ES2325391B1

ES2325391B1 - Procedimiento para la inmovilizacion covalente orientada de anticuerpos, anticuerpos asi obtenidos y sus aplicaciones.

Info

Publication number: ES2325391B1
Application number: ES200701782A
Authority: ES
Inventors: Pilar Batalla Bosquet; Manuel Fuentes Garcia; Cesar Mateo Gonzalez; Roberto Fernandez Lafuente; Jose Manuel Guisan Seijas; Bonavia Valeria Gazu
Original assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Current assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Priority date: 2007-06-26
Filing date: 2007-06-26
Publication date: 2010-06-17
Anticipated expiration: 2027-06-26
Also published as: ES2325391A1

Abstract

Procedimiento para la inmovilización covalente orientada de anticuerpos, anticuerpos así obtenidos y sus aplicaciones.

La invención describe un procedimiento para la inmovilización covalente orientada de anticuerpos sobre un soporte activado con grupos glioxil que dirigen la inmovilización por la región de la superficie del anticuerpo opuesta al fragmento Fab del anticuerpo. Este anticuerpo inmovilizado obtenido por el procedimiento de la invención puede ser utilizado en distintos procesos biotecnológicos como por ejemplo en cromatografía de afinidad o de detección de antígenos utilizado como inmunosensor.

Description

Sector de la técnica

La aplicación es la preparación de columnas de afinidad o inmunosensores, con posible aplicación en Biotecnologia, Biocatálisis, Fermentación, Purificación de proteínas o enzimas Biomedicina, Medio-ambiente, Deteción preventiva de toxinas, Alimentación, Control de aguas y Bioseguridad.

Estado de la técnica

La alta especificidad de los anticuerpos les ha convertido en herramientas fundamentales en procedimientos de inmunoafinidad y en el desarrollo de biosensores. No obstante, para ambas aplicaciones, los anticuerpos han de estar inmovilizados y la etapa de inmovilización puede definir las posibles aplicaciones de los anticuerpos inmovilizados (ver referencias 1-7 y 10-11).

Un sistema óptimo para inmovilizar anticuerpos para cualquiera de sus posibles aplicaciones debería de reunir una serie de requisitos, dependiendo del tipo de sistema al que se quiera aplicar:

1.- La inmovilización no debe de provocar grandes distorsiones del centro de reconocimiento del anticuerpo,

2.- La zona de reconocimiento debe de estar lo más expuesta posible al medio. Esto será clave si se pretenden utilizar en el reconocimiento de bio-macromoléculas o células, o si se pretende realizar la lectura mediante la utilización de un segundo anticuerpo o biomacromolécula, ya que sólo las moléculas cuyo centro activo estén expuestas al medio serán capaces de adsorber las macromoléculas, de forma que el porcentaje de moléculas bien orientadas determinarán la velocidad de adsorción del analito (biosensores) o la capacidad de carga de la columna,

3.- La superficie final del soporte debe de ser lo más inerte posible, para evitar adsorciones inespecificas de otras moléculas sobre el soporte, de forma que compliquen los análisis finales. En columnas de bioafinidad, la adsorción inespecífica de cualquier otro compuesto reduciría drásticamente el potencial uso de este tipo de técnicas de purificación. En el caso de biosensores, una adsorción inespecífica podrá también disminuir las posibles aplicaciones del mismo, pero se debería de conseguir especialmente que no se adsorban de forma inespecífica ninguno de los componentes implicados en la lectura de la señal (p.e., anticuerpos marcados con proteínas).

Recientemente, se ha descrito un protocolo que permite inmovilizar anticuerpos según estas características (5 y 6). El procedimiento está basado en la inmovilización del anticuerpo a través de las cadenas glicosiladas oxidadas con periodato: el anticuerpo se inmoviliza covalentemente sobre soportes aminados, que son capaces de adsorber proteínas por intercambio aniónico, y para evitarlo se procede a una etapa de bloqueo con dextrano-aspártico-aldehído, requiriéndose un control muy estricto de esta etapa para evitar la modificación química de las zonas de reconocimiento del anticuerpo. Este método permite recuperar anticuerpos con hasta un 60-70% de funcionabilidad y sin que el soporte adsorba proteínas de crudos de diferentes microorganismos. Sin embargo, el procedimiento es complejo cuando se pretende escalar a nivel industrial y complicado si se pretende recubrir el soporte de anticuerpos debido a la relativa lentitud de la reacción covalente azúcar oxidado-aminos primarios.

