ES2370359A1 - Nanoestructuras multifuncionales como agentes de diagnosis trimodal mri-oi-spect. - Google Patents
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Abstract
Nanoestructuras multifuncionales como agentes de diagnosis trimodal MRI-OI-SPECT.Nanoestructuras multifuncionales que consisten en una ferritina, caracterizada porque comprende al menos un quantum dot y al menos una molécula de un polímero biocompatible ambos unidos covalentemente a la superficie de la ferritina. La invención también se refiere a un método para obtener dichas nanoestructuras, así como a su uso como medicamento y más preferiblemente para la diagnosis de cáncer o como agente de contraste.
Description
Nanoestructuras multifuncionales como agentes de
diagnosis trimodal MRI-OI-SPECT.
La presente invención se refiere a una
nanoestructura multifuncional, concretamente a una ferritina, además
de su aplicación como agente de contraste en OI, MRI o SPECT. Por
tanto, la invención se podría encuadrar dentro del campo de la
biomedicina.
La integración de la Nanotecnología en la
biotecnología ha hecho florecer una nueva disciplina: la
nanomedicina. En este campo, se diseñan y preparan nanopartículas
metálicas para obtener bioimágenes mediante el uso simultáneo de
varias técnicas, distribución efectiva de fármacos o técnicas de
terapias tan prometedoras como la hipertermia originada localmente
por nanopartículas magnéticas. Es un área de tremendo potencial
sujeta al desarrollo de nuevas nanoestructuras para su avance.
Las nanopartículas magnéticas han atraído
atención principalmente por su uso potencial como agentes de
contraste en Imagen por Resonancia Magnética (MRI). Esta técnica se
basa en la resonancia magnética de los protones de tejidos del
cuerpo (agua, membranas, lípidos, proteínas, etc) y es actualmente
el método más potente de diagnosis.
El contraste en MRI, puede mejorarse con
sustancias paramagnéticas. La capacidad de un compuesto para
incrementar la velocidad de relajación de los espines de protón de
las moléculas de agua del entorno se llama relajación y se define
como R1\sim1/T1 o R2\sim1/T2. Las nanopartículas
superparamagnéticas son candidatos para actuar como agentes de
contraste en MRI. Al igual que las sustancias paramagnéticas,
pierden su magnetización cuando se elimina el campo magnético
externo, pero a diferencia de éstas, su magnetización es
sensiblemente mayor. Por lo tanto, la relajación que producen es
mucho más alta que las de los clásicos complejos paramagnéticos de
Gd(III). El efecto de las nanopartículas superparamagnéticas
se puede describir en base a la heterogeneidad del intenso campo
magnético que afecta a los protones de alrededor, induciendo un
desfase del momento magnético y dando lugar a un acortamiento del
tiempo de relajación T2. De este modo, las nanopartículas
superparamagnéticas son unos buenos candidatos para el desarrollo de
nuevos agentes de contraste, permitiendo una detección temprana de
patologías severas y de gran impacto social.
Por otro lado, los denominados quantum dots
(QDs), han sido usados con éxito como nuevos marcadores
fluorescentes en el campo biomédico y son considerados como una
herramienta prometedora en Imagen óptica de fluorescencia (OI) para
diagnóstico clínico. Los QDs son nanopartículas inorgánicas,
generalmente compuestas de elementos de los grupos
II-VI y III-V, los cuales, debido a
su confinamiento cuántico de cargas en un diminuto espacio muestran
unas propiedades fluorescentes únicas: espectros de emisión
estrechos, rendimiento cuántico alto, espectros de absorción anchos,
buena estabilidad química y alta fotoestabilidad y longitud de onda
de emisión dependiente del tamaño, ampliando su rango de emisión
hasta la región NIR (infrarrojo cercano) o IR (infrarrojo) y
ofreciendo una mayor penetración en tejido para una mejor imagen.
Sin embargo, a pesar de las excepcionales propiedades fluorescentes
que presentan, estas nanopartículas necesitan ser funcionalizadas
con algún tipo de polímero o proteína que las haga biocompatibles y
por tanto aptas para su utilización in vivo.
Un enfoque dentro de la nanomedicina es el uso
de nanopartículas que puedan combinar diferentes técnicas de
bioimagen. Cada modalidad de bioimagen tiene sus propios méritos
pero también ciertas desventajas y por lo tanto los métodos de
imagen multimodales presentan mayor capacidad para obtener una
imagen integral y más detallada. La combinación
MRI-OI es un buen ejemplo de un método biomodal y
una ruta para su consecución es el uso de nanoestructuras que
contengan dos componentes metálicos, uno magnético y otro
fluorescente: nanopartículas bifuncionales
magneto-fluorescente. El nanocomponente magnético
puede incorporar un radiomarcador, como ^{99m}TcO_{4}^{-},
añadiendo a la nanoestructura multifuncional una nueva modalidad de
imagen médica mediante la detección de la radiación gamma que dicho
radionúclido genera mediante gammagrafía (SPECT).
Un punto clave para la aplicación biomédica de
las nanopartículas metálicas es que no pueden ser tóxicas y deben
permanecer en circulación el tiempo suficiente para alcanzar el
blanco biológico. El sistema fagocítico mononuclear (MPS) reconoce y
elimina, a través de los macrófagos, las partículas de la
circulación, con su simultánea concentración en órganos con alta
actividad fagocítica (principalmente el hígado). Por lo tanto, una
estrategia sensata es el uso de nanopartículas que sean capaces de
evadir el ataque por parte del MPS y no sean fagocitadas por los
macrófagos, aumentando consecuentemente el tiempo de vida media en
plasma y permitiendo alcanzar un órgano o tejido específico.
Este tipo de agentes de diagnosis ideales para
su aplicación clínica deberían poseer una alta y específica
acumulación en las células adecuadas, lo que tendría como
consecuencia la posibilidad de diagnosticar de forma cada vez más
precoz una enfermedad aún tratable.
Numerosos métodos físicos y químicos han sido
utilizados para preparar nanopartículas magnéticas. Puesto que las
propiedades magnéticas son muy dependientes del tamaño, es crucial
que el método a desarrollar permita la obtención de nanopartículas
con tamaños uniformes. Una posible ruta para obtener nanopartículas
metálicas sin agregación y con tamaño controlado es el uso de una
plataforma molecular preorganizada, con una cavidad que pueda actuar
como nanoreactor para el control químico y espacial en la formación
de las nanopartículas. Un ejemplo típico de este tipo de moléculas
es la proteína ferritina. La apoferritina consiste en una proteína
esférica formada por 24 subunidades rodeando una cavidad acuosa con
un diámetro de aproximadamente 8 nm.
La organización de las multisubunidades para
formar la apoferritina genera la presencia de canales. Ocho canales
hidrofílicos de aproximadamente 4 A permiten la entrada de iones
metálicos y moléculas suficientemente pequeñas al interior de la
cavidad de la proteína. Esto ha permitido la introducción de
magnetita en el interior de la apoferritina produciendo
magnetoferritina, la cual ha sido usada como método de diagnostico
monomodal (MRI) (Journal of Magnetic Resonance Imaging.
