horas a 4ºC y a continuación se le añadieron 7 \mul de [3H]-metilnitrosourea, incubándose la mezcla a 37ºC durante 2 h. Finalizada la reacción de metilación, el ADN metilado se precipitó con acetato sódico y etanol. El precipitado obtenido, conteniendo el [^{3}H]-metil-ADN se lavó de forma exhaustiva con etanol y se resuspendió finalmente en solución tampón 50 mM Tris pH=7,8, 1 mM DTT y 5 mM EDTA, conservándose a -20ºC hasta su uso en los ensayos de actividad.

Ensayo de la actividad de la hAGT in vitro . La actividad reparadora del ADN de la hAGT y su inhibición por los compuestos de la invención se determinó siguiendo básicamente el método descrito en [20]. Brevemente, la enzima hAGT se preincubó durante 30 min a 37ºC con diferentes concentraciones de los compuestos Ia, Ib (Asinex) (0, 25, 50, 75 o 100 \muM) disueltos en dimetilsufóxido (DMSO), usando como medio de reacción una solución tampón 50 mM Tris pH=7,8, 1 mM DTT y 5 mM EDTA. Tras esta pre-incubación se inició la reacción mediante la adición del substrato, [^{3}H]-metil-ADN, y se incubó a 37ºC durante 90 minutos. El volumen final de las reacciones fue de 200 \mul, siendo las concentraciones finales de la hAGT y del [^{3}H]-metil-ADN 0.5 \muM y 50 \muM, respectivamente. Todas las reacciones se detuvieron por la adición de 400 \mul de una solución acuosa de ácido tricloroacético (TCA, Sigma) al 13%. El [^{3}H]-metil-ADN restante, no reparado por la acción de la hAGT se hidrolizó calentando la mezcla de reacción hasta alcanzar 90ºC durante 30 min. La hAGT se precipitó por centrifugación a 16100 g durante 10 minutos y se lavaron los precipitados resultantes con una solución acuosa de TCA al 5%. Tras dichos lavados se resuspendieron en 200 \mul de solución tampón 0.2 M de Tris pH=8,0. La radioactividad correspondiente al grupo ^{3}H-metil incorporado a la hAGT durante la reacción enzimática de reparación del ADN se midió con un contador de centelleo líquido (Wallac 1414), utilizando el cóctel de centelleo Optiphase HiSafe 3 (Perkin Elmer). Esta actividad remanente de la hAGT tras la preincubación con los compuestos de la invención se calculó en relación a los controles positivos, en los que la enzima se preincubó sólo con el disolvente DMSO (con ningún compuesto inhibidor). Como control negativo se usaron ensayos con la enzima hAGT-C145S, mutante sin actividad. Todos los ensayos se efectuaron por duplicado, y en cada uno de ellos las diferentes concentraciones de los compuestos se realizaron por cuadriplicado. Los resultados se expresan mediante el porcentaje de actividad remanente de hAGT en relación a la determinada para los controles positivos (en los que no hay inhibición de la actividad reparadora de dicha enzima).

Los resultados de este ensayo se ilustran en la Figura 5, donde se puede observar que los compuestos Ia y Ib, inhiben la actividad reparadora del ADN metilado catalizada por la hAGT, siendo mayor la eficacia inhibidora del compuesto Ib que la del Ia (compárense las IC_{50}, concentración de compuesto necesaria para reducir al 50% la actividad reparadora de ADN de la hAGT).

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Ejemplo 2

Optimización del efecto antitumoral de la carmustina (agente alquilante) mediante inhibición por el compuesto Ia de la actividad hAGT in vivo

Dado que la acción de la hAGT es la base de uno de los mecanismos de supervivencia de las células frente a la lesión en su ADN provocada por su metilación, puede concluirse que la inhibición de dicha enzima debe provocar una mayor sensibilidad por parte de las células a compuestos que, como los agentes alquilantes usados en quimioterapia, inducen dichas lesiones. Este es un efecto positivo desde el punto de vista terapéutico puesto que optimiza la acción antitumoral de dichos agentes. Los autores de la presente invención demostraron este efecto en cultivos de células tumorales proveniente de adenocarcinoma colorectal humano (código ATCC: HTB 38) tratadas con carmustina. En particular se empleó el ensayo de formación de colonias, previamente utilizado en el estudio de agentes adyuvantes de quimioterapia en células tumorales [21].

Ensayo de formación de colonias. Se sembraron 15000 células en cada uno de los 6 pocillos de placas de cultivo (Falcon) utilizando como medio el RPMI 1640 (Genycell) suplementado con 10% de suero fetal bovino (Biowhittaker). Tras una incubación durante 48 horas a 37ºC se reemplazó el medio y se añadió al nuevo medio diferentes concentraciones del compuesto Ia (0, 5, 10, 50 y 100 \muM). Tras una pre-incubación durante 6 horas con los compuestos de la invención, se añadió a los cultivos carmustina (1,3-Bis(2-cloroetil)1-nitrosourea, también conocido como BCNU, Sigma) disuelta en una solución 1:1 de tampón fosfato salino pH=7,6 y etanol para llegar a una concentración final de 40 \muM en el medio de cultivo. Asimismo se efectuaron controles positivos para cada uno de los cultivos con las diferentes concentraciones de compuestos de la invención en los que se añadía únicamente la solución 1:1 de tampón fosfato salino pH=7,6 y etanol sin contener carmustina. Se incubaron todos los cultivos 2 horas y se reemplazó el medio de cultivo por medio RPMI suplementado con suero fetal bovino y que contenía las respectivas concentraciones de los compuestos de la invención. Tras un periodo de incubación de 16 horas se lavaron las células y se resembraron 2000 células por pocillo en nuevas placas de cultivo, creciéndose los cultivos durante 12 días a 37ºC.