Descripción de la invención Descripción breve

Un objeto de la invención lo constituye un procedimiento para la inmovilización covalente orientada de anticuerpos, en adelante procedimiento de la invención, basado en que se lleva a cabo sobre un soporte activado que dirigen la inmovilización por la región de la superficie del anticuerpo más rica en grupos Lys y porque comprende las siguientes etapas:

i) activación de un soporte con grupos aldehídos alifáticos, preferentemente grupos glioxil, y

ii) una reducción final de la preparación en baja concentración con un agente reductor de aldehídos o de bases schif, preferentemente con borohidruro sódico.

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Otro objeto de la invención lo constituye el anticuerpo inmovilizado obtenido por el procedimiento de la invención.

Otro objeto de la invención lo constituye el uso del anticuerpo inmovilizado en un proceso biotecnológico perteneciente al siguiente grupo: proceso de cromatografía de afinidad o de detección de antígenos utilizado como inmunosensor, por ejemplo en mezclas con partículas en suspensión, por ejemplo, membranas o células.

Descripción detallada

La presente invención se basa en que los inventores han observado que la inmovilización covalente orientada de un anticuerpo puede llevarse a cabo sobre un soporte activado con grupos aldehido alifaticos implicando principalmente las cadenas pesadas del anticuerpo. Más concretamente, este procedimiento de inmovilización covalente orientada está caracterizado por el uso de soportes activados con grupos aldehído alifáticos tipo glioxil que dirigen la inmovilización del anticuerpo a pH alcalino.

Cada enlace individual amino-aldehído es muy débil (incluso considerando los grupos amino más reactivos) y el anticuerpo (u otra cualquier proteína) no se inmovilizan sobre estos soportes a pH neutro y sobre soportes poco activados. Únicamente cuando se usan soportes muy activados y se realiza la inmovilización a pH alcalino (muchas lisinas reactivas en la superficie de la proteína) se produce una inmovilización muy rápida e irreversible por unión covalente multipuntual entre las regiones más ricas en lisina de la proteína y estos soportes muy activados. Este método de inmovilización es único ya que no involucra los residuos amino más reactivos de la superficie de la proteína (como hacen todos los métodos de inmovilización irreversible vía grupos amino) sino que involucra únicamente la región o regiones más ricas en lisinas situadas en la superficie de las proteínas. Como puede observarse en la Figura 1, en el caso de las inmunoglobulinas, estas regiones ricas en lisina se encuentran en la proximidad de las cadenas glicosiladas en la región opuesta al fragmento Fab del anticuerpo. Es decir, la región más adecuada para una correcta inmovilización de anticuerpos el soporte.

En estas condiciones la inmovilización se produce por la región de la superficie de la proteína más rica en grupos lisina (Lys) capaces de reaccionar por su accesibilidad con una superficie plana (referencias 12 y 13) que se encuentran precisamente en la zona opuesta al centro de reconocimiento del anticuerpo. Este tipo de anticuerpos inmovilizados y orientados conservan su actividad biológica y adsorben muy rápidamente y específicamente sus correspondientes antígenos (ver Ejemplos). Tras reducir el anticuerpo inmovilizado (p.e. con borohidruro sódico), los aldehídos se transforman en inertes hidroxilos (referencia 13). Si se desea aumentar la hidrofilicidad o polaridad de la superficie del soporte, es posible incubar la preparación de anticuerpo inmovilizada (antes de reducir), con 1 M de glicina durante 1 hora y reducir la preparación posteriormente, quedando así la superficie del soporte, recubierta de estos aminoácidos, inerte para la adsorción inespecífica de cualquier otro tipo de proteínas (albúmina, inmunoglobulinas, extractos crudos de Escherichia coli, etc.). De esta forma estas superficies son tanto química como físicamente inertes, con los que ninguna proteína, por ejemplo, de E. coli. o suero bovino se adsorbe a las mismas en incubación a pH neutro y moderada fuerza fónica (10-100 mM fosfato sódico).