4(3):497-505, 1994
May-Jun.).
En vista del estado de la técnica un objetivo de
la presente invención es proporcionar un agente de contraste OI, el
cual puede además ser usado como agente bimodal,
OI-MRI, e incluso trimodal,
OI-MRI-SPECT, basado en una
ferritina, caracterizada porque comprende al menos un quantum dot
(QD) y al menos una molécula de un polímero biocompatible unidos
ambos covalentemente a la superficie de la ferritina (Figura 1).
Estas partículas han demostrado que se biodistribuye en diferentes
tejidos, como el hígado, pulmón y cerebro, por lo que son útiles
como agentes de contraste para enfermedades en dichos tejidos.
La ferritina de la invención es biocompatible y
la bioconjugación con un quantum dot, mejora significativamente la
biodistribución de ambas partículas por separado. La nanoestructura
formada por la conjugación de la ferritina y del quantum dot puede
ser usada como agente de contraste en OI y muestra tiempos de vida
medios suficientemente extensos para distribuirse por el sistema
circulatorio sin ser fagocitados en un tiempo menor de 3 h, pero a
la vez suficientemente cortos para evitar su acumulación en el
cuerpo.
En el contexto de la presente invención se
entiende por ferritina cualquier apo-ferritina,
independiente del material que se encuentre encapsulado en su
cavidad interna, incluidas las apo-ferritinas en las
cuales la cavidad interna está vacía.
Los componentes fluorescentes, como por ejemplo
los QD525, QD655 y QD800, que podría enlazar covalentemente a la
capa externa de la ferritina mediante formación de un enlace
covalente amida por reacción entre los grupos -NH_{2} libres de
los restos de lisinas de la capa externa de la ferritina y los
grupos carboxílicos del QD.
Los denominados quantum dots QDs, han sido
usados con éxito como nuevos marcadores fluorescentes en el campo
biomédico y son considerados como una herramienta prometedora en
Optical Imaging para diagnóstico clínico in vivo [Choi, H.
S. Liu, W. Misra, W., Tanaka, E, Zimmer, J. P., Ipe, B. I., Bawendi,
M. G, Frangioni, J. V, Nat. Biotechnol. 2007, 25,
1165-1170 y Qi, L., Gao, X. Expert. Opin. Drug
Delivery 2008, 5, 263-267.]. Los QDs son
nanopartículas inorgánicas, generalmente compuestas de elementos de
los grupos II-VI y III-V, los
cuales, debido a su confinamiento cuántico de cargas en un diminuto
espacio muestran unas propiedades fluorescentes únicas: espectros de
emisión estrechos, rendimiento cuántico alto, espectros de absorción
anchos, buena estabilidad química y alta fotoestabilidad y longitud
de onda de emisión dependiente del tamaño, ampliando su rango de
emisión y ofreciendo una mayor penetración en tejido para una mejor
imagen. Una de las limitaciones de los QD para poder tener
aplicaciones in vivo es su bajo tiempo de residencia en
sangre. No obstante, esta limitación puede ser superada mediante
funcionalización con polímeros hidrofóbicos como el polietilén
glicol (PEG) [Daou, T. Jean; Li, Liang; Reiss, Peter; Josserand,
Veronique; Texier, Isabelle . Langmuir (2009), 25(5),
3040-3044 y referencias]. Una vez
convenientemente funcionalizados, pueden ser administrados in
vivo y su localización detectada por la emisión fluorescente
correspondiente.
Los quantum dots se pueden seleccionar por
ejemplo entre los que se listan en el catálogo Invitrogen Molecular
Probes 2009 y preferiblemente se seleccionan entre Qdot® 625
ITK^{TM} carboxyl quantum dots (A10200), Qdot® 605 ITK^{TM}
carboxyl quantum dots 8 \muM solution (Q21301MP), Qdot® 585
ITK^{TM} carboxyl quantum dots 8 \muM solution (Q21311MP), Qdot®
655 ITK^{TM} carboxyl quantum dots 8 \muM solution (Q21321MP),
Qdot® 565 ITK^{TM} carboxyl quantum dots 8 \muM solution
(Q21331MP), Qdot® 525 ITK^{TM} carboxyl quantum dots 8 \muM
solution (Q21341MP), Qdot® 705 ITK^{TM} carboxyl quantum dots 8
\muM solution (Q21361MP), Qdot® 800 ITK^{TM} carboxyl quantum
dots 8 \muM solution (Q21371MP), Qdot® 545 ITK^{TM} carboxyl
quantum dots 8 \muM solution (Q21391MP). Qdot® 605 ITK^{TM}
amino (PEG) quantum dots 8 \muM solution (Q21501MP), Qdot® 585
ITK^{TM} amino (PEG) quantum dots 8 \muM solution (Q21511MP),
Qdot® 655 ITK^{TM} amino (PEG) quantum dots 8 \muM solution
(Q21521MP), Qdot® 565 ITK^{TM} amino (PEG) quantum dots 8 \muM
solution (Q21531MP), Qdot® 525 ITK^{TM} amino (PEG) quantum dots 8
\muM solution (Q21541MP), Qdot® 705 ITK^{TM} amino (PEG) quantum
dots 8 \muM solution (Q21561MP), Qdot® 800 ITK^{TM} amino (PEG)
quantum dots 8 \muM solution (Q21571MP), Qdot® 545 ITK^{TM}
amino (PEG) quantum dots 8 \muM solution (Q21591MP) y cualquiera
de sus combinaciones. Los quantum dots preferidos son los que emiten
entre 750 y 850 nm.
Aunque hay diferentes maneras de anclar el
quantum dot a la superficie de la ferritina, preferiblemente estos
están anclados a través de enlaces covalentes tipo amida,
aprovechando los grupos amino que están libres en la superficie de
la ferritina.
Normalmente entre 1 y 2 unidades de quantum dots
anclados a la superficie son suficientes para el uso de la ferritina
como agente de contraste.
El número de quantum dots anclados a la
magnetoferritina se puede calcular según la fórmula:
N = 2\pi (R_{Fe} + R_{QD})^{2}/(3)^{1/2} (R_{QD})^{2}, donde R_{Fe} es el radio de la nanopartícula y R_{QD} es el radio del quantum dot (QD). Esta expresión, estimativa, proviene de dividir el área de la ferritina cubierta por los quantum dots y dividirla por el área de ferritina cubierta por un solo quantum dot. El cálculo asume un empaquetamiento compacto de QDs sobre la superficie de la ferritina y tiene en consideración los huecos entre los QDs. Por ejemplo para una partícula magnética de 10 nm el número máximo de QDs aumenta desde 45 hasta 133 cuando el diámetro del QD disminuye de 4 a 2 nm (D. Wang, J. He, N. Rosenzweig, Z. Rosenzweig, Nano Lett. 2004, 4, 409-413).