La eficacia de la hAGT para inhibir el crecimiento celular se determinó mediante el recuento de las colonias formadas usando tinción con violeta de cresilo (cristal violeta, Merck). Tras una incubación en la solución de tinción durante 30 minutos a temperatura ambiente se lavaron las colonias varias veces con agua destilada y desionizada (MilliQ) y se dejaron secar a temperatura ambiente. Finalmente, se resuspendieron con una solución acuosa de ácido acético al 10% y se midió la absorbancia de las resuspensiones a 590 nm. El número de colonias se representó como porcentaje de las mismas respecto al valor observado en el control negativo: células pre-incubadas e incubadas sólo con el medio utilizado para disolver los distintos compuestos de la invención (concentración = 0 \muM) y no tratadas con carmustina (columnas en negro en el extremo izquierdo de todas las gráficas).

Los resultados de este ensayo se ilustran en la Figura 6. Se observó que los compuestos ensayados potenciaban el efecto inhibidor de la proliferación celular o formación de colonias mediado por la carmustina. El compuesto la reforzó el efecto de la carmustina a concentraciones iguales o superiores a 10 \muM de dicho compuesto.

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Claims (6)

1. \global\parskip0.900000\baselineskip

   1. Uso de un compuesto derivado de piperadinil-metil-tetrazol-quinolinona, de fórmula I

   5

   en la que:

   - X es un átomo de carbono (C) o nitrógeno (N), indistintamente;

   - R^{1}, R^{2}, R^{3} y R^{4} son iguales o diferentes y están independientemente seleccionados del grupo constituido por: hidrógeno, alquilo lineal, alquilo ramificado, cicloalquilmetil, cicloalquiletil, aminocarbonilalquil, alquiloxi lineal, alquiloxi ramificado, furilmetil, imidazolilmetil, imidazoliletil, imidazolilpropil, R^{7}, metil-R^{7}, etil-R^{7}, propil-R^{7}, metoxi-R^{7}, etoxi-R^{7}, propoxi-R^{7}, donde R^{7} es un arilo en el que cada una de sus cinco posiciones restantes está sustituida por un grupo independientemente seleccionado entre hidrógeno, fluor, cloro, bromo, trifluorometilo, hidroxi, alcoxi (alquilóxido de 1 a 4 átomos de C), alquilcarbonil, alquilamino, y sulfonilamino;

   o bien un isómero, profármaco, solvato o sal farmacéuticamente aceptables de dicho compuesto, en la elaboración de una composición farmacéutica o medicamento destinado al tratamiento del cáncer.
2. 2. Uso de un compuesto según la reivindicación 1 donde

   - X es nitrógeno,

   - R^{1} es 2,5-dimetilfenil,

   - R^{2} es hidrógeno,

   - R^{3} es metoxi,

   - R^{4} es fenil-metil,

   compuesto denominado 3-[[4-(2,5-dimetilfenil)-1-piperazinil][1-(fenilmetil)-1H-tetrazol-5-il]metil]-6-metoxi-2
   (1H)-quinolinona.
3. 3. Uso de un compuesto según la reivindicación 1 donde

   - X es carbono,

   - R^{1} es fenil-metil,

   - R^{2} es metil,

   - R^{3} es hidrógeno,

   - R^{4} es fenil-metil,

   compuesto denominado 3-[(4-bencil-1-piperadinil)-(1-bencil-1H-5-tetrazolil)]metil-7-metil-2(1H)quinolinona.

   \global\parskip1.000000\baselineskip

4. 4. Uso de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la composición farmacéutica o medicamento está destinado al tratamiento de un cáncer seleccionado del grupo que comprende: carcinoma de próstata, mama, pulmón, páncreas, esófago, laringe, tiroides, hígado, vejiga urinaria, riñón, útero, cerviz, carcinoma cólorrectal, gástrico, osteosarcoma, sarcoma de partes blandas y angiosarcoma; tumor hematopoyético (incluyendo leucemias y linfomas), neuroblastomas, glioblastomas y astrocitomas, melanoma, carcinoma dérmico de células basales y carcinoma dérmico de células escamosas.
5. 5. Composiciones farmacéuticas y medicamentos útiles para el tratamiento del cáncer por sí solos o en combinación con otras composiciones farmacéuticas o medicamentos, caracterizados porque comprenden al menos:

   - un compuesto de fórmula I, o

   - un isómero, profármaco, solvato o sal farmacéuticamente aceptables de uno de dichos compuestos.
6. 6. Composiciones farmacéuticas y medicamentos según la reivindicación 8 en la que el compuesto de fórmula I es:

   \bullet 3-[[4-(2,5-dimetilfenil)-1-piperazinil][1-(fenilmetil)-1H-tetrazol-5-il]metil]-6-metoxi-2(1H)-quinolinona, o

   \bullet 3-[(4-bencil-1-piperadinil)-(1-bencil-1H-5-tetrazolil)]metil-7-metil-2(1H)quinolinona.