Este procedimiento de inmovilización se puede llevar a cabo sobre todo tipo de soportes sólidos pre-existentes y para todo tipo de aplicaciones de anticuerpos inmovilizados. Por un lado, la inmovilización de anticuerpos sobre geles de agarosa es útil para la preparación de soportes de inmunoafinidad para la adsorción selectiva de enzimas y proteínas. Por otro lado, la inmovilización de anticuerpos sobre partículas magnéticas sería muy útil para la detección de trazas de células, proteínas y cualquier analitos de interés presentes en mezclas complejas (sangre, alimentos, aguas residuales, etc.).

Así, un objeto de la invención lo constituye un procedimiento para la inmovilización covalente orientada de anticuerpos, en adelante procedimiento de la invención, basado en que se lleva a cabo sobre un soporte activado que dirigen la inmovilización por la región de la superficie del anticuerpo más rica en grupos Lys y porque comprende las siguientes etapas:

ii) una reducción final de la preparación en baja concentración con un agente reductor de aldehidos o de bases schif, preferentemente con borohidruro sódico.

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Por otro lado, cuando el soporte a utilizar es hidrofóbico, por ejemplo, partículas magnéticas de poliestireno, el procedimiento de la invención debe someterse a una etapa intermedia a i) y ii) de hidrofilización de la superficie del soporte mediante la incubación del anticuerpo inmovilizado con un compuesto hidrofílico con un grupo amino primario, preferentemente con carga neta 0 a pH neutro (e.g., gly, mezclas Lys/Asp, etc.)

Un objeto particular de la invención lo constituye el procedimiento de invención en el que el soporte utilizado es poroso, por ejemplo, agarosa, vidrio, silica o epoxi-acrílico; o no porosa, como por ejemplo una nanopartícula magnética no porosa.

Descripción de las figuras

Figura 1.- Imágenes de IgG (obtenida con el programa PyMOL v0.99) a partir del fichero 1IGY correspondiente al anticuerpo anti-peroxidasa obtenido en conejo y depositado en el banco de datos de proteínas (PDB). En la Figura 1A se observa una visión vertical de la IgG con las cadenas pesadas coloreadas en verde y las cadenas ligeras coloreadas en naranja. Las regiones de reconocimiento del antígeno (Fab) se encuentran en las partes superiores derecha e izquierda (en el extremo de la intersección entre cadenas ligeras y pesadas). En la Figura 2 se observa la región con mayor densidad en grupos lisina, coloreados en color azul, (la región que reacciona con los soportes glioxil). Desde esta perspectiva se observan muy próximas las cadenas glicosiladas (coloreadas de amarillo) y ya descritas como buena orientación para la inmovilización de IgG. Desde esta visión no se observan las cadenas ligeras confirmándose que efectivamente se está intentando inmovilizar el anticuerpo por una región muy alejada de la región Fab y, por tanto, con una orientación muy adecuada para un posterior reconocimiento de antígenos sobre los anticuerpos inmovilizados.

Ejemplos de la invención Ejemplo 1 Inmovilización de anticuerpos sobre glioxil-agarosa

10 mg de anticuerpo anti-peroxidasa se disolvieron en 100 mL de tampón bicarbonato a pH 10 y 4ºC. A continuación se añadieron 10 g de glioxil agarosa. Tras 3 horas bajo agitación suave, todo el anticuerpo se había inmovilizado. En ese momento se añadieron 100 mg de borohidruro sódico. Tras 30 minutos, el derivado se lavó abundantemente con tampón pH 7 y agua destilada.