N = 2\pi (R_{Fe} + R_{QD})^{2}/(3)^{1/2} (R_{QD})^{2}, donde R_{Fe} es el radio de la nanopartícula y R_{QD} es el radio del quantum dot (QD). Esta expresión, estimativa, proviene de dividir el área de la ferritina cubierta por los quantum dots y dividirla por el área de ferritina cubierta por un solo quantum dot. El cálculo asume un empaquetamiento compacto de QDs sobre la superficie de la ferritina y tiene en consideración los huecos entre los QDs. Por ejemplo para una partícula magnética de 10 nm el número máximo de QDs aumenta desde 45 hasta 133 cuando el diámetro del QD disminuye de 4 a 2 nm (D. Wang, J. He, N. Rosenzweig, Z. Rosenzweig, Nano Lett. 2004, 4, 409-413).
De acuerdo con el primer aspecto de la presente
invención la ferritina tiene cadenas de un polímero biocompatible
covalentemente unidas a la superficie de la ferritina. La presencia
de este polímero mejora las propiedades de la ferritina de la
invención para ser usada como agente de contraste puesto que aumenta
su estabilidad general obteniendo tiempos medios de vida en sangre
adecuados para su uso. El polímero biocompatible preferido es
polietilenglicol (PEG), entre otras razones por su disponibilidad
industrial, su facilidad de incorporación a la superficie de la
ferritina y su alta biocompatibilidad. El proceso de unir
covalentemente el polímero de PEG a otras moléculas, normalmente
fármacos o proteínas terapéuticas es conocido como PEGylación
(Kohler, N.; Fryxell, G. E.; Zhang, M. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126,
7206. Paul, K. G.; Frigo, T. B.; Groman, J. Y.; Groman, E. V.
Bioconjugate Chem. 2004, 15, 394.). En nuestro caso, el PEG va unido
covalentemente a la ferritina. Este proceso se puede llevar a cabo
de forma sencilla, incubando un derivado del PEG reactivo con las
nanopartículas. La unión covalente de PEG las enmascara del sistema
inmune, aumenta la talla hidrodinámica (talla en solución) lo que
aumenta el tiempo de vida media en sangre y reduce su eliminación
por el sistema inmune. Este proceso además aumenta la solubilidad en
agua de dichas nanopartículas y le confiere de forma general una
estabilidad adicional. Se puede además controlar el número de
moléculas de PEG que se unen a la superficie de la nanopartícula.
Los derivados del PEG de tipo succinimidil éster permiten la
formación de un enlace covalente de tipo amida por reacción con los
grupos amino en la superficie externa de las nanopartículas. En
resumen, para conseguir la unión de las cadenas de PEG y la
ferritina, el PEG debe de estar derivatizado con grupos funcionales
capaces de unirse por sí solos o con la ayuda de un reactivo a la
superficie de la ferritina. El PEG se une preferiblemente mediante
enlaces amida, siendo por lo tanto los derivados de PEG preferidos,
como ya se ha comentado antes, los que contienen el grupo funcional
succinimidil éster, que permite una funcionalización directa de las
ferritinas, ya que este grupo éster activado reacciona con los
grupos aminos que rodean las nanopartículas, formando el enlace
covalente tipo amida. Uno de los PEG preferidos es PEG1163
MeO-PEG-COO-Su
\alpha-Metoxi-\omega-ácido
carboxílico succinimidil éster poli(etilenglicol)
PEG-WM 2,000 Dalton. Los PEG funcionalizados como
éster succinimidil son comerciales y su acoplamiento covalente a la
partícula superparamagnética se puede llevar a cabo después de la
introducción del ^{99m}Tc.
El número de cadenas de PEG introducidas se
pueden controlar dependiendo de la estequiometría y del PEG
empleados. Por ejemplo, cuando se utilizan derivados de éster
activados, dada la alta reactivad de dichos ésteres y de las aminas
de la nanopartícula, la reacción es completa, de tal forma que el
número de PEG enlazados covalentemente a la superficie de la
nanopartícula coincide con el número de moléculas del derivado de
PEG/nanopartículas que se utiliza en la reacción. Además el número
de cadenas introducidas se comprobó a través del uso de un patrón
electroforético, analizando las diferentes ferritinas derivatizadas
con PEG y viendo su correspondencia con un aumento escalonado y
gradual del peso molecular y por ende de una mayor retención.
El PEG puede ser mono- o bifuncionalizado con ésteres activados y se
pueden unir PEG con diferente densidad y cristalinidad. La
estabilidad de la ferritina de la invención se ve aumentada por la
introducción del polímero biocompatible, y en especial cuando este
es PEG, pero este mayor aumento de la estabilidad no es proporcional
al número de cadenas introducidas. Por lo tanto, aunque se puede
introducir entre 1 y 72 cadenas, se pueden dejar grupos amino libre
por sí se desea realizar subsiguientes derivatizaciones o
simplemente para reducir los coste de fabricación. Preferiblemente
se incorporan de media entre 3 y 10 cadenas de PEG por ferritina y
más preferiblemente entre 4 y 6.