A continuación, a 1 g de este anticuerpo se ofreció 10 ml de un solución que contenía 100 mg de un extracto de proteínas de E. coli conteniendo 0.2 mg de peroxidasa de rábano en fosfato 10 mM a pH 7. Tras 1 hora, con agitación continua, el 100% de la actividad peroxidasa había sido adsorbida por el soporte. En un experimento similar en el que el anticuerpo había sido sustituido por 1 g de glioxil-agarosa reducida, no se apreció que la peroxidasa se adsorbiera al soporte. A continuación, se recuperó el anticuerpo inmovilizado con la peroxidasa adsorbida, se lavó abundantemente con agua y se sometió a una electroforesis en SDS, las únicas bandas visibles correspondieron a la cadena ligera del anticuerpo y a la peroxida.

De esta forma se confirmó que el anticuerpo era plenamente funcional y que no se producía ninguna adsorción inespecífica de proteínas sobre los mismos.

Ejemplo 2 Inmovilización de anticuerpos sobre aldehído-partícula nano-magnética de poliestireno

1 g de nano-partículas magnéticas de poliestireno conteniendo grupos epóxido se incubó durante 12 horas en 100 ml de ácido sulfúrico 250 mM para transformar los grupos epóxido en grupos diol. Las partículas se lavaron repetidas veces con agua destilada hasta que el pH era neutro, y se añadió 100 mL de periodato sódico 10 mM para generar grupos aldehido por oxidación de los dioles.

50 mg de anti-peroxidasa se disolvieron en 100 mL de tampón bicarbonato a pH 10 y 4ºC. A continuación, se añadieron 1 g de nanopartículas-aldehído. Tras 6 horas bajo agitación continua, todo el anticuerpo se había inmovilizado. En ese momento, se eliminó el sobrenadante y se resuspendió durante 1 hora en 100 mL de 1 M de glicina. Pasado este tiempo, se añadieron 100 mg de borohidruro sódico. Tras 30 minutos, el derivado se lavó abundantemente con tampón pH 7 y agua destilada.

A continuación, a 10 mg de este anticuerpo inmovilizado se ofreció 100 ml de un solución que contenía 100 mg de un extracto de proteínas de E. coli conteniendo 1 mg de peroxidasa de rábano en fosfato 50 mM a pH 7. Tras 1h, el 100% de la actividad peroxidasa había sido adsorbida por el soporte. En un experimento similar en el que el anticuerpo inmovilizado había sido sustituido por 10 mg de partículas aldehido-glicina reducidas no se apreció que la peroxidasa se adsorbiera al soporte. A continuación, se recuperó el anticuerpo inmovilizado con la peroxidasa adsorbida, se lavó abundantemente con agua y se sometió a una electroforesis en SDS, las únicas bandas visibles correspondieron a la cadena ligera del anticuerpo y a la peroxidasa.

De esta forma se confirmó que el anticuerpo era plenamente funcional y que no se producía ninguna adsorción inespecífica de proteínas sobre el soporte.

Referencias

1.- Ahluwalia A., DeRossi D., Schirone A., Serra C.. 1991. A comparative study of protein immobilization techniques for optical immunosensors. Biosens. Bioelectron. 7: 207-214.

2.- Anderson G.P., Jacoby M.A., Ligler F.S., King K.D.. 1997. Effectiveness of protein A for antibody immobilization for a fiber optic biosensor. Biosens. Bioelectron 12: 39-336.

3.- Babacam S, Pivarnik P., Lecther S., Rand AG, 2000. Evaluation of antibody immobilization methods for piezoelectric biosensor application. Biosens. Bioelectron. 15: 615-621

4.- Danczyk R., Krieder B., North T., Webster T., Hogenesch H., Rundell A. 2003 Comparison of antibody functionality using different immobilization methods. Biotechnol. Bioeng. 84: 215-223.

5.- Fuentes, Manuel, Cesar Mateo, J.M. Guisán* and Roberto Fernández-Lafuente 2005 "PREPARATION OF INERT MAGNETIC NANO-PARTICLES FOR THE DIRECTED IMMOBILIZATION OF ANTIBODIES" Biosen. Bioelec. 20: 1380-1387

6.- Fuentes, García, Manuel, César Mateo González, Roberto Fernández Lafuente, Jose Manuel Guisán Seijas, Carmen Force Redondo, Ignacio Rodríguez Galván, Pedro Tartaj Salvador, Carlos Serna Pereda "Inmovilización de anticuerpos en partículas magnéticas para detección de trazas de proteínas en fluidos biológicos" Patente española 200202751

7.- Lu B, Smy MR, O'Kennedy R., 1996. Oriented immobilization of antibodies and its application in immunoassays and immunosensors. Analyst 121: 29R-32R.

8.- Mateo, C. Fernández-Lorente G., Abian O.; Fernández-Lafuente R., Guisán J.M.. 2000. Multifunctional epoxy- supports. A new tool to improve the covalent immobilization of proteins: the promotion of physical adsorption of proteins: the promotion of physical adsorptions of proteins on the supports before their covalent linkage. Biomacromolecules 1: 739-745.

9.- Mateo C., Torres R., Fernández G., Ortiz C., Fuentes M., Hidalgo A., Lopez-Gallego F., Betancor L., Pessela B.C.C., Aminati A., Fernández-Lafuente R., Guisán J.M.. 2003. Epoxy-amino sepabeads: a new support for immobilization of proteins under mild conditions. Biomacromolecules 4: 772-777.

10.- Weetall H H, Lee M J. 1989. Antibodies immobilized on Inorganic supports. Appl Biochem. Biotech. 22: 311-330.

11.- Zull JE, Reed-Mundell J, Lee YW, Vezenov D, Ziats NP, Anderson Jm, Sukenik CN, 1994. Problems and approaches in covalent attachment of peptides and proteins to inorganic surfaces for biosensors applications. J. Indust. Microbiol. 13: 137-143.

12.- Mateo, C., Abian, O., Bernedo, M., et al 2005 "SOME SPECIAL FEATURES OF GLYOXYL SUPPORTS TO IMMOBILIZE PROTEINS" Enzyme Microb. Technol. 37, 456-462.

13.- Mateo, C., Palomo, J.M., Fuentes, M. et al 2006 "Glyoxyl-agarose: a fully inert hydrophilic support for immobilization and high stabilization of proteins" Enzyme Microb. Technol. 39. 274-280.

Claims

1. Procedimiento para la inmovilización covalente orientada de anticuerpos caracterizado porque se lleva a cabo sobre un soporte activado que dirige la inmovilización por la región de la superficie del anticuerpo más rica en grupos lisina y porque comprende las siguientes etapas:

i) activación de un soporte con grupos aldehídos alifáticos, y

ii) una reducción final de la preparación en baja concentración con un agente reductor de aldehídos o de bases schif.

2. Procedimiento según la reivindicación 1 caracterizado porque el grupo aldehído alifático de i) es un grupo glioxil.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 caracterizado porque, opcionalmente y para el caso que la superficie del soporte de i) sea hidrofóbica, comprende una etapa de hidrofilización de la superficie del soporte tras la etapa i) mediante la incubación del anticuerpo inmovilizado con un compuesto hidrofílico con un grupo amino primario, preferentemente con carga neta 0 a pH neutro.

4. Procedimiento según la reivindicación 3 caracterizado porque el compuesto hidrofílico que se utiliza para inertizar el soporte pertenece al siguiente grupo: glicina, mezclas Lys/Asp.

5. Procedimiento según la reivindicación 1 caracterizado porque el agente reductor de aldehído es borohidruro sódico.

6. Procedimiento según la reivindicación 1 caracterizado porque el soporte utilizado es poroso, por ejemplo, agarosa, vidrio, silica o epoxi-acrilico, o no poroso.

7. Procedimiento según la reivindicación 6 caracterizado porque el soporte No poroso es una nanopartícula magnética no porosa.

8. Anticuerpo inmovilizado caracterizado porque se obtiene por el procedimiento según las reivindicaciones 1 a la 7.

9. Uso del anticuerpo inmovilizado según la reivindicación 8 en un procedimiento biotecnológico perteneciente al siguiente grupo: en procesos de cromatografía de afinidad y de detección de antígenos.