A continuación se detallan algunos de los
derivados de PEG útiles para la presente invención:
i) MeO-PEG-COOH:
PEG1156 MeO-PEG(11)-COOH
\alpha-Metoxi-\omega-ácido
propanoico unde(etilenglicol) PEG-WM 588,7
g/mol, PEG1161 MeO-PEG-COOH
\alpha-Metoxi-\omega-ácido
carboxílico poli(etilenglicol) PEG-WM 750 D,
PEG1158 MeO-PEG-COOH
\alpha-Metoxi-\omega-ácido
carboxílico poli(etilen glicol) PEG-WM 2.000
D, PEG1160 MeO-PEG-COOH
\alpha-Metoxi-\omega-ácido
carboxílico poli(etilenglicol) PEG-WM 5.000
D, PEG1157 MeO-PEG-COOH
\alpha-Metoxi-\omega-ácido
carboxílico poli(etilenglicol) PEG-WM 10.000
D, PEG1159 MeO-PEG-COOH
\alpha-Metoxi-\omega-carboxílico
ácido poli(etilenglicol) PEG-WM 20.000 D,
PEG1166
MeO-PEG-COO-Su
\alpha-Metoxi-\omega-ácido
carboxílico succinimidil éster poli(etilenglicol)
PEG-WM 750 D, PEG1163
MeO-PEG-COO-Su
\alpha-Metoxi-\omega-carboxílico
ácido succinimidil éster poli(etilenglicol)
PEG-WM 2.000 D, PEG1165
MeO-PEG-COO-Su
\alpha-Metoxi-\omega-ácido
carboxílico succinimidil éster poli(etilenglicol)
PEG-WM 5.000 D, PEG1162
MeO-PEG-COO-Su
\alpha-Metoxi-\omega-ácido
carboxílico succinimidil éster poli(etilenglicol)
PEG-WM 10.000 D, PEG1164
MeO-PEG-COO-Su
\alpha-Metoxi-\omega-ácido
carboxílico succinimidil éster poli(etilenglicol)
PEG-WM 20.000 D,
ii)
HOOC-PEG-COOH:PEG1091
HOOC-PEG(12)-COOH
\alpha,\omega-Bis(propionico ácido)
duodeca(etilen glicol) PEG-WM 2.000 690,8
g/mol, PEG1083 HOOC-PEG-COOH
\alpha,\omega-Bis-carboxi
poli(etilen glicol) PEG-WM 2.000 D,
PEG1085 HOOC-PEG-COOH \alpha,\omega-Bis-carboxi poli(etilen glicol) PEG-WM 3.000 DPEG1086 HOOC-PEG-COOH \alpha,\omega-Bis-carboxi poli(etilenglicol) PEG-WM 6.000 D, PEG1082 HOOC-PEG-COOH \alpha,\omega-Bis-carboxi poli(etilenglicol) PEG-WM 10.000 D PEG1084 HOOC-PEG-COOH \alpha,\omega-Bis-carboxi poli(etilen glicol) PEG-WM 20.000 D,
PEG1085 HOOC-PEG-COOH \alpha,\omega-Bis-carboxi poli(etilen glicol) PEG-WM 3.000 DPEG1086 HOOC-PEG-COOH \alpha,\omega-Bis-carboxi poli(etilenglicol) PEG-WM 6.000 D, PEG1082 HOOC-PEG-COOH \alpha,\omega-Bis-carboxi poli(etilenglicol) PEG-WM 10.000 D PEG1084 HOOC-PEG-COOH \alpha,\omega-Bis-carboxi poli(etilen glicol) PEG-WM 20.000 D,
\newpage
iii)
NHS-PEG-NHS:PEG1184
Su-OOC-PEG-COO-Su
\alpha,\omega-Di-succinimidil
éster poli(etilen glicol) PEG-WM 2.000 D,
PEG1186
Su-OOC-PEG-COO-Su
\alpha,\omega-Di-succinimidil
éster poli(etilen glicol) PEG-WM 3.000 D,
PEG1187
Su-OOC-PEG-COO-Su
\alpha,\omega-Di-succinimidil
éster poli(etilen glicol) PEG-WM 6.000 D,
PEG1183
Su-OOC-PEG-COO-Su
\alpha,\omega-Di-succinimidil
éster poli(etilen glicol) PEG-WM 10.000 D,
PEG1185
Su-OOC-PEG-COO-Su
\alpha,\omega-Di-succinimidil
éster poli(etilen glicol) PEG-WM 20.000
D,
iv)
H_{2}N-PEG-COOH:PEG1096
H_{2}N-PEG-COOH*HCl
\alpha-Amino-\omega-carboxi
poli(etilen glicol) clorohidrato PEG-WM 3.000
D, PEG1097 H_{2}N-PEG-COOH*HCl
\alpha-Amino-\omega-carboxi
poli(etilenglicol) clorohidrato PEG-WM 5.000
Dalton PEG1095 H_{2}N-PEG-COOH*HCl
\alpha-Amino-\omega-carboxi
poli(etilenglicol) clorohidrato PEG-WM
10.000
Dalton.
Dalton.
\vskip1.000000\baselineskip
Se eligió preferiblemente el PEG1163
MeO-PEG-COO-Su
\alpha-Metoxi-\omega-carboxílico
ácido succinimidil éster poli(etilen glicol)
PEG-WM 2.000 Dalton. El derivado de PEG que contiene
el grupo funcional succinimidil éster, permite una funcionalización
directa de las ferritinas ya que este grupo éster activado reacciona
con los grupos aminos que rodean las nanopartículas, formando un
enlace covalente tipo amida.
Los datos experimentales han demostrado que
después de 3 h de inyección, las partículas se acumulan de forma
significativa en pulmón. Por otra parte, puesto que se puede
controlar la cantidad de Tc/partícula (en un rango
0-20, con un 100% prácticamente de incorporación de
Tc) permite que se pueda alcanzar de sobra el rango óptimo de
concentraciones de Tc (10^{-9} M) y el de MRI (del orden de
10^{-5} M).
Se puede utilizar la cavidad interior de la
ferritina para introducir magnetita, obteniendo una nanopartícula
superparamagnética llamada magnetoferritina, a partir de ahora la
magnetoferritina de la invención. Esta nanopartícula
superparamagnética está constituida por una nanopartícula de
magnetita encapsulada en la ferritina que presenta propiedades para
comportarse como agente de contraste en MRI.
La magnetoferritina de la invención es
biocompatible y presenta una biodistribución en distintos órganos,
mejorando significativamente las propiedades de otros agentes de
contraste como son la magnetita sola. Esta puede ser usada como
agente de contraste bimodal en MRI.
Otras ventajas de la magnetoferritina de la
presente invención es que en la preparación de estas nanopartículas
se puede ocluir ^{99m}Tc. Preferiblemente este se introduce en
forma de ^{99m}TcO_{4}^{-}. La introducción de
^{99m}TcO^{4} se puede llevar a cabo a temperatura ambiente en
un tiempo óptimo para su inyección en el cuerpo. Además no requiere
reducción del Tc(VII) y su incorporación a la nanopartícula
es prácticamente total, lo que permite una acumulación óptima del
radionúclido. El hecho de que el pertecnectato vaya ocluido en la
red del mineral de Fe, hace que pueda controlarse la cantidad de
^{99m}TcO_{4}^{-} por partícula y por lo tanto, puedan
prepararse fármacos de diferentes dosis de radionúclido, en función
de las necesidades. Al introducirse el ^{99m}Tc hace que las
magnetoferritina de la invención se pueden usar como agente de
contraste trimodal,
OI-MRI-SPECT.
La especie de Tc preferida para su inclusión en
la magnetoferritina de la invención es ^{99m}TcO_{4}^{-}. La
concentración de ^{99m}Tc se puede ajustar en función de la
necesidad, por ejemplo diagnosis o terapia pero preferiblemente está
comprendida entre 10^{-9}-10^{-5}M.
Los presentes inventores han logrado obtener
partículas de magnetita de alto contenido en Fe en la cavidad de
ferritina. El contenido en Fe puede ser modulado hasta 3800 átomos
de Fe por unidad de ferritina. Preferiblemente se modula la cantidad
de Fe de 3000 a 3800 átomos de Fe por unidad de ferritina, lo cual
permite mejorar sus propiedades como agente de contraste en MRI.
Durante la preparación de la nanopartícula de
magnetita (i), el Tc queda ocluido dentro de la magnetita, lo que es
un ventaja frente a los complejos de coordinación de Tc puesto que
la concentración de Tc por partícula es mucho mayor (hasta 20 veces
mayor) y permite acumular una mayor densidad de átomos de Tc. Esta
mayor acumulación redunda en un incremento de la radiación gamma y
en una mayor resolución. Asimismo, la acumulación optimiza la
concentración del radiomarcador, lo que permite el uso de menores
dosis.
Los datos experimentales han demostrado que
después de 3 h de inyección, las partículas se acumulan de forma
significativa en pulmón (Figura 2). Por otra parte, puesto qué
controlar la cantidad de Tc/ferritina (en un rango
0-20, con un 100% prácticamente de incorporación de
Tc) permite que se pueda alcanzar de sobra el rango óptimo de
concentraciones de Tc (10^{-9} M) y el de MRI (del orden de
10^{-5} M).
Otro de los aspectos es proporcionar un método
para la síntesis de las ferritinas y las magnetoferritinas de la
presente invención. Este método comprende:
a) anclar al menos un quantum dot a la
superficie de la ferritina
b) y después anclar las cadenas de PEG a la
superficie de la ferritina.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización preferida la etapa (a)
comprende: adicionar una disolución que comprende un quantum dot
derivatizado con grupos carboxílicos en la superficie y un agente de
acoplamiento, como una carboimida; a otra disolución de la ferritina
y posteriormente hacer reaccionar la disolución que comprende el
PEG.
La introducción de las cadenas de polímero
biocompatible se deben de realizar después de la introducción del
QD. La introducción del polímero biocompatible se realiza
preferentemente mediante el uso de derivados del polímero
biocompatible que comprenden ácidos carboxílicos, y así se forman
enlaces tipo amida, por lo que se puede usar un agente de
acoplamiento para la catálisis de la reacción. El biopolímero puede
estar activado/funcionalizado, es decir los ácidos carboxílicos
pueden estar derivatizados, incluyendo ya el agente de
acoplamiento.
Los agentes de acoplamiento preferidos de la
presente invención se seleccionan entre
N,N-diciclohexilcarbodiimida,
1-[3-(dimetilamino)propil]-3-etilcarbodiimida,
diisopropilcarbodiimida y cualquiera de sus combinaciones.
Respecto la síntesis de la magnetoferritina,
esta se realiza antes de la introducción del QD y del polímero
biocompatible. Aunque la introducción de la magnetita se puede hacer
mediante el proceso descrito por Douglas (Masaki Uchida, Masahiro
Terashima, Charles H. Cunningham, Yoriyasu Suzuki, Deborah A.
Willits, Ann F. Willis, Philip C. Yang, Philip S. Tsao, Michael V.
McConnell, Mark J. Young and Trevor Douglas, Magnetic Resonance in
Medicine 60:1073-1081 (2008)), los presentes
inventores han desarrollado una variación, que proporciona algunas
ventajas. El método de la invención comprende al menos las etapas
de:
i) preparar una disolución de apoferritina,
preferiblemente de concentración entre 0,1 y 100 mg/mL, y más
preferiblemente entre 5 y 20 mg/mL,
ii) Preparar una disolución que comprenda
Fe(II) y Fe(III) en estequiometría aproximada de 1:2,
es decir entre 1:1,8 a 1,8:1,
iii) preparar una disolución de pertecnectato
(^{99m}Tc),
iv) adicionar de forma intercalada la disolución
preparada en el paso (ii) y la disolución preparada en la etapa
(iii) sobre la preparada en el paso (i).
v) Preferiblemente, se aísla la magnetoferritina
superparamagnética dopada con ^{99m}Tc.
\vskip1.000000\baselineskip
La estequiometría inicial de Fe(II) y
Fe(III) es determinante para la preparación apropiada de
magnetoferritina y por ende de sus propiedades magnéticas. A
diferencia del método reportado por Douglas y colaboradores, donde
todo el Fe de partida está en su estado de oxidación Fe(II) y
se ha comprobado que con un riguroso control de la extensión de la
oxidación, en nuestro método, el balance estequiométrico de partida
confiere las condiciones óptimas y no requiere un control exhaustivo
de la entrada de aire en el sistema.
Las sales de hierro (II) y (III) útiles para la
preparación de la magnetoferritina son conocidas por los expertos en
la materia. En una realización preferida la etapa (ii) se prepara
mezclando una disolución que comprende sulfato de hierro (II)
amoniaco hexahidratado con otra que comprende Fe
(NO_{3})_{3} en HCl.
La inclusión de ^{99m}TcO_{4}^{-} se lleva
a cabo mediante pequeñas adiciones de ^{99m}TcO_{4}^{-} al
mismo tiempo que se hace la red de magnetita. Se puede dializar la
disolución resultante en bolsas de diálisis con tamaño de poro
adecuado y separar las partículas de todo el material restante. En
la disolución que no contiene las partículas se puede medir la
concentración de Tc y de esta forma se conoce el porcentaje de Tc
incorporado. En algunos casos se ha estudiado el comportamiento del
MoO_{4}^{2-}, porque tiene una química muy similar a del
^{99m}TcO_{4}^{-}, pero no es radioactivo. Se ha observado que
para pequeños contenidos de Mo (0-20 átomos de
Mo/magnetoferritina), la incorporación es prácticamente del
100%.
Con objeto de llevar una caracterización más
pormenorizada que permita conocer la distribución de Tc en la
nanopartícula superparamagnética, se llevó a cabo un estudio
mediante Microscopía Electrónica de Transmisión de muestras
similares en las que en vez de usar el radiomarcador pertecnectato,
se usaron otros aniones del tipo molibdato, vanadato, arseniato y
fosfato. La química de estos aniones es similar a la del
pertecnectato, especialmente si no hay cambios del estado de
oxidación del metal.
El estudio de Microscopía Electrónica de
Transmisión es de especial utilidad en el caso de las nanopartículas
dopadas con vanadato; esta técnica nos proporciona tanto información
sobre la distribución del tamaño de las nanopartículas como sobre la
composición química y distribución espacial de los estados de
oxidación en nanopartículas individuales. Las imágenes de campo
oscuro a alto ángulo son sensibles al número atómico del material,
es decir, aquellas zonas en la que estén presentes los elementos más
pesados se mostrarán en la imagen como puntos de mayor intensidad.
En nuestro caso de estudio, las nanopartículas, al contener
elementos de alto número atómico, aparecerán en la imagen con alto
contraste, siendo visualizadas directamente y de forma individual.
En estas condiciones de registro de la imagen se pueden realizar
medidas directas del tamaño de las nanopartículas presentes en la
muestra, a partir de las cuales se puede establecer una distribución
de tamaños de partícula. Adicionalmente se puede determinar la
distribución espacial, con resolución
sub-nanométrica, de los elementos químicos presentes
en las partículas individuales, utilizando la técnica de pérdida de
energía de los electrones (EELS). Esta técnica nos permite estudiar
directamente las transiciones electrónicas que ocurren en el átomo
cuando este es sometido a un haz de electrones de alta energía, 200
kV. En particular esta técnica mide la energía que el electrón
incidente pierde cuando interacciona con un átomo. Por ejemplo en el
caso de los átomos de Vanadio, se estudian directamente las
transiciones L2,3 donde los electrones 2p del átomo son transferidos
a estados no ocupados sobre el nivel de Fermi. La energía requerida
para esta transición es un valor característico para cada átomo y es
igual a la energía pérdida por el electrón incidente. Así, midiendo
la pérdida de energía de los electrones incidentes uno puede
identificar los distintos elementos presentes en las nanopartículas,
(V 513 eV, O 532 eV, Fe 708 eV). Adicionalmente la estructura fina
del espectro EELS de los metales de transición se caracteriza por la
presencia de dos picos intensos (líneas blancas) cuya intensidad y
posición en energía varía en función del estado de oxidación del
material (Leapman et al Phys. Rev. Lett. 45, 397 (1980),
Turquat et al. International Journal of Inorganic Materials 3
(2001) 1025-1032). El estudio detallado de la
estructura fina del pico de absorción refleja información sobre el
estado electrónico del material pudiendo estudiar las posibles
variaciones del estado de oxidación del hierro o vanadio a través de
las nanopartículas.
El estudio de la composición química y los
estados de oxidación en nanopartículas individuales fue llevado a
cabo combinando las propiedades de las imágenes en campo oscuro a
alto ángulo con la espectroscopia de pérdida de energía de los
electrones, utilizando el método de adquisición conocido como
espectro-imagen (Tence, M. Quartuccio and C.
Colliex, Ultramicroscopy 58 (1995) 42, Maigne et al Journal
of Electron Microscopy 58(3): 99-109 (2009)).
Este modo consiste en adquirir simultáneamente la señal de campo
oscuro a alto ángulo y los espectros EELS mientras la sonda barre
una zona predeterminada, imagen (1D) o espectro línea. En particular
utilizando un tiempo de adquisición de 2 segundos se adquirió un
espectro EELS, con energía de dispersión de 0,5eV, cada 0,6 nm a lo
largo de una línea de 36,7nm que pasa a través de las
nanopartículas. El análisis de cada uno de los espectros adquiridos
(cuantificación y estudio del estado de oxidación) a lo largo de la
nanopartícula nos proporciona la composición y estado de oxidación
del metal caracterizado a la escala subnanométrica.
Preferiblemente en el método la disolución de la
etapa (a) está tamponada con AMPSO a un pH entre pH 7,5 y 9,5,
preferiblemente entre 8,0 y 9,0.
En una realización particular, las cadenas del
polímero biocompatible, preferiblemente PEG, se hacen reaccionar con
la magnetoferritina después de la inclusión de la magnetita/Tc.
Otro aspecto se refiere a una composición
farmacéutica que comprende la magnetoferritina de la presente
invención y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable, así
como el uso de dicha composición farmacéutica para la preparación de
un medicamento.
Las ferritinas de la presente invención, y
especialmente la magnetoferritina, así como la composición
farmacéutica que las incluye son útiles para la preparación de
medicamento para la diagnosis de diferentes enfermedades, según la
utilización de moléculas que lo confieran especificidad por un
tejido u órgano en cuestión, pero en especial cáncer, incluyendo
cáncer cervical, de cabeza y cuello, renal y de uréter, de colon,
recto y ano, de endometrio, de esófago, de estómago, de hígado, de
laringe, de ovario, de páncreas, de piel, de próstata, de pulmón, de
cerebro, de testículo, leucemia, melanoma, y linfoma.
Además de para detectar enfermedades también son
útiles tanto la ferritina de la presente invención, y especialmente
magnetoferritina, así como la composición farmacéutica que las
comprende como agentes de contraste en general y como agente de
contraste en MRI, OI o SPECT.
A lo largo de la descripción y las
reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no
pretenden excluir otras características técnicas, aditivos,
componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos,
ventajas y características de la invención se desprenderán en parte
de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los
siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se
pretende que sean limitativos de la presente invención.
La figura 1 muestra una de las realizaciones
particulares de la nanoestructura de la invención. Esta consta de
ferritina (i), con un núcleo de magnetita dopado con ^{99m}Tc
(iv), un quantum dot anclado a la superficie (ii), y polímero
biocompatible de PEG (iii). La nanoestructura es capaz de actuar
como agente de contraste en MRI (i), OI(ii), gammagrafía (iv)
y muestra tiempos de vida medio en sangre suficientemente extensos
para distribuirse por el sistema circulatorio sin ser fagocitados en
un tiempo menor de 3 h.
La figura 2. TEM-STEM de la
nanoestructura mostrando la formación preferencial de dímeros
ferritina-QD.
La figura 3. EELS en línea de un dímero
ferritina-QD, demostrando la presencia de Fe y O en
el bloque de ferritina y de Cd en el de QD.
La figura 4. Imagen de ratones atímicos a los
que se les inyectó la nanoestructura objeto de la presente patente.
Tras 3 h, se observa la fluorescencia de la nanoestructura, centrada
preferencialmente en pulmones, con una concentración prácticamente
despreciable en el hígado.
Como ejemplo de una de nuestras realizaciones
particulares, la ferritina se acopló con 3 tipos diferentes de
quantum dots: un primer tipo de quantum dots emitiendo en el verde
(QD525), un segundo tipo emitiendo en el rojo (QD655) y un tercero
que emite en el cercano infrarrojo (QD800). Para ello se llevó a
cabo una incubación directa de ambos tipos de nanopartículas
(magnetoferritina y Qdot) en presencia del catalizador EDC
(1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]
carbodiimida), y se obtuvo una nanoestructura que contenía ambos
tipos de nanoprecursores (magnetoferritina+Qdot).
El estudio por Optical Imaging de la
biodistribución de la magnetoferritina acoplada al QD800 mostró lo
siguiente: en un tiempo de entre 15 minutos y 1 hora después de la
administración intravenosa la nanoestructura se concentra en hígado,
pulmón y cerebro, en orden decreciente. Después de 3 horas, se
localiza preferentemente en pulmones, siendo la concentración en
hígado muy poco significativa (Figura 4). Tras 24 horas no se
detectaron nanopartículas.
Disolución 1. Se preparan 10 ml una disolución
de apoferritina (Sigma-Aldrich Ref.
A341-1G, lot. 048K7004) de concentración 10 mg/ml en
tampón AMPSO pH 8,6 (Sigma A6659). La disolución se desgasifica con
una corriente fuerte de argón y en agitación durante 10 min.
Disolución 2. Se preparan dos disoluciones: 5 ml
de Sal de Mohr (Amonium Iron (II) sulfate hexahydrate, Aldrich Chem.
20,350-5) 0,05 M en HCl 0,01 M y 5 ml de Fe
(NO_{3})_{3} 0,1 M en HCl 0,01 M, se mezclan y se
desgasifica con una corriente fuerte de argón y en agitación durante
10 min.
Disolución 3. Una disolución de NaOH 0,1 M se
desgasifica con una corriente fuerte de argón y en agitación durante
10 min.
Disolución 4. Una disolución de pertenectato
(^{99m}Tc) obtenida a partir de kit comercial se desgasifica con
una corriente fuerte de argón y en agitación durante 2 min.
Suspensión 5. Se lleva a cabo la adición lenta
de la disolución 2 sobre la disolución 1. Se llevan a cabo adiciones
de 0,25 ml cada 2 min hasta completar 1 ml. Antes de la 5 adición de
la disolución 2, se adicionan 56 \mul de la disolución de
^{99m}Tc (disolución 4).
Disolución 6. A la suspensión 5 se le adiciona
lentamente 1 ml de una disolución de citrato sódico 0,1 M para
eliminar todo los compuestos metálicos que no hayan quedado
encapsulados en la apoferritina. La disolución resultante se
cromatografía (10 min) en columna de exclusión por tamaño (Sephadex
G-25, lot.360710, GE Healthcare,
PD-10 Desalting Columns,
17-0851-01), obteniendo la
disolución final 6 que contiene magnetita dopada con ^{99m}Tc
encapsulada en la cavidad de la apoferritina.
Disolución 4. Se usa un generador de
^{99}Mo/^{99m}Tc de 12 GBq de actividad calibrada. La elución
realizada es analizada en términos de actividad de ^{99m}Tc.
Conocida la relación específica mCi/\mug de ^{99m}Tc, es posible
controlar la cantidad de Tc utilizada y por ende su actividad
radioquímica.
Suspensión 5. Se lleva a cabo la adición lenta
de la disolución 2 sobre la disolución 1. Se llevan a cabo adiciones
de 0,25 ml cada 2 min hasta completar 1 ml. Antes de la 5 adición de
la disolución 2, se adicionan 0,5 ml de la disolución de ^{99m}Tc
(disolución 4).
Para la realización del control de calidad
usamos tiras de papel Whatman 3 MM de 10 cm de longitud y 0,5 cm de
ancho, en las que depositamos una alícuota (150 \mul) del
radiofármaco marcado, y para su desarrollo las introducimos en
tanques cromatográficos con acetona hasta unos 0,5 mm de la base.
Cuando la cromatografía se ha desarrollado la medimos en el Radio
Cromatógrafo Minigita Raytest. En el origen de la tira
cromatográfica se quedarán los coloides (Rf=0), en este caso la
magnetoferritina dopada con Tc, y en el frente el pertecnetato libre
(Rf=1).
Los quantum dots QD525, QD655 y QD800 se
adquirieron en Invitrogen (Q21341MP, Q21321MP, Q21371MP,
respectivamente). Los quantum dots están recubiertos por un polímero
funcionalizado con grupos carboxílicos para reaccionar con los
grupos amino de la ferritina. Los residuos carboxílicos de los QDs
deben activarse con EDC
(1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]
carbodiimida, Fluka 03450-25G).
Disolución 7. 20 \mul de la solución stock del
QD comercial (8 mM) se incuban con 10 \mul de una disolución stock
de EDC (10 mg/ml en agua bidestilada) durante 30 min para su
activación. Esta preparación se lleva a cabo mientras se
desgasifican las disoluciones requeridas en el paso anterior de la
síntesis de magnetoferritina.
Disolución 8. 0,2 ml de la disolución 6
(magnetoferritina-^{99m}Tc) se diluyen hasta 2 ml
en tampón PBS (Fosfato potásico monobásico, Acros Organics 424205000
y fosfático sódico dibásico, Acros Organics 424375000) y se le añade
la disolución 7 (quantum dot activado. La mezcla se incuba durante 1
h en agitación suave y a 4ºC. Posteriormente la muestra se purifica
en una columna de cromatografía (15 min) por exclusión de tamaño
(Sephacryl 5,5 cm x 1,5 cm de lecho, Sigma) con el fin de eliminar
el exceso de producto que no hubiese reaccionado.
El derivado de polietilenglicol
MeO-PEG-NHS
\alpha-Metoxi-\omega-carboxílico
ácido succinimidil éster poli(etilenglicol)
(PEG-MW 2.000 Dalton)/ M.W. 2000 g/mol) se adquirió
en Iris Biotech GmbH (PEG1164, lot. 125447).
Disolución 9. 1000 moles de PEG (0.0058 g en 0.5
ml de agua bidestilada) fueron añadidos a la disolución 8 y se dejó
30 min en agitación suave y a temperatura ambiente. Se cromatografió
(10 min) en una columna de exclusión por tamaño (Sephadex
G-25, lot.360710, GE Healthcare,
PD-10 Desalting Columns,
17-0851-01) hasta obtener una
disolución pura de nanopartículas de magnetita dopadas con
^{99m}Tc, acopladas covalentemente con un QD y PEG.
Solamente cuando la preparación se lleva a cabo
en un fuerte exceso de QD, se logra observar nanopartículas del tipo
QD-magnetoferritina-QD. El recuento
del número de QD enlazados convalentemente a la magnetoferritina en
la nanoestructura objeto de la presente invención se llevó a cabo
mediante TEM (Microscopía Electrónica de Transmisión) (figura 2) y
mediante Microscopía Electrónica de
Barrido-Transmisión en modo Campo Oscuro Anular de
Alto Ángulo (HAADF-STEM) (figura 2). En esta última
técnica, la intensidad de la señal con la que se construye la imagen
depende del número atómico (Z), de tal forma que en las zonas de la
imagen en las que están presentes elementos químicos con mayor valor
de Z, el brillo es mayor. La relación entre la intensidad en la
imagen y el valor del número atómico es aproximadamente del tipo
Z^{2} (S.J. Pennycook, D.E. Jesson, Ultramicroscopy, 1991, 37,
14). Como puede observarse en la figura, la imagen
STEM-HAADF muestra claramente la presencia de dos
partículas de dimensiones nanométricas próximas entre sí. Puede
apreciarse, igualmente, que hay una clara diferencia de brillo entre
las dos partículas que forman la nanoestructura, tal como cabría
esperar, puesto que una contiene un óxido de Fe (Z_{Fe}=26,
Z_{O}=8) y la otra, una capa de CdSe (Z_{Cd}= 48,
Z_{\underline{Se}}=34). De acuerdo con lo comentado
anteriormente, la partícula que muestra menor intensidad sería la
que contiene elementos más ligeros (Fe, O) y la más brillante
aquella que contiene a los elementos más pesados (Cd, Se). Para
confirmar la interpretación anterior y obtener una evidencia directa
sobre la naturaleza química de cada una de las dos partículas que se
integraban en las nanoestructuras detectadas mediante Microscopía
Electrónica, se llevó a cabo un estudio complementario mediante la
técnica denominada EELS (Espectroscopía de pérdida de energía de los
electrones). Esta técnica, que se lleva a cabo en los microscopios
electrónicos de transmisión, se registra la energía cinética que
pierde el haz de electrones incidente al atravesar la muestra. Esta
pérdida de energía corresponde a las interacciones inelásticas
electrón-muestra. Parte de estas interacciones
corresponden a excitaciones de electrones de los niveles internos de
los átomos presentes en la muestra a niveles por encima del nivel de
Fermi. Como las energías de estas transiciones son específicas de
cada átomo, el registro del espectro de pérdida de energías
constituye una huella dactilar de los elementos presentes en la
muestra, permitiendo en definitiva realizar un análisis químico
cualitativo y cuantitativo de la zona iluminada por el haz de
electrones. Como el diámetro de las sondas de electrones que se
pueden obtener en microscopios de transmisión como el empleado para
obtener la figura, dotado con cañón de emisión de campo o FEG, puede
ser del orden de tan solo unos pocos Angstroms, esta técnica permite
realizar lo que viene a llamarse como nanoanálisis, es decir un
análisis químico cualitativo y cuantitativo con una resolución
espacial mejor que un nanómetro. Es más, si formamos una de estas
sondas de dimensiones nanométricas, controlamos su movimiento sobre
la muestra y en paralelo realizamos un registro simultáneo de la
señal STEM-HAADF y de los espectros EELS podemos
trabajar en un modo denominado de espectro-imagen
(en el caso en el que la muestra se barra a lo largo de dos
direcciones, sobre un área) o de espectro-línea
(cuando la sonda de electrones se barre siguiendo una trayectoria
lineal desde un punto a otro de la muestra). Trabajando en estos
modos obtenemos información no sólo de qué elementos están presentes
y en qué cantidad sino, además, sobre la distribución espacial de
los elementos presentes en la muestra, con resolución
subnanométrica. Esta aproximación experimental de
espectro-línea es la que se ha aplicado al estudio
de la composición química de las nanoestructuras reivindicadas. En
nuestro caso se ha realizado análisis EELS a lo largo de
trayectorias lineales que, partiendo del extremo de una de las
partículas y cruzándola, llegaban y cruzaban la segunda de las
partículas, adquiriendo un espectro, con una sonda menor que
5\ring{A}, tras cada 5\ring{A}. Como puede observarse (Figura
3), los espectros correspondientes a la zona de la imagen
correspondiente a la partícula más brillante muestran señales
correspondientes al Cd, mientras que los espectros registrados en la
zona de la imagen correspondiente a la partícula menos brillante,
contienen señales de Fe y O, confirmando que la nanoestructura
consiste en dímeros de magnetoferritina y QD.
Claims (24)
1. Una ferritina, caracterizada porque
comprende al menos un quantum dot y al menos una molécula de un
polímero biocompatible ambos unidos covalentemente a la superficie
de la ferritina.
2. La ferritina según la reivindicación
anterior, caracterizada porque el quantum dot emite entre 750
y 850 nm.
3. La ferritina según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde el quantum dot está
funcionalizado con grupos carboxílicos.
4. La ferritina según cualquiera las tres
reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el quantum
dot está unido covalentemente a la superficie de la ferritina
mediante enlaces amida.
5. La ferritina según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizada porque comprende
entre 1 y 2 unidades de quantum dots anclados a la superficie de la
ferritina.
6. La ferritina según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el polímero
biocompatible es polietilén glicol.
7. La ferritina según la reivindicación
anterior, caracterizada porque es obtenible por la unión de
PEG1163
MeO-PEG-COO-Su
\alpha-Metoxi-\omega-ácido
carboxílico succinimidil éster poli(etilenglicol)
PEG-WM 2,000 Dalton a la superficie de la
ferritina.
8. La ferritina según cualquiera de las dos
reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el
polietilén glicol está unido mediante enlaces covalentes de tipo
amida.
9. La ferritina según cualquiera de las tres
reivindicaciones anteriores, caracterizada porque tiene entre
3 y 10 cadenas de polietilén glicol unidas covalentemente a la
superficie de la ferritina.
10. La ferritina según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracteriza porque el núcleo
tiene magnetita ocluyendo ^{99m}Tc.
11. La ferritina según la reivindicación
anterior, caracterizada porque la especie de ^{99m}Tc es
^{99m}TcO_{4}^{-}.
12. La ferritina según cualquiera de las dos
reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la
concentración de la especie ^{99m}Tc está comprendida entre
10^{-9}-10^{-5}M.
13. Un método para la síntesis de cualquiera de
las ferritinas como se definen en las reivindicaciones anteriores
que comprende:
a) anclar al menos un quantum dot a la
superficie de la ferritina
b) y después anclar las cadenas de polietilén
glicol a la superficie de la ferritina.
\vskip1.000000\baselineskip
14. El método según la reivindicación anterior,
donde la etapa (a) comprende: adicionar una disolución que comprende
un quantum dot derivatizado con grupos carboxílicos en la superficie
y una carboimida a otra disolución de la ferritina y posteriormente
hacer reaccionar la disolución que comprende el polietilén
glicol.
15. El método según cualquiera de las dos
reivindicaciones anteriores, donde la etapa (b) comprende un agente
de acoplamiento.
16. El método según cualquiera de las tres
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el agente
de acoplamiento se selecciona entre
N,N-diciclohexilcarbodiimida,
1-[3-(dimetilamino)propil]-3-etilcarbodiimida,
diisopropilcarbodiimida y cualquiera de sus combinaciones.
17. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 16 para la síntesis de cualquiera de las
ferritinas como se definen en las reivindicaciones 10 a 12 que
comprende antes de la incorporación del quantum dot al menos las
siguientes etapas:
i) preparar una disolución de apoferritina,
preferiblemente de concentración entre 0,1 y 100 mg/mL, y más
preferiblemente entre 5 y 20 mg/mL,
ii) preparar una disolución que comprenda Fe
(II) y Fe(III) en estequiometría aproximada de 1:2.
iii) preparar una disolución de pertenectato
(^{99m}Tc),
iv) adicionar de forma intercalada la disolución
preparada en el paso (ii) y la disolución preparada en la etapa
(iii) sobre la preparada en el paso (i).
v) aislar la magnetoferritina superparamagnética
dopada con ^{99m}Tc.
\vskip1.000000\baselineskip
18. El método según la reivindicación anterior
en la que la disolución de la etapa (ii) se prepara mezclando una
disolución que comprende sulfato de hierro (II) amoniaco
hexahidratado con otra que comprende Fe (NO_{3})_{3} en
HCl.
19. El método según cualquiera de las dos
reivindicaciones anteriores, donde la disolución de la etapa (i)
esta tamponada con AMPSO a un pH entre pH 7,5 y 9,5, preferiblemente
entre 8,0 y 9,0.
20. Una composición farmacéutica que comprende
la ferritina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 y al
menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.
21. Uso de la composición farmacéutica según la
reivindicación anterior para la preparación de un medicamento.
22. El uso de la composición según la
reivindicación anterior para la preparación de un medicamento para
la diagnosis de cáncer.
23. El uso de la ferritina según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 12 o de la composición farmacéutica según
la reivindicación 20 para la preparación de un medicamento como
agente de contraste.
24. El uso ferritina según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12 o de la composición farmacéutica según la
reivindicación 20 para la preparación de un medicamento para su uso
como agente de contraste en MRI, OI o SPECT.
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| ES200931146A ES2370359B1 (es) | 2009-12-11 | 2009-12-11 | Nanoestructuras multifuncionales como agentes de diagnosis trimodal mri-oi-spect. |
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- 2009-12-11 ES ES200931146A patent/ES2370359B1/es not_active Expired - Fee Related